JPH0692440B2 - カルシウムチャンネル遮断薬として有用なポリペプチド - Google Patents
カルシウムチャンネル遮断薬として有用なポリペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアゲレノプシス アペルタ（Agelenopsisapert
a）クモの毒液中に存在することが見い出されたポリペ
プチドおよび前記ポリペプチドと本質的に同じアミノ酸
配列および本質的に同じ活性を持つポリペプチドに関す
る。このポリペプチドおよびその医薬として適当な塩は
無脊椎動物および脊椎動物を含む種々の生物体の神経お
よび筋肉細胞を含む細胞中のカルシウム チャンネルを
遮断する。さらに、本発明は前記ポリペプチドおよびそ
の塩からなる組成物に関する。
a）クモの毒液中に存在することが見い出されたポリペ
プチドおよび前記ポリペプチドと本質的に同じアミノ酸
配列および本質的に同じ活性を持つポリペプチドに関す
る。このポリペプチドおよびその医薬として適当な塩は
無脊椎動物および脊椎動物を含む種々の生物体の神経お
よび筋肉細胞を含む細胞中のカルシウム チャンネルを
遮断する。さらに、本発明は前記ポリペプチドおよびそ
の塩からなる組成物に関する。
従来の技術 クモ アゲレノプシス アペルタ（Agelenopsis apert
a）の毒液はカルシウム流動に影響を及ぼす少くとも２
つの毒素を含んでいることが報告されている。Jackson,
H.,らSoc.Neu.Sci.Abstr.12:1078（1987）。これらの著
者は1,000ダルトン未満の分子量を持ち、組織の広い範
囲においてのカルシウム流動を抑制する毒素（そこでは
AG2と称されている）について記載している。さらに、J
ackson,H.らはSoc.Neu.Sci.Abstr.12:730（1986）にお
いて約6,000の分子量の成分からなるアゲレノプシス
アペルタ （Agelenopsis aperta）からの他の毒素を報
告している。その毒素は伝達の前シナプシス封鎖に影響
を与え、神経伝達物質の放出と関連があるカルシウム
チャンネルをその毒素が遮断することが示唆されてき
た。
a）の毒液はカルシウム流動に影響を及ぼす少くとも２
つの毒素を含んでいることが報告されている。Jackson,
H.,らSoc.Neu.Sci.Abstr.12:1078（1987）。これらの著
者は1,000ダルトン未満の分子量を持ち、組織の広い範
囲においてのカルシウム流動を抑制する毒素（そこでは
AG2と称されている）について記載している。さらに、J
ackson,H.らはSoc.Neu.Sci.Abstr.12:730（1986）にお
いて約6,000の分子量の成分からなるアゲレノプシス
アペルタ （Agelenopsis aperta）からの他の毒素を報
告している。その毒素は伝達の前シナプシス封鎖に影響
を与え、神経伝達物質の放出と関連があるカルシウム
チャンネルをその毒素が遮断することが示唆されてき
た。
アゲレノプシス アペルタ （Agelenopsis aperta）ク
モの毒液中に存在することが発見されたある種のポリペ
プチドが1989年４月28日に出願された米国特許出願第07
/346,181号に記載されている。これらのポリペプチドは
そこで細胞のカルシウムチャンネルの遮断薬として記載
されており、それらが見い出される分画に従って下記の
ごとく記載されている： 分画G: アミノ末端アミノ酸配列中が、 H2N−glu−lys−gly−leu−pro−glu−gly−ala−glu−
cys−asp−gly−asn−glu−ser−asp−cys−lys−cys−
ala−gly−gln−trp−ile−lys−cys−arg−cys−pro−
trp−lys−trp−his−ile−thr−gly−glu−gly−pro−
cys−thr−cys−glu−arg−gly−leu−lys−lys−thr−
cys−ile−ser−lys−len−ser−asp−pro−asn−arg−
asn−glu−trp−leu−ser− からなり;FAB MSによる全ポリペプチドの分子量:7267。
モの毒液中に存在することが発見されたある種のポリペ
プチドが1989年４月28日に出願された米国特許出願第07
/346,181号に記載されている。これらのポリペプチドは
そこで細胞のカルシウムチャンネルの遮断薬として記載
されており、それらが見い出される分画に従って下記の
ごとく記載されている： 分画G: アミノ末端アミノ酸配列中が、 H2N−glu−lys−gly−leu−pro−glu−gly−ala−glu−
cys−asp−gly−asn−glu−ser−asp−cys−lys−cys−
ala−gly−gln−trp−ile−lys−cys−arg−cys−pro−
trp−lys−trp−his−ile−thr−gly−glu−gly−pro−
cys−thr−cys−glu−arg−gly−leu−lys−lys−thr−
cys−ile−ser−lys−len−ser−asp−pro−asn−arg−
asn−glu−trp−leu−ser− からなり;FAB MSによる全ポリペプチドの分子量:7267。
分画H1： H2N−ala−cys−val−gly−glu−asn−gln−gln−cys−
ala−asp−trp−ala−gly−pro−his−cys−cys−asp−
gly−tyr−tyr−cys−thr−cys−arg−tyr−phe−pro−
lys−cys−ile−cys−arg−asn−asn−asn−CONH2;FAB
MS:4198. 分画H2： アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−ala−lys−ala−leu−pro−pro−gly−ser−val−
cys−asp−gly−asn−glu−ser−asp−cys−lys−cys−
tyr−gly−lys−trp−his−lys−cys−arg−cys−pro−
pro−lys−gly−his−phe−thr−gly−glu− からなり;FAB MSによる全ポリペプチドの分子量:5494。
ala−asp−trp−ala−gly−pro−his−cys−cys−asp−
gly−tyr−tyr−cys−thr−cys−arg−tyr−phe−pro−
lys−cys−ile−cys−arg−asn−asn−asn−CONH2;FAB
MS:4198. 分画H2： アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−ala−lys−ala−leu−pro−pro−gly−ser−val−
cys−asp−gly−asn−glu−ser−asp−cys−lys−cys−
tyr−gly−lys−trp−his−lys−cys−arg−cys−pro−
pro−lys−gly−his−phe−thr−gly−glu− からなり;FAB MSによる全ポリペプチドの分子量:5494。
分画I: H2N−asp−cys−val−gly−glu−ser−gln−gln−cys−
ala−asp−trp−ala−gly−pro−his−cys−cys−asp−
gly−tyr−tyr−cys−thr−cys−arg−tyr−phe−pro−
lys−cys−ile−cys−val−asn−asn−asn−CONH2;FAB
MS:4158。
ala−asp−trp−ala−gly−pro−his−cys−cys−asp−
gly−tyr−tyr−cys−thr−cys−arg−tyr−phe−pro−
lys−cys−ile−cys−val−asn−asn−asn−CONH2;FAB
MS:4158。
分画J: アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−asp−glu−pro−cys−ile−pro−leu−gly−lys−
ser−cys−ser−trp−lys−ile−gly−thr−pro−tyr−
cys−cys−thr−his−pro−asp−asp−ala− からなり;FAB MSによる全ポリペプチドの分子量:5505。
ser−cys−ser−trp−lys−ile−gly−thr−pro−tyr−
cys−cys−thr−his−pro−asp−asp−ala− からなり;FAB MSによる全ポリペプチドの分子量:5505。
分画K: H2N−glu−asp−asn−cys−ile−ala−glu−asp−tyr−
gly−lys−cys−thr−trp−gly−gly−thr−lys−cys−
cys−arg−gly−arg−pro−cys−arg−cys−ser−met−
ile−gly−thr−asn−cys−glu−cys−thr−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu−ser−phe−ala−CON
H2;FAB MS:5274 分画L1： アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−ile−val−gly−gly−lys−thr−ala−lys−phe−
gly−asp−tyr−pro−trp−met−val−ser−ile−gln−
gln−lys−asn−lys−lys−gly−gly−phe−asp− からなり；全ポリペプチドのおよその分子量は約20,00
0。
gly−lys−cys−thr−trp−gly−gly−thr−lys−cys−
cys−arg−gly−arg−pro−cys−arg−cys−ser−met−
ile−gly−thr−asn−cys−glu−cys−thr−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu−ser−phe−ala−CON
H2;FAB MS:5274 分画L1： アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−ile−val−gly−gly−lys−thr−ala−lys−phe−
gly−asp−tyr−pro−trp−met−val−ser−ile−gln−
gln−lys−asn−lys−lys−gly−gly−phe−asp− からなり；全ポリペプチドのおよその分子量は約20,00
0。
分画L2： 下記の同定特性を持つポリペプチド： （ａ）アゲレノプシス アペルタ（Agelenopsis apert
a）クモの粗毒液からの分画に存在し、Ｃ−18バイダッ
ク（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300Å
の細孔径、10μの粒子径のカラムにおいて、15ml/分の
流速および５％→20％Ｂ、95％→80％Ａ〔０→30分〕続
いて20％→70％Ｂ、80％→30％Ａ〔30→55分〕（ここで
Ａは0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルであ
る）の直線勾配プログラムを使用する溶媒系を用いて約
43分に溶出され；および （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
在し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）10mm×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径のカラ
ムにおいて3.5ml/分の流速および25％→40％Ｂ、75％→
60％Ａ〔０→30分〕（ここでＡは0.1％TFA水溶液であ
り、Ｂはアセトニトリルである）の直線勾配プログラム
を使用する溶媒系を用いて約22.5分に溶出される。
a）クモの粗毒液からの分画に存在し、Ｃ−18バイダッ
ク（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300Å
の細孔径、10μの粒子径のカラムにおいて、15ml/分の
流速および５％→20％Ｂ、95％→80％Ａ〔０→30分〕続
いて20％→70％Ｂ、80％→30％Ａ〔30→55分〕（ここで
Ａは0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルであ
る）の直線勾配プログラムを使用する溶媒系を用いて約
43分に溶出され；および （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
在し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）10mm×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径のカラ
ムにおいて3.5ml/分の流速および25％→40％Ｂ、75％→
60％Ａ〔０→30分〕（ここでＡは0.1％TFA水溶液であ
り、Ｂはアセトニトリルである）の直線勾配プログラム
を使用する溶媒系を用いて約22.5分に溶出される。
分画M: アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−glu−ala−thr−glu−ala−ala−lys−val−leu−
ser−asn−leu−asp−glu−thr−val−asp−pro− からなり；全ポリペプチドのおよその分子量が約80,00
0。
ser−asn−leu−asp−glu−thr−val−asp−pro− からなり；全ポリペプチドのおよその分子量が約80,00
0。
発明が解決しようとする問題点 カルシウム拮抗薬である化合物は種々の有用性を持って
いる。カルシウム拮抗薬はアンジーナ、高血圧、心筋
症、上心室性不整脈、食道アカラシア、早産およびレイ
ノー病などのごとき状態の処置における臨床応用に見る
ことができる。M.G.Nayler,カルシウム拮抗薬、アカデ
ミックプレス、ハルコートブレイス ヤバノヴィッチ
パブリッシャーズ、ニューヨーク、NY1988、を参照され
たい、その教えはここに引例として含まれている。さら
に、そのような化合物は神経および筋肉細胞のごとき細
胞の生理学の研究および無脊椎動物の害虫の制御に有用
である。
いる。カルシウム拮抗薬はアンジーナ、高血圧、心筋
症、上心室性不整脈、食道アカラシア、早産およびレイ
ノー病などのごとき状態の処置における臨床応用に見る
ことができる。M.G.Nayler,カルシウム拮抗薬、アカデ
ミックプレス、ハルコートブレイス ヤバノヴィッチ
パブリッシャーズ、ニューヨーク、NY1988、を参照され
たい、その教えはここに引例として含まれている。さら
に、そのような化合物は神経および筋肉細胞のごとき細
胞の生理学の研究および無脊椎動物の害虫の制御に有用
である。
問題を解決するための手段 本発明はアゲレノプシス アペルタ（Agelenopsis aper
ta）クモの毒液中に存在することが見い出されたポリペ
プチドに関する。本発明のポリペプチドおよびそれが存
在する本発明による分画は以下のごとくである： 分画Q: （ａ）アゲレノプシス アペルタ （Agelenopsis aper
ta）クモの粗毒液からの分画に存在し、Ｃ−18バイダッ
ク（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300Å
の細孔径、５μの粒子径のカラムにおいて15ml/分の流
速および５％→20％Ｂ、95％→80％Ａ〔０→30分〕続い
て20％→70％Ｂ、80％→30％Ａ〔30→55分〕〔ここでＡ
は0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液であり、Ｂはア
セトニトリルである〕の直線勾配プログラムを使用する
溶媒系を用いて約41.5分に溶出され； （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
在し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）10mm×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径のカラ
ムにおいて3.5ml/分の流速および70％Ａ、30％Ｂ（ここ
でＡは0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルであ
る）の無勾配系を使用する溶媒系を用いて約7.5分に溶
出され；および （ｃ）アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−lys−lys−lys−cys−ile−ala−lys−asp−tyr−
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− からなる。
ta）クモの毒液中に存在することが見い出されたポリペ
プチドに関する。本発明のポリペプチドおよびそれが存
在する本発明による分画は以下のごとくである： 分画Q: （ａ）アゲレノプシス アペルタ （Agelenopsis aper
ta）クモの粗毒液からの分画に存在し、Ｃ−18バイダッ
ク（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300Å
の細孔径、５μの粒子径のカラムにおいて15ml/分の流
速および５％→20％Ｂ、95％→80％Ａ〔０→30分〕続い
て20％→70％Ｂ、80％→30％Ａ〔30→55分〕〔ここでＡ
は0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液であり、Ｂはア
セトニトリルである〕の直線勾配プログラムを使用する
溶媒系を用いて約41.5分に溶出され； （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
在し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）10mm×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径のカラ
ムにおいて3.5ml/分の流速および70％Ａ、30％Ｂ（ここ
でＡは0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルであ
る）の無勾配系を使用する溶媒系を用いて約7.5分に溶
出され；および （ｃ）アミノ末端アミノ酸配列が： H2N−lys−lys−lys−cys−ile−ala−lys−asp−tyr−
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− からなる。
本発明のポリペプチドは細胞中のカルシウムチャンネル
を遮断する。それ故、前記ポリペプチドはそれ自身で細
胞のカルシウム チャンネルの遮断に有用である。前記
ポリペプチドはまた無脊椎動物の害虫の制御および細胞
のカルシウム チャンネル機能が介在する哺乳類の疾病
および健康状態の処置に有用である。
を遮断する。それ故、前記ポリペプチドはそれ自身で細
胞のカルシウム チャンネルの遮断に有用である。前記
ポリペプチドはまた無脊椎動物の害虫の制御および細胞
のカルシウム チャンネル機能が介在する哺乳類の疾病
および健康状態の処置に有用である。
本発明はまた前記ポリペプチドからなる医薬組成物およ
び前記ポリペプチドの投与方法にも関している。
び前記ポリペプチドの投与方法にも関している。
毒液はアゲレノプシス アペルタ（Agelenopsis apert
a）クモから当業者にはよく知られている常法に従い、
電気刺激による乳液しぼり出し過程により得られる。腹
部逆流物または血リンパによる全毒液への混入に対して
防護できる方法を用いるのが好適である。そのような方
法は当業者にはよく知られている。そのようにして得ら
れた全毒液は以下に記載する精製に使用されるまでは−
78℃にて凍結状態で貯蔵された。
a）クモから当業者にはよく知られている常法に従い、
電気刺激による乳液しぼり出し過程により得られる。腹
部逆流物または血リンパによる全毒液への混入に対して
防護できる方法を用いるのが好適である。そのような方
法は当業者にはよく知られている。そのようにして得ら
れた全毒液は以下に記載する精製に使用されるまでは−
78℃にて凍結状態で貯蔵された。
全毒液からの成分の精製は、Ｃ−４およびＣ−18バイダ
ック（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）カラム（レイニン
インスツルメント Co.Inc.,マックロード，ウォバー
ン，マサチューセッツ01801）のごとき種々の分取用お
よび半分取用カラムによる透相高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）により達成された。ピークの検出は220−2
30nmの単色光で実施された。分画のさらなる分析は例え
ばウォーターズ990ダイオードアレー検出器（ミリポア
コーポレーション，ウォーターズ クロマトグラフィー
ディビジョン、34メープルストリート、ミルホード
マサチューセッツ01757）で集められた多色光UVデータ
により達成された。カラムからの分画はISCO/“FOXY"フ
ラクションコレクターおよびISCO2159ピーク検出器（IS
CO,4700スーペリオール，リンカーン，ネブラスカ6850
4）を使用するごとき既知の方法により集められた。分
画は無菌ポリエチレン実験器具のごとき適当な大きさの
容器に集められる。分画の濃縮は溶出液からの凍結乾燥
続いての水からの凍結乾燥により達成される。得られる
成分分画の純度は分画の最終精製に使用された系よりも
少ない勾配の勾配系を用いる分析カラムを使用するクロ
マトグラフィー分析により決定できる。
ック（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）カラム（レイニン
インスツルメント Co.Inc.,マックロード，ウォバー
ン，マサチューセッツ01801）のごとき種々の分取用お
よび半分取用カラムによる透相高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）により達成された。ピークの検出は220−2
30nmの単色光で実施された。分画のさらなる分析は例え
ばウォーターズ990ダイオードアレー検出器（ミリポア
コーポレーション，ウォーターズ クロマトグラフィー
ディビジョン、34メープルストリート、ミルホード
マサチューセッツ01757）で集められた多色光UVデータ
により達成された。カラムからの分画はISCO/“FOXY"フ
ラクションコレクターおよびISCO2159ピーク検出器（IS
CO,4700スーペリオール，リンカーン，ネブラスカ6850
4）を使用するごとき既知の方法により集められた。分
画は無菌ポリエチレン実験器具のごとき適当な大きさの
容器に集められる。分画の濃縮は溶出液からの凍結乾燥
続いての水からの凍結乾燥により達成される。得られる
成分分画の純度は分画の最終精製に使用された系よりも
少ない勾配の勾配系を用いる分析カラムを使用するクロ
マトグラフィー分析により決定できる。
各々の分画に含まれるものの構造はマススペクトル法お
よび核磁気共鳴法のごとき既知の分析法により決定され
た。分画Ｑのポリペプチドは既知の方法に従って配列決
定された。例えば、試験するポリペプチドのシスチン残
基のＳ−ピリジルエチル化は溶液中で実施でき、続いて
ポリペプチドのアミノ酸配列決定がなされる。Ｓ−ピリ
ジルエチル化のためのそのような方法の１つは以下のご
とくである。１部の4mMのEDTAを含む1MトリスHCl,pH8.5
および３部の8Mグアニジン・HClを混合することにより
調製された緩衝液に約１から10μｇのポリペプチドを溶
解または希釈して50μｌとする。次に2.5μｌの10％２
−メルカプトエタノール水溶液を添加して混合物を暗
所、アルゴン下室温にて２時間インキュベートする。イ
ンキュベーション後、２μｌの４−ビニルピリジン（ア
ルゴン下−20℃で貯蔵されている新しい試薬）を添加
し、混合物は暗所にてアルゴン下室温でさらに２時間イ
ンキュベートする。混合物は次に好適には短い逆相カラ
ム上のクロマトグラフィーにより脱塩される。回収され
たアルキル化ポリペプチドは続いて既知の方法に従って
配列決定される。
よび核磁気共鳴法のごとき既知の分析法により決定され
た。分画Ｑのポリペプチドは既知の方法に従って配列決
定された。例えば、試験するポリペプチドのシスチン残
基のＳ−ピリジルエチル化は溶液中で実施でき、続いて
ポリペプチドのアミノ酸配列決定がなされる。Ｓ−ピリ
ジルエチル化のためのそのような方法の１つは以下のご
とくである。１部の4mMのEDTAを含む1MトリスHCl,pH8.5
および３部の8Mグアニジン・HClを混合することにより
調製された緩衝液に約１から10μｇのポリペプチドを溶
解または希釈して50μｌとする。次に2.5μｌの10％２
−メルカプトエタノール水溶液を添加して混合物を暗
所、アルゴン下室温にて２時間インキュベートする。イ
ンキュベーション後、２μｌの４−ビニルピリジン（ア
ルゴン下−20℃で貯蔵されている新しい試薬）を添加
し、混合物は暗所にてアルゴン下室温でさらに２時間イ
ンキュベートする。混合物は次に好適には短い逆相カラ
ム上のクロマトグラフィーにより脱塩される。回収され
たアルキル化ポリペプチドは続いて既知の方法に従って
配列決定される。
本発明の実施には先に概説した一般式な方法が用いら
れ、毒液の最初の分画化に適したカラムはＣ−18バイダ
ック（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300
Åの細孔径、10μの粒子径のカラムであることが見い出
された。このカラムは15ml/分の流速で95％→80％Ａ、
５％→20％Ｂ〔０→30分〕続いて80％→30％Ａ、20％→
70％Ｂ〔30→55分〕〔ここでＡは0.1％トリフルオロ酢
酸（TFA）水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである〕
の直線勾配プログラムを用いて溶出される。分画は前記
のごとく集められる。そのようにして得られたＱ′と名
付けられた分画がさらなる精製のために選択された。分
画Ｑ′の溶出時間は約41.5分であった。
れ、毒液の最初の分画化に適したカラムはＣ−18バイダ
ック（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300
Åの細孔径、10μの粒子径のカラムであることが見い出
された。このカラムは15ml/分の流速で95％→80％Ａ、
５％→20％Ｂ〔０→30分〕続いて80％→30％Ａ、20％→
70％Ｂ〔30→55分〕〔ここでＡは0.1％トリフルオロ酢
酸（TFA）水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである〕
の直線勾配プログラムを用いて溶出される。分画は前記
のごとく集められる。そのようにして得られたＱ′と名
付けられた分画がさらなる精製のために選択された。分
画Ｑ′の溶出時間は約41.5分であった。
分画Ｑ′はＣ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録
商標）10mm×250mm、300Åの細孔径、5.0μの粒子径の
カラムを用い、3.5ml/分の流速で70％0.1％TFA水溶液、
30％アセトニトリルの無勾配系を用いてさらに精製され
た。分画は前記のごとくして集められた。分画Ｑはカラ
ムから約7.5分で溶出された。また、約8.3分に溶出され
る分画は米国特許出願第07/346,181号において、分画Ｋ
と記載されているポリペプチドを含んでいた事が観察さ
れた。
商標）10mm×250mm、300Åの細孔径、5.0μの粒子径の
カラムを用い、3.5ml/分の流速で70％0.1％TFA水溶液、
30％アセトニトリルの無勾配系を用いてさらに精製され
た。分画は前記のごとくして集められた。分画Ｑはカラ
ムから約7.5分で溶出された。また、約8.3分に溶出され
る分画は米国特許出願第07/346,181号において、分画Ｋ
と記載されているポリペプチドを含んでいた事が観察さ
れた。
分画Ｑは： H2N−lys−lys−lys−cys−ile−ala−lys−asp−tyr−
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− からなるアミノ末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが
含まれていた。
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− からなるアミノ末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが
含まれていた。
アゲレノプシス アペルタ（Agelenopsis aperta）から
の毒液の分画Ｑに存在する化合物に関して本開示内容に
利点を与えるよう現在全毒液からの単離／精製以外の方
法により前記化合物を得ることが可能である。本発明の
ポリペプチドは、前記ポリペプチドまたはその一部をコ
ードしている配列のクローニングによる組換え体DNAを
用いて製造できる。例えば、全ポリペプチドをコードし
ている配列のクローン化のため、前記ポリペプチドの現
在知られているアミノ酸配列情報を利用するバイブリダ
イゼーションプローブが当業者にはよく知られた方法に
従って用いることができる。組換え体DNA技術および試
験管内でのタンパク質合成の組合せもまた本発明のポリ
ペプチドの製造に用いることができる。そのような試験
管内タンパク質合成法としては、当業者にはよく知られ
ている標準メリーフィールド化学または他の固相化学を
用いるABI 430A固相ペプチド合成機（アプライド バイ
オシステムス,Inc.,850リンカーンセンター ドライ
ブ，フォスター市 カリホルニア94404）の使用が挙げ
られるがそれに制限されるわけではない。
の毒液の分画Ｑに存在する化合物に関して本開示内容に
利点を与えるよう現在全毒液からの単離／精製以外の方
法により前記化合物を得ることが可能である。本発明の
ポリペプチドは、前記ポリペプチドまたはその一部をコ
ードしている配列のクローニングによる組換え体DNAを
用いて製造できる。例えば、全ポリペプチドをコードし
ている配列のクローン化のため、前記ポリペプチドの現
在知られているアミノ酸配列情報を利用するバイブリダ
イゼーションプローブが当業者にはよく知られた方法に
従って用いることができる。組換え体DNA技術および試
験管内でのタンパク質合成の組合せもまた本発明のポリ
ペプチドの製造に用いることができる。そのような試験
管内タンパク質合成法としては、当業者にはよく知られ
ている標準メリーフィールド化学または他の固相化学を
用いるABI 430A固相ペプチド合成機（アプライド バイ
オシステムス,Inc.,850リンカーンセンター ドライ
ブ，フォスター市 カリホルニア94404）の使用が挙げ
られるがそれに制限されるわけではない。
本分野においては前記ポリペプチドの機能に影響しな
い。または本質的に影響しないある種のアミノ酸の置換
をポリペプチド中にすることができることがよく知られ
ている。可能である的確な置換はポリペプチド間で変化
する。許容される置換の決定は当業者によく知られた方
法に従って達成される。
い。または本質的に影響しないある種のアミノ酸の置換
をポリペプチド中にすることができることがよく知られ
ている。可能である的確な置換はポリペプチド間で変化
する。許容される置換の決定は当業者によく知られた方
法に従って達成される。
本発明のポリペプチドは無脊椎動物および脊椎動物の神
経および筋肉系の細胞のごとき種々の細胞に存在するカ
ルシウム チャンネルを不可逆的に遮断する。
経および筋肉系の細胞のごとき種々の細胞に存在するカ
ルシウム チャンネルを不可逆的に遮断する。
カルシウム チャンネルを遮断する本発明のポリペプチ
ドの能力は以下の方法により示される。小脳顆粒細胞を
生後８日のラットの小脳から調製する（Wilkin,G.P.
ら、Brain Res:115:181−199,1976）。Aclar（プロプラ
スチックInc.,5033インダストリアル アベニュ，ウォ
ール,N.J.07719）の四角片（１cm2）をポリ−Ｌ−リジ
ンで被覆し、1mlのイーグルの基礎培地を含む12−ウェ
ルの皿に入れる。細胞を解離させ、6.25×106細胞を含
む液をAclarの四角片を含む各々のウェルに添加する。
細胞播種24時間後にシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノ
フラノシドを添加する（最終濃度10μＭ）。培養6.7お
よび８日目に細胞をfura2分析に使用する。細胞（Aclar
四角片に付着している）をHEPES緩衝液（0.01％ウシ血
清アルブミン,0.01％デキストロースを含み、pH7.4、マ
グネシウム除去）に溶解した２μMfura2/AM（モレキラ
ープロープInc.,コージーン,OR,97402）の1mlを含む12
−ウェル皿へ移す。細胞を37℃にて40分間インキュベー
トし;fura2/AM含有緩衝液を除き、fura2/AM除いた1mlの
同じ緩衝液に置き換える。石英のキュベットに2.0mlの
前もって温めてある（37℃）緩衝液を加える。Aclar上
の細胞をキュベット中に置き、キュベットを磁気攪拌器
を備えた恒温に保たれている（37℃）ホールダー中へ挿
入し、蛍光分光光度計（バイオメディカル インスツル
メント グループ、ペンシルバニア大学）で蛍光を測定
する。蛍光信号は約２分間まって安定化させる。次にリ
ン酸緩衝化塩溶液（PBS,pH7.4）に適当な濃度で溶解さ
せた５−20μｌの試験する化合物の貯蔵溶液をキュベッ
トに添加する。蛍光信号の校正およびfura2/AM漏出補正
はNemethらの確立された方法〔J.Biol.Chem.262:5188
（1987）〕を用いて実施され、各々の試験完了時、最大
蛍光値（Fmax）はイオノマイシン（35μＭ）の添加によ
り決定され、最小蛍光値（Fmin）は続いてのキレートカ
ルシウムへのEGTA（12mM）の添加により決定された。以
上の方法を用い、被験化合物によるカルシウム チャン
ネルの遮断が起こることは被験化合物の添加により蛍光
が減少することにより示される。
ドの能力は以下の方法により示される。小脳顆粒細胞を
生後８日のラットの小脳から調製する（Wilkin,G.P.
ら、Brain Res:115:181−199,1976）。Aclar（プロプラ
スチックInc.,5033インダストリアル アベニュ，ウォ
ール,N.J.07719）の四角片（１cm2）をポリ−Ｌ−リジ
ンで被覆し、1mlのイーグルの基礎培地を含む12−ウェ
ルの皿に入れる。細胞を解離させ、6.25×106細胞を含
む液をAclarの四角片を含む各々のウェルに添加する。
細胞播種24時間後にシトシン−ベータ−Ｄ−アラビノ
フラノシドを添加する（最終濃度10μＭ）。培養6.7お
よび８日目に細胞をfura2分析に使用する。細胞（Aclar
四角片に付着している）をHEPES緩衝液（0.01％ウシ血
清アルブミン,0.01％デキストロースを含み、pH7.4、マ
グネシウム除去）に溶解した２μMfura2/AM（モレキラ
ープロープInc.,コージーン,OR,97402）の1mlを含む12
−ウェル皿へ移す。細胞を37℃にて40分間インキュベー
トし;fura2/AM含有緩衝液を除き、fura2/AM除いた1mlの
同じ緩衝液に置き換える。石英のキュベットに2.0mlの
前もって温めてある（37℃）緩衝液を加える。Aclar上
の細胞をキュベット中に置き、キュベットを磁気攪拌器
を備えた恒温に保たれている（37℃）ホールダー中へ挿
入し、蛍光分光光度計（バイオメディカル インスツル
メント グループ、ペンシルバニア大学）で蛍光を測定
する。蛍光信号は約２分間まって安定化させる。次にリ
ン酸緩衝化塩溶液（PBS,pH7.4）に適当な濃度で溶解さ
せた５−20μｌの試験する化合物の貯蔵溶液をキュベッ
トに添加する。蛍光信号の校正およびfura2/AM漏出補正
はNemethらの確立された方法〔J.Biol.Chem.262:5188
（1987）〕を用いて実施され、各々の試験完了時、最大
蛍光値（Fmax）はイオノマイシン（35μＭ）の添加によ
り決定され、最小蛍光値（Fmin）は続いてのキレートカ
ルシウムへのEGTA（12mM）の添加により決定された。以
上の方法を用い、被験化合物によるカルシウム チャン
ネルの遮断が起こることは被験化合物の添加により蛍光
が減少することにより示される。
本発明のポリペプチドはそれ自身、カルシウムチャンネ
ル遮断薬として有用である。それだけでなく、これらの
化合物はまか無脊椎動物の害虫の制御およびアンジー
ナ、高血圧、心筋症、上心室性不整脈、食道アカラシ
ア、早産およびレイノー病のごとき哺乳類の細胞のカル
シウム チャンネル機能が介在する疾患および健康状態
の処置にも有用である。さらに、これらの化合物は神経
および筋肉系の細胞を含む（しかしそれらに制限される
わけではない）細胞の生理学の研究に有用である。
ル遮断薬として有用である。それだけでなく、これらの
化合物はまか無脊椎動物の害虫の制御およびアンジー
ナ、高血圧、心筋症、上心室性不整脈、食道アカラシ
ア、早産およびレイノー病のごとき哺乳類の細胞のカル
シウム チャンネル機能が介在する疾患および健康状態
の処置にも有用である。さらに、これらの化合物は神経
および筋肉系の細胞を含む（しかしそれらに制限される
わけではない）細胞の生理学の研究に有用である。
本発明のポリペプチドの医薬として適当な塩もまた本発
明の範囲内である。そのような塩は当業者にはよく知ら
れた方法により形成される。例えば、ポリペプチドの塩
基塩が常法に従って調製できる。
明の範囲内である。そのような塩は当業者にはよく知ら
れた方法により形成される。例えば、ポリペプチドの塩
基塩が常法に従って調製できる。
本発明のポリペプチドが哺乳類に投与される場合、単独
でまたは標準的な医薬処方に従って医薬組成物中の医薬
として適当な担体または希釈剤と組合わせて投与でき
る。本発明のポリペプチドは経口または非経口で投与で
きるが、ポリペプチドには非経口投与法が好適であろ
う。非経口投与には静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下およ
び局所投与が含まれる。
でまたは標準的な医薬処方に従って医薬組成物中の医薬
として適当な担体または希釈剤と組合わせて投与でき
る。本発明のポリペプチドは経口または非経口で投与で
きるが、ポリペプチドには非経口投与法が好適であろ
う。非経口投与には静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下およ
び局所投与が含まれる。
本発明のポリペプチドの経口使用のためには、本化合物
は例えば錠剤またはカプセルまたは水性溶液または懸濁
液の形で投与できる。経口使用のための錠剤の場合にお
いては、通常使用される担体として乳糖およびコーンス
ターチが挙げられ、ステアリン酸マグネシウムのごとき
潤滑剤が普通添加される。カプセルの形での経口投与の
ための有用な希釈剤は乳糖および乾燥コーンスターチで
ある。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる場
合、活性成分は乳化および沈殿防止剤と混合される。必
要に応じ、ある種の甘味および／または芳香剤が添加で
きる。
は例えば錠剤またはカプセルまたは水性溶液または懸濁
液の形で投与できる。経口使用のための錠剤の場合にお
いては、通常使用される担体として乳糖およびコーンス
ターチが挙げられ、ステアリン酸マグネシウムのごとき
潤滑剤が普通添加される。カプセルの形での経口投与の
ための有用な希釈剤は乳糖および乾燥コーンスターチで
ある。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる場
合、活性成分は乳化および沈殿防止剤と混合される。必
要に応じ、ある種の甘味および／または芳香剤が添加で
きる。
筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内使用のためには、活
性成分の無菌溶液が通常調製され、溶液のpHは適切に調
節および緩衝化されなければならない。静脈内使用のた
めには、調製液を等張にするために、溶質の全濃度が制
御されなければならない。
性成分の無菌溶液が通常調製され、溶液のpHは適切に調
節および緩衝化されなければならない。静脈内使用のた
めには、調製液を等張にするために、溶質の全濃度が制
御されなければならない。
本発明のポリペプチドまたはその塩がヒトの患者に使用
される場合、日用量は通常処方する医者により決定され
るであろう。さらに、用量は患者の微候の激烈さおよび
投与される特定の化合物の強力さ同様に個々の患者の年
令、体重および応答性に従って変化するであろう。
される場合、日用量は通常処方する医者により決定され
るであろう。さらに、用量は患者の微候の激烈さおよび
投与される特定の化合物の強力さ同様に個々の患者の年
令、体重および応答性に従って変化するであろう。
本発明のポリペプチドまたはその塩が無脊椎動物害虫の
制御に使用される場合、前記ポリペプチドは前記無脊椎
動物へ直接投与されるかまたは前記無脊椎動物の環境へ
供給される。例えば、本発明の化合物は溶液として前記
無脊椎動物上に噴霧できる。前記無脊椎動物の制御に必
要な化合物の量は、無脊椎動物および環境状態に従って
変化するであろうし、化合物を使用する人により決定さ
れるであろう。
制御に使用される場合、前記ポリペプチドは前記無脊椎
動物へ直接投与されるかまたは前記無脊椎動物の環境へ
供給される。例えば、本発明の化合物は溶液として前記
無脊椎動物上に噴霧できる。前記無脊椎動物の制御に必
要な化合物の量は、無脊椎動物および環境状態に従って
変化するであろうし、化合物を使用する人により決定さ
れるであろう。
本発明のポリペプチドまたはその塩が細胞の生理学的研
究に使用される場合、前記ポリペプチドは細胞に当業者
にはよく知られている方法に従って投与される。例え
ば、前記ポリペプチドは適当な生理学的緩衝液に溶解し
て細胞に投与できる。そのような研究に使用するための
本発明の化合物の適当な濃度は100μＭである。しかし
ながら、そのような研究における前記ポリペプチドの濃
度は100μＭより高くても低くてもよい。投与される化
合物の量は既知の方法に従い当業者により決定されるで
あろう。
究に使用される場合、前記ポリペプチドは細胞に当業者
にはよく知られている方法に従って投与される。例え
ば、前記ポリペプチドは適当な生理学的緩衝液に溶解し
て細胞に投与できる。そのような研究に使用するための
本発明の化合物の適当な濃度は100μＭである。しかし
ながら、そのような研究における前記ポリペプチドの濃
度は100μＭより高くても低くてもよい。投与される化
合物の量は既知の方法に従い当業者により決定されるで
あろう。
以下の実施例は例示のためであり、本発明の範囲を制限
すると解釈してはならない。
すると解釈してはならない。
実施例 アゲレノプシス アペルタ （Agelenopsis aperta）の
全毒液の最初の分画化 ナチュラル プロダクト サイエンス Inc.（ソルトレ
ーク市、ユタ84108）から得られ約−78℃で凍結状態で
貯蔵されていたアゲレノプシス アペルタ （Agelenop
sis aperta）の全毒液を融解し、その10から60μｌに希
釈し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）（22mm×250mm、300Åの細孔径、10μの粒子径）の
カラムに負荷し15ml/分の流速および５％→20％Ｂ、95
％→80％Ａ〔０→30分〕続いて20％→70％Ｂ、80％→30
％Ａ〔30→55分〕（ここでＡは0.1％TFA水溶液であり、
Ｂはアセトニトリルである〕の直線勾配プログラムを使
用する溶媒系を用いて溶出する。ピーク検出は220−230
nmの単色光で実施し、分画はISCO/“FOXY"フラクション
コレクターおよびISCO2159ピーク検出器を用いて集め
た。分画は20分から60分まで集めた。分画Ｑ′は約41.5
分に集められた。
全毒液の最初の分画化 ナチュラル プロダクト サイエンス Inc.（ソルトレ
ーク市、ユタ84108）から得られ約−78℃で凍結状態で
貯蔵されていたアゲレノプシス アペルタ （Agelenop
sis aperta）の全毒液を融解し、その10から60μｌに希
釈し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）（22mm×250mm、300Åの細孔径、10μの粒子径）の
カラムに負荷し15ml/分の流速および５％→20％Ｂ、95
％→80％Ａ〔０→30分〕続いて20％→70％Ｂ、80％→30
％Ａ〔30→55分〕（ここでＡは0.1％TFA水溶液であり、
Ｂはアセトニトリルである〕の直線勾配プログラムを使
用する溶媒系を用いて溶出する。ピーク検出は220−230
nmの単色光で実施し、分画はISCO/“FOXY"フラクション
コレクターおよびISCO2159ピーク検出器を用いて集め
た。分画は20分から60分まで集めた。分画Ｑ′は約41.5
分に集められた。
実施例２ 分画Ｑ′の再分画およびその中の構造物の決定 実施例１に記載されたごとくして得られた分画Ｑ′をＣ
−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）（10mm
×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径）のカラムに負
荷し、3.5ml/分の流速および70％Ａ、30％Ｂ（ここでＡ
は0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである）
の無勾配溶媒系を用いてカラムから溶出した。ピーク検
出はウォーターズ990ダイオード アレー検出器を用い
行い、分画収集は実施例１に記載したごとく行った。
−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）（10mm
×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径）のカラムに負
荷し、3.5ml/分の流速および70％Ａ、30％Ｂ（ここでＡ
は0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである）
の無勾配溶媒系を用いてカラムから溶出した。ピーク検
出はウォーターズ990ダイオード アレー検出器を用い
行い、分画収集は実施例１に記載したごとく行った。
下記の２つの分画が得られた： 分画 溶出時間 Ｑ 約7.5分 Ｋ 約8.3分 ポリペプチドを含む分画ＱおよびＫは次に既知の方法に
従って溶出液を凍結乾燥し続いて水から凍結乾燥するこ
とにより配列決定のために調製された。
従って溶出液を凍結乾燥し続いて水から凍結乾燥するこ
とにより配列決定のために調製された。
分画ＱおよびＫのアルキル化ポリペプチドのアミノ酸分
析はウォーターズ ピコ／タグ法を用い、製造元の使用
法に従って得られた。配列データは水性TFA転換してア
プライド バイオシステムス47OA型タンパク質／ペプチ
ドシークエンサー（アプライド バイオシステムス,In
c.850リンカーン センター ドライブ、フォスター
市、カリホルニア94404）で集められた。得られたフェ
ニルヒダントインアミン酸の分析はオンラインでアプラ
イド バイオシステム12OA型PTH分析機でまたはオフ
ラインでデュポン ソルベックスPTHカラム（バイオメ
ディカル プロダクト デパートメント、クロマトグラ
フィープロダクツ、E.I.デュポンド ヌムール アンド
Co.,Inc.,1007マーケット ストリート、ウィルミント
ン、デラウェア19898）により達成された。
析はウォーターズ ピコ／タグ法を用い、製造元の使用
法に従って得られた。配列データは水性TFA転換してア
プライド バイオシステムス47OA型タンパク質／ペプチ
ドシークエンサー（アプライド バイオシステムス,In
c.850リンカーン センター ドライブ、フォスター
市、カリホルニア94404）で集められた。得られたフェ
ニルヒダントインアミン酸の分析はオンラインでアプラ
イド バイオシステム12OA型PTH分析機でまたはオフ
ラインでデュポン ソルベックスPTHカラム（バイオメ
ディカル プロダクト デパートメント、クロマトグラ
フィープロダクツ、E.I.デュポンド ヌムール アンド
Co.,Inc.,1007マーケット ストリート、ウィルミント
ン、デラウェア19898）により達成された。
アミノ酸分析の結果、分画Ｑのポリペプチドの一部のア
ミノ末端アミノ酸配列は下記のごとく決定された： H2N−lys−lys−lys−cys−ile−ala−lys−asp−tyr−
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− アミノ酸分析の結果、分画Ｋは前記および米国特許出願
第07/346,181号に記載されている分画Ｋのポリペプチド
からなることも決定された。
ミノ末端アミノ酸配列は下記のごとく決定された： H2N−lys−lys−lys−cys−ile−ala−lys−asp−tyr−
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− アミノ酸分析の結果、分画Ｋは前記および米国特許出願
第07/346,181号に記載されている分画Ｋのポリペプチド
からなることも決定された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＱ ＡＢＲ ＡＢＵ ＡＣＪ ＡＣＶ ＡＤＤ 8314−4Ｃ (72)発明者 ニコラス・エイ・サッコマノ アメリカ合衆国コネチカット州06339，レ ッドヤード，ペイント・ミル・ドライブ ４ (72)発明者 ロバート・エイ・フォルクマン アメリカ合衆国コネチカット州06355，ミ スティック，ドッグウッド・レーン 135
Claims (4)
- 【請求項１】下記（ａ）−（ｃ）の同定特性： （ａ）アゲレノプシス アペルタ（Agelenopsis apert
a）クモの粗毒液からの分画に存在し、Ｃ−18バイダッ
ク（Ｃ−18Vydac ）（登録商標）22mm×250mm、300Å
の細孔径、10μの粒子径のカラムにおいて15ml/分の流
速および５％→20％Ｂ、95％→80％Ａ〔０→30分〕続い
て20％→70％Ｂ、80％→30％Ａ〔30→55分〕〔ここでＡ
は0.1％TFA（トリフルオロ酢酸）水溶液であり、Ｂはア
セトニトリルである〕の直線勾配プログラムを使用する
溶媒系を用いて約41.5分に溶出され； （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
在し、Ｃ−18バイダック（Ｃ−18Vydac ）（登録商
標）10mm×250mm、300Åの細孔径、５μの粒子径のカラ
ムにおいて3.5ml/分の流速および70％Ａ、30％Ｂ（ここ
でＡは0.1％TFA水溶液であり、Ｂはアセトニトリルであ
る）の無勾配溶媒系を用いて約7.5分に溶出され；およ
び （ｃ）アミノ末端アミノ酸配列が H2N−lys−lys−lys−cys−ile−ala−lys−asp−tyr−
gly−arg−cys−lys−trp−gly−gly−thr−pro−cys−
cys−arg−gly−arg−gly−cys−ile−cys−ser−ile−
met−gly−thr−asn−cys−glu−cys−lys−pro−arg−
leu−ile−met−glu−gly−leu− からなる； 本質的に純粋なポリペプチドまたはその医薬として適当
な塩。 - 【請求項２】カルシウム チャンネル遮断量の特許請求
の範囲第１項記載のポリペプチドまたはその医薬として
適当な塩および医薬として適当な希釈剤または担体から
なる哺乳類の細胞中のカルシウム チャンネルを遮断す
るための医薬組成物。 - 【請求項３】医薬としての使用のための特許請求の範囲
第１項記載のポリペプチドまたはその医薬として適当な
塩。 - 【請求項４】無脊椎動物害虫の抑制に使用するための特
許請求の範囲第１項記載のポリペプチドまたはその医薬
として適当な塩。
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|---|---|---|---|---|
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-
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-
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