PT1117682E - Péptidos de chi-conotoxina como inibidores de transportadores neuronais de aminais - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS DE CHI-CONOTOXINA COMO INIBIDORES de TRANSPORTADORES NEURONAIS DE AMINAS" A presente invenção refere-se a novos péptidos e seus derivados, úteis como inibidores de transportadores neuronais de aminas de neurotransmissores, tais como a noradrenalina, serotonina, dopamina, ácido glutâmico alicina. _nv€ refere-se igualmente a composições farmacêuticas que compreendem estes péptidos, sondas de ácidos nucieicos úteis na descoberta de análogos activos destes péptidos, ensaios para descobrir compostos com actividade inibidora do transportador neuronal da noradrenalina e à utilização destes péptidos na profilaxia ou tratamento de distúrbios, tais como, mas não limitadas à incontinência, distúrbios cardiovasculares e perturbações do humor.

Os búzios do género Conus (caracóis cone) utilizam uma estratégia bioquímica sofisticada para capturar as suas presas. Como predadores tanto de peixe, minhocas ou outros moluscos, os caracóis cone injectam a sua presa com veneno que contém um cocktail, de pequenos péptidos bioactivos. Estas moléculas de toxinas, que são referidas por conotoxinas, interferem com a neurotransmissão pela vectorização de uma variedade de receptores e canais de iões. 0 veneno de qualquer urna das espécies Conus pode conter mais de 100 péptidos diferentes. As cono toxinas estão divididas em classes, com base nos seus alvos fisiológicos. Até à data, foram descritas dez ciasses. A classe de péptidos das co-cono toxinas vectoriza e bloqueia canais de Ca2+ sensíveis voltagem, inibindo -ibertaçãc de neurotransmissores. As α-conotoxinas (ver documento WO-A-98/22126) e ψ-conotoxinas vectorizam e bloqueiam os receptores nicotlnicos da ACh, causando o bloqueio ganglionar e neuromuscular. Os péptidos da classe das μ-conotoxinas actuam para bloquear os canais de Nal sensíveis à voltagem, inibindo potenciais de acção dos músculos e nervos. As δ-conotoxinas vectorizam e atrasam a inactivação de canais de Na+ sensíveis à. voltagem, aumentando a excitabilidade neuronai. A classe de péptidos das κ-conotoxinas, vectoriza e bloqueia canais de KT sensíveis à voltagem, e estes também causam uma excitabilidade neuronai acrescida. As conopressinas são antagonistas dos receptores da vasopressina e as conantocinas são antagonistas dos receptores do NMDA. Maís recentemente, foram descritos o protótipo de uma nova classe de γ-conotoxinas, que vectoriza um canal de catião não específico sensível à voltagem, e de uma nova classe de o-conotoxinas, que antagoniza o receptor SHlt.

Foi agora verificado que conotoxinas, daqui em diante χ-conotoxinas, que são caracteriz de inibir transportadores neurona existe referida adas por uma nova como a possuírem classe de classe das a c a. ρ a c i d. a d e is de amimas.

Os compostos que inibem a recaptação de neurotransmissores foram verificados como sendo úteis no tratamento de distúrbios do tracto urinário inferior, tais como incontinência urinária, instabilidade do músculo detrusor e cistite intersticial. Um desses compostos é a "imipramina" que, além de inibir a recaptação de noradrenalina, mostrou afectar o bloqueio dos canais de cálcio, exibir actividade anestésica local anticolinérgica e um determinado número de outros efeitos. Outros compostos capazes de inibir a recaptação de noradrenalina são descritos na Patente U.S. N° 5.441,985. Estes compostos são 2 referidos como possuindo um efeito anticolinérgico reduzido em relação à imipramina.

No caso dos péptidos da presente invenção, esta inibição de recaptação de neurotransrnissores é conseguida pela inibição selectiva do transportador neuronal de neurotransrnissores, tal como o transportador de noradrenalina, que funciona para rapidamente remover a noradrenalina libertada da sinapse de volta aos neurónios.

Os péptidos da presente invenção são os primeiros péptidos a possuir actividade na inibição de um transportador de aminas. Todos os outros péptidos de conotoxina caracterizados até à data

vectorizam canais células, de iões ou receptores sobre 5; uperfícies das De acordo com um aspecto da pres ente invenção, 0 p r o p o r c i. o n a d o u rn péptido de χ-conotoxi Π ci -1. s O .1 3. Cl O f sintético OU recombinante, com a capacidade de inibir um transportador neuronal de aminas.

De uma forma preferida, o transportador neuronal de aminas é o transportador neuronal de noradrenalina. 0 péptido de χ-conotoxina pode ser um péptido de ocorrência natural 1 solado a partir de um c ai. r a c 01 c one 01 j um seu derivado. De 1. ima forma preferida, 0 péptido de χ- conotoxina é χ-MrIA ou χ-MrII if ou um seu derivado. 0 χ-Mr IA e 0 χ-MrIB podem ser isolados a partir do veneno do caracol ,·*'' /·, Ό O que caça moluscos,

Conus marmoreus.

Este ao amiooí péptido 1 O U- w> s ae il resiauos ae amrnoaciaoí em comprimento e contêm ligações 2-dissulfureto; os péptidos apresentam maior homologia aos membros na classe de α-conotoxinas, que actuam como antagonistas dos receptores nicotínicos da ACh.

As sequências de aminoácidos de χ-MrIA e χ-MrIB são como se segue: χ-MrIA . NGVCCGYKI iCHOC SEQ ID R° χ-MrIB VGVCCGYKI jCHOC SEQ ID N° 0 terminal C pode ser um ácido livre ou amidado.

Nas sequências anter : i o r e s, 0 "0" refere-se a 4-hidroxiprolina (Hyp) . Este residir o de aminoácido resulta da modificação pós-transl acionai do pép t ido c o d i i i. c a o o e n á cr e directamente codificado 1 p 0 À. 3. S equência de r lucleótidos.

De uma forma preferida, o péptido de χ-conotoxina é um inibidor se rectivo do transportador neuronal de noradrenalina. Os termos "selectivo" e "seiectivamente", como aqui utilizados, significam que a actividade do péptido como um inibidor do transportador neuronal de noradrenalina é consideravelmente maior do que qualquer actividade nos adrenoceptores oti. A Patente li., re c a p t a ç ã o de anticolinérgico c tratamento de dist

ISO 5,441,98 5 in di c a qu os inibidores da noraarenairna tsprezável são rbios do tracto que possuem particularmente urinário inferior um ereito úteis no -se que -Mr também não possui um efeito anticolinérgico detectável

Em consequência,, numa forma de realização preferida da invenção é proporcionado um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante que possui a capacidade de inibir selectivamente o transportador neuronal de noradrenalina e que possui um efeito anticolinérgi .co des jprezável ou nulo. 0 j ;-MrIA foi também ver ificado como 1 1 d O P o s s u i n d o a ct i v idad e como bloqueador de canais de sódio ou como inibidor dos transport ado res da dopamina. A 3. usência em χ-MrIA c lestas actividades farmacológicas adicionais habitualmente associadas a outros inibidores do transportador de noradrenalina e em péptidos preferidos de acordo com a invenção, torna estes péptidos ferramentas farmacológicas úteis.

Os péptidos de χ-conotoxina de acordo com a invenção podem poaem ser aerrva O o s o le pèotxdos de ocorrência natural. ocorrência natural por uma 01 mais :iA e irai. "X-Mr IB, ou em 1 . i α a c a lO com . 3.1S como χ-b ír IA .os r >éptic ios de soes. ad 1ÇÕ es, la‘ teraí; de aminoácidos, Tais derivados que não possuem a capacidade de inibir o transportador neuronal de noradrenalina, não se incluem no âmbito da presente invenção.

As substituições abrangem as alterações de aminoácidos em que um aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido diferente de ocorrência natural ou não convencional. Tais substituições podem ser classificadas como "conservadoras”, em cujo caso um resíduo de aminoácido contido num polipéptido é >corrência natural de substituído por outro aminoácido carácter semelhante, ou em relação à polaridade, funcionalidade de cadeia lateral ou tamanho, por exemplo,

Ser<^Thr*-»HProOHyp<-»-Gl y<-»Ala/ Valol le<-»Leu, Hi sf>LysoArge,

Asn<--->Gln<--->Asp<--->Glu ou Phe<--->Trp<--->Tyr. Deve ser entendido que alguns aminoácidos na o convenc i ona is podem ser ig ualmente substituições ap r o p r i a d a s para aminoácido s ae ocorrência natural. Por exemplo, a ornitina, homoarginina e dimetil --lisina estão rei acionados com His, Arg e I jys ·

As substituições englobadas pela presente invenção podem ser igua.lm.ente "não conservadoras", em que um resíduo de aminoácido que esta presente num péptido é substituído por um amínoácido com diferentes 'Propriedades, tais como um aminoácido de ocorrência natural de um grupo diferente (e. g., substituindo um aminoácido com carga ou hidrófobo por alanina), ou em alternativa, em que um aminoácido de ocorrência natural é substituído por um aminoácido não convencional.

As substituições ae aminoácidos são, normalmente, de resíduos únicos, mas podem ser de resíduos múltiplos, tanto agrupados como dispersos. ue uma forma preferida, as substituições de aminoácidos são conservadoras.

As aaições englobam a adição de um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou não convencionais. A deieçao engloba a deleçáo de um ou mais resíduos de aminoácidos.

Como referido anteriormente, a presente invenção inclui peptidos em que um ou mais dos aminoácidos sofreram modificações de cadeias laterais. Os exemplos de modificações de cadeias laterais contemplados pela presente invenção incluem modificações de grupos amino, tais como por alquilaçâo redutora, por reacção com um aldeído, seguida por redução com NaBH4; amidinação com metilacetimidato; acilação com anidrido acético; carbamoilação de grupos amino com cianato; trinitrobenzilação de grupos amino com ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS); acilação de grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetra-hidroftãlico; e piridoxilação de lisina com piridoxal-5--fosfato, seguida de redução com NaBH4. 0 grupo guanidina de res modificado pela formação de heterociclicos com reagentes, fenilglioxal e glioxal. duos de arginina pode se produtos cie condensação tais como 2, 3- butanodiona, 0 qn jpo carboxilo pode ser arbodi imi da por interi nédio eia eguida pc ;r derivação si íbsegu ente correspondente„ modificado pela activação de f o rm a. ç a o de 0 " a c i r 1. s o u r e i a, por exemplo, para uma amida

Os grupos sulfidrilo podem ser modificados por métodos tais como a carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida; oxidação do ácido perfórmico para ácido cisteico; formação de díssulfuretos mistos com outros compostos de tiol; reacção com maleimida, anidrido maleico ou outra maleimida substituída; formação de derivados mercuriais utilizando 4-cloromercuriben-zoato, ácido 4-cioromercurífeníIsulfóníco, cloreto de fenilmercúrio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol e outros compostos mercuriais; carbamoilação com cianato, a pH alcalino. Qualquer modificação de resíduos cisterna não deve afectar a capacidade do péptido para formar as ligações díssulfureto necessárias. É também possível substituir os grupos sulfidrilo de cisteína com equivalentes de selénio, tal que o péptido forme uma ligação de dísselénio em vez de uma ou mais ligações díssulfureto. -7 /

Os resíduos de triptofano podem ser modificados, por exemplo, pela oxidação com N-bromossuccinimida ou alquilação do anel de Índole com brometo de 2-hidroxi-5-nitrobenzilo ou com halogenetos de sulfenilo. Os resíduos de tirosina, por outro lado, podem ser alterados por nitração com tetranitrometano, para formar um derivado de 3-nitrotirosina. A modificação do anel de imidazole de um resíduo de nistidína pode ser efectuada pela alquilação com derivados do ácido iodoacético ou peia N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato. 0 resíduo de prolina pode ser modificado, por exemplo, pela hidroxilação na posição 4.

Mostra-se, na Tabela 1, uma lista de alguns aminoácidos com cadeias laterais modificadas e outros aminoácidos não naturais. TABELA 1

Aminoácído não Código Aminoácído não Código c o n v e n c i o n a 1 c o n v e n c i o n a 1 ácido a-aminobutírico Abu L --'N-metil alanina Nmala a-amino-a-metilfoutirato Mgabu I, -N-metil ar gin i na. Nmarg aminociclopropanocarboxi- Cpro L -N-metil asparagina Nmasn lato á. eido L-N -meti1aspártico Nmasp ácido aminoisobutírico Aib L -N-metil cisteína Nmcys aminonorbornilcarboxilato N o rb L -N-metil glutamina Nmgln á eido L-N -metilglutâmí c o Nmglu ciclo-hexi1alanina Chexa L -N-metil -h.rstid.ina Nmhis ciclopentilalanina Cpen I, -N-metil isoleucina Nmi le D-a. la nina Dal I, -N-metil -leucina Nmleu D-arainina Dara L -N-metil -lisina Nmlvs (continuação)

Aminoácido não c o n v e n c i o n a. .1. Código Aminoácido não convencional Código ácido D-aspártico Dasp L-N-meti1metionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmn i e D-glutamina Dgl n L-N-metilnorva1in a Nmnva ácido D-glutâmico Dgiu L-N-metilornitina Kmorn D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanína Kmphe D-isoleucina D i I e L-N-metilprolina Nmpro D-leucina D leu L-N-metilserina Nmser D-Iis ina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionina Dme t L-N-metiltriptofano Nmt rp D-ornitina Dom L-N-metiltirosina Nmtyr D-fenilalanína Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-meti1-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dtnr L-norieucina Nle D-triptofano Dtrp L-norvaiina Nva D-tirosina Dtyr a-metil-aminoisobutirato Maib D-valina D vai α-me t i1-γ-ami nobu tirato Mgabu D-a-me ti1a1an í na Diria 1 a. a-metilciclo-hexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Ornara a-metilciclopentilalanina Mcpen D-a-metilasparagina íjitlcí s n a-metil-α-naftilaianina Manap D-a-metilaspartato Dmasp a-metilpenicilamina Mpen D- a--me tilcisteina Dmcys N- (4-aminobutí1)glicina Nglu D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetii)glicina Naeg D-a-metil-histidina Dmh i. s N-(3-aminopropil)glicina Norn D-a-metilisoleucina Dmi le N ami η o - «---me t i Ibu t i r a t o Nmaabu D-a-meti1-leucina Drnleu α - n aftila i a η i. n a Anap D-a-metil-1isina Dmi ys N-benzilgiicina Nphe D~a---metilmetí onina Dmme t N- (2-carbamileti1)giicina Nqln 9 (continuação)

Aminoácido não c o n v e n c i o n a. 1 Código Aminoácido nao convencional Códigi D- a-metilornitina Dmorn N- (c a rb am i1me t i1)glici na Nasn D- •α-metilfenilalanir ia Dmphe N- (2-carboxietil)glicina N g 1 u D- •α-metilprolina Dmpro N- (carboximeti1)glicina Nasp D- •a-metilserina Drns e r N- ciclobu ti1glicina N cbu t D- •α-metiltreonina Dmthr N- ciclo-heptilglicina Kc hep D- •α-meti1triptofano Dmtrp N- ciclo-hexilglicina Nchex D- •a-metiltirosina Dmty N- ciclodecilglicina N c ο Θ c D- •α-metilvalina Dmv a 1 N- ciclododecilglicina Kcdod D- N-met. ilalanina Dnmala N- ciclooctilglicina Ncoct D- N-meti larginina Dnmarg N- ciclopropilglicina Kcpro D- N-meti 1 aspar agi na Dnmasn N“ cicloundecilglicina Kcund D- • N - me t i 1 a s p a r t a t o Dnmasp N- f 2,2-di.f enilet il) glicina Nbhm D- •N-metilcisteí n a Dnmcys N~ (3,3-difenilpropil)glicina Nbhe D·· N-metiiglutamina Dnmgln N- (3-guanidinopropil)glicina Narg D- •N-metilglutamato Dnmglu N~ (1-hidroxiet11)glicina Nthr D- •N-metil-histidina Dnmhis N~ (hidroxietil)glicina Kser D- ' N ” ΙΤΙ.Θ t..-i. 1. & O -i. Θ li C η. Γ1 cl. Dnmile N- (imidazoliletil))glicina Nhi s D~ •N-me t il-leuci n a Dnm.leu N- (3-indo1iletil)g1icina Nhtrp D~ •N-meti 1-1 is ina Dnm.lys N- metiΙ-γ-aminobutirato Nmgabí N- •met ilciclo- Nrnchexa D- N-metiImetionina Dnrnme' hexi xaian ma D- N-me tilorni tina Dnmorn N- metilglicina N 3. i. cl N- •metilaminoiso- Nmaib iy U tirato N- • (1-metilpro- Ni le pi .1) glicina N- (2-metilpro--- NI eu N~metilciclopentilalanina D-N-metilfenilalanina D-N-metílprolina D-N-metilserina D-N-metiItreonina

Dnmphe Dnmpro Dnmser Dnmthr 10 ρd-r) g~licj.η3. (continuação) m i η o a c i α o n a o convencional 'ódigo Aminoácido não convencional ooaigo ;·> _ N· -metiltriptofano Dnmtrp N -(1-meti letil}glicina Nval ;·> _ N- -metiltirosina Dnmtyr N -metil-n aftilalanina Nmanap pN _ N- -meti1vaiina Dnmva1 N· -met i]pe ni ci1amina Nmperi ác :ido γ-aminobutirico 0 a 3o u N· -(p-hidr oxifenil)glicina Nhtyr L- t- -buti1gli ci na Tbua Ν'· - (t í ornet i ] ) qd i c i na L- '0 : t i 1 g ]. i c i n a Etg penicilam ina Pen L- h’i < Dmofenilalanina Hphe L· -a-metil alanina Mala L- « -metilarginina Mar a L· -a-metil asparagina Masn L~ a- -metilaspartato Masp L· -a-meti1 -t-butiIglicina Mtbug L- a- -metilcisteína Mcys L -metilet iIglicina Metg L~ a meti Iglu tamina Mq 1 n L 'a-metil glutamato Mglu L- a- -meti1-histidina Mhis L -a-meti1 -homofenilalanin a Mhphe Γ,- o,.· -met í li soleiKvina Mile Ν' - (2-meti Itioetil)glicina Nmet L- a- Ml eu L' -a-metil -lisina Mlys L~ a- -me t i1metionin a Miria t' L' -a-meti1 norleucina Mn 1 e L- a- “rrieti 1 nerval i na Mnva L· -a-meti 1 o rn 11 i n a Morn L- a· -metilfenilalanina Mphe L -a-metil prolina Mpro L~ a- --metilserina Mser L -a-metil treonina Mthr L- α· -metiItriptofano Mt rp L -a-meti1 trrosrna Mtyr L- ·α· -metilvalina Mv a i. L' -N-meti1 -homofenilalan in a Nmhphe N- α Sí~ {2. f a ~cl.11.θπί .i.01.. ί .i.) Nnbnrn Μ - (N- (3,3 -difeniIpropil) Nnbhe

NtTi.bc carbamilmetiigiícina 1-carboxi-l-(2,2-difeniletilamino)cici -propano carbami1meti1g1icina O-metil-L-serina O-metil-L-homosserina

Umser

Omhser

Estes tipos de modificações podem ser importantes para estabilizar o péptido, se administrado a um indivíduo ou se utilizado como um reagente diagnóstico.

Outros derivados contemplados pela presente invenção incluem uma gama de variantes de glicosilação a partir de uma molécula completamente não glicosilada para uma molécula glicosilada modificada. Os padrões de glicosilação alterados podem resultar da expressão de moléculas recombinantes em diferentes células hospedeiras.

As χ-conotoxinas da presente invenção são, normalmente, amidadas no terminal C, no entanto, compostos com um terminal carboxilo livre ou outras modificações no terminal C são consideradas como estando dentro do âmbito da presente invenção. De uma forma preferida, os péptidos são ami dados ou têm um carboxilo livre no terminal C.

De uma forma preferida, os derivados de péptidos de χ-conotoxina de ocorrência natura1 reterão os residuos Cys e o padrão de 1: Lgação dissulf· ureto caracterí s t i co. Os derivados podem incluir resíduos Cys adicionais, des Η o que estes estejam protegidos durante a formação das ligações dissulfuret

Na modificação para formar derivados de péptidos de χ-conotoxina de ocorrência natural, é útil comparar as sequências de aminoácidos de péptidos activos de ocorrência natural para determinar quais, se alguns, dos resíduos são conservados entre espécies activas. A substituição destes resíduos conservados, embora não proibida, é menos favorecida do que substituições de resíduos não conservados. 12

Os derivados onde Ala substitui um ou 'eol^u°c, poaem ser utilizados para identificar o farmaco preferida, apenas um ou dois aminoácidos é de cada vez. Podem ser feitos novos oéptidos foro. De uma forma substituído por Ala adicionais onde são -j a r e s °u h .1 d r ó f ob o s, r- mais Precisamente o de s t a cla s s e ;gs substituições não ou resíduos polares ligaçã substituídos resíduos com carga, po respectivamente, para auxiliar a defini tipo de interacções envolvidas na farmacológica de péptido ao seu receptor. conservativas, onde a carga é revertida, substituem resíduos hidrófobos, podem ainda j.dentiiie«r rte&íduus envolvidos na ligação. Todos estes péptidos tem uO^encial t-aia 3 e 1 e c t i vi dade -i or evidenciar uma potência melhorada, c i"'Ίsoí^f~' lu<d alterações de aminoácidos não nativos pode ma .·:> s tabi 1 idade . para melhorar a potência, selectividade e/ou de estar envolvidos qer sistematicamente - , mudança de resíduos possa particuiar envase na Xi na periferia do erais mais longas : r a. c ç õ e s de 1 i ga ç ã o

Os resíduos expostos são mais provaveu em ligações ao receptor e podem substituídos. envolvidos na ligação e resíduos apena c ,.. , - , . , , . i ^ferais mais longas farmacororo, utiiizanao rormas ae caaeias ou mudanças não conservadas para apanhar in

.. , melhoradas· A adicionais para urna potência e/ou seiectat............ , _ a cauda de MriA ou reauçao ou aumento dos tamanhos das ansas t a

MrlB modifica ainda mais a actividade. ~ „,,Aqfnc Ha rima cauda

Deve-se notar que MriA e MrlB sao comP^" (resíduos 1-3), e duas ansas (resíduos 6-9 e 11-12), no entanto .. , . . , . . , _ „ ,, ,.,rosente invenção nao us peptioos ae χ-conotoxma e aenvaaoo ua P-L - ,. „i o r>srtϊ c.u-i-ar de estão restritos aos que possuem esta axspo»·-'5' ilmente p o s s r v eis, igações dissulfureto. São i9uc resultante possua a da aminoácidos e outras disposições e, desde que o péptido actividade requerida, um p>éptido incluir.T- ί H a, n s p é ρ t -i d o s presente invenção. De uma forma prefc1 J-ua' " ’ - - g0*“ cl ámiox1 suirao, pelo menos, dois resíduos cisteína e, pelo menos, uma ligaçao dxssuixureto ou, de uma forma mais preferida, quatro resíduos cxstexna e duas ligações dissulfureto. D ou A- D/B-C, sendo a última a C e D referem-se ao primeiro, aos Cys e nvolvido s n a formação Ά capaciaaae de íxga.ção destas ligações dissulfureto nestes péptidos pode ser A-B/C-D, A-c/B-D 01 preferida para MrlA e MrIB. a, segundo, terceiro e quarto resídu< cie ligações dissulfureto, respectivamentt

Esr.es pépnd.os podem, também, ser marcados e utilizados para estabeiecer ensaios cie ligação, para identificar novas moléculas que actuam no mesmo sítio. Por exemplo, o ligando marcado de MrlA ou MrIB podem ter trítio incluído ou podem ter i o d o r a d. i o a. c t i v o ou seme lhante liga ido através de ui n resíduo Tyr ou outro apropri ado. Um varrimento Tyr através de cada pépt ido estabelecera um local apropriado para a incorporação do Tyr. A iniciçào de ligação de tais péptidos marcados a homogenados tecidulares ou transportadores expressos, por compostos ou misturas, permitiria a identificação de novos péptidos activos neste sítio, incluindo os péptidos presentes no soro e tecido nervoso e muscular de mamíferos, incluindo tecidos humanos. 0 ensaio permitirá igualmente a identificação de moléculas de não psptidos que também actuam no mesmo sítio de MrlA e MrIB, e que P°de ter utilidade como formas oralmente activas destes ééptídos. Os péptidos marcados permitirão, adicíonalmente es tuc ruto-radiográficos P= identificar o local da ligação do ° Péptido através de vários tecidos. A <0; porções sequências podem ser utilizadas para

Pronn r-T r • v- va cl J. bar >es de dados 3 ESr ER, para identificar em m amiferos, Péptidos ou proteínas que contenham informação da sequência reiaciGnada, que podei'1 a ser utilizada para identificar ligandos endógenos que actuam de um modo emelhante ein mamíferos.

As χ - c ο η o t o x i n a s da presente ir ívenção podem ser preparadas através da utilização de métodos sii ntético s de peptidos padrão, seguidos pela formação d· e ligações dissul fureto oxidantes. Por exe mplo, OS > péptidos line ares : podem ser sin tetiz a dos por met odolo gi cL de fase sói ida u' tili zando química EOC, como de s c rito por Schn oi tz er et aí. ( 1992) * A segui r à desprotec çao e c I d. V agem 3. part j ! ν' do veículo sói .ido, os péptidos reduz: idos S G. 0 pur if ica ud s rr tilizando crom atog raf ia preparativa . Os Pép t -, Η .'Λ Q '-J O reduzido s P ur iIlCâdOS são oxic lados em sistemas ! tam pão, por exe mplo. r :on' •o descri to no ex empl •*\ O . O Z v Os péptidos o x i d ci d o s f oram pu r if ica do O f u tilizando croma i.togi raf ia preparativa.

As referências que descrevem a síntese de incluem Sato et aí., Lew et al. e o documento WO 91/07980. s χ-conotoxinas podem ser também preparadas através da itilização de tecnologia de ADN recombinante. Uma sequência de

As nu cl eótid O s que codifi Cg pa .T.' B a sequ ênc ria de pép tido desej a cia; pode s e r: ί n serida num vector e prot :eina apr opri a dos, expr e s s a num sis te ;ma de express ão apropriado. Snr í algui is c- 3- SOS, pode ser apro príad a uma modii _ z o cl ç a o químic. :a poste :rior do pép tido expr esso, Dor exemp] . o f a 3.ΓΠ.1 Π cl v( B 0 do terin linal r"1 * Sob de te rmina das cr rcunstâ. ncias, ] pode s< r· desej ável X. 0 cL .1. .1. Z cl X rama. f orm ação de ligação ox idante d o pépti rd n expre sso, como um p a s s o quim ico a se iguir à expr cessão do pépti ; 0 Este pode : ser prece dido de u rn ou a ISO redutor, p ara forn ecer o pé; p tido não proce ssado . OS espe cialí sta s na técnica p odem de t erminar facilmente a s cond içoes ap ropriadas p ara a re dução e ; 05 cidação do pépti do. A invenção proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico isolada, que compreende uma sequência de nucleótidos °1αΘ codifica para, ou é complementar da sequência que codifica para um péptido de χ-conotoxina, como descrito anteriormente.

Num outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma sonda. de a. c i o o nucleico qu .e compreei 3C10 UIU 3 S 0 CJU Θ Ώ C 1.3. d.0 nucleótidos que codifica pa ra, ou é complementar de uma sequência que coc iifíca para a totalidade ou parte de um péptido de χ-conotoxina.

Numa forma de realização particularmente preferida, a sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos que codifica para, ou é complementar de uma sequência que codifica para a sequência mostrada na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID K° 2.

Como aqui utilizada, uma referência a uma "sonda" inclui a referência a um iniciador utilizado na amolificacão ou a uma para u t i ] o na hibr idação directa. Ainda um outro aspecto da presente invenção é dirigido a orpos par 3 O S péptidos de y-conotoxina de acordo com 3 ção. Tais 3 u tr c :orpos poc iem ser monoclonais ou policlonais 0 podem ser seleccíonados a partir de anticorpos de ocorrência natural para os péptidos ou podem ser criados especificamente para os péptidos, utilizando técnicas padrão. No caso dos últimos, os péptidos podem necessitar de ser primeiramente associados a uma molécula de veículo. Os anticorpos da presente invenção são particularmente úteis como agentes terapêuticos ou de diaqnóstico. A este respeito, podem ser utilizados anticorpos específicos para rastrear os péptidos de acordo com a invenção. As técnicas para tais ensaios são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, ensaios sandwich e ELISA. 0 conhecimento dos níveis de péptidos pode ser importante para a monitorização de c e r t o s p r o t o c o 1 o s t e r a p ê u t i c o s .

Pode igualmente ser possível preparar anticorpos anti--idiotípicos através da utilização de técnicas conhecidas na técnica. Estes anticorpos antr-idiotípicos e a sua utilização como agentes terapêuticos representam mais um aspecto da presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser ADN ou ARN. Quando a molécula de ácido nucleico esta sob a forma de ADN, pode ser ADN genómico ou ADNc. As formas de ARN das moléculas de ácido nucleico da presente invenção são geralmente ARNm. L V CL O ou . r a s em

Apesar das moléculas de ácido nucleico dai presente invei estarem geralmente sob a forma isolada, podem ser integradas i ig; ou de outro modo fundidas ou associadas morecur

o UT genéticas, tais como moléculas de vectores e, particular, moléculas de vectores de expres são. Os vectores e vectores de expressão são geralmente c .apa z e s de replicação e, se aplicável, expressão numa ou em ambas de uma célula procariótica ou de célula eucariótica. De uma forma preferida, as células procarióticas incluem E. coli, Bacillus sp e Pseudomonas sp. As células eucarióticas preferidas incluem células de levedura, fúngicas, de mamíferos e insectos.

Em COll S Θ Q l: ê Π C -1- CÍ r outro aspect o da ρ ΓΘ8Θn le invenção contempla uma construção gené ti ca que compr eende uma porção de vector e um gene capazes de c odificar paira i um péptído de acordo com a invenção • De uma. f orma. pref e r 1. da., a p o r ç ã o de gene da construção genética está ligado operativamente a um promotor sobre o vector, tal qu e o citadc d promotor é capaz de dirigir a expressão CL 3. e tais construções genéticas óticas eme compreendem as da porção de gene numa célula apropris A presente invenção estende-se a e a células procarióticas ou encara mesmas,

As quimeras de χ-conotoxina3·' --ais como MrlA, com outras con o toxinas ou adicional mente cora outros pep ridos ou proteínas, podem ser feitas para conceber a actividade noutras moléculas, em determinados casos, paira pro0-^11' uma nova molécula com funcionalidade extra. Isto ser'ia efectuado, de uma forma preferida, utilizando o segmento ou segmentos da sequência destes péptidos que contêm o farmacoforo* Quanao o farmacóioro é descontínuo, os segmentos que perfazem o farmacoforo devem estar oosicionados na. nova construção P«*« permitir a ligação ao receptor. As quimera; resíduos Cvs adicionais e ligações podem inclui .^om outra3 cono toxinas dissulfureto adicionais . . - π·-,-, oí-. ronotoxina dentro de uma classe E comum, para peprrdus o<= ^ , . , liri padrão semelhante de ligação de actividade, possuírem um t ^Hdo entre os resíduos cisteína dissulfureto, com ansas de pepti·* o Y-MrTB, as ligações dissulfureto ligam respect ivos . Para χ-ι4ι Ia. e X J·*-' segundo e o terceiro resíduos o primeiro e o quarto, e , .. . ,· fc,T^te do padrão de ligação observado cisteína. Este padrao é dií^rcutu

Apesar desta diferença, os para os péptidos de a-couotoxi— ηοο^τη ser preparados através da derivados quiméricos pou-m , ^ _ηο~ qe um péptido de χ-conotoxina com. a ansa substituição Ge uma ansa i ^ que compreende uma sequência de outro péptido, incluindo a α-conotoxina. i n c. A invenção também, dímeros, trimeros, etc., de , . . , - .ΛΓ,ΛίΛΥΐ r>a, assim como péptidos de χ-conotoxina péptidos ae χ-οοί;-'νν,χ·η·α' ligados a outros péptiaos♦ i 8

De uma forma preferida, os péptidos de χ-conotoxina de acordo com a. invenção, possuem de 10 a 30 aminoácidos, cie uma forma mais preferida, de 11 a 20.

Pode ser obtida uma sequência de genes completa para os péptidos de χ-conotoxina de ocorrência natural através da utilização de uma estratégia combinada 5' RACE e 3' RACE acoplada com a clonagem e sequenciação de ADN.

Os péptidos de χ-conotoxina de acordo com a presente invenção são activos na inibição do transportador neuronal de η o r adre n a 1 i n a. E m c o n s e qu ê n c .ia, a i n v e n ç ã o p r o p o r c i ona a utilização de um péptido de χ-conotoxina como um inibidor do transportador neuronal de η o r a d r e n a 1 i n a, e no trate profilaxia de Q Ο θ Π Ç 3 S O u condições em -C Θ J_ 3 Ç ci O 3. S inibição do transpor tador neuronal de noradrenal associado ao tratamento eficaz. Tal actividade em agentes farmacológicos, está associada à actividade na profilaxia ou tratamento de doenças ou clistú cardiovascu lar, ou perturbações controlo da dor ou infla rua cão. ios dos sistemas urinário ou

Em consequência, a presente invenção proporciona um método para o tratamento ou profilaxia de distúrbios ou doenças urinárias ou cardiovasculares, ou perturbações do humor, ou para o tratamento ou controlo da dor ou inflamação, incluindo o passo de administração a um mamifero, de uma quantidade eficaz de um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante, com a capacidade de inibir o transportador neuronal de noradrenalina.

Os exemplos de doenças ou condições do sistema urinári incluem a incontinência urinãri ou condições c ardi0va s cu i are origens e a insuficiência O· perturbações do humor i nc.l 1I6C8S s 1 d. a d 0 s compulsivas, t a i. s dor incluem a dor crónica, dor

De uma forma preferida, tratamento, apesar do péptxdo sentido profiláctico. a e fecal» Os exemplos de doenças incluem arritmias de várias diaca coronária. Os exemplos de em a depressão, ansiedade e como o tabagismo. Os exemplos de leuropática e dor inflamatória. o mamífero necessita de tal poder ser administrado com um omposição que sintético ou t r a n s p o r t a d o r ou diluente A invenção proporciona, igualmente, uma compreende um péptido de χ-conotoxina isolado, recombinante, com a capacidade de inibir o neuronal de noradrenalina, e um veículo farma ceuticame :e a: :eí t

De uma forma preferida, uma composição farmacêutica. compos ição es t; soo a forma de É igualmente proporcionada a utilização de um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante, com a capacidade de inibir o transportador neuronal de noradrenalina na preparação de um medicamento, para o tratamento ou profilaxia de distúrbios ou doenças urinárias ou cardiovasculares, ou perturbações do humor, ou para o tratamento ou controlo da dor ou inflamação.

Deve-se também notar que o transportador de noradrenalina é expresso não apsnas por células nervosas, mas também por outros tecidos, incluindo a placenta, células endoteliais pulmonares e o útero. Os péptidos de acordo com. a presente invenção podem transportadores de

t31TbOGrp S0I 0 í C cl Z Θ S Π3. í Π i Í0 í C cl Ο ό-Θ S ο. Θ S noradrenalina, e podem ser úteis no tratamento de condições em que estes transportadores estão implicados.

Como será facilmente reconhecido pelos especialistas na técnicaf a via de administração e a natureza do veiculo farmaceuticamente aceitável irá depender da natureza do distúrbio e do mamífero a ser tratado. Crê-se que a escolha de um veiculo ou sistema de libertação, e via de administração particulares, poderiam ser facilmente determinados por uma pessoa COJX! competência na técnica. Na preparação de qualquer formula- ção que contêm os a c t .1 v o s d o "p 0 ]0 L .1. cl 0 f cl Θ V 0 ter-se o cuidado em garantir que a a ctividade do péptido não é destruida no proc e s s o - e que o péptido é capaz de atingir o seu sitio de accão s em s er destruído. Sm determinadas circunstâncias pode ser ca, vra necessário tais como, de adminis seu sitio proteger o péptido por meios conhecidos na técni por exemplo, rnicroencap sul ação. Do mesmo modo, a jtração escolhida deve ser tal que o péptido atinj de acção.

As formas farmacêuticas apropriadas para utilização injectável incluem soluções ou dispersões injectáveis estéreis, e pós estéreis, para a preparação extemporânea de soluções injectáveis estéreis. Estas devem ser estáveis sob condições de preparação e armazenagem e devem ser conservadas contra a oxidação e a acção contaminante de microorganismos, tais como .O cí C L 0 J- .j. ò S O U a. li Ώ Q O S *

Os especialistas na técnica podem determinar facilmente as formulações apropriadas para os péptidos ou péptidos modificados da presente invenção, através da utilização de abordagens convencionais, A identificação das gamas de pH preferidas e excipientes apropriados, por exemplo anti-oxidantes, é rotina na técnica (ver, por exemplo, Cleland efc al., 1993). Os sistemas tampão são utilizados rotineiramente para fornecer valores de pH de uma gama desejada e incluem tampões de ácido carboxíiico, por exemplo acetato, citrato, lactato e succinato. Está disponível uma variedade de anti-oxidantes para tais formulações, incluindo compostos fenólicos, tais como BHT ou vitamina E, agentes redutores, tais como metionina ou sulfito, e quelantes de metais, tais como a. EDTA. O solvente ou meio injectável pode conter veículos convencionais de dispersão para a solução ou dispersão qualquer dos sistemas de solventes ou >ara os péptidos activos, e pode conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) , misturas apropriadas destes e óleos vegetais. Pode ser mantida a fluidez correcta, por exemplo, pela utilização de um cçãc : de π licroorga ní: ela incli usão de Vc o s, por ex emp] Lo, ico, +' j_ rosal e se i n c Lu ir agent es pa 3 Γ 6 S ou. c loret o de ; revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. A prevenção da realizada quando necessária, antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenoí clorobutanol, fenol, ácido sc muitos casos, será preferíve osm.oIali.dade, por exemplo, açúcares ou. cloreto de sódio. De uma forma preferida, a formulação para injecção será isotónica com o sangue. A absorção prolonaada das composições injectáveis pode ser provoc :a.d.a pela ut rilização nas composições, de a. gentes gue ret .ardam a . ab it 0 X. Ç cl 0 f por exemplo, monoestearato de alumínio e gel atina. As f o rmas f a r m a. cêut i c a s apropriadas para uti1ização como injectáveis podem ser administradas por gualguer via apropriada, incluindo a injecção ou infusão intravenosa, intramuscular, intracerebral, intratecal e epidural.

As soluções injectáveis estéreis são preparadas pela incorporação de compostos activos na quantidade requerida no soivente apropriado, com vários cios outros ingredientes, tais como os enumerados anteriormente, como requerido, seguida pela esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas peia incorporação de v< os ingredientes activos esterilizados num veiculo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos, a partir desses enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, 03 métodos de preparação preferidos são a secagem sob vácuo ou secagem por congelação de uma solução previamente filtrada estéril do ingrediente activo mais quaisquer ingredientes adicionais desejados.

Quando os ingredientes activos estão adequadamente protegidos, estes podem ser administrados oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível a gele it ina dura r GU podem ser dieta . Par :a a ;tivo pode S0I ! a forma de scos, cáps u iâS t assimilável, ou podem ser encerrados numa cáps ou mole, ou podem ser prensados em comprimid incorporados directamente com os alimentos da diet administração terapêutica oral, o composto activo pode se incorporado com excipientes e utilizado i comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes. Tais composições e preparações contêm, de uma forma preferida, pelo menos 1% ®ιγι ρβ»ο do omposto activo. As percentagens das .cl composições e das preparações podem, evidentemente, ser variadas e podem, de modo conveniente, ser entre cerca de 5 e cerca de 80% do peso da unidade. A quantidade de composto activo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que será obtida um dosaaem apropriada.

Os comprimido», trociscos, arageias, cápsulas e semelhantes >odem também contei os componentes como listados a seguir: Um -igante, tal como a goma, goma arábica, amido de milho ou gelatina; excipientes ' w —“-'-'-o; um agente b de batata, emelhantes; um lubrificante, tal como Q estearato de magnésio; e um agente edulcorante, tal como um& sacarose, lactose ou sacarina clÇfCntG S T ΟΓΠ811 Z ci FTC Θ f tal :al como o fosfato dicálcicí de desmtegrante, tai como o amido de milho, amidr ácido alginico e podem ser adicionan ύnados, ou um como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria, ou aromatizante de cereja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, podem conter, além de materiais do tipo acima, um veículo liquido. Podem estar presentes vários outros materiais como revest iment-oq nn f . j ou Para mooificar de outro modo a forma física da unidade de dosagem. Por drageias orou ambos. Um xarope ou elixir rrH, * , . jr uu s-i_.\_ Po de conter o composto activo, sacarose como agente edulcorante , j —e, metxl- e propilparaoenos como conservantes, um corante e aromat-i l *·' d- z 3. n tj, Θ >r exemplo, os comprimidos, ápsuias podem ser revestidas com goma-laca, açúcar X cl 1 :omo aroma de ute qualquer material uti 1 i zado de dosagem unitária deve ser tanc iaimente não tó xico nas na preparação de qualquer forir farmaceuticamente puro e sul: quantidades empregues. Além disso, 0{s) composto(s) activo (s) pode(m) ser incorporado(s) em preparações e formulações de 1ibertação controlada. >resence .nvencao estenae- se igualmente para quaisquer outras formc.s apropriadas para administração, por exemplo, aplicação tópica, tal como cremes, loções e géis, ou composições apropriadas para inalação ou administração intranasal, por exemplo, soluções ou pós secos. As formas de dosagem parentériCas são preferidas, incluindo aquelas apropriadas para administração intravenosa, intratecal, intracerebral ou epidurai. Oí veicuios e/oi diluentes - a rma c eu. tic ame n t e aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardantes da absorção e semelhantes, A utilização de tais meios e agentes para substâncias activas farmacêuticas é bera conhecida na técnica.. Com excepção até ao ponto de qualquer meio ou agente convencionais ser incompatível cora o ingrediente activo, a utilização deste nas composições terapêuticas é contemplada. Os ingredientes activos suplementares podem também ser incorporados nas composições. sob a forma e i mif ormicl aqm i i L--I H 1—1 H j_) 3. p "n opr: i adas ser em trati sp ecificaçã o para é is novas f on Çã· o são dm tadas pc cr, e dix :ect r í sticas úr licas do material a cr E especialiuente vantajoso formular composições parentéricas sob a forma de dosagem unitária para facilidade de administração r de dosagem. A forma de dosagem unitária, como .a, refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para sujeitos mamíferos a serem tratados; cada unidade contém uraa quantidade pré-determinada de material activo, calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A espec dosagem unitárias da invenção dependente, (a) das caracterísl do efeito terapêutico particular a. ser conseguido, e (b) das limitações inerentes na técnica de composição de tal material activo para o tratamento de doença em sujeitos vivos com uma condição de doença em que saúde corporal está debilitada, como aqui divulgado em pormenor. 0 ingrediente activo principal é composto para uma administração conveniente e eficaz em quantidades eficazes, com um veículo farmaceuticamente aceitável apropriado em forma de dosagem unitária. Uma forma de dosagem unitária pode conter, por exemplo, o composto activo principal em quantidades que variam de 0,25 ug a cerca de 2000 mg. Expresso em proporções, o presente composto activo está geralmente cerca de 200 mg/mL de veículo. No ingredientes activos suplementares pela referência à dose habitua em cerca de 0,25 ug a :aso de composições que contêm as dosagens são determinadas e modo de administração dos ingredientes citados. incia aos desenhos observar que a é para anular a. A invenção será agora descrita com refei e exemplos anexos, no entanto, faz-se particularidade da descrição seguinte não generalidade da descrição anterior da invenção

Com referência as figuras: A Figura 1 é uma r e p r esenta ç a. o gráfi ca que mostra o efeito típico de χ-MrIA no curso de " tempo . da contracção do c a nal deferente prostát ico do rato b i s s e c tado à estimulai são de campo com um pulse > supramaximal único / \ ; 3 1-7-. ri V bd \ JO V r λ. líLb ; » \j χ-MrTA (30 nM 3 uM .} foi adiei 0 n £j_ cl 0 ao banho de 6 r g ã o s cumulativamente em passos unitários de metade de logaritmo. A Figura 2 é uma representação gráfica do eleito do χ-MrIA,

-Mr IA. nas respostas contrácte I. s de p o rções bissectadas do canal deferente epid Lidimal do rato a agonistas exógenos do adren oceptor cg . (a.) curvas d· o log concentração-resposta cl norad renalina na aus ência (0) e em presença de 1 μΜ (Δ) OU 3 μΜ (□) em χ-MrIA, -MrIA„ (b) curvas do log concentração- -resposta à metoxami .na. na a usência (O) £1 em presença. (□) de 3 μΜ χ-MrIA. Cada ponto de dados em (a ) e (b) representa a. média ±SEM de observações de 4-5 preparações de tecido individuais. Algumas barras de erro estão ocultadas pelos símbolos. umano. ?\ A ci CUI11U1 ci Ç ci o de como uma percentaaem de χ-Mrri Os pontos de da dos A Figura 3 é uma representação grátíca que mostra a inibição pelo χ-MrIA. na acumulação sensível à desipramina de [3H]-noradrenalina por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) transf ectadas com o clone ADNc para o transportador neuronal de noradrenalina [°H] -noradrenalina é express, captação celular na ausência c representam a média ±SEM ou observações de 4 experiências

A Figura 4 deriv ci C ã 0 da cone. A P CR e uma representação em diagrama aue mostra a OS ( ae veneno ; 00 caracors '_) 0 i n .i c iadores AP 1 + CHI- de Pép tidos 1: ide r, que e os ii 'ii ciado r '0 S da PCR A 3' UTR ut. i. li zando os o +j Cl) I 0. deriva ção de uma te e í 0 s θ cru 0 n c i a. 31 UTR. -1B ρ r o d u z o em seguida específicos .1. n ± c -i. 0 ci o -C Θ s sequência de s sequências de péptic de 5' RACE utilizando 5' UTR e a sequência u t i1izada para gerar para as χ-conotoxinas. :H1-1A + ANCHOR compl péptidos madura restan Fármacos

Os fármacos utilizados neste e nos exemplos seguintes, incluem: cloridrato de desipramina (Sigma); indometacina (Sigma); cloridrato de metoxamina (Sigma); bitartarato de ()-noradrenalina (Sigma); [ Ul]-1-noradrenalina (actividade específica 2200 Cí./mM; New England Nuclear, Boston,

Massachusetts, E.U.A.); tetrodotoxina (Sigma); cloridrato de ioimbina (Sigma).

Análise Esta titica

Os dados para os exemplos seguintes são expressos como a média e erro padrão de 4-6 experiências. 0 ajuste da curva sigmoidal para o cálculo de valores de EC5q, foi efectuada por regressão não linear, utilizando o conjunto de programas Igor Pro (WaveMetrics). As diferenças entre médias foram avaliadas pelo teste t de Student (amostras emparelhadas) utilizando o conjunto de programas Prism (GraphPad). Foram tomados valores de P < 0,05 para indicar diferenças estatisticamente significativas.

Preparação do deferente do rato

Mataram·· se ratos Wistar machos (250 350 g ) por deslocamento cal e i removeram- -se os canais deferentes Cada tecido foi .ido em porções epididimais e prostátíca ,s bissectadas. Os Ώ L G b de tecido j :oram montados em banhos oraânicos de 5 ml, segurnre 1 IP· 4 ? 1/ 1^/ sob u .ma tensão de 0,5 g. A solu ção do banho possuia a compo sição (mM): NaCl, 119; KC1, 4,7; MgS04, 1,17; KH2PO NaHCO 3, 25,0; glucose, 5,5; CaCl; Ο Γ-. ii Pi1 φ Já 2f 0,026; foi a 37 °C e borbulhada com 5% v/ v de CO2 em Oo 7\ ,ci pIT0 foram equilibradas dur a n t.. Θ f pelo menos, 45 m in. antes d< da experimentação. Registaram-se as contracções por intermédio de um transdutor de força isométrica e gravaram-se num computador Power Macintosh, utilizando o programa Chart versão 3.5.4/s e um sistema de aquisição de dados MacLab/8s (ADInstruments) a uma frequência de amostragem de 200 Hz, 2 8

Os segmentos r,,- . , . .

Piostaticos loissectados íoram utilizados para examinar o efeito tu „ M T, ^ Z”MriA na contracçao evocada electricamente do músculo liso, . . meaxado por neurotransmrssão simpatica. As preparações de teoi-u- . -Cio ioram escarranchadas com eiectrodos de estimulação de plai- -;^., A * . ο^ποί. λ estimuiaçao ae campo electrrco (SFS) foi efectuada em ίρι·Ω„,^Λ. -AeívaiOb ae o mm., utilizando um pulso único de 55 V de 1 rns de a _ , . , „ . ... ^ umaÇtí.o, produzrdo por ura astunulaaor Grass 54-.. Cj..u.v.cvõg3 podiam ser bloqueadas por tetrodotoxina (0,1 μΜ) , mdicando que eram mediadas neuralmente. Adicionaram- -se concentrações crescentes do péptido ao banho de órgãos i..umu.o ti voite.em incrementos unitários de metade de it,no. i.ada dose foi aplicada uma vez o efei to da dose ρ. Π t Θ r' 1 Ο T Γ! P V P ^ Vi γ'ν ^ +- - ' . . ^ ... ·· -v-i '/uià a est..im.uiaçao eiectnca ter atingido um nível estacionário. brer <..*..·· αο χ MrxA na neurc transmissão simpática ttu porçoes bissectadas cio canal deferente prostático cio rato responderam à. estimulação de campo com. uma contracçao pifasica. Nesta preparação, os dois componentes da contracçao oifasica íoram bem separados temporalmente. A primeira parte da respost a foi a dominar aproxim a da mera - p 2 0 0 ms segunda fase d cl contrac 5 0 0 m.s após ci estimula activid ade f P" γ'Τρ acológic investi. gação do; s seus

, e conseguiu um nível máximo de pós entrega do pulso eléctrico. A -ναθ atingiu um pico de aproximadamente são. As tentativas para identificar a i do χ-MrIA, iniciaram-se corri uma efeitos no canal deferente do rato estimulado por estimulação cie campo, o efeito cio χ-MrIA na resposta cia preparaçã .o em relação à. estimulação de campo é mostrado na Figura 1. A conotoxina (30 n.M - 3 μΜ) actuou para aumentar a segunda fase da cor itracçâo. Este efeito foi

Peia na concentração. aos traços obtidos específico pe]_o péptido de apenas o torna-se evidente. A curva y-MrlA que actua para segundo componente pode também ser considerado como sendo dependente da suburacçào ciei resposta. o.e controlo presença de %—MrIA, o aumento segundo componente da contracçâc concen t r a ç ã. o -resposta par a o espec1ficamente potenc1ar o co jtruídc A cicção do x Mrj.A na resposta evocada eiectricamente foi altciineiine espe^ífi^a, aumentando apenas o segundo componente da resposta pxlásxca. asta rase tardia da contracção é reconhecido como sendo mediada pela noradrenalina, e é inibida se.iect.j-vamente peia. prazosina e outros antagonistas do ctdxeuoceptor cg. ά primeira fase da contracção, que é devida à. activaçao de purinoceptores P2x pós-juncionais por ATP libertado, Πα0 toi aumentada de modo semelhante. A amplitude do componente noradrenérgico da contracção é modulada pela quantidade de noradrenalina libertada pelo aquecimento do nervo simpático, a densidade dos adrenoceptores cg pós-juncionais e o seu acoplamento a sistemas efectores, e a velocidade à qual a noradrenalina é removida da sinapse. 0 antagonismo nos adrenoceptores a2 pré-sinápticos é bem reconhecida pc sr aumentar a libertação evocada electric amen te de 110 r a d r e n a. 1 í n a a partir de nervos siir páticos, pelo bloquea mento activaçao de um s.i L s tema de retorno negati .. vo pe la n°r«drenaiina libertada. No entar 11 o, o antagond .sino cios à ^r eη o cep t o r e s «2 não pode £ jer o mecan ismo de a.c :ção do X -Mrl A, Ao invés do χ-MrIA, os antagonistas dos adrenoceptores cg, tais como a ioimbina e o idazoxano, actuam para aumentar igualmente os coin.ponent.es purinérgicos e noradrenergicos da contracção do ca deferente do rato. Além. disso, a resposta a. um único 30 pulso, em! i oposição a uma série de estir nulos, não está s regulação por este mecanismo de retorn o negative ), dado haveria a m agonista presente nestes sit ros recept ores no da estimulação. Em consequência, a ioimbina (1 μΜ) efeito nas respostas evocadas neste ensaio. u i e i t a. à que não momento não tem

ãOS

Preparação para examinar o gonistas dos adrenoceptores efeito OCj d ο χ -Mr IA n a s resOosta; 0 canal deferente anteriormente, excepto não foram estimulados em vez disso, utiliu concent.ração--resposta à presença de χ-MrIA. Nes : do rato foi utilizado como descrito que os segmentos epidimais bissectados electricamente. Estas preparações foram, zadas para estabelecer as curvas de noradrenalina e metoxamina na ausência e te tecido, a noradrenalina e a metoxamina ;am c o icçac mu; 30 pó; intermédio da activaç de adrenoceptores «i pós-junctionais. 0 χ-Mr IA a uma. concentração de ou 1 μΜ ou 3 μΜ, foi aplicado ao banho de órgãos e deixado equilibrar com o tecido durante 20 min., antes das adições cumulativas de noradrenalina ou metoxamina. Foi determinada uma única curva de concentração-resposta por preparação, com segmentos de tecido contralaterais aos quais o χ-MrIA não foi aplicado, servindo como controlos.

Eteito do χ-MrIÃ nas resposta; aac η π Ί a r a a

OOS adrenoceptores cg

Foi possível determinar se cçâo do χ-MrIA ocorre a 31 montante ou a jusante cia libertação de neurotransmissor, através do exame do efeito do péptido na resposta à noradrenalina aplicada «xogenamente. Dado que o χ-MriA aumentou a potência da noradrenalina aplicada no banho, pode-se concluir aue a conotoxina actua pela potenciação da resposta à noradrenalina, em vez de por promoção da sua libertação a partir dos armazéns neuronais. Esta potenciação pode ocorrer como uma cosseaoência da resposta aumentada do adrenoceptor «i ou terminação debilitada da acção o'a noradrenalma. 0 agomsta do aclre^oc^oto'" di para averiguar c [uai destes foi ° !—1 fr\ iste agonista do adrenoceptor di metoxamina foi utilizad·: mecanismo de acção do χ-difere da noradrenalina no facto de não ser um substrato para 0 transportador neuronal de noradrenalina. Este transoortador funciona para elrm-i_nar ^ Liorad-i-enal-i-na. e nutras categ^ 1 mínas da sinapse através ua capLaçci.0 no iuterj..or dos terminais nervoso®^ cia representa o principal mecanismo para terminar a acção de noradrenalina nos adrenoceptores ae tecidos enervado* simpaticamente. Dado que a metoxamina nao está suieita à remoção por este mecanismo, a inibição do transportador não aumenta a potência das suas acçoes. nas respostas dO& ^ ePididimal do rato de ct3. -a „ íog «ca curvas αο j ilJsência e presença de c°ncentração de 1 μΜ, 0 a sensibiUdade do tecido cie concent-,,,, Ci 'y. Cv dvado foi maior na a

Foi investigado o efeito do χ-Mrl^ segmentos bissectados do canal deíerent dois agonistas dos aarenoceptores oonoentraçao—resposta a noraci.:.encil.:-ncÍ na cuiQr /-MrlA são mostradas na Figura 2a. A uma χ-MrIA actuou Para aumentar noradrenalina, desviando a cuiva ae concentração-resposta para a esquerda. 0 grau Ge potenciação experiências com d μΜ de χ-h^iA. Nem α concentração da conotoxina alterou a resposta máxima do tecido à nora(irenalina_ 0 χ_ΜΓιΑ a uma concentração de 3 uM não teve qualquer efeito na curva 32 concentração -resposta à metoxamina (Figura z.o ) . A observação de que ο χ-Μ.τ;ΙΑ não potenci a a acção da metoxamir ia, em contraste ao seu efeito na. resposta a noradrenalina, e consistente com o facto do χ-] drIA ser um inibidor do transpoj ctador neuronal de η o r a d r ena.] 1 n s A falta de efeito do χ-MrIA na curva concentração-resposta à metoxamina, demonstra igualmente que o χ-MrIA não tem qualquer efeito nos adrenoceptores cg, o que seria evidente como um desvio paraiero da curva para a direita. Isto distingue o χ-MrIA de alguns outros inibidores do transporte de noradrenalina, partrcularmente os utilizados como antidepressivos. 0 alvo terapêutico de t r a n s p o r t a d n ·. muitos dos fármacos antidepressivos é o neuronal de noradrenalina. No entanto, muitos destes compostos, especialmente os antidepressivos tricíclicos em menor grau, alguns fármacos mais novos que estão estruL-uralmente não relacionados com tricíclicos convencionais, SdO reconnecidos como actuando s d r e η o c e p t o r e 1 <- i O S Si! t; como oí «i e os receptores muscarínicos da ACh. de cobai •aram-se cobaios mac) nos (285-4 ° ur.ro, por deslocamen to cer- 'm Se segmentos do ile o de a > n τ~ Ί , e nmparam-se os conneú ut~i lixando uma seri nqa (7* 0 j ~ x-es foram colocadas em "Cl g LO uçâo de banho com cl seguint -5 g) em jejum de um dia meai e exsanguinaram-se. proximadamente 1,5 om de íos lummais por lavagem com solução de banho. As 2,68; CaCl2, 1,84; MgCl2, 1,03; glucose, 5,55; NaHCCg, 11,9; e ΚΗ2Ρ04, 0,45; aquecida para 37 °C e borbulhada com 5% v/v de CCç em 02 · Incluiu-se indometacina (10 μΜ) na solução do banho para produzir uma linha de referência estável. Os tecidos foram colocados sob uma. tensão de 1,0 g e deixados e qu. i 1 i. b r a r d u r a n t e 4 0 m. i n. ante s d o c o me ç o d. a e x p e r d. m e n taça o , Foram então aplicadas doses de nicotina (4 μΜ) em intervalos de 15 min.f até se observarem respostas consistentes. O χ-MrIA (3 μΜ) foi em seguida adicionado, 25 min., após o qual se aplicou outra dose de nicotina. As respostas à nicotina foram medidas ísometrícamente e diqitalizados a uma velocidade de amostragem de 10 Hz. hj j~ ei t O do 'V- A -MrIÃ Ώ 3 S respo: s tas à ni o x- Mrl A (3 não teve qua( Q1 -j p 'j-' espo st d. S de se :gment OS ( ,10 i d. .80 T3 ‘ onot o x i. n ci f ci respost a mé ‘dia í : o i. 3,83 r ' ± 0, 8 0 g. qi jando ο X" -MrlA 0 81. í ava p N a a u s e n c z a d a. emparelhado; n= 4). As α-conotoxinas bloqueiam os receptores nicotinicos da ACh tanto de subtipo neuronal como muscular. Demonstrou·· se que o χ-MrIA nâo vectoriza os receptores nicotinicos da ACh neuronaís, utilizando segmentos isolados de íleo de cobaia. Devido à dependência da resposta contráctil na activação do receptor muscarinico, deveria ser esperado que a. resposta do íleo de cobaia à nicotina fosse atenuada na presença de χ-MrIA, se a conotoxina também actuasse como um antagonista dos receptores musca.rinicos da ACh. Nesta preparação, a libertação de ACh induzida pela nicotina e vários outros irol emissores que actívam os receptores pós-juncionais, não foi afectada pelo χ-MrIA. Assim, e em contraste com muitos outros 3 4 inibidores de transporte, o χ-MrIA tem falta de actividade anti-muscarínica.

Preparação de nervo frenico-hemidiatragma de ratinho

Mataram-se ratinhos Quackenbush machos (20-30 g) por deslocação cervical. Os hemidiafragmas esquerdo e direito foram removidos com os nervos fréni co ligados. A base de cada hemidiafragma f 0 i P O S 1 C -í 0113 d 3. entre dois eléctrodos ; de estimulação de p 1 a t ina paralelos e 0 nervo irenj .. c 0 foi c 01 ocado através de duas pequenas ansas de platina para estimulação de campo. A preparação foi incubada a 37 °C num banho de órgãos de 5 iriL e borbulhada com 5% v/v CO2 em O2. A composição da solução do banho foi (mM) : NaCl, 13b, 0; KC1, 5,0; CaCl2, 2,0;

Os tecidos foram

glucose, 11,0; NaHC03, 15,0; e KH2PO colocados sob 1,0 g de tensão de repouso. Após deixados durante pelo menos 30 min. para equilíbrio, efectuaram-se estimulações directas e indirectas alternadas em intervalos de 10 s, utilizando um pulso de 30 V de 2 ins de duração ao músculo, e um pulso de 3 V de 0,2 ms de duração ao nervo, respectivamente. Foi examinado o efeito de uma dose única de χ-MrIA a uma concentração de 3 μΜ nas contracções reveladas directa e indirectamente. As respostas foram digitalizadas e gravadas, como descrito para as preparações do canal deferente. iito do χ-MrIA nas respostas à estimulação eléctrica do nervo frénico-hemidiafragma de ratinho

As contracçõ es reveladas pela es· frén ico, ou por estimulação direct 3 l: Θ C ta da s por 3 uM de χ-MrIA (n = 4) O χ-MrIA não nao xoram bloqueia os receptores nicotínicos da ACh do músculo na preparação do nervo frénico-hemidiafragma de ratinho. A falta de actividade do χ-MrIA no músculo esquelético ou no nervo motor distingue-o da maioria dos péptídos de conotoxina caracterizados até à data, que são toxinas paralisantes e possuem então um papel claro na captura de presas. 5 capLãçao ceiuiar oe [~tíj

Cultivaram-se células de ovário de hamster Chinês (CHO) em placas de 24 poços (Falcon), em 10% v./v de soro fetal de bovino. Ao atingir 60-70% de confluência, as células foram transiectadas de modo transitório (Lipofectamine, Gibco) com um vector de expressão (pcDNA3, Invitrogen) incorporando o ADNc de rimento total para o transp ortador neuronal de noradrenalina no (Pacholczyk et al. , (19 9 1) N a tu re, 350, 350- 4). Utilizou- um clone de ADNc do transp; A X L O vA O .1. neuronal de noradrena. 1 i na. lum. Institute, Fort rland, Oregon . f X.i JA) . Os Θ & L X*! Ca O s de captação celular foram, efectuados 36 horas após transfecção. As cérulas CHO foram lavadas inicialmente com tampão de transporte i) : NaCr, 157; ΚΓ i ? 7 ; Nai -Í9rU4 f 11,8; MgC12, 1,0 e ( de pH 7 Δ • f * As célulc LS f O ram em seguida incubad· de trans ;porte contendo 5 0 nJM de [ J.H] -noradrenali: (suplementado com. noradrenalina não marcada, como necessário) e 100 uM de ácido ascórbico. O χ-MrIA (0,1 nM - 1 μΜ) ou desipramina (10 μΜ) foram igualmente incluídos, como apropriado. Após 20 minutos à temperatura ambiente, as células foram lavadas rapidamente com solução tampão salina de fosfato glacial e, em seguida, lisadas em 0,1% v/v de Triton-X. Os lisados celulares foram tomados para contagem por cintilação de líquidos, para determinar o seu nível de radioactividade. compiementarmente, utilizou-se uma alíquota do lisado celular para medir a concentração de proteína (ensaio de proteínas BioRad uC) . A captação específica de [3H]-noradrenalina peio transportador de noradrenalina foi definida como o componente sensível à desipramina. (10 uM).

Efeito do χ-MrIA na acumulação celular de [3H]-noradrenalina CHO expressando o foi reduzida para ia quantidade de controlo pela desipramina A acumulação de noradrenalina nas células neuronal de noradrenalina humano transportador neu menos do que f o .1 de v i d a qu ase (10 pM), demonstrando que a acumulação

à captação específica por intermédio do nado. O transportador de noradrenalina foi conotoxina em estudos de captação celular. O χ-MrIA (0,1 nM - 1 μΜ) inibiu a acumulação de iomarcada de um modo dependente da concentração " A inteiramente transportador c confirmado como o alvo da c noradrenalina radioma (Figura 3), com um valor de log CI50 de -8,17 + 0,0275 (n= 4) concentração de χ-MrIA necessária para inibir a acumulação por 50% foi descoberta como sendo de aproximadamente 7 nM. Esta concentração é aproximadamente de uma ordem de grandeza inferior à necessária para a. desipramina produzir o mesmo efeito. A cocaína e o χ-MrIA são ambos compostos de ocorrência natural, no entanto, são bastante diferentes. A cocaína é um alcaloide extraído ,qas folhas da planta da coca, enquanto o χ-MrIA é um péptido directamente codificado por um gene animal. Além do seu eiei.ro no transportador de captação, a cocaína é conhecida por possuir propriedades anestésicas locais potentes. Isto é devido ao bloqueio de ambos os canais de sódio e de 37 potássio o Nâo foi encontrada evidência de actividade anestésica local do ! bA, O i—! •R em. qualquer dos ensaios. Descobriu- se que O χ-ΜΠΑ nã O L θ V Θ nem efeitos contrá cteis nem relaxantes no tórn as do can al def erer: tte por si mesmo. Estudos semelhantes revelar. arn que a χ-conotoxina não inibe o transportador da dopamina.

Mediu-se a ligação do mazindol tritiado ao transportador da noradrenalina em células que expressam a proteína transportadora (ver o Exemplo 5). Mediu-se a influência do χ-MrIA de 10"° a 10-y na ligação do mazindol tritiado. O χ-MrIA não teve qualquer efeito na ligação do mazindol tritiado, indicando que actua não competitivamente, num sitio distinto dos inibidores do transporte da noradrenalina tradicionais, tal como a desipramina, mazindol e cocaína.

Derivação da sequência de genes para os péptidos de χ-conotoxina

Isolou-se a sequência de genes completa para o χ-MrIA utilizando um 5' RACE ("Random Amplification of cDNA Ends"), combinado e estratégia 3' RACE acoplada com clonagem e seque η c i a ç ã o de ADN.

RACE 3 8 CHI-1B foi concebi h.. maduro. α A relação Qos segue, e m c o n j u n t o r. v-ora 0 iniciador de oligonucleótid partir da sequência de péptido oligonucleótidos ao péptido é como £ sequência de oligonucleótido: χ-Mrl - NGVCCGYKLCHPC SEG ID N°. 3 CHI-1B 5’ - CANGGRTGRCANARYTTRTA - 3’ SEQ ID N° 4 AP1 5' - CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC -3! SEG ID N° 5 (onde N = A/C/G/T, R - A/G, Y - C/T, ) utilizando

Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) , foi efect--3 oligonucleótido CH1-1B em combinação cor* 4acLc oligonucleótido AP1 nos moldes de ADNc derivados do ARNm íso1 de canais de veneno de caracol cone. Os produtos da PCR. representam a sue regra o õ' do gene MrlA, foram isolaf^^_ purificados, clonados em vectores bacterianos e sequenciadoj sequência de genes para o MrlA foi obtida de C. mar mo (Fig. 4) . -‘-e;

3' RACE A sequência de ADN para as regiões conceber oligonucleótidos que d o gene f o i u t i j -j ada rarn capazes de detect^v· a. sequência de MrlA, e sequências de outros péptidos estreitamento relacionados. O posicionamento dos oligonucleótidos em relação à sequência do gene, é ι CHjl rA 1.οi utrlizaao n ANC HOR, p a r a produz ir péptido líder, péptido maduro e trado na Figura r> 4 # 0 PCR em conjunto com o fragmen tos de A DN cor (3'UTR) e regiões 3' não traduz do gene. A PCR de moldes de ADNc do canal ae veneno uU- C. marmoreus, produziu fragmentos de ADK correspondendo ao péptido MrlA.

As Sequências de ADN para os oligonucleótidos, são: CHI-1A 5’ - ACAGGCAGAATGCGCTGTCTCCC -3’ SEG !D N°. 6 ANCHOR 5' - AACTGGAAGAATTGGCGGCCGCAGGAAT -3’ SEQ ID N°. 7

Sequência completa para o χ-MrIA A sequência do gene para o χ-MrIA produzido utilizando 5' RACE e 3' RACE representam os fragmentos sobrepostos do gene. Estes fragmentos foram combinados, para. produzir uma sequência de consenso para o gene. A sequência de consenso é o ADNc total para o gene, e inclui 5' tJTR, o péptido líder, o péptido maduro e o 3" UTR. A sequência de oligonucleótido do χ-MrIA líder e do péptido maduro é mostrada em SEQ ID N° 8, enquanto a sequência de aminoácido do péptido líder e do péptido maduro é mostrada em SEQ ID N° 9, atgcgctgtctcccagtcttgatcattcttctgctgctgactgcatctgcacctgg cgttgttgtcctaccgaagaccgaagatgatgtgcgcatgtcatctgtctactgt aatggaaagagtatcctacgaggaatjctgaggaacggtgtgtgctgtggctata

AGTTGTGCC ATCC AT GTT AA SEQ ID N°. 8

MRCLPVLnLLLLTASAPGVVVLPKTEDDVPMSSVYCNGKSILRGILRNGVCCGYKLC

HPC SEQ ID N°. 9

Através da t o t a1idade de s t a especificação e cias reivindicações que se seguem, saivo exigência em contrário do contexto, a palavra "compreendem" e variações, tais como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um determinado inteiro ou passo ou grupo de inteiros ou passos, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou passo ou grupo de inteiros ou passos.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <11Q> Lewis, Richard J. Alewood. Pau! F.

Sharpe, lain A. <120> NOVOS PÉPTÍOOS <13G> Davies GoHIson cave <14Q> 09/787,986 <141 > 1999-10-01 <16Q> 9 <170> Patentin Ver, 2,1

<21G> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Conus marmoreus <22Z> PÉPTIDO <222> (12) <223> Xaa na posição 12 é 4Hyp. <400> 1

Asn Gly Vai Cyõ Cys 1 5

Gly Tyr Lys Leu Cys Hia Xaa Cya 10

<210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Conus marmoreus <220> <221 > PÉPTIDO <222> (12) <223> Xaa na posição 12 é 4Hyp <400>2

Vai Gly Vai cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 io

<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Conus marmoreus <400>3

Asn Gly Vai Cya Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro cys 15 io

<210> 4 <211> 20 <212>ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda de Oligonucleótido <400>4 canggrtgrc anaryttrta 20

<210> 5 <211> 27 <212>ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda de Oligonucleótido <400>5 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 6 42 <2ΪΤ>"23

<212>ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda de Oiigonucleótido <400>6 acaggcagaa Igcgctgtot ccc 23 <210>7 <211 >23

<212>ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificiai: Sonda de Oiigonucleótido <400> 7 aactggaaga aítcgcggcc gcaggaaí 28 <210>8 <211> 186

<212> ADN <213> Gonus marmoreus <400>8 atgcgc.tgtc teceagtctt gatcaxtett ctgetgcfcga ctgeacefcge acctggcgcc so gttgtccrtac c-gaagaccga agstgatgt.g cecafcgtcafc ctgfcctactg taatggaaag 120 agtatcctac gaggaattct gagg&acggfc gtgtgetgtg gctabaagfcfc gtgcieatecâ 180 tgtt.aa

<210>9 <211 >61 <212> PRT <213> Gonus marmoreus <400>9

Mefc Arg Cys !»eu Sro Val LCU Xle lie Leu Leii Leu Leu TLr Ala Ser 5 10 15 Ala Pre Gly Val val Val Leu Pro Lys Thr Glu Asp Asp V&iL Pro Met. 20 25 30 Ser Ser Vai Tyr Cys As λ Oly Lys ser Xle Lsu Arg Gly Ile Leu Arg 35 4Õ 45 Asn Gly Vai Cys cys siy Tyr Lys Leu Cys Hiss ífr o Cys so 55 eo Li sbo a. f 2 :7 de 0 'Ut.ll bro de 200 6 4 3

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES Péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante oa um seu derivado, com a capacidade de inibir um transportador neuronal de aminas, Péptido de χ-conotoxina de acordo com reivindicação 1, com a capacidade de inibir um transportador neuronal de noradrenalina. Péptido de χ-conotoxina isolado, sintético O "· "· recombinante, com a capa cidade de ii íibir um transport; a dor neuronal de aminas, com uma sequênci a seleccíonada a pa rtir de: NGVCCGYKLCHOC SEQ ID N° 1 e VGVCCGYKLCHOC SEQ ID N° 2 ou mais deleções, adições, de cadeias laterais de ou uma sequência que sofreu uma substituições ou modificações aminoácidos. Péptido de χ-conotoxina de acordo com reivindicação 3, que é χ-MrIA ou χ-MrIB. Péptido de χ-conotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, que é um inibidor selectivo de um transportador neuronal de noradrenalina. Péptido de χ-conotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, com um efeito anticolinérgico desprezável ou nulo. Péptido cie χ-conotoxina de acordo com a reivindicação 2, com uma activida.de desprezável ou nula corno bloqueador dos carnais de sódio. Péptido de χ-conotoxina de acordo com a reivindicação 2, com uma actividade desprezável ou nula como inibidor de um transportador de ciopamina. Péptido de χ-conotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, com quatro resíduos cisterna e duas liqaçoes dissulfureto. Péptido c :le χ-conotox. ina de acordo que a c apacídade de ligação das A-D/B-C, em que A., B, C e D segundo, terceiro e quarto resídu formação de ligações dissulfureto, om a reivindicação 9, em ias ligações dissulfureto é D se referem ao primeiro, .vamenue. Uti1i z et g c io d.e um Pépti do de χ· qualqu O V~ uma das reivir idicações 1JL g cl Ç 3 0 a um ree :eptor, para te molécu la como in ibidor de um aminas r de uma forma preferi neuron de noradí enalin 3 .2. Molécula de ácido nuclerco isolada, compreendendo uma sequência de nuc leótidos q- uma sequêr i C1 l qu< e codifica Oe acordo com quí 111 cl Sonda de CÍ v.. .1 . do nucleico codifica ou é complementar de 1 a 1! nucleótidos que codifica ou é complementar de uma sequência 2 13 qn e codiiica para a totalidade ou parte de um y - c ο η o t o x i n a, de acordo com qual .quer uma. das re: péptido de /indicações
2. 4. Anticorpo monoclonal ou policlonal de um péptido de χ-conotoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
3. 5. Construção genét: ica compreendendo uma porção de vector e um ácido nucleico capaz de codificar para um péptid. O de χ-conotoxina, de acordo com qualquer uma das re: ivindic ações Péptido quimérico compreendendo um segmento ou sequência de um péptido de χ-conotox. ina de ocorrência natural, como definido em a 1 quer uma. da s reivindicações 1 a 10, e um segmento o U. sequência de outro péptido ou proteinai biologicamer ite a c t i v o s, tal que o péptí do quimérico resultante possui uma actividade associada ao péptido ou proteina citados. Péptido de χ-conotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, para utilização no tratamento ou profilaxia de doenças ou distúrbios urinários ou cardiovasculares, ou perturbações do humor, ou no tratamento ou controlo da dor ou inflamação. • Utilização de um péptido de χ-conotoxina de acordo com qualquer um a das reivindicações 2 a 10, na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de doenças ou G j_ S t U X Ο -X O S em relação às quais a inibição de um transportador neuronal de noradrenalina está associado ao tratamento ou profilaxia eficaz.
4. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o referido medicamento é para o tratamento ou profilaxia de doenças ou distúrbios urinários ou cardiovasculares, ou perturbações do humor, ou para o tratamento ou controlo da dor ou inflamação.
5. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a doença ou distúrbio do sistema urinário é a incontinência u r i n á r i a o u f e c a 1.
6. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a doença ou distúrbio cardiovascular é uma arritmia ou insuficiência cardíaca coronária.
7. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que as perturbações do humor são a depressão, ansiedade ou necessidades compulsivas.
8. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a dor é a dor crónica, dor neuropática ou dor inflamatória.
9. 24. Composição que compreende um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante, com a capacidade de inibir um transportador neuronal de noradrenalina, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
10. 25. Composição de acordo com a reivindicação 24, que é uma composição farmacêut ica. :6. Utilização de um péptido de χ-conotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, na preparação de um medicamento para o tamento ou profilaxia de doenças ou _ ç a o de um associado ao distúrbios em relação às quais a init transportador neuronal de noradrenalina está tratamento ou profilaxia eficaz. Lisboa, 27 de Outubro de 2006