JP2792518B2 - ゲオリコサ・リオグランデからの孔形成ペプチド - Google Patents
ゲオリコサ・リオグランデからの孔形成ペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はゲオリコサ・リオグランデ（Geolycosa rio
grande）クモの毒液に見られるポリペプチドおよび該ポ
リペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列および実質的
に同一の活性を有するポリペプチドに関する。これらの
ポリペプチドおよびその医薬として受容される塩は細胞
の原形質膜に孔を形成して細胞内カルシウムイオンを細
胞中で可動化させるのに有効である。
grande）クモの毒液に見られるポリペプチドおよび該ポ
リペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列および実質的
に同一の活性を有するポリペプチドに関する。これらの
ポリペプチドおよびその医薬として受容される塩は細胞
の原形質膜に孔を形成して細胞内カルシウムイオンを細
胞中で可動化させるのに有効である。
孔を形成する化合物は種々の有用性がある。たとえ
ば、孔を形成する化合物は薬物放出、癌化学療法（たと
えば、免疫結合物）および免疫療法（たとえば、免疫結
合物；補体−および細胞−仲介性溶解）に臨床的応用が
できる。細胞内カルシウムイオンを可動化させる化合物
は、たとえば神経細胞および筋肉細胞のような細胞の生
理学研究において種々の有用性を有する。
ば、孔を形成する化合物は薬物放出、癌化学療法（たと
えば、免疫結合物）および免疫療法（たとえば、免疫結
合物；補体−および細胞−仲介性溶解）に臨床的応用が
できる。細胞内カルシウムイオンを可動化させる化合物
は、たとえば神経細胞および筋肉細胞のような細胞の生
理学研究において種々の有用性を有する。
発明の総括 本発明はゲオリコサ・リオグランデ（Geolycosa rio
grande）クモの毒液に見られるポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドおよび本発明に従って該ポリペプ
チドが存在する分画は次のようである。
grande）クモの毒液に見られるポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドおよび本発明に従って該ポリペプ
チドが存在する分画は次のようである。
ゲオリコサペプチド15aは配列番号１のアミノ酸配列
を有する。ゲオリコサペプチド15bは配列番号２のアミ
ノ酸配列を有する。ゲオリコサペプチド17は配列番号３
のアミノ酸配列を有する。
を有する。ゲオリコサペプチド15bは配列番号２のアミ
ノ酸配列を有する。ゲオリコサペプチド17は配列番号３
のアミノ酸配列を有する。
本発明のポリペプチドは細胞の原形質膜に孔を形成し
細胞中で細胞内Ca2+を可動化させる。孔形成の主たる生
物学的結果は細胞溶解である。従って、この効果を利用
した治療剤は薬物放出、癌化学療法（たとえば、免疫結
合物）および免疫療法（たとえば、免疫結合物；補体−
および細胞−仲介性溶解）のような分野に有用性があ
る。
細胞中で細胞内Ca2+を可動化させる。孔形成の主たる生
物学的結果は細胞溶解である。従って、この効果を利用
した治療剤は薬物放出、癌化学療法（たとえば、免疫結
合物）および免疫療法（たとえば、免疫結合物；補体−
および細胞−仲介性溶解）のような分野に有用性があ
る。
上記ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列およ
び実質的に同一の孔形成および／またはCa2+可動化活性
を有するポリペプチドも本発明の範囲内にある。
び実質的に同一の孔形成および／またはCa2+可動化活性
を有するポリペプチドも本発明の範囲内にある。
本発明は、上記ポリペプチドからなる医薬組成物およ
び上記ポリペプチドを投与する方法にも関する。
び上記ポリペプチドを投与する方法にも関する。
発明の詳細な説明 毒液はゲオリコサ・リオグランデ（Geolycosa riogr
ande）クモから当業者には周知の標準的方法によって電
気刺激によって絞り出す方法で得られる。使用される方
法は、腹部吐瀉物または血液リンパによって全毒液が汚
染するのを防止する方法であることが好ましい。そのよ
うな方法は当業者に周知である。そのようにして得られ
る全毒液は下記精製のため使用するまで約−78℃で凍結
保存される。全毒液からの成分の精製は逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）をＣ−4C−8Vydac（登録商
標）カラム（マサセッチューセッツ州、ウオバーン、マ
ックロードのライニン・インストルーメント・コ・イン
コーポレーテッド）のような種々の調製用および半調製
用カラムで達成される。ピークの検出は単色で220−230
nmで行われる。たとえばウオーター990ダイオードアレ
イ検出器（マサチューセッツ州01757、ミルフォード、
メイプルストリート34にミリポアコポレイション、ウオ
ータークロマトグラフィー部門）によって収集された多
色UVデータによって分画をさらに分析できる。これらの
カラムからの分画をISCO/“FOXY"フラクションコレクタ
ーおよびISCO2159ピーク検出器（ネブラスカ州68504、
リンカーン、シューペリアー4700のISCO）の使用のよう
な公知方法によって集める。これらの分画を滅菌ポリエ
チレン実験器具のような適当な大きさの容器に集める。
これらの分画を溶出剤からの凍結乾燥に続いて水からの
凍結乾燥によって濃縮する。得られた成分含有分画の純
度は、これらの分画の最終的精製において使用される勾
配系よりもアイソクラチックである勾配系を有する分析
用カラムを使用するクロマトグラフィーによる分析によ
って測定できる。
ande）クモから当業者には周知の標準的方法によって電
気刺激によって絞り出す方法で得られる。使用される方
法は、腹部吐瀉物または血液リンパによって全毒液が汚
染するのを防止する方法であることが好ましい。そのよ
うな方法は当業者に周知である。そのようにして得られ
る全毒液は下記精製のため使用するまで約−78℃で凍結
保存される。全毒液からの成分の精製は逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）をＣ−4C−8Vydac（登録商
標）カラム（マサセッチューセッツ州、ウオバーン、マ
ックロードのライニン・インストルーメント・コ・イン
コーポレーテッド）のような種々の調製用および半調製
用カラムで達成される。ピークの検出は単色で220−230
nmで行われる。たとえばウオーター990ダイオードアレ
イ検出器（マサチューセッツ州01757、ミルフォード、
メイプルストリート34にミリポアコポレイション、ウオ
ータークロマトグラフィー部門）によって収集された多
色UVデータによって分画をさらに分析できる。これらの
カラムからの分画をISCO/“FOXY"フラクションコレクタ
ーおよびISCO2159ピーク検出器（ネブラスカ州68504、
リンカーン、シューペリアー4700のISCO）の使用のよう
な公知方法によって集める。これらの分画を滅菌ポリエ
チレン実験器具のような適当な大きさの容器に集める。
これらの分画を溶出剤からの凍結乾燥に続いて水からの
凍結乾燥によって濃縮する。得られた成分含有分画の純
度は、これらの分画の最終的精製において使用される勾
配系よりもアイソクラチックである勾配系を有する分析
用カラムを使用するクロマトグラフィーによる分析によ
って測定できる。
本発明のポリペプチドは公知方法によって配列決定で
きる。一次構造を決定する一般的方法はたとえば、次の
ようなステップからなる。１）上記ペプチドの単一また
は複数段階の酵素的分解／化学的開裂による制御された
開裂。２）ペプチド断片の逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）による単離および精製。３）Ｎ−末端配列
化およびイオン−スプレー質量分析によるペプチド断片
の同定。
きる。一次構造を決定する一般的方法はたとえば、次の
ようなステップからなる。１）上記ペプチドの単一また
は複数段階の酵素的分解／化学的開裂による制御された
開裂。２）ペプチド断片の逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）による単離および精製。３）Ｎ−末端配列
化およびイオン−スプレー質量分析によるペプチド断片
の同定。
ゲオリコサ・リオグランデの毒液分画15a、15bおよび
17に存在するペプチドに関して本明細書に述べた利点に
ついて、全毒液から単離／精製以外の方法によって上記
ペプチドを得ることは今や可能である。本発明のポリペ
プチドは、組み換えDNA技術を使用して上記ポリペプチ
ドまたはその部分をコードする配列のクローニングする
ことにより生成できる。たとえば、上記ポリペプチドの
今や公知のアミノ酸配列情報を利用するハイブリダイゼ
イションプローブを当業者に周知の方法よって、そのポ
リペプチド全体をコード化する配列をクローニングでき
る。組み換えDNA技術とインビトロ蛋白質合成を組み合
わせて本発明のポリペプチドを生成することもできる。
そのようなインビトロ蛋白質合成は標準的なメリフィー
ルド（Merrifield）化学または当業者に周知の他の固相
化学を利用するABI430Amataha433A固相ペプチド合成機
（カリフォルニア州94404、フォスター市、リンカーン
センタードライブ850のアプライド・バイオシステムズ
・インク）を使用することを含むが、それらに限定され
ない。
17に存在するペプチドに関して本明細書に述べた利点に
ついて、全毒液から単離／精製以外の方法によって上記
ペプチドを得ることは今や可能である。本発明のポリペ
プチドは、組み換えDNA技術を使用して上記ポリペプチ
ドまたはその部分をコードする配列のクローニングする
ことにより生成できる。たとえば、上記ポリペプチドの
今や公知のアミノ酸配列情報を利用するハイブリダイゼ
イションプローブを当業者に周知の方法よって、そのポ
リペプチド全体をコード化する配列をクローニングでき
る。組み換えDNA技術とインビトロ蛋白質合成を組み合
わせて本発明のポリペプチドを生成することもできる。
そのようなインビトロ蛋白質合成は標準的なメリフィー
ルド（Merrifield）化学または当業者に周知の他の固相
化学を利用するABI430Amataha433A固相ペプチド合成機
（カリフォルニア州94404、フォスター市、リンカーン
センタードライブ850のアプライド・バイオシステムズ
・インク）を使用することを含むが、それらに限定され
ない。
ポリペプチドの機能に影響を及ぼさず、あるいは実質
的に影響を及ぼさない特定のアミノ酸置換基をポリペプ
チドに置換することができる。可能な置換基は正確には
ポリペプチドに拠る。許容される置換基の決定は当業者
に周知の方法によって達成される。このように、実質的
に同一のアミノ酸配列を有して実質的に同じ活性を有す
るすべてのポリペプチドは本発明の範囲である。
的に影響を及ぼさない特定のアミノ酸置換基をポリペプ
チドに置換することができる。可能な置換基は正確には
ポリペプチドに拠る。許容される置換基の決定は当業者
に周知の方法によって達成される。このように、実質的
に同一のアミノ酸配列を有して実質的に同じ活性を有す
るすべてのポリペプチドは本発明の範囲である。
本発明のポリペプチドの医薬として受容される塩も本
発明の範囲にある。そのような塩類は当業者に周知の方
法によって形成される。たとえば、ポリペプチドの塩基
塩は従来方法によって製造できる。
発明の範囲にある。そのような塩類は当業者に周知の方
法によって形成される。たとえば、ポリペプチドの塩基
塩は従来方法によって製造できる。
本発明のポリペプチドを哺乳動物に投与する場合、単
独あるいは標準的薬学的操作により医薬組成物において
医薬として受容される担体または希釈剤と組み合わせて
投与できる。ポリペプチドは経口的に、あるいは非経口
的に投与できるが、ポリペプチドについては非経口投与
経路が好ましい。非経口投与は静脈内、筋肉内、腹腔
内、皮下、および局所投与である。
独あるいは標準的薬学的操作により医薬組成物において
医薬として受容される担体または希釈剤と組み合わせて
投与できる。ポリペプチドは経口的に、あるいは非経口
的に投与できるが、ポリペプチドについては非経口投与
経路が好ましい。非経口投与は静脈内、筋肉内、腹腔
内、皮下、および局所投与である。
本発明のポリペプチドを経口投与するために、ポリペ
プチドをたとえば錠剤またはカプセル、あるいは水溶液
または懸濁液の形で投与することができる。経口用の錠
剤の場合、通常使用される担体は乳糖およびとうもろこ
しデンプンであり、ステアリン酸マグネシウムのような
滑剤が通常使用される。カプセルの形で経口投与するの
に有用な希釈剤は乳糖および乾燥とうもろこしデンプン
である。経口投与のために水性懸濁液が必要な場合、活
性成分を乳化剤および懸濁化剤と一緒にする。必要なら
特定の甘味剤および／または付香剤を添加できる。
プチドをたとえば錠剤またはカプセル、あるいは水溶液
または懸濁液の形で投与することができる。経口用の錠
剤の場合、通常使用される担体は乳糖およびとうもろこ
しデンプンであり、ステアリン酸マグネシウムのような
滑剤が通常使用される。カプセルの形で経口投与するの
に有用な希釈剤は乳糖および乾燥とうもろこしデンプン
である。経口投与のために水性懸濁液が必要な場合、活
性成分を乳化剤および懸濁化剤と一緒にする。必要なら
特定の甘味剤および／または付香剤を添加できる。
筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内投与のためには、
通常上記活性成分の滅菌溶液をつくり、該溶液のpHを適
当に調節し緩衝液を加える。静脈内投与には、溶質の総
濃度をコントロールし製剤を等張にしなくてはならな
い。
通常上記活性成分の滅菌溶液をつくり、該溶液のpHを適
当に調節し緩衝液を加える。静脈内投与には、溶質の総
濃度をコントロールし製剤を等張にしなくてはならな
い。
本発明のポリペプチドまたはその塩を人間に使用する
場合、日用量は通常主治医である内科医によって決定さ
れよう。さらに、投与量は年齢、体重および個々の患者
の応答ならびに患者の重症度および投与される特定化合
物の効力によって変化するであろう。
場合、日用量は通常主治医である内科医によって決定さ
れよう。さらに、投与量は年齢、体重および個々の患者
の応答ならびに患者の重症度および投与される特定化合
物の効力によって変化するであろう。
本発明のポリペプチドまたはその塩を細胞生理学的研
究に使用する場合、該ポリペプチドは当業者周知の方法
によって細胞に投与される。たとえば、該ポリペプチド
は適当な生理学的緩衝液中で細胞に投与できる。そのよ
うな研究に使用する本発明のポリペプチドの適当な濃度
は１μＭである。しかし、そのような研究での上記ポリ
ペプチドの濃度は１μＭより高いかあるいははるかに低
くてもよい。投与されたポリペプチドの量は当業者によ
って周知の方法によって投与されよう。
究に使用する場合、該ポリペプチドは当業者周知の方法
によって細胞に投与される。たとえば、該ポリペプチド
は適当な生理学的緩衝液中で細胞に投与できる。そのよ
うな研究に使用する本発明のポリペプチドの適当な濃度
は１μＭである。しかし、そのような研究での上記ポリ
ペプチドの濃度は１μＭより高いかあるいははるかに低
くてもよい。投与されたポリペプチドの量は当業者によ
って周知の方法によって投与されよう。
ゲオリコサ（Geolycosa）ペプチド15a,15bおよび17の
２つの生物学的作用は（１）原形質膜での孔形成により
細胞溶解および（２）Ｇ蛋白質の活性化による細胞内Ca
2+の移動である。これらの作用は両方ともマストパラン
（mastoparan）やメリチン（melittin）のような他の小
さな塩基性ペプチドによって示される。これら後者のペ
プチドは膜においてα−らせん構造を有するらしいこと
が知られており、この２次構造配置はこれらの蛋白質の
孔形成能力およびＧ蛋白質賦活能力に非常に寄与してい
ると信じられている。ゲオリコサ（Geolycosa）ペプチ
ドの治療上の有意性はこれら２つの作用に由来する可能
性がある。
２つの生物学的作用は（１）原形質膜での孔形成により
細胞溶解および（２）Ｇ蛋白質の活性化による細胞内Ca
2+の移動である。これらの作用は両方ともマストパラン
（mastoparan）やメリチン（melittin）のような他の小
さな塩基性ペプチドによって示される。これら後者のペ
プチドは膜においてα−らせん構造を有するらしいこと
が知られており、この２次構造配置はこれらの蛋白質の
孔形成能力およびＧ蛋白質賦活能力に非常に寄与してい
ると信じられている。ゲオリコサ（Geolycosa）ペプチ
ドの治療上の有意性はこれら２つの作用に由来する可能
性がある。
ゲオリコサ・リオグランデの毒液から単離された本発
明のポリペプチド、すなわちゲオリコサ17,15aおよび15
bは、アミノ酸25個（ゲオリコサ17）またはアミノ酸27
個（ゲオリコサ15aおよび15b）の直鎖状配列を含み、シ
ステインを欠き、リシンに富む。これらのペプチドの細
胞内Ca2+を移動させる能力はジブトリルcAMPで区別され
fura−２を負荷されたHL−60細胞中で評価された。0.5
ないし２μＭの濃度で試験すると、３つのペプチドはす
べて［Ca2+］ｉを急速かつ移り動いて増加させて細胞外
のCa2+を持続的に不存在するが，細胞に貯蔵されたCa2+
がイオノマイシンによる前処理によって枯渇すると該増
加は停止した。ゲオリコサ15a,15bおよび17はこのよう
にしてHL−60細胞中の細胞内Ca2+を動かす。
明のポリペプチド、すなわちゲオリコサ17,15aおよび15
bは、アミノ酸25個（ゲオリコサ17）またはアミノ酸27
個（ゲオリコサ15aおよび15b）の直鎖状配列を含み、シ
ステインを欠き、リシンに富む。これらのペプチドの細
胞内Ca2+を移動させる能力はジブトリルcAMPで区別され
fura−２を負荷されたHL−60細胞中で評価された。0.5
ないし２μＭの濃度で試験すると、３つのペプチドはす
べて［Ca2+］ｉを急速かつ移り動いて増加させて細胞外
のCa2+を持続的に不存在するが，細胞に貯蔵されたCa2+
がイオノマイシンによる前処理によって枯渇すると該増
加は停止した。ゲオリコサ15a,15bおよび17はこのよう
にしてHL−60細胞中の細胞内Ca2+を動かす。
膜翅目（Hymenoptera）の毒液から単離されたマスト
パランおよびメリチンのような小さい塩基性ペプチド
は、ホスホリパーゼＣに結合されたＧ蛋白質の直接活性
化を含む可能性がある作用によって種々の細胞中で細胞
内Ca2+を動かすことが示された。マストパランおよびメ
リチンのように、ゲオリコサペプチド15a,15bおよび17
はまた、臭化エチジウム（EB）取り込みによって示され
るように細胞を透過した。他の多くの孔形成化合物の作
用のように、これらのペプチドのEB取り込みに対する効
果は総細胞外二価カチオン濃度が0.1mMに低下すると増
大し、細胞外Mg2+から1mMから5mMへと増加すると阻害さ
れる。HL−60細胞の透過を生ぜしめる効力のランク順は
メリチン＞ゲオリコサ15b＞ゲオリコサ17＝ゲオリコサ1
5a＞マストパランであった。
パランおよびメリチンのような小さい塩基性ペプチド
は、ホスホリパーゼＣに結合されたＧ蛋白質の直接活性
化を含む可能性がある作用によって種々の細胞中で細胞
内Ca2+を動かすことが示された。マストパランおよびメ
リチンのように、ゲオリコサペプチド15a,15bおよび17
はまた、臭化エチジウム（EB）取り込みによって示され
るように細胞を透過した。他の多くの孔形成化合物の作
用のように、これらのペプチドのEB取り込みに対する効
果は総細胞外二価カチオン濃度が0.1mMに低下すると増
大し、細胞外Mg2+から1mMから5mMへと増加すると阻害さ
れる。HL−60細胞の透過を生ぜしめる効力のランク順は
メリチン＞ゲオリコサ15b＞ゲオリコサ17＝ゲオリコサ1
5a＞マストパランであった。
膜に孔を形成するゲオリコサ17の能力はT3線維芽細
胞、副甲状腺細胞、および分別および未分別HL−60細胞
において試験した。孔形成は細胞の臭化エチジウム（E
B,分子量394）に対する透過性を測定することによって
決定された。ゲオリコサ17の濃度が7.5μＭを越えると
すべての被験細胞におけるEB取り込みを増加させた。
胞、副甲状腺細胞、および分別および未分別HL−60細胞
において試験した。孔形成は細胞の臭化エチジウム（E
B,分子量394）に対する透過性を測定することによって
決定された。ゲオリコサ17の濃度が7.5μＭを越えると
すべての被験細胞におけるEB取り込みを増加させた。
細胞内Ca2+の移動から生じる［Ca2+］ｉの増加は20時
間100ng/mlの百日咳トキシン（PTx）で前処理すること
によって阻害された。前以てPTxにさらしても細胞外ATP
によって誘導された細胞内Ca2+の移動を遮断した。
間100ng/mlの百日咳トキシン（PTx）で前処理すること
によって阻害された。前以てPTxにさらしても細胞外ATP
によって誘導された細胞内Ca2+の移動を遮断した。
ゲオリコサ17の低濃度（１−３μＭ）は細胞内Ca2+を
移動させるのには有効であるが、10分後でさえEB取り込
みを大きく増加させなかった。反対に、ゲオリコサ17の
高濃度（＞10μＭ）は５分以内に完全に透過させた。
移動させるのには有効であるが、10分後でさえEB取り込
みを大きく増加させなかった。反対に、ゲオリコサ17の
高濃度（＞10μＭ）は５分以内に完全に透過させた。
すべての点で、ゲオリコサ15aはゲオリコサ17と同様
に行動した。ゲオリコサ15aは細胞内Ca2+を移動させる
に有効な濃度においてさえEB取り込みを増加させにくか
った。
に行動した。ゲオリコサ15aは細胞内Ca2+を移動させる
に有効な濃度においてさえEB取り込みを増加させにくか
った。
ゲオリコサ15bはゲオリコサ17およびゲオリコサ15aと
同様に行動し細胞内Ca2+を移動させた。細胞内Ca2+を移
動させるのに有効であることが分かった濃度でのEBの取
り込みはほとんどなかったが、それよりわずかに高濃度
ではEBの大なる取り込みが得られた。ゲオリコサ15bは
ゲオリコサ15aおよびゲオリコサ17の約２倍の効力があ
るらしく、また、ゲオリコサ15aおよびゲオリコサ17は
マストパランの約２倍の効力がある。ゲオリコサ15bの
作用機作は他の２つのゲオリコサペプチドに比較してPT
x;すなわちゲオリコサ15bによって誘導された細胞内Ca
2+の可動化に影響を与えなかったPTxによる前処理の点
で主として異なる。
同様に行動し細胞内Ca2+を移動させた。細胞内Ca2+を移
動させるのに有効であることが分かった濃度でのEBの取
り込みはほとんどなかったが、それよりわずかに高濃度
ではEBの大なる取り込みが得られた。ゲオリコサ15bは
ゲオリコサ15aおよびゲオリコサ17の約２倍の効力があ
るらしく、また、ゲオリコサ15aおよびゲオリコサ17は
マストパランの約２倍の効力がある。ゲオリコサ15bの
作用機作は他の２つのゲオリコサペプチドに比較してPT
x;すなわちゲオリコサ15bによって誘導された細胞内Ca
2+の可動化に影響を与えなかったPTxによる前処理の点
で主として異なる。
EB取り込みによって測定されたように、マストパラン
およびメリチンは両方HL−60細胞（および種々の他の細
胞タイプ）を透過した。メリチンは孔を形成させるのに
最も効力がある（EC50約250nM）。ストパランおよびメ
リチンは両方とも分化されたHL−60細胞での細胞内Ca2+
の可動化を起こさせた。マストパランによって誘導され
た可動化はPTxによって阻害され、一方メリチンによっ
て誘導された可動化は阻害されなかった。細胞内Ca2+を
可動化させる濃度ではマストパランまたはメリチン有意
に孔を形成する。このように、ゲオリコサペプチドとは
反対に顕著な孔形成なしにCa2+可動化を生起するこれら
のペプチドには濃度は基準にならなかった。
およびメリチンは両方HL−60細胞（および種々の他の細
胞タイプ）を透過した。メリチンは孔を形成させるのに
最も効力がある（EC50約250nM）。ストパランおよびメ
リチンは両方とも分化されたHL−60細胞での細胞内Ca2+
の可動化を起こさせた。マストパランによって誘導され
た可動化はPTxによって阻害され、一方メリチンによっ
て誘導された可動化は阻害されなかった。細胞内Ca2+を
可動化させる濃度ではマストパランまたはメリチン有意
に孔を形成する。このように、ゲオリコサペプチドとは
反対に顕著な孔形成なしにCa2+可動化を生起するこれら
のペプチドには濃度は基準にならなかった。
ゲオリコサペプチドは孔を形成させてCa2+可動化させ
ることが可能である点で他の小さな塩基ペプチドと同様
に行動する。しかし、マストパランおよびメリチンによ
る細胞内Ca2+可動化は必ず有意の孔形成を伴うが、ゲオ
リコサペプチドによる細胞内Ca2+可動化は孔形成を伴わ
ない。このことは、これらのペプチドのCa2+可動化を引
き起こす能力が直接それらの孔形成能力に関係ないこと
を示唆する。事実、PTxはゲオリコサ17、ゲオリコサ15a
およびマストパランのCa2+可動化に対する作用を遮断す
るが、これらのペプチドによって誘導された孔形成には
作用しない。
ることが可能である点で他の小さな塩基ペプチドと同様
に行動する。しかし、マストパランおよびメリチンによ
る細胞内Ca2+可動化は必ず有意の孔形成を伴うが、ゲオ
リコサペプチドによる細胞内Ca2+可動化は孔形成を伴わ
ない。このことは、これらのペプチドのCa2+可動化を引
き起こす能力が直接それらの孔形成能力に関係ないこと
を示唆する。事実、PTxはゲオリコサ17、ゲオリコサ15a
およびマストパランのCa2+可動化に対する作用を遮断す
るが、これらのペプチドによって誘導された孔形成には
作用しない。
実施例 実施例１、ゲオリコサ17 ゲオリコサ・リオグランデ（Geolycosa riogrande）
の全毒液の最初の分画は次のように行った。
の全毒液の最初の分画は次のように行った。
ゲオリコサ・リオグランデの全毒液はユタ州84108ソ
ルトレイク市のNPSファーマシューテイカルズ社（NPS
Pharmaceuticals,Inc.,）から得られ、約−78℃で凍結
状態で保存し、融解させ、その10ないし60μｌ量ずつを
200μｌに希釈し、Ｃ−18Vydac（登録商標）（22mm×25
0mm,孔サイズ300Å、粒子サイズ10μ）カラムにのせ
て、15ml/分の流速で、80％→60％Ａおよび20％→40％
Ｂの線形勾配プログラムを使用した溶媒系を使用して80
分かけて溶出した。ここでＡは0.1％トリフルオル酢酸
（TFA）水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである。ピ
ーク検出は220−230nmでの単光色で行われ、分画はISCO
/“FOXY"フラクションコレクターおよびISCO2159ピーク
検出器で集めた。分画を０−60分かけて集めた。分画15
を約33.5分に、分画17を37.9分に集めた。
ルトレイク市のNPSファーマシューテイカルズ社（NPS
Pharmaceuticals,Inc.,）から得られ、約−78℃で凍結
状態で保存し、融解させ、その10ないし60μｌ量ずつを
200μｌに希釈し、Ｃ−18Vydac（登録商標）（22mm×25
0mm,孔サイズ300Å、粒子サイズ10μ）カラムにのせ
て、15ml/分の流速で、80％→60％Ａおよび20％→40％
Ｂの線形勾配プログラムを使用した溶媒系を使用して80
分かけて溶出した。ここでＡは0.1％トリフルオル酢酸
（TFA）水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである。ピ
ーク検出は220−230nmでの単光色で行われ、分画はISCO
/“FOXY"フラクションコレクターおよびISCO2159ピーク
検出器で集めた。分画を０−60分かけて集めた。分画15
を約33.5分に、分画17を37.9分に集めた。
分画17のアミノ酸配列は（Ｈ）−配列番号:3−（−NH
2）と同定され、ゲオリコサ17と表示された。質量スペ
クトルm/z＝2883。
2）と同定され、ゲオリコサ17と表示された。質量スペ
クトルm/z＝2883。
実施例２および３、ゲオリコサ15aおよびゲオリコサ15b 実施例１からの分画15を次のようにサブ分画した。
上記実施例１から得られた分画15をBaker Bond Wid
e Pore Ootadecylカラム（Ｃ−18、4.6mm×250mm、孔
サイズ300Å、粒子サイズ５μ）に載せ、そこから流速
1.0ml/分で、A75％、B25％のアイソクラテイック（isoc
ratic）溶媒系を使用して溶出した。ここでＡは0.1％TF
A水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである。ピーク検
出はWaters990ダイオードアレイ検出器を使用して行わ
れ、分画集めは実施例１に記載のように行った。２つの
分画が得られ、分画15aは約30分に集め、分画15bは約32
分に集めた。ポリペプチドからなる分画15aおよび15b
を、配列決定のために周知方法で溶出剤からの凍結乾燥
次いで水からの凍結乾燥によって調製した。
e Pore Ootadecylカラム（Ｃ−18、4.6mm×250mm、孔
サイズ300Å、粒子サイズ５μ）に載せ、そこから流速
1.0ml/分で、A75％、B25％のアイソクラテイック（isoc
ratic）溶媒系を使用して溶出した。ここでＡは0.1％TF
A水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである。ピーク検
出はWaters990ダイオードアレイ検出器を使用して行わ
れ、分画集めは実施例１に記載のように行った。２つの
分画が得られ、分画15aは約30分に集め、分画15bは約32
分に集めた。ポリペプチドからなる分画15aおよび15b
を、配列決定のために周知方法で溶出剤からの凍結乾燥
次いで水からの凍結乾燥によって調製した。
分画15aおよび15bのアルキル化ポリペプチドのアミノ
酸分析は製造者の説明書に従って、Waters Pico−Tag
法を使用して行った。配列データはApplied Biosystem
s model 470A 蛋白質／ペプチドシークエンサー（Ap
plied Biosystems Inc.,カリフォルニア州フォスター
市、リンカーンセンタードライブ850）からTFA水溶液に
よる転化によって集めた。得られたフェニルチオヒダン
トインアミノ酸の分析はApplied Biosystems Model
120A PTHアナライザーとのオンラインあるいはDuPont
Zorbax PTHカラム（デラウエア州19898、ウイルミン
トン、マーケットストリート1007のE.I.duPont de No
emours and Co.Inc.,のBiomedical Procuct Depart
ment）とオンラインで行った。分画15aのアミノ酸配列
は（Ｈ）−配列番号:1−（−OH）と同定されたゲオリコ
サ15bと表示された。質量スペクトルm/z＝3279。
酸分析は製造者の説明書に従って、Waters Pico−Tag
法を使用して行った。配列データはApplied Biosystem
s model 470A 蛋白質／ペプチドシークエンサー（Ap
plied Biosystems Inc.,カリフォルニア州フォスター
市、リンカーンセンタードライブ850）からTFA水溶液に
よる転化によって集めた。得られたフェニルチオヒダン
トインアミノ酸の分析はApplied Biosystems Model
120A PTHアナライザーとのオンラインあるいはDuPont
Zorbax PTHカラム（デラウエア州19898、ウイルミン
トン、マーケットストリート1007のE.I.duPont de No
emours and Co.Inc.,のBiomedical Procuct Depart
ment）とオンラインで行った。分画15aのアミノ酸配列
は（Ｈ）−配列番号:1−（−OH）と同定されたゲオリコ
サ15bと表示された。質量スペクトルm/z＝3279。
配列表 （２） 配列番号１の情報： （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:27アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （ii） 分子タイプ：ペプチド （vi） 起源： （Ａ）生物：ゲオリコサ・リオグランデ（Geolycos
a riogrande） （Ｆ）組織タイプ：毒液 （xi） 配列：配列番号1: （２） 配列番号２の情報： （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:25アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （ii） 分子タイプ：ペプチド （vi） 起源： （Ａ）生物：ゲオリコサ・リオグランデ（Geolycos
a riogrande） （Ｆ）組織タイプ：毒液 （xi） 配列：配列番号2: （２） 配列番号３の情報： （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:27アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （ii） 分子タイプ：ペプチド （vi） 起源： （Ａ）生物：ゲオリコサ・リオグランデ（Geolycos
a riogrande） （Ｆ）組織タイプ：毒液 （xi） 配列：配列番号3:
a riogrande） （Ｆ）組織タイプ：毒液 （xi） 配列：配列番号1: （２） 配列番号２の情報： （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:25アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （ii） 分子タイプ：ペプチド （vi） 起源： （Ａ）生物：ゲオリコサ・リオグランデ（Geolycos
a riogrande） （Ｆ）組織タイプ：毒液 （xi） 配列：配列番号2: （２） 配列番号３の情報： （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:27アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （ii） 分子タイプ：ペプチド （vi） 起源： （Ａ）生物：ゲオリコサ・リオグランデ（Geolycos
a riogrande） （Ｆ）組織タイプ：毒液 （xi） 配列：配列番号3:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴォルクマン，ロバート・エイ アメリカ合衆国コネチカット州06355, ミスティック，ドッグウット・レーン 135 (72)発明者 サッコマーノ，ニコラス・エイ アメリカ合衆国コネチカット州06339, レッドヤード，パンプキン・ヒル・ロー ド 473 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/435 A61K 38/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】アミノ酸配列： からなるポリペプチド、あるいはその医薬として受容で
きる塩。 - 【請求項２】アミノ酸配列： からなるポリペプチド、あるいはその医薬として受容で
きる塩。 - 【請求項３】アミノ酸配列： からなるポリペプチド、あるいはその医薬として受容で
きる塩。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18409794A | 1994-01-19 | 1994-01-19 | |
| US08/184,097 | 1994-01-19 | ||
| US184,097 | 1994-01-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09502203A JPH09502203A (ja) | 1997-03-04 |
| JP2792518B2 true JP2792518B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=22675533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7519441A Expired - Lifetime JP2792518B2 (ja) | 1994-01-19 | 1995-01-03 | ゲオリコサ・リオグランデからの孔形成ペプチド |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5756462A (ja) |
| EP (1) | EP0804476A1 (ja) |
| JP (1) | JP2792518B2 (ja) |
| CA (1) | CA2181592A1 (ja) |
| FI (1) | FI950211A (ja) |
| WO (1) | WO1995019989A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19961141A1 (de) * | 1999-12-17 | 2001-07-26 | Mack Gerd R | Pharmazeutische Zusammensetzung aus Spinnengiften sowie deren Herstellung und Verwendung zur Behandlung von Tumorerkrankungen |
| CN100590130C (zh) * | 2007-07-31 | 2010-02-17 | 厦门北大之路生物工程有限公司 | 抗癌活性肽 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU204283B (en) * | 1988-12-23 | 1991-12-30 | Merrell Dow Pharma | Process for isolating polypeptide from poison of spider hololena curta and pharmaceutical compositions containing them |
| US5073542A (en) * | 1989-06-07 | 1991-12-17 | Magainin Sciences Inc. | CPF peptide compositions and their use in inhibiting growth of target cells or a virus |
| US5122596A (en) * | 1989-09-29 | 1992-06-16 | Pfizer Inc. | Polypeptides useful as blockers of calcium channels |
| JPH07506404A (ja) * | 1992-05-01 | 1995-07-13 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 綿含有織物をｃｂｈ ｉが多いセルラーゼで処理する方法 |
-
1995
- 1995-01-03 JP JP7519441A patent/JP2792518B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-03 WO PCT/IB1995/000005 patent/WO1995019989A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-01-03 US US08/682,621 patent/US5756462A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-03 EP EP95903444A patent/EP0804476A1/en not_active Withdrawn
- 1995-01-03 CA CA002181592A patent/CA2181592A1/en not_active Abandoned
- 1995-01-18 FI FI950211A patent/FI950211A/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI950211A0 (fi) | 1995-01-18 |
| FI950211A (fi) | 1995-07-20 |
| WO1995019989A1 (en) | 1995-07-27 |
| JPH09502203A (ja) | 1997-03-04 |
| CA2181592A1 (en) | 1995-07-27 |
| EP0804476A1 (en) | 1997-11-05 |
| US5756462A (en) | 1998-05-26 |
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