JP2572715B2 - フィリスタタ・ヒベルナリス由来のカルシウムチャンネル閉鎖ポリペプチド - Google Patents

フィリスタタ・ヒベルナリス由来のカルシウムチャンネル閉鎖ポリペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、クモFilistata hibernalis（フィリスタタ
・ヒベルナリス）の毒液中に見出されるポリペプチド、
並びにこのポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列及
び実質的に同じ活性を有するポリペプチドに係わる。こ
れらのポリペプチドとその薬剤学的に許容可能な塩は、
無脊椎動物及び脊椎動物を含めた様々な生物のニューロ
ン細胞及び筋細胞などの細胞のカルシウムチャンネルを
閉鎖する。本発明は、上記ポリペプチドとその塩の、生
物の神経系及び筋系内の細胞などの細胞のカルシウムチ
ャンネルの閉鎖へのそれ自体の使用、並びに哺乳類のカ
ルシウムチャンネル媒介疾患及び状態の治療への使用に
も係わる。本発明は更に、上記ポリペプチドとその塩を
含有する組成物に係わる。
カルシウル拮抗薬である化合物には様々な効用が有
る。カルシウム拮抗薬は、特にアンギナ、高血圧症、心
筋障害、上室性不整脈、食道弛緩不能症、早期分娩及び
レイノー病などの状態の治療において臨床的に適用され
得る。その教示が本明細書に参考として含まれるW.G.Na
yler,Calcium Antagonists,Academic Press,Harcourt B
race Jovanovich Publishers,New York,NY 1988を参照
されたい。更に、上記のような化合物はニューロン細胞
及び筋細胞などの細胞の生理学的研究にも有用である。
発明の概要 本発明は、クモFilistata hibernalisの毒液中に存在
することが判明したポリペプチドに係わる。本発明のポ
リペプチド、及び該ポリペプチドに含まれる本発明によ
る部分配列は次のとおりである。
I.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）を有するFili
stataペプチド10 SEQ ID NO:1. H2N−Ala−Glu−Cys−Val−Asn−lle−Tyr−Gln−Pro−
Cys−Ser−Thr−lle−Gly−Leu−Arg−Cys−Cys−Tyr−
Gly−Ala−Arg−Cys−Tyr−Cys−Lys−Glu−Lys−Leu−
Asn−Cys−Arg−Tyr−Asn−Arg−Ser−Thr−Arg−Lys−
Arg−Asp−Cys−Gly−Trp−Ser−Ser−Tyr−Asp−Cys−
Lys−Cys−Asp−Tyr−Thr−Trp−Met−His−Arg−lle−
Asp−Asp−Trp−Arg−Glu−Gly−Tyr−Ser−Cys−Tyr−
Cys−Lys−Glu−CO2H II.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号２）を有するFil
istataペプチド12 SEQ ID NO:2. H2N−Ala−Glu−Cys−Leu−Met−Val−Gly−Asp−Thr−
Ser−Cys−Val−Pro−Arg−Leu−Gly−Arg−Arg−Cys−
Cys−Tyr−Gly−Ala−Trp−Cys−Tyr−Cys−Asp−Gln−
Gln−Leu−Ser−Cys−Arg−Arg−Val−Gly−Arg−Lys−
Gln−Gln−Cys−Gly−Trp−Arg−Glu−Val−Asn−Cys−
Lys−Cys−Asp−Trp−Ser−Trp−Ser−Gln−Arg−lle−
Asp−Asp−Trp−Arg−Ala−Asp−Tyr−Ser−Cys−Lys−
Cys−Pro−Glu−Asp−Gln−CO2H III.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号３）を有するFi
listataペプチド13−１ SEQ ID NO:3. H2N−Ala−Glu−Cys−Leu−Met−Val−Gly−Asp−Thr−
Ser−Cys−Val−Pro−Arg−Leu−Gly−Arg−Arg−Cys−
Cys−Tyr−Gly−Ala−Trp−Cys−Tyr−Cys−Asp−Gln−
Gln−Leu−Ser−Cys−Arg−Arg−Val−Gly−Arg−Lys−
Arg−Glu−Cys−Gly−Trp−Val−Glu−Val−Asn−Cys−
Lys−Cys−Gly−Trp−Ser−Trp−Ser−Gln−Arg−lle−
Asp−Asp−Trp−Arg−Ala−Asp−Tyr−Ser−Cys−Lys−
Cys−Pro−Glu−Asp−Gln−CO2H IV.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号４）を有するFil
istataペプチド13−２ SEQ ID NO:4. H2N−Ala−Glu−Cys−Leu−Met−Val−Gly−Asp−Thr−
Ser−Cys−Val−Pro−Arg−Leu−Gly−Arg−Arg−Cys−
Cys−Tyr−Gly−Ala−Trp−Cys−Tyr−Cys−Asp−Gln−
Gln−Leu−Ser−Cys−Arg−Arg−Val−Gly−Arg−Lys−
Arg−Glu−Cys−Gly−Trp−Val−Glu−Val−Asn−Cys−
Lys−Cys−Gly−Trp−Ser−Trp−Ser−Gln−Arg−lle−
Asp−Asp−Trp−Arg−Ala−Asp−Tyr−Asn−Cys−Lys−
Cys−Pro−Glu−Asp−Gln−CO2H V.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号５）を有するFili
stataペプチド13−３ SEQ ID NO:5. H2N−Ala−Glu−Cys−Leu−Met−lle−Gly−Asp−Thr−
Ser−Cys−Val−Pro−Arg−Leu−Gly−Arg−Arg−Cys−
Cys−Tyr−Gly−Ala−Trp−Cys−Tyr−Cys−Asp−Gln−
Gln−Leu−Ser−Cys−Arg−Arg−Val−Gly−Arg−Lys−
Arg−Glu−Cys−Gly−Trp−Val−Glu−Val−Asn−Cys−
Lys−Cys−Gly−Trp−Ser−Trp−Ser−Gln−Arg−lle−
Asp−Asp−Trp−Arg−Ala−Asp−Tyr−Ser−Cys−Lys−
Cys−Pro−Glu−Asp−Gln−CO2H VI.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号６）を有するFil
istataペプチド13−４ SEQ ID NO:6. H2N−Ala−Glu−Cys−Val−Asn−lle−Tyr−Gln−Pro−
Cys−Ser−Asn−lle−Gly−Leu−Arg−Cys−Cys−Tyr−
Gly−Ala−Arg−Cys−Tyr−Cys−Lys−Glu−Lys−Leu−
Ser−Cys−Arg−Tyr−Asn−Arg−Val−Thr−Arg−Lys−
Arg−Asp−Cys−Gly−Trp−Ser−Ser−Tyr−Asp−Cys−
Lys−Cys−Asp−Tyr−Thr−Trp−Met−His−Arg−lle−
Asp−Asp−Trp−Leu−Asp−Gly−Tyr−Ser−Cys−Tyr−
Cys−Lys−Glu−CO2H VII.次のＮ末端アミノ酸配列（配列番号７）を有するFi
listataペプチド14−１ SEQ ID NO:7. H2N−Glu−Glu−Lys−Lys−Cys−Lys−Leu−lle−Asp−
Glu−Pro−Cys−Ser−Asn−Lys−Asp−Pro−lle−lle−
Cys−Cys−Lys−Gly−Ala−Arg−Cys−Val−Cys−Asn−
Asp−Val−Arg−Ser−Gly−Thr−Ser−Lys−Asp−Tyr−
Leu−Gly−Arg−Asn−lle−Pro−Ala−Phe−Val−Arg−
Val−Cys−Lys−Cys−Asp−Trp−Ser−Tyr−Pro−Ala−
Tyr−Leu−Lys−Asp−Leu−Ala−Thr−Phe−Phe−Asn−
Cys−Asn−Cys−Arg−CO2H 本発明のポリペプチドは細胞のカルシウムチャンネル
を閉鎖する。従って、本発明のポリペプチドはそれ自体
で細胞のカルシウムチャンネルの閉鎖に有用である。本
発明のポリペプチドはまた、有害無脊椎動物の防除、並
びに細胞のカルシウムチャンネル機能によって媒介され
る哺乳類の疾患及び状態の治療に有用である。
上述のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列及び
実質的に同じカルシウムチャンネル閉鎖活性を有するポ
リペプチドも本発明の範囲内である。
本発明は、これらのポリペプチドを含有する医薬組成
物、及びこれらのポリペプチドの投与方法にも係わる。
発明の詳細な説明 毒液はクモFilistata hibernalisから、当業者に良く
知られた標準的方法に従い電気的刺激による抽出過程を
経て取得する。用いる方法は、全毒液を腹からの吐出物
（abdominal regurgitant）または血リンパによる汚染
から保護するものであることが好ましい。このような方
法は当業者に良く知られている。上記のようにして得た
全毒液は、以下に説明する精製に用いる時まで約−78℃
で凍結状態で貯蔵する。全毒液からの成分精製は、Ｃ−
４及びＣ−18 Vydac（登録商標）カラム（Rainin Instr
ument Co.Inc.,Mack Road,Woburn,Massachusetts 0180
1）などの様々な分取型及び半分取型カラムでの逆相高
性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって実施す
る。ピーク検出は220〜230nmの単色光によって行なう。
例えばWaters 990ダイオードアレイ検出器（Millipore
Corporation,Waters Chromatography Division,34 Mapl
e Street,Milford,Massachusetts 01757）で収集した多
色UVデータを用いて画分を更に分析することも可能であ
る。ISCO/“FOXY"フラクションコレクター及びISCO 215
9ピーク検出器（ISCO,4700 Superior,Lincoln,Nebraska
68504）を用いるなどの公知方法によってカラムから画
分を集める。画分は滅菌ポリエチレン実験用具などの、
適当な寸法の容器に集める。集めた画分を溶離液から凍
結乾燥し、次いで水から凍結乾燥することによって濃縮
する。得られた成分画分の純度は、画分の最終精製で用
いた系よりもアイソクラチックな勾配系を伴う分析用カ
ラムを用いるクロマトグラフィー分析によって測定し得
る。
本発明のポリペプチドは公知方法に従って配列決定さ
れる。一次構造を決定する通常の方法は、例えば次のよ
うな諸段階を含む。１）ジスルフィド架橋したシステイ
ン残基を還元及びＳ−ピリジル化して、酵素作用を受け
やすくする。２）ペプチドを単段または多段酵素消化に
よって制御下に切断する。３）ペプチドフラグメントを
逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって単
離精製する。４）Ｎ末端配列決定及びイオンスプレー質
量分析によってペプチドフラグメントの特徴を明らかに
する。
調べるポリペプチドのシステイン残基のＳ−ピリジル
エチル化を、例えば溶液の状態で行ない、その後ポリペ
プチドのアミノ酸配列決定を行なうことも可能である。
上記Ｓ−ピリジルエチル化の一方法は、以下に述べるよ
うなものであり得る。
約１〜10μｇのポリペプチドを、4mMのEDTAを含有す
るpH8.5の1MトリスHCl 1部と、8M塩酸グアニジン３部と
を混合して製造した50μまでの緩衝液に溶解させる
か、または該緩衝液で稀釈する。2.5μの10％水性２
−メルカプトエタノールを添加し、混合物を２時間アル
ゴン下の暗闇中で室温に保温（incubate）する。保温
後、２μの４−ビニルピリジン（−20℃でアルゴン下
に貯蔵しておいた新しい試薬）を添加し、混合物を更に
２時間アルゴン下の暗闇中で室温に保温する。その後、
混合物を、好ましくは短い逆相カラムでのクロマトグラ
フィーによって脱塩する。回収したアルキル化ポリペプ
チドを公知方法に従って配列決定する。
本発明を実施し、かつ先に概説した通常の方法を用い
るうえで、毒液の最初の分画に適したカラムは半分取型
ポリスルホエチルアスパルタミドカラム（PolyLC 9.4×
200mm、５μ）であることが判明した。このカラムを、B
20％、C 80％及びD 0％で始まり、B 20％、C 0％及びD
80％で終わる、45分間にわたる三相直線濃度勾配プロ
グラム（ＢはCH3CN、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、Ｄは
Ｃ＋1M NaCl）を用いて流速3.5ml/分で溶離し、220nmで
検出する。その後所望の画分を、例えば実施例に示した
ように0.1％トリフルオロ酢酸及びCH3CNでの二相直線濃
度勾配プログラムを用いて流速15ml/分で300Å、22×25
0mmのVydac（登録商標）Ｃ−18などの逆相HPLCカラムに
適用することにより更に精製し得る。
Filistata hibernalis由来の毒液の、配列番号１〜７
の画分10、12、13−１、13−２、13−３、13−４及び14
−１中にそれぞれ存在するペプチドに関し本明細書の開
示が為されたので、今や前記ペプチドを全毒液からの単
離／精製による以外の方法で得ることができるようにな
った。本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドまたは
その一部をコードする配列のクローニングによる組み換
えDNA技術を用いて製造し得る。例えば、本発明のポリ
ペプチドにより明らかとなったアミノ酸配列情報を利用
すれば、ハイブリダイゼーションプローブを当業者に良
く知られた方法に従って用いて、ポリペプチド全体をコ
ードする配列をクローニングすることができる。本発明
のポリペプチドの製造に、組み換えDNA技術とin vitro
タンパク合成とを組み合わせて用いることも可能であ
る。そのようなin vitroタンパク合成法には、標準適な
Merrifield法、または当業者に良く知られた他の固相法
を用いるABI 430A固相ペプチド合成装置（Applied Bios
ystems,Inc.,850 Lincoln Center Drive,Foster City,C
alifornia 94404）の使用が非限定的に含まれる。
ポリペプチドにおいて該ポリペプチドの機能に影響し
ないか、または実質的に影響することなく幾つかのアミ
ノ酸置換が起こり得ることは、この分野では良く知られ
ている。実際に起こり得る置換はポリペプチド毎に様々
である。許容可能な置換は当業者に良く知られた方法に
従って確認される。即ち、実質的に同じアミノ酸配列及
び実質的に同じカルシウムチャンネル閉鎖活性を有する
ポリペプチドは総て本発明の範囲内である。
本発明のポリペプチドは、無脊椎動物及び脊椎動物の
神経系及び筋系内の細胞などの様々な細胞に存在するカ
ルシウムチャンネルを不可逆的に閉鎖する。
本発明のポリペプチドのカルシウムチャンネル閉鎖能
は、以下の操作によって評価される。８日齢ラットの小
脳から小脳顆粒細胞を得る（Wilkinら，Brain Res.115,
pp.181−199,1976）。Aclar（Proplastics Inc.,5033 I
ndustrial Ave.,Wall,NJ 07719）の正方形片（1cm2）を
ポリＬ−リシンで被覆し、1mlのイーグルの基礎培地を
入れた12ウェル皿の中に置く。細胞を解離し、6.25×10
6細胞を含有するアリコートを、Aclarの正方形片を収容
した各ウェルに加える。プレーティングの24時間後にシ
トシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド（最終濃度10μＭ）
を添加する。６日、７日及び８日培養した時点で栽培を
fura2分析に用いる。（Aclar正方形片に付着した）細胞
を、２μＭのfura2/AM（Molecular Probes Inc.,Eugen
e,OR 97402）を含有するHEPES緩衝液（ウシ血清アルブ
ミン0.01％、デキストロース0.01％含有;pH7.4;マグネ
シウム非含有）を1ml入れた12ウェル皿に移す。細胞を4
0分間37℃に保温し、fura2/AM含有緩衝液を除去して、
替わりにfura2/AMを含有しない同じ緩衝液1mlを加え
る。石英キュベットに、2.0mlの予め加温した（37℃）
緩衝液を入れる。このキュベット内にAclar上の細胞を
配置し、磁気撹拌機を具備した定温（37℃）ホルダーに
キュベットを挿入し、蛍光分光光度計（Biomedical Ins
trument Group,University of Pennsylvania）で蛍光を
測定する。蛍光信号は約２分掛けて安定させる。次に、
試験化合物をリン酸緩衝溶液（PBS;pH7.4）に適当濃度
で溶解させたストック溶液５〜20μをキュベットに添
加する。各試験完了時に、Nemethら，J.Biol.Chem.262,
p.5188（1987）の確立された操作を用いて蛍光信号の補
正とfura2/AM漏れの修正とを行なう。キレートカルシウ
ムにイオノマイシン（ionomycin）（35μＭ）を添加す
ることによって蛍光最大値（Fmax）を、またその後EGTA
（12mM）を添加することによって蛍光最小値（Fmin）を
測定する。このような操作を用いて、本発明のポリペプ
チドを添加した際に蛍光が減少することに基づき、本発
明のポリペプチドによるカルシウムチャンネル閉鎖が起
こったことが示される。本発明のポリペプチドは、この
アッセイを用いてのカルシウムチャンネル閉鎖に関して
0.3nM未満の値を含めた低いIC50値を示す。それに比べ
て、市販されている２種の公知カルシウム拮抗薬Nifedi
pine及びVerapamilは33nM及び4,800nMのIC50値をそれぞ
れ有する。
本発明のポリペプチドはそれ自体でカルシウムチャン
ネル閉鎖物質として有用である。従ってこの化合物は、
有害無脊椎動物の防除、及びアンギナ、高血圧症、心筋
障害、上室性不整脈、食道弛緩不能症、早期分娩及びレ
イノー病などの、哺乳類において細胞のカルシウムチャ
ンネル機能によって媒介される疾患及び状態の治療にも
有用である。上記化合物は更に、神経系及び筋系の細胞
を非限定的に含めた細胞の生理学的研究において有用で
ある。
本発明のポリペプチドの薬剤学的に許容可能な塩も、
本発明の範囲内である。そのような塩は当業者に良く知
られた方法で形成する。例えば、ポリペプチドの塩基性
塩（base salts）を通常方法に従って製造し得る。
本発明のポリペプチドを哺乳類に投与するべき場合、
該ポリペプチドを単独で投与しても、あるいはまた標準
的な薬剤学的手法に則り医薬組成物中に、薬剤学的に許
容可能なキャリヤまたは稀釈剤と組み合わせて存在させ
て投与してもよい。ポリペプチドは経口投与も非経口投
与も可能であるが、非経口投与経路の方がポリペプチド
には好ましい。非経口投与には、静脈内投与、筋肉内投
与、腹腔内投与、皮下投与及び局所投与が含まれる。
本発明のポリペプチドを経口で用いる場合は、この化
合物を例えば錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または
水性の溶液もしくは懸濁液として投与し得る。経口使用
のための錠剤の場合、通常用いられるキャリヤにはラク
トース及びコーンスターチが含まれ、またステアリン酸
マグネシウムなどの滑沢剤が通常添加される。カプセル
剤形態での経口投与ではラクトース及び乾燥コーンスタ
ーチが有用な稀釈剤である。経口使用のために水性懸濁
液が必要である場合は、活性成分を乳化及び懸濁化剤と
組み合わせる。所望であれば、何等かの甘味剤及び／ま
たは着香料を添加することが可能である。
筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内使用の場合は普通、
活性成分の滅菌溶液を調製するが、この溶液のpHは適宜
調節及び緩衝するべきである。静脈内使用では溶質の総
濃度を調節して、調製物を等張性とするべきである。
本発明のポリペプチドまたはその塩をヒトに用いる場
合、毎日の投与量は通常処方する医師が決定する。その
うえ、投与量は個々の患者の年齢、体重及び感受性、並
びに患者の症状の重篤度、及び投与する特定化合物の効
力に従って様々となる。
本発明のポリペプチドまたはその塩を有毒無脊椎動物
の防除に用いる場合は、前記ポリペプチドを有害無脊椎
動物に直接投与するか、または有害無脊椎動物を取り巻
く環境に適用する。例えば、本発明の化合物を溶液とし
て有害無脊椎動物に吹き付けることが可能である。有害
無脊椎動物の防除に必要な化合物量は無脊椎動物の種類
及び環境条件に従って様々となり、化合物を適用する者
によって決定される。
本発明のポリペプチドまたはその塩を細胞の生理学的
研究に用いる場合は前記ポリペプチドを細胞に、当業者
に良く知られた方法に従って投与する。例えば、本発明
のポリペプチドを適当な生理学的緩衝液中の細胞に投与
し得る。本発明の化合物の、上記のような研究で用いる
のに適した濃度は100μＭである。しかし、上記のよう
な研究における本発明のポリペプチドの濃度は100μＭ
より高くても、またはるかに低くてもよい。化合物の投
与量は当業者が良く知られた方法に従って決定する。
以下の実施例は解説のためのものであり、本発明の範
囲を限定すると解釈されるべきでない。
実施例1:ペプチド10 A.粗製Filistata hibernalis（DW）毒液（〜80μ）を
半分取型ポリスルホエチル（PolyLC 9.4×200mm、５
μ）アスパルタミドカラムに適用し、このカラムを、45
分掛けてB 20％、C 80％及びD 0％からB 20％、C 0％及
びD 80％にする三相直線濃度勾配プログラム（ＢはCH3C
N、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、ＤはＣ＋1M NaCl）を用
いて操作し、220nmで検出し、流速を3.5ml/分とした。3
8.5分から40分までにある所望の画分を集めた。貯溜画
分を濃縮せずに脱塩した。
B.3,360μの粗製毒液に由来する、上記ステップＡの
分画から得た物質を逆相HPLCカラム［Vydac（登録商
標）Ｃ−18、300Å、22×250mm］に適用し、このカラム
を、42分掛けてA 80％及びB 20％からA 56％及びB 44％
にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出
し、流速を15ml/分とした。13分から14分までにある所
望の画分を集めた。各回の相当分から得て貯溜した類似
画分を凍結乾燥によって濃縮した。
ペプチド10の構造を次の方法で決定及び証明した。Wa
ters Pico−Tagシステムを用いて、１〜10nmolに対する
PTC−アミノ酸分析を反復して３回行なった。パルス−
液相型シーケンサー（ABI社）において、生のペプチド
と還元／ピリジルエチル化ペプチドとの両方のＮ末端配
列を決定した。SCI−EX API IIIイオンスプレー質量分
析計か質量スペクトル分析データを得た。
両方で得られたデータから、ペプチド10の構造が下記
のように確認される。
配列番号1:72残基、12システイン、６ジスルフィド結
合。
計算質量＝8,699.18 実測質量＝8,698.36（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝8.05 実施例2:ペプチド12 A.粗製Filistata hibernalis（DW）毒液（〜80μ）を
半分取型ポリスルホエチル（PolyLC 9.4×200mm、５
μ）アスパルタミドカラムに適用し、このカラムを、45
分掛けてB 20％、C 80％及びD 0％からB 20％、C 0％及
びD 80％にする三相直線濃度勾配プログラム（ＢはCH3C
N、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、ＤはＣ＋1M NaCl）を用
いて操作し、220nmで検出し、流速を3.5ml/分とした。3
2分から33分までにある所望の画分を集めた。貯溜画分
を濃縮せずに脱塩した。
B.3,360μの粗製毒液に由来する、上記ステップＡの
分画から得た物質を逆相HPLCカラム［Vydac（登録商
標）Ｃ−18、300Å、22×250mm］に適用し、このカラム
を、42分掛けてA 80％及びB 20％からA 56％及びB 44％
にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出
し、流速を15ml/分とした。16分から17分までにある所
望の画分を集めた。各回の相当分から得て貯溜した類似
画分を凍結乾燥によって濃縮した。
ペプチド12の構造を次の方法で決定及び証明した。Wa
ters Pico−Tagシステムを用いて、１〜10nmolに対する
PTC−アミノ酸分析を反復して３回行なった。パルス−
液相型シーケンサー（ABI社）において、生のペプチド
と還元／ピリジルエチル化ペプチドとの両方のＮ末端配
列を決定した。SCI−EX API IIIイオンスプレー質量分
析計から質量スペクトル分析データを得た。
ペプチド12のＮ末端配列決定に適したピリジルエチル
化誘導体は次のように製造した。ペプチド12（100μ
ｇ）を10μの緩衝液（比1:3の1Mトリス、pH8.4、４μ
M EDTA二塩基酸及び8M塩酸グアニジン）に溶解させ、1.
41M（10％ v/v）の２−メルカプトエタノールを緩衝液
に加えた溶液2.4μで処理し、室温で３時間暗闇中に
保持した。次に反応混合物を0.93Mの４−ビニルピリジ
ンを緩衝液に加えた溶液3.7μで処理し、暗闇中で18
時間室温に維持した。反応混合物を184μの10％ CH3C
N/H2Oで稀釈してHPLCカラム（Baker WPC−18、4.6×250
mm）に適用し、このカラムを、30分掛けてＡを100％か
ら65％、Ｂを０％から35％にし、その後、15分掛けてＡ
を65％から40％、Ｂを35％から60％にする二相直線濃度
勾配プログラム（Ａは0.1％トリフルオロ酢酸、ＢはCH3
CN）を用いて操作し、220nmで検出し、流速を1.0ml/分
とした。32.5分から33.5分までにある所望の画分を集
め、凍結乾燥によって濃縮した。（アミノ酸分析に基づ
く）およびその収量は82.36μｇであった。
両者で得られたデータから、ペプチド12の構造が下記
のように確認される。
配列番号2:74残基、12システイン、６ジスルフィド結
合。
計算質量＝8,739.38（酸） 実測質量＝8,738.47±0.98（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝8.20 実施例3:ペプチド13−１ A.粗製Filistata hibernalis（DW）毒液（〜80μ）を
半分取型ポリスルホエチル（PolyLC 9.4×200mm、５
μ）アスパルタミドカラムに適用し、このカラムを、45
分掛けてB 20％、C 80％及びD 0％からB 20％、C 0％及
びD 80％にする三相直線濃度勾配プログラム（ＢはCH3C
N、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、ＤはＣ＋1M NaCl）を用
いて操作し、220nmで検出し、流速を3.5ml/分とした。3
4分から35.5分までにある所望の画分を集めた。貯溜画
分を濃縮せずに脱塩した。
B.3,360μの粗製毒液に由来する、上記ステップＡの
分画から得た物質を逆相HPLCカラム［Vydac（登録商
標）Ｃ−18、300Å、22×250mm］に適用し、このカラム
を、60分掛けてA 75％及びB 25％からA 70％及びB 30％
にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出
し、流速を15ml/分とした。25.5分から28.5分までにあ
る所望の画分を集めた。各回の相当分から得て貯溜した
類似画分を凍結乾燥によって濃縮し、ペプチド13−１と
13−２との混合物を得た。
ペプチド13−１の構造を次の方法で決定及び証明し
た。Waters Pico−Tagシステムを用いて、１〜10nmolに
対するPTC−アミノ酸分析を反復して３回行なった。パ
ルス−液相型シーケンサー（ABI社）において、生のペ
プチドと還元／ピリジルエチル化ペプチドとの両方のＮ
末端配列を決定した。SCI−EX API IIIイオンスプレー
質量分析計から質量スペクトル分析データを得た。
ペプチド13−１のＮ末端配列決定に適したピリジルエ
チル化誘導体は次のように製造した。ペプチド13−１
（150μｇ）を10μの緩衝液（比1:3の1Mトリス、pH8.
4、４μM EDTA二塩基酸及び8M塩酸グアニジン）に溶解
させ、1.41M（10％ v/v）の２−メルカプトエタノール
を緩衝液に加えた溶液3.65μで処理し、室温で３時間
暗闇中に保持した。次に反応混合物を、0.93Mの４−ビ
ニルピリジンを緩衝液に加えた溶液5.91μで処理し、
暗闇中で18時間室温に維持した。反応混合物を280μ
の10％ CH3CN/H2Oで稀釈してHPLCカラム（Baker WPC−1
8、4.6×250mm）に適用し、このカラムを、30分掛けて
Ａを100％から65％、Ｂを０％から35％にし、その後15
分掛けてＡを65％から40％、Ｂを35％から60％にする二
相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフルオロ酢
酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出し、流速
を1.0ml/分とした。33分から34.5分までにある所望の画
分を集め、凍結乾燥によって濃縮した。（アミノ酸分析
に基づく）およその収量は79.4μｇであった。
ペプチド13−１と13−２とはその相同性ゆえに、イオ
ン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィ
ーでは分離しなかった。混合物の最初の配列決定は初め
の50のアミノ酸が同じであることを明らかにして、完全
な構造解明にペプチドの分解を利用することを示唆し
た。混合物をGlu−Ｃで消化して得られたフラクション
を配列決定し、更にpH8.5の1M塩酸グアニジン、0.1Mト
リス−HCl中のトリプシンで消化した後質量スペクトル
測定分析及び配列決定を行なって、ペプチド13−１の構
造を下記のように確認した。
配列番号3:74残基、12システイン、６ジスルフィド結
合。
計算質量＝8,653.26 実測質量＝8,652.57±0.87（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝7.65 実施例4:ペプチド13−２ 上記実施例３に述べたようにして、フラクション13−
２の構造を確認した。
配列番号4:74残基、12システイン、６ジスルフィド結
合。
計算質量＝8,680.29 実測質量＝8,678.64±1.64（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝7.65 実施例5:ペプチド13−３ A.粗製Filistata hibernalis（DW）毒液（〜80μ）を
半分取型ポリスルホエチル（PolyLC 9.4×200mm、５
μ）アスパルタミドカラムに適用し、このカラムを、45
分掛けてB 20％、C 80％及びD 0％からB 20％、C 0％及
びD 80％にする三相直線濃度勾配プログラム（ＢはCH3C
N、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、ＤはＣ＋1M NaCl）を用
いて操作し、220nmで検出し、流速を3.5ml/分とした。3
4分から35.5分までにある所望の画分を集めた。貯溜画
分を濃縮せずに脱塩した。
B.3,360μの粗製毒液に由来する、上記ステップＡの
分画から得た物質を逆相HPLCカラム［Vydac（登録商
標）Ｃ−18、300Å、22×250mm］に適用し、このカラム
を、60分掛けてA 75％及びB 25％からA 70％及びB 30％
にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出
し、流速を15ml/分とした。29分から31分までにある所
望の画分を集めた。各回の相当分から得て貯溜した類似
画分を凍結乾燥によって濃縮した。
ペプチド13−３の構造を次の方法で決定及び証明し
た。Waters Pico−Tagシステムを用いて、１〜10nmolに
対するPTC−アミノ酸分析を反復して３回行なった。パ
ルス−液相型シーケンサー（ABI社）において、生のペ
プチドと還元／ピリジルエチル化ペプチドとの両方のＮ
末端配列を決定した。SCI−EX API IIIイオンスプレー
質量分析計から質量スペクトル分析データを得た。
ペプチド13−３のＮ末端配列決定に適したピリジルエ
チル化誘導体は次のように製造した。ペプチド13−３
（300μｇ）を20μの緩衝液（比1:3の1Mトリス、pH8.
4、４μM EDTA二塩基酸及び8M塩酸グアニジン）に溶解
させ、1.41M（10％ v/v）の２−メルカプトエタノール
を緩衝液に加えた溶液7.28μで処理し、室温で３時間
暗闇中に保持した。次に反応混合物を、10％ v/vの４−
ビニルピリジンを緩衝液に加えた溶液11.19μで処理
し、暗闇中で18時間室温に維持した。反応混合物を１％
TFA/H2Oで稀尺して600μとしたものをHPLCカラム（B
aker WPC−18、4.6×250mm）に適用し、このカラムを、
30分掛けてＡを100％から65％、Ｂを０％から35％に
し、その後15分掛けてＡを65％から40％、Ｂを35％から
60％にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％ト
リフルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで
検出し、流速を1.0ml/分とした。34分から35分までにあ
る所望の画分を集め、凍結乾燥によって濃縮した。（ア
ミノ酸分析に基づく）およその収量は194μｇであっ
た。
両方で得られたデータから、ペプチド13−３の構造が
下記のように確認される。
配列番号5:74残基、12システイン、６ジスルフィド結
合。
計算質量＝8,668.29 実測質量＝8,668（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝7.65 実施例6:ペプチド13−４ A.粗製Filistata hibernalis（DW）毒液（〜80μ）を
半分取型ポリスルホエチル（PolyLC 9.4×200mm、５
μ）アスパルタミドカラムに適用し、このカラムを、45
分掛けてB 20％、C 80％及びD 0％からB 20％、C 0％及
びD 80％にする三相直線濃度勾配プログラム（ＢはCH3C
N、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、ＤはＣ＋1M NaCl）を用
いて操作し、220nmで検出し、流速を3.5ml/分とした。3
4分から35.5分までにある所望の画分を集めた。貯溜画
分を濃縮せずに脱塩した。
B.3,360μの粗製毒液に由来する、上記ステップＡの
分画から得た物質を逆相HPLCカラム［Vydac（登録商
標）Ｃ−18、300Å、22×250mm］に適用し、このカラム
を、60分掛けてA 75％及びB 25％からA 70％及びB 30％
にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出
し、流速を15ml/分とした。22分から22.5分までにある
所望の画分を集めた。各回の相当分から得て貯溜した類
似画分を凍結乾燥によって濃縮した。
ペプチド13−４の構造を次の方法で決定及び証明し
た。Waters Pico−Tagシステムを用いて、１〜10nmolに
対するPTC−アミノ酸分析を反復して３回行なった。パ
ルス−液相型シーケンサー（ABI社）において、生のペ
プチドと還元／ピリジルエチル化ペプチドとの両方のＮ
末端配列を決定した。SCI−EX API IIIイオンスプレー
質量分析計から質量スペクトル分析データを得た。両方
で得られたデータから、ペプチド13−４の構造が下記の
ように確認される。
配列番号6:72残基、12システイン、６ジスルフィド結
合。
計算質量＝8,640.15 実測質量＝8,640（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝7.87 実施例7:ペプチド14−１ A.粗製Filistata hibernalis（DW）毒液（〜80μ）を
半分取型ポリスルホエチル（PolyLC 9.4×200mm、５
μ）アスパルタミドカラムに適用し、このカラムを、45
分掛けてB 20％、C 80％及びD 0％からB 20％、C 0％及
びD 80％にする三相直線濃度勾配プログラム（ＢはCH3C
N、ＣはpH4.5の5mM H3PO4/H2O、ＤはＣ＋1M NaCl）を用
いて操作し、220nmで検出し、流速を3.5ml/分とした。2
8分から29分までにある所望の画分を集めた。貯溜画分
を濃縮せずに脱塩した。
B.3,360μの粗製毒液に由来する、上記ステップＡの
分画から得た物質を逆相HPLCカラム［Vydac（登録商
標）Ｃ−18、300Å、22×250mm］に適用し、このカラム
を、42分掛けてA 80％及びB 20％からA 56％及びB 44％
にする二相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフ
ルオロ酢酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出
し、流速を15ml/分とした。18分から19.5分までにある
所望の画分を集めた。各回の相当分から得て貯溜した類
似画分を凍結乾燥によって濃縮した。
ペプチド14−１の構造を次の方法で決定及び証明し
た。Waters Pico−Tagシステムを用いて、１〜10nmolに
対するPTC−アミノ酸分析を反復して３回行なった。パ
ルス−液相型シーケンサー（ABI社）において、生のペ
プチドと還元／ピリジルエチル化ペプチドとの両方のＮ
末端配列を決定した。SCI−EX API IIIイオンスプレー
質量分析計から質量スペクトル分析データを得た。
ペプチド14−１のＮ末端配列決定に適したピリジルエ
チル化誘導体は次のように製造した。ペプチド14−１
（150μｇ）を10μの緩衝液（比1:3の1Mトリス、pH8.
4、４μM EDTA二塩基酸及び8M塩酸グアニジン）に溶解
させ、1.41M（10％ v/v）の２−メルカプトエタノール
を緩衝液に加えた溶液3.65μで処理し、室温で３時間
暗闇中に保持した。次に反応混合物を、0.93Mの４−ビ
ニルピリジンを緩衝液に加えた溶液5.91μで処理し、
暗闇中で18時間室温に維持した。反応混合物を280μ
の10％ CH3CN/H2Oで稀釈してHPLCカラム（Baker WPC−1
8、4.6×250mm）に適用し、このカラムを、30分掛けて
Ａを100％から65％、Ｂを０％から35％にし、その後15
分掛けてＡを65％から40％、Ｂを35％から60％にする二
相直線濃度勾配プログラム（Ａは0.1％トリフルオロ酢
酸、ＢはCH3CN）を用いて操作し、220nmで検出し、流速
を1.0ml/分とした。33分から34.5分までにある所望の画
分を集め、凍結乾燥によって濃縮した。
このペプチドの配列は、残基52までは明確に決定され
ている。pH8.5の1mM EDTA、25mMトリス−HCl中で、20μ
ｇの還元及びピリジルエチル化ペプチドを２μｇのエン
ドプロテイナーゼLys−Ｃで消化した。配列決定及びイ
オンスプレー質量分析によって、ペプチド14−１の一次
構造の全体を下記のように解明した。
配列番号7:73残基、10システイン、５二重結合。
計算質量＝8,308.05 実測質量＝8,307.67±0.55（イオンスプレー質量分析） 推定pI＝8.17
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＲ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ ＡＢＵ ＡＢＱ ＡＣＪ ＡＣＶ ＡＣＶ ＡＢＲ ＡＤＳ ＡＡＡ (72)発明者 ネイソン，デイーン・エム・ザ・セカン ド アメリカ合衆国、コネテイカツト・ 06360、ノーウイツク、プレイン・ヒ ル・ロード・90 (72)発明者 ロノー，ロバート・テイー アメリカ合衆国、コネテイカツト・ 06355、ゲイルズ・フエリー、メイド・ マリオン・ドライブ・６ (72)発明者 サツコマノ，ニコラス アメリカ合衆国、コネテイカツト・ 06339、レドヤード、ペイント・ミル・ ドライブ・４ (72)発明者 ボークマン，ロバート・エイ アメリカ合衆国、コネテイカツト・ 06355、ミステイツク、ドツグウツド・ レーン・135 (72)発明者 ヘツク，ステイーブン・デイー アメリカ合衆国、コネテイカツト・ 06340、グロトン、ミツチエル・レー ン・250、アパートメント・110

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
    列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の
    アミノ酸配列を有することを特徴とする、実質的に純粋
    なポリペプチド、またはその薬剤学的に許容可能な塩。
JP5520246A 1992-05-21 1993-04-30 フィリスタタ・ヒベルナリス由来のカルシウムチャンネル閉鎖ポリペプチド Expired - Lifetime JP2572715B2 (ja)

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