CZ470790A3 - Čištěná polypeptidová sloučenina - Google Patents
Čištěná polypeptidová sloučenina Download PDFInfo
- Publication number
- CZ470790A3 CZ470790A3 CS904707A CS470790A CZ470790A3 CZ 470790 A3 CZ470790 A3 CZ 470790A3 CS 904707 A CS904707 A CS 904707A CS 470790 A CS470790 A CS 470790A CZ 470790 A3 CZ470790 A3 CZ 470790A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cys
- gly
- lys
- minutes
- fraction
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 67
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 241000238898 Agelenopsis aperta Species 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 239000002435 venom Substances 0.000 claims abstract description 9
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims abstract description 9
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000008061 calcium-channel-blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 abstract description 13
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 9
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 229920004439 Aclar® Polymers 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000005023 polychlorotrifluoroethylene (PCTFE) polymer Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002708 spider venom Substances 0.000 description 3
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 description 2
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 2
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010067171 Regurgitation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005055 short column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
- A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
- Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Neurology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Oblast techniky
1' i Vynález se týká čištěné polypeptidové sloučeniny, která je obsažena v jedu pavouka Agelenopsis aperta a polypeptidu, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako tento polypeptid. Polypeptidy a jejich soli, přijatelné z farmaceutického hlediska, blokují kalciové kanály v buňkách včetně neuronů a svalových buněk různých organismů, a to bezobratlých i obratlovců. Tyto uvedené polypeptidové sloučeniny a jejich soli je možno použít k blokování kalciových kanálů v buňkách, například nervových a svalových buněk v organismu a k léčbě onemocnění a stavů, které byly u savců vyvolány poruchami ve funkcí kalciových kanálů. Tyto látky je možno použít také k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých. Tyto polypeptidové sloučeniny je možno rovněž použít k přípravě farmaceutických prostředků s obsahem těchto polypeptidů a jejich solí.
Dosavadní stav techniky
Z dosavadního stavu techniky je známo, že jed pavouka Agelenopsis aperta obsahuje alespoň dva toxiny, které ovlivňují metabolismus vápníku, přičemž v tomto směru je možno uvést publikaci : Jackson H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987). Autoři této publikace popisují toxin AG2 s molekulovou hmotností nižší než 1000, přičemž je zde rovněž uvedeno, že tento toxin potlačuje přesuny vápníku *
v řadě tkání. Mimoto se v publikaci Jackson H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986) uvádí existence dalšího toxinu téhož pavouka se složkou o hmotností přibližně 6000. Tento toxin ovlivňuje presynoptickou blokádu přenosu a patrně blokuje kanály, jimiž se přepravuje vápník ve spojení s uvolňováním nervového přenosu.
Některé polypeptidy, přítomné v jedu pavouka Agelenopsis aperta jsou uvedeny v patentové přihlášce Spojených států amerických č. 07/346 181, podané 28. dubna 1989. V této přihlášce se uvádí, že tyto polypeptidy jsou blokátory vápníkových kanálů V buňkách, přičemž tyto polypeptidy byly popsány dále uvedeným způsobem podle frakcí, v nichž byly nalezeny.
Frakce G
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
t^N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asnglu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-argcys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thrcys-glu-arg-glv-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-serasp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-sermolekulová hmotnost celého polypeptidu zjištěná metodou FAB MS: 7267.
Frakce t^N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-cys-ala-asp-trp-alagly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cvs-arg-asn--asn-asn-CONHj molekulová hmotnost : FAB MS: 4198.
Frakce H2
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-argcys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thr-gly-glumolekulová hmotnost celého polypeptidu FAB MS: 5494.
Frakce I
H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gin-gin-cys-ala-asp-trp-ala- . gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-C0NH2 molekulová hmotnost FAB MS: 4158.
Frakce J
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-thr-his-pro-asp-asp-ala-, molekulová hmotnost celého polypeptidu FAB MS: 5505.
Frakce K
H2N-glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu-asp-tyr-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg-cys-sermet-ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu-ile-metglu-gly-leu-ser-phe-ala-CONH2 molekulová hmotnost FAB MS: 5274.
Frakce
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupínou obsahuje:
H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-protrp- met- val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asppřibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je přibližně 20 000.
Frakce L2 • »
Polypeptid s následujícími vlastnostmi:· , (a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka -·* # .Agelenópsis aperta, která se vymývá na sloupci s rozměry ;
2’2ý x 250 mm v koloně Vydac Č-18 s rozměrem částic 10 μιη· a průměrem pórů 3 x 10~^ cm při rychlostí průtoku 15 ml/min při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5 % až 20 % B, 95 až 80 % A v průběhu 0 až 30 minut a pak í až 70 % B, a 80 až 30 % A mezi 30 až 55 minutami, ořičemž.
A je 0,1 % vodný roztok TFA a B je acetonitril, frakce se vymyje přibližně po 43 minutách a (b) je přítomen ve frakci frakce, popsané v odstavci (a), která se vymývá na sloupci stejných rozměrů s náplní téhož materiálu, avšak při velikosti částic 5 μιη a velikosti pórů 3 X 106 cm při rychlosti průtoku 3,5 ml/mín a při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 25 až % B a 75 až 60 % A v průběhu 0 až 30 minut, kde
A a B mají svrchu uvedený význam, frakce se vymyje po 22,5 min.
Frakce Μ
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
H2N-glU'ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-propřibližná-molekulová hmotnost celého polypeptidu je 80 000.
- Sloučeniny, které.jsou antagonisty vápníku, mají široké použití. Tyto sloučeniny je možno použít k léčbě angíny pectoris, zvýšeného krevního tlaku, kardiomyopathii, . „ supraventrikulárních arythmií, jícnové achalasie, . T**. * 1 ,!|t .· b> ΊΡ -ň! •fAW·, + předčasného porodu, Raynaudovy choroby a podobně, jak je uvedeno v publikaci Nayler, W.G. , Calcium Antagonists, Academis Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1988. Dále je možno tyto látky použít při zkoumání fyziologie buněk, například nervových a svalových buněk a k potlačení.škůdců ze skupiny bezobratlých.
Podstata vynálezu . ?
Vynález se týká polypeptidů, přítomných v jedu pavouka Agelenopsis aperta.
Podstatou předmětného vynálezu je čištěná polypeptidová sloučenina, která má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac. . rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10-6 cm, velikost částic 10 μ, za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/rainutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % ——>,.20 % Β, „ .
% —-> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut , potom % -> 70 % B, 80 % -30 % A v průběhu 30 až 55, minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;
I *(b) je přítomna ve frakci frakce popsané v odstavci (a) výše, která se eluuje v koloně C-18 Vydac ó rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů -6 . J**'' . 10 cm, velikost částic 5 za.použití průtokové rychlosti 3,5 mililitru/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A, 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:
l^N-lys-lys-lyš-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-gluCys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- ;
nebo polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako výše uvedený polypeptid a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny.
Ve výhodném provedení podle vynálezu je touto sloučeninou čištěná polypeptídová sloučenina, ( která má následující charakteristiky:
Ί (a) je přítomna ve frakci surové jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů 3 . 10'° cm, rozměr částic 10 za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, a potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A j-e 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;
.. (b) je přítomna ve frakci frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů 'x 250 milimetrů, rozměr pórů - 6 . 10 cm, rozměr částic 5 g, za použití průtokové rychlosti 3.5 mililitrů/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:
l^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lyš-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arggly-cys-íle-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- ;
nebo farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny.
Polypeptid podle vynálezu a frakce, v níž je přítomen, je možno vyjádřit následujícím způsobem:
Frakce Q (a) je přítomna ve frakci surového jedu uvedeného pavouka, která se vymývá na sloupci s rozměry 22 x 250 mm v koloně Vydac C-18 s rozměrem částic 10 pm a rozměrem pórů 3 x 10'6 cm při rychlosti průtoku 15 ml/min a při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5 až 20 %
B v průběhu 0 až 30 min a pak 20 až 70 % B mezi 30 až 55 min, přičemž A znamená 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluorootové (TFA) a B je acetonitril, frakce se vymyje přibližně po 41,5 minutách, (b) je přítomen ve frakci frakce, popsané v odstavci (a) , která se vymývá na sloupci s rozměry 10 x 250 mm kolony Vydac C-18 s rozměrem částic 5 pm a rozměrem pórů
--- 3-x l-0-6 cm při rychlosti průtoku 3,5 'inT/min á'při 'použití.....
systému rozpouštědel s obsahem 70 % A a 30 % δ, kde A je 0,1 % vodný roztok TFA a B je acetonitril, frakce se vymyje v průběhu 7,5 minut, a
c) aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
l^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lystrp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- .
Polypeptid podle vynálezu blokuje vápníkové kanály v buňkách a je tedy možno jej použít k tomuto účelu. Dalším možným použitím je potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých a léčba onemocnění a stavů, způsobených u savců chybnou * - I» funkcí kalciových kanálů v buňkách.
Do rozsahu vynálezu spadají také polypeptidy, které mají v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako svrchu uvedený polypeptid.
Tyto polypeptidové sloučeniny podle vynálezu je možno rovněž použít k přípravě farmaceutických prostředků s obsahem těchto polypeptidů.
Jed je možno získat od pavouka Agelenopsis aperta elektrickým podrážděním běžnými postupy, které jsou v tomto - oboru podle dosavadního stavu techniky známy V tomto případě je výhodné použít takovou metodu, která brání kontaminaci jedu abdominální regurgitací hemolyrafy. Tyto postupy jsou v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky rovněž známy. Celý obsah jedu, získaný tímto způsobem se skladuje ve zmrazeném stavu pří teplotě přibližně -78 °C až do svého čištění, které bude dále popsáno.
Čištění složek jedu se provádí vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) s reverzními fázemi na různých preparátivních a semipreparativních sloupcích, jako jsou například sloupce C-4 a C-18 Vydac (Rainin Instrumet Co. Inc., Mack Road, Voburn Massachusetts 01801). Detekce se provádí monochromaticky v rozmezí 220 až 230 nm. Další analýzu frakcí je možno provádět například při použití údajů, získaných v UV světle při použití detektoru s diodou .Vaters 990 (Millipore Corporation, Vaters Chromátography Division, 34 Maple Street, Mildford, Massachusetts 01757). Frakce ze sloupce se odebírají známým způsobem, například při použití automatického kolektoru ISCO/FOXY a detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504).
Frakce se odebírají do zásobníků s příslušným objemem, například vyrobené ze sterilního polyethylenu. V dalším postupu se tyto frakce koncentrují lyofilizací z eluátu a pak se ještě lyofilizují z vody. Čistotu výsledných frakcí je pak možno stanovit chromatograficky při použití analytického sloupce s gradientovým systémem, který je více isokratický než systém, užitý pro konečné čištění frakcí.
Struktury látek v různých frakcích se stanoví známými analytickými postupy, jako například hmotovou spektrometrií a nukleární magnetickou resonancí. Polypeptid ve frakcí Q byl sekvenován známým způsobem. Je například možno provést S-pyridylethylaci cystinových zbytků v polypeptidu, který je určen k analyzování, v roztoku a pak stanovit jeho řetězec aminokyselin. Rovněž je například možno postupovat tak, že , se jeden až 10 pg polypeptidu rozpustí nebo zředí na 50 μΐ — pufrem, který se získá smísením'1 dílů ÍM třiš HC! o' pH '875 s obsahem 4 mM EDTA a 3 dílů 8M guanidinhydrochloridu.
V dalším postupu se přidá 2,5 pl 10.% vodného
2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti ve tmě v argonové atmosféře 2 hodiny. Po inkubaci se přidají 2 pl 4-vinylpyridinu (čerstvé reakční činidlo, uchovávané pod argonem při teplotě -20 °C) a směs se inkubuje další 2 hodiny ve tmě v argonové atmosféře. Pak se směs zbaví solí, s výhodou chromatografií na krátkém sloupci v reverzní fázi, načež se stanoví řetězec alkylovaného polypeptidu známým způsobem.
Při provádění postupu přípravy uvedených, polypeptidových sloučenin podle vynálezu bylo zjištěno, že vhodným sloupcem pro počáteční frakcionaci jedu je sloupec C-18 Vydac s rozměry 2 x 250 mm, rozměry pórů 3 x 10cm, rozměry částic 10 pm. Tento sloupec se vymývá při rychlosti průtoku 15 ml/mxn při použití lineárního gradientu 95 až 80 % A, 5 až 20 % B v průběhu 0 až 30 minut a pak 80 až 30 % A a 20 až 70 % B mezi 30 a 55 minutami, přičemž A je 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové (TFA) a B je acetonitril. Frakce se odebírají svrchu popsaným způsobem. Jedna ze získaných frakcí byla označena Q a tato frakce byla vybrána pro další čištění. Eluční doba této frakce byla 41,5 minut.
Frakce Q bylo podrobeno dalšímu čištění při použití sloupce C-18 Vydac s rozměry 10 x 250 mm při velikosti pórů 3 x 10”/·* a průměru částic 5,0 pm při rychlosti průtoku 3,5. ml/min:a při použití isokratického systémuJ70 %, 0,1 % vodného roztoku TFA a 30 % acetonitrilu. Frakce byly odebírány svrchu uvedeným způsobem. Frakce Q vychází ze sloupce přibližně v době 7,5 minut. Bylo také zjištěno, že frakce, která se vymývá za 8,3 minuty obsahuje polypeptid, popsaný v patentové přihlášce Spojených států amerických č. 07/346 181 jako frakce K.
Frakce Q obsahuje polypeptid s následující sekvencí aminokyselin s koncovou aminoskupinou:
F^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
Vzhledem k získání sloučeniny, přítomné ve frakci Q jedu pavouka Agelenopsis aperta, je nyní možno získat tuto látku jiným způsobem než izolací a čištěním jedu. Polypeptid je možno získat pří použití rekombinantní DNA klonováním kódového řetězce pro tento polypeptid nebo jeho částí.
Například je možno použít hybridizační sondy, založené na znalosti řetězce aminokyselin tohoto polypeptidu a použít tuto metodu známým způsobem pro klonování kódového řetězce pro celý polypeptid. Je také možno k výrobě polypeptidu užít kombinace rekombinantní techniky a syntézy bílkoviny in vitro. Syntéza in vitro zahrnuje například použití syntetizátoru peptidů v pevné fázi ABI 430A (Applied Biosysteras, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404), při použití standardních postupů podle Merrifielda nebo. jiných metod běžně známých v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky..
Všeobecně je známo, že v polypeptidech je možno nahradit některé aminokyseliny jinými aminokyselinami tak, že nedojde nebo v podstatě nedojde k ovlivnění funkce polypeptidu. Aminokyseliny, které lze takto nahradit se od . __ -pol-y peptidů- k polypeptidu Tiší. Stanovení možných' 'substituci' je v tomto oboru z dosavadního stavu techniky běžně známé.
Do oboru vynálezu tedy spadají všechny polypeptidy s v podstatě stejným řetězcem aminokyselin a v podstatě stejnou účinností na vápníkové kanály. ..,
Polypeptidy podle vynálezu irreversibilně blokují kalciové kanály v různých buňkách, například v buňkách nervového a svalového systému bezobratlých i obratlovců.
Tuto schopnost polypeptidů podle vynálezu je možno prokázat následujícím způsobem: Mozečkové buňky byly připraveny z mozečků 8 dní starých krys způsobem podle publikace Wilkin G.P. a kol., Brain Res.: 115, 181 až 199, 1976. Potom byly čtverce Aclar (Proplastics lne., 5033 Industrial Ave., Valí, 35, N.J., 07719) o rozměru 1 cm^ povlečeny poly-L-lysinem a uloženy do plat s 12 jímkami s obsahem Eaglova základního prostředí. Do každé j ímky £ s obsahem čtverce z Aclaru bylo přidáno 6,25 x 10° mozečkových buněk. Po 24 hodinách pak byl přidán cytosin-p-D-arabinofuranosid do koncentrace 10 μΜ. Buňky byly užity pro analýzu f ura2 po 6, 7 a 8 dnech pěstování. Buňky, ulpělé na čtvercích Aclar byly přeneseny do plat s 12 jímkami s obsahem 1 ml 2 μΜ fura2/AM (Molecular Probes lne., Eugene, OR, 97402), v pufru HEPES s obsahem 0,01 % sérového bovinního albuminu, 0,01 % dextrosy o pH 7,4, ‘ přičemž pufr byl prostý hořčíku. Buňky byly inkubovány .40 minut při teplotě 37 °C, pak byl pufr s obsahem fura2/AM odstraněn a nahražen 1 mililitrem téhož pufru bez uvedené látky. Do -kyvety z křemene byly vloženy 2,0 mililitry pufru, předehřátého na 37 °C. Buňky na čtvercích Aclaru byly potom vloženy do kyvety a tato kyveta byla uložena při teplotě 37 C do termostatu, opatřeného magnetickým míchadlém a pak byla měřena fluorescence pomocí fluorescenčního spektrofotometru (Biomedical Instruments Group, University of Pennsylvania). Fluorescenční signál se nechá stabilizovat 2 minuty a pak se přidá 5 áž 20 μΐ zásobního roztoku zkoumané sloučeniny ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS, pH 7,4) v příslušné koncentraci. Kalibrace fluorescenčního signálu a oprava na únik fura2/Ah se provede doporučeným postupem podle publikace Nemeth a kol., J. Biol. Chem., 262 : 5188 (1987) po ukončení každé zkoušky. Maximální hodnota fluorescence (Fmax) se stanoví přidáním ionomycinu do 35 μμί a minimální hodnota fluorescence (Fmin) se stanoví následným přidáním EGTA do 12 mM ke vzniku chelátu vápníku.
Při použití tohoto postupu je možno prokázat blokování vápníkových kanálů určitou látkou podle poklesu fluorescence po přidání zkoumané látky.
Polypeptid podle vynálezu je možno užít jako všechny látky s podobným účinkem k blokování vápníkových kanálů v buňkách, k hubení škůdců ze skupiny bezobratlých a k léčbě onemocnění a stavů, způsobených funkcí kalciových kanálů v buňkách savců, jako jsou angína pectoris, zvýšený krevní tlak, kardiomyopathie, supraventikulární arythmie, jícnová achalasie, předčasný porod a Raynaudova nemoc. Dále je možno tyto látky použít k výzkumu fyziologie buněk, včetně buněk nervového a svalového systému.
Do rozsahu předmětného vynálezu spadají rovněž soli uvedeného polypeptidů, přijatelné z farmaceutického hlediska. Tyto soli se vyrábějí způsobem běžně známým z dosavadního stavu techniky v tomto oboru. Tímto způsobem je například možno připravit bazické soli.
V případě, že polypeptid podle vynálezu má být podán savcům, je možno jej podat jako takový nebo v kombinaci s nosičem nebo ředidlem, to znamená s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičovou látkou, ve formě j
obvyklých farmaceutických prostředků, které je možno podávat perorálně nebo s výhodou parenterálně, například nitrožilně, nitrosvalově, intraperitonálně, podkožně nebo místně.
Pro perorální podání je možno zpracovat polypeptid například na tablety nebo kapsle nebo na vodné roztoky nebo suspenze. V případě tablet pro perorální podání se přidávají obvyklé nosičové látky, včetně laktosy a kukuřičného škrobu, a kluzné látky, například stearan hořečnatý. Pro perorální podání ve formě kapslí jsou vhodnými ředidly laktosa a sušený kukuřičný škrob. Při výrobě vodných suspenzí pro perorální podání se účinná složka mísí s emulgátory a Činidly, které napomáhají vzniku suspenze. Popřípadě je možno přidat sladidla a/nebo chufové látky.
Pro nitrosvalové, intraperitoneální, podkožní a nítrožílní použití se obvykle připravují sterilní roztoky účinné-látky, jejichž pH je možno upravit, a zajistit přidáním pufru. Pro nitrožilní použití je nutno zajistit také izotonicitu roztoku.
V případě, že se polypeptid nebo jeho sůl použije k léčení lidí, závisí použitá dávka na věku, hmotnosti, závažnosti onemocnění a účinnosti použitého derivátu, přičemž přesnou dávku vždy stanoví lékař.
*' . Ί . t „ nv> · 1 μ» ^.s. · J
V případě, že se polypeptid podle vynálezu nebo jeho sůl užije k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých, podává se tento škůdcům přímo nebo do prostředí, v němž žijí. Například je možno užít postřiku. Nutné množství látky závisí na škůdci a na podmínkách použití.
V případě použití k výzkumu fyziologie buněk se polypeptid podává známým způsobem, například v příslušném pufru. Vhodná koncentrace k tomuto účelu je asi 100 μΜ. Tato koncentrace však může být i vyšší až do 100 μΜ. Použité vhodné množství snadno stanoví každý odborník pracující v daném oboru.
Příklady provedení vynálezu
Čištěná polypeptidová sloučenina a postup její přípravy budou blíže osvětleny s pomocí následujících příkladů provedení, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.
- 16 Příklad 1
Počáteční frakcionace jedu Agelenopsis aperta
Jed Agelenopsis aperta, získaný od Natural Products Sciencec Inc., Salt Lake City, Utah 84108 a skladovaný ve zmrazeném stavu při teplotě -78 °C byl roztát a 10 až 60^ul tohoto jedu bylo zředěno na 200/Ul a naneseno na chromatografický sloupec C-18 Vydac s rozměry 22 x 250 mm s průměrem pórů 3 x 10^ cm při středním průměru částic 10/um a sloupec byl vymýván rychlostí 15 ml/min systémem rozpouštědel při pažití lineárního gradientu 5 až 20 % B a 95 až 80 % A v průběhu 0 až 30 minut a pak 20 až % B a 80 až 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, přičemž A je 0,1% vodné TFA a B je acetonitril. Detekce vrcholů byla prováděna monochromaticky při 220 až 230 nm a frakce byly odebírány zařízením ISC0/F0XY kolektorem s detektorem ISCO 2159« Frakce byly odebírány v rozmezí 20 až 60 minut.
fc
Frakce Q# hýla vymyta po přibližně 41,5 minutách.
*>
- 17 Příklad 2
Subfrakcionace frakce Q* a stanovení struktur v této frakci
Frakce Q', získané způsobem podle příkladu 1 byla nanesena na chromatografický sloupec C-18 Vydac s rozměrem 10 x 250 mm, při velikosti pórů 3 x 10* cm a středním průměru částic 5/um a sloupec byl vymýván rychlostí 3,5 ml/min při použití-isokratického systému rozpouš- „ _ tědla 70 % A a 30 % B ve významu z příkladu 1. Detekce vrcholů byla prováděna detektorem Waters 990 s diodou a frakce se odebírají podle příkladu 1. Byly získány dvě frakce následujícím způsobem:
frakce doba eluce
Q přibližně 7,5 minut
K přibližně 8,3 minuty F řFrakce Q a K, které obsahují pólypeptidy pak byly připraveny lyofilizací z ředidla a pak lyofilizací z vody známým způsobem tak, aby bylo možno provést analýzu řetězce.
*
Analýza řetězce aminokyselin alkylovaného polypeptidu z frakcí Q a K byla získána při použití metody Weters Pico-Tag podle doporučení výrobce. Údaje byly získány při použití zařízení Applied Biosystems model #70A
- 18 protein/peptide sequencer (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) při použití vodné TFA. Analýza vzniklých fenylthiohydantionaminokyselin byla prováděna analyzátorem aminokyselin Applied Biosystems model 120A PTH nebo pomocí sloupce DuPont Zorbax PTH (Biomedical Product Department, Chromatography Products, Ε. I. duPont de Memours and Co., Inc., 1007 Markét Street, Wilmington, Delaware 19898).
Výsledkem analýzy aminokyselin je aminoterminální řetězec aminokyselin části polypeptidu, představované frakci Q:____ _____ _
HgN-lys-lye-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-ijiet*glu-gly-leu“.
Analýzou řetězce aminokyseliny bylo také možno stanovit, že polypeptid z frakce K byl popsán v US patentové přihlášce Č. 07/346 181.
A
P AT ENT O V É
Claims (2)
- NÁROKY1. Čištěná polypeptidová sloučenina, která má rnásledující identifikační charakteristiky: » í(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10cm, velikost částic 10 )p-', za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % --> 80 %.A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 a’ž~55 minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;(b) je přítomna ve frakci frakce popsané v odstavci (a) výše, která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10 cm, velikost částic 5 tyf, za použití průtokové rychlosti 3,5 mililitru/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A, 30 % B, kde A je0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:ř^N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-argcys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg- * giy -cys-ile-cys-ser-ile-met-glý-thr-asn-cys-glucys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu- ; J nebo polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako výše uvedený polypeptid | a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny.
- 2. Čištěná polypeptidová sloučenina podle nároku 1, která má následující charakteristiky:(a) je přítomna ve frakci surové jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů . 10 cm, rozměr částic 10 za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, a potom __________ - -20,% — -t> 70-%-B,- 80 -> -30--% A- -v průběhu“30 až 55__ minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, pří asi 41,5 minutách;(b) je přítomna ve frakci frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a) , která se eluuje v koloně C-18 Vydac-, . o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů- 6 v ijťnv . 10 cm, rozměr částic 5 jY, za použití průtokové rychlosti 3.5 mililitrů/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou ,t je tvořen:
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/415,139 US5122596A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Polypeptides useful as blockers of calcium channels |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ470790A3 true CZ470790A3 (cs) | 1998-02-18 |
| CZ283651B6 CZ283651B6 (cs) | 1998-05-13 |
Family
ID=23644517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS904707A CZ283651B6 (cs) | 1989-09-29 | 1990-09-27 | Čištěná polypeptidová sloučenina |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5122596A (cs) |
| EP (1) | EP0425096B1 (cs) |
| JP (1) | JPH0692440B2 (cs) |
| KR (1) | KR930007435B1 (cs) |
| CN (1) | CN1033976C (cs) |
| AT (1) | ATE103611T1 (cs) |
| AU (1) | AU626203B2 (cs) |
| CA (1) | CA2026418C (cs) |
| CZ (1) | CZ283651B6 (cs) |
| DD (1) | DD297652A5 (cs) |
| DE (1) | DE69007739T2 (cs) |
| DK (1) | DK0425096T3 (cs) |
| EG (1) | EG19316A (cs) |
| ES (1) | ES2053118T3 (cs) |
| FI (1) | FI96865C (cs) |
| HU (1) | HU208705B (cs) |
| IE (1) | IE64218B1 (cs) |
| IL (1) | IL95765A (cs) |
| MY (1) | MY106832A (cs) |
| NO (1) | NO175208C (cs) |
| NZ (1) | NZ235496A (cs) |
| PH (1) | PH27403A (cs) |
| PL (1) | PL164541B1 (cs) |
| PT (1) | PT95424B (cs) |
| RU (1) | RU2026866C1 (cs) |
| YU (1) | YU184490A (cs) |
| ZA (1) | ZA907782B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
| US5677288A (en) * | 1991-05-15 | 1997-10-14 | Cypros Pharmaceutical Corporation | Use of aminoglycosides to protect against excitotoxic neuron damage |
| US5763568A (en) * | 1992-01-31 | 1998-06-09 | Zeneca Limited | Insecticidal toxins derived from funnel web (atrax or hadronyche) spiders |
| GB9208110D0 (en) * | 1992-04-13 | 1992-05-27 | Isis Innovation | Assay for antibodies that bind calcium channels |
| CA2139947C (en) * | 1992-07-27 | 1998-06-30 | Robert A. Volkmann | Calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta |
| WO1994015960A1 (en) * | 1993-01-07 | 1994-07-21 | Eisai Co., Ltd. | Peptide with glutamate liberation inhibitor and calcium channel inhibitor activities |
| ES2075796B1 (es) * | 1993-08-17 | 1996-03-01 | Pfizer | Polipeptido de la agelenopsis aperta bloqueante de los canales de ca lcio |
| JP2792518B2 (ja) * | 1994-01-19 | 1998-09-03 | ファイザー・インコーポレーテッド | ゲオリコサ・リオグランデからの孔形成ペプチド |
| US5512592A (en) * | 1994-09-09 | 1996-04-30 | Wake Forest University | Method of producing cardiotonic effect and improving cardiac contractile function by administration of carnosine |
| US5756663A (en) * | 1996-01-03 | 1998-05-26 | Zeneca Limited | Antiarrhythmic peptide from venom of spider Grammostola spatulata |
| US5776896A (en) * | 1996-01-03 | 1998-07-07 | Zeneca Limited | Analgesic peptides from venom of grammostola spatulata and use thereof |
| WO1998036743A1 (en) * | 1997-02-21 | 1998-08-27 | Cypros Pharmaceutical Corporation | Neuroprotective poly-guanidino compounds which block presynaptic n and p/q calcium channels |
| JP2006056805A (ja) * | 2004-08-18 | 2006-03-02 | Senmi Ekisu Co Ltd | カルシウムチャンネル阻害剤 |
| US8299211B2 (en) * | 2005-09-30 | 2012-10-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Peptides and regulation of calcium channels |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
| US4950739A (en) * | 1988-02-10 | 1990-08-21 | New York University | Membrane calcium channels and factors and methods for blocking, isolating and purifying calcium channels |
| IL92819A0 (en) * | 1988-12-23 | 1990-09-17 | Merrell Dow Pharma | Polypeptides isolated from the venom of the spider hololena curta |
| DD298412A5 (de) * | 1989-04-28 | 1992-02-20 | ������@���Kk�� | Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die geeignet sind als antagonisten exzitatorischer aminosaeure-neurotransmitter und/oder blocker der calciumkanaele |
-
1989
- 1989-09-29 US US07/415,139 patent/US5122596A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-12 DD DD90343970A patent/DD297652A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-13 PH PH41197A patent/PH27403A/en unknown
- 1990-09-24 AT AT90310419T patent/ATE103611T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-24 EP EP90310419A patent/EP0425096B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-24 DE DE69007739T patent/DE69007739T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-24 DK DK90310419.8T patent/DK0425096T3/da active
- 1990-09-24 ES ES90310419T patent/ES2053118T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-24 IL IL9576590A patent/IL95765A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-26 MY MYPI90001663A patent/MY106832A/en unknown
- 1990-09-26 PT PT95424A patent/PT95424B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 CA CA002026418A patent/CA2026418C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 KR KR1019900015349A patent/KR930007435B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-27 CZ CS904707A patent/CZ283651B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 EG EG57290A patent/EG19316A/xx active
- 1990-09-28 NZ NZ235496A patent/NZ235496A/en unknown
- 1990-09-28 AU AU63660/90A patent/AU626203B2/en not_active Ceased
- 1990-09-28 JP JP2260329A patent/JPH0692440B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-28 RU SU904831267A patent/RU2026866C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 IE IE349190A patent/IE64218B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 YU YU184490A patent/YU184490A/sh unknown
- 1990-09-28 CN CN90108137A patent/CN1033976C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-28 NO NO904251A patent/NO175208C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 ZA ZA907782A patent/ZA907782B/xx unknown
- 1990-09-28 PL PL90287113A patent/PL164541B1/pl unknown
- 1990-09-28 HU HU906267A patent/HU208705B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 FI FI904789A patent/FI96865C/fi active IP Right Grant
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2691141B2 (ja) | 興奮性アミノ酸神経伝達物質の拮抗物質として、および／またはカルシウムチャンネルの遮断剤として有用なポリペプチド | |
| RU2104286C1 (ru) | Полипептид или его фармацевтически приемлемые соли | |
| CZ470790A3 (cs) | Čištěná polypeptidová sloučenina | |
| US5804554A (en) | Calcium channel blocking polypeptides from filistata hibernalis | |
| JP2613852B2 (ja) | アシダカグモ由来の，カルシウムチャンネルを遮断するポリペプチド類 | |
| RU2120945C1 (ru) | Производные полипептидов, способ блокирования кальциевых каналов в клетке |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090927 |