ES2543381T3 - Ensayo con gen indicador, las células y el kit para realizar dicho ensayo - Google Patents

Abstract

Una célula para ser utilizada en ensayos con anticuerpos contra un ligando extracelular seleccionado del grupo compuesto de una citocina y un factor de crecimiento, iniciando dicho ligando extracelular una señal específica de ligando en el núcleo de la célula, comprendiendo dicha célula: a) un primer constructo de ADN que tiene una secuencia que comprende un primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción, siendo dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción inducible por el ligando, y una porción codificadora de un primer producto génico indicador, activada por dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción, pudiendo ser detectado dicho primer producto génico indicador cuando el primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción es inducida por el ligando, comprendiendo dicho primer conjunto de uno o más elementos de control de transcripción un elemento de control de transcripción seleccionado a partir del grupo compuesto de un elemento de respuesta a la estimulación con IFN (ISRE), una secuencia activada por gamma (GAS), un sitio de reconocimiento NFkB, un transductor de señal y activador de transcripción (STAT5); y b) un segundo constructo de ADN con una secuencia que comprende: i) un segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción diferente de dicho primer conjunto; ii) un segmento activado por dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción que codifica un segundo producto génico indicador, y dicho segundo producto génico indicador puede ser medido independientemente en presencia de dicho primer producto génico indicador y viceversa; y iii) en un cistrón separado, un segmento que codifica dicho ligando, también activado por dicho segundo conjunto de uno o más elementos de control de transcripción.

Description

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núcleo de la célula. La célula según la presente invención contiene (1) un primer constructo de ADN que tiene una secuencia que incluye una primera serie de uno o más elementos de control de transcripción, que es inducible por el ligando, y también codifica una primera etiqueta mensurable (primer producto génico indicador), cuya expresión es promovida por la primera serie de uno o más elementos de control de transcripción cuando es inducida por la presencia del ligando y (2) un segundo constructo de ADN que tiene una secuencia que incluye una segunda serie de uno o más elementos de control de transcripción diferente de la primera, un segmento de ADN que codifica una segunda etiqueta mensurable (segundo producto génico indicador) cuya expresión es promovida por la segunda serie de uno o más elementos de control de transcripción, y en un cistrón separado un segmento que codifica un ligando, cuya expresión es también promovida por la segunda serie de uno o más elementos de control de transcripción.

[0042] La presente invención también proporciona un kit que contiene una pluralidad de células según la presente invención, siendo utilizado dicho kit para determinar en una muestra el nivel de un ligando extracelular que inicia una señal específica de ligando en el núcleo de la célula o de un anticuerpo neutralizante contra el ligando extracelular o un antagonista del ligando extracelular. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para determinar dicho nivel en una muestra.

Descripción breve de las figuras

[0043] La Figura 1 es un diagrama de flujo esquemático de las fases realizadas en el reciente ensayo basado en células "iLite" y en el ensayo de una fase "NanoLite" según la presente invención.

[0044] La Figura 2 es una ilustración esquemática de un modo de realización en el que el ligando (citocina) y el gen indicador de luciferasa Renilla (RL) son expresados por el mismo promotor. La luciferasa Renilla permanece en la célula mientras que la citocina expresada es secretada, interactuando con un receptor para el ligando de citocina que inicia la transducción de señal para promover la expresión de luciferasa de luciérnaga (FL) a partir de un promotor de respuesta-ligando citocina. La presencia de anticuerpos neutralizantes (NAb) para la citocina impide que la citocina interactúe con su receptor de superficie celular y el resultado es una reducción de la actividad de la citocina (determinada por la actividad relativa del indicador de luciferasa de luciérnaga de respuesta a citocina, FL1/RL (control) > FL2/RL).

[0045] La Figura 3 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga y un promotor citomegalovirus (CMV) que promueve la expresión del interferón α2a (IFNα2a) y el gen indicador de luciferasa de Renilla.

[0046] La Figura 4 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga y el promotor de expresión rápida mínima de citomegalovirus (CMV) que promueve la expresión del interferón α2a (IFNα2a) y el gen indicador de luciferasa de Renilla pero con el orden de expresión de IFNα2a y luciferasa de renilla invertidos con respecto al que aparece en la Fig. 3.

[0047] La Figura 5 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga y un elemento de respuesta a tetraciclina (Tet)/el promotor de expresión rápida CMV que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de Renilla y IFNα2a (Tet-On). A falta de tetraciclina o doxiciclina, el represor de Tet inverso (rTetR) se fija al TRE, silenciando la transcripción. También se ilustra la fijación del transactivador de tetraciclina inverso (rtTA) al TRE después de la adición de tetraciclina o doxiciclina que conduce a la activación de la transcripción.

[0048] La Figura 6 es una vista esquemática de dos constructos separados, un promotor mínimo ISRE/SV40 que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga y un elemento de respuesta a tetraciclina (Tet)/promotor de expresión rápida CMV que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de Renilla y IFNβ (Tet-On).

[0049] La Figura 7 es una vista esquemática de dos constructos independientes para un ensayo de gen indicador para NAb anti-TNFα, 5 repeticiones en tándem del promotor mínimo SV40/sitio de reconocimiento NFKB canónico que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga, y un promotor mínimo de expresión rápida CMV/elemento de respuesta Tet (TRE) que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de renilla y TNFα (Tet-On).

[0050] La Figura 8 es una vista esquemática de tres constructos independientes para un ensayo de gen indicador para Nabs antagonistas de anti-TNFα: 5 repeticiones en tándem del promotor mínimo SV40/sitio de reconocimiento NFΚB canónico que promueve la expresión del gen indicador de luciferasa de renilla; un promotor mínimo de expresión rápida CMV/elemento de respuesta Tet (TRE) que promueve la expresión del gen indicador CBRLuc y TNFα (Tet-On); y un promotor inducible de mifepristona quimérico que promueve la transcripción del gen indicador CBG68Luc y el antagonista de TNFα. El promotor quimérico inducible de mifepristona consiste en la secuencia TATA y GAL4-UAS del promotor mínimo E1b Adenovirus que es transcripcionalmente silencioso a falta de

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[0059] La Figura 17 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de doxiciclina en la expresión de la actividad de luciferasa de renilla y de luciérnaga en el ensayo de una fase. Las células del ensayo de una fase (PIL5C2.2) fueron tratadas con concentraciones variables de doxiciclina tal como se describe en Materiales y Métodos e incubadas durante la noche por duplicado. Las actividades de la luciferasa de renilla y de luciérnaga determinadas secuencialmente en el mismo pocillo utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo tal como se describe en Materiales y Métodos. Las células fueron lisadas a continuación añadiendo 75 µl/pocillo del sustrato de luciferasa de luciérnaga conteniendo reactivo, y se determinó la actividad de luciferasa de luciérnaga tal como se describe en Materiales y Métodos. La actividad de luciferasa de renilla fue determinada a continuación después de añadir en el mismo pocillo 50µl de sustrato de luciferasa de renilla.

[0060] La Figura 18 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración variable de doxiciclina en las actividades de neutralización del suero humano en el ensayo de una fase. Las células del ensayo de una fase (PIL5C2.2) fueron tratadas con concentraciones variables de doxiciclina tal como se indica en la figura e incubadas durante la noche por duplicado con doxiciclina solo o con una dilución 1/20 de suero humano indicado en la figura. Las actividades de la luciferasa de renilla y de luciérnaga determinadas secuencialmente en el mismo pocillo utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo tal como se describe en Materiales y Métodos. Las células fueron lisadas a continuación añadiendo 75 Letra µl/pocillo del sustrato de luciferasa de luciérnaga conteniendo reactivo, y se determinó la actividad de luciferasa de luciérnaga tal como se describe en Materiales y Métodos. La actividad de luciferasa de renilla fue determinada a continuación después de añadir en el mismo pocillo 50µl de sustrato de luciferasa de renilla. La actividad neutralizante de la muestra NAb fue determinada a continuación a partir del ratio de la actividad de luciferasa de luciérnaga de la muestra conteniendo NAb (FL2) normalizada con respecto a la expresión de luciferasa de renilla (RL2) y la actividad de luciferasa de luciérnaga de la muestra de control (FL1) normalizada con respecto a la expresión de luciferasa de renilla de la muestra de control (RL1): (FL2/RL2)/(FL1/RL1).

[0061] Las Figuras 19A y 19B son gráficos que muestran la cuantificación de NAb utilizando una concentración de IFN constante (100 IU/ml) contra concentraciones de suero variables (Fig. 19A) o concentración de IFN variable contra concentración de suero constante (1/100) (Fig. 19B). Diluciones seriadas de suero humano fueron incubadas por duplicado durante 1 hora a 37°C seguidas de 2 horas a 4ºC con una cantidad constante (10 LU/ml) de un IFNα2 tal como se describe en Materiales y Métodos (Figura 19A), o una dilución constante de suero (1:100) fue incubada en las mismas condiciones con diluciones seriadas de IFN (Figura 19B). Luego se determinó la actividad IFN residual utilizando el ensayo de gen indicador PIL5 tal como se describe en Materiales y Métodos. La preparación de IFN utilizada en cada test de neutralización fue también valorada simultáneamente para determinar su actividad IFN precisa en el ensayo de ese día. La dilución más baja del suero sometido a prueba fue también valorada sola para determinar la presencia de toxicidad o actividad IFN. El título neutralizante fue determinado utilizando la metodología Kawade (Grossberg et al., 2001b; y Lallemand et al., 2008) que determina el recíproco de la dilución de anticuerpos que reduce la actividad IFN de 10 a 1,0 LU/ml y expresada como TRU/ml tal como se describe en Materiales y Métodos. Los títulos de neutralización fueron corregidos en el número real de LU/ml de IFN utilizados en el ensayo de neutralización a partir del valor obtenido en la valoración simultánea de IFN.

[0062] Las Figuras 20A-20C son gráficos que comparan la determinación del título neutralizante utilizando diferentes métodos/ensayos. El título neutralizante de una serie de sueros humanos fue determinado por el método de anticuerpos constantes utilizando el ensayo de gen indicador y los resultados fueron comparados con los obtenidos para los mismos sueros determinados utilizando el ensayo de una fase (Figura 20A). El título neutralizante de la misma serie de sueros humanos fue determinado por el método IFN constante utilizando el ensayo CPE tal como se describe en Materiales y Métodos y los resultados fueron comparados con los obtenidos para los mismos sueros determinados utilizando el ensayo de gen indicador y el método de anticuerpos constantes (Figura 20B). El título neutralizante de la misma serie de sueros humanos fue determinado por el método IFN constante utilizando el ensayo CPE tal como se describe en Materiales y Métodos y los resultados fueron comparados con los obtenidos para los mismos sueros determinados utilizando el ensayo de una fase (Figura 20B).

Descripción detallada de la invención

[0063] Los ensayos convencionales basados en células para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes (NAbs) son imprecisos, dan resultados variables y a menudo requieren dos o más días para ser completados. Además, los ensayos convencionales basados en células requieren personal especializado e instalaciones de contención biológica, son trabajosos y difíciles de automatizar. El uso de células congeladas con división detenida transfectadas con un gen indicador controlado por un promotor quimérico de respuesta a ligando (WO 2004/039990 y US 2004/023517) en un ensayo de anticuerpos neutralizantes permitiría cuantificar NAbs anti-ligando con precisión en pocas horas. Aunque dicho ensayo superaría muchas de las limitaciones de los ensayos de neutralización basados en células convencionales, seguiría siendo relativamente trabajoso y requeriría incluir en el ensayo diluciones seriadas de la muestra de prueba y del ligando, controles positivo y negativo y reactivos de referencia. Además, la precisión del ensayo se ve negativamente afectada por la pérdida de células de ensayo (o excedente de ligando o NAb después de la dilución seriada). Dichos ensayos también siguen siendo relativamente difíciles de automatizar.

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de/anticuerpo contra el ligando extracelular) la actividad de transducción de señal de una proteína de superficie celular, y para el que los anticuerpos neutralizantes generados de la misma en el sujeto mamífero tratado con el agente terapéutico serían indeseables. El ligando extracelular también puede abarcar componentes de moléculas o preparaciones tales como virus vivos o atenuados o vacunas bacterianas, cuyos componentes interactúan con receptores de reconocimiento de patrones. Ejemplos preferentes no excluyentes de ese ligando extracelular incluyen citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento, como interferon-α, interferon-β, interferon-γ, eritropoietina (EPO), TNFα, interleucinas, hormona del crecimiento, factor de estimulación de la colonia de granulocitos (GM-CSF); gonadotropinas, insulina y otras hormonas; integrinas; inmunoglobulinas (policlonales, monoclonales, quiméricas, humanizadas o de cadena sencilla, etc.) y otras proteínas que interactúan con una molécula de superficie celular o con un receptor de reconocimiento de patrón para transmitir una señal al núcleo. Ejemplos no excluyentes de antagonistas (es decir, anticuerpos) del ligando extracelular, al que se fijan los anticuerpos neutralizantes, incluyen antagonistas de TNFα como Enbrel y Infliximab (un anticuerpo quimérico), Adalimumab (un anticuerpo totalmente humano) y Etanercept (una proteína de fusión del receptor IgGlFc TNFp75.

[0070] Los ensayos de anticuerpos neutralizantes (NAb) son muy importantes clínicamente hoy porque aquellos pacientes que son tratados continuamente de una enfermedad crónica, como la EM recurrente/remitente tratada con interferón, dejan de obtener beneficios del tratamiento con el agente terapéutico una vez que se ha producido una respuesta inmune, en particular la producción de NAbs, contra el agente terapéutico por parte del paciente. Por lo tanto, es importante ser capaces de detectar cuándo y si un paciente ha desarrollado NAbs a fin de detener el tratamiento en ese punto. Igualmente, impediría la posibilidad de reacciones adversas como choque anafiláctico y reacciones a la perfusión, y permitiría al paciente ser tratado con una terapia eficaz alternativa. Además, las pruebas NAb pueden aportar considerables ahorros de costes al asegurador/proveedor de atención sanitaria y al paciente al evitar el uso continuado de un biofarmacéutico caro e ineficaz.

[0071] La proteína de superficie celular a partir de cuya actividad de transducción de señal, en respuesta a una señal extracelular de un agente o proteína terapéuticos, se regula la expresión de un producto génico indicador puede ser cualquier proteína de superficie celular que sea conocida por los expertos en la técnica o que pueda ser identificada por los expertos en la técnica. Proteínas de superficie celular incluyen, sin ánimo exhaustivo, receptores de superficie celular y canales de iones. Ejemplos no excluyentes de receptores de superficie celular incluyen receptores de citocinas (por ej. receptores para interferón tipo I, interferón tipo II, interleucinas, hormona del crecimiento, eritropoietina (EPO), factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de la colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), TNFα, TGFβ, ligando Fas, factor inhibidor de leucemia (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF),etc.), receptores de factores de crecimiento, receptores de antígenos, receptores de complementos y neuroreceptores. El texto de referencia, J.M. Cruse y Robert E. Lewis, Atlas of Immunology, CRC Press, Washington, DC, 1999, revela muchos receptores implicados en la respuesta inmunitaria e interacciones del sistema inmunitario. Los receptores de superficie celular también incluyen, sin ánimo exhaustivo, receptores muscarínicos (por ej., M2 humano (entrada en GenBank #M16404); M3 de rata (entrada en GenBank # M16407); M4 humano (entrada GenBank # M16405); M5 humano (Bonner et al., 1988); y similares); receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (por ej., subtipos α2, α3 y β2); subunidad α2 de rata (Wada et al., 1988); la subunidad α3 de rata (Boulter et al., 1986); la subunidad α4 de rata (Goldman et al., 1987); la subunidad α5 de rata (Boulter et al., 1990; la subunidad β2 de rata (Deneris et al., 1988); la subunidad β3 de rata (Deneris et al., 1989); la subunidad β4 de rata (Duvoisin et al., 1989); combinaciones de subunidades α de rata; subunidades β y subunidades α y β; receptores GABA (por ej. subunidades α1 y β1 bovinas (Schofield et al. 1987); subunidades α2 y α3 bovinas (Levitan et al., 1988); la subunidad γ (Pritchett et al., 1989); las subunidades β2 y β3 (Ymer et al., 1989); la subunidad δ (Shivers, B.Dm 1989); y similares); receptores de glutamato (por ej. receptor aislado de cerebro de rata (Hollmann et al., 1989); y similares); receptores adrenérgicos (por ej. β1 humano (Frielle et al., 1987); α2 humano (Kobilka et al., 1987); hámster (32 (Dixon et al., 1986); y similares); receptores de dopamina (por ej. D2 humano (Stormann et al., 1990); rata (Bunzow et al., 1988); y similares); receptores NGF (por ej. receptores NGF humanos (Johnson et al., 1986); y similares); receptores de serotonina (por ej. 5HT1a (Kobilka et al., 1987); 5HT2 de rata (Julius et al., 1990); 5HT1c de rata (Julius et al., 1988); y similares).

[0072] El receptor de reconocimiento de patrones del que su actividad de transducción de señal, en respuesta a una señal extracelular de un componente de una molécula o preparación como virus atenuado o vivo o vacuna bacteriana regula la expresión de un producto génico indicador, incluye sin ánimo exhaustivo receptores tipo Toll (TLR), receptores de membrana endosomal y de superficie celular (Uematsu y Akira, 2007) o las proteínas receptoras citosólicas de tipo gen I (GIG-I) inducibles por ácido retinoico RIG-I, MDA5, y LGP2 (Yoneyama y Fujita, 2007) que reconocen o interactúan con componentes de virus atenuados o vivos o vacunas bacterianas. La evaluación de anticuerpos neutralizantes generados en el sujeto mamífero tratado con la vacuna es importante para determinar el grado de protección conseguido por vacunación.

[0073] Trece miembros de la familia TLR han sido identificados en mamíferos (Uematsu y Akira, 2007). Cada TLR media en una respuesta característica en asociación con diferentes combinaciones de cuatro proteínas adaptadoras que contienen dominio (TIR) receptores Toll/IL-1 (MyD88, TRIF, TIRAP/MAL, y TRAM). Todos los TLRs excepto TLR3 interactúan con MyD88. TLR3, que reconoce ARN viral de una cadena o de doble cadena, está localizado en los endosomas de DCs mieloides y requiere la acidificación de vesículas para su activación. TLR3 señaliza vía TRIF y activa TBK1/IKKε que fosforila el factor regulador de interferones 3 (IRF3) y NFkB, con el resultado de producción

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de IFN β (Hemmi et al, 2004, Perry et al., 2004). Las proteínas receptoras de tipo RIG-I son helicasas de ARN DExD/H box dos de las cuales, RIG-I y MDA5, comportan activación de caspasa.

[0074] Los canales de iones incluyen, pero de manera no excluyente, canales de iones de calcio (por ej. subunidad α2 neuronal humana (ver W089/09834); subunidad α1 músculo esquelético de conejo (Tanabe et al. 1987); subunidad α2 músculo esquelético de conejo (Ellis et al., 1988); subunidad β músculo esquelético de conejo (Ruth et al., 1989); subunidad γ músculo esquelético de conejo (Jay et al., 1990); y similares); canales de iones de potasio (por ej. cerebro de rata (BK2) (McKinnon, D., 1989); cerebro de ratón (BK1) (Tempel et al., 1988); y similares); canales de iones de sodio (por ej. cerebro de rata I y II (Noda et al., 1986); cerebro de rata III (Kayano et al., 1988); y otros).

[0075] Será apreciado por los expertos en la técnica que la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones indicados más arriba sean preferentemente endógenos a la célula de la presente invención. Sin embargo, también será apreciado que la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones puedan ser expresados a partir de ADN clonado, para complementar el número de receptores de reconocimiento de patrones o el número de proteínas de superficie celular en la superficie de la célula, o la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones puedan ser expresados a partir de ADN clonado pero es una proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones que es heterólogo para la célula anfitriona.

[0076] Para la transducción de señal, la señal intracelular que es transducida es iniciada por la interacción específica de una señal extracelular con un receptor o un canal de iones presente en la superficie de la célula. Esta interacción pone en movimiento una cascada de eventos intracelulares, incluyendo una señal específica del ligando en el núcleo de la célula, cuya consecuencia última es un cambio rápido y detectable en la expresión del producto génico, que en la célula de la presente invención es preferentemente un producto génico indicador. La señal extracelular o molécula efectora es cualquier compuesto o sustancia que actúa como ligando para alterar específicamente la actividad de una proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones. Ejemplos de dichas señales incluyen, sin ánimo excluyente, moléculas como citocinas (es decir, interferones), factores de crecimiento, hormonas, endorfinas, neurotransmisores, acetilcolina y sustancias mitogénicas, como acetato de forbol mirístico (PMA), que se fijan a receptores de superficie celular y canales de iones y modulan la actividad de dichos receptores y canales. Otros ejemplos incluyen componentes de virus atenuados y vivos y vacunas bacterianas.

[0077] Los constructos de ADN transportados por la célula según la presente invención son constructos de ADN que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico indicador operativamente unido a elementos/secuencias de control transcripcional. La transcripción del gen indicador está controlada por estas secuencias. La actividad de al menos una o más de estas secuencias de control está directa o indirectamente regulada por la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones. Las secuencias de control transcripcional incluyen sin ánimo exhaustivo promotores y otras regiones reguladoras, como secuencias potenciadoras y sitios de fijación de activadores y represores, que modulan la actividad del promotor o secuencias de control que modulan la actividad o eficiencia de la polimerasa de ARN que reconoce al promotor, o secuencias de control que son reconocidas por moléculas efectoras, incluyendo aquellas que son específicamente inducidas por interacción de una señal extracelular con una proteína de superficie celular o un receptor de reconocimiento de patrones. Por ejemplo, la modulación de la actividad del promotor puede verse afectada por la alteración de la unión de la polimerasa de ARN a la región promotora, o, de manera alternativa, por interferir en el inicio de transcripción o extensión del mARN. Tales secuencias son denominadas colectivamente aquí como elementos o secuencias de control transcripcional. Además, los constructos pueden incluir secuencias de nucleótidos que alteran la translación del mARN resultante, alterando así la cantidad de producto génico indicador expresado.

[0078] Un promotor que es regulado o mediado por la actividad de una proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones es un promotor cuya actividad cambia cuando una célula es expuesta a una señal extracelular particular (ligando) en virtud de la presencia de proteínas de superficie celular o receptores de reconocimiento de patrones cuyas actividades se ven afectadas por la señal extracelular. Por ejemplo, el promotor cfos es específicamente activado por la interacción específica de ciertas señales extracelulares, como hormonas de crecimiento, con una proteína de superficie celular, como un receptor de hormona de crecimiento. En particular, la regulación de tales promotores por la proteína de superficie celular, aunque indirecta, se produce a los pocos minutos de la interacción de la proteína de superficie celular con la señal extracelular. Como se utiliza aquí, el acoplamiento operativo se refiere al acoplamiento de un elemento de control transcripcional, es decir, un promotor, a una secuencia de codificación de nucleótidos de manera que el elemento de control transcripcional queda correctamente posicionado para su actividad de fijarse a polimerasa de ARN e iniciar la transcripción de la secuencia de codificación de nucleótidos. Por lo tanto, una secuencia de codificación de nucleótidos en acoplamiento operativo con un promotor se produce aguas abajo, con respecto a la dirección de transcripción del promotor, está en el marco de lectura correcto con respecto al sitio de inicio de transcripción e insertado de manera que la extensión de la transcripción transcurre a través de la secuencia de codificación de nucleótidos.

[0079] Se puede obtener o derivar elementos de control transcripcional adecuados de las regiones reguladoras transcripcionales de genes cuya expresión es inducida rápidamente, por lo general a los pocos minutos de contacto

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entre la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones y el ligando efector que modula la actividad de la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones. Ejemplos de dichos genes incluyen pero no se limitan a los genes de expresión rápida (Sheng et al., 1990), como c-fos. Los genes de expresión rápida son genes que son rápidamente inducidos al unir un ligando a una proteína de superficie celular. Los elementos de control transcripcional que son preferibles para utilizar en los constructos de ADN (gen indicador) incluyen elementos de control transcripcional de genes de expresión rápida, elementos derivados de otros genes que exhiben algunas o todas las características de genes de expresión temprana, o elementos sintéticos que se construyen de forma que dichos genes en acoplamiento operativo exhiban dichas características. Las características de genes preferidos a partir de los cuales se derivan elementos de control transcripcional incluyen, sin ánimo exhaustivo, expresión baja o indetectable en células quiescentes, inducción rápida a nivel transcripcional a los pocos minutos de estimulación extracelular, inducción que es pasajera e independiente de nuevas síntesis de proteínas, la detención subsiguiente de la transcripción requiere nueva síntesis de proteínas y mARNs transcritos a partir de estos genes tienen una vida media corta. No es necesario que estén presentes todas estas propiedades.

[0080] Promotores y elementos de control transcripcional adecuados incluyen, pero sin ánimo exhaustivo, el promotor citomegalovirus (CMV), promotor de virus de simio 40 (SV40) y promotores mínimos del mismo, el promotor génico del péptido intestinal vasoactivo (VIP) (de respuesta a cAMP); Fink et al., 1988); el promotor génico de somatostatina (de respuesta a cAMP; Montminy et al., 1986); el promotor de proencefalina (de respuesta a cAMP, agonistas nicotínicos y ésteres de forbol; Comb et al., 1986); el promotor génico fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (de respuesta a cAMP; Short et al., 1986); el promotor génico NGFI-A (de respuesta a NGF, cAMP y suero; Changelian et al., 1989); los elementos de control transcripcional obtenidos o derivados del gen c-fos; y otros que pueden ser conocidos o preparados por los expertos en el campo.

[0081] El protooncogén c-fos es el homólogo celular del gen transformador del virus del osteosarcoma FBJ. Codifica una proteína nuclear que participa muy probablemente en el crecimiento y diferenciación celular normal. La transcripción de c-fos es rápida y transitoriamente activada por factores de crecimiento y por inductores de otras proteínas de superficie celular, incluyendo hormonas, agentes específicos de diferenciación, estrés, mitógenos y otros inductores conocidos de proteínas de superficie celular. La activación es independiente de la síntesis de proteínas. Los elementos reguladores de c-fos incluyen un TATA box necesario para iniciar la transcripción, dos elementos ascendentes para transcripción basal y un potenciador, que incluye un elemento con simetría diádica y que es necesario para inducción por TPA, suero, EGF y PMA. El elemento potenciador transcripcional 20 bp situado entre -317 y -298 corriente arriba del sitio cap mARN de c-fos, que es esencial para la inducción del suero en células NIH 3T3 privadas de suero. Uno de los dos elementos corriente arriba está situado en -63 y -57 y se parece a la secuencia de consenso para la regulación de cAMP.

[0082] Los elementos de control transcripcional, particularmente cuando se refieren a un modo de realización preferente de la presente invención donde el interferón de tipo I y/o tipo II es la señal extracelular, son preferentemente un elemento de respuesta a la estimulación con IFN (ISRE) y/o una secuencia activada por gamma (GAS. Hay una serie de ISREs caracterizados a partir de diferentes genes humanos que responden a interferón de tipo I y una secuencia de consenso, ggraaagwGAAActg /SEQ ID NO: 1; las letras mayúsculas denotan la secuencia principal; lo subrayado alta conservación), a la que se une el complejo STAT1/STAT2/IRF9, fue identificada para ISRE (Levy et al., 1988). Un ISRE preferente procede del gen humano ISG15 y se presenta como SEQ ID NO: 2 donde los nucleótidos 41-55 corresponden a la secuencia ISRE de consenso. ISRE es también altamente conservado entre especies. Por ejemplo, una secuencia presente en la región promotora del gen Mx de pollo inducible por interferón (Schumacher et al., 1994) es similar a la encontrada en primates y se conforma a la secuencia de consenso ISRE para genes de respuesta al interferón de mamíferos incluyendo roedores y vacas (ver Fig. 2 de Perry et al., 1999).

[0083] Con respecto a GAS, a la que se une el homodímero STAT1 en genes de respuesta a interferón tipo II, se identificó una secuencia de consenso, nnnsanttccgGGAAntgnsn (SEQ ID NO: 3; letras mayúsculas denotan secuencia central; lo subrayado denota alta conservación); a partir de muchas secuencias de fijación seleccionadas (Horvath et al, 1995).

[0084] En el ejemplo en el que el interferón de tipo I o de tipo II es la señal de ligando extracelular, una combinación preferente de elementos de control transcripcional es un promotor quimérico de respuesta a interferón en el que un ISRE y/o GAS controla un promotor mínimo SV40 operativamente acoplado a una secuencia de nucleótidos que codifica un primer producto génico indicador como primera etiqueta mensurable.

[0085] Cuando el ligando extracelular es TNFα, una combinación preferente de elementos de control transcripcional es un promotor quimérico de respuesta a TNFα en el que repeticiones (es decir, 5 repeticiones en tándem; SEQ ID NO: 11) del sitio de reconocimiento de NFΚcB controla un promotor mínimo SV40 operativamente acoplado a una secuencia de nucleótidos que codifica un primer producto génico indicador.

[0086] Cuando el ligando extracelular es eritropoyetina (EPO), una combinación preferente de elementos de control transcripcional es un promotor quimérico de respuesta a EPO en que repeticiones del transductor de señal y activador de secuencia de transcripción #5 (STAT5) (5 repeticiones en tándem) es

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tcgagTTCGAAGAAaacTTCTTGGAAgaTTCCTGGAgcTTCTAG GAAgaTTCCGGGAA (SEQ ID NO: 4), donde la secuencia en letras mayúsculas representa variantes de la secuencia de consenso STAT5), a través de la cual EPO envía señales desde su receptor de superficie celular al núcleo, controla un promotor mínimo SV40 operativamente acoplado a una secuencia de nucleótidos que codifica como un primer producto génico indicador.

[0087] El primer producto génico indicador (también conocido aquí como primera etiqueta mensurable), cuyo nivel es una medida de la presencia y/o del nivel de un ligando extracelular que activa la actividad de transducción de señal de una proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones, puede ser ARN o proteína, siempre que sean fácilmente detectables, aunque es preferible una proteína. Por ejemplo, las luciferasas, como la luciferasa de luciérnaga, luciferasa de renilla, luciferasa Gaussia y luciferasa Metridia, la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y aequorina de medusa son modos de realización preferentes de productos génicos indicadores (etiquetas mensurables) en la célula según la presente invención. En el caso de las enzimas luciferasa de luciérnaga (deWet et al., 1987) y otras luciferasas y aequorina de medusa (Rider et al., 2003), el resultado de su actividad enzimática, la luz, es detectada y medida con un luminómetro, mientras que en el caso de EGFP, se puede utilizar un analizador o distribuidor celular activado por fluorescencia (FACS) que puede ser utilizado a una longitud de onda adecuada para detectar y cuantificar la cantidad de EGFP expresada en una célula. La curva de distribución de la cantidad de luciferasa, aequorina o EGFP expresada en una muestra de células estará determinada por la cantidad de ligando al que está expuesta la célula en el entorno externo inmediato que rodea la célula. Ejemplos no excluyentes de otros productos génicos indicadores adecuados incluyen dsRED, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (Alton et al., 1979) otros sistemas de detección de enzimas, como β-galactosidasa, luciferasa bacteriana (Engebrecht et al., 1984 y Baldwin et al., 1984), fosfatasa alcalina (Toh et al. 1989) y Hall et al. 1983), y β-lactamasa bacteriana o humanizada (Zlokarnik et al., 1998).

[0088] El segundo producto génico indicador (también conocido como segunda etiqueta mensurable), cuyo nivel es una medida del nivel del ligando, expresado junto con el segundo producto génico indicador (y en un cistrón separado del mismo promotor) y secretado en el entorno externo inmediato que rodea la célula y siendo capaz dicho ligando de activar la actividad de transducción de señal de un receptor/proteína de superficie o un receptor de reconocimiento de patrones. El segundo producto génico indicador puede ser cualquiera de los mencionados arriba con respecto al primer producto génico indicador salvo en que el primero y segundo productos génicos indicadores deben ser diferentes entre sí para que un producto génico indicador pueda ser medido independientemente en presencia del otro, y viceversa. El término "cistrón" se utiliza con el significado normalmente entendido en la técnica como un segmento de ADN que codifica un único polipéptido pero expresado a partir de la misma serie de uno o más elementos de control de transcripción (es decir, promotor) que el segundo producto génico indicador.

[0089] Cuando la célula se va a utilizar para determinar anticuerpos neutralizantes en un antagonista/anticuerpo de un ligando (por ej. antagonistas de TNFα como Eubrel, Infliximab, Adalimumab, Etanercept, etc.), la célula llevará además un tercer constructo que incluye un segmento que codifica un tercer producto génico indicador (tercera etiqueta mensurable) impulsado por una tercera serie de uno o más elementos de control de transcripción diferente de la primera y segunda serie de elementos de control de transcripción en el primer y segundo constructos. Este producto génico indicador se expresa junto con un antagonista de ligando (en un cistrón separado promovido por el mismo promotor/elementos de control de transcripción) y cuyo nivel es una medida del nivel del antagonista de ligando expresado. El antagonista de ligando es expresado y secretado en el entorno externo inmediato que rodea la célula junto con el ligando expresado por el segundo constructo. El nivel de actividad de ligando mensurable es una medida de la cantidad de anticuerpos neutralizantes del antagonista de ligando que impiden al antagonista de ligando inhibir la actividad de señalización del ligando. El tercer producto génico indicador puede ser cualquiera de los mencionados arriba con respecto al primero y segundo productos génicos indicadores, incluyendo preferentemente un gen indicador CBG68Luc, salvo en que el tercer producto génico indicador y el primero y segundo productos génicos indicadores deben ser diferentes entre sí para que cada producto génico indicador pueda ser medido de forma independiente en presencia de los otros dos.

[0090] En el caso de ligandos extracelulares que inhiben la proliferación de células, inducen apoptosis o inducen la regulación negativa del receptor, la expresión del ligando es controlada por una serie de uno o más elementos de control de transcripción que es inducible (es decir, no hay expresión a menos que haya un inductor presente). Ello impediría la actividad inhibitoria indeseable del ligando extracelular mientras la célula está creciendo o antes de que la célula esté lista para ser utilizada en un ensayo basado en células. Otro ejemplo en el que los elementos de control de transcripción inducibles son deseables para expresar el ligando es cuando la célula se utiliza en un ensayo basado en células en el que se trata de determinar solo el nivel del ligando extracelular en una muestra, sin que dicho ligando sea producido a partir de la segunda serie de uno o más elementos de control de transcripción, en lugar del nivel de anticuerpos neutralizantes del ligando extracelular. En caso de que un antagonista de ligando deba ser expresado en un antagonista de ligando debe ser expresado en un tercer constructo, la expresión del antagonista de ligando se controla preferentemente por una serie de uno o más elementos de control de transcripción que es inducible.

[0091] Promotores inducibles y otros elementos de control transcripcional, algunos de los cuales se mencionan más arriba, son bien conocidos en el sector. Un elemento preferente de control transcripcional inducible bien conocido para su uso en el control de la expresión del ligando y un producto génico indicador es un elemento de respuesta a

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tetraciclina del sistema de expresión génica Tet-On/Tet-Off (como el de Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Este elemento, al que se fija un represor de tetraciclina inverso (rTetR; un versión mutada del represor de tetraciclina), inhibiendo así la transcripción de la construcción Tet-On, se coloca corriente arriba de un promotor mínimo preferentemente, como el promotor mínimo de expresión rápida del citomegalovirus (CMV). En presencia de un inductor, por ej., tetraciclina o doxiciclina, la versión mutada del TetR (rTetR) se convierte en un transactivador inverso controlado por tetraciclina (rtTA) y se fija a TRE permitiendo que comience la transcripción.

[0092] En otro modo de realización, el promotor inducible es un promotor Tet-0ff en el que el TetR se fija a TRE, silenciando la transcripción en presencia de tetraciclina o doxiciclina. Después de la eliminación de tetraciclina o doxiciclina, el transactivador controlado por tetraciclina (tTA) se fija a TRE, activando así la transcripción.

[0093] Un modo de realización de la célula según la presente invención deriva de la línea celular promonocítica humana U937 transfectada con el gen indicador de luciferasa de luciérnaga controlado por un promotor quimérico de respuesta a interferón que contiene un promotor mínimo SV40 y el ISRE del gen ISG 15 tal como se ha descrito previamente en WO 2004/039990 y US 2004/023517, que se incorporan aquí como referencia y se muestra en la Fig. 3. Estas células fueron transfectadas a continuación con el vector 5991 bp pIRES/IFNA2/hRL (SEQ ID NO: 5) que comprende la secuencia de codificación del gen IFN α2a (nucleótidos 1-586 de SEQ ID NO:5), IRES (Internal Ribosome Entry Site; SEQ ID NO: 6) de citomegalovirus (CMV), junto con la secuencia de codificación del gen indicador de luciferasa de renilla (nucleótidos 1532-2484 de SEQ ID NO:5), bajo el control de un promotor CMV constitutivo (nucleótidos 5282-5991 de SEQ ID NO: 1) tal como se indica en la Fig. 3. Por lo tanto, esta construcción permite que la transcripción de ARN primario sea trasladada a dos proteínas nativas distintas (IFNα2a y luciferasa de Renilla) para conservar la estructura terciaria de la proteína IFNα2a humana y por lo tanto, su reconocimiento por anticuerpos anti-IFNα.

[0094] En un modo de realización preferente de la célula de la presente invención, el gen indicador de luciferasa de Renilla fue clonado corriente arriba del IRES y el gen IFNα2a humano (Fig. 4) a fin de incrementar los bajos niveles de expresión génica de renilla observados cuando el gen IFNα2a humano u otros genes IFN tipo I humanos (es decir, IFNβ), fue clonado corriente arriba del gen indicador de luciferasa de renilla.

[0095] En un segundo modo preferente de realización de la célula de la presente invención, el gen indicador de luciferasa de renilla y el gen IFNα2a humano fueron expresados bajo el control de un promotor inducible a fin de impedir que la expresión continuada de IFNs tipo I humanos inhibiera la proliferación celular y por lo tanto impidiera el cultivo de la línea celular transfectada. Por lo tanto, el gen indicador de luciferasa de renilla y el gen IFNα2a humano fueron expresados bajo el control de un promotor CMV (Fig. 5), cuya expresión es inducida en presencia de doxiciclina o tetraciclina (Tet-On).

[0096] En un tercer modo preferente de realización de la célula de la presente invención, el gen indicador de luciferasa de renilla y el gen IFNβ1a humano fueron expresados bajo el control de un promotor CMV Tet-On (Fig. 6).

[0097] En otro modo de realización de la célula de la presente invención, el gen indicador de luciferasa de renilla y el gen TNFα humano fueron expresados bajo el control de un promotor CMV Tet-On (Fig. 7). El uso de un promotor inducible es esencial para la expresión del TNFα, cuya producción incontrolada induciría apoptosis en las células anfitrionas sensibles a TNFα. La secuencia de 5 repeticiones en tándem del sitio de reconocimiento NFKB canónico utilizado en el otro constructo en la Fig. 7 para promover la expresión de luciferasa de luciérnaga en combinación con un promotor mínimo SV40 es SEQ ID NO: 11.

[0098] En otro modo más de realización de la célula de la presente invención, el gen indicador de luciferasa de renilla y el gen de eritropoyetina humano son expresados bajo el control de un promotor CMV Tet-On (Fig. 9). El uso de un promotor inducible es esencial para la expresión de EPO, cuya producción continua provocaría regulación negativa de receptores específicos de EPO en las células anfitrionas sensibles a EPO.

[0099] En otro modo más de realización de la célula de la presente invención, el gen indicador de luciferasa de renilla se expresa bajo el control de un promotor quimérico consistente en 5 repeticiones en tándem del sitio de reconocimiento NFKB canónico/promotor mínimo SV40. Además, el gen indicador CBRLuc y TNFα se expresan ambos bajo el control de un elemento de respuesta a Tet (TRE)/promotor mínimo de expresión rápida CMV (Tet-On) como segundo constructo, y el antagonista TNFα de interés y el gen indicador CBG68Luc se expresan en un tercer constructo bajo el control de un promotor inducible diferente como el promotor inducible de mifepristona quimérico. En este sistema, la secuencia TATA y GAL4-UAS se expresan a partir del promotor mínimo E1b Adenovirus que es transcripcionalmente silencioso a falta de activación. El dominio de fijación al ADN Gal4 que une la proteína reguladora al promotor GAL4-Elb y el dominio de fijación al ligando receptor de progesterona humana truncado (hPR-LBD) que experimenta un cambio de conformación cuando fija la mifepristona antagonista de progesterona se expresan a partir de un promotor TK mínimo en el vector. Por lo tanto, al añadir mifepristona, el antagonista se fija a la región hPR-LBD del vector provocando un cambio de conformación en la proteína reguladora con el resultado de la transcripción del antagonista TNFα y el gen indicador CBG68Luc (Fig. 8).

[00100] A fin de hacer que la célula según la presente invención sea de un solo uso que no pueda ser propagada

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negativamente a su sensibilidad a IFN. Después de ser tratada con un agente anti-mitótico o pro-apoptótico, una célula puede alcanzar una larga vida media incluso temperaturas de congelación estándar de -20ºC si se trata además con DMSO y una vez descongelada dicha célula seguirá estando activa, es decir, para ensayos de transducción de señales utilizados para determinar la cantidad de ligandos o anticuerpos neutralizantes del ligando o de un anticuerpo anti-ligando, durante aproximadamente 24 horas hasta que sufra apoptosis como resultado de ser tratada con un agente anti-mitótico o pro-apoptótico. Cualquier agente anti-mitótico o pro-apoptótico que mate células durante el proceso de replicación al inducir apoptosis, como radiación gamma o agentes químicos como vinblastina, 5-FU, cisplatina, doxorubicina, o un agente intercalante anti-tumoral (es decir, mitomicina C) puede ser utilizado para este propósito ya que se espera que las células permanezcan biológicamente activas durante un periodo quiescente transcurrido el cual las células empiezan a morir.

[00106] La célula transformada tratada (transformada con el primero, segundo y, opcionalmente, tercer constructo de ADN) se congela a una temperatura y en condiciones tales que reanudará la transducción de señales después de la descongelación. Aunque la célula se descongela preferentemente a una temperatura entre -20ºC y -200ºC, más preferiblemente a -80ºC, las células pueden ser posteriormente almacenadas a -20ºC, una temperatura de congelación normalmente disponible en casi todos los laboratorios, se pretende que se utilicen otras temperaturas adecuadas para la criopreservación de células, como la temperatura del nitrógeno líquido de unos -200ºC. Más preferentemente la célula transformada tratada es resuspendida en una solución que contenga un criopreservante antes de congelarla. El dimetilsulfóxido (DMSO) es el criopreservante preferido aunque se pueden utilizar otros criopreservantes adecuados que tengan una elevada afinidad de unión por el agua, como el etilenglicol, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol, butanodiol, propanediol, y formamida, siempre y cuando no afecten al uso de la célula después de la descongelación. Cuando se utiliza solo DMSO como criopreservante, la solución que contiene el DMSO contiene preferentemente un 10% aproximadamente de DMSO. De manera más preferente, se utiliza un 2,5% de DMSO combinado con un 10% de glicerol como criopreservante.

[00107] La célula según la presente invención es preferentemente una célula aviar o de mamífero, más preferentemente una célula humana y más preferentemente aún una célula promonocítica humana. Una célula promonocítica humana preferente que transporta el vector ISRE-luc que contiene el constructo de gen indicador de luciferasa de luciérnaga es una célula PIL5. Otras líneas de células preferentes incluyen sin ánimo exhaustivo, líneas de células humanas mieloides (es decir, U266R), linfoma de células T (es decir, Jurkatt), adenocarcinoma de mama (es decir, MCF7) y linfoma de ratón (es decir, L1210) y líneas de células de leucemia eritroide. La célula se trata para hacer una línea de células comercial que tenga las propiedades comercialmente deseables de una vida media suficiente a efectos del ensayo y para que sea una célula de un solo uso que no pueda ser propagada para más usos. Preferentemente, la célula se trata o bien 1) por irradiación con rayos gamma 6 12 Gy, más preferentemente 9 Gy, y almacenamiento a temperatura ambiente durante 14 días después de radiación o 2) por exposición a un agente anti-mitótico o pro-apoptótico, como vinblastina, cisplatina, o 5-fluorouracilo, más preferentemente vinblastina, durante 10 minutos a 37ºC antes de resuspenderla en una solución que contenga 40% de suero bovino fetal (FBS) y 2,5% de DMSO + 10% glicerol y congelación a -80ºC.

[00108] A fin de optimizar el método de obtener una célula con una vida media indefinida durante su almacenamiento congelada, pero que muera aproximadamente 24 horas después de descongelada (una vez descongelada, sin embargo, el producto tiene una sensibilidad, precisión así como selectividad excelentes), los parámetros que pueden variar en el curso de dicha optimización incluyen:

1) Concentración de FBS. Además de FBS, se puede utilizar cualquier suero ya que actúan como un sumidero tóxico para proteger a las células de las toxinas mientras están siendo descongeladas o mientras son tratadas con un agente anti-mitótico o pro-apoptótico. La concentración de FBS puede provocar que los resultados varíen.

2) El tiempo es una variable. La cantidad de tiempo de exposición a un agente químico anti-mitótico o proapoptótico, como vinblastina, antes de que las células sean centrifugadas y lavadas para eliminar el agente (es decir, la vinblastina).

3) Al utilizar la vinblastina como un ejemplo no excluyente, la fórmula de la vinblastina es importante. Actualmente, la vinblastina soluble en una fórmula pretamponada patentada vendida por Eli Lilly con el nombre de Velbe en Francia es la utilizada de forma preferente. Una fórmula diferente puede necesitar una combinación de parámetros ligeramente diferentes.

4) La concentración de vinblastina.

5) Concentración celular durante el tratamiento con vinblastina.

6) La cantidad de criopreservante o combinación de criopreservantes.

[00109] Todos estos parámetros pueden variar empíricamente así como los resultados después de congelación relativos a sensibilidad y precisión, asumiendo que las células permanecen vivas aproximadamente 24 horas

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después de descongeladas. Esto puede determinarse rápidamente por alguien con conocimientos básicos en la materia sin experimentación indebida, particularmente con las orientaciones suministradas en los experimentos que se muestran en las Figs. 11-24 para células PIL5 en WO 2004/039990 y US 2004/023517, a fin de obtener un producto que tenga sustancialmente la misma sensibilidad que las células vivas no tratadas durante un periodo de al menos una hora, preferentemente 8-24 horas, después de la descongelación pero que tengan una viabilidad de no más de 30 días, preferentemente no más de 14 días, más preferentemente no más de 5 días y más preferentemente aún no más de 3 días.

[00110] A continuación se ponen ejemplos de protocolos para la preparación de placas de ensayo de microtitulación y ampollas/viales de células PIL5 (como células modelo) tratadas con el agente anti-mitótico y pro-apoptótico vinblastina µg/ml durante 10 minutos a 37ºC antes de su almacenamiento congeladas a -20ºC y descongelación posterior a efectos de realizar el ensayo.

Preparación de Placas de Ensayo de Microtitulación

1.

Células PIL5 a una concentración de aproximadamente 2x105 a 7x105 células/ml en medio de cultivo RMPI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) son tratadas con una solución fresca de 1mg/ml de vinblastina (disponible en Eli Lilly bajo la fórmula pre-tamponada VELBE), diluida en 1mg/ml de H2O, durante 10 minutos a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2 en aire. Se puede utilizar una incubadora de CO2 por comodidad.

2.

Las células PIL5 son centrifugadas a 800 x g durante 10 minutos a 4ºC, y lavadas una vez con el mismo volumen de medio RPMI 1640 con 10% FBS para eliminar la vinblastina.

3.

Las células PIL5 son re-suspendidas a una concentración de 2x107 células/ml en medio RMPI 1640 con 40% de suero fetal bovino (FBS) y 2,5% de dimetilsulfóxido + 10% glicerol.

4.

La suspensión celular es repartida en los pocillos de una micro-placa de fondo plano para obtener

300.000 células por pocillo (equivalente a 25 ml de suspensión celular por pocillo).

5.

La micro-placa se congela a -80ºC en una bolsa de aluminio sellada al vacío con la tapa en lo más alto.

6.

Las micro-placas pueden ser almacenadas a continuación durante periodos limitados a -20ºC hasta su uso.

[00111] De manera alternativa, las células PIL5 a una concentración de 2x107 células/ml en medio RMPI 1640 con 40% de suero fetal bovino (FBS) y 2,5% de dimetilsulfóxido + 10% glicerol pueden ser congeladas a -80º C o -200ºC en un único o en múltiples viales criopreservantes. Inmediatamente antes del uso los viales se descongelan rápidamente y las células se distribuyen en una o más placas de microtitulación. Los viales también pueden ser preparados conteniendo suficientes células para media o un cuarto de placa de microtitulación, según sea necesario.

Preparación de Ampollas/Viales Criopreservantes

1.

Células PIL5 a una concentración de aproximadamente 2x105 a 7x105 células/ml en medio de cultivo RMPI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) son tratadas con una solución fresca de 1mg/ml de vinblastina (disponible en Eli Lilly bajo la fórmula pre-tamponada VELBE), diluida en 1mg/ml de H2O, durante 10 minutos a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2 en aire. Se puede utilizar una incubadora de CO2 por comodidad.

2.

Las células PIL5 son centrifugadas a 80 x g durante 10 minutos a 4ºC, y lavadas una vez con el mismo volumen de medio RPMI 1640 con 10% FBS para eliminar la vinblastina.

3.

Las células PIL5 son re-suspendidas a una concentración de 2x107 células/ml en medio RMPI 1640 con 40% de suero fetal bovino (FBS) y 2,5% de dimetilsulfóxido + 10% glicerol.

4.

La suspensión celular (1ml) es repartida en un vial criopreservante y congelado a -80%.

5.

El vial criopreservante puede ser almacenado posteriormente a -20ºC durante periodos limitados hasta su uso.

[00112] La presente invención también proporciona un método para utilizar una célula según la presente invención para determinar el nivel en una muestra de un ligando extracelular que inicia una señal específica de ligando en el núcleo (es decir, por transducción de señal desde un receptor de superficie celular o desde un receptor de reconocimiento de patrones) o el nivel de anticuerpos neutralizantes bien contra el ligando extracelular o un antagonista contra el ligando extracelular o el nivel de una forma soluble del receptor de ligando. El método incluye incubar la célula de la presente invención en una mezcla con una muestra en la que se busca determinar el nivel del

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ligando extracelular o el anticuerpo neutralizante. El nivel de la primera etiqueta mensurable (primer producto génico indicador, como luciferasa de luciérnaga en los modos de realización mostrados en los dibujos) en la muestra se determina con relación al nivel de la primera etiqueta mensurable en ausencia de la muestra para calcular el nivel en la muestra del ligando extracelular o el anticuerpo neutralizante.

[00113] La presente invención también proporciona un medio de detectar la presencia de medicamento residual en la muestra para determinar la presencia de NAbs anti-medicamentos. La presencia de medicamento residual puede hacer que los resultados de los ensayos de neutralización no se puedan interpretar. En el caso de pacientes tratados con un medicamento biofarmacéutico que es, por ejemplo, una forma recombinante de una citocina como IFNβ o un factor de crecimiento como EPO, la presencia del medicamento (IFNβ o un factor de crecimiento) en la muestra (suero u otro fluido biológico) en la que hay que determinar la presencia de NAbs anti-factor de crecimiento o anticitocinas puede ser determinada utilizando el método de la presente invención antes de llevar a cabo el ensayo de neutralización según la presente invención simplemente incubando en primer lugar la muestra con la célula de ensayo de la presente invención durante un tiempo adecuado (3 a 6 horas). La activación de luciferasa de luciérnaga, en ausencia de adición de tetraciclina o doxiciclina, indicará la presencia de medicamento residual. El grado de activación de la luciferasa de luciérnaga permitirá cuantificar el nivel de medicamento residual. El medicamento residual puede ser eliminado a continuación mediante el procedimiento adecuado. Por ejemplo, en el caso de IFNβ, el medicamento puede ser separado de cualquiera de los anticuerpos presentes en la muestra utilizando un tamiz molecular con un columna por afinidad anti-IFNβ o punto límite de 20 a 30 kDa. De manera alternativa, los NAbs anti-IFN pueden ser retirados de la muestra utilizando una columna por afinidad con proteínas G o proteínas A.

[00114] La muestra se puede analizar a continuación para determinar la presencia de NAbs anti-IFN después de activar el constructo de luciferasa de renilla-ligando en presencia de tetraciclina o doxociclina.

[00115] En el caso de antagonistas de TNFα como Infliximab (un anticuerpo quimérico), Adalimumab (un anticuerpo totalmente humano) o Etanercept (una proteína de fusión del receptor IgGlFC-TNFp75, la presencia de medicamento residual puede afectar a la detección de NAbs contra el antagonista de TNFα. La presencia de medicamento residual en la muestra puede ser detectada utilizando el método de ensayo de una fase según la presente invención incubando simplemente la muestra de suero con las células de ensayo en presencia de tetraciclina o doxiciclina antes de la activación del constructo Infliximab inducible. En este constructo, el Infliximab que codifica ácido nucleico está bajo el control de un promotor inducible diferente del promotor Tet-On o Tet-Off. Por ejemplo, se puede emplear un promotor regulado por mifepristona como el que comercializa Invitrogen (Carlsbad, CA. En este sistema, un promotor quimérico consistente en la secuencia TATA y GAL4-UAS del promotor mínimo E1b Adenovirus es transcripcionalmente silencioso a falta de activación. El dominio de fijación al ADN Gal4 que une la proteína reguladora al promotor GAL4-Elb y el dominio de fijación al ligando receptor de progesterona humana truncado (hPR-LBD) que experimenta un cambio de conformación cuando fija la mifepristona antagonista de progesterona se expresan a partir de un promotor TK mínimo en el vector. Por lo tanto, al añadir mifepristona, el antagonista se fija a la región hPR-LBD del vector provocando un cambio de conformación en la proteína reguladora con el resultado de la transcripción del promotor GAL4-Elb.

[00116] Por lo tanto, una reducción de la señal de luciferasa de renilla inducida-TNFα regulado por Tet-on, debida a la producción de TNFα expresado endógenamente, después de añadir una muestra a las células de la presente invención, indicará la presencia del antagonista de TNFα en la muestra a examinar para determinar la presencia de NAbs antagonistas de anti-TNFα. El grado de reducción de la señal de renilla producido por TNFα expresado endógenamente, permitirá la concentración del antagonista de TNFα en la muestra a cuantificar. El antagonista de TNFα puede ser retirado a continuación de la muestra por los medios adecuados. Por ejemplo, en el caso de Infliximab, que se compone únicamente de cadenas ligeras kappa, el medicamento puede ser retirado de la muestra a examinar para determinar la presencia de NAbs anti-Infliximab utilizando una columna por afinidad con anti-kappa. De manera alternativa, los NAbs anti-Infliximab pueden ser retirados de la muestra utilizando una columna por afinidad con proteínas G o proteínas A utilizando el método de ensayo de una fase según la presente invención.

[00117] La muestra que es analizada en el método según la presente invención es un fluido biológico de un sujeto mamífero, preferentemente un sujeto humano, en el que se espera que estén presentes el ligando extracelular o anticuerpos neutralizantes, como sangre. De manera más preferente la muestra es suero, saliva, lavado broncoalveolar o fluido cerebroespinal.

[00118] Una forma de realización preferente del método según la presente invención es cuando la célula utilizada en el ensayo es una célula tratada con un agente anti-mitótico o pro-apoptótico congelado como se ha descrito arriba y que es descongelada a continuación, antes del uso, dentro de un periodo de tiempo en que la célula descongelada mantiene la actividad de transducción de señal específica de ligando.

[00119] Cuando el método según la presente invención se utiliza para determinar el nivel en una muestra de un ligando extracelular que inicia una señal específica de ligando en el núcleo, la célula según la presente invención necesitaría tener cualquier producción endógena de ligando por la propia célula para que fuera insignificante o ausente. Dado que el ligando se expresa a partir de una segunda serie de uno o más elementos de control de

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