FI96865C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen, olennaisesti puhtaan polypeptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 96865

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen, olennaisesti puhtaan polypeptidin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti 5 käyttökelpoisen, olennaisesti puhtaan polypeptidin valmistamiseksi, jolla on seuraavat identifioivat tunnusmerkit: (a) mukana raa'asta Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkystä saadussa fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 Vydac 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huokos- 10 koko, 10 μ:η hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 15 ml/ min ja käytettäessä liuotinjärjestelmänä seuraavaa lineaarista gradienttiohjelmaa 5 % -» 20 % B, 95 % -*· 80 % A, [0 - 30 min], sitten 20 % -* 70 % B, 80 % -♦ 30 % A [30 -» 55 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen trifluorietik-15 kahappo (TFA) ja B on asetonitriili, noin 41,5 minuutissa, ja (b) mukana edellä (a):ssa kuvatun fraktion fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 ® o ,

Vydac , 10 iti x 250 mm, 300 A:n huokoskoko, 5 μ:η hxukkas-20 koko, virtausnopeuden ollessa 3,5 ml/min ja käytettäessä liuotinjärjestelmänä isokraattista liuotinjärjestelmää 70 * % A, 30 % B, jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B

on asetonitriili, noin 7,5 minuutissa, ja • '·· (c) aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka si- *:* 25 sältää • · · · H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys- • · · lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttä- t i « 3 0 vien suolojen valmistamiseksi.

• · · *. * Uuden polypeptidin on havaittu olevan mukana Agele- ’ ’ ’ nopsis aperta -hämähäkin myrkyssä.

: Polypeptidi ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat salpaavat kalsiumkanavia soluissa, joihin sisälty- 35 vät eri organismien, sekä selkärangattomien että selkäran-

• · I

· · • « 96865 2 kaisten, hermo- ja lihasolut. Kuvataan myös polypeptidin ja sen suolojen käyttöä kalsiumkanavien salpaamisessa soluissa, kuten organismin hermo- ja lihasjärjestelmien soluissa per se ja kalsiumkanavan välittämien tautien ja 5 sairauksien hoidossa nisäkkäällä. Lisäksi kuvataan koostumuksia, jotka sisältävät mainittua polypeptidiä ja sen suoloja.

On kuvattu, että Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkky sisältää vähintään kahta toksiinia, jotka vaikutta-10 vat kalsiumvirtoihin [Jackson, H. et ai., Soc. Neu. Sei. Abstr., 12:1078 (1987)]. Nuo kirjoittajat kuvaavat toksiinin, jota julkaisussa kutsutaan AG2:ksi, jonka moolimassa on vähemmän kuin 1 000 D (1 650 x 10'24 g) ja joka näyttää estävän kalsiumvirtoja suuressa joukossa kudoksia. Lisäksi 15 Jackson, H. et ai., julkaisussa Soc. Neu. Sei. Abstr., 12: 730 (1986) kuvaavat toista Agelenopsis aperta -hämähäkistä saatavaa myrkkyä, joka sisältää komponentin, jonka moolimassa on noin 6 000. Tuon toksiinin ilmoitetaan saavan aikaan välityksen presynaptisen salpaamisen ja on ehdotet-20 tu, että toksiini salpaa kalsiumkanavat, jotka liittyvät hermovälittäjän vapautumiseen.

; Tiettyjä polypeptideja, joiden on havaittu olevan * mukana Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkyssä, esitetään : *· EP-patenttijulkaisussa 395 357 A3. Polypeptidejä kuvataan ..li* 25 siinä kalsiumkanavien salpaajina soluissa ja ne kuvataan • · · seuraavasti niiden fraktioiden mukaan, joista ne on löy-detty.

Fraktio G: . .·. Aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka sisältää: 30 H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly- • · · asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-, * arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys- :...: thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu- .···. ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-, täydellisen po- 35 lypeptidin moolimassa FAB MS:n mukaan on 7267.

• · · • « li 3 96865

Fraktio H,: H2N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-kys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-arg-asn-asn-asn-CONH2, FAB MS: 5 4198.

Fraktio H2:

Aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka sisältää: H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly*-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-10 arg-cys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thr-gly-glu-, täydellisen polypeptidin moolimassa FAB MS:n mukaan 5494.

Fraktio I: H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-15 tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2, FAB MS: 4158.

Fraktio J:

Aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka sisältää: H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-20 trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-thr-his-pro-asp-asp- ala-, täydellisen polypeptidin moolimassa FAB MS:n mukaan *; / on 5505.

Fraktio K: i · H2N-glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu-asp-tyr-gly-lys-cys- 25 thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg- ··· cys-ser-met-ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu- ile-met-glu-gly-leu-ser-phe-ala-CONH2, FAB MS 5274.

Fraktio L,: . ;\ Aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka sisältää: 30 H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-

t » I

pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-, täydellisen polypeptidin likimääräinen moolimassa on noin 20 000.

* % 1 t · · 4 96865

Fraktio L2:

Polypeptidi, jolla on seuraavat identifioivat tunnusmerkit:

(a) mukana Agelenopsis aperta -hämähäkin raa'asta 5 myrkystä saadussa fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 Vydac®, 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huokoskoko, 10 μ:n hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 15 ml/min ja käytettäessä liuotinjärjestelmänä seuraavaa lineaarista gradienttiohjelmaa 5 % -1· 20 % B, 95 % -2· 80 % A

10 [0 -1 30 min], sitten 20 % -» 70 % B, 80 % -♦ 30 % A [30 -► 55 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B on asetonitriili, noin 43 minuutissa, ja (b) mukana edellä (a):ssa kuvatun fraktion fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 ® o # 15 Vydac , 10 mm x 250 mm, 300 A:n huokoskoko, 5 μ:η hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 3,5 ml/min ja käyttäen liuotinjär jestelmänä seuraavaa lineaarista gradienttiohjelmaa 25 % -2· 40 % B, 75 % -1· 60 % A [0 -2 30 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B on asetonitriili, noin 20 22,5 minuutissa.

Fraktio M: * · · .1 2 Aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka sisältää: li v H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu- . # 2 * 1· asp-glu-thr-val-asp-pro-, täydellisen polypeptidin liki- ♦i2 25 määräinen moolimassa noin 80 000.

?3· Yhdisteillä, jotka ovat kalsiumantagonisteja, on • t» «1j1. monenlaista käyttöä. Kalsiumantagonisteille voi löytyä kliinistä käyttöä hoidettaessa sairaustiloja, kuten angiinaa, kohonnutta verenpainetta, kardiomyopatiaa, ylikammion * · t *;1 30 rytmihäiriöitä, ruokatorven kouristusta, ennenaikaisia 3 * 1 ♦ *. synnytyspolttoja ja Raynaudin tautia muiden muassa. Katso * 1 julkaisua W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic

Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY, 1988, jonka kuvaukset liitetään tähän viitteenä. Lisäksi 35 tällaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia solujen, kuten

’ I I

96865 5 hermosolujen ja lihassolujen tutkimuksessa ja selkärangattomiin kuuluvien tuholaisten torjunnassa.

Tämä keksintö koskee siis menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen, olennaisesti puhtaan polypeptidin val-5 mistamiseksi, jolla on seuraavat identifioivat tunnusmerkit: (a) mukana raajasta Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkystä saadussa fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 Vydac 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huo- 10 koskoko, 10 μ:η hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 15 ml/min ja käytettäessä liuotinjärjestelmänä seuraavaa lineaarista gradienttiohjelmaa, 5 % -* 20 % B, 95 % -*· 80 % A [0 -► 30 min], sitten 20 % -* 70 % B, 80 % -» 30 % A [30 -» 55 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen trifluori-15 etikkahappo (TFA) ja B on asetonitriili, noin 41,5 minuutissa, ja (b) mukana edellä (a):ssa kuvatun fraktion fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 ® o ,

Vydac , 10 mm x 250 mm, 300 A:n huokoskoko, 5 μ:n hiukkas- 20 koko, virtausnopeuden ollessa 3,5 ml/min ja käytettäessä : ; ; liuotinjärjestelmänä isokraattista järjestelmää 70 % A, 30 % B, jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B on ;·, asetonitriili, noin 7,5 minuutissa, ja . (c) aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka si- *;;; 25 sältää • · ’···' H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys- • « · ·.' · lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile- cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu- i#·.· ile-met-glu-gly-leu, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttä- 30 vien suolojen valmistamiseksi.

.Λφ Polypeptidin sisältävä fraktio kutsutaan tämän kek- • · sinnön mukaisesti fraktioksi Q.

Keksinnön mukaisesti saatu polypeptidi salpaa kal-: : siumkanavia soluissa. Siten polypeptidi on käyttökelpoinen 35 hoidettaessa nisäkkään tauteja ja sairauksia, jotka ovat I · 6 96865 kalsiumkanavatoiminnan välittämiä soluissa. Polypeptidi on myös käyttökelpoinen tutkittaessa solujen kalsiumkanavia per se.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 5 että Agelenopsis apertan myrkky kokonaisuudessaan eluoi-daan pylväästä C-18 Vydac®, 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huokoskoko, 10 μ:η hiukkaskoko, käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min ja liuotinjärjestelmänä seuraavaa gradienttiohjel-maa: 5 % -* 20 % asetonitriiliä, 95 % -* 80 % 0,l-%:ista 10 vesipitoista trifluorietikkahappoa [0 -* 30 min], sitten 20 % -*· 70 % asetonitriiliä, 80 % -► 30 % 0,l-%:ista vesipitoista trif luorietikkahappoa [30 -* 55 min], ja monokromaattista piikin ilmaisua aallonpituudella 220 - 230 nm, noin 41,5 minuutin kuluessa eluoitunut fraktio kerätään ja

® O

15 pannaan pylvääseen C-18 Vydac , 10 mm x 250 mm, 300 A:n huokoskoko, 5 μ:n hiukkaskoko, ja eluoidaan käyttäen virtausnopeutta 3,5 ml/min, isokraattista liuotinjärjestel-mää, joka koostuu 70 %:sta 0,l-%:ista vesipitoista tri-fluorietikkahappoa ja 30 %:sta asetonitriiliä, ja piikin 20 ilmaisua aallonpituudella 220 - 230 nm, jolloin fraktio, joka eluoituu noin 7,5 minuutissa kerätään ja mahdollises-ti lyofilisoidaan, suspendoidaan uudelleen veteen ja lyo-;’t* filisoidaan, ja mahdollisesti muutetaan polypeptidi far maseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen sinänsä tunnettu-25 jen menetelmien avulla.

*···* Myrkky saadaan Agelenopsis aperta -hämähäkistä me- * netelmän avulla, jossa myrkky lypsetään sähköisen stimu loinnin avulla alan ammattimiesten hyvin tuntemien vakio-’•/•S menetelmien mukaisesti. On edullista, että käytettävä me- 30 netelmä on sellainen, joka suojaa myrkyn vatsansisällön tai hemolymfin aiheuttamalta saastumiselta. Alan ammatti- • · *. * miehet tuntevat hyvin tällaiset menetelmät. Näin saatu myrkky varastoidaan jäädytetyssä tilassa noin -78 °C:n : : lämpötilassa, kunnes se puhdistetaan seuraavassa kuvatulla 35 tavalla.

t! 96865 7

Myrkyn aineosien puhdistaminen suoritetaan kään-teisfaasi-HPLC:n (HPLC = suuren erotuskyvyn nestekromato- grafia) avulla käyttäen useita preparatiivisia ja semi- ........ . ® preparatiivisia pylväitä, kuten C-4- ja C-18 -Vydac -pyl- 5 väitä (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn

Massachusetts 01801). Huipun ilmaiseminen suoritetaan mo-nokromaattisesti aallonpituudella 220 - 230 nm. Fraktioiden muu analysointi voidaan suorittaa esimerkiksi polykro-mi UV -tietojen avulla, jotka kerätään Waters 990 -diodi-10 järjestelmädetektorilla (Millipore Corporation, Waters

Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Pylväästä saatavat fraktiot kerätään tunnettujen menetelmien avulla, kuten käyttämällä ISCO/"FOXY" -fraktionkerääjää ja ISCO 2159 -huippudetektoria (ISC0, 15 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Fraktiot kerätään sopivan kokoisiin astioihin, kuten steriileihin polyety-leenisiin laboratorioastioihin. Fraktioiden väkevöinti suoritetaan sitten lyofilisoimalla eluaatista, mitä seuraa lyofilisointi vedestä. Tulokseksi saadun aineosien frak-20 tion puhtaus voidaan määrittää kromatografisen analyysin ; avulla käyttäen analyyttistä pylvästä ja gradienttijärjes- telmää, joka on isokraattisempi kuin fraktioiden lopulli- • ’ sessa puhdistamisessa käytetty järjestelmä.

Rakenteet, jotka sisältyvät kuhunkin fraktioon, 25 määritetään tunnettujen analyyttisten menetelmien mukaan, • · kuten massaspektrometrian ja ydinmagneettisen resonanssin » » · V ' avulla. Fraktion Q polypeptidin sekvenssi määritetään tun nettujen menetelmien mukaan. Esimerkiksi tutkittavan poly- *·.·.· peptidin kystiinijäännösten S-pyridyylietylointi voidaan 30 suorittaa liuoksessa, mitä seuraa polypeptidin aminohappo-sekvenssin määrittäminen. Yksi tällainen menetelmä S-pyri- • ·

dyylietyloinnin suorittamiseksi on seuraava. Noin 1-10 μg polypeptidiä liuotetaan tai laimennetaan 50 μl:aan asti puskuria, joka on valmistettu sekoittamalla 1 osa 1 M 35 Tris-HCl:a, jonka pH-arvo on 8,5 ja joka sisältää 4 mM

96865 8 EDTA:a, ja 3 osaa 8M -guanidiini-HCl:a. Sitten lisätään 2.5 μΐ 10-%:ista vesipitoista 2-merkaptoetanolia ja seosta inkuboidaan huoneenlämpötilassa pimeässä argonin alla kahden tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen lisätään 2 μΐ 4-vi- 5 nyylipyridiinia (tuore reagenssi, joka on varastoitu argonin alla -20 °C:n lämpötilassa) ja seosta inkuboidaan vielä kaksi tuntia huoneenlämpötilassa pimeässä argonin alla. Sitten seoksesta poistetaan suolat, mieluummin kromatogra-fian avulla käyttäen lyhyttä käänteisfaasipylvästä. Tallo teenotetun alkyloidun polypeptidin sekvenssi määritetään sitten tunnettujen menetelmien mukaan.

Harjoitettaessa tätä keksintöä ja käytettäessä edellä esitettyä yleistä toimintatapaa on havaittu, että . .. .... <8 sopiva pylväs myrkyn alkufraktiointun on C-18 Vydac , 15 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huokoskoko, 10 μ:η hiukkaskoko.

Tätä pylvästä eluoidaan virtausnopeudella 15 ml/min käyttäen lineaarista gradienttiohjelmaa seuraavasti: 95 % -* 80 % A, 5 % -► 20 % B [0 -► 30 min], sitten 80 % -» 30 % A, 20 % -» 70 % B [30 -♦ 55 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoi-20 nen trifluorietikkahappo (TFA) ja B on asetonitriili.

Fraktiot kerätään kuten edellä on kuvattu. Näin saatu fraktio, joka merkittiin Q':11a, valittiin puhdistettavaksi edelleen. Fraktion Q' eluointiaika oli noin 41,5 mi-. nuuttia.

‘".1 2 5 Fraktio Q' saatettiin puhdistettavaksi edelleen : : ® o käyttäen pylvästä C-18 Vydac , 10 mm x 250 mm, 300 A:n • · · *·' ‘ huokoskoko, 5,0 μ:η hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 3.5 ml/min, jolloin käytettiin isokraattista järjestelmää, ·.·.· joka koostui 70 %:sta 0,l-%:ista vesipitoista TFA:ta ja 30 30 %:sta asetonitriiliä. Fraktiot kerättiin kuten edellä :·]·. on kuvattu. Fraktio Q eluoitiin pylväästä noin 7,5 minuu tissa. Havaittiin myös, että fraktio, joka eluoitui noin 8,3 minuutissa, sisälsi polypeptidin, joka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 395 357 A3 fraktiona K.

35 Fraktio Q sisälsi polypeptidin, jolla oli seuraava aminopäätteinen aminohapposekvenssi:

It 9 96865 H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.

5 Keksinnön mukaisesti saatu polypeptidi salpaa pa lautuma ttomasti kalsiumkanavat, jotka ovat läsnä erilaisissa soluissa, kuten selkärangattomien ja selkärankaisten hermo- ja lihasjärjestelmissä.

Keksinnön mukaisesti saadun polypeptidin kyky sal-10 vata kalsiumkanavat osoitetaan seuraavan menetelmän avulla. Pikkuaivojen rakeisia soluja preparoidaan 8 päivän ikäisten rottien pikkuaivoista (Wilkin, G. P. et ai., Brain Res., 115:181 - 199, 1976). Aclar (Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, N. J., 07719) -neliöt (1 cm2) 15 päällystetään poly-L-lysiinillä ja sijoitetaan 12-kuoppai-seen maljaan, joka sisältää 1 ml Eagles Basal -ravinto-alustaa. Solut dissosioidaan ja 6,25 x 106 solua sisältävät näytteet lisätään kuhunkin Aclar-neliön sisältävään kuoppaan. Sytosiini-beta-D-arabino-furanosidia (lopullinen 20 konsentraatio 10 μΜ) lisätään 24 tunnin kuluttua solujen lisäämisestä. Soluja käytetään fura2-analyysiin viljelyn 6., 7. ja 8. päivänä. Solut (jotka ovat kiinnittyneet

Aclar-neliöihin) siirretään 12-kuoppaisiin maljoihin, jotka sisältävät 1 ml 2 μΜ fura2/AM:iä (Molecular Probes 25 Inc., Eugene, OR, 97402) HEPES -puskurissa (joka sisältää • · *···’ 0,01 % naudan seerumin albumiinia, 0,01 % dekstroosia, »·· r 9 9 • « « ’ pH 7,4, mutta ei sisällä magnesiumia). Soluja inkuboidaan 40 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa, fura2/AM:n sisältä- !.;.i vä puskuri poistetaan ja korvataan 1 ml: 11a samaa puskuria : 30 ilman fura2/AM:iä. Kvartsikyvettiin lisätään 2,0 ml esi- ·.]·. lämmitettyä (37 °C) puskuria. Aclarin pinnalla olevat so- • · lut pannaan kyvettiin ja kyvetti pannaan lämpösäädettyyn (37 °C) telineeseen, joka on varustettu magneettisekoitta-jalla, ja fluoresenssi mitataan fluoresenssispektrofoto-35 metrillä (Biomedical Instrument Group, University of Penn- 10 96865 sylvania). Fluoresenssisignaalin annetaan stabiloitua noin kahden minuutin ajan. Sitten kyvettiin lisätään 5 - 20 μΐ tutkittavan yhdisteen varastoiiuosta fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS, pH 7,4) sopivina konsentraa-5 tioina. Fluoresenssisignaalien kalibrointi ja fura2/AM:n vuodon korjaaminen suoritetaan jokaisen testin päättyessä käyttäen vakiintuneita menetelmiä, jotka on selostettu julkaisussa Nemeth et ai., J. Biol. Chem. 262 (1987) 5188; maksimaalinen fluoresenssiarvo (Fmax) määritetään lisää-10 mällä ionomysiiniä (35 μΜ) ja minimaalinen fluoresenssiarvo (Fmin) määritetään lisäämällä sen jälkeen EGTA:ta (12 mM) kalsiumin kelatoimiseksi.

Käytettäessä edellä kuvattua menetelmää tietyn yhdisteen aiheuttama kalsiumkanavan salpaaminen ilmenee 15 fluoresenssin vähenemisenä yhdisteen lisäämisen jälkeen.

Keksinnön mukaisesti saatu polypeptidi on käyttökelpoinen kalsiumkanavan salpaajana soluissa per se. Tällaisena yhdiste on myös käyttökelpoinen hoidettaessa tauteja ja sairauksia, jotka ovat kalsiumkanavatoiminnan vä-20 littämiä nisäkkään soluissa, kuten esimerkiksi angiinan, kohonneen verenpaineen, kardiomyopatian, yläkammion ryt-i mihäiriön, ruokatorven kouristuksen, ennenaikaisten synny- tyspolttojen ja Raynaudin taudin hoidossa. Lisäksi yhdiste : on käyttökelpoinen tutkittaessa solujen fysiologiaa, mu- ·“* 25 kaan luettuna hermo- ja lihasjärjestelmän solut niihin *...' kuitenkaan rajoittumatta.

• · · · Keksinnön mukaisesti saatu polypeptidi on terapeut tisesti käyttökelpoinen myös farmaseuttisesti hyväksyttä-: vän suolan muodossa. Tällaisia suoloja muodostetaan alan 30 ammattimiesten hyvin tuntemien menetelmien avulla. Esimer-kiksi polypeptidin emässuoloja voidaan valmistaa tavan- • · · • ** omaisten menetelmien mukaan.

Kun keksinnön mukaisesti saatua polypeptidiä anne taan nisäkkäälle, se voidaan antaa yksinään tai yhdistel-35 mänä farmaseuttisesti hyväksyttävien kantajien tai laimen-nusaineiden kanssa farmaseuttisessa koostumuksessa farma- li 11 96865 seuttisen vakiokäytännön mukaisesti. Polypeptidi voidaan antaa suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuolisesta mikä on polypeptideille edullinen tapa. Ruuansulatuskanavan ulkopuoliseen lääkkeenantoon sisältyy laskimonsisäi-5 nen, lihaksensisäinen, vatsakalvon sisäinen, ihonalainen tai paikallinen lääkkeenanto.

Keksinnön mukaisesti saadun polypeptidin käyttämiseksi suun kautta yhdiste voidaan annostella esimerkiksi tablettien tai kapseleiden muodossa tai vesipitoisena 10 liuoksena tai suspensiona. Suun kautta otettavien tablettien ollessa kysymyksessä lisätään yleisesti tavanomaisesti käytettäviä kantajia, joihin sisältyvät laktoosi ja maissitärkkelys, ja liukastavia aineita, kuten magnesium-stearattia. Kun kysymyksessä ovat suun kautta otettavat 15 kapselit, käyttökelpoisia laimennusaineita ovat laktoosi ja kuivattu maissitärkkelys. Kun vaaditaan vesipitoisia suspensioita suun kautta käytettäväksi, aktiivinen aine yhdistetään emulgoivien ja suspendoivien aineiden kanssa. Haluttaessa voidaan lisätä tiettyjä makeutus- ja/tai aro-20 miaineita.

Lihaksen sisäistä, vatsakalvon sisäistä, ihonalais-ta ja laskimonsisäistä käyttöä varten valmistetaan yleensä ‘ aktiivisen aineen steriilejä liuoksia ja liuosten pH:n pitäisi olla sopivasti säädetty ja puskuroitu. Laskimonsi-25 säistä käyttöä varten liuenneiden aineiden kokonaiskon- • · *···' sentraatiota pitäisi kontrolloida valmisteen muuttamiseksi • *· * isotoonikseksi.

Kun keksinnön mukaisesti saatua polypeptidiä tai i#jt: sen suolaa käytetään ihmispotilaan hoidossa, hoitava lää- 30 käri määrää normaalisti päivittäisen annostuksen. Lisäksi annos voi vaihdella yksittäisen potilaan iän, painon ja • · reagoinnin mukaan sekä potilaan oireiden vakavuuden ja ·;· annettavan erityisen yhdisteen tehon mukaan.

: Kun polypeptidiä tai sen suolaa käytetään solujen 35 fysiologisessa tutkimuksessa, se lisätään soluihin alan 12 96865 ammattimiesten hyvin tuntemien menetelmien mukaisesti. Polypeptidi voidaan esimerkiksi lisätä soluihin sopivassa fysiologisessa puskurissa. Yhdisteen sopiva konsentraatio on tällaisissa tutkimuksissa 100 μΜ. Kuitenkin polypepti-5 din konsentraatio tällaisissa tutkimuksissa voi olla suurempi tai pienempi kuin 100 μΜ. Lisättävän yhdisteen määrän määrittelee alan ammattimies hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Seuraavat esimerkit ovat keksintöä kuvaavia eivätkä 10 ole tarkoitettu keksinnön piiriä rajoittaviksi.

Esimerkki 1

Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkyn a lkufr aktio inti

Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkkyä, joka oli 15 saatu yhtiöltä Natural Product Sciences Inc., Salt Lake City, Utah 84108, ja joka oli varastoitu jäätyneessä tilassa noin -78 °C:n lämpötilassa, sulatettiin ja jaettiin 10 - 60 μΐ määriin, jotka laimennettiin 200 μΐ^εΐ, li- • · ® o sättun pylvääseen C-l8 Vydac (22 mm x 250 mm, 300 A:n 20 huokoskoko, 10 μ:n hiukkaskoko) ja eluoitiin käyttäen vir-tausnopeutta 15 ml/min ja liuotinjärjestelmänä seuraavaa lineaarista gradienttiohjelmaa: 5 % -» 20 % B, 95 % -+ 80 % A [0 -► 30 min], sitten 20 % -► 70 % B, 80 % -» 30 % A [30 -*· 55 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B on 25 asetonitriili. Huipun ilmaisu suoritettiin monokromaatti- • * *;··’ sesti aallonpituudella 220 - 230 nm ja fraktiot kerättiin V * käyttäen ISCO/"FOXY" -fraktionkerääjää ja ISCO 2159 huip- pudetektoria. Fraktiot kerättiin 20 - 60 minuutin ajalta.

c :,· Fraktio Q' kerättiin noin 41,5 minuutissa.

:V: 30 Esimerkki 2 .•I·. Fraktion Q' alafraktiointi ja sen rakenteiden mää- • · rittäminen

Fraktio Q', joka oli saatu kuten esimerkissä 1 on . . ® selostettu, pantiin c-18 Vydac -pylvääseen (10 mm x 250 35 mm, 300 Ä:n huokoskoko, 5 μ:η hiukkaskoko) ja eluoitiin käyttäen virtausnopeutta 3,5 ml/min ja isokraattista liuotinjär jestelmää, joka koostui 70 %:sta A:ta ja 30 %:sta

II

13 96865 B:tä, jolloin A oli 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B oli asetonitriili. Huipun ilmaiseminen suoritettiin Waters 990 -diodijärjestelmädetektorin avulla ja fraktion kerääminen suoritettiin kuten esimerkissä 1 on selostettu. Saatiin 5 kaksi fraktiota seuraavasti:

Fraktio Eluointiaika Q noin 7,5 minuuttia K noin 8,3 minuuttia 10

Fraktiot Q ja K, jotka sisälsivät polypeptidejä, preparoitiin sitten sekvenssin määrittämistä varten lyofi-lisoimalla eluentista ja sitten vedestä hyvin tunnettujen menetelmien mukaan.

15 Fraktioiden Q ja K alkyloidun polypeptidin amino- happoanalyysi saatiin käyttäen Water Pico-Tag -menetelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssitiedot kerättiin käyttäen Applied Biosystems malli 470A -proteiini/peptidi- sekvenaattoria (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Cen- 20 ter Drive, Foster City, California 94404) vesipitoisen . . . TFA:n konversion avulla. Saatujen fenyylitiohydantoiini- aminohappojen analyysi suoritettiin kytkettynä (on-line) ' ‘ Applied Biosystems model 120A PTH -analysaattorilla tai ’ . käyttäen erillisenä (off-line) DuPont Zorbax PTH -pylvästä 25 (Biomedical Product Department, Chromatography Products, *···* E.I. duPont de Nemours and Co., Inc., 1007 Market Street, ··* : Wilmington, Delaware 19898) .

Aminohappoanalyysin tuloksena fraktion Q sisältämän t :*: polypeptidin osan aminopäätteinen aminohapposekvenssi mää- 30 ritettiin seuraavaksi: H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys- » · · lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.

35 Aminohappoanalyysin tuloksena määritettiin myös, että fraktio K sisälsi EP-patenttijulkaisussa 395 357 A3 polypeptidin ja edellä kuvatun fraktion K.

Claims (2)

14 96865 Patentt i vaat imus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen, olennaisesti puhtaan polypeptidin valmistamiseksi, jolla on seu-5 raavat identifioivat tunnusmerkit: (a) mukana raajasta Agelenopsis aperta -hämähäkin myrkystä saadussa fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 Vydac® 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huokoskoko, 10 μ:n hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 15 ml/ 10 min ja käytettäessä liuotinjärjestelmänä seuraavaa lineaa rista gradienttiohjelmaa 5 % -*· 20 % B, 95 % -» 80 % A, [0 - 30 min], sitten 20 % -* 70 % B, 80 % -» 30 % A [30 -» 55 min], jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen trifluorietik-kahappo (TFA) ja B on asetonitriili, noin 41,5 minuutissa, 15 ja (b) mukana edellä (a):ssa kuvatun fraktion fraktiossa, joka eluoituu pois käytettäessä pylvästä C-18 φ A f Vydac , 10 mm x 250 mm, 300 A:n huokoskoko, 5 μ:η hiukkaskoko, virtausnopeuden ollessa 3,5 ml/min ja käytettäessä 20 liuotinjärjestelmänä isokraattista liuotinjärjestelmää 70 % A, 30 % B, jolloin A on 0,l-%:inen vesipitoinen TFA ja B on asetonitriili, noin 7,5 minuutissa, ja (c) aminopäätteinen aminohapposekvenssi, joka si- I I ' sältää

25 H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys- t***· ... lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile- • · · V · cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu- ile-met-glu-gly-leu-, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttä-: vien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, : 30 että Agelenopsis apertan myrkky kokonaisuudessaan eluoi- daan pylväästä C-18 Vydac®, 22 mm x 250 mm, 300 Ä:n huo- • · koskoko, 10 μ:n hiukkaskoko, käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min ja liuotinjärjestelmänä seuraavaa gradienttiohjelmaa: 5 % ->· 20 % asetonitriiliä, 95 % -+ 80 % 0,l-%:ista 35 vesipitoista trifluorietikkahappoa [0 -+ 30 min], sitten 20 tl 96865 % -» 70 % asetonitriiliä, 80 % -1 30 % 0,l-%:ista vesipitoista trifluorietikkahappoa [30 -+ 55 min], ja monokromaattista piikin ilmaisua aallonpituudella 220 - 230 nm, noin 41,5 minuutin kuluessa eluoitunut fraktio kerätään ja 5 pannaan pylvääseen C-18 Vydac®, 10 mm x 250 mm, 300 Ä:n huokoskoko, 5 μ:n hiukkaskoko, ja eluoidaan käyttäen virtausnopeutta 3,5 ml/min, isokraattista liuotinjärjestelmää, joka koostuu 70 %:sta 0,l-%:ista vesipitoista tri-fluorietikkahappoa ja 30 %:sta asetonitriiliä, ja piikin 10 ilmaisua aallonpituudella 220 - 230 nm, jolloin fraktio, joka eluoituu noin 7,5 minuutissa kerätään ja mahdollisesti lyofilisoidaan, suspendoidaan uudelleen veteen ja lyo-filisoidaan, ja mahdollisesti muutetaan polypeptidi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen sinänsä tunnettu-15 jen menetelmien avulla. i 1 > • · · » I » « · I 1 1 · « I · < • « · t : • ·· ♦ 9 · ♦ · · • · « * « « » • « · ·· « • · · • « « • « · • 1 · ♦ · 16 96865 Förfarande för framställning av en terapeutiskt användbar, väsentligen ren polypeptid med följande identi-5 fierande karakteristika: (a) närvarande i en fraktion erhällen ur rätt gift frän spindeln Agelenopsis aperta, vilken fraktion elueras frän en C-18 Vydac -kolonn med storleken 22 mm x 250 mm, porstorleken 300 Ä och partikelstorleken 10 μ, under an- 10 vändning av en strömhastighet pä 15 ml/min och följande lineära gradientprogram som lösningsmedelsystem 5 % -*· 20 % B, 95 % -* 80 % A [0 -» 30 min], sedan 20%-*70%B, 80%-* 30 % A [30 -* 55 min], varvid A är 0,1-procentig vattenhal-tig trifluorättiksyra (TFA) och B är acetonitril, vid ca 15 41,5 minuter, och (b) närvarande i en fraktion av den i (a) beskrivna fraktionen, vilken senare fraktion elueras frän en C-18 Vydac -kolonn av storleken 10 mm x 250 mm, porstorleken 300 k och partikelstorleken 5 μ, under användning av en 20 strömhastighet pä 3,5 ml/min och ett isokratiskt lösnings-, ,·. medelsystem pä 70 % A, 30 % B, varvid A är 0,1-procentig I · vattenhaltig TFA och B är acetonitril, vid ca 7,5 minuter, ,; * och a · * *' (c) en aminoterminal aminosyrasekvens som omfattar ...i 25 H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys- *»..* lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile- ·· · *.· ’ cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu- ile-met-glu-gly-leu-, samt farmaceutiskt godtagbara salter s av denna, kännetecknat därav, att giftet frän i»· ·*;*; 30 Agelenopsis aperta i sin helhet elueras frän en C-18 Vy- * ® dac -kolonn med storleken 22 mm x 250 mm, porstorleken 300 » · · •t ;* k och partikelstorleken 10 μ, under användning av en strömhastighet pä 15 ml/ min och följande lineära gra-:" : dientprogram som lösningsmedelsystem 5 % -* 20 % acetoni- 1. i 35 tril, 95 % -* 80 % 0,1-procentig vattenhaltig trifluorät- II 96865 tiksyra [O -+ 30 min], sedan 20 % -* 70 % acetonitril, 80 % -*· 30 % 0,1-procentig vattenhaltig trifluorättiksyra [30 -* 55 min], samt monokromatisk toppdetektion pä väglängden 220 - 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 41,5 minuter 5 tas tillvara och leds m i en C-18 Vydac -kolonn med stor-leken 10 mm x 250 mm, porstorleken 300 Ä och partikelstor-leken 5 μ, och elueras under användning av en strömhastig-het pä 3,5 ml/min och ett isokratiskt lösningsmedelsystem bestäende av 70 % 0,1-procentig vattenhaltig trifluorät-10 tiksyra och 30 % acetonitril, samt toppdetektion pä väglängden 220 - 230 nm varvid fraktionen, som elueras vid ca 7,5 minuter tas tillvara och eventuellt lyofiliseras, sus-penderas pä nytt i vatten och lyofiliseras, och eventuellt överförs polypeptiden i ett farmaceutiskt godtagbart sait 15 med i och för sig kända förfaranden. 4 4 # • t · « « « • « « • < 4 > « « I I I »II· ··· t ; t« * ·· > • · · * · • · ( • « « *· · ««I • · « • e * ·· · • · · « · « · I f I l I I I t I I I » I « i I • I I I III • $ ·