CZ470790A3

CZ470790A3 - Čištěná polypeptidová sloučenina

Info

Publication number: CZ470790A3
Application number: CS904707A
Authority: CZ
Inventors: Douglas Phillips; Nicholas A. Saccomano; Robert A. Volkmann
Original assignee: Pfizer Inc.; Natural Product Sciences, Inc.
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1998-02-18
Also published as: NO175208C; KR930007435B1; DK0425096T3; PH27403A; AU626203B2; ES2053118T3; NZ235496A; JPH0692440B2; CA2026418A1; EP0425096A1; PT95424A; DE69007739T2; FI96865C; FI96865B; NO904251L; HUT55036A; NO904251D0; HU208705B; AU6366090A; IL95765A

Description

Oblast techniky

1' i Vynález se týká čištěné polypeptidové sloučeniny, která je obsažena v jedu pavouka Agelenopsis aperta a polypeptidu, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako tento polypeptid. Polypeptidy a jejich soli, přijatelné z farmaceutického hlediska, blokují kalciové kanály v buňkách včetně neuronů a svalových buněk různých organismů, a to bezobratlých i obratlovců. Tyto uvedené polypeptidové sloučeniny a jejich soli je možno použít k blokování kalciových kanálů v buňkách, například nervových a svalových buněk v organismu a k léčbě onemocnění a stavů, které byly u savců vyvolány poruchami ve funkcí kalciových kanálů. Tyto látky je možno použít také k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých. Tyto polypeptidové sloučeniny je možno rovněž použít k přípravě farmaceutických prostředků s obsahem těchto polypeptidů a jejich solí.

Dosavadní stav techniky

Z dosavadního stavu techniky je známo, že jed pavouka Agelenopsis aperta obsahuje alespoň dva toxiny, které ovlivňují metabolismus vápníku, přičemž v tomto směru je možno uvést publikaci : Jackson H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987). Autoři této publikace popisují toxin AG2 s molekulovou hmotností nižší než 1000, přičemž je zde rovněž uvedeno, že tento toxin potlačuje přesuny vápníku *

v řadě tkání. Mimoto se v publikaci Jackson H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986) uvádí existence dalšího toxinu téhož pavouka se složkou o hmotností přibližně 6000. Tento toxin ovlivňuje presynoptickou blokádu přenosu a patrně blokuje kanály, jimiž se přepravuje vápník ve spojení s uvolňováním nervového přenosu.

Některé polypeptidy, přítomné v jedu pavouka Agelenopsis aperta jsou uvedeny v patentové přihlášce Spojených států amerických č. 07/346 181, podané 28. dubna 1989. V této přihlášce se uvádí, že tyto polypeptidy jsou blokátory vápníkových kanálů V buňkách, přičemž tyto polypeptidy byly popsány dále uvedeným způsobem podle frakcí, v nichž byly nalezeny.

Frakce G

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

t^N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asnglu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-argcys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thrcys-glu-arg-glv-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-serasp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-sermolekulová hmotnost celého polypeptidu zjištěná metodou FAB MS: 7267.

Frakce t^N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-cys-ala-asp-trp-alagly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cvs-arg-asn--asn-asn-CONHj molekulová hmotnost : FAB MS: 4198.

Frakce H₂

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-argcys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thr-gly-glumolekulová hmotnost celého polypeptidu FAB MS: 5494.

Frakce I

H₂N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gin-gin-cys-ala-asp-trp-ala- . gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-C0NH₂ molekulová hmotnost FAB MS: 4158.

Frakce J

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-thr-his-pro-asp-asp-ala-, molekulová hmotnost celého polypeptidu FAB MS: 5505.

Frakce K

H₂N-glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu-asp-tyr-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg-cys-sermet-ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu-ile-metglu-gly-leu-ser-phe-ala-CONH₂ molekulová hmotnost FAB MS: 5274.

Frakce

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupínou obsahuje:

H₂N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-protrp- met- val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asppřibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je přibližně 20 000.

Frakce L₂ • »

Polypeptid s následujícími vlastnostmi:· , (a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka -·* # .Agelenópsis aperta, která se vymývá na sloupci s rozměry ;

2’2ý x 250 mm v koloně Vydac Č-18 s rozměrem částic 10 μιη· a průměrem pórů 3 x 10~^ cm při rychlostí průtoku 15 ml/min při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5 % až 20 % B, 95 až 80 % A v průběhu 0 až 30 minut a pak í až 70 % B, a 80 až 30 % A mezi 30 až 55 minutami, ořičemž.

A je 0,1 % vodný roztok TFA a B je acetonitril, frakce se vymyje přibližně po 43 minutách a (b) je přítomen ve frakci frakce, popsané v odstavci (a), která se vymývá na sloupci stejných rozměrů s náplní téhož materiálu, avšak při velikosti částic 5 μιη a velikosti pórů 3 X 106 cm při rychlosti průtoku 3,5 ml/mín a při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 25 až % B a 75 až 60 % A v průběhu 0 až 30 minut, kde

A a B mají svrchu uvedený význam, frakce se vymyje po 22,5 min.

Frakce Μ

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-glU'ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-propřibližná-molekulová hmotnost celého polypeptidu je 80 000.

- Sloučeniny, které.jsou antagonisty vápníku, mají široké použití. Tyto sloučeniny je možno použít k léčbě angíny pectoris, zvýšeného krevního tlaku, kardiomyopathii, . „ supraventrikulárních arythmií, jícnové achalasie, . T**. * ¹ ,!|_t .· b> ΊΡ -ň! •fAW·, + předčasného porodu, Raynaudovy choroby a podobně, jak je uvedeno v publikaci Nayler, W.G. , Calcium Antagonists, Academis Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1988. Dále je možno tyto látky použít při zkoumání fyziologie buněk, například nervových a svalových buněk a k potlačení.škůdců ze skupiny bezobratlých.

Podstata vynálezu . ?

Vynález se týká polypeptidů, přítomných v jedu pavouka Agelenopsis aperta.

Podstatou předmětného vynálezu je čištěná polypeptidová sloučenina, která má následující identifikační charakteristiky:

(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac. . rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10^-6 cm, velikost částic 10 μ, za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/rainutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % ——>,.20 % Β, „ .

% —-> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut , potom % -> 70 % B, 80 % -30 % A v průběhu 30 až 55, minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;

I *(b) je přítomna ve frakci frakce popsané v odstavci (a) výše, která se eluuje v koloně C-18 Vydac ó rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů -6 . J**'' . 10 cm, velikost částic 5 za.použití průtokové rychlosti 3,5 mililitru/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A, 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:

l^N-lys-lys-lyš-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-gluCys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- ;

nebo polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako výše uvedený polypeptid a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je touto sloučeninou čištěná polypeptídová sloučenina, ₍ která má následující charakteristiky:

Ί (a) je přítomna ve frakci surové jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů 3 . 10'° cm, rozměr částic 10 za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, a potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A j-e 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;

.. (b) je přítomna ve frakci frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů 'x 250 milimetrů, rozměr pórů - 6 . 10 cm, rozměr částic 5 g, za použití průtokové rychlosti 3.5 mililitrů/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:

l^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lyš-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-íle-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- ;

nebo farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny.

Polypeptid podle vynálezu a frakce, v níž je přítomen, je možno vyjádřit následujícím způsobem:

Frakce Q (a) je přítomna ve frakci surového jedu uvedeného pavouka, která se vymývá na sloupci s rozměry 22 x 250 mm v koloně Vydac C-18 s rozměrem částic 10 pm a rozměrem pórů 3 x 10'⁶ cm při rychlosti průtoku 15 ml/min a při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5 až 20 %

B v průběhu 0 až 30 min a pak 20 až 70 % B mezi 30 až 55 min, přičemž A znamená 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluorootové (TFA) a B je acetonitril, frakce se vymyje přibližně po 41,5 minutách, (b) je přítomen ve frakci frakce, popsané v odstavci (a) , která se vymývá na sloupci s rozměry 10 x 250 mm kolony Vydac C-18 s rozměrem částic 5 pm a rozměrem pórů

--- 3-x l-0-6 cm při rychlosti průtoku 3,5 'inT/min á'při 'použití.....

systému rozpouštědel s obsahem 70 % A a 30 % δ, kde A je 0,1 % vodný roztok TFA a B je acetonitril, frakce se vymyje v průběhu 7,5 minut, a

c) aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

l^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lystrp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- .

Polypeptid podle vynálezu blokuje vápníkové kanály v buňkách a je tedy možno jej použít k tomuto účelu. Dalším možným použitím je potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých a léčba onemocnění a stavů, způsobených u savců chybnou * - I» funkcí kalciových kanálů v buňkách.

Do rozsahu vynálezu spadají také polypeptidy, které mají v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako svrchu uvedený polypeptid.

Tyto polypeptidové sloučeniny podle vynálezu je možno rovněž použít k přípravě farmaceutických prostředků s obsahem těchto polypeptidů.

Jed je možno získat od pavouka Agelenopsis aperta elektrickým podrážděním běžnými postupy, které jsou v tomto - oboru podle dosavadního stavu techniky známy V tomto případě je výhodné použít takovou metodu, která brání kontaminaci jedu abdominální regurgitací hemolyrafy. Tyto postupy jsou v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky rovněž známy. Celý obsah jedu, získaný tímto způsobem se skladuje ve zmrazeném stavu pří teplotě přibližně -78 °C až do svého čištění, které bude dále popsáno.

Čištění složek jedu se provádí vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) s reverzními fázemi na různých preparátivních a semipreparativních sloupcích, jako jsou například sloupce C-4 a C-18 Vydac (Rainin Instrumet Co. Inc., Mack Road, Voburn Massachusetts 01801). Detekce se provádí monochromaticky v rozmezí 220 až 230 nm. Další analýzu frakcí je možno provádět například při použití údajů, získaných v UV světle při použití detektoru s diodou .Vaters 990 (Millipore Corporation, Vaters Chromátography Division, 34 Maple Street, Mildford, Massachusetts 01757). Frakce ze sloupce se odebírají známým způsobem, například při použití automatického kolektoru ISCO/FOXY a detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504).

Frakce se odebírají do zásobníků s příslušným objemem, například vyrobené ze sterilního polyethylenu. V dalším postupu se tyto frakce koncentrují lyofilizací z eluátu a pak se ještě lyofilizují z vody. Čistotu výsledných frakcí je pak možno stanovit chromatograficky při použití analytického sloupce s gradientovým systémem, který je více isokratický než systém, užitý pro konečné čištění frakcí.

Struktury látek v různých frakcích se stanoví známými analytickými postupy, jako například hmotovou spektrometrií a nukleární magnetickou resonancí. Polypeptid ve frakcí Q byl sekvenován známým způsobem. Je například možno provést S-pyridylethylaci cystinových zbytků v polypeptidu, který je určen k analyzování, v roztoku a pak stanovit jeho řetězec aminokyselin. Rovněž je například možno postupovat tak, že , se jeden až 10 pg polypeptidu rozpustí nebo zředí na 50 μΐ — pufrem, který se získá smísením'1 dílů ÍM třiš HC! o' pH '875 s obsahem 4 mM EDTA a 3 dílů 8M guanidinhydrochloridu.

V dalším postupu se přidá 2,5 pl 10.% vodného

2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti ve tmě v argonové atmosféře 2 hodiny. Po inkubaci se přidají 2 pl 4-vinylpyridinu (čerstvé reakční činidlo, uchovávané pod argonem při teplotě -20 °C) a směs se inkubuje další 2 hodiny ve tmě v argonové atmosféře. Pak se směs zbaví solí, s výhodou chromatografií na krátkém sloupci v reverzní fázi, načež se stanoví řetězec alkylovaného polypeptidu známým způsobem.

Při provádění postupu přípravy uvedených, polypeptidových sloučenin podle vynálezu bylo zjištěno, že vhodným sloupcem pro počáteční frakcionaci jedu je sloupec C-18 Vydac s rozměry 2 x 250 mm, rozměry pórů 3 x 10cm, rozměry částic 10 pm. Tento sloupec se vymývá při rychlosti průtoku 15 ml/mxn při použití lineárního gradientu 95 až 80 % A, 5 až 20 % B v průběhu 0 až 30 minut a pak 80 až 30 % A a 20 až 70 % B mezi 30 a 55 minutami, přičemž A je 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové (TFA) a B je acetonitril. Frakce se odebírají svrchu popsaným způsobem. Jedna ze získaných frakcí byla označena Q a tato frakce byla vybrána pro další čištění. Eluční doba této frakce byla 41,5 minut.

Frakce Q bylo podrobeno dalšímu čištění při použití sloupce C-18 Vydac s rozměry 10 x 250 mm při velikosti pórů 3 x 10”/·* a průměru částic 5,0 pm při rychlosti průtoku 3,5. ml/min:a při použití isokratického systémuJ70 %, 0,1 % vodného roztoku TFA a 30 % acetonitrilu. Frakce byly odebírány svrchu uvedeným způsobem. Frakce Q vychází ze sloupce přibližně v době 7,5 minut. Bylo také zjištěno, že frakce, která se vymývá za 8,3 minuty obsahuje polypeptid, popsaný v patentové přihlášce Spojených států amerických č. 07/346 181 jako frakce K.

Frakce Q obsahuje polypeptid s následující sekvencí aminokyselin s koncovou aminoskupinou:

F^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.

Vzhledem k získání sloučeniny, přítomné ve frakci Q jedu pavouka Agelenopsis aperta, je nyní možno získat tuto látku jiným způsobem než izolací a čištěním jedu. Polypeptid je možno získat pří použití rekombinantní DNA klonováním kódového řetězce pro tento polypeptid nebo jeho částí.

Například je možno použít hybridizační sondy, založené na znalosti řetězce aminokyselin tohoto polypeptidu a použít tuto metodu známým způsobem pro klonování kódového řetězce pro celý polypeptid. Je také možno k výrobě polypeptidu užít kombinace rekombinantní techniky a syntézy bílkoviny in vitro. Syntéza in vitro zahrnuje například použití syntetizátoru peptidů v pevné fázi ABI 430A (Applied Biosysteras, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404), při použití standardních postupů podle Merrifielda nebo. jiných metod běžně známých v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky..

Všeobecně je známo, že v polypeptidech je možno nahradit některé aminokyseliny jinými aminokyselinami tak, že nedojde nebo v podstatě nedojde k ovlivnění funkce polypeptidu. Aminokyseliny, které lze takto nahradit se od . __ -pol-y peptidů- k polypeptidu Tiší. Stanovení možných' 'substituci' je v tomto oboru z dosavadního stavu techniky běžně známé.

Do oboru vynálezu tedy spadají všechny polypeptidy s v podstatě stejným řetězcem aminokyselin a v podstatě stejnou účinností na vápníkové kanály. ..,

Polypeptidy podle vynálezu irreversibilně blokují kalciové kanály v různých buňkách, například v buňkách nervového a svalového systému bezobratlých i obratlovců.

Tuto schopnost polypeptidů podle vynálezu je možno prokázat následujícím způsobem: Mozečkové buňky byly připraveny z mozečků 8 dní starých krys způsobem podle publikace Wilkin G.P. a kol., Brain Res.: 115, 181 až 199, 1976. Potom byly čtverce Aclar (Proplastics lne., 5033 Industrial Ave., Valí, 35, N.J., 07719) o rozměru 1 cm^ povlečeny poly-L-lysinem a uloženy do plat s 12 jímkami s obsahem Eaglova základního prostředí. Do každé j ímky £ s obsahem čtverce z Aclaru bylo přidáno 6,25 x 10° mozečkových buněk. Po 24 hodinách pak byl přidán cytosin-p-D-arabinofuranosid do koncentrace 10 μΜ. Buňky byly užity pro analýzu f ura2 po 6, 7 a 8 dnech pěstování. Buňky, ulpělé na čtvercích Aclar byly přeneseny do plat s 12 jímkami s obsahem 1 ml 2 μΜ fura2/AM (Molecular Probes lne., Eugene, OR, 97402), v pufru HEPES s obsahem 0,01 % sérového bovinního albuminu, 0,01 % dextrosy o pH 7,4, ‘ přičemž pufr byl prostý hořčíku. Buňky byly inkubovány .40 minut při teplotě 37 °C, pak byl pufr s obsahem fura2/AM odstraněn a nahražen 1 mililitrem téhož pufru bez uvedené látky. Do -kyvety z křemene byly vloženy 2,0 mililitry pufru, předehřátého na 37 °C. Buňky na čtvercích Aclaru byly potom vloženy do kyvety a tato kyveta byla uložena při teplotě 37 C do termostatu, opatřeného magnetickým míchadlém a pak byla měřena fluorescence pomocí fluorescenčního spektrofotometru (Biomedical Instruments Group, University of Pennsylvania). Fluorescenční signál se nechá stabilizovat 2 minuty a pak se přidá 5 áž 20 μΐ zásobního roztoku zkoumané sloučeniny ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS, pH 7,4) v příslušné koncentraci. Kalibrace fluorescenčního signálu a oprava na únik fura2/Ah se provede doporučeným postupem podle publikace Nemeth a kol., J. Biol. Chem., 262 : 5188 (1987) po ukončení každé zkoušky. Maximální hodnota fluorescence (Fmax) se stanoví přidáním ionomycinu do 35 μμί a minimální hodnota fluorescence (Fmin) se stanoví následným přidáním EGTA do 12 mM ke vzniku chelátu vápníku.

Při použití tohoto postupu je možno prokázat blokování vápníkových kanálů určitou látkou podle poklesu fluorescence po přidání zkoumané látky.

Polypeptid podle vynálezu je možno užít jako všechny látky s podobným účinkem k blokování vápníkových kanálů v buňkách, k hubení škůdců ze skupiny bezobratlých a k léčbě onemocnění a stavů, způsobených funkcí kalciových kanálů v buňkách savců, jako jsou angína pectoris, zvýšený krevní tlak, kardiomyopathie, supraventikulární arythmie, jícnová achalasie, předčasný porod a Raynaudova nemoc. Dále je možno tyto látky použít k výzkumu fyziologie buněk, včetně buněk nervového a svalového systému.

Do rozsahu předmětného vynálezu spadají rovněž soli uvedeného polypeptidů, přijatelné z farmaceutického hlediska. Tyto soli se vyrábějí způsobem běžně známým z dosavadního stavu techniky v tomto oboru. Tímto způsobem je například možno připravit bazické soli.

V případě, že polypeptid podle vynálezu má být podán savcům, je možno jej podat jako takový nebo v kombinaci s nosičem nebo ředidlem, to znamená s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičovou látkou, ve formě j

obvyklých farmaceutických prostředků, které je možno podávat perorálně nebo s výhodou parenterálně, například nitrožilně, nitrosvalově, intraperitonálně, podkožně nebo místně.

Pro perorální podání je možno zpracovat polypeptid například na tablety nebo kapsle nebo na vodné roztoky nebo suspenze. V případě tablet pro perorální podání se přidávají obvyklé nosičové látky, včetně laktosy a kukuřičného škrobu, a kluzné látky, například stearan hořečnatý. Pro perorální podání ve formě kapslí jsou vhodnými ředidly laktosa a sušený kukuřičný škrob. Při výrobě vodných suspenzí pro perorální podání se účinná složka mísí s emulgátory a Činidly, které napomáhají vzniku suspenze. Popřípadě je možno přidat sladidla a/nebo chufové látky.

Pro nitrosvalové, intraperitoneální, podkožní a nítrožílní použití se obvykle připravují sterilní roztoky účinné-látky, jejichž pH je možno upravit, a zajistit přidáním pufru. Pro nitrožilní použití je nutno zajistit také izotonicitu roztoku.

V případě, že se polypeptid nebo jeho sůl použije k léčení lidí, závisí použitá dávka na věku, hmotnosti, závažnosti onemocnění a účinnosti použitého derivátu, přičemž přesnou dávku vždy stanoví lékař.

*' . Ί . t „ nv> · 1 μ» ^.s. · J

V případě, že se polypeptid podle vynálezu nebo jeho sůl užije k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých, podává se tento škůdcům přímo nebo do prostředí, v němž žijí. Například je možno užít postřiku. Nutné množství látky závisí na škůdci a na podmínkách použití.

V případě použití k výzkumu fyziologie buněk se polypeptid podává známým způsobem, například v příslušném pufru. Vhodná koncentrace k tomuto účelu je asi 100 μΜ. Tato koncentrace však může být i vyšší až do 100 μΜ. Použité vhodné množství snadno stanoví každý odborník pracující v daném oboru.

Příklady provedení vynálezu

Čištěná polypeptidová sloučenina a postup její přípravy budou blíže osvětleny s pomocí následujících příkladů provedení, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

- 16 Příklad 1

Počáteční frakcionace jedu Agelenopsis aperta

Jed Agelenopsis aperta, získaný od Natural Products Sciencec Inc., Salt Lake City, Utah 84108 a skladovaný ve zmrazeném stavu při teplotě -78 °C byl roztát a 10 až 60^ul tohoto jedu bylo zředěno na 200/Ul a naneseno na chromatografický sloupec C-18 Vydac s rozměry 22 x 250 mm s průměrem pórů 3 x 10^ cm při středním průměru částic 10/um a sloupec byl vymýván rychlostí 15 ml/min systémem rozpouštědel při pažití lineárního gradientu 5 až 20 % B a 95 až 80 % A v průběhu 0 až 30 minut a pak 20 až % B a 80 až 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, přičemž A je 0,1% vodné TFA a B je acetonitril. Detekce vrcholů byla prováděna monochromaticky při 220 až 230 nm a frakce byly odebírány zařízením ISC0/F0XY kolektorem s detektorem ISCO 2159« Frakce byly odebírány v rozmezí 20 až 60 minut.

fc

Frakce Q^# hýla vymyta po přibližně 41,5 minutách.

*>

- 17 Příklad 2

Subfrakcionace frakce Q* a stanovení struktur v této frakci

Frakce Q', získané způsobem podle příkladu 1 byla nanesena na chromatografický sloupec C-18 Vydac s rozměrem 10 x 250 mm, při velikosti pórů 3 x 10* cm a středním průměru částic 5/um a sloupec byl vymýván rychlostí 3,5 ml/min při použití-isokratického systému rozpouš- „ _ tědla 70 % A a 30 % B ve významu z příkladu 1. Detekce vrcholů byla prováděna detektorem Waters 990 s diodou a frakce se odebírají podle příkladu 1. Byly získány dvě frakce následujícím způsobem:

frakce doba eluce

Q přibližně 7,5 minut

K přibližně 8,3 minuty ^F řFrakce Q a K, které obsahují pólypeptidy pak byly připraveny lyofilizací z ředidla a pak lyofilizací z vody známým způsobem tak, aby bylo možno provést analýzu řetězce.

*

Analýza řetězce aminokyselin alkylovaného polypeptidu z frakcí Q a K byla získána při použití metody Weters Pico-Tag podle doporučení výrobce. Údaje byly získány při použití zařízení Applied Biosystems model #70A

- 18 protein/peptide sequencer (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) při použití vodné TFA. Analýza vzniklých fenylthiohydantionaminokyselin byla prováděna analyzátorem aminokyselin Applied Biosystems model 120A PTH nebo pomocí sloupce DuPont Zorbax PTH (Biomedical Product Department, Chromatography Products, Ε. I. duPont de Memours and Co., Inc., 1007 Markét Street, Wilmington, Delaware 19898).

Výsledkem analýzy aminokyselin je aminoterminální řetězec aminokyselin části polypeptidu, představované frakci Q:____ _____ _

HgN-lys-lye-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-ijiet*glu-gly-leu“.

Analýzou řetězce aminokyseliny bylo také možno stanovit, že polypeptid z frakce K byl popsán v US patentové přihlášce Č. 07/346 181.

A

P AT ENT O V É

Claims

NÁROKY

1. Čištěná polypeptidová sloučenina, která má r

následující identifikační charakteristiky: » í

(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10cm, velikost částic 10 )p-', za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % --> 80 %.A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 a’ž~55 minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;

(b) je přítomna ve frakci frakce popsané v odstavci (a) výše, která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10 cm, velikost částic 5 tyf, za použití průtokové rychlosti 3,5 mililitru/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A, 30 % B, kde A je

0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:

ř^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg- * giy -cys-ile-cys-ser-ile-met-glý-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- ; ^J nebo polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako výše uvedený polypeptid | a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny.
2. Čištěná polypeptidová sloučenina podle nároku 1, která má následující charakteristiky:

(a) je přítomna ve frakci surové jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů . 10 cm, rozměr částic 10 za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, a potom __________ - -20,% — -t> 70-%-B,- 80 -> -30--% A- -v průběhu“30 až 55^__ minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, pří asi 41,5 minutách;

(b) je přítomna ve frakci frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a) , která se eluuje v koloně C-18 Vydac-, . o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů

- 6 v ijťnv . 10 cm, rozměr částic 5 jY, za použití průtokové rychlosti 3.5 mililitrů/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou ,_t je tvořen: