CZ283651B6 - Čištěná polypeptidová sloučenina - Google Patents
Čištěná polypeptidová sloučenina Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283651B6 CZ283651B6 CS904707A CS470790A CZ283651B6 CZ 283651 B6 CZ283651 B6 CZ 283651B6 CS 904707 A CS904707 A CS 904707A CS 470790 A CS470790 A CS 470790A CZ 283651 B6 CZ283651 B6 CZ 283651B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cys
- lys
- gly
- minutes
- fraction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
- A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
- Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Čištěná polypeptidová sloučenina, přítomná v jedu pavouka Agelenopsis aperta a polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako výše uvedený polypeptid a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od této sloučeniny. Tyto polypeptidy a jejich soli blokují vápníkové kanálky v buňkách různých organizmů a proto je možno je použít k tomuto účelu při léčbě různých onemocnění a k hubení škůdců ze skupiny bezobratlých.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká čištěné polypeptidové sloučeniny, která je obsažena vjedu pavouka Agelenopsis aperta, a polypeptidu, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako tento polypeptid. Polypeptidy a jejich soli, přijatelné z farmaceutického hlediska, blokují kalciové kanály v buňkách včetně neuronů a svalových buněk různých organismů, a to bezobratlých i obratlovců. Tyto uvedené polypeptidové sloučeniny a jejich soli je možno použít k blokování kalciových kanálů v buňkách, například nervových a svalových buněk v organismu a k léčbě onemocnění a stavů, které byly u savců vyvolány poruchami ve funkci kalciových kanálů. Tyto látky je možno použít také k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých. Tyto polypeptidové sloučeniny je možno rovněž použít k přípravě farmaceutický ch prostředků s obsahem těchto polypeptidu a jejich solí.
Dosavadní stav techniky
Z dosavadního stavu techniky je známo, že jed pavouka Agelenopsis aperta obsahuje alespoň dva toxiny, které ovlivňují metabolismus vápníku, přičemž v tomto směru je možno uvést publikaci: Jackson H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987). Autoři této publikace popisují toxin AG2 s molekulovou hmotnostní nižší než 1000, přičemž je zde rovněž uvedeno, že tento toxin potlačuje přesuny vápníku v řadě tkání. Mimoto se v publikaci Jackson H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986) uvádí existence dalšího toxinu téhož pavouka se složkou o hmotnosti přibližně 6000. Tento toxin ovlivňuje presynoptickou blokádu přenosu a patrně blokuje kanály, jimiž se přepravuje vápník ve spojení s uvolňováním nervového přenosu.
Některé polypeptidy, přítomné vjedu pavouka Agelenopsis aperta, jsou uvedeny v patentové přihlášce Spojených států amerických č. 07/346 181, podané 28. dubna 1989. V této přihlášce se uvádí, že tyto polypeptidy jsou blokátory vápníkových kanálů v buňkách, přičemž tyto polypeptidy byly popsány dále uvedeným způsobem podle frakcí, v nichž byly nalezeny.
Frakce G
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
fUN-glu-lys-gly- leu-pro-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-glygln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-gluarg-ly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-sermolekulová hmotnost celého polypeptidu, zjištěná metodou FAB MS: 7267.
Frakce H(
HiN-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-glytyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-arg-asn—asn-asn-CONH2 molekulová hmotnost: FAB MS: 4198.
Frakce H2
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
H2N-ala-lys-ala— leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyrgly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thr-gly-glu
- 1 CZ 283651 B6 molekulová hmotnost celého polypeptidu FAB MS: 5494.
Frakce I
H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-glytyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH?
molekulová hmotnost FAB MS: 4158.
Frakce J
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
I-FN-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-iys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cysthr-his-pro-asp-asp-ala-, molekulová hmotnost celého polypeptidu FAB MS: 5505.
Frakce K
H2N-glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu—asp-tyr-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-arg-glyarg-pro-cys-arg-cys-ser-met-ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu-ile-met-glu-glyleu-ser-phe-ala-C ONH?
molekulová hmotnost FAB MS: 5274.
Frakce L,
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
FFN-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asppřibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je přibližně 20 000.
Frakce L2
Polypeptid s následujícími vlastnostmi:
(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se vymývá na sloupci s rozměry 22y x 250 mm v koloně Vydac C-18 s rozměrem částic 10 pm a průměrem pórů 3 x 10*6 cm při rychlosti průtoku 15 ml/min při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5 % až 20 % B, 95 až 80 % A v průběhu 0 až 30 minut a pak 20 až 70 % B, a 80 až 30 % A mezi 30 až 55 minutami, přičemž A je 0,1 % vodný roztok TFA a B je acetonitril, frakce se vymyje přibližně po 43 minutách, a (b) je přítomen ve frakci frakce, popsané v odstavci (a), která se vymývá na sloupci stejných rozměrů s náplní téhož matriálu, avšak při velikosti částic 5 pm a velikosti pórů 3 x 10-6 cm při rychlosti průtoku 3,5 ml/min a při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 25 až 40 % B a 75 až 60 % A v průběhu 0 až 30 minut, ke A a B mají svrchu uvedený význam, frakce se vymyje po 22,5 min.
Frakce M
Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
-2CZ 283651 B6
H2N-glu-ala-thr-glu-ala—ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-propřibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je 80 000.
Sloučeniny, které jsou antagonisty vápníku, mají široké použití. Tyto sloučeniny je možno použít k léčbě anginy pectoris, zvýšeného krevního tlaku, kardiomyopathii, supraventrikulámích arythmií, jícnové achalasie, předčasného porodu, Raynaudovy choroby a podobně, jak je uvedeno v publikaci Nayler, W. G., Calcium Antagonists, Academis Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1988. Dále je možno tyto látky použít při zkoumání fyziologie buněk, například nervových a svalových buněk a k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých.
Podstata vynálezu
Vynález se týká polypeptidů, přítomných v jedu pavouka Agelenopsis aperta.
Podstatou předmětného vynálezu je čištěná polypeptidová sloučenina, která má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 106 cm, velikost částic 10 μιη, za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, 95 % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové ky seliny aB je acetonitril, při asi 41,5 minutách;
(b) je přítomna ve frakci frakce, popsané v odstavci (a) výše, která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3. 10“6 cm, velikost částic 5 μπι, za použití průtokové rychlosti 3,5 mililitru/minutu a isokratického rozpouštědlového systému, tvořeného 70 % A, 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:
PLN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugiy-leu-;
nebo polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků, jako výše uvedený polypeptid, a farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny.
Ve výhodném provedením podle vynálezu je touto sloučeninou čištěná polypeptidová sloučenina, která má následující charakteristiky:
(a) je přítomna ve frakci surové jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně ΟΙ 8 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů 3 . 10 6 cm, rozměr částic 10 pm, za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, 95 % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, a potom 20 % -> 70 % B, 80 % -* 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;
-3 CZ 283651 B6 (b) je přítomna ve frakci frakce, popsané ve výše uvedené odstavci (a), která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů 3 . 106 cm, rozměr částic 5 pm, za použití průtokové rychlosti 3.5 mililitrů/minutu a isokratického rozpouštědlového systému, tvořeného 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyseliny s koncovou aminovou skupinou je tvořen:
HjN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugly-leu-;
nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny.
Polypeptid podle vynálezu a frakce, v níž je přítomen, je možno vyjádřit následujícím způsobem:
Frakce Q (a) je přítomna ve frakci surového jedu uvedeného pavouka, která se vymývá na sloupci s rozměry 22 x 250 mm v koloně Vydac C-18 s rozměrem částic 10 pm a rozměrem pórů 3 x 10-6 cm při rychlosti průtoku 15 ml/min a při použití systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5 až 20 % B v průběhu 0 až 30 min a pak 20 až 70 % B mezi 30 až 55 min, přičemž A znamená 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové (TFA) a B je acetonitril, frakce se vymyje přibližně po
41,5 minutách, (b) je přítomen ve frakci frakce, popsané v odstavci (a), která se vymývá na sloupci s rozměry 10 x 250 mm kolony Vydac C-17 s rozměrem částic 5 pm a rozměrem pórů 3 x 10-6 cm při rychlosti průtoku 3,5 ml/min a při použití systému rozpouštědel s obsahem 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 % vodný roztok TFA a B je acetonitril, frakce se vy myje v průběhu 7,5 minut, a (c) aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:
FLN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugly-leu-.
Polypeptid podle vynálezu blokuje vápníkové kanály v buňkách a je tedy možno jej použít k tomuto účelu. Dalším možným použitím je potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých a léčba onemocnění a stavů, způsobených u savců chybnou funkcí kalciových kanálů v buňkách.
Do rozsahu vynálezu spadají také polypeptidy, které mají v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako svrchu uvedený polypeptid.
Tyto polypeptidové sloučeniny podle vynálezu je možno rovněž použít k přípravě farmaceutických prostředků s obsahem těchto polypeptidů.
Jed je možno získat od pavouka Agelenopsis aperta elektrickým podrážděním běžnými postupy, které jsou v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky známy. V tomto případě je výhodné použít takovou metodu, která brání kontaminaci jedu abdominální regurgitací hemolymfy. Tyto postupy jsou v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky rovněž známy. Celý obsah jedu, získaný tímto způsobem, se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -78 °C až do svého čištění, které bude dále popsáno.
-4CZ 283651 B6
Čištění složek jedu se provádí vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPCL) s reverzními fázemi na různých preparativních a semipreparativních sloupcích, jako jsou například sloupce C—l C-18 Vydac (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Wobum Massachusetts 01801). Detekce se provádí monochromaticky v rozmezí 220 až 230 nm. Další analýzu frakcí je možno provádět například při použití údajů, získaných v UV světle při použití detektoru s diodou Waters 990 (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Mildford, Massachusetts 01757). Frakce ze sloupce se odebírají známým způsobem, například při použití automatického kolektoru ISCO/FOXY a detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504).
Frakce se odebírají do zásobníků s příslušným objeme, například vyrobené ze sterilního polyethylenu. V dalším postupu se tyto frakce koncentrují lyofilizací z eluátu a pak se ještě lyofilizují z vody. Čistotu výsledných frakcí je pak možno stanovit chromatograficky při použití analytického sloupce s gradientovým systémem, který je více isokratický než systém, užitý pro konečné čištění frakcí.
Struktury látek v různých frakcích se stanoví známými analytickými postupy, jako například hmotovou spektrometrií a nukleární magnetickou rezonancí. Polypeptid ve frakci Q byl sekvenován známým způsobem. Je například možno provést S-pyridylethylaci cystinových zbytků v polypeptidů, který je určen k analyzování, v roztoku a pak stanovit jeho řetězec aminokyselin. Rovněž je například možno postupovat tak, že se jeden až 10 pg polypeptidů rozpustí nebo zředí na 50 μΐ pufrem, který se získá smísením 1 dílu 1M iris HCI o pH 8,5 s obsahem 4 mM EDTA a 3 dílů 8M guanidinhydrochloridu. V dalším postupu se přidá 2,5 μΐ 10 % vodného 2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti ve tmě v argonové atmosféře 2 hodiny. Po inkubaci se přidají 2 μΐ 4-vinylpyridinu (čerstvé reakční činidlo, uchovávané pod argonem při teplotě -20 °C) a směs se inkubuje další 2 hodiny ve tmě v argonové atmosféře. Pak se směs zbaví solí, s výhodou chromatografií na krátkém sloupci v reverzní fázi, načež se stanoví řetězec alkylovaného polypeptidů známým způsobem.
Při provádění postupu přípravy uvedených polypeptidových sloučenin podle vynálezu bylo zjištěno, že vhodným sloupcem pro počáteční frakcionaci jedu je sloupec C-18 Vydac s rozměry 2 x 250 mm, rozměry pórů 3 x1ο-6 cm, rozměry částic 10 μιη. Tento sloupec se vymývá při rychlosti průtoku 15 ml/min při použití lineárního gradientu 95 až 80 % A, 5 až 20 % B v průběhu 0 až 30 minut a pak 80 až 30 % A a 20 až 70 % B mezi 30 až 55 minutami, přičemž A je 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové (TFA) a B je acetonitril. Frakce se odebírají svrchu popsaným způsobem. Jedna ze získaných frakcí byla označena Q a tato frakce byla vybrána pro další čištění. Eluční doba této frakce byla 41,5 minut.
Frakce Q byla podrobena dalšímu čištění při použití sloupce C-18 Vydac s rozměry 10 x 250 mm při velikosti pórů 3 x 10*6 a průměru částic 5,0 pm při rychlosti průtoku 3,5 ml/min a při použití isokratického systému 70 %, 0,1 % vodného roztoku TFA a 30 % acetonitrilu. Frakce byly odebírány svrchu uvedeným způsobem. Frakce Q vychází ze sloupce přibližně v době
7,5 minut. Bylo také zjištěno, že frakce, která se vymývá za 8,3 minuty, obsahuje polypeptid, popsaným v patentové přihlášce Spojených států amerických č. 07/346 181 jako frakce K.
Frakce Q obsahuje polypeptid s následující sekvencí aminokyselin s koncovou aminoskupinou:
H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugly-leuVzhledem k získání sloučeniny, přítomné ve frakci Q jedu pavouka Agelenopsis aperta, je nyní možno získat tuto látku jiným způsobem než izolací a čištěním jedu. Polypeptid je možno získat
-5CZ 283651 B6 při použití rekombinantní DNA klonováním kódového řetězce pro tento polypeptid, nebo jeho částí. Například je možno použít hybridizační sondy, založené na znalosti řetězce aminokyselin tohoto polypeptidu a použít tuto metodu známým způsobem pro klonování kódového řetězce pro celý polypeptid. Je také možno k výrobě polypeptidu užít kombinace rekombinantní techniky a syntézy bílkoviny in vitro. Syntéza in vitro zahrnuje například použití syntetizátoru peptidů v pevné fázi ABI 430A (Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, Califomia 94404), při použití standardních postupů podle Merrifielda nebo jiných metod, běžně známých v tomto oboru podle dosavadního stavu techniky.
Všeobecně je známo, že v polypeptidech je možno nahradit některé aminokyseliny jinými aminokyselinami tak, že nedojde nebo v podstatě nedojde k ovlivnění funkce polypeptidu. Aminokyseliny, které lze takto nahradit, se od polypeptidů k polypeptidu liší. Stanovení možných substitucí je v tomto oboru z dosavadního stavu techniky běžně známé. Do oboru vynálezu tedy spadají všechny polypeptidy s v podstatě stejným řetězcem aminokyselin a v podstatě stejnou účinností na vápníkové kanály.
Polypeptidy podle vynálezu ireverzibilně blokují kalciové kanály v různých buňkách, například v buňkách nervového a svalového systému bezobratlých i obratlovců.
Tuto schopnost polypeptidů podle vynálezu je možno prokázat následujícím způsobem: Mozečkové buňky byly připraveny z mozečků 8 dní starých krys způsobem podle publikace Wilkin G. P. a kol., Brain Res.: 115, 181 až 199, 1976. Potom byly čtverce Aclar (Proplastics lne., 5033 Industrial Ave., Wall, 35, N. J., 07719) o rozměru 1 cm2 povlečeny poly-L-lysinem a uloženy do plat s 12 jímkami s obsahem Eaglova základního prostředí. Do každé jímky s obsahem čtverce z Aclaru bylo přidáno 6,25 x 106 mozečkových buněk. Po 24 hodinách pak byl přidán cytosin-(3-D-arabinofuranosid do koncentrace 10 μΜ. Buňky byly užity pro analýzu fura2 po 6, 7 a 8 dnech pěstování. Buňky, ulpělé na čtvercích Aclar, byly přeneseny do plat s 12 jímkami s obsahem 1 ml 2 μΜ fura2/AM (Molecular Probes lne., Eugene, OR, 97402), v pufru HEPES s obsahem 0,01 % sérového bovinního albuminu, 0,01 % dextrózy o pH 7,4, přičemž pufr byl prostý hořčíku. Buňky byly inkubovány 40 minut při teplotě 37 °C, pak byl pufr s obsahem fura2/AM odstraněn a nahražen 1 milimetrem téhož pufru bez uvedené látky. Do kyvety z křemene byly vloženy 2,0 mililitry pufru, předehřátého na 37 °C. Buňky na čtvercích Aclaru byly potom vloženy do kyvety a tato kyveta byla uložena při teplotě 37 °C do termostatu, opatřeného magnetickým míchadlem, a pak byla měřena fluorescence pomocí fluorescenčního spektrofotometru (Biomedical Instrumets Group, University of Pennsylvania). Fluorescenční signál se nechá stabilizovat 2 minuty a pak se přidá 5 až 20 μΐ zásobního roztoku zkoumané sloučeniny ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS, pH 7,4) v příslušné koncentraci. Kalibrace fluorescenčního signálu a oprava na únik fura2/AM se provede doporučeným postupem podle publikace Nemeth a kol., J. Biol. Chem., 262 : 5188 (1987) po ukončení každé zkoušky. Maximální hodnota fluorescence (Fmax) se stanoví přidáním ionomycinu do 35 μΜ a minimální hodnota fluorescence (Fmin) se stanoví následným přidáním EGTA do 12 mM ke vzniku chelátu vápníku.
Při použití tohoto postupuje možno prokázat blokování vápníkových kanálů určitou látkou podle poklesu fluorescence po přidání zkoumané látky.
Polypeptid podle vynálezu je možno užít jako všechny látky s podobným účinkem k blokování vápníkových kanálů v buňkách, k hubení škůdců ze skupiny bezobratlých a k léčbě onemocnění a stavů, způsobených funkcí kalciových kanálů v buňkách savců, jako jsou angína pectoris, zvýšený krevní tlak, kardiomyopathie, supraventikulámí arythmie, jícnová achalasie, předčasný porod a Raynaudova nemoc. Dále je možno tyto látky použít k výzkumu fy ziologie buněk, včetně buněk nervového a svalového systému.
-6CZ 283651 B6
Do rozsahu předmětného vynálezu spadají rovněž soli uvedeného polypeptidu, přijatelné z farmaceutického hlediska. Tyto soli se vyrábějí způsobem běžně známým z dosavadního stavu techniky v tomto oboru. Tímto způsobem je například možno připravit bázické soli.
V případě, že polypeptid podle vynálezu má být podán savcům, je možno jej podat jako takový nebo v kombinaci s nosičem nebo ředidlem, to znamená s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičovou látkou, ve formě obvyklých farmaceutických prostředků, které je možno podávat perorálně nebo s výhodou parenterálně, například nitrožilně, nitrosvalově, intraperitonálně, podkožně nebo místně.
Pro perorální podání je možno zpracovat polypeptid například na tablety nebo kapsle, nebo na vodné roztoky nebo suspenze. V případě tablet pro perorální podání se přidávají obvyklé nosičové látky, včetně laktózy a kukuřičného škrobu, a kluzné látky, například stearan hořečnatý. Pro perorální podání ve formě kapslí jsou vhodnými ředidly laktóza a sušený kukuřičný škrob. Při výrobě vodných suspenzí pro perorální podání se účinná složka mísí s emulgátory a činidly, které napomáhají vzniku suspenze. Popřípadě je možno přidat sladidla a/nebo chuťové látky.
Pro nitrosvalové, intraperitoneální, podkožní a nitrožilní použití se obvykle připravují sterilní roztoky účinné látky, jejichž pH je možno upravit a zajistit přidáním pufru. Pro nitrožilní použití je nutno zajistit také izotonicitu roztoku.
V případě, že se polypeptid nebo jeho sůl použije k léčení lidí, závisí použitá dávka na věku, hmotnosti, závažnosti onemocnění a účinnosti použitého derivátu, přičemž přesnou dávku vždy stanoví lékař.
V případě, že se polypeptid podle vynálezu nebo jeho sůl užije k potlačení škůdců ze skupiny bezobratlých, podává se tento škůdcům přímo nebo do prostředí, v němž žijí. Například je možno užít postřiku. Nutné množství látky závisí na škůdci a na podmínkách použití.
V případě použití k výzkumu fyziologie buněk se polypeptid podává známým způsobem, například v příslušném pufru. Vhodná koncentrace k tomuto účelu je asi 100 μΜ. Tato koncentrace však může být i vyšší až do 100 μΜ. Použité vhodné množství snadno stanoví každý odborník, pracující v daném oboru.
Příklady provedení vynálezu
Čištěná polypeptidová sloučenina a postup její přípravy budou blíže osvětleny s pomocí následujících příkladů provedení, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Příklad 1
Počáteční frakcionace jedu Agelenopsis aperta
Jed Agelenopsis aperta, získaný od Natural Products Sciencec lne., Salt Lake City, Utah 84108 a skladovaný ve zmrazeném stavu při teplotě -78 °C, byl roztát a 10 až 60 μΐ tohoto jedu bylo zředěno na 200 μΐ a naneseno na chromatografický sloupec C-18 Vydac s rozměry 22 x 250 mm s průměrem pórů 3 x 10“6 cm při středním průměru částic 10 pm a sloupec byl vymýván rychlostí 15 ml/min systémem rozpouštědel při použití lineárního gradientu 5 až 20 % B a 95 až 80 % A v průběhu 0 až 30 minut a pak 20 až 70 % B a 80 až 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, přičemž A je 0,1% vodná TFA a B je acetonitril. Detekce vrcholů byla prováděna monochromaticky při
-7 CZ 283651 B6
220 až 230 nm a frakce byly odebírány zařízením ISCO/“FOXY“ kolektorem s detektorem ISCO 2159. Frakce byly odebírány v rozmezí 20 až 60 minut. Frakce Q’ byla vymyta po přibližně
41,5 minutách.
Příklad 2
Subfrakcionace frakce Q’ a stanovení struktur v této frakci
Frakce Q’, získaná způsobem podle příkladu 1, byla nanesena na chromatografický sloupec C-18 Vydac s rozměrem 10 x 250 mm, při velikosti pórů 3 x 10“6 cm a středním průměru částic 5 pm a sloupec byl vymýván rychlostí 3,5 ml/min při použití isokratického systému rozpouštědla 70 % A a 30 % B ve významu z příkladu 1. Detekce vrcholů byla prováděna detektorem Waters 990 s diodou a frakce se odebírají podle příkladu 1. Byly získány dvě frakce následujícím způsobem:
frakce doba eluce
Q přibližně 7,5 minut
K přibližně 8,3 minuty
Frakce Q a K, které obsahují polypeptidy, pak byly připraveny lyofilizací z ředidla a pak lyofilizací z vody známým způsobem tak, aby bylo možno provést analýzu řetězce.
Analýza řetězce aminokyselin alkylovaného polypeptidu z frakcí Q a K byla získána při použití metody Waters Pico-Tag podle doporučení výrobce. Údaje byly získány při použití zařízení Applied Biosystems model 470A protein/peptide sequencer (Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, Califomia 94404) při použití vodné TFA. Analýza vzniklých fenylthiohydantionaminokyselin byla prováděna analyzátorem aminokyselin Applied Biosystems model 120A PTH, nebo pomocí sloupce DuPont Zorbax PTH (Biomedical Product Department, Chromatography Products, E. I. duPont de Memours and Co., Inc., 1007 Markét Street, Wilmington, Delaware 19898).
Výsledkem analýzy aminokyselin je aminoterminální řetězec aminokyselin části polypeptidu, představované frakcí Q:
FLN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugly-leuAnalýzou řetězce aminokyseliny bylo také možno stanovit, že polypeptid z frakce K. byl popsán v US patentové přihlášce č. 07/346 181.
Claims (2)
1. Čištěná polypeptidová sloučenina, která má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10“6 cm, velikost částic 10 pm, za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % —> 20 % B, 95 % —> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom
-8CZ 283651 B6
20 % -+ 70 % Β, 80 % -+ 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;
(b) je přítomna ve frakci frakce, popsané v odstavci (a) výše, která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 5 pm, za použití průtokové rychlosti 3,5 mililitru/minutu a isokratického rozpouštědlového systému, tvořeného 70 % A, 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:
HjN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugly-leu-;
nebo polypeptid, který má v podstatě stejný řetězec aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků, jako výše uvedený polypeptid, a farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny.
2. Čištěná polypeptidová sloučenina podle nároku 1, která má následující charakteristiky:
(a) je přítomna ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje v koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů 3 . 10“6 cm, rozměr částic 10 pm, za použití průtokové rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % —> 20 % B, 95 % —> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, a potom 20 % —> 70 % B, 80 % -+ 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 41,5 minutách;
(b) je přítomna ve frakci frakce, popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje v koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, rozměr pórů 3 . 10“6 cm, rozměr částic 5 pm, za použití průtokové rychlosti 3,5 mililitrů/minutu a isokratického rozpouštědlového systému tvořeného 70 % A a 30 % B, kde A je 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 7,5 minutách, a (c) řetězec aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je tvořen:
FLN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arggly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glugly-leu-;
a farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/415,139 US5122596A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Polypeptides useful as blockers of calcium channels |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ470790A3 CZ470790A3 (cs) | 1998-02-18 |
CZ283651B6 true CZ283651B6 (cs) | 1998-05-13 |
Family
ID=23644517
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS904707A CZ283651B6 (cs) | 1989-09-29 | 1990-09-27 | Čištěná polypeptidová sloučenina |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5122596A (cs) |
EP (1) | EP0425096B1 (cs) |
JP (1) | JPH0692440B2 (cs) |
KR (1) | KR930007435B1 (cs) |
CN (1) | CN1033976C (cs) |
AT (1) | ATE103611T1 (cs) |
AU (1) | AU626203B2 (cs) |
CA (1) | CA2026418C (cs) |
CZ (1) | CZ283651B6 (cs) |
DD (1) | DD297652A5 (cs) |
DE (1) | DE69007739T2 (cs) |
DK (1) | DK0425096T3 (cs) |
EG (1) | EG19316A (cs) |
ES (1) | ES2053118T3 (cs) |
FI (1) | FI96865C (cs) |
HU (1) | HU208705B (cs) |
IE (1) | IE64218B1 (cs) |
IL (1) | IL95765A (cs) |
MY (1) | MY106832A (cs) |
NO (1) | NO175208C (cs) |
NZ (1) | NZ235496A (cs) |
PH (1) | PH27403A (cs) |
PL (1) | PL164541B1 (cs) |
PT (1) | PT95424B (cs) |
RU (1) | RU2026866C1 (cs) |
YU (1) | YU184490A (cs) |
ZA (1) | ZA907782B (cs) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
US5677288A (en) * | 1991-05-15 | 1997-10-14 | Cypros Pharmaceutical Corporation | Use of aminoglycosides to protect against excitotoxic neuron damage |
US5763568A (en) * | 1992-01-31 | 1998-06-09 | Zeneca Limited | Insecticidal toxins derived from funnel web (atrax or hadronyche) spiders |
GB9208110D0 (en) * | 1992-04-13 | 1992-05-27 | Isis Innovation | Assay for antibodies that bind calcium channels |
RU2104286C1 (ru) * | 1992-07-27 | 1998-02-10 | Пфайзер Инк. | Полипептид или его фармацевтически приемлемые соли |
WO1994015960A1 (en) * | 1993-01-07 | 1994-07-21 | Eisai Co., Ltd. | Peptide with glutamate liberation inhibitor and calcium channel inhibitor activities |
ES2075796B1 (es) * | 1993-08-17 | 1996-03-01 | Pfizer | Polipeptido de la agelenopsis aperta bloqueante de los canales de ca lcio |
CA2181592A1 (en) * | 1994-01-19 | 1995-07-27 | Paul R. Kelbaugh | Pore forming peptides from geolycosa riogrande |
US5512592A (en) * | 1994-09-09 | 1996-04-30 | Wake Forest University | Method of producing cardiotonic effect and improving cardiac contractile function by administration of carnosine |
US5776896A (en) * | 1996-01-03 | 1998-07-07 | Zeneca Limited | Analgesic peptides from venom of grammostola spatulata and use thereof |
US5756663A (en) * | 1996-01-03 | 1998-05-26 | Zeneca Limited | Antiarrhythmic peptide from venom of spider Grammostola spatulata |
US6063819A (en) * | 1997-02-21 | 2000-05-16 | Cypros Pharmaceutical Corp. | Neuroprotective poly-guanidino compounds which block presynaptic N and P/Q calcium channels |
JP2006056805A (ja) * | 2004-08-18 | 2006-03-02 | Senmi Ekisu Co Ltd | カルシウムチャンネル阻害剤 |
US8299211B2 (en) * | 2005-09-30 | 2012-10-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Peptides and regulation of calcium channels |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
US4950739A (en) * | 1988-02-10 | 1990-08-21 | New York University | Membrane calcium channels and factors and methods for blocking, isolating and purifying calcium channels |
CA2006087C (en) * | 1988-12-23 | 1999-09-21 | Andrew G. Stapleton | Polypeptides isolated from the venom of the spider hololena curta |
DD298412A5 (de) * | 1989-04-28 | 1992-02-20 | ������@���Kk�� | Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die geeignet sind als antagonisten exzitatorischer aminosaeure-neurotransmitter und/oder blocker der calciumkanaele |
-
1989
- 1989-09-29 US US07/415,139 patent/US5122596A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-12 DD DD90343970A patent/DD297652A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-13 PH PH41197A patent/PH27403A/en unknown
- 1990-09-24 AT AT90310419T patent/ATE103611T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-24 IL IL9576590A patent/IL95765A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-24 EP EP90310419A patent/EP0425096B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-24 DE DE69007739T patent/DE69007739T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-24 ES ES90310419T patent/ES2053118T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-24 DK DK90310419.8T patent/DK0425096T3/da active
- 1990-09-26 MY MYPI90001663A patent/MY106832A/en unknown
- 1990-09-26 PT PT95424A patent/PT95424B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 CA CA002026418A patent/CA2026418C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 CZ CS904707A patent/CZ283651B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 KR KR1019900015349A patent/KR930007435B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 EG EG57290A patent/EG19316A/xx active
- 1990-09-28 AU AU63660/90A patent/AU626203B2/en not_active Ceased
- 1990-09-28 ZA ZA907782A patent/ZA907782B/xx unknown
- 1990-09-28 NO NO904251A patent/NO175208C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 YU YU184490A patent/YU184490A/sh unknown
- 1990-09-28 RU SU904831267A patent/RU2026866C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 PL PL90287113A patent/PL164541B1/pl unknown
- 1990-09-28 HU HU906267A patent/HU208705B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 NZ NZ235496A patent/NZ235496A/en unknown
- 1990-09-28 FI FI904789A patent/FI96865C/fi active IP Right Grant
- 1990-09-28 IE IE349190A patent/IE64218B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 JP JP2260329A patent/JPH0692440B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-28 CN CN90108137A patent/CN1033976C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2746359B2 (ja) | 興奮性アミノ酸神経伝達物質の拮抗物質として、および/またはカルシウムチャンネルの遮断剤として有用なポリペプチド | |
CZ283651B6 (cs) | Čištěná polypeptidová sloučenina | |
RU2104286C1 (ru) | Полипептид или его фармацевтически приемлемые соли | |
US5804554A (en) | Calcium channel blocking polypeptides from filistata hibernalis | |
US5627154A (en) | Calcium channel blocking polypeptides from Heteropoda venatoria | |
CZ283548B6 (cs) | Polypeptid a jehi použití | |
RU2014324C1 (ru) | Способ получения полиаминов или их фармацевтически приемлемых солей |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090927 |