CZ284794A3 - Polypeptides inhibiting calcium channels comprised in filistata hibernalis spider poison - Google Patents

Description

- 1 - t?i νη < C· -i v> í> < 2· σ o — o or te

Polypeptidy blokující vápníkové kanálky nacházejrrcí—sον jedu pavouka Filistata hibernalis

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidů nacházejících se v jedu pavouka Filistata hibernalis a polypeptidů, které mají v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost jako uvedené polypeptidy. Tyto polypeptidy a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin blokují vápníkové kanálky v buňkách, včetně neuronových buněk a svalových buněk různých organismů, například obratlovců a bezobratlích. Uvedený vynález se rovněž týká použití uvedených polypeptidů a jejich solí jako takových při blokování vápníkových kanálků v buňkách, jako jsou například buňky v nervovém a svalovém systému organizmu, a jejich použití při léčení onemocnění a různých stavů u savců zprostředkovaných vápníkovými kanálky. Kromě toho se uvedený vynález týká prostředků obsahujících tyto polypeptidy a uvedené soli.

Dosavadní stav techniky

Sloučeniny, které představují antagonisty vápníku, mají četná různá použití. Antagonisté vápníku nalézají použití při klinických aplikacích při léčení takových onemocnění jako jsou angína, hypertenze, kardiomyopatie, supraventrikulární arytmie, jícnová achalazie, předčasný porod a Raynaudova nemoc, jestliže se mají uvést alespoň některé tyto stavy, viz. například publikace W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academie Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishers, New York, NY 1988, která je zde ft í ϋ i !9 * ú \ « i 2 uvedena jako odkazový materiál. Kromě toho je možno uvést, že tyto sloučeniny jsou vhodné pro studium fyziologie buněk, jako jsou například neuronové buňky a svalové buňky.

Podstata vynálezu

Vynález se týká polypeptidů, které se nalézají v jedu pavouka Filistata hibernalis. Tyto polypeptidy podle uvedeného vynálezu a frakce, ve kterých se nalézají, jsou následující ; I. Filistata peptid 10 má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin, ID č. SEQ 1 : I^N-Ala-Glu-Cys-Val-Asn-Ile-Tyr-Gln-Pro-Cys-Ser-Thr-Ile-

Gly-Leu-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Arg-Cys-Tyr-Cys-Lys-Glu-

Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Tyr-Asn-Arg-Ser-Thr-Arg-Lys-Arg-Asp-

Cys-Gly-Trp-Ser-Ser-Tyr-Asp-Cys-Lys-Cys-Asp-Tyr-Thr-Trp-

Met-His-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Glu-Gly-Tyr-Ser-Cys-Tyr-

Cys-Lys-Glu-CC^H II. Filistata peptid 12 má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin, ID č. SEQ 2 : I^N-Ala-Glu-Cys-Leu-Met-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Cys-Val-Pro-

Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys-

Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Gln-Gln-

Cys-Gly-Trp-Arg-Glu-Val-Asn-Cys-Lys-Cys-Asp-Trp-Ser-Trp-

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Ser-Cys-Lys-

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln-C^H III. Filistata peptid 13-1 má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin, ID č. SEQ 3 : 3 H2N-Ala-Glu-Cys-i^u-Met-Val-Gly-Ásp-Thr-Ser-Cys-Val-Pro-

Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys-

Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Arg-Glu-

Cy s - Gly-Trp-Val-Glu-Val - Asn- Cy s - tys - Cys-Gly- T rp -Sjer-Trp -''

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Ser-Cys-Lys-

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln-C02H IV. Filistata peptid 13-2 má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin, ID č. SEQ 4 : H2N-Ala-Glu-Cys-Leu-Met-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Cys-Val-Pro-

Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Typ-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys- —Αβρ^Ο1η-Ο1η-Ι-β^8βΐ:-Ον8-Α^-Α^-νΒΐ-*'Ο^-Α^·-1^8·-Α·^-01η-*'“'

Cys-Gly-Trp-Val-Glu1Val-Asn-Cys-Lys-Cys-Gly-Trp-Ser-Trp-

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Asn-Cys-Lys- *

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln-COjH V. Filistata peptidJ13-3 má.následující N-koncovou sekvenci aminokyselin, ID č. SEQ 4 :

H2N-Ala-Glu-Cys-Leu-Met-Ile-Gly-Asp-Thr-Ser-Cys-Val-Pro-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys-Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Arg-Glu-Cys-Gly-Trp-Val-Glu-Val-Asn-Cys-Lys-Cys-Gly-Třp-Ser-Trp-Ser-Gln-Arg- Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Ser-Cys-Lys-Cys-Pro-Glu-Asp-Gln-C02H 1' VI. Filistata peptid 13-4 má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin,. ID č. SEQ 6. :........ ..... H2N-Ala-Glu-Cys-Val-Asn-Ile-Tyr-Gln-Pro-Cys-Ser-Asn-Ile-

Gly-Leu-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Arg-Cys-Tyr-Cys-Lys-Glu-

Lys-Leu-Ser-Cys-Arg-Tyr-Asn-Arg-Val-Thr-Arg-Lys-Arg-Asp-

Cys-Gly-Trp-Ser-Ser-Tyr-Asp-Cys-Lys-Cys-Asp-Tyr-Thr-Trp-

Met-His-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Leu-Asp-Gly-Tyr-Ser-Cys-Tyr-

Cys-Lys-Glu-CC^H VII. Filistata peptid 14-1 má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin, ID č. SEQ 6 : I^N-Glu-Glu-Lys-Lys-Cys-Lys-Leu-Ile-Asp-Glu-Pro-Cys-Ser-Asn-Lys-Asp-Pro-Ile-Ile-Cys-Cys-Lys-Gly-Ala-Arg-Cys-Val-Cys-Asn-Asp-Val-Arg-Ser-Gly-Thr-Ser-Lys-Asp-Tyr-Leu-Gly-Arg-Asn-Ile-Pro-Ala-Phe-Val-Arg-Val-Cys-Lys-Cys-Asp-Trp-Ser-Tyr-Pro-Ala-Tyr-Leu-Lys-Asp-Leu-Ala-Thr-Phe-Phe-Asn-Cys-Asn-Cys-Arg-Cí^H.

Tyto polypeptidy podle uvedeného vynálezu blokují vápníkový kanálek v buňkách. . ,

Vzhledem k výše uvedenému je možno tyto polypeptidy použít jako takové k blokování vápníkových kanálků. Ovšem tyto polypeptidy je možno rovněž použít ke kontrolování bezobratlého škodlivého hmyzu a pro léčení nemocí a stavů u savců, které jsou zprostředkovány funkcí vápníkových kanálků v buňkách.

Rovněž spadají do rozsahu uvedeného, vynálezu takové polypeptidy, které mají v podstatě stejnou sekvenci . aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při.blokování vápníkových kanálků jako jsou polypeptidy výše uvedené.

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží farmaceutické prostředky obsahující tyto uvedené polypeptidy a způsoby podávání uvedených polypeptidů. r 5 -

Jed z pavouka Fi listata kibernalis se získá prccesem produkování mléka za použití elektrické stimulace, což jsou metody z dosavadního stavu techniky běžně známé. Ve výhodném provedení se použije takové metody, při které je zajištěno, že nedojde ke kontaminaci celého podílu jedu abdominální nebo hemolymfovou regurgitací^ Rovněž i tyto metody jsou pro odborníky pracující v daném oboru z dosavadního stavu techniky běžně známé. Celý podíl tohoto jedu, získaný tímto shora uvedeným způsobem, se potom skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -78 eC až do okamžiku, kdy se podrobí přečištění, což bude podrobně uvedeno dále.

Vyčištění a získání jednotlivých složek z tohoto celkového podílu jedu „se, provádí vysokoúčinnou..kapalinovou____— —— chromatografickou metodou s reverzními fázemi (HPLC), při které je možno použít celé řady-preparativních a semi-preparativních kolon, jako jsou například kolony C-4 p a C-18 Vydac (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Voburn Massachusetts 01801). Detekce píku. se provádí monochromaticky při vlnových délkách 220-230 nm. Další analýzu frakcí je možno provést například za použití: . polychromních UV dat získaných, pomocí detektoru s diodovým uspořádáním Vaters 990 (Millipore Corporation, Vaters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Frakce z těchto kolon se shromáždí j f běžně známými metodami; jako například za použití kolektoru na shromažďování frakcí Isco/"Foxy"a za použití detektoru píku Isco 2159 (Isco, 4700, Superior, Lincoln, Nebraska 68504) . Získané frakce se shromáždí v nádobách o vhodné velikosti, jako jsou například sterilní polyethylenové laboratorní nádoby. Zkoncentrování jednotlivých frakcí je možno provést lyofilizací eluentu, přičemž potom následuje lyofilizace z vody. Čistotu výsledných frakcí tvořících 4 danou složku je potom možno stanovit chromátografickou analýzou za použití analytické kolony s gradientovým systémem, který je více izokratický než systém použitý při konečném čištění frakcí.

A 1 - A

Polypeptidy podle uvedeného vynálezu se sekvenují pomoci běžně známých metod -z dosavadního stavu techniky. Obecná strategie určování primární struktury zahrnuje, například následující stupně : (1) redukce a S-pyridylace cysteinových zbytků spojených disulfidovými můstky, čímž se dosáhne zvýšení susceptibílity substrátu k enzymatickému působení; (2) kontrolované štěpení peptidu pomocí jednostupňové nebo vícestupňové digesce; (3) isolování a vyčištění peptidových fragmentů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografíckou metodou s reverzními fázemi (HPLC); (4) charakterizace peptidových fragmentů N-koncovým sekvenováním a ion-sprayovou hmotnostní spektrometrií.

Tuto S-pyriďylethylaci cysteinových zbytků výše >ř uvedených polypeptidů, které jsou předmětem zkoumání, je možno například provést v roztoku, přičemž potom následuje sekvenováni aminokyselin těchto polypeptidů. Jeden z těchto S-pyridylethylačních postupů je možno provést následujícím způsobem.

Podle tohoto postupu se asi 1 až 10 pg polypeptidů rozpustí nebo zředí v až asi 50 μΐ pufru, přičemž tento pufr se připraví smícháním 1 dílu 1 M roztoku Tris-hydrochloridu o hodnotě pH 8, obsahujícího 4 mM EDTA a 3 díly 8 M hydrochloridu guanidinu. Potom se přidá 2,5 μΐ 10 %-ního vodného roztoku 2-merkaptoethanolu a tato směs se potom ' 7 r inkubuje při teplotě místnosti v tmavém prostředí a pod r»k«w>; ^ Λ kuuawi μχ iuaj j. utmnť erťrnnn nrt íín^in /limu V»a/Í í « D/ muV4X wx VM IA^ &UAAU uv uwu U V UW JJV/W«LJ.l, A \ 2 μΐ 4-vinylpyridinu (čerstvé reakční činidlo skladované pod atmosférou argonu při teplotě -20 eC) a tato směs se potom ponechá inkubovat po dobu dalších dvou hodin při teplotě -místnosti v tmavém prostředí pod atmosférou argonu. V dalším postupu se tato směs odsolí, což se provede ve výhodném provedení v krátké chromátografické koloně s reverzními fázemi. Takto získaný alkylovaný polypeptid se potom sekvenuje běžně známými metodami podle dosavadního stavu techniky. ^ Při praktickém provádění postupu podle vynálezu a.za , současné „aplikace *.shora .uvedeného, postupu-byló zjištěno,-že- -------- vhodnou kolonou pro tuto počáteční frákcionaci jedu je semi-preparativní.polysulfoethylaspartamidová kolona (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ). Tato kolona se eluuje elučním činidlem při průtočném množství 3,5 mililitru/minutu,' přičemž se použije troj fázového lineárního gradientového programu přičemž:, se začíná se směsí 20 % B, 80 % C a 0 % D a končí se směsi 20 % B, 0%Ca80%Da eluce se provádí po dobu 45 minut (B = CH-jCN,'C = 5'roM H^PO^/HjO o hodnotě pH 4,5, D=C+1M NaCl) á detekce probíhá při 220 nm.

Požadované frakce je možno potom dále čistit, například vysokoůčinnou kapalinovou chromatografické metodou v reverzními fázemi v koloně Vydac^ C-18, 30 nm, 22 x 250 milimetrů, při průtočném množství 15 mililitru/minutu a za > použiti dvojfázového gradientového programu s 0,1 % i kyselinou trifluoroctovou a CH^CN, jak bude uvedeno - v příkladech.

Na základě uvedeného vynálezu, který je podrobně popsán v tomto popisu, je možno peptidy ve frakcích 10, 12, 13-1, 13-2, 13-3, 13-4 a 14-1, to znamená frakce s ID č. SEQ 1 až 7, které jsou obsaženy v jedu pavouka Filistata hibernalis, nyní podle vynálezu získat jiným způsobem než isolováním/čištěním celého podílu jedů získaného z uvedeného pavouka. Tyto polypeptidy podle uvedeného vynálezu je možno připravit za použití rekombinantní DNA-metody klonováním kódovací sekvence uvedených polypeptidů nebo jejich částí. , Například je možno uvést, že je možno použít hybridizačních sond, které využívají dosud známé informace aminokyselinové sekvence uvedených polypeptidů ke klonování kódovací sekvence pro celý polypeptid, přičemž se použije metod běžně známých z dosavadního stavu techniky. K přípravě polypeptidů podle uvedeného vynálezu je možno rovněž použít kombinace rekombinantních DNA-metod a proteinové syntézy in vitro. Při této proteinové syntéze in .vitro je možno použít peptidového syntetizéru pracujícího s pevnou fází ABI 430A (Applied . Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404), využívajícího standardní Merrifieldovy . chemické metody nebo jiných chemických metod s pevnou fází, které jsou z dosavadního stavu techniky dobře známy, přičemž rozsah uvedeného vynálezu není na tyto metody a zařízení nijak omezen, : Λ . V tomto oboru je z dosavadního;·stavu techniky velice dobře známo, že v pólypeptidech je možno provádět určité aminokyselinové substituce, které neovlivňují nebo v podstatě neovlivňují funkci daného polypeptidů. Tytb konkrétní možné substituce se mění od jednoho polypeptidů k jinému.polypeptidů. Stanovení těchto; konkrétních přípustných substitucí se provede běžnými metodami známými z dosavadního stavu techniky. Vzhledem k výše uvedenému jet nutno uvést, že do rozsahu uvedeného vynálezu náleží všechny polypeptidy, které mají v podstatě stejnou aminokyselinovou 9 - sekvenci a v podstatě stejnou aktivitu při blokování vápníkových k&nál -ků:

Tyto polypeptidy.podle uvedeného vynálezu ireversibilně blokují vápníkové kanálky přítomné v různých buňkách v nervovém a muskulárním systému obratlovců a bezobratlích.'

Schopnost polypeptidů podle uvedeného vynálezu blokovat vápníkové kanálky je možno demonstrovat následujícím postupem. Granulované buňky malého mozku se. připraví z mozečku 8 dní starých krys (viz. Wilkin, G.P. a kol. , Brain Res : 115 : 181-199, 1976). Čtverečky (o ploše „I, cm..), Acl aru* (Pr opia. sti.c s. lne., 5033 r.Industrial Ave.. ,~Wall, NJ, 07719) sé potáhnou polý^L-lysinem a umístí se do 12-rjímkových misek obsahujících 1 ..mililitr roztoku Eagles Basal Medium. Výše uvedené buňky se disociují, přičemž do každé jímky obsahujícího čtverečky Aclar se umístí alikvótní podíly obsahující 6,25 . 10^ buněk. Po 24 hodinách po tomto naočkování se přidá cytosin-beta-D-arabinofuranosid (konečná koncentrace 10 μΜ). Tyto buňky se potom použijí pro fura2Tanalýzu, která se.provede po 6, 7 a 8 dnech kultivace. Buňky navázané na Aclar čtverečky se přemístí do 12-jímkových misek obsahujících 1 mililitr 2 μΜ fura2/AM (Molecular Probes lne. , Eugene, OR 97402) v pufru HEPES (obsahujícího 0,01% bovinního' sérového albuminu; 0,01 % dextr.ozy; pH 7,4; pufr neobsahuje hořčík). Tyto buňky se potom inkubují po dobu 40 minut při teplotě 37 eC, přičemž potom se tento pufr obsahující fura2/AM oddělí a náhradí se 1 mililitrem tohoto stejného pufru^neobsahujícího fura2/AM. .. Do křemenné kyvety se potom umístí 2,0 mililitry předem ohřátého pufru (o teplotě 37 *C). Do těchto kyvet se potom umístí buňky na Aclarů a tyto kyvety se vloží do termostatovaného držáku (teplota 37 °C) vybaveného magnetickým míchadlem, přičemž fluorescence se změří pomocí fluorescenčního spektrofotometru (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania) . Fluorescenční signál se ponechá stabilizovat po dobu asi 2 minut. V dalším postupu se do kyvety přidá 5 - 20 μΐ zásobního roztoku testované sloučeniny v solném roztoku s fosfátovým pufrem (PBS; pH 7,4) ve vhodné koncentraci. Kalibrace fluorescenčních signálů a korekce úniku fura2/AM se provedou po dokončení každého testu podlei standardní metody, viz. Nemeth a kol., J. Biol. Chem. 262:5188 (1981): Maximální fluorescenční hodnota (Fmax) určí přídavkem ionomycinu (35 μΜ) a minimální fluorescenční hodnota (Fmin) se určí následným přídavkem EGTA (12 mM) za účelem chelatování vápníku. Při provedení tohoto výše uvedeného postupu se schopnost polypeptidových sloučenin podle uvedeného vynálezu blokovat vápníkové « kanálky zjistí podle poklesu fluorescence po přídavku těchto sloučenin. Uvedené polypeptidy podle uvedeného vynálezu vykazují nízké hodnoty IC^q, to znamená hodnoty pod 0,3 nm, při blokování vápníkových kanálků za použití tohoto testu. Pro porovnání byly testovány dvě běžně známé látky, používané jako antagonisty vápníkového kanálku, Nifedipin % a Verapamil, které měly odpovídající hodnoty IC^q 33 nm a 4800 nm.

Polypeptidy podle uvedeného vynálezu jako takové jsou vhodné jako blokátory vápníkových kanálků v buňkách. Jako takové jsou uvedené polypeptidy podle uvedeného vynálezu rovněž vhodné ke,kontrolování bezobratlého škodlivého hmyzu a při léčení nemocí a stavů zprostředkovaných funkcí vápníkových kanálků v buňkách u savců, jako je například angína, hypertenze, kardiomyopatie, supraventrikulární arytmie, jícnová achalazie, předčasný porod a Raynaudova 11 nemoc. Kromě toho je možno uvést, že tyto sloučeniny jsou vhodné nro studium fvzioloaie buněk "Jako i sou nanříklad buňky v nervovém a muskulárním systému, čímž ovšem není rozsah této aktivity nijak omezen.

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto polypeptidů podle vynálezu. Tyto soli se připraví metodami běžně známými z dosavadního stavu techniky. Například je možno uvést, že pomocí těchto běžných metod je možno připravit bazické soli polypeptidů podle vynálezu.

Jestliže se tyto polypeptidové sloučeniny podle vynálezu „použij í-,k. podávání savcům,, potom,· je, možno. je podávat samotné nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou nebo ředidlem ve formě farmaceutického prostředku, jak je to běžné podle standardní farmaceutické praxe v tomto oboru. Tyto polypeptidové sloučeniny je možno podávat perorálně nebo parenterálně, přičemž v případě těchto polypeptidů j:e výhodnáparenterální: forma podávání. Mezi. způsoby, parenterální ho podávání je možno zahrnout.’, intravenózní. podáváníintramuskulární podávání, intraperitoneální podávání, subkutánní podávání a místní aplikace. V případě perorálního aplikování polypeptidových sloučenin podle vynálezu je možno tyto sloučeniny podávat například ve formě tablet nebo kapslí nebo ve formě vodného roztoku nebo suspenze. V případě tablet pro perorální aplikování je možno jako nosičových látek použít materiálů, které jsou běžně používány v podobných případech, jako jsou například laktóza a kukuřičný škrob, přičemž obvykle se v těchto případech používá rovněž přídavek maziv, jako je například stearát horečnatý. V případě per orálního podávání kapslí jsou vhodnými ředidly laktóza a sušený kukuřičný škrob. V případě, že se pro perorální aplikaci používá vodných suspenzí, potom se účinná látka kombinuje s emulgačními a suspendačními činidly. V případě potřeby je možno rovněž použít přídavku sladidla nebo vonné (neboli aromatizační) přísady. V případě intramuskulárního, intraperitoneálního, subkutáního a intravenózního podávání se obvykle připravují sterilní roztoky obsahující účinnou látku, přičemž hodnota pH těchto roztoků se upraví na vhodnou hodnotu a přidá se pufr. V případě intravenózního aplikování se celková koncentrace rozpuštěných látek kontroluje takovým způsobem, aby byl připraven isotonický roztok. Při použití polypeptidových sloučenin podle uvedeného vynálezu u lidí je nutno, aby denní dávku stanovil ošetřující lékař. Kromě toho je třeba poznamenat, že dávkované množství závisí na věku pacienta, na jeho - hmotnosti a na reakci, která nastane u každého jednotlivého pacienta po podání této látky, a rovněž tak i na intenzitě .r.-symptomů vyskytujících se u pacienta á na účinnosti každé konkrétní podávané sloučeniny. V případě, že se polypeptidová sloučenina podle uvedeného vynálézu nebo sůl odvozené od této sloučeniny použije pro kontrolu bezobratlého hmýzu, potom se tyto sloučeniny aplikují na uvedený bezobratlý hmyz přímo"iiěbo se aplikují do prostředí, ve kterém se tento hmyz vyskytuje. Například je možno uvedené sloučeniny podle vynálezu použít ve formě roztoků a tento roztok aplikovat postřikem přímo na uvedený bezobratlý hmyz. Množství sloučeniny nezbytné pro 13 kontrolování daného bezobratlého hmyzu se bude měnit podle konkrétního druhu tohoto hmyzu a podle podmínek vyskytující se v daném prostředí, ve kterém se má tato látka aplikovat, přičemž toto množství stanoví osobá provádějící toto aplikování. V případě, že se polypeptidové sloučeniny podle uvedeného vynálezu nebo soli odvozené od těchto sloučenin použijí pro fyziologická studia buněk, potom se tyto polypeptidové sloučeniny aplikují na buňky běžně známými metodami používanými podle dosavadního stavu techniky. Například je možno tyto polypeptidové sloučeniny aplikovat na buňky ve vhodném fyziologickém pufru. V případě provádění těchto, testů, je .vhodná^koncentrace sloučenin.-podle.- uvedeného vynálezu asi 100 μΜ. Ovšem i zde je třeba poznamenat, že koncentrace uvedených sloučenin při. provádění těchto testů může být značně: větší nebo o mnoho menší než je uváděných 100 μΜ. Množství aplikované sloučeniny podle uvedeného vynálezu stanoví příslušný odborník v tomto oboru podle běžně známých metod. Příklady provedeni vynálezu

Polypeptidy blokující vápníkové kanálky podle uvedeného vynálezu, jejich příprava a další charakteristiky budou uvedeny v následujících příkladech provedení, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

AT Příklad 1 • t

Peptid 10. (A) Surový jed pavouka Filistata hibernalis (DV) v množství asi 80 μΐ byl aplikován na semipreparativní polysulfoethylaspartamidovou kolonu (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ) , ve které bylo zpracovávání prováděno za použití troj fázového lineárního gradientového programu, zpočátku 20 % B, 80 % C a 0 % D a na konci 20 % B, 0 % C a 80 % D, což probíhalo po dobu 45 minut (B = CH^CN, C = 5 mM H3P04/H20 o hodnotě PH4,5aD = C + lM NaCl), přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 3,5 mililitru/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 38,5 až 40 minutách. Shromážděné frakce byly odsoleny bez zkoncentrovávání. < ** (B) Podíl získaný z frakcionace podle stupně (A) , viz-výše, získaný z 3360 μΐ surového jedu, byl aplikován na kolonu k provedení vysokoúčinné kapalinové chromátografie s reverzními fázemi (HPLC kolona Vydac^,. C-18, 30 nm, 22 x 250 milimetrů), ve které bylo zpracovávání provedeno S dvojfázovým lineárním gradientovým programem, zpočátku 80 % A a 20 % B a na konci 56%Aa44%B, což probíhalo po dobu 42 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina a B - CH^CN, přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 15 mililitrů/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 13 až 14 minutách. Shromážděné frakce z jednotlivých postupů byly zkoncentrovány lyofilizací, ť ,· " .·' '.V1' ' r

Struktura peptidu 10 byla určena a ověřena pomocí následujících metod. Aminokyselinová analýza PTC byla provedena třikrát s 1 až 10 nmoly, přičemž bylo použito systému Vaters Pico-Tag systém. N-koncové sekvenování bylo 15 provedeno pomocí impulzního-kapalinového sekvenátoru ABI jak s ^ju v u u 11 j. ΐΓι ucp Liuem Xak s r e duk ovanym/py ridy1ethy1 ováným peptidem. Hodnoty hmotnostní spektrální analýzy byly získány pomocí SCI-EX API III ion-sprayového hmotnostního spektrometru. 4

Zjištěné shromážděné hodnoty potvrzovaly strukturu peptidu 10, jak je to uvedeno níže. ID č. SEQ 1 : 72 zbytků, 12 cysteinů, 6 disulfidových vazeb Vypočítaná hmotnost = 8699,18

Zjištěná hmotnost ' = 8698,36 (ion-sprayová hmotnostní spektrometrie)

Odhadnutá-hodnota pl -=~8,05> ,— — — __________ Příklad 2 Peptid 12.

(A) Surový jed pavouka Filistata hiberná lis (DV) v množství asi 80 μΐ byl aplikován na semipreparativní polysulfoethylaspartamidovou kolonu (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ), ve které.bylo zpracovávání prováděno;za.\ použití trojfázového lineárního gradientóvého programu, zpočátku 20 % B, 80 % C a 0 % D a na konci 20 % B, 0 % C a 80 % D, což probíhalo po dobu 45 minut (B = CH^CN, C « 5 mM H3P04/H2Ó o hodnotě pH 4,5 a D = C + 1 H NaCl) , přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 3,5 mililitru/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 32 až 33 minutách. Shromážděné frakce byly odsoleny bez zkoncentrovávání. (B) Podíl získaný z frakcionace podle stupně (A), viz výše, získaný z 3360 μΐ surového jedu, byl aplikován na - J.0 - kolonu k provedení vysokoúčinrté kapalinové chromatografie

D s reverzními fázemi (HPLC kolona Vydac , C-18, 30 nm, 22 x 250 milimetrů), ve které bylo zpracovávání provedeno s dvojfázovým lineárním gradientovým programem, zpočátku 80 % A a 20 % B a na konci 56 % A a 44 % B, což probíhalo po dobu 42 minut (A = 0,1 %„trifluoroctová kyselina a B = CH^CN, přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 15 mililitrů/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 16 až 17 minutách. Shromážděné frakce •j - ' . z jednotlivých postupů byly zkoncentrovány lyofilizací.

Struktura peptidu 10 byla určena a ověřena pomocí následujících metod. Aminokyselinová analýza PTC byla provedena třikrát s 1 až 10 nmoly, přičemž bylo použito systému Vaters Pico-Tag systém. N-koncové sekvenování bylo provedeno pomocí impulzního-kapalinového sekvenátorú ABI jak s původním peptidem tak s redukovaným/pyridylethylovaným peptidem. Hodnoty hmotnostní spektrální analýzy byly.získány pomocí SCI-EX API III ion-sprayového hmotnostního spektrometru. ,1 * 1 Pyridylethylovaný derivát peptidu 12, vhodný pro N-koncové sekvenování byl připraven následujícím způsobem, Peptid 12 (v množství 100 pg) byl rozpuštěn v 10 μΐ pufru (1 M tris, pH 8,4 obsahující 4 μΜ,dvojsytného EDTÁ a 8 M guanidinhydrochlorid v poměru 1 : 3) a.potom bylo.provedeno zpracování pomocí přídavku 2,4 μΐ 1,41 M roztoku (10 % obj/obj) 2-merkaptoethanolu v pufru a tato reakční směs byla udržována po dobu 3 hodin v tmavém prostředí při teplotě místnosti. Takto získaná reakční směs byla potom zpracována přídavkem 3,7 μΐ 0,93 M roztoku 4-vinylpyridinu v pufru a potom byla uchovávána při teplotě místnosti v tmavém ' prostředí po dobu 18 hodin. V, dalším postupp byla tato 17 reakční směs zředěna přídavkem 184 μΐ 10 %-ního CH3CN/H2O a aplikována na HPLC kolonu (vysokuúčinná kapalinová chromatografická kolona Baker VPC-18, 4,6 x 250 milimetrů) pracující s dvoj fázovým lineárním gradientovým programem 100 až 65 % A a 0 až 35 % B v intervalu 30 minut a následně 65 až 40 % A a 35 až 60 % B v intervalu 15 minut (A = 0,1 % triflúoroctová kyselina,’ B = CH3CN), přičemž detekce byla provedena při 220 nm a průtočné množství bylo 1,0 mililitr/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 32,5 až 33,5 minuty, přičemž tento podíl byl zkoncentrován lyofilizací. Přibližný výtěžek (na základě aminokyselinové analýzy) : 82,36 pg. . -ID-č.— SEQ 2 -:--7-4 zbytků-, -1-2- cysteinů-6 disul-f idových vazeb Vypočítaná hmotnost = 8739,38 (kyselina)

Zjištěná hmotnost = 8738,47 ±0,98 L(ion-sprayová hmotnostní spektrometrie)

Odhadnutá hodnota pl = 8,20. i * r r Příklad 3

Peptid 13-1. * * (A). Surový jed pavouka Fil.istata hibernalis (DV) v množství asi 80 μΐ byl aplikován na semipreparativní polysulfoethyláspartamidovou kolonu (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ), ve které bylo zpracovávání prováděno za použití trojfázového lineárního gradientového programu, zpočátku 20 % B, 80%Ca0%Da na konci 20 % B, 0 % C a 80 % D, což probíhalo po dobu 45 minut (B = CHjCN, C> 5 mM H3PO4/H2O o. hodnotě pH 4,5 a D = C + 1 M NaCl) , . přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 3,5 mililitru/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 34 až 35,5 minuty. Shromážděné frakce byly odsoleny" bez 1.0 - zkoncentrovávání. (B) Podíl získaný z frakcionace podle stupně (A) , viz výše, získaný z 3360 μΐ surového jedu, byl aplikován na · kolonu k provedení vysokoúčinné kapalinové chromátografie

D s reverzními fázemi (HPLC kolona Vydac , C-18, 30 nm, 22 x 250 milimetrů), ve které bylo zpracovávání provedeno, s dvojfázovým lineárním gradientovým programem, zpočátku 75 % A a 25 % B a na konci 70 % A a 30' % B, což probíhalo po dobu 60 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina a B = CH^CN, přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 15 mililitrů/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 25,5 až 28,5 minuty. Shromážděné frakce z jednotlivých postupů byly zkoncentrovány lyofilizací, Čímž byla získána směs peptidů 13-1 a 13-2.

Struktura peptidu 13-1 byla určena a ověřena pomocí následujících metod. Aminokyselinová analýza PTC byla provedena třikrát s 1 až 10 nmoly, přičemž bylo použito systému Vaters Pico-Tag systém. N-koncové sekvenování bylo provedeno pomocí impulzního-kapalinového sekvenátoru ABI jak s původním peptidem tak s redukovaným/pyridylethylovaným peptidem. Hodnoty hmotnostní spektrální analýzy byly získány pomocí SCI-EX API III ion-sprayového hmotnostního spektrometru.

Pyridylethylovaný derivát peptidu 13-1, vhodný pro N-koncové sekvenování byl připraven následujícím způsobem, Peptid 13-1 (v množství 150 pg) byl rozpuštěn v 10 μΐ pufru (1 M tris, pH 8,4 obsahující 4 μΜ dvojsytného EDTA a 8 M guanidinhydrochlorid v poměru 1 : 3) a potom bylo provedeno zpracování pomocí přídavku 3,65 μ1* 1,41 M roztoku (10 % obj/obj) 2-merkaptoethanolu v pufru a tato reakční směs byla udržována po dobu 3 hodin v tmavém prostředí při teplotě místnosti. Takto získaná reakční směs byla potom zpracována přídavkem 5,91 μΐ 0,93 M roztoku 4-vinylpyridinu v pufru a potom byla uchovávána při teplotě místnosti v tmavém prostředí po dobu 18 hodin. V dalším postupu byla. tato. reakční směs zředěna přídavkem 280 μΐ 10 %-n'íHó CH^CN/K^O a aplikována na HPLC kolonu (vysokoúčinná kapalinová chromatografická kolona Baker VPC-18, 4,6 x 250 milimetrů) pracující s dvoj fázovým lineárním gradientovým programem 100 až 65 % A a 0 až 35 % B v intervalu 30 minut a následně 65 až 40 % A a 35 až 60 % B v intervalu 15 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina, B = CH3CN), přičemž detekce byla provedena při 220 run a průtočné množství bylo 1,0 ^mililitr/.minutu..Požadovaná frakc.e...byla,„odebrána. po„33_až_,____ 34,5 minuty, přičemž tento podíl byl zkoncentrován · lyofilizací. Přibližný výtěžek (na základě aminokyselinové analýzy) : 79,4 pg.

Vzhledem k homologii peptidů 13-1 a 13-2 nebyly tyto peptidy odděleny iontovou výměnou ani chromatografickou metodou s reverzními fázemi. Při počátečním sekvenováňí této směsi bylo zjištěno, že prvních 50 aminokyselin je stejných, takže k objasnění celé struktury je možno použít degradace peptidu. Po digesci této směsi Glu-C, po které následovalo sekvenování výsledných frakcí a potom další digesce za použití trypsinu v 0,1 M tris hydrochloridu a 1 M guanidinhydirochloridu o hodnotě pH 8,5, přičemž po hmotnostní spektrometrické analýze a sekvenování byla potvrzena struktura peptidu 13-1, tak jak je tó uvedeno 20 ID č. SEQ 3 : 74 zbytků, 12 cysteinů, 6 disulfidových vazeb Vypočítaná hmotnost * 8653,26

Zjištěná hmotnost = 8652,57 (ion-sprayová hmotnostní spektrometrie) .

Odhadnutá hodnota pl = 7,65. P ř í k 1 a d " ' 4 ^ . > ·.

Peptid 13-2.

Struktura frakce 13-2 byla potvrzena způsobem uvedeným výše v příkladu 3. ID Č. SEQ ,4 : 74 zbytků, 12 cysteinů, 6 disulf idových vazeb Vypočítaná hmotnost - 8680,29

Zjištěná hmotnost = 8678,64 ± 1,64 (ion-sprayová hmotnostní spektrometrie) Odhadnutá hodnota pl = 7,65. , . Příklad 5 ·

Peptid 13.-3. (A) Surový jed pavouka Filistata hibernalis (DV) v množství asi 80 μΐ byl aplikován na semipreparativní polysulfoethylašpartamidovou kolonu (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ), ve které bylo zpracovávání prováděno za použití troj fázového lineárního gradientového programu, zpočátku 20 % B, 80%Ca0%Dana konci 20 % B, 0 % C a 80 % D, což probíhalo po dobu 45 minut (B = CH^CN, C ='5 mM H3P04/H20 o hodnotě pH 4,5 a D = C + 1 M NaCl) , přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 3,5 mililitru/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 34 až 35,5 minutě. Shromážděné frakce byly odsoleny bez zkoncentrovávání. . v . 21 - (B) Podíl získaný z frakcionace podle stupně (A), viz - výše, získaný z 3360 μΐ surového jedu, byl aplikován na kolonu k provedeni vysokoúčinné kapalinové chromatografie p s reverzními fázemi (HPLC kolona Vydac , C-18; 30 nm, 22 x 250 milimetrů), ve které bylo zpracovávání provedeno s dvoj fázovým lineárním gradientovým programem, zpočátku — 75 % A a 25 96 B a na konci 70 96 A a 30 % B, což probíhalo po dobu 60 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina a B = CHjCN, přičemž detekce probíhala při 220 ran a průtočné množství bylo 15 mililitrů/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 29 až 31 minutě. Shromážděné frakce z jednotlivých postupů byly zkoncentrovány lyofilizací.

Struktura peptidu 13-3 byla určena a ověřena pomocí následujících metod. Aminokyselinová analýza.PTC byla provedena třikrát s 1 až 10 nmoly, přičemž bylo použito systému Vaters Pico-Tag systém. N-koncové sekvenování bylo provedeno pomocí impulzního-kapalinového sekvenátoru ABI jak s původním peptidem tak s redukovaným/pyridylethylovaným peptidem..Hodnoty hmotnostní spektrální analýzy bylý získány pomocí SCI-EX API III ion-sprayového hmotnostního spektrometru. 1 ‘ ·'

Pyridylethylovaný derivát peptidu 13-3, vhodný pro N-koncové sekvenování byl připraven následujícím způsobem, Peptid 13-3 (v množství 300 μg) byl rozpuštěn v 20 μΐ pufru (1 M tris,1 pH 8,4 obsahující 4 >M dvojsytného EDTA a 8 M guanidinhydrochlorid v poměru 1 : 3) a potom bylo provedeno zjpracování pomocí přídavku .7,28 .μΐ 1,41 M roztoku (10 %- -obj/obj) 2-merkaptoethanolu^v pufru a tato reakční směs byla udržována po dobu 3 hodin v tmavém prostředí při teplotě místnosti. Takto získaná reakční směs byla potom zpracována 22 přídavkem 11,19 μΐ 10 % (obj.(obj.) roztoku 4-vinylpyridinu v pufru a potom byla uchovávána při teplotě místnosti v tmavém prostředí po dobu 18 hodin. V dalším postupu byla tato* reakční směs zředěna na objem 600 μΐ přídavkem 1 %-ního TFA/H2Ó a tato směs byla aplikována na HPLC kolonu (vysokoúčinná kapalinová chromatografická kolona Baker VPC-18, 4,6 x 250 milimetrů) pracující s dvojfázovým ~ ~ lineárním gradientovým programem 100 až 65 % A a 0 až 35 % B v intervalu 30 minut a následně 65 až 40 % A a 35 až 60 % B v intervalu 15 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina, B = CH^CN), přičemž detekce byla provedena při 220 nm a průtočné množství bylo 1,0 mililitr/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 34 až 35 minutách, přičemž tento podíl byl zkoncentrován lyofilizací. Přibližný výtěžek (na základě aminokyselinové analýzy) : 194 pg.

Zjištěné shromážděné hodnoty potvrzovaly strukturu peptidu 13-3, jak je to uvedeno níže. ID č. SEQ 5 : 74 zbytků, 12 cysteinů, 6 disulfidových^azeb Vypočítaná hmotnost = 8668,29 » J.

Zjištěná hmotnost = 8668 (ion-sprayová hmotnostní spektrometrie)

Odhadnutá hodnota pl = 7,65. 1 Příklad 6 Peptid 13-4. * (A) Surový jed pavouka Filistata hibernalis (DV) v množství asi 80 μΐ byl aplikován na semipreparativní polysulfoethylaspartamidovou kolonu (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ), ve které bylo zpracovávání prováděno za použití trojfázového lineárního gradientového programu, zpočátku 20 % B, 80%Ca0%Dana konci 20 % B, 0 % C . a 80 % D, což probíhalo po dobu 45 minut (B = CH^CN, C' = 5 mři HgFO^/ř^O o hodnotě pH 4,5 a D « C + 1 ři NaCl) , přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 3,5 mililitru/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 34 až 35,5 minutě. Shromážděné frakce byly odsoleny bez zkoncentrovávání. (B) Podíl získaný z frakcionace podle stupně (A), viz výše, získaný z 3360 μΐ surového jedu, byl aplikován na kolonu k provedení vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzními fázemi (HPLC kolona Vydac^, C-18, 30 nm, 22 x 250 milimetrů), ve které bylo zpracovávání provedeno s dvoj fázovým lineárním gradientovým programem, zpočátku . Ί5 % ·Ά—a-· 25-% Έ a~na'konci"70~% A- á*·30^^7 -což'· probíhalo ~po dobu 60 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina a B = CH^CN, přičemž detekce probíhala při 220 nm a průtočné množství bylo 15 mililitrů/minutu.* Požadovaná frakce byla odebrána po 22 až 22,5 minutě. Shromážděné frakce z jednotlivých .postupů byly zkoncentrovány lyofilizací .

Struktura peptidu 13-4 byla. určena a ověřena pomocí následujících metod. Aminokyselinová analýza PTC byla provedena třikrát s 1 až 10 nmoly, přičemž bylo použito systému Vaters Pico-Tag systém. N-koncové sekvenování bylo provedeno pomocí impulzního-kapalinového sekvenátoru ABI jak s původním peptidem tak s redukovaným/pyridylethylovaným peptidem. Hodnoty hmotnostní spektrální analýzy byly získány pomocí SCI-EX API. III ion-sprayového hmotnostního spektrometru. t t * . i

Zjištěné shromážděné hodnoty potvrzovaly strukturu peptidu 13-4, jak je to uvedeno níže. Z4 - ID č. SEQ 6 : 72 zbytků, 12 cysteinů, 6 disulfidových vazeb Vypočítaná hmotnost = 8640,15

Zjištěná hmotnost = 8640. (ion-sprayová hmotnostní spektrometrie)

Odhadnutá hodnota pl = 7,87. P f r k 1 a d 7 -Peptid 14-1. *

(A) Surový jed pavouka Filistata hibernalis (DV) v množství asi 80 μΐ byl aplikován na semipreparativni polysulfoethylaspartamídovou kolonu (PolyLC 9,4 x 200 milimetrů, 5 μ), ve které bylo zpracovávání prováděno za použití trojfázového lineárního gradientového programu, zpočátku 20 % B, 80 % C a 0 % D a na konci .20 % B, 0 % C 1. a 80 % D, což probíhalo po dobu 45 minut (B = CH^CN, C = 5 mM H3P04/H20 o hodnotě pH 4,5 a D =. C + 1M NaCl), přičemž detekce probíhala při 220 ran a průtočné množství bylo 3,5 mililitru/minutu. Požadovaná frakce bylá odebrána po 28 až 29 minutě. Shromážděné frakce byly odsoleny bez zkoncentrovávání. ..... 4 - * J-'r_ (B) Podíl získaný z frakcionace podle stupně (A), viz výše, získaný z 3360 μΐ surového jedu, byl aplikován na kolonu k provedení vysokoúčiímé kapalinové chromatografie s reverzními fázemi (HPLC kolona Vydac®, C-18, 30 nm, 22 x 250 milimetrů), ve které bylo zpracovávání provedeno s dvojfázovým lineárním gradientovým programem, zpočátku 80 % A a 20 % B a na konci 56 % A a 44 %„B, což probíhalo po dobu 42 minut (A = 0,1 % trifluoroctová kyselina a B - CH^CN, přičemž detekce probíhala„při 220™nm a^průtočné množství bylo 15 mililitrů/minutu. Požadovaná frakce byla odebrána po 18 až 19,5 minutě. Shromážděné frakce , * 25 z jednotlivých postupů byly zkoncentrovány lyofilizací.

Struktura peptidu 14-1 byla určena a ověřena pomocí následujících metod. Aminokyselinová analýza PTC byla provedena třikrát s 1 až 10 nmoly, přičemž bylo použito systému Vaters Pico-Tag systém. N-koncové sekvenování bylo provedeno pomocí impulzního-kapalinového sekvenátoru ABI jak~ s původním peptidem tak s redukovaným/pyridylethylováným peptidem. Hodnoty hmotnostní spektrální analýzy byly získány pomocí SCI-EX API III ion-sprayového hmotnostního spektrometru. p

, ' . * V

Pyridylethylovaný derivát-peptidu 14-1, vhodný pro -N-.konóové -sekvenování: byl1, připraven následuj.ícím-způsobem,

Peptid 14-1 (v množství 150 pg) byl rozpuštěn v 10 μΐ pufru

(i M tris, pH 8,4 obsahující 4 μΜ dvojsytného EDTA a 8 M guanidinhydrochlórid v poměru 1 : 3) a potom bylo provedeno zpracování pomocí přídavku 3,65 μΐ 1,41 M roztoku (10 % obj/úbj) 2-merkaptoethanolu v pufru a tato reakční směs byla udržována po dobu 3 hodin v tmavém prostředí při teplotě. místnosti. Takto získaná reakční směs byla potom zpracována : přídavkem 5,91 μΐ 0,93 M roztoku 4-vinylpyridinu v pufru a potom byla uchovávána při teplotě místnosti v tmavém prostředí po dobu 18 hodin. V dalším postupu byla tato

reakční směs zředěna přídavkem 280 μΐ 10 %-ního CH3CN/H2O a tato směs byla aplikována na HPLC kolonu (vysokoúčinná kapalinová chromátografická kolona Baker VPC-18, 4,6 x 250 milimetrů) pracující*s dvojfázovým lineárním gradientovým programem 100 až 65 % A a 0 až 35 % B v intervalu 30 minut a následně 65 až 40 % A a 35 až 60 % B v inte;rvalu 15 minut (A*=0,1 % trifluoroctová kyselina, B = CH^CN), přičemž » detekce byla provedena při 220 nm a průtočné množství bylo $ 1,0 mililitr/minutu. Požadovaná frakce: byla odebrána po 33 až 34,5 minuty, přičemž tento podíl byl zkoncentrován lyofilizací.

Sekvence tohoto peptidu byla stanovena jednoznačně až * do zbytku 52. Redukovaný a pyridylethylovaný peptid v množství 20 μg byl potom podroben digesci ve 25 mM tris hydrochloridu s přídavkem 1 .mM EDTA o pH 8,5 za použití-- - -20 pg Lys-C. Po charakterizaci sekvenováním a ion-sprayové hmotnostní spektrometrii byla získána kompletní primární struktura peptidu 14-1, jak je to uvedeno dále. ID Č. SEQ 7 : 73 zbytků, 10 cysteinů, 5 dvojných vazeb Vypočítaná hmotnost = 8308,05

Zjištěná hmotnost = 8307,67 ± 0,55 (ion-sprayová hmotnostní spektrometrie)

Odhadnutá hodnota pl = 8,17. 27 Přehled o sekvencích1 (1) Obecné informace : (I) Přihlašovatel : (A) Název Pfizer lne (B) Místo : 235 East 42nd Street. . _ (Čj Město : Ňew York “ (D) Stát : New York (F) Země : Spojené státy americké (F) Poštovní kód (ZIP) : 10017 (G) Telefon : (203) 441-4905 (H) Telefax : (203) 441-5221 (A) Název : NPS Pharmaceuticals, lne. -------------(B)_ Místo „: „420.* Chi peta _ Vay ___ _ ► (C) .Město : Salt Lake City (D) Stát : Utah (F) Země : Spojené státy americké (F) Poštovní kód (ZIP) : 84108 (G) Telefon : (801) 583-4939 (M) Telefax : (801) 583-4961 (II) Název vynálezu : Polypeptidy blokující vápníkové kanálky nacházející se v jedu pavouka Filistata hibernalis (III) Počet sekvencí : 7 (IV) . Počítačově čitelná forma : (A) Typ média : Floppy disk (B) Počítač : IBM PC compatibilní

(C) Operační systém : PC-D0S/MS-D0S (D) Software : Patentln Release #1.0» Version #1.25 (EPO) ...... (VI) prioritní data o přihlášce vynálezu : (A) Číslo přihlášky : US 07/887073 (B) Den podání : 21. květen 1992 28

(2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : I (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 72 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů : jeden (D) Topologie : lineární _„ * ► (II) Molekulový typ : protein (VI) Původní zdroj : \> (A) Organismus : Filistatá hibernališ (F) Typ tkáně : jed (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ ,1 :

Ala-Glu-Cys-Val-Asn-Ile-Tyr-Gln-Pro-Cys-Ser-Thr-Ile- 1 5 10

Gly-Leu-Arg-Cýs-Cys-Tyr-Gly-Ala-ArgrCys-Tyr~Cys-Lys-Glu-15 20 25

Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Tyr-Asn-Arg-Ser-Thr-Arg-Lys-Arg^Asp-30 35 40

Cys-Gly-Trp-Ser-Ser-Tyr-Asp-Cys-Lys-Cys-Asp-Tyr-Thr-Trp-45 50 55

Met-His-Arg- Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Glu-Gly-Tyr-Ser-Cys-Tyr- 60 65

Cýs-Lys-Qlu 70 29 (2) Informace pro sekvenci ID Č. SEQ : 2 (I) Charakteristika sekvence : * (A) Délka : 74 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů : jeden (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : protein (VI) Původní zdroj : (A) Organismus : Filistata hibernalis (F) Typ tkáně : jed — ------(XI) -Popis-sekvence-:' TD'čr SEQ"· 2—: ~~~· ^

Ala-Glu-Cys - Leu-Met-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Cys-Val-Pr ο-Ι 5 10

Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys-15 20 25

Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Gln-Gln-30 35 40

Cys-Gly-Trp-Arg-Glu-Val-Asn-Cys-Lys-Cys-Asp-Trp-Ser-Trp· 45 50 55

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Ser-Cys-Lys- 60 65

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln 70

i

30 - (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 3 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 74 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů : jeden (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : protein (VI) Původní zdroj : (A) Organismus : Filistata hibernalis (F) Typ tkáně : jed (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 3 :

Ala-Glu-Gys-Leu-Met-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Cys^Val-Pro- 1 5 10

Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys- 15 20 25 4

Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Arg-Glu- 30 35 40

Cys-Gly-Trp-Val-Glu-Val-Asn-Cys-Lys-Cys-Gly-Trp-Ser-Trp-45 50 55 4,

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Ser-Cys-Lys-. 60 65

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln 70 31 (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 4 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 74 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů jeden 1 (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : protein (VI) Původní zdroj : (A) Organismus : Filistata hibernalis (F) Typ tkáně : jed * — . . — (XT)~Popis-sekvence r-ID^č. "SEQ'4

Ala-Glu-Cys-Leu-Met-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Cys-Val-Pro-1 5 10

Arg?Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys-15 20 25

Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Arg-Glu-30 *; 35 40

Cys-Gly-Trp-Val-Glu-Val-Asn-Cys-Lys-Cyš-Gly-Trp-Ser-Trp-45 50 55

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Asp-Trp-Arg-Alá-Asp-Tyr-Asn-Cys-Lys- 60 65

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln 70 32 (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 5 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 74 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů : jeden (D) Topologie ^lineární (II) Molekulový typ : protein (VI) Původní zdroj : (A) Organismus : Filistata hibernalis (F) Typ tkáně : jed (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 5 :

Ala-Glu-Cys-Leu-Met-Ile-Gly-Asp-ThrrSer-Cys-Val-Pró-1 5 10

Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Trp-Cys-Tyr-Cys-15 20 25

Asp-Gln-Gln-Leu-Ser-Cys-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Lys-Arg-Glu- 30 35 40

Cys-Gly-Trp-Val-Glu^Val-Asri-Cys-Lys-Cýs-Gly^Trp-Sfer-Trp- 45 50 * 55 i

Ser-Gln-Arg-Ile-Asp-Ašp-Trp-Arg-Ala-Asp-Tyr-Ser-Cys-Lys- 60 65 ^

Cys-Pro-Glu-Asp-Gln 70 33 (2) Informace pro sekvenci ID č; SEQ : 6 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 72 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů : jeden (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : protein (VI) Původní zdroj : * (A) Organismus : Filistata hibernalis (F) Typ tkáně : jed —,i r(XI-)- Popis-sekvence ·: -ID. č.—SEQ 6~ : — T~

Ala-Glu-Cys-Val-Asn- Ile-Tyr-Gln-Pro-Cys-Ser-Asn-Ile- 1 5 ' 10 >

Gly-Leu-Arg-Cys-Cys-Tyr-Gly-Ala-Arg^Cys-Tyr-Cys-Lys-Glu-15 20 1 25

Lys-Leu-Ser-Cys-Arg-Tyr-Asn-Arg-Val-Thr-Arg-Lys-Arg-Asp- 30 35 40

Cys-Gly-Trp-Ser-Ser-Tyr-Asp-Cys-Lys-Cys-Asp^Tyr-Thr-Trp- 45 50 55 *

Met-His-Arg- Ile-Asp-Asp-Trp-Leu-Asp-Gly-Tyr-Ser-Cys-Tyr- 60 65

Cys-Lys-Glu 70 *

Claims (2)

1. - J*t
2. - (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 7 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 73 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (C) Počet pramenů : jeden (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : protein 4 (VI) Původní zdroj : ' ' (A) Organismus : Filistata hibernalis (F) Typ tkáné : jed (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 7 : Glu-Glu-Lys-Lys-Cys-Lys-Leu-Ile-Asp-Glu-Pro-Cys-Ser-15 10 Asn-Lys-Asp-Pro- Ile-Ile-Cys-Cys-Lys-Gly-Ala-Arg~Cys-Val-15 20 25 Cys-Asn-Asp-Val-Arg-Ser-Gly-Thr-Ser-Lys-Asp-Tyr-Leu-Gly-30 35 40 Arg-Asn-Ile-Pro-Ala-Phe-Val-Arg-Val-Cys-Lys-Cys-Asp-Trp-45 50 55 Ser-Tyr-Pro-Ala-Tyr-Leu-Lys-Asp-Leu-Ala-Thr-Phe-Phe-Asn- 60_ 65 Cys-Asn-Cys-Arg 70.