PL164541B1

PL164541B1 - Sposób wyodrebniania z jadu pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farmakologicznych o strukturze peptydu PL PL PL PL

Info

Publication number: PL164541B1
Application number: PL90287113A
Authority: PL
Inventors: Douglas Phillips; Nicholas A Saccomano; Robert A Volkmann
Original assignee: Nps Pharma Inc; Pfizer
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1994-08-31
Also published as: US5122596A; JPH03120299A; RU2026866C1; KR910006326A; NO175208B; CZ470790A3; PH27403A; FI904789A0; ZA907782B; FI96865B; JPH0692440B2; DE69007739D1; YU184490A; NO904251D0; CA2026418C; AU626203B2; IE903491A1; MY106832A; CN1051182A; DE69007739T2

Abstract

Sposób w yodrebniania z jad u pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasnosciach farm akologi- cznych o strukturze peptydu o wzorze H 2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg- cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg- gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu- cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leu- ala-C O N H 2 ewentualnie w postaci jego dopuszczalnych farm akologicznie soli, znamienny tym, ze pelny jad Agelenop- sis aperta eluuje sie z kolum ny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkosc porów 30 nm, wielkosc czastek 10 µ m, stosujac szybkosc przeplywu 15 m l/m inute i uklad rozpuszczalnikowy o progra- mie z gradientem liniowym od 5% - 20% acetonitrylu, 95% - 80% 0,1% wodnego kwasu trójfluoroocto- wego [0 —30 m inut], nastepnie 20% - 70% acetonitrylu, 80% - 30% 0,1% wodnego kwasu trójfluoroocto- wego [30 - 55 m inut] i m onochrom atyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera sie frakcje, która eluuje w 41,5 m inuty i nanosi sie ja na kolum ne C-18 Vydac® o wymiarach 10 m m X 250m m , wielkosc porów 30nm , wielkosc czastek 5 µ m, a nastepnie eluuje sie te kolum ne z szybkoscia 3,5 nil/m inute izokratycznym ukladem rozpuszczalnikowym z 70% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctow ego i 30% acetonitrylu z wykrywaniem piku przy 220-230 nm, zbiera sie fiakcje eluujaca w okolo 7,5 minuty i ewentualnie liofilizuje sie ja lub zawiesza sie ponow nie w wodzie 1 liofilizuje i ewentualnie otrzym any polipeptyd przeksztalca sie w dopuszczalna farm akologicznie sól. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o własnościach farmakologicznych o strukturze peptydu. Wyodrębniony peptyd i jego dopuszczalne farmakologicznie sole blokują kanały wapniowe w komórkach, w tej liczbie w komórkach nerwowych i mięśniowych różnych organizmów, w tym bezkręgowców i kręgowców. Dzięki zdolności blokowania kanałów wapniowych w komórkach wyodrębniony peptyd ma zastosowanie w leczeniu u ssaków chorób i stanów, w których pośredniczy kanał wapniowy, jak również w zwalczaniu szkodników należących do bezkręgowców. W tych celach stosuje się wytworzone peptydy w postaci odpowiednich kompozycji.

Relacjonowano, że jad pająka Agelenopsis aperta zawiera co najmniej dwie toksyny działające na strumienie wapniowe [Jackson, H. i wsp., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987)]. Autorzy ci odkryli toksynę, określaną tu jako AG2, która ma masę cząsteczkową niższą od 1.000 daltonów i przejawia zdolność tłumienia strumieni wapniowych w szerokiej gamie tkanek. Ponadto, Jackson, H. i wsp., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986) opisali inną toksynę z Agelenopsis aperta zawierającą składnik o masie cząsteczkowej 6000. Toksynę tę opisano jako wywołującą blokadę presynaptyczną przenoszenia i sugerowano, że blokuje ona kanały wapniowe związane z uwalnianiem przenośnika nerwowego.

Pewne peptydy znajdujące się w jadzie pająka Agelenopsis aperta ujawniono w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 07/346 181 z. 28 kwietnia 1989. Peptydy te opisano jako blokujące kanały wapniowe w komórkach w odniesieniu do frakcji, w których zostały znalezione.

164 541

Frakcja G: Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca: H₂N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gIy-ala-glu-cys-aspgly-as n-gl u-ser-a sp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-ly^^^^^^^i^i^-<^ę^^-j3i^<^^t:rp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyslys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argasn-glu-trp-leu-ser-, masa cząsteczkowa całego polipeptydu według FAB:7267,

Frakcja Hi.

H 2 N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-glncys-ala-a-p-trp-ala-gly-ala-gly-pΓo-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-trp-eys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-ile-cys-arg-asnasn-asn-CONH2, FAB:4190.

Frakcja H 2:

Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca: FhN-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-servaI-cys-asp-gIy-asn-gIu--er-asp-cys-lyscys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cysarg-cys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thrgly-glu-, masa cząsteczkowa całego polipeptydu.

Frakcja I:

^N-asp-cys^al-gly-glu-ser-gln-glncys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-wllasn-asn-asn-CON^, FAB: 4158.

Frakcja J:

Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca: H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lysser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-thr-his-pro-asp-asp-ala, masa cząsteczkowa całego polipeptydu według FAB: 5505.

Frakcja K:

H2N-glu-a-ptasn-cy--iletala-glu-aspt tys-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lyscy--cys-arg-gly-arg-protcystarg-cys-sermet-ile-gl;^-^thr-asn-cys-glu-cy^-^tlhr-proarg-leu-ile-met-glu-gly-leu-ser-phe-ala-CON^, FAB: 5274.

Frakcja Li.

Amino końcowa sekwencja aminokwasowa obejmująca:

H 2 N-iIetvaItgly-gly-lys-thr-aIa-Iy--phegIy-asp-tyr-prottrptmet-vaIt-er-iIegIn-gIn-IyStasn-Iys-IyStg[ytgίy-phe-a-pprzybliżona masa cząsteczkowa całego polipetydu około 20.000.

Frakcja L2:

Polipeptyd mający następujący charakterystykę identyfikacyjną:

a) występuje we frakcji surowego jadu pająka Agelenopsis aperta, którą z kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10μιη. eluuje się przy szybkości przepływu 15 ml/minutę układem rozpuszczalnikowym, stosując program z gradientem liniowym od 5%—20% B, 95%—80% A [0—30 minut], następnie 20%—70% B, 80%—30% A [30—55 minut], gdzie A jest 0,1% wodnym TFA, a B jest acetonitrylem, w około 43 minutach i

b) występuje we frakcji opisanej wyżej w punkcie a) frakcji, którą z. kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 10 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 5μηι, eluuje się przy szyb4

164 541 kości przepływu 3,5 ml/minutę układem rozpuszczalnikowym, stosując program z gradientem liniowym od 25%->40% B, 75%—60% A [θ—3θ minut], gdzie A jest 0,1% wodnym TFA, a B jest acetonitrylem, w około 22,5 minutach.

Frakcja M: Amino końcowa sekwencja aminokwasowa zawierająca:

H 2N-glu-ala-thr-glu-aIa-aila-lys-val-leuser-asn-leu-asp-glu-th r-val-asp-proprzybliżona masa cząsteczkowa całego polipeptydu około 80.000.

Związki będące antagonistami wapnia mają różne zastosowania praktyczne. Antagonisty wapnia mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu takich między innymi chorób jak angina, nadciśnienie, zaburzenia patologiczne mięśnia sercowego, niemiarowość pozakomorowa, brak rozluźnienia skurczu, przedwczesny poród i choroba Raymanda. Patrz W. G. Nayler, Calcium Antagonists Academic Press, Harcourt Brace Javanovick Publishers, New Jork, NY 1988. Ponadto, takie związki są użyteczne w badaniu fizjologii komórek, takich jak komórki nerwowe i mięśniowe i w zwalczaniu szkodników z grupy bezkręgowców.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębniania peptydu występującego w jadzie pająka Agelenopsis aperta. Polipeptyd wyodrębniony sposobem według wynalazku i frakcja, w której jest on obecny, jest frakcją Q.

Sposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o własnościach farmakologicznych o strukturze peptydu o wzorze

HzN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2 ewentualnie w postaci jego dopuszczalnych farmakologicznie soli, polega zgodnie z wynalazkiem na tym, że pełny jad Agelenopsis aperta eluuje się z kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10μ m, stosując szybkość przepływu 15 ml/minutę i układ rozpuszczalnikowy o programie z gradientem liniowym od 5%—20% acetonitrylu, 95%—80% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [0-* 30 minut], następnie 20%->70% acetonitrylu, 80%->30% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [30—55 minut] i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję, która eluuje w 41,5 minuty i nanosi się ją na kolumnę C-18 Vydac® o wymiarach 10mmX-250mm, wielkość porów 30nm, wielkość cząstek 5 pm, a następnie eluuje się tę kolumnę z szybkością 3,5 ml/minutę izokratycznym układem rozpuszczalnikowym z 70% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego i 30% acetonitrylu z wykrywaniem piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję eluującą w około 7,5 minuty i ewentualnie liofilizuje się ją lub zawiesza się ponownie w wodzie i liofilizuje i ewentualnie otrzymany polipeptyd przekształca się w dopuszczalną farmakologicznie sól.

Polipeptyd wytwarzany sposobem według wynalazku blokuje kanały wapniowe w komórkach. A więc jest on per se użyteczny w blokowaniu kanałów wapniowych. Polipeptyd ma również zastosowanie w zwalczaniu szkodników z gatunku bezkręgowców i w leczeniu chorób i stanów występujących u ssaków, w których pośredniczy funkcja kanału wapniowego w komórce.

Jad uzyskuje się z pająka Agelenopsis aperta drogą ściągania przez stymulację elektryczną według standardowych metod, dobrze znanych fachowcom. Korzystnie, zastosowana metoda jest jedną z tych, które chronią pełny jad przed zanieczyszczeniem przez cofnięcie brzuszne lub hemolimfę. Takie metody są dobrze znane fachowcom. Otrzymany w ten sposób pełny jad przechowuje się w stanie zamrożonym, w temperaturze około -78°C do czasu użycia do opisanego dalej oczyszczania.

Oczyszczanie składników pełnego jadu przeprowadza się metodą wysokosprawnej chromatogiafii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC) na różnych kolumnach preparatywnych i półpreparatywnych, takich jak kolumny C-4 i C-18 Vydac® (Rainin Instrument Co. Inc. MackRoad. Wobum Massachusetts 01801). Wykrywanie piku prowadzi się monochromatycznie przy 220-230 nm. Dalsza analiza frakcji może być przeprowadzana, na przykład z danych polychrome UV zebranych z detektora układu diodowego Waters 990 (Millipore Corporatin, Waters Chromatography Divi164 541 sion, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Frakcje z kolumn zbiera się w znany sposób, taki jak zastosowanie kolektora frakcji ISCO/„FOXY“ i detektora piku ISCO 2169 (ISCO, 47-00 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Frakcje zbiera się do naczyń o równej w przybliżeniu pojemności, takich jak jałowe naczynia laboratoryjne z polietylenu. Zatężenia frakcji dokonuje się przez liofilizację z eluenta, a następnie liofilizację z wody. Czystość frakcji składowych otrzymanych w ten sposób określa się następnie pizez analizę chromatograficzną z zastosowaniem kolumny analitycznej z układem gradientowym, który jest bardziej izokratryczny niż układ stosowany do końcowego oczyszczenia frakcji.

Struktury zawarte w odpowiednich frakcjach określa się znanymi metodami analitycznymi, takimi jak spektrometria masowa i protonowy rezonans magnetyczny. Polipeptyd z frakcji Q sekwencjonuje się znanymi metodami. Na przykład S-pirydyloetylowanie reszt cysteinowych badanego polipeptydu można przeprowadzić w roztworze, a następnie dokonać sekwencjonowania aminokwasowego polipeptydu. Jedna z metod S-pirydyloetylowania jest nastąpująca. Około 1 do 10pg, polipeptydu rozpuszcza się lub rozcieńcza w do 50μ\ buforu otrzymanego przez zmieszanie 1 części lMTrisHCl pH 8,5 zawierającego4 mM EDTA i 3 części 8M guanidyny HCl. Następnie dodaje się 2,5μΐ 10% wodnego 2-merkaptoetanolu i mieszaninę tę inkubuje się 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, w atmosferze argonu. Po inkubacji dodaje się 2μ\ 4-winylopirydyny (świeży reagent przechowywano w atmosferze argonu w temperaturze -20°C) i mieszaninę tę inkubuje się przez dalsze 2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności, w atmosferze argonu. Mieszaninę następnie odsolono, korzystnie chromatograficznie na krótkiej kolumnie z odwróconą fazą. Odzyskany, alkilowany polipeptyd sekwencjonuje się następnie znanymi sposobami.

W praktycznym wykonywaniu wynalazku i stosując ogólne postępowanie podane wyżej stwierdzono, że odpowiednią kolumną do wstępnego frakcjonowania jadu jest kolumna C-17 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10μιη. Kolumnę tę eluuje się przy szybkości przepływu 15 ml/minutę, stosując program z gradientem liniowym 95%-80% A, 5%—20% B [0-30 minut], następnie 80%-30% A, 20%-70% B [30-55 minut], gdzie A jest 0,1% wodnym kwasem trójfluorooctowym (TFA), a B jest acetonitrylem. Frakcje zbiera się w opisany wyżej sposób. Otrzymaną w ten sposób frakcję oznaczoną Q' wybiera się do dalszego oczyszczania. Czas eluowania frakcji Q' był około 41,5 minuty.

Frakcję Q' poddaje się dalszemu oczyszczaniu stosując kolumnę C-18 Vydac® o wymiarach 10 mm X 250 mm,_wielkpść porów 30 nm, wielkość cząstek 5,0/zm, przy szybkości przepływu 3,5 ml/minutę, i układ izokratyczny 70% wodnego TFA, 30% acetonitrylu. Frakcje zebrano w opisany wyżej sposób. Frakcję Q eluuje się z kolumny po około 7,5 minutach. Stwierdzono również, że frakcja eluująca w około 8,3 minutach zawierała polipeptyd, który opisano w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 07/346 181 jako frakcję K.

Frakcja Q zawiera peptyd mający następującą sekwencję aminokwasową:

H 2 N-lys-lys^ll^;^5^-il<^-;da-lys^asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ne-cys-se r-de-m et-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2.

Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku nieodwracalne blokują kanały wapniowe obecne w różnych komórkach, takich jak komórki systemu nerwowego i układu mięśniowego kręgowców i bezkręgowców.

Zdolność polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku do blokowania kanałów wapniowych wykazano w następujący sposób. Mózgowe komórki żerne mikrogleju otrzymano z móżdżków 8 dniowych szczurów (Wilkin, G. P. i wsp., Brain Res: 115: 181-199, 1076). Kwadratyo powierzchni 1cm2 Aclar) Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, N. J. 07719) powlekano poli-L-lizyną i umieszczano na płytkach z 12 otworami, które zawierały 1 ml Eagels Basel Medium. Komórki rozszczepiano i do każdego otworu zawierającego kwadraty Aclar dodawano odmierzone ilości zawierające 6,25 X 10^e komórek. Po upływie 24 godzin po umieszczeniu dodano cytozyno-beta-D-arabinofuranozyd (stężenie końcowe 10/iM). Komóiki są używane do analizy fura 2 w hodowli 6, 7 i 8 dniowej. Komórki (przywiązane do kwadratów Aclar) przenoszono na płytki z 12 otworami zawierającymi 1 ml 2μΜ fura 2/AM (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, 97402) w buforze HEPES (zawierającym 0,1% albuminy osocza wołowego, 0,01% dekstrozy, pH 7,4, wolnym od magnezu). Komórki unkubowano 40 minut w temperaturze 37°C. Bufor zawierający fura 2/AM usunięto i zastąpiono 1 ml takiego samego buforu bez fura 2/AM. Do kwarcowej kuwety dodano 2,0 ml ogrzanego uprzednio (37°C) buforu. Komórki na Aclar umieszczono w kuwecie, a samą kuwetę wprowadzono do termostatowanego (37°C) uchwytu wyposażonego w mieszadło magnetyczne i umieszczono fluorescenęję spektoforometrem fluerescencyjnym (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania). Pozwolono na ustabilizowanie się w ciągu około 2 minut sygnału fluorescencyjnego.

Następnie do kuwety dodawano 5-20 μΐ roztworu podstawowego badanego związku w solance buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) w odpowiednich stężeniach kalibrowanie sygnałów fluorescencyjnych i korekty upływności fura 2/AM są przeprowadzane z zastosowaniem ustalonych sposobów postępowania Nemetha i wsp. J. Biol. Chem. 262:5188 (1987) do zakończenia każdego badania, przy czym maksymalną wartość fluorescencji (F max) oznaczano przez dodanie jonomycyny (35 pM), a minimalną wartość fluorescencji (F min) oznaczano przez dodanie następnie EGTA (12 mM) w celu schelatowania wapnia. Stosując powyższe postępowanie wykazano, że blokowanie kanału wapniowego badanym związkiem powoduje spadek fluorescencji po dodaniu tego związku.

Peptyd wyodrębniany sposobem według wynalazku i jego sole są użyteczne jako środki blokujące kanał wapniowy w komórkach. Jako takie, związki te są również użyteczne w zwlaczaniu szkodników z gatunku bezkręgowców i w leczeniu chorób i stanów, w których pośredniczy funkcja kanałów wapniowych w komórkach u ssaków, takich jak angina, nadciśnienie, zaburzenia patologiczne mięśnia sercowego, niemiarowość pozakomorowa, brak rozluźnienia skurczu, przedwczesny poród i choroba Raymonda. Ponadto omawiane związki są użyteczne w badaniach fizjologii komórki obejmujących, ale nie ograniczonych do nich, komórki systemu nerowowego i systemu mięśniowego.

Jak wspomniano, sposobem według wynalazku wytwarza się również dopuszczalne farmakologicznie sole peptydu. Sole te są wytwarzane metodami dobrze znanymi fachowcom, na przykład zasadowe sole peptydu wytwarza się znanymi metodami.

Jeżeli peptyd wyodrębniony sposobem według wynalazku ma być podawany ssakom, to można go podawać jako taki albo w kombinacji z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami lub rozcieńczalnikami zgodnie ze standardową praktyką farmaceutyczną. Peptyd może być podawany doustnie lub pozajelitowo, przy czym korzystna jest droga pozajelitowa. Obejmuje ona podawanie dożylne, domięśniowe, dociemieniowe, podskórne lub zewnętrzne.

W przypadku doustnego podawania peptydu można go podawać na przykład w postaci tabletek, kapsułek lub zawiesin lub roztworów wodnych. W przypadku tabletek do podawania drogą doustną użytecznymi, ogólnie stosowanymi nośnikami są laktoza i skrobia kukurydziana, a także zwykle dodawane czynniki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu. Do podawania doustnego w postaci kapsułek użytecznymi rozczynnikami są laktoza i suszona skrobia kukurydziana. Jeżeli ma się stosować doustnie zawiesiny wodne, to składnik czynny łączy się z czynnikami emulgującymi i suspendującymi. W razie potrzeby można dodawać pewne środki słodzące i/lub zapachowe.

Do stosowania domięśniowego, dociemieniowego, podskórnego i dożylnego przygotowuje się zwykle jałowe roztwory składnika czynnego, a pH tych roztworów powinno być odpowiednio regulowane i buforowane. Do podawania dożylnego całkowite stężenie substancji rozpuszczonych powinno być tak regulowane, aby preparat był izotoniczny.

Jeżeli wyodrębniony peptyd lub jego sól są stosowane dla ludzi, to dawka dzienna będzie zwykle określana przez przepisującego lekarza. Ponadto dawka będzie zmieniać się z wiekiem, ciężarem ciała i reakcją poszczególnego pacjenta, jak również nasileniem występujących u niego objawów i mocy tego związku lub soli, którą się podaje.

Jeżeli wyodrębniony peptyd lub jego sól są stosowane do zwalczania szkodników z gatunku bezkręgowców, to związek ten podaje się bezpośrednio bezkręgowcowi albo doprowadza się do

164 541 jego środowiska. Na przykład związek wyodrębniony sposobem według wynalazku może być rozpylany jako roztwór na bezkręgowca. Ilość związku konieczna do zniszczenia bezkręgowca będzie zmieniała się w zależności od bezkręgowca i warunków środowiskowych, a będzie określana przez osobę stosującą związek.

Jeżeli peptyd lub jego sól stosuje się do badania fizjologicznego komórek, to do komórki wprowadza się je metodami znanymi fachowcom. Na przykład peptyd można wprowadzać do komórki w odpowiednim buforze fizjologicznym. Odpowiednim stężeniem wyodrębnionego związku do wykorzystania w takich badaniach jest 100μΜ. Jednak stężenia tego peptydu w tych badaniach mogą być większe niż lub znacznie mniejsze niż 100μΜ. Ilość podawanego związku będzie określana przez fachowca zgodnie ze znanymi metodami.

Następujący przykład ilustruje sposób według wynalazku.

Przykład.

a) Wstępne frakcjonowanie pełnego jadu Agelenopsis aperta.

Pełny jad Agelenopsis aperta, otrzymany z Narural Product Sciences Ins., Salt Lake City, Utah 84108, który przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -78°C, odmrożono i 10 do 60pl tego jadu rozcieńczono do objętości 200μΐ, którą naniesiono na kolumnę C-18 Vydac® (22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10pl) i eluowano przy szybkości przepływu 15 ml/minutę układem rozpuszczalnikowym, stosując program z gradientem liniowym od 5%-20% B, 95%—80% A [0-30 minut], a następnie 20%-70% B, 80%-30% A [30-55 minut], gdzie A jest 0,1% wodnym TFA, a B jest acetonitrylem. Wykrywanie piku prowadzono monochromatycznie przydługości220-230 nm,frakcjezbieranowkolektorzefrakcjiISCO/„FOXY“ i użyto wykrywacz piku ISCO 2159. Zbierano frakcje od 20 minut do 60 minut. Frakcję Q' zbierano w około 41,5 minutach.

b) Rozfrakcjonowanie frakcji Q' i określenie jej struktur.

Frakcję Q', otrzymaną jak opisano w przykładzie I, naniesiono na kolumnę C-18 Vydac® (10 mmX 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 5pm) i eluowano z kolumny przy szybkości przepływu 3,5 ml/minutę, stosując izokratyczny układ rozpuszczalnikowy 70% A, 30% B, gdzie A jest 0,1 wodnym TFA, a B jest acetonitrylem. Wykrywanie piku prowadzono stosując diodowy układ detektorowy Waters 990, a frakcje zbierano w sposób opisany w przykładzie I. Otrzymano dwie następujące frakcje:

Frakcja Czas eluowania

Q około 7,5 minut

K o koto 8/3 minut

Frakcje Q i K, które zawierały polipeptydy preparowano następnie w celu ustalenia kolejności przez liofilizację z eluenta, a następnie przez liofilizację z wody według znanych metod.

Analizy aminokwasów alkilowanego polipeptydu z frakcji Q i K dokonano stosując metodę Waters Pico-Tag według przepisów wytwórcy. Dane o kolejności czerpano z sekwencera proteina peptyd Applied Biosystems, Inc. 470A (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) z zastosowaniem konwersji wodnym TFA. Analizę otrzymanych kwasów fenylotiohydaatoinowych przeprowadzono na linii analizatorem Applied Biosystems model 120A PTH albo poza linią na kolumnie DuPont Zorbax PTH (Biomedical Product Departament, Chromatography Products, E. I. DuPont de Nemours and Co., Inc. 1007 Market Street, Wilmington, Delaware, 19898).

W wyniku analizy aminokwasów sekwencję aminokwasową wyodrębnionego peptydu zawartego we frakcji Q określono jako:

H 2 N-lys-lys-lys-cys-ne-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-iie-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH2

W wyniku analizy aminokwasowej ustalono również, że fiakcja K zawierała polipeptyd z frakcji K opisanej wyżej i ujawniony w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 07/346 181.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o własnościach farmakologicznych o strukturze peptydu o wzorze

IDN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-gly-leuala-CONH₂ ewentualnie w postaci jego dopuszczalnych farmakologicznie soli, znamienny tym, że pełny jad Agelenopsis aperta eluuje się z kolumny C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 10 pm, stosując szybkość przepływu 15 ml/minutę i układ rozpuszczalnikowy o programie z gradientem liniowym od 5%—20% acetonitrylu, 95%—80% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [0—30 minut], następnie 20%—70% acetonitrylu, 80%—30% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego [30—55 minut] i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję, która eluuje w 41,5 minuty i nanosi się ją na kolumnę C-18 Vydac® o wymiarach 10 mm X 250 mm, wielkość porów 30 nm, wielkość cząstek 5 pm, a następnie eluuje się tę kolumnę z szybkością 3,5 ml/minutę izokratycznym układem rozpuszczalnikowym z 70% 0,1% wodnego kwasu trójfluorooctowego i 30% acetonitrylu z wykrywaniem piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję eluującą w około 7,5 minuty i ewentualnie liofilizuje się ją lub zawiesza się ponownie w wodzie i liofilizuje i ewentualnie otrzymany polipeptyd przekształca się w dopuszczalną farmakologicznie sól.