JPH09301998A - 神経細胞の細胞骨格の動的制御因子蛋白質、そのポリヌクレオチドおよびその抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コロニンやｐ５７に類似した神経細胞の細胞
骨格の動的制御因子蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコ
ードするポリヌクレオチドの塩基配列を特定することを
課題とする。 【解決手段】 ヒト大脳由来のｍＲＮＡを用いた均一化
ＤＮＡライブラリーからスクリーニングにより、コロニ
ン又はｐ５７類似の神経細胞の細胞骨格の動的制御因子
蛋白質をコードする遺伝子を同定し、該遺伝子がコード
する蛋白質を同定する。また、該蛋白質及び該遺伝子の
改変体、変異体、一部である蛋白質及びポリヌクレオチ
ドを提供する。該蛋白質及び該遺伝子は、神経細胞の細
胞骨格の動的制御、さらにはニューライトの進展、シナ
プスの形成や組み換えといった生理学的な機能の解明、
該機能の異常に基づく神経細胞の変性性疾患の治療方法
又は治療薬、さらに該疾患の検査方法及び検査薬等への
利用を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、神経細胞の細胞骨
格の動的制御因子蛋白質、そのポリヌクレオチドおよび
該蛋白質を認識する抗体に関する。該蛋白質は、神経細
胞の細胞骨格の動的制御、さらにはニューライトの進
展、シナプスの形成や組み換えといった生理学的な機能
の解明、また該機能の異常に基づく疾患の治療方法又は
治療薬、さらに該疾患の検査方法及び検査薬等に応用可
能である。

【０００２】

【従来の技術】神経細胞のネットワークは時間的・空間
的にダイナミックに変動し、該変動が学習や記憶の分子
レベルでの基盤となっている。該変動の中で本質的なの
は、シナプス接合の新たな形成過程である。この過程で
細胞骨格（マイクロチュブラス、ニューロフィラメン
ト、アクチンマイクロフィラメント）は、大きな役割を
負っている。

【０００３】シナプス接合の新たな形成過程は、神経細
胞の突起（アクソン）の先端部である成長錐が、形を変
えながら標的（別の神経細胞）を探し、それと接合（コ
ンタクト）する過程である。このとき、アクソンでは、
サイトスケルタル−リアレンジメントと呼ばれている細
胞内構造の再編成が起こっていて、その主役はアクチン
及びマイクロチューブ並びにそれら（すなわち、アクチ
ン及びマイクロチューブ両方の）の動的制御因子蛋白質
群である。該再編成については、三つのステージ（グ
ロースコーンエクスプロレーション、サイトセレクシ
ョン、サイトスタビリゼーション）から成るモデルが
考えられており、アクチン及びマイクロチューブに対し
て、個々のステージで特有の制御、すなわち、サイトス
ケルトンの構造が大きく変わるような制御（動的制御）
が行われているものと考えられている（『Ｃｅｌｌ ｖ
ｏｌ．８３（１９９５年）』ｐ．１７１−１７６参
照）。したがって、サイトスケルトンの動的制御は学習
や記憶の分子レベルでの基盤を成すものであり、この解
明のために該制御に関する物質、すなわちサイトスケル
トンに結合する蛋白質やサイトスケルトンを基質とする
キナーゼ、フォスファターゼがさかんに研究されている
（『Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｓｉｎａｕｅ
ｒ社、アメリカ）第８章参照）。これらのうち、特に、
アクチンに対する制御物質について、さかんに研究がな
されている。

【０００４】粘菌で見出されたコロニン（『ＥＭＢＯ
Ｊ． ｖｏｌ．１３』ｐ．４０９７−４１０４、『Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ｖｏｌ１２０』ｐ．１６３−
１７３）やヒト及びウシの胸腺細胞から単離されたｐ５
７（『ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ．３６４』
ｐ．２８３−２８８）は、主要な細胞骨格であるアクチ
ンフィラメントに結合し、細胞骨格へのシグナル伝達に
関与するとされる細胞内因子蛋白質である。両蛋白質と
もそのアミノ酸配列は特定されており、蛋白質相互作用
を担うとされるＷＤ ｒｅｐｅａｔｓ（『Ｎａｔｕｒｅ
ｖｏｌ．３７１』ｐ．２９７−３００（１９９４年）
参照）から成る構造をとり、シグナル関連蛋白質の新し
いファミリーを形成することが知られている。コロニン
及びｐ５７について、その生化学的、生理学的な重要性
を列挙すると以下の通りである。 （１）コロニン及びｐ５７は、アクチンと結合する。コ
ロニンについては、アクチンとの結合を利用して細胞骨
格へのシグナル伝達に関与することが、『Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ． ｖｏｌ１２０』ｐ．１６３−１７３のデ
ータ等から実証されており、ｐ５７についても、細胞骨
格へのシグナル伝達に関与することが推定されている。 （２）コロニンは、粘菌の移動と形態変化に不可欠の役
割を持つ。 （３）ｐ５７は、フォスフォリパーゼと結合する。 （４）コロニンについては、粘菌でのファゴサイトシス
において中心的な役割を果たすことが報告されており
（『Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．８３（１９９５年）』ｐ．９１
５−９２４参照）、上記（１）のコロニンについての報
告を併せると、細胞骨格（特にアクチン含有構造）の制
御におけるコロニンの役割の重要性はほぼ確立したもの
となっている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、コロニ
ンやｐ５７が細胞骨格の動的制御に関する蛋白質である
ことは明らかであり、これらに類似した蛋白質を神経細
胞において見出すことは神経細胞の細胞骨格の動的制御
の解明をさらに進めるものであり、ひいては変性性疾病
（例えば、アルツハイマー病やパーキンソン病）の根本
的治療への重要な手がかりを提供するものである。した
がって、本発明の課題は、神経細胞において発現してい
るコロニン及びｐ５７類似の新規な蛋白質のアミノ酸配
列及び該蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配
列を特定し、該蛋白質及び該ポリヌクレオチドを提供す
ることである。さらに、本発明は、該ポリヌクレオチド
のアンチセンスポリヌクレオチド、該蛋白質に対する抗
体の提供を課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するべく鋭意研究を行い、ヒト大脳由来のｍＲＮＡ
を用いた均一化ＤＮＡライブラリー（佐々木等の方法
（『ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．１』（１９９
４年）ｐ．９１−９６参照）に準じて作製した。）から
スクリーニングにより、神経細胞において発現している
コロニン又はｐ５７類似の蛋白質のアミノ酸配列を特定
し上記課題を達成した。すなわち、コロニン及びｐ５７
の全体のアミノ酸配列と比較し、有意なホモロジーを持
ち（ただし、コロニン、ｐ５７のいずれのアミノ酸配列
とも一致しない）、そのＷＤ ｒｅｐｅａｔｓ構造も共
通している神経細胞由来のポリペプチドをコードする遺
伝子を単離することに成功した（以下このポリペプチド
をＦＣ９６蛋白質、遺伝子をＦＣ９６遺伝子とい
う。）。さらに、ＦＣ９６遺伝子の発現を１６種類の組
織で検討し、脳においては特に高い発現が見られること
（図２参照）、また、脳においては蛋白質レベルでも高
い発現を示すこと（図３参照）を明らかにした。さら
に、ＦＣ９６蛋白質がアクチンと直接結合する能力を有
していることを見出した（図４参照）。本発明は、ＦＣ
９６遺伝子及び該遺伝子を導入した形質転換体にＦＣ９
６蛋白質を産生させる方法又はＦＣ９６を発現している
細胞の抽出液から抗ＦＣ９６抗体を用いた免疫沈降等に
より製造又は精製したＦＣ９６蛋白質を提供する。本発
明のＦＣ９６蛋白質は、Ｆ−アクチンと結合する、すな
わち神経細胞の細胞骨格に結合する。また、ＷＤ ｒｐ
ｅａｔｓ構造を有していることならびにコロニン及びｐ
５７にアミノ酸配列が類似していることによって、神経
細胞の細胞骨格の動的制御に関与していることが推定さ
れる。

【０００７】また、ＦＣ９６蛋白質及びＦＣ９６遺伝子
について、実質的にそれらの機能が変わらない改変体
や、変異体、それらの一部分を得ることが可能であり、
本発明はそれらを提供する。本発明では、ＦＣ９６蛋白
質について、実質的にその機能が変わらない一部分、改
変体、変異体及びそれらの一部分である蛋白質をＦＣ９
６相同蛋白質という。また、ＦＣ９６相同蛋白質をコー
ドする遺伝子（縮重による変異体を含む）の集合をＦＣ
９６相同遺伝子という。また、ＦＣ９６相同蛋白質の各
蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ
及びそれらの誘導体）の集合をＦＣ９６相同ポリヌクレ
オチドという。さらに、本発明から得られるＦＣ９６相
同蛋白質及びＦＣ９６相同ポリヌクレオチドは神経細胞
の細胞骨格の動的制御、さらにはニューライトの進展、
シナプスの形成や組み換えといった生理学的な機能の解
明を可能とし、また該機能の異常に基づく疾患の治療方
法又は治療薬、さらに該疾患の検査方法及び検査薬等に
応用可能とするものである。

【０００８】すなわち、本発明の第１態様は、コロニン
及びｐ５７の全体のアミノ酸配列と比較し、有意なホモ
ロジーを持つ（ただしコロニン、ｐ５７のいずれのアミ
ノ酸配列とも一致しない）神経細胞の細胞骨格の動的制
御因子蛋白質である。該蛋白質は以下により特徴付けら
れる。 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部を少
なくとも有しており、且つアクチンと結合できること。
ここでいう「一部を少なくとも有して」いるということ
は、全部を有するということを排除しない。 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において一
又は複数のアミノ酸が、置換、欠失又は付加されてお
り、且つアクチンと結合できる蛋白質。これは、上記
の特徴を有する蛋白質の改変体、変異体又はその一部で
ある蛋白質と同意である。

【０００９】本発明の第２態様は、配列表の配列番号１
に記載のアミノ酸配列のうちの連続する八以上のアミノ
酸を有する蛋白質である。該蛋白質は、本発明の第１態
様の蛋白質を抗原として用いるときに使用可能なもので
ある。

【００１０】本発明の第３態様は、上記の第１又は第２
態様の蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。蛋
白質のアミノ酸配列が配列表の配列番号１に記載のもの
である場合、該蛋白質をコードするポリヌクレオチドで
あって天然に存在するものの塩基配列は、配列表の配列
番号２に記載のものになる。

【００１１】本発明の第４態様は、上記の第３態様のポ
リヌクレオチドのアンチセンス鎖の全部又は一部の配列
を有し、且つ上記の第１又は第２態様の蛋白質の生合成
を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドである。本発
明の第５態様は、上記の第４態様のアンチセンスポリヌ
クレオチドの誘導体である。

【００１２】本発明の第６態様は、上記の第１又は第２
態様の蛋白質に対する抗体である。

【００１３】本発明の第７態様は、上記の第３又は第４
態様のポリヌクレオチドを挿入されたベクターである。
本発明の第８態様は、上記の第７態様のベクターを導入
された形質転換体である。

【００１４】本発明の第９態様は、上記の第４又は第５
態様のアンチセンスポリヌクレオチドを含み上記の第１
又は第２態様の蛋白質を検出するポリヌクレオチドプロ
ーブである。

【００１５】本発明の第１０態様は、上記の第４又は第
５態様のアンチセンスポリヌクレオチドを含む神経細胞
の変性性疾患の治療薬である。

【００１６】本発明の第１１態様は、上記の第６態様の
抗体により、上記の第１又は第２態様の蛋白質を検出又
は分離する方法である。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明の神経細胞の細胞骨格の動
的制御因子蛋白質であるＦＣ９６蛋白質は、配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもの又は該配列
におけるＮ末端のメチオニンが無いものである。ＦＣ９
６蛋白質（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を
有するもの）とコロニン、及びＦＣ９６とｐ５７とのア
ミノ酸配列を比較すると、そのホモロジーはそれぞれ３
８．１％、４３．９％である。ＦＣ９６蛋白質のアミノ
酸配列（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列）の
特徴は、ＷＤ ｒｅｐｅａｔｓを有することである。Ｗ
Ｄ ｒｅｐｅａｔｓは蛋白質−蛋白質間相互作用におい
て、蛋白質の高次構造に応答して形を変え得る表面を成
し、蛋白質−蛋白質相互作用のインターフェイスとなる
と推定されている。ＦＣ９６蛋白質は、図１において枠
で囲って示すように、ＷＤリピーティングユニット（Ｗ
Ｄ ｒｅｐｅａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）を５カ所有し、こ
れらの部分が一体となり蛋白質−蛋白質相互作用のイン
ターフェイスとなると推定される。ＦＣ９６蛋白質の分
子量は、抗ＦＣ９６抗体を用いたウェスタンブロットの
結果により約５４ｋＤであることが分かる。また、ＦＣ
９６蛋白質の機能としては、アクチンとの結合性が挙げ
られる。また、フォスフォリパーゼとの結合性が推定さ
れる。

【００１８】自然の変異により又は人工の変異（例え
ば、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）
１５．１〜１５．１１３頁を参照）によりポリヌクレオ
チドの構造の一部を、該ポリヌクレオチドがコードする
蛋白質の主たる活性に変化を与えることなく、変化させ
ることが可能である。本発明のＦＣ９６蛋白質について
も、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一又は
複数のアミノ酸を、該蛋白質の主たる活性であるアクチ
ンとの結合性を変化させずに、置換、欠失又は付加する
ことが可能である。したがって、本発明のＦＣ９６蛋白
質はこのような、アミノ酸配列において一又は複数のア
ミノ酸が、置換、欠失又は付加されており、且つアクチ
ンと結合できる蛋白質を含むものである。既述のよう
に、これらを本発明ではＦＣ９６相同蛋白質という。

【００１９】ＦＣ９６相同蛋白質は、コロニンの精製又
はｐ５７の精製方法と同様にして得られ、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動等の方法により検出可能である。アクチン
との結合性は、コロニン又はＦＣ９６相同蛋白質の場合
と同様にして確認することができる。具体的には、
（『ＥＭＢＯ Ｊ． ｖｏｌ．１３』ｐ．４０９７−４
１０１に記載の方法（コロニンの場合）、『ＦＥＢＳ
ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ．３６４』ｐ．２８３−２８６
に記載の方法（ｐ５７の場合）により、確認可能であ
る。両方法とも、コセディメンテーションアッセイ（ｃ
ｏｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）といわれ
る方法である。該方法においては、アクチンが不溶性で
あることを利用している。「検討したい蛋白質（可溶性
蛋白質）」をアクチンと混合し、懸濁する。その後、超
遠心分離機で上清とペレットに分離する。アクチン及び
アクチンに結合した蛋白質は不溶性なのでペレットとな
り、アクチンに結合しなかったものは上清に残る。ペレ
ットと上清それぞれに含まれる「検出したい蛋白質」を
ウェスタンブロット法等により検出することにより、該
蛋白質がアクチンに結合するかどうかを判定できる。フ
ォスフォリパーゼとの結合性もｐ５７の場合と同様にし
て確認することができる。具体的には、『ＦＥＢＳ ｌ
ｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ．３６４』ｐ．２８３−２８５に
記載の方法により、行うことができる。

【００２０】本発明のＦＣ９６相同蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドは、上記の全ての蛋白質をコードする
塩基配列を有するものである。遺伝暗号の縮重により、
ポリヌクレオチドから生産される蛋白質のアミノ酸配列
を変えることなく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少
なくとも一部の塩基を他の種類の塩基に置換することが
できる。したがって、本発明のＦＣ９６相同蛋白質をコ
ードするポリヌクレオチドの塩基配列は、該蛋白質をコ
ードする全ての縮重のパターンをとり得る。なお、配列
表の配列番号２に示される塩基配列は天然に存在するＦ
Ｃ９６遺伝子の塩基配列である。

【００２１】本発明のＦＣ９６相同ポリヌクレオチド
は、配列表の配列番号２の塩基配列のうちの一部を有す
るＤＮＡ又は該ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリー等をス
クリーニングすることによって、すなわち該ｃＤＮＡラ
イブラリーから該プローブにハイブリダイズするクロー
ンを選別することによって得ることができる。このと
き、使用するプローブには、配列表の配列番号２の塩基
配列のうち、連続する１２塩基以上の長さを持つポリヌ
クレオチドを用いることが可能である。特に、連続する
１６塩基以上であることが好ましい。ハイブリダイズの
条件は、例えば、後述の実施例１の３．２）に示す条件
が挙げられる。使用するｃＤＮＡライブラリーとして
は、脳由来のものが好ましく使用できる。これらのｃＤ
ＮＡライブラリーからランダムサンプリングにより選択
された一群のｃＤＮＡを検索の試料とすることができ
る。また、市販のものでも使用可能である。特に、ｃＤ
ＮＡライブラリーは、『ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖ
ｏｌ．１』（１９９４年）９１〜９６頁に記載の方法等
により均一化を行ったものであることが好ましい。本発
明において、ｃＤＮＡライブラリーのどの程度をスクリ
ーニングするかについては、特に制限はない。例えば、
１×１０⁵ ないし５×１０⁵ 個程度をスクリーニングす
ることができる。

【００２２】さらに、スクリーニングの際にプラスミド
を得る方法についても、特に制限はなく、公知の方法に
より可能である。例えば、『細胞工学実験プロトコー
ル』（秀潤社、１９９１年）７１〜１０７頁に記載の方
法が挙げられる。また、ヘルパーファージを用いたｉｎ
ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法（例えば、ストラタジ
ーン社のＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲクローニングキット（登
録商標）取扱説明書に記載の方法）にしたがってプラス
ミドの形に変換することが好ましい。

【００２３】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。例えば、『細胞工学プロトコール』（秀潤社、１
９９１年）１０５〜１０７頁に記載の方法により可能で
ある。

【００２４】上記により得られるプラスミドのインサー
トの塩基配列を決定することで、コロニン及びｐ５７と
高いホモロジーのあるアミノ酸配列をコードするｃＤＮ
Ａが選択可能となるが、本発明では、そのインサートの
一部又は全部を解析するかどうかについては、特に制限
はない。適当な長さの塩基配列を決定し、その結果に基
づきさらに適当なプラスミドを選択することも好ましく
可能である。例えば、インサートの５’末端のいくつか
の塩基配列を決定し、該決定された塩基配列がコードす
るアミノ酸を予測し、この結果に基づいて、アミノ酸配
列においてコロニン及びｐ５７とホモロジーの高いクロ
ーンを選択することが好ましい。この場合、インサート
の５’末端は少なくとも２００塩基以上は解析されるこ
とが好ましい。解析されたプラスミド（特に制限はな
く、例えばランダムに適当な数を選択することが可能で
ある。）の５’末端の塩基配列の決定方法は、本発明に
おいては、特に制限ない。例えば、Ｔａｑサイクルシー
クエンシング法（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｖｏ
ｌ．７』（１９８９年）４９４〜４９９頁に記載の方法
は好ましく使用可能である。

【００２５】得られた塩基配列から翻訳されるアミノ酸
配列と、既に知られているコロニン及びｐ５７との比較
方法については、特に制限がない。例えば、市販のプロ
グラム（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）−ＣＤプ
ログラムＶｅｒ．２７（ソフトウェアディベロプメント
社製）により、プロテインデータベース（登録商標）リ
リース４３（ＮＢＲＦ社製）と比較してホモロジー解析
することが可能である。このホモロジー解析の結果、例
えば、連続する１００残基において３０％以上のホモロ
ジーがあるものを選択することが可能となる。選択され
たアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡに基づき、コード
領域全体を含むクローンを単離するためのスクリーニン
グ方法については特に制限がない。該塩基配列の一部又
は全部を利用するかどうかは特に制限はなく、該塩基配
列を利用してスクリーニング可能であればよい。例え
ば、上記で得られた塩基配列の約半分の塩基配列を利用
することも可能である。これは、使用するスクリーニン
グ方法にも依存する。スクリーニング方法については、
公知の種々の方法が好適に使用可能であり、特に制限は
ない。例えば、ラベル化したオリゴヌクレオチドを用い
たハイブリダイゼーションによる方法や、５’方向又は
３’方向のプライマーを用いたＲＡＣＥ法等が使用可能
である。上記ラベル化については特に制限なく、例え
ば、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニン等が使用可
能である。さらに、ハイブリダイゼーションの条件につ
いても、本発明においては、特に制限なく、公知の種々
の方法が使用可能であり、例えば、『細胞工学実験プロ
トコール』（秀潤社、１９９１年）５７〜６５頁に記載
の方法が好適に使用可能である。

【００２６】上記でスクリーニングされたポジティブク
ローンから、該インサートの塩基配列を決定するための
方法については、本発明においては、特に制限はなく、
公知の方法により種々可能である。例えば、欠失変異株
を作製し、個々のクローンの塩基配列を決め、該配列を
配列編集ソフト上で連結する方法が使用可能である。

【００２７】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに
は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合
したものが、天然には存在しないものを含めて全て含ま
れる。その代表的なものは、ＤＮＡとｍＲＮＡである。
また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドには、そ
の立体構造や機能がポリヌクレオチドと類似する誘導体
が全て含まれる。例えば、ポリヌクレオチドの３’末端
もしくは５’末端に他の物質が結合したものやポリヌク
レオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか一部
において、置換や欠失や付加の修飾が生じた物質、天然
に存在しないような塩基、糖、リン酸を有するものや、
糖−リン酸骨格以外の骨格を有するものである。該アン
チセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、ＦＣ９６
相同ポリヌクレオチドのいかなる部分にハイブリダイズ
するものであってもよい。なお、ＦＣ９６蛋白質の全部
又は一部をコードするｍＲＮＡの一部に対して相補的な
塩基配列を有し、該ｍＲＮＡにハイブリダイズするもの
が好ましい。特に好ましくは、少なくともＦＣ９６遺伝
子又はＦＣ９６蛋白質をコードするｍＲＮＡにハイブリ
ダイズするものである。

【００２８】また、該アンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体を使用して、組織や細胞におけるＦＣ９６
相同ポリヌクレオチドの存在やその発現状況を調べるた
めの研究用ポリヌクレオチドプローブとして、直ちに使
用可能である。また、診断用ポリヌクレオチドプローブ
としても使用可能である。なお、プローブとしては、１
２塩基以上且つＧＣ含有率が３０ないし７０％であるも
のが好ましく、１６塩基以上且つＧＣ含有率が３０ない
し７０％であるものが、特に好ましい。また、該アンチ
センスポリヌクレオチド及びその誘導体を使用して、Ｆ
Ｃ９６相同蛋白質の発現を調節することが可能である。
これらはＦＣ９６相同遺伝子又はＦＣ９６をコードする
ｍＲＮＡにハイブリダイズしてＦＣ９６相同蛋白質の発
現を促進ないし抑制することが期待されるので、ＦＣ９
６相同蛋白質が関与するニューライトの進展、シナプス
の形成や組み換えといった機能の異常に基づく神経細胞
の変性性疾患の治療薬として使用可能である。すなわ
ち、該アンチセンスポリヌクレオチドやその誘導体より
アンチセンス医薬品を開発することが可能である。

【００２９】蛋白質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡの相
補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用して、該
蛋白質の発現を調節する方法は、アンチセンス法と呼ば
れており、現在多くの研究者によって研究が進められて
いる技術である。相補的な配列を有するポリヌクレオチ
ドは、 遺伝子からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、 ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシン
グ段階、 核膜通過段階、 蛋白への翻訳段階 のいずれかで、遺伝情報を担うＤＮＡ又はｍＲＮＡに結
合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白
質の発現を調節すると考えられている。ハイブリダイズ
のし易さの点では、一般的には、ステムループを形成し
ている領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つポリヌ
クレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を設計するとよ
いとされている（『臨床免疫 ２５巻』１２００〜１２
０６頁、１９９３年）。

【００３０】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなポリヌクレオチドは、一般に
高い発現抑制効果が期待できる（『癌と化学療法 ２０
巻１３号』１８９９〜１９０７頁）。したがって、本発
明のアンチセンスポリヌクレオチド又はその誘導体であ
って、ＦＣ９６相同遺伝子又はＦＣ９６相同蛋白質をコ
ードするｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の相補的な
配列を含むものは、高い発現抑制効果が期待される。現
在一般に知られている誘導体は、ヌクレアーゼ耐性、組
織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも一つが高め
られた誘導体であることが好ましく、特に好ましくは、
当該ポリヌクレオチド誘導体は、フォスフォロチオエー
ト結合を骨格構造として有する誘導体である。本発明の
ポリヌクレオチド及びその誘導体についても、これらの
機能又は構造を有する誘導体が含まれる。

【００３１】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体の製造方法については、例えば、『ｉｎ
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ』に記載の方法を用いることが可
能である。例えば、天然型のＤＮＡやＲＮＡであれば、
化学合成機を使用して合成したり、ＦＣ９６相同遺伝子
を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンスポリ
ヌクレオチドを得ることができる。また、メチルフォス
フォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の
中には、化学合成機（例えば、パーキンエルマージャパ
ン社製３９４型）を使用して合成できるものもある。こ
の場合には、化学合成機に添付されている説明書にした
がって操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグ
ラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによ
っても、目的のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド
誘導体を得ることができる。

【００３２】ＦＣ９６相同蛋白質に対する抗体の作製に
用いる抗原としては、該蛋白質の全長又は一部が使用可
能である。一部を用いる場合には、アミノ酸残基数が８
以上であることが好ましい。抗体の作製方法としては、
公知の方法を用いることが可能であり、例えば、『Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８年）１２章に
記載の方法に準じて抗体を得ることができる。また、免
疫感作によって充分な抗体価のポリクローナル抗体が得
られるならば、該免疫した動物のリンパ球を用いたハイ
ブリドーマによりモノクローナル抗体を得ることも可能
である。例えば、前出の『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』に記載の方法に
準じて行える。

【００３３】上記の抗体を用いて、ウェスタンブロット
法により、ＦＣ９６相同蛋白質を検出することが可能と
なる。すなわち、ＦＣ９６相同蛋白質を含む試料をポリ
アクリルアミドゲルに電気泳動した後メンブレン上にエ
レクトロブロットし、該蛋白質と該抗体とを反応させ
て、該ゲル上に該蛋白質に対応するバンドを検出するこ
とが可能である。例えば、前出の『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』に記載
の方法に準じて行うことができる。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの実施例に限られるものではない。 ＜実施例１＞ＦＣ９６遺伝子の塩基配列及びＦＣ９６蛋
白質のアミノ酸配列の特定 １．ヒト大脳由来均一化ライブラリーの作製 ヒと大脳由来のｍＲＮＡを用いて、均一化ｃＤＮＡライ
ブラリー（λＺＡＰファージライブラリー）の作製を行
った。均一化は佐々木らの方法（『ＤＮＡ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ｖｏｌ．１』（１９９４年）ｐ．９１−９６参
照）にしたがい、 半固相系でのセルフハイブリダイゼーション、 の処理を行ったｍＲＮＡからのファージｃＤＮＡラ
イブラリーの作製、 インサートｃＤＮＡからｃＲＮＡへの変換 の各ステップをの順で行って、均一化ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。

【００３５】２．ＦＣ９６遺伝子ｃＤＮＡのクローニン
グ １）１．で作製された均一化ｃＤＮＡライブラリー１ｍ
ｌのうち１００μｌをＥＸアシストヘルパーファージ
（ストラタジーン社製）を用いたｉｎ ｖｉｖｏｅｘｃ
ｉｓｉｏｎの方法（ストラタジーン社製のＵｎｉ−ＺＡ
Ｐ ＸＲクローニングキット（登録商標）取扱説明書に
記載の方法）にしたがって、プラスミドの形に変換し
た。下記に具体的にその方法を述べる。 大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ２００μｌと均一化ｃＤ
ＮＡライブラリー１００μｌ、ヘルパーファージＲ４０
８ １μｌ（＞１×１０⁶ ｐｆｕ／ｍｌ）を５０ｍｌチ
ューブにて混合し、３７℃、１５分間、均一化ｃＤＮＡ
ライブラリーとヘルパーファージとを大腸菌に感染させ
た。 ５ｍｌの２×ＹＴ培地（１０ｇＮａＣｌ，１０ｇ
Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１６ｇ
Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ／１ｌ）を加え、３７℃で
３時間振盪培養し、大腸菌よりファージミドを分泌させ
た。

【００３６】７０℃で２０分間熱処理した後、４００
０ｇで５分間遠心し、菌体を死滅させた。上清のファー
ジミドを別の試験管に移した。 この上清にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）粒子
が含まれており、この上清２００μｌあるいは１００倍
に希釈した溶液２０μｌと大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ
２００μｌ（ＯＤ６００＝１．０）を混合し、３７℃で
１５分間混合し感染させた。 で得られた液（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）
粒子を感染させた大腸菌を含む液）を１０μｌ、３０μ
ｌ、１００μｌずつ取り（１〜１００μｌの範囲の量を
数点取ればよい）、ＬＢ／Ａｍｐプレートにプレーティ
ングした後、３７℃で一晩培養した。 現れたコロニーはインサートＤＮＡを含む二本鎖のｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）をもった大腸菌（ＸＬ
−１ Ｂｌｕｅ）形質転換体である。

【００３７】２）１）で得られた大腸菌形質転換体から
プラスミドをＱＩＡｗｅｌｌ ８Ｐｌｕｓキット（登録
商標、キアゲン社製）を用いて調製した。

【００３８】３）２）で得られたプラスミドのインサー
トの５’末端の配列をパーキンエルマー社製ＤＮＡシー
クエンサー３７３Ａを用い、Ｔａｑサイクルシークエン
シング法（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｖｏｌ．
７』ｐ．４９４−４９９（１９８９年）参照）により決
定した。

【００３９】４）３）で決定した塩基配列を翻訳して得
られたアミノ酸配列をＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）−Ｃ
ＤプログラムＶｅｒ．２７（ソフトウェアディベロプメ
ント社製）により、プロテインデータベース（登録商
標）リリース４３（ＮＢＲＦ社製）と比較してホモロジ
ー解析を行った。

【００４０】５）５００個以上のプラスミドについて、
塩基配列決定を行った。該塩基配列から翻訳したアミノ
酸配列を決定し、該アミノ酸配列とコロニン及びｐ５７
のアミノ酸配列とのホモロジー解析を蛋白質全体に亘っ
て行った。この結果、有意なホモロジーを有する一クロ
ーン（遺伝子）を選択した（ＦＣ９６遺伝子と名付け
た。（ＦＣはＦｏｒｅｂｒａｉｎ Ｃｏｒｔｅｘの
略））。

【００４１】３．ＦＣ９６遺伝子ｃＤＮＡのコード領域
のクローニング １）さらに、ＦＣ９６蛋白質をコードする領域全体を含
むクローンを以下の手順で調製した。 （１）前頭葉皮質由来のｃＤＮＡライブラリー（ストラ
タジーン社製）を用いて、２．で得られたＦＣ９６遺伝
子の一部（５４５番目から１４２８番目の配列、該部分
の塩基配列については、配列表の配列番号３に示し
た。）をプローブとして、スクリーニングを行った。 （２）ファージｃＤＮＡライブラリー溶液２０μｌと大
腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ２００μｌを３７℃で１５分
間培養した。 （３）これを２〜３ｍｌのトップアガー（４８℃）に加
えＮＺＹアガープレートへプレーティングして、３７℃
で一晩培養した。１００ｍｍ四角プレートには約５０，
０００個のプラークを培養し、６枚のプレートに撒い
て、約３×１０⁵ 個のプラークをスクリーニング用に用
いた。 （４）ＮＺＹプレートを４℃で２時間冷却し、このプレ
ート上にナイロンフィルター（ハイボンドＮ＋（登録商
標、アマシャム社製））を載せ、２分間放置した。 （５）これを剥がしてフィルターペーパー上で乾燥し、
紫外線照射により固定してスクリーニング用フィルター
を調製した。

【００４２】２）これを用いて、以下のハイブリダイゼ
ーションを行った。 （１）ハイブリダーゼーションのためのプローブは、配
列表の配列番号３（ＦＣ９６遺伝子の５４５番目から１
４２８番目の配列）に記載の塩基配列を持つＤＮＡ断片
を、メガプライムラベリングキット（登録商標、アマシ
ャム社製）で³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム社製）標識し
たものを使用した。 （２）プレハイブリダイゼーション溶液として、５×Ｓ
ＳＣ（ＮａＣｌ ０．１５Ｍ，クエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．０）０．０１５Ｍ）、５０％フォルムアミド、１
×ｄｅｎｈａｒｄｔ（ウシ血清アルブミン（フラクショ
ンＶ）０．２％、ポリビニルピロリドン０．２％、Ｆｉ
ｃｏｌｌ４００ ０．２％）溶液、０．１％ＳＤＳ、１
００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。 （３）フィルターは、４２℃、３時間、プレハイブリダ
イゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識プロ
ーブを加えたハイブリダイゼーション溶液（１０％デキ
ストランサルフェイトを含むプレハイブリダイゼーショ
ン溶液）で４２℃、１６時間、インキュベートしてハイ
ブリダイゼーションを行った。

【００４３】３）以上の操作の後、フィルターを洗浄、
Ｘ線フィルムに露光し、ハイブリダイズしたクローンを
検出した。その結果、８個のポジティブクローンが得ら
れた。得られたアガープレート中のポジティブＺＡＰフ
ァージクローンのプラークの中心をパスツールピペット
でくり抜き、５００μｌのＳ緩衝液と２０μｌのクロロ
フォルム混合液中に溶出し、ボルテックスをした後、一
晩放置した。

【００４４】４）上記の８個のポジティブクローンに対
し、２．の１）の操作と同様にして、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ（−）を持った大腸菌（ＸＬ−１ Ｂｌｕ
ｅ）の形質転換体を得た。 ５）８個のポジティブクローンの大腸菌から２．の２）
と同様にしてプラスミドの調製を行った。 ６）該プラスミドのうち、最も長いインサート（約２．
７ｋｂのインサート）を持つクローンとその次に長いイ
ンサートを持つクローン（約１．３ｋｂのインサート）
について以下のＤＮＡ塩基配列の決定を行った。この２
つのクローンは０．８ｋｂ重複していた。

【００４５】７）上記で得られたクローンの塩基配列
を、パーキンエルマー社製のＤＮＡシークエンサー３７
３Ａを用い、Ｔａｑサイクルシークエンシング法により
決定した。得られたヒトＦＣ９６のｃＤＮＡの塩基配列
の解析結果のうちコード領域の１４２８塩基を配列表の
配列番号２に示す。オープンリーディングフレームは１
４２５塩基であり、４７５個のアミノ酸がコードされて
いる。 ８）上記の配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有す
るｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ
Ｋ^- により形質転換された大腸菌をｐＢＳ−ＦＣ９６と
命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８
年２月２８日に寄託した（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１
５４８１）。

【００４６】４．ヒトＦＣ９６遺伝子のコードするアミ
ノ酸配列の解析 決定した塩基配列から翻訳したアミノ酸配列は、図１に
示すように、コロニン及びｐ５７とのアミノ酸レヴェル
の比較で蛋白質全体に亘る有意なホモロジーを持ち（そ
れぞれ３８．１％及び４３．９％）、そのＷＤ ｒｅｐ
ｅａｔｓ構造も共通している。図１で、上段はＦＣ９６
蛋白質、中段はヒトｐ５７、下段はコロニンのアミノ酸
配列をそれぞれ表す。図中配列の両端の数字は何番目の
アミノ酸に当たるのかを示す。三者で共通しているアミ
ノ酸はその下に＊印を付した。ＷＤ ｒｅｐｅａｔｓを
枠で囲み、それぞれの枠の上部に〜の番号を付し
た。

【００４７】＜実施例２＞１６種類の細胞におけるＦＣ
９６遺伝子の発現のレヴェルの比較 １．材料及び方法 比較は、ノーザンブロット解析法により、『Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ』
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））ｐ．７．３９−
７．５２に記載の方法に準じて行った。Ｈｕｍａｎ ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂ
ｌｏｔｔＩＩ（登録商標、クローンテック社製）は、そ
れぞれ２μｇの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎
臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、前立腺、卵巣、小腸、大
腸、抹消リンパ球から抽出したｐｏｌｙＡ⁺ ＲＮＡをア
ガロース電気泳動したものをメンブランに転写したもの
である。

【００４８】２．ハイブリダイゼーション １）ハイブリダイゼーションのためのプローブは、配列
表の配列番号３（ＦＣ９６遺伝子の５４５位から１４２
８番目の配列）に記載された塩基配列を持つＤＮＡ断片
を、メガプライムラベリングキット（登録商標、アマシ
ャム社製）で³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム社製）標識し
たものを使用した。 ２）プレハイブリダイゼーション溶液として、５×ＳＳ
Ｃ（ＮａＣｌ ０．１５Ｍ，クエン酸ナトリウム（ｐＨ
７．０）０．０１５Ｍ）、５０％フォルムアミド、１×
ｄｅｎｈａｒｄｔ（ウシ血清アルブミン（フラクション
Ｖ）０．２％、ポリビニルピロリドン０．２％、Ｆｉｃ
ｏｌｌ４００ ０．２％）溶液、０．１％ＳＤＳ、１０
０μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。 ３）１．のメンブランを、４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼーション溶液（１０％
デキストランスルフェイトを含むプレハイブリダイゼー
ション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベートして
ハイブリダイゼーションを行った。

【００４９】４）洗浄後、メンブランをＸ線フィルムに
密着させた状態で。−８０℃、２日間置き、その後現像
した。結果を図２に示す。図２中、脳のレーンにはっき
りとバンドが見られ、脳で多くＦＣ９６遺伝子が発現し
ていることが認められる。

【００５０】＜実施例３＞抗ＦＣ９６抗体の作製 抗体の作製は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）第５章に記載
の方法に準じて以下のように行った。 １．抗原の作製 配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＦＣ９６
部分蛋白質をコードする遺伝子を、発現ベクターｐＱＥ
３１（キアゲン社製）に挿入した。次に、該ベクターを
大腸菌に導入し、形質転換体を得た。次に、該形質転換
体を培養液中で培養し、配列表の配列番号４に記載のア
ミノ酸配列に記載のアミノ酸配列からなるＦＣ９６部分
蛋白質（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の全
長のＦＣ９６蛋白質の２９７位から４７５位までの部
分）のＮ末端に６個のヒスチジンが付加された蛋白質を
産生させた。次に、この培養液中の形質転換体を破砕
し、ＦＣ９６部分蛋白質を培養液中に混入させた。次
に、この培養液をＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅカラム（キアゲ
ン社製）により精製し、抗原とするＦＣ９６部分蛋白質
を得た。上記の操作法は全てキアゲン社のマニュアルに
したがった。

【００５１】２．免疫 １．で作製した抗原をウサギに２週間の間隔をあけて４
回免疫した。最初の免疫の７週間後に免疫したウサギの
血液を一部回収して、遠心分離して抗血清を得た。該抗
血清の抗体価を、免疫に用いた抗原によるＥＬＩＳＡ法
によりチェックした。その結果、５０，０００倍以上に
抗体価が上昇したことが確認された。

【００５２】＜実施例４＞抗ＦＣ９６抗体によるＦＣ９
６蛋白質の検出 クローンテック社製のヒト脳由来の組織ホモジネートお
よびヒト肝臓由来の組織ホモジネートをそれぞれ５０μ
ｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した
後、メンブレン上にエレクトロブロットした。次に、該
メンブレンに実施例３で作製した抗血清を用いてウェス
タンブロット法による解析を『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』第１２章に
記載の方法に準じて行った。結果を図３に示す。ＦＣ９
６全長蛋白質のバンドの位置を矢印で示す。図中、レー
ン１はヒト脳由来の組織ホモジネートを電気泳動したレ
ーンであり、レーン２はヒト肝臓由来の組織ホモジネー
トを電気泳動したレーンである。図から明らかなよう
に、ヒト脳由来の組織ホモジネートのみに、配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦＣ９６全長蛋
白質に対応するバンドが見られた。すなわち、実施例３
で得られた抗体は本発明のＦＣ９６全長蛋白質を認識す
ることが分かった。したがって、該抗体は、配列表の配
列番号４のアミノ酸配列が保存されているＦＣ９６相同
蛋白質をも認識する。

【００５３】＜実施例５＞ＦＣ９６蛋白質とＦ−アクチ
ンとの結合の確認 １．ＦＣ９６蛋白質の作製 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により、配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列を持つＦＣ９６蛋白質のＮ端に
Ｔ７ペプチドタグ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ）を付加したＦＣ９６蛋白質を作製した。ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ転写／翻訳の試薬は、ＴＮＴカプルドレティキ
ュロサイトライセートシステム（ＴＮＴ ｃｏｕｐｌｅ
ｄ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓ
ｔｅｍ）（プロメガ社製）を用いた。操作法は添付のマ
ニュアルにしたがった。ＦＣ９６蛋白質の検出は、該Ｆ
Ｃ９６蛋白質に付加したＴ７ペプチドタグを抗Ｔ７抗体
で検出することにより行った。

【００５４】２．ＦＣ９６蛋白質とＦ−アクチンとの結
合 ウサギ筋アクチン（ｒａｂｂｉｔ ｍｕｓｃｌｅ ａｃ
ｔｉｎ）（シグマ社製）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよ
うにバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＡＴＰ、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ₂ ）１００ｍｌに溶かした。この
液に、１．で用意したＦＣ９６蛋白質１μｌを加えた。
この液を２５℃で１時間置いた後、遠心操作（３００，
０００ｇ、３０分、４℃）を行った。Ｆ−アクチン（フ
ィラメント化したアクチン）はこの条件で速やかに沈降
し、ペレットになる。この後、ペレットと上清を別々に
回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動
し、メンブレン上にエレクトロブロットした後、抗Ｔ７
ペプチド抗体を用いてウェスタンブロット法による解析
を行った。対象としてアクチンを加えていないサンプル
についても同じ操作を行った。

【００５５】結果を図４に示す。図中、レーン１は、ア
クチンを加えていない対象のサンプルの上清を電気泳動
したレーンであり、レーン２は、アクチンを加えていな
い対象のサンプルのペレットを電気泳動したレーンであ
る。レーン３は、アクチンを加えたサンプルの上清を電
気泳動したレーンであり、レーン４は、アクチンを加え
たサンプルのペレットを電気泳動したレーンである。矢
印で示したのが、ＦＣ９６蛋白質のバンドである。図か
ら、アクチンを加えない対象のサンプルではＦＣ９６蛋
白質のほとんどが上清に存在するが、アクチンを加えた
場合、少なくとも試験管内の実験では、ＦＣ９６蛋白質
のほとんどがペレットに存在すること、すなわちＦＣ９
６蛋白質がＦ−アクチンに結合しうることが分かる。な
お、６６ｋＤ付近のバンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／
翻訳の試薬中の蛋白質が抗Ｔ７ペプチド抗体に反応した
もので無関係である。

【００５６】

【発明の効果】本発明により提供されるコロニン又はｐ
５７類似の神経細胞の細胞骨格の動的制御因子蛋白質で
あるＦＣ９６蛋白質、その相同蛋白質、該蛋白質をコー
ドするポリヌクレオチド、該相同蛋白質をコードするポ
リヌクレオチドであるＦＣ９６相同ポリヌクレオチド、
前記ポリヌレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドな
らびにＦＣ９６蛋白質およびＦＣ９６相同蛋白質を認識
する抗体は、神経細胞の細胞骨格の動的制御、ニューラ
イトの進展、シナプスの形成や組み換えといった生理学
的な機能の解明を可能とし、また該機能の異常に基づく
神経細胞の変性性疾患の治療方法又は治療薬、さらに該
疾患の検査方法及び検査薬等への利用が可能なものであ
る。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４７５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ser Trp Arg Pro Gln Tyr Arg Ser Ser Lys Phe Arg Asn Val Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Val Ala Asn Arg Glu His Cys Phe Asp Gly Ile Pro Ile Thr 20 25 30 Lys Asn Val His Asp Asn His Phe Cys Ala Val Asn Thr Arg Phe Leu 35 40 45 Ala Ile Val Thr Glu Ser Ala Gly Gly Gly Ser Phe Leu Val Ile Pro 50 55 60 Leu Glu Gln Thr Gly Arg Ile Glu Pro Asn Tyr Pro Lys Val Cys Gly 65 70 75 80 His Gln Gly Asn Val Leu Asp Ile Lys Trp Asn Pro Phe Ile Asp Asn 85 90 95 Ile Ile Ala Ser Cys Ser Glu Asp Thr Ser Val Arg Ile Trp Glu Ile 100 105 110 Pro Glu Gly Gly Leu Lys Arg Asn Met Thr Ala Ala Leu Leu Glu Leu 115 120 125 His Gly His Ser Arg Arg Val Gly Leu Val Glu Trp His Pro Thr Thr 130 135 140 Asn Asn Ile Leu Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Tyr Lys Val Leu Ile Trp 145 150 155 160 Asn Leu Asp Val Gly Glu Pro Val Lys Met Ile Asp Cys His Thr Asp 165 170 175 Val Ile Leu Cys Met Ser Phe Asn Thr Asp Gly Ser Leu Leu Thr Thr 180 185 190 Thr Cys Lys Asp Lys Lys Leu Arg Val Ile Glu Pro Arg Ser Gly Arg 195 200 205 Val Leu Gln Glu Ala Asn Cys Lys Asn His Arg Val Asn Arg Val Val 210 215 220 Phe Leu Gly Asn Met Lys Arg Leu Leu Thr Thr Gly Val Ser Arg Trp 225 230 235 240 Asn Thr Arg Gln Ile Ala Leu Trp Asp Gln Glu Asp Leu Ser Met Pro 245 250 255 Leu Ile Glu Glu Glu Ile Asp Gly Leu Ser Gly Leu Leu Phe Pro Phe 260 265 270 Tyr Asp Ala Asp Thr His Met Leu Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Asp Gly 275 280 285 Asn Ile Arg Tyr Tyr Glu Ile Ser Thr Glu Lys Pro Tyr Leu Ser Tyr 290 295 300 Leu Met Glu Phe Arg Ser Pro Ala Pro Gln Lys Gly Leu Gly Val Met 305 310 315 320 Pro Lys His Gly Leu Asp Val Ser Ala Cys Glu Val Phe Arg Phe Tyr 325 330 335 Lys Leu Val Thr Leu Lys Gly Leu Ile Glu Pro Ile Ser Met Ile Val 340 345 350 Pro Arg Arg Ser Asp Ser Tyr Gln Glu Asp Ile Tyr Pro Met Thr Pro 355 360 365 Gly Thr Glu Pro Ala Leu Thr Pro Asp Glu Trp Leu Gly Gly Ile Asn 370 375 380 Arg Asp Pro Val Leu Met Ser Leu Lys Glu Gly Tyr Lys Lys Ser Ser 385 390 395 400 Lys Met Val Phe Lys Ala Pro Ile Lys Glu Lys Lys Ser Val Val Val 405 410 415 Asn Gly Ile Asp Leu Leu Glu Asn Val Pro Pro Arg Thr Glu Asn Glu 420 425 430 Leu Leu Arg Met Phe Phe Arg Gln Gln Asp Glu Ile Arg Arg Leu Lys 435 440 445 Glu Glu Leu Ala Gln Lys Asp Ile Arg Ile Arg Gln Leu Gln Leu Glu 450 455 460 Leu Lys Asn Leu Arg Asn Ser Pro Lys Asn Cys 465 470 475

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：１４２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG TCC TGG CGT CCG CAA TAC CGT AGC TCC AAG TTC CGG AAT GTC TAC 48 GGG AAG GTG GCC AAC CGG GAG CAC TGC TTC GAT GGG ATC CCC ATC ACC 96 AAG AAT GTG CAC GAC AAC CAC TTC TGT GCC GTC AAC ACC CGC TTC CTG 144 GCC ATC GTC ACC GAG AGC GCA GGG GGC GGC TCC TTC CTC GTC ATC CCC 192 CTG GAG CAG ACA GGC AGG ATT GAA CCC AAC TAC CCC AAG GTC TGC GGC 240 CAC CAG GGC AAT GTG CTG GAT ATC AAA TGG AAC CCC TTC ATC GAC AAC 288 ATC ATT GCC TCG TGC TCG GAG GAC ACG TCG GTG CGG ATC TGG GAG ATC 336 CCC GAG GGC GGG CTG AAG CGG AAC ATG ACG GCG GCG CTC CTG GAG CTG 384 CAC GGG CAC AGC CGG CGT GTG GGG CTG GTC GAG TGG CAC CCC ACC ACC 432 AAC AAC ATC CTG TTC AGC GCT GGC TAC GAC TAC AAG GTC CTC ATC TGG 480 AAC CTG GAT GTG GGT GAG CCG GTG AAG ATG ATT GAC TGC CAC ACG GAT 528 GTG ATC CTC TGC ATG TCC TTC AAC ACG GAC GGC AGC CTG CTC ACC ACC 576 ACG TGC AAG GAC AAG AAG CTG CGT GTG ATT GAG CCC CGC TCT GGC CGT 624 GTT CTG CAG GAG GCC AAC TGC AAA AAC CAC AGA GTG AAC CGG GTG GTG 672 TTC CTG GGG AAC ATG AAG CGG CTC CTC ACG ACA GGG GTC TCC AGG TGG 710 AAC ACA AGA CAG ATT GCC CTC TGG GAC CAG GAG GAC CTC TCC ATG CCC 768 CTG ATC GAA GAG GAA ATT GAT GGG CTC TCT GGC CTC CTG TTC CCC TTC 816 TAT GAT GCT GAC ACC CAC ATG CTC TAC CTG GCT GGA AAG GGT GAT GGA 864 AAC ATC CGG TAC TAC GAG ATC AGC ACT GAG AAG CCC TAC CTG AGT TAC 912 CTC ATG GAG TTC CGC TCC CCA GCC CCG CAG AAA GGC CTA GGG GTC ATG 960 CCC AAG CAC GGG CTG GAT GTG TCA GCC TGC GAG GTG TTC CGC TTC TAC 1008 AAG CTG GTG ACT CTC AAG GGC CTG ATC GAG CCC ATC TCC ATG ATC GTG 1056 CCC CGG AGG TCA GAT TCC TAC CAG GAA GAC ATT TAC CCA ATG ACA CCA 1104 GGC ACG GAG CCA GCA CTG ACC CCG GAT GAA TGG CTG GGA GGC ATC AAC 1152 CGA GAT CCC GTG CTG ATG TCT TTG AAA GAA GGC TAT AAG AAG TCC TCA 1200 AAA ATG GTA TTT AAG GCT CCC ATC AAA GAA AAG AAG AGT GTT GTG GTC 1248 AAC GGA ATA GAT TTA TTA GAA AAT GTC CCA CCC AGG ACA GAG AAT GAG 1296 CTC CTT CGA ATG TTC TTC CGG CAG CAG GAT GAG ATT CGA CGG TTG AAA 1344 GAG GAG CTG GCC CAG AAG GAC ATC CGC ATT CGG CAG CTC CAG CTG GAA 1392 CTG AAA AAC TTG CGC AAC AGC CCC AAG AAC TGT TAG 1428

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：８８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CC TTC AAC ACG GAC GGC AGC CTG CTC ACC ACC ACG TGC AAG GAC AAG 47 AAG CTG CGT GTG ATT GAG CCC CGC TCT GGC CGT GTT CTG CAG GAG GCC 95 AAC TGC AAA AAC CAC AGA GTG AAC CGG GTG GTG TTC CTG GGG AAC ATG 143 AAG CGG CTC CTC ACG ACA GGG GTC TCC AGG TGG AAC ACA AGA CAG ATT 191 GCC CTC TGG GAC CAG GAG GAC CTC TCC ATG CCC CTG ATC GAA GAG GAA 239 ATT GAT GGG CTC TCT GGC CTC CTG TTC CCC TTC TAT GAT GCT GAC ACC 287 CAC ATG CTC TAC CTG GCT GGA AAG GGT GAT GGA AAC ATC CGG TAC TAC 335 GAG ATC AGC ACT GAG AAG CCC TAC CTG AGT TAC CTC ATG GAG TTC CGC 383 TCC CCA GCC CCG CAG AAA GGC CTA GGG GTC ATG CCC AAG CAC GGG CTG 431 GAT GTG TCA GCC TGC GAG GTG TTC CGC TTC TAC AAG CTG GTG ACT CTC 479 AAG GGC CTG ATC GAG CCC ATC TCC ATG ATC GTG CCC CGG AGG TCA GAT 527 TCC TAC CAG GAA GAC ATT TAC CCA ATG ACA CCA GGC ACG GAG CCA GCA 575 CTG ACC CCG GAT GAA TGG CTG GGA GGC ATC AAC CGA GAT CCC GTG CTG 623 ATG TCT TTG AAA GAA GGC TAT AAG AAG TCC TCA AAA ATG GTA TTT AAG 671 GCT CCC ATC AAA GAA AAG AAG AGT GTT GTG GTC AAC GGA ATA GAT TTA 719 TTA GAA AAT GTC CCA CCC AGG ACA GAG AAT GAG CTC CTT CGA ATG TTC 767 TTC CGG CAG CAG GAT GAG ATT CGA CGG TTG AAA GAG GAG CTG GCC CAG 815 AAG GAC ATC CGC ATT CGG CAG CTC CAG CTG GAA CTG AAA AAC TTG CGC 863 AAC AGC CCC AAG AAC TGT TAG 884

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Thr Glu Lys Pro Tyr Leu Ser Tyr Leu Met Glu Phe Arg Ser Pro Ala 1 5 10 15 Pro Gln Lys Gly Leu Gly Val Met Pro Lys His Gly Leu Asp Val Ser 20 25 30 Ala Cys Glu Val Phe Arg Phe Tyr Lys Leu Val Thr Leu Lys Gly Leu 35 40 45 Ile Glu Pro Ile Ser Met Ile Val Pro Arg Arg Ser Asp Ser Tyr Gln 50 55 60 Glu Asp Ile Tyr Pro Met Thr Pro Gly Thr Glu Pro Ala Leu Thr Pro 65 70 75 80 Asp Glu Trp Leu Gly Gly Ile Asn Arg Asp Pro Val Leu Met Ser Leu 85 90 95 Lys Glu Gly Tyr Lys Lys Ser Ser Lys Met Val Phe Lys Ala Pro Ile 100 105 110 Lys Glu Lys Lys Ser Val Val Val Asn Gly Ile Asp Leu Leu Glu Asn 115 120 125 Val Pro Pro Arg Thr Glu Asn Glu Leu Leu Arg Met Phe Phe Arg Gln 130 135 140 Gln Asp Glu Ile Arg Arg Leu Lys Glu Glu Leu Ala Gln Lys Asp Ile 145 150 155 160 Arg Ile Arg Gln Leu Gln Leu Glu Leu Lys Asn Leu Arg Asn Ser Pro 165 170 175 Lys Asn Cys

【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：５４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ACT GAG AAG CCC TAC CTG AGT TAC CTC ATG GAG TTC CGC TCC CCA GCC 48 CCG CAG AAA GGC CTA GGG GTC ATG CCC AAG CAC GGG CTG GAT GTG TCA 96 GCC TGC GAG GTG TTC CGC TTC TAC AAG CTG GTG ACT CTC AAG GGC CTG 144 ATC GAG CCC ATC TCC ATG ATC GTG CCC CGG AGG TCA GAT TCC TAC CAG 192 GAA GAC ATT TAC CCA ATG ACA CCA GGC ACG GAG CCA GCA CTG ACC CCG 240 GAT GAA TGG CTG GGA GGC ATC AAC CGA GAT CCC GTG CTG ATG TCT TTG 288 AAA GAA GGC TAT AAG AAG TCC TCA AAA ATG GTA TTT AAG GCT CCC ATC 336 AAA GAA AAG AAG AGT GTT GTG GTC AAC GGA ATA GAT TTA TTA GAA AAT 384 GTC CCA CCC AGG ACA GAG AAT GAG CTC CTT CGA ATG TTC TTC CGG CAG 432 CAG GAT GAG ATT CGA CGG TTG AAA GAG GAG CTG GCC CAG AAG GAC ATC 480 CGC ATT CGG CAG CTC CAG CTG GAA CTG AAA AAC TTG CGC AAC AGC CCC 528 AAG AAC TGT TAG 540

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＣ９６蛋白質のアミノ酸配列について、コロ
ニン及びｐ５７のアミノ酸配列との比較の結果を表す図
である。

【図２】ＦＣ９６遺伝子についての各臓器におけるノー
ザンブロット解析の結果を表す写真である。

【図３】ヒト脳由来の組織ホモジネートおよびヒト肝臓
由来の組織ホモジネートについて、抗ＦＣ９６抗体を用
いて、ウェスタンブロット法による解析を行った結果を
示す写真である。

【図４】Ｔ７ペプチドを付加させたＦＣ９６蛋白質とＦ
−アクチンとの結合について、抗Ｔ７ペプチド抗体を用
いて、ウェスタンブロット法による解析を行った結果を
示す写真である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年３月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図３】

【図４】

【図２】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 39/00 ＡＡＢＨ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＭ 39/395 Ｄ 39/00 ＡＡＢ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＭ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列の一部を少なくとも有しており、且つアクチンと結合
   できる蛋白質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列において一又は複数のアミノ酸が、置換、欠失又は付
   加されており、且つアクチンと結合できる蛋白質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を有する蛋白質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列のうちの連続する八アミノ酸残基以上のアミノ酸を有
   し、且つ抗原性を有する蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４いずれか一項に記載の
   蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列を
   有するポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項５又は６のポリヌクレオチドのア
   ンチセンス鎖の全部又は一部の配列を有し、且つ請求項
   １ないし４いずれか一項に記載の蛋白質の生合成を阻害
   するアンチセンスポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のアンチセンスポリヌク
   レオチドの誘導体であって、且つ請求項１ないし４いず
   れか一項に記載の蛋白質の生合成を阻害する機能を保持
   したアンチセンスポリヌクレオチド誘導体。
9. 【請求項９】 請求項１ないし４いずれか一項に記載の
   蛋白質を認識する抗体。