ES2233938T3 - Chaperonina 10. - Google Patents
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Abstract
UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE CPN 10 EN SUERO U OTROS FLUIDOS BIOLOGICOS QUE COMPRENDE LOS PASOS DE (I) ELEVAR EL ANTICUERPO A CPN 10; (II) REACCIONAR DICHO ANTICUERPO CON UNA MUESTRA DE FLUIDO BIOLOGICO SOSPECHOSO DE CONTENER CPN 10; Y (III) DETECTAR LA PRESENCIA DE CPN 10 EN DICHA MUESTRA POR UNA AMPLIFICACION DE SEÑAL RESULTANTE DE LA PRODUCCION DE COMPLEJO DE ANTICUERPO DE CPN 10. SE PREVE TAMBIEN UN PROCEDIMIENTO PARA LA PROMOCION DE CRECIMIENTO CELULAR O INMUNOSUPRESION QUE COMPRENDE EL PASO DE ADMINISTRACION DE CPN 10 A UN PACIENTE MAMIFERO. SE PREVE TAMBIEN CPN 10 RECOMBINANTE QUE TIENE LA SECUENCIA ** FORMULA **
Description
Chaperonina 10.
Esta invención se refiere a la chaperonina 10,
conocida de otro modo como cpn 10.
Las chaperoninas pertenecen a la clase más amplia
de las chaperonas moleculares, moléculas implicadas en el
plegamiento, fijación como diana y ensamblaje postraduccionales de
otras proteínas, pero que no forman parte ellas mismas de la
estructura ensamblada final, tal como tratan Ellis et al.,
1991, Annu. Rev. Biochem. 60, 321-347. La mayoría de
las chaperonas moleculares son proteínas de "choque térmico" o
de "estrés" (hsp, "heat shock proteins"); es decir, su
producción está inducida o aumenta por una variedad de ataques
celulares (tales como alteraciones metabólicas, radicales de
oxígeno, inflamación, infección y transformación), siendo el calor
sólo una de las tensiones (estrés) mejor estudiadas tal como
revisaron Lindquist et al., 1988, Annu. Rev. Genet. 22
631-677. Además de estos cambios cuantitativos en
niveles de proteínas específicas, el estrés puede inducir el
movimiento de proteínas de estrés producidas de manera constitutiva
hasta diferentes compartimentos celulares, tal como se hace
referencia en la referencia de Lindquist mencionada anteriormente.
La respuesta al choque térmico es uno de los sistemas genéticos más
conservados conocidos y las diversas familias de proteínas de choque
térmico están entre las proteínas más estables evolutivamente que
existen. Además de permitir a las células que se enfrenten a
condiciones adversas, los elementos de estas familias realizan
funciones esenciales en células normales.
Existen dos tipos de moléculas de cpn, cpn60
(monomérica M_{r} \sim 60.000) y cpn10 (monomérica M_{r}
\sim 10.000). Cpn60 se ha estudiado exhaustivamente. Se ha
identificado en todas las bacterias, mitocondrias y plastidios
examinados, y se ha identificado una forma citoplásmica,
TCP-1, en las células eucariotas; se ha informado de
su presencia sobre la superficie de algunas células, aunque esto se
ha cuestionado en la referencia de Ellis referida anteriormente y
también en van Eden, 1991, Immunol. Reviews 121
5-28. Hasta muy recientemente, cpn10 sólo se había
identificado en bacterias, pero se han hallado ahora equivalentes
estructurales y funcionales en los cloroplastos (Bertsch et
al., 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
89 8696-8700) y en mitocondrias de hígado de
rata (Hartman et al., 1992 Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 89 3394-3398) y
bovino (Lubben et al., 1990, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 87 7683-7687).
Cpn60 y cpn 10 interaccionan funcionalmente, en
presencia de ATP, para mediar el ensamblaje de proteínas. No se ha
informado todavía de ejemplos de cpn10 que actúen independientemente
de cpn60 pero cpn60, que aparentemente actúa sola, se ha
involucrado en acontecimientos bastante dispares. Por ejemplo, es
una diana inmunodominante de las respuestas de anticuerpos y células
T durante las infecciones bacterianas pero, debido a que la proteína
está tan sumamente conservada, se genera autorreactividad. Los
individuos sanos pueden utilizar este autorreconocimiento para
eliminar células autólogas transformadas e infectadas, pero los
defectos en el control de tal reconocimiento pueden conducir a una
enfermedad autoinmune, tal como trata van Eden, 1991, Immunol.
Reviews, 121 5-28. De manera no sorprendente,
cpn60 se ha asociado con estados tales como la artritis reumatoide.
Por tanto, existe una conciencia creciente de que las chaperonas
moleculares, con su capacidad para unirse a y alterar la
conformación de una amplia variedad de polipéptidos, pueden
desempeñar papeles clave en las funciones celulares distintas a la
biogénesis de proteínas. Puede hacerse referencia también a Hartman
et al., 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 90 2276-2280, que describe la
estabilización de moléculas proteicas utilizando cpn10 y cpn60.
También puede establecerse que para la cpn10 de
los mamíferos, existe una homología de secuencia muy estrecha. Por
tanto y por ejemplo, la molécula cpn10 de rata (Hartman et
al., 1992 Proceedings of the National Academy of Sciences USA
80 3394-3398) tiene una homología superior
al 99% con la estructura de la cpn10 bovina notificada en el
Directorio de la Base de Datos EMBL (Laboratorio Europeo de Biología
Molecular) en MT BTC PN10, que fue presentada por J. E. Walter, MRC
Lab. de Biología Molecular, Hills Road, Cambridge, RU. Esto se ha
contrastado con la cpn10 bacteriana que tiene un grado medio de
homología con la chaperonina 10 de rata de sólo el 34% (Hartman
et al., 1992).
El EPF se describió en primer lugar como una
sustancia relacionada con el embarazo. (Morton et al., 1976,
Proc. R. Soc. B. 193 413-419) y su
descubrimiento creó un considerable interés ya que permitía la
detección de un posible embarazo dentro de 6-24
horas desde la fertilización. Inicialmente, al EPF se le asignó un
papel como inmunosupresor en virtud de su capacidad para liberar
factores supresores desde los linfocitos (Rolfe et al., 1988,
Clin. exp. Immunol. 73 219-225). Estos
factores supresores reducen la reacción de hipersensibilidad de tipo
retardado en ratones y, por tanto, podría suprimir una posible
respuesta inmune maternal frente al feto antigénicamente diferente.
Estudios más recientes han demostrado que la producción de EPF no se
limita al embarazo. Es un producto de la proliferación celular
primaria y neoplásica y, en estas condiciones actúa como un factor
de crecimiento (Quinn et al., 1990, Clin. exp. Immunol.
80 100-108; Cancer Immunol. Immunother.,
1992, 34 265-271). EPF es también un producto
de la activación plaquetaria y, por tanto, se propone que puede
desempeñar un papel en la cicatrización de heridas y en la
reparación cutánea (Cavanagh et al., 1991, Journal
Reproduction and Fertility 93, 355-365).
Hasta la fecha, la prueba de inhibición de
rosetas sigue siendo el único medio de detectar EPF en mezclas
biológicas complejas (Morton et al., 1976, Procedimiento R
Soc B 413-419). Este ensayo depende del hallazgo
original de Bach y Antoine, 1968, Nature (Lond) 217
658-659 de que el suero antilinfocítico (ALS) puede
inhibir la formación espontánea de rosetas in vitro entre los
linfocitos y los glóbulos rojos heterólogos. Se introdujo una
modificación del ensayo para detectar EPF tras demostrarse que los
linfocitos, preincubados en EPF, daban un título de inhibición de
rosetas (RIT) significativamente superior con un ALS que el que
daban los linfocitos del mismo donante sin EPF, tal como se describe
en la referencia de 1976 anterior. Esta prueba se ha descrito en
detalle en la referencia de 1976 anterior así como en Morton et
al., 1987, en "In Current Topics in Developmental Biology"
Vol 23 73-92, Academic Press, San Diego, pero
brevemente supone una cascada de acontecimientos con la unión de EPF
a los linfocitos y que induce secuencialmente la liberación de
factores supresores (Rolfe et al., 1988, Clin. exp. Immunol.
73 219-225): (Rolfe et al., 1989,
Immunol. Cell Biol. 67 205-208).
En Athanasas-Platsis et
al., 1989, Journal Reproduction and Fertility 87
495-502 y Athanasas-Platsis et
al., 1991, Journal Reproduction and Fertility 92
443-451, se describe la producción de anticuerpos
monoclonales y policlonales contra EPF y la inmunización pasiva de
ratones hembra preñadas con estos anticuerpos, lo que produce la
pérdida de la viabilidad embrionaria. Estos estudios establecieron
que EPF es necesario para el establecimiento satisfactorio de la
gestación.
En Quinn et al., 1990, Clin. exp. Immunol.
80 100-108, se propone que EPF es un producto
regulado de crecimiento de células transformadas y tumorales
cultivadas. Estas células también dependen de EPF para el
crecimiento continuado, es decir, EPF actúa en un modo
autocrino.
Se ha establecido que EPF desempeña un papel en
promover el crecimiento tumoral puesto que el crecimiento de las
células tumorales puede retrasarse significativamente mediante los
Acm anti-EPF. Además, esta referencia sugiere que
los hibridomas que producen anticuerpos anti-EPF de
elevada afinidad pueden ser intrínsecamente inesta-
bles.
bles.
En Quinn et al., 1992, Cancer Immunol.
Immunother. 34 265-271, también se describe
el efecto de los anticuerpos monoclonales (Acm) contra EPF sobre el
crecimiento in vivo de tumores murinos transplantables. La
idea central de esta referencia es que la neutralización de EPF
retrasa el crecimiento tumoral in vivo.
Es evidente a partir de la referencia de Quinn
et al. de 1992 que cuando el cáncer está en una fase muy
temprana de crecimiento, la neutralización de EPF mediante el Acm
anti-EPF evitará su desarrollo. Sin embargo, una vez
que el cáncer se ha establecido, el tratamiento con estos Acm
retrasará pero no destruirá totalmente el tumor.
Otras referencias con respecto al papel de EPF en
el crecimiento tumoral incluyen Quinn et al., 1991, Immunol.
Cell Biol. 69 1-6 y Quinn, K. A. en una tesis
doctoral titulada "Early pregnancy factor: a novel factor envolved
in cell proliferation" ("Factor temprano de embarazo: un factor
novedoso implicado en la proliferación celular") de la
Universidad de Queensland en Australia, de 1991.
EPF se revisa en detalle en Morton et al.,
1992, Early Pregnancy Factor, Seminars in Reproductive Endocrinology
10 72-82. Se describen el sitio y la
regulación de la producción de EPF, seguido por la purificación de
EPF de las plaquetas y la relación del producto purificado con EPF
derivado de otras fuentes. Esta revisión también trata ciertos
aspectos del bioensayo para detectar EPF (es decir, la prueba de
inhibición de rosetas) que incluye la monitorización de los
procedimientos de purificación y la investigación de fuentes de
producción. Se trata la actividad biológica de EPF y se describen
las posibles aplicaciones clínicas de EPF y sus antagonistas.
Morton et al., 1992, Reprod. Fertil Dev.
4 411-422 revisa las publicaciones previas
que describen las propiedades inmunosupresoras y como factor de
crecimiento de EPF. El papel de EPF en mantener el preembrión
también se describe en esta referencia.
Ambas referencias mencionadas anteriormente, que
son esencialmente artículos de revisión, describen la preparación de
EPF purificado para plaquetas sanguíneas que incluía las etapas
secuenciales iniciales de extracción con calor de las plaquetas,
cromatografía de intercambio catiónico en
SP-Sephadex C-25, cromatografía de
afinidad en Heparina-Sefarosa CL-6B
y Concanavalina A-Sefarosa 4B. La purificación final
de EPF se consiguió mediante cromatografía de interacción hidrófoba
de alta resolución, seguido por tres etapas de
RP-HPLC (RP, "reversed phase") en fase inversa.
Tras la etapa de RP-HPLC, se aisló EPF como un único
pico que absorbe en el UV coincidente con actividad biológica, bien
separado de varios contaminantes minoritarios. El material biológico
y la radiactividad de una muestra yodada de este material eluyó con
idéntico tiempo de retención cuando se fraccionó en las mismas
condiciones. Cuando se analizó mediante SDS-PAGE y
se visualizó mediante autorradiografía, el material yodado corrió
como una única banda de M_{r} aproximada de 10.000 de nuevo
coincidente con actividad biológica. El rendimiento aproximado de
EPF mediante este método fue de 5 \mug por 100 unidades de
plaquetas.
Esto demuestra que era necesario utilizar este
complejo procedimiento de purificación para obtener sólo una pequeña
cantidad de EPF nativo y, por tanto, este método no podía utilizarse
a escala comercial. A este respecto, las únicas fuentes prácticas
conocidas para obtener EPF nativo en este momento eran las plaquetas
y el hígado en regenera-
ción.
ción.
De manera sorprendente, según la presente
invención, se encontró que cuando el EPF fraccionado final se
sometía a secuenciación tal como se describe con más detalle más
adelante en el presente documento, la estructura del EPF nativo
correspondía a la de la chaperonina 10, lo que no podría haberse
pronosticado a partir de la técnica anterior mencionada
previamente.
Este descubrimiento inesperado, tal como será
evidente a partir de la descripción más adelante en el presente
documento, se ha llevado ahora a la práctica porque se ha encontrado
que la chaperonina 10 recombinante tiene toda la actividad biológica
asociada previamente con EPF y, por tanto, EPF puede producirse
ahora comercialmente, lo que no era el caso anteriormente,
utilizando técnicas adecuadas para producir cpn10 recombinante.
También será evidente que EPF puede producirse ahora de manera
sintética.
En un aspecto, la invención se refiere al
descubrimiento de que cpn10 es EPF y tiene las propiedades
desconocidas e insospechadas hasta ahora demostradas por EPF. Las
propiedades desconocidas e insospechadas de cpn10 incluyen
actividades extracelulares tales como la capacidad para actuar como
un factor de crecimiento y un factor inmunosupresor. En otro
aspecto, la invención proporciona uno o más métodos de uso de cpn10
para aprovechar las propiedades desconocidas e insospechadas de
cpn10. El uno o más métodos incluyen un método de uso de cpn10 para
estimular el crecimiento y un método de uso de cpn10 para suprimir
la actividad inmunológi-
ca.
ca.
El término "cpn10" tal como se utiliza en el
presente documento, en tanto que se refiere a métodos de
estimulación del crecimiento celular e inmunosupresión, incluye
dentro de su alcance, cpn10 recombinante además de cpn10 que se
produce de manera sintética. El término "cpn10" también incluye
cpn10 eucariota además de cpn10 procariota incluyendo groES o
derivados de cpn10 recombinante. La cpn10 recombinante puede
producirse mediante la tecnología del ADN recombinante, tal como se
describe más adelante en el presente documento. El término también
incluye fragmentos biológicos.
La presente invención también incluye dentro de
su alcance una cpn10 recombinante modificada además de derivados y
fragmentos peptídicos derivados de la misma.
La detección de cpn10 en suero u otros fluidos
biológicos utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales contra
cpn10 o contra modificaciones o fragmentos de la misma solos o en
combinación entre sí o con cpn60 (en presencia de ATP u otros
nucleótidos trifosfato) para el fin de:
- (a)
- diagnóstico de embarazo en cualquier especie de mamífero;
- (b)
- monitorizar el bienestar embrionario en embarazos de "alto riesgo";
- (c)
- diagnóstico de tumores; y
- (d)
- monitorizar pacientes tras la extirpación quirúrgica de tumores.
El uso de cpn10 como un factor de crecimiento o
un inmunosupresor en el tratamiento de:
- (a)
- injertos de piel u órganos;
- (b)
- cicatrización de heridas, reparación tisular o regeneración de tejido;
- (c)
- enfermedad autoinmune;
- (d)
- infertilidad/aborto espontáneo;
- (e)
- enfermedad alérgica; y
- (f)
- estados inflamatorios.
Se lavaron concentrados de plaquetas (del banco
de sangre), hasta 7 días caducados clínicamente, con tampón Tyrodes,
siguiendo las técnicas descritas en Methods in Enzymology, 1989,
169 7-11, se congelaron rápidamente con
N_{2} y se almacenaron a -70ºC.
Inmediatamente antes de la purificación, se
descongelaron aproximadamente 100 unidades de plaquetas lavadas en
un baño de agua hirviendo, luego se mantuvieron a
75-85ºC durante 15 minutos con agitación suave,
continua. Tras enfriamiento con hielo, se eliminaron los residuos
celulares mediante centrifugación (8000 g, 20 minutos, 4ºC) y el
sedimento se extrajo dos veces mediante homogeneización en ácido
acético 0,05 M/NaCl 0,1 M/azida de sodio 0,1 mg/ml, pH 3,0, seguido
por centrifugación (8000 g, 15 minutos, 4ºC). Se reunieron los tres
sobrenadantes dando un volumen total del extracto de
500-600 ml.
Este extracto procedente de 100 unidades de
plaquetas se ajustó hasta pH 3,0 con HCl conc. y se agitó
suavemente, durante la noche a 4ºC, con 250 ml de
SP-Sephadex C-25
(Pharmacia-LKB) previamente hinchado y equilibrado
con ácido acético 0,05 M/NaCl 0,1 M, pH 3,0. El gel se empaquetó
entonces en una columna lavada con 20 vol. del mismo tampón y se
eluyó con 5 vol. de tampón fosfato de sodio 0,5 M/NaCl 0,05 M, pH
7,5. Luego se desechó el gel.
El eluato procedente de
SP-Sephadex se ajustó hasta pH de
6,3-6,4 con HCl conc. y se aplicó a una columna de
Heparina-Sefarosa CL-6B (2,5 x 7,5
cm; Pharmacia-LKB) equilibrada previamente con
tampón fosfato de sodio 0,05 M/NaCl 0,05 M, pH 6,3. La columna se
lavó entonces con 5 vol. del mismo tampón y se eluyó con 5 vol. de
Tris-HCl 0,05 M/CaCl_{2} 5 mM/NaCl 0,2 M, pH 7,5,
aplicado en el sentido inverso al utilizado para la aplicación de la
muestra.
Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido
al eluato procedente de Heparina-Sefarosa hasta una
concentración final de 2 M y, tras su paso a través de un filtro de
0,45 \mum, la muestra se bombeó a través de un tubo dedicado a
disolvente sobre una columna TSK Phenyl 5PW (7,5 x 75 mm,
Pharmacia-LKB) equilibrada previamente con
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0/CaCl_{2} 5
mM/(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con 10
vol. del mismo tampón y se eluyó con un gradiente lineal en 50
minutos, desde este tampón hasta Tris-HCl 0,1 M, pH
7,0/CaCl_{2} 5 mM/acetonitrilo al 10%. (Figura 1a).
Se reunieron las fracciones activas procedentes
de la HIC-HPLC, luego se fraccionaron en una
columna C_{1} (Ultrapore RPSC, Beckman Instruments) utilizando un
sistema de disolvente que consistía en A, Tris/HCl 0,04 M, pH
7,0/CaCl_{2} 5 mM y B, Tris/HCl 0,04 M, pH 7,0/CaCl_{2} 5
mM/acetonitrilo al 80% (v/v). La columna de equilibró con el
disolvente A antes de la aplicación de la muestra, después de lo
cual se lavó con 5 vol. de disolvente A y se eluyó con un gradiente
lineal en 30 minutos desde este disolvente hasta disolvente B al 75%
(Figura 1b).
Se reunieron las fracciones activas procedentes
de la RP-HPLC 1 de las diversas preparaciones de 100
unidades de plaquetas, se añadió EDTA y DTT hasta una concentración
final de 20 mM y 1 mM, respectivamente, y se dejó reposar la mezcla
durante 0,5-1 h, 4ºC. Tras la dilución con 2 vol. de
disolvente A, se aplicó a una columna C_{3}, dedicada a esto y las
etapas posteriores, y se fraccionó tal como se describió para
RP-HPLC 1 pero omitiendo el CaCl_{2}. (Figura
1c).
Se reunieron las fracciones activas procedentes
de la RP-HPLC 2, se añadió ácido trifluoroacético
hasta una concentración final del 0,1% y, tras la dilución con 2
vol. de TFA al 0,1%, se aplicó la mezcla a una columna C_{3}, que
se había equilibrado previamente con TFA al 0,1%. La columna se
eluyó después con gradiente lineal en 30 minutos desde este
disolvente hasta acetonitrilo al 60% (v/v)/TFA al 0,1%, seguido por
un gradiente lineal en 3 minutos hasta acetonitrilo al 90% (v/v)/TFA
al 0,1%. Se reunieron las fracciones activas. (Figura 1d).
Una unidad representa las plaquetas de una única
donación de sangre que es de aproximadamente 500 ml. Las
"fracciones activas" fueron fracciones activas en la prueba de
inhibición de rosetas.
EPF se ha purificado procedente de diversas
fuentes tal como se trata en Cavanagh y Morton, 1994, Eur. J.
Biochem. 222 551-560; Quinn et al.,
1994, Hepatology 20 Nº 5 1294-1302.
En todos los casos, la actividad biológica siguió
el mismo patrón en todo el complejo esquema de purificación descrito
anteriormente para las plaquetas humanas. Además, la fracción activa
final de todas las fuentes se unió específicamente por un anticuerpo
monoclonal inmovilizado anti-EPF y pudo recuperarse
casi cuantitativamente (véase la figura 1e).
Estos estudios son importantes por diversos
motivos:
- A.
- La similitud bioquímica e inmunológica observada con todos estos materiales proporciona la evidencia contundente de que el bioensayo está detectando una única sustancia o una familia estrechamente relacionada de sustancias que actúan en diversas situaciones biológicas.
- B.
- Los agentes activos purificados procedentes de todos estos materiales son de varios a muchos órdenes de magnitud más potentes que casi todas las sustancias notificadas anteriormente que eran EPF. Esto confirma la suposición, basándose en el análisis detallado del bioensayo de EPF tal como se trató anteriormente, de que la actividad asociada con la mayoría de preparaciones de supuesto EPF debe reflejar la presencia de un contaminante muy minoritario.
- C.
- Los únicos materiales fuente que proporcionan suficiente EPF para estudiarlo a nivel proteico (a diferencia de la actividad) fueron las plaquetas y el hígado en regeneración, dando una media de 15 \mug por 100 unidades (equivalente a \sim 50 litros de sangre) y 5 \mug por 40 g de tejido (remanente hepático de 6 ratas), respectivamente. Es inmediatamente evidente que está presente mucho más EPF dentro de las células que el que aparece en el espacio extracelular; no obstante, el conocimiento acumulado de la biología del EPF (revisado recientemente en la referencia mencionada anteriormente de Morton et al. de 1992) indica que esta aparición extracelular no es fortuita.
El EPF derivado de plaquetas humano, que es el
más abundante, se ha estudiado con cierto detalle. En
SDS-PAGE, corrió como una única banda de M_{r}
aproximada de 8.500, coincidente con actividad biológica (véase la
figura 2a); el EPF procedente de hígado de rata en regeneración
mostró un comportamiento idéntico. La espectrometría de masas del
material plaquetario proporcionó una determinación exacta y precisa
de la masa molecular de 10.843,5 \pm 2 Da, junto con la evidencia
definitiva del alto grado de homogeneidad de la preparación (véase
la figura 2b). Siguiendo a los intentos de degradación de Edman, que
indicaron que la molécula estaba bloqueada en N, se realizó una
escisión proteolítica de aproximadamente 4 nmoles de EPF. Los
fragmentos peptídicos resultantes se separaron mediante HPLC en fase
inversa y se sometieron a secuenciación mediante degradación de
Edman. Se hallaron tres zonas de secuencia que contenían 12
(fragmento 1), 27 (fragmento 2) y 33 (fragmento 3) residuos que se
correspondían con los residuos 7 a 18, 27-53 y
69-101 (el extremo C-terminal) en
cpn10 mitocondrial de rata. En el fragmento 2, el residuo 52 era
diferente (S en cpn10, G en cpn10 de rata; este cambio solo podría
explicar que la cpn10 humana sea 30 Da más larga que la cpn10 de
rata). Todos los demás residuos eran idénticos, lo que concuerda con
la naturaleza sumamente conservada de las chaperoninas (véase la
figura 2c).
Desde que se confirmó la identidad de secuencia
entre EPF y cpn10, se han realizado varios estudios sobre la
relación funcional, utilizando cpn10 mitocondrial de rata, cpn10 de
E. coli (conocida como groES) y cpn60 de E.
coli (groEL). En primer lugar, se ha demostrado que cpn10
puede actuar como EPF. Se probó cpn10 de rata en el bioensayo de EPF
y se encontró que era positiva en el intervalo de diluciones
esperado: esta actividad podía neutralizarse mediante anticuerpos
monoclonales contra EPF (véase la tabla 1). De manera interesante,
cpn10 de E. coli, que es homóloga en \sim 40% con la cpn10
de rata, no mostró actividad en el bioensayo (véase la tabla 1);
esto concuerda con la observación de que un medio acondicionado con
E. coli no es activo en el bioensayo de EPF, mientras que un
medio acondicionado con todas las líneas celulares de mamíferos
probadas, así como con células de levaduras, si es activo. Cpn60 era
inactiva en el bioensayo y no tenía efecto sobre la actividad de
EPF. Entonces, se demostró que EPF puede actuar como cpn10. EPF se
mezcló con cpn60, en presencia o ausencia de ATP, y la mezcla se
fraccionó en una columna de permeación en gel TSK G3000SW; se
analizaron las fracciones resultantes mediante
SDS-PAGE. Cpn60 es un decatetrámero y eluye en el
volumen excluido de esta columna (límite de exclusión de 300.000).
En presencia de ATP, pero no en su ausencia, EPF también aparece en
esta fracción, lo que demuestra la formación de un complejo estable
con cpn60. Esta fracción era activa en el bioensayo de EPF pero la
fracción equivalente del experimento sin ATP (en el que EPF no se
asociaba con cnp60) no lo fue (véase la figura 3a). Por tanto, la
actividad de EPF y cpn10 reside en la misma molécula.
Estas investigaciones proporcionan pruebas
inequívocas de que EPF derivado de plaquetas es un homólogo
estructural y funcional de cpn10; se examinó entonces la relación
entre cpn10 y la actividad en la prueba de inhibición de rosetas
(figura 3b). En presencia, pero no en ausencia de ATP, la cpn60
inmovilizada podía eliminar toda la actividad del material de la
fuente arquetípica y podía recuperarse la actividad eliminando el
ATP del complejo inmovilizado. Como con el experimento descrito en
la figura 3a, el requerimiento de ATP demuestra la especificidad de
la interacción entre cpn60 y el resto activo; por tanto, cpn10 es la
entidad molecular que inicia la respuesta en el bioensayo de
EPF.
La identificación de EPF como una cpn10 ha sido
un importante paso adelante en la investigación en este tema y ayuda
a explicar muchos de los hallazgos que se han realizado hasta la
fecha. Se han suscitado críticas frente a las reivindicaciones de
que la producción de EPF se produce en una variedad tan amplia de
situaciones biológicas, por ejemplo, embarazo antes y después de la
implantación, proliferación celular primaria y tumoral y activación
plaquetaria. En su papel como una hsp (proteína de choque térmico)
tras la llegada de la presente invención, éstas son todas
condiciones en las que podría esperarse la rápida aparición de la
producción de EPF. Las funciones de la hsp que son vitales para la
supervivencia de las células son intracelulares, tal como se muestra
en la referencia anterior de Linquist et al. Por el
contrario, la actividad de EPF descrita hasta ahora es extracelular;
por ejemplo, aparece en el suero de ratones en un plazo de 4 a 6
horas tras el apareamiento en Morton et al., 1987, Current
Topics in Development Biology, Vol. 23 73-92
y de 4 a 8 horas tras la hepatectomía parcial en ratas, tal como se
muestra en la tesis doctoral de Quinn (1991). Se ha demostrado que
EPF puede actuar en un modo autocrino, tal como se trata en la
referencia de Quinn et al. de 1990 a la que se hizo
referencia anteriormente o en modo exocrino, tal como se trata en el
documento de Rolfe et al. de 1988 a la que se hizo referencia
anteriormente; estos no son papeles descritos anteriormente para una
hsp.
También se apreciará que, puesto que la
estructura de EPF se conoce ahora, puede producirse en cantidades
comerciales mediante cualquier técnica adecuada de tecnología del
ADN recombinante.
La producción para uso comercial puede obtenerse
insertando un gen de cpn10 de mamífero, preferentemente un gen de
cpn10 de cADN humano, en un vector adecuado, tal como plásmidos del
sistema pGEX, y el sistema pET que expresa el cpn10 de mamífero
codificado y purificando la cpn10 recombinante.
| ANGIS | Servicio Nacional Australiano de Información Genómica |
| pb | par de bases |
| BSA | albúmina sérica bovina |
| ADNc | ADN complementario |
| Cpn10 | Chaperonina 10 |
| ADN | ácido desoxirribonucleico |
| E. coli | Escherichia coli |
| GSH | glutatión (forma reducida) |
| GST | glutatión-S-transferasa |
| LB | Caldo de Luria-Bertani |
| M | Molar |
| ORF | marco de lectura abierto |
| PCR | reacción en cadena de la polimerasa |
| EPFr | Factor Temprano de Embarazo recombinante |
| RSP | cebador inverso de secuenciación |
| SDS | dodecilsulfato de sodio |
| SDS-PAGE | electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio |
| Tris | Tris(hidroximetil)aminometano |
| USP | cebador universal de secuenciación |
Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) para amplificar inicialmente parte del ORF (274 pb) del ADNc
de cpn10 humana procedente de una librería de ADNc del fago lambda
de una línea celular de melanoma A2058 (Stratagene). Se diseñó un
amplímero de cpn10 degenerado (P1) a partir la secuencia de
aminoácidos VLDDKDYFL correspondiente a los residuos de aminoácidos
83-91 de la cpn10 humana. El cebador P1 tiene la
secuencia 5' ARRAARTARTCYTTRTCRTC 3', en la que R es A e Y es C o T.
El cebador inverso de secuenciación (RSP) se utilizó para la
amplificación por PCR (el cebador no específico) así como para la
secuenciación de los constructos de ADN y tiene la secuencia 5'
CAGGAAACAGTATGAC 3'. El cebador universal de secuenciación tiene la
secuencia 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'. La amplificación por PCR de la
librería del fago se consiguió utilizando un amplímero aguas arriba
no específico (RSP) y P1, cada uno a una concentración final de 0,05
\muM, MgCl_{2} 1,5 mM (Pharmacia Biotech), 1X tampón polimerasa
(Boehringer Mannheim) y 5 unidades de ADN polimerasa de Thermus
aquaticus (Boehringer Mannheim) en un volumen final de 50
\mul. Para 30 ciclos, los parámetros fueron: desnaturalización a
94ºC durante 1 minuto, hibridación a 40ºC durante 30 segundos y
extensión a 72ºC durante 3 minutos. Una extensión final a 72ºC
durante 7 minutos estuvo seguido por un ciclo de inmersión a 4ºC
durante 10 minutos. Se volvió a amplificar una alícuota de 1 \mul
en las mismas condiciones para aumentar el número de copias.
Se diseñaron dos amplímeros específicos de cpn10
que englobaban el marco de lectura abierto. El cebador aguas arriba
P2,
5'-GCGCGGATCCATGGCAGGACAAGCGTTTAG-3',
se diseñó a partir de la secuencia del fragmento para PCR inicial.
El cebador aguas abajo P3,
5'-ATATGAATTCAGTCTACGTACTTTCC-3' se
diseñó a partir de la secuencia obtenida de la base de datos de
"Expressed Sequence Tag" (marcador de secuencia expresada) a
través de ANGIS (Nº de registro HUM00TB037). Se amplificó un
fragmento de 319 pb de la librería del fago utilizando las mismas
condiciones de reacción y ciclos que anteriormente, excepto que la
temperatura de hibridación fue de 50ºC.
Todos los digestos de la enzima de restricción de
los productos y vectores de PCR se realizaron según Sambrook et
al. (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, NY) utilizando enzimas de restricción y sus tampones,
obtenidos de Boehringer Mannheim. El fragmento inicial para PCR se
digirió con Eco R1 y se ligó (Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY) en los sitios Eco R1 y
Sma I del vector pBluescript KS(+) (Stratagene) creando el
plásmido pRM1 (figura 4; inserto de cpn10 parcial de 274 pb). El
producto de 319 pb se digirió con BamHI y EcoR1 y se
clonó inicialmente en el plásmido de expresión
pGEX-2T (Pharmacia Biotech) creando el plásmido pRM2
(figura 5). Para confirmar su identidad, el fragmento
BamHI-EcoR1 se subclonó en pBluescript (SK +) (pRM3;
figura 6) y se secuenció. El ADN se analizó en geles de agarosa al
0,8-1,0% (p/v) que contenían bromuro de etidio y
tras la electroforesis se observó bajo iluminación UV.
Se transformaron células competentes de E.
coli DH5\alpha (100 \mul) con los plásmidos mediante el
método del pulso térmico (Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, NY). La mezcla de células y ADN
(10-100 ng) se puso en hielo durante 30 minutos y se
sometió a pulsos térmicos durante exactamente 2 minutos a 42ºC y se
puso de nuevo en hielo durante 2 minutos. Se dejó que las células se
recuperasen a 37ºC con agitación durante 1 hora tras la adición de
0,9 ml de LB. Se cultivó en placa una alícuota de 100 \mul en
placas de agar LB complementado con ampicilina a una concentración
final de 100 \mug/ml. Tras la incubación durante la noche a 37ºC,
se seleccionaron colonias aleatorias para su investigación
adicio-
nal.
nal.
Se clonaron los fragmentos de restricción de los
productos de PCR en pBluescript y se secuenciaron en ambas
orientaciones mediante el método didesoxi, de terminación de cadena
utilizando el kit de polimerasa de T7 según las instrucciones del
fabricante (Pharmacia Biotech). Se desnaturalizaron aproximadamente
2 \mug de ADN de plásmido, se precipitaron con etanol y se
hibridaron a USP, RSP o P3. Las reacciones de secuenciación se
sometieron a electroforesis en un gel de acrilamida al 8%/urea al
46%. Tras la fijación y el secado, una película de rayos X se expuso
al gel durante la noche y se reveló.
Se seleccionaron clones transformados con pRM2
para la expresión de la proteína de fusión
glutatión-S-transferasa a escala de
cultivo pequeña (2 ml) según los métodos descritos por Smith et
al. (Smith et al., 1988, Gene 67(1)
31-40). Se diluyó un cultivo durante la noche, se
indujo a expresar la proteína de fusión mediante la adición de IPTG
hasta 0,1 mM y se hizo crecer a 37ºC durante varias horas. Las
células se sedimentaron, lisaron en PBS/Triton X-100
al 0,1% y el lisado se mezcló con un 50% de perlas de
glutatión-agarosa (Sigma Chemical Company). La
proteína de fusión recombinante se eluyó de las perlas de afinidad
llevándolas a ebullición en tampón de carga con SDS. Se corrió una
alícuota de la muestra en un gel de SDS-PAGE al 10%.
El gel se fijó y luego se tiñó con azul de Coomassie. Tras confirmar
la expresión de la proteína de fusión, se llevó a cabo la
purificación de cpn10r a partir del resto GST a mayor escala.
Se hicieron crecer las células y se indujeron
como anteriormente, se resuspendió el sedimento celular en PBS, se
sonicó (nivel de salida 4, ciclo de trabajo del 50%, 2 x 30
segundos) y el lisado celular se almacenó a -30ºC. Se descongeló el
lisado de 10 litros de cultivo celular y se aisló la cpn10r mediante
técnicas similares a las utilizadas por Gearing et al.
(Gearing et al., 1989, Biotechnology 7
1157-1161) para el aislamiento de LIFr. En resumen,
se añadió Triton X-100 hasta una concentración final
del 0,1% y se eliminaron los restos celulares por centrifugación (15
minutos, 1500 rpm, 4ºC). Se añadieron diez ml de gel de
glutatión-Sefarosa 4 B
(Pharmacia-LKB Biotechnology) al sobrenadante y la
suspensión se mezcló durante 2 horas, a 4ºC. Se sedimentó el gel, se
lavó x 5 con 50 ml de PBS/Triton X-100 al 0,1%, una
vez con 50 ml de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0/NaCl 0,15 M
y una vez con Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0/NaCl 0,15
M/CaCl_{2} 2,5 mM. El gel se resuspendió en 4 ml de tampón
Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0 / NaCl 0,15 M/CaCl_{2} 2,5
mM, se añadieron 1000 unidades de trombina (Sigma T6884) y la
suspensión se mezcló en un baño de agua con agitación durante 1
hora, a 37ºC. Se sedimentó el gel, se conservó el sobrenadante y
luego se lavó el gel con 3 x 4 ml de Tris-HCl 0,05
M, pH 8,0/NaCl 0,15 M. Se reunieron estos lavados y el primer
sobrenadante, que contienen la cpn10r, dando 4-5 mg
de proteína recombinante. Se recuperó cpn10r adicional, que estaba
unida no específicamente al gel, tal como sigue. Se añadieron 4 ml
de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0 / NaCl 2 M y la
suspensión se mezcló durante 2 horas, a 4ºC.
Tras las sedimentación, el gel se lavó con 3 x 2
ml de este tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0/NaCl 2 M,
se reunieron los lavados con el primer sobrenadante, dando
aproximadamente 1 mg adicional de cpn10r. Se calcularon las
concentraciones de proteína mediante el método de Lowry et
al. (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193
265-275); se analizaron las proteínas mediante
SDS-PAGE utilizando geles de
Tris-Tricina al 15% (Schagger et al., 1987,
Anal. Biochem. 166 368-379).
La cpn10 recombinante tiene dos aminoácidos
adicionales en el extremo N-terminal. El extremo
N-terminal de la proteína recombinante es
Gly-Ser-Metionina-Ala
mientras que el extremo N-terminal de la proteína
nativa es Ac-Ala. La secuencia de aminoácidos de
cpn10 recombinante es tal como sigue:
GSMAGQAFRKFLPLFDRVLVERSAAETVTKGGIMLPEKSQGKVLQATVEAVGSGSKGKGGEIQPVSVKE
GDKVLLPEYGGTKVVLDDKDYFLFRDGDILGKYVD.
GDKVLLPEYGGTKVVLDDKDYFLFRDGDILGKYVD.
Se expresó una proteína de fusión bacteriana,
GST/cpn10, y se aisló con glutatión-Sefarosa, tal
como se describió para la preparación de cpn10. La proteína de
fusión se eluyó del gel mediante la aplicación de glutatión reducido
50 mM en solución salina tamponada con Tris. Las fracciones eluidas
se analizaron mediante SDS-PAGE y se reunieron las
que contenían la mayor parte de la proteína de fusión. Se determinó
la concentración de proteína mediante el método de Lowry et
al., 1951, J. Biol. Chem. 193
265-175.
Se produjeron anticuerpos contra la proteína de
fusión en conejos utilizando un programa de inmunización que
consistía en 4 inyecciones semanales seguido por al menos 4
refuerzos mensuales. Se utilizaron para cada inyección
aproximadamente 10 \mug de proteína, emulsionada en adyuvante
completo de Freund para la primera inyección y adyuvante incompleto
de Freund posteriormente. Se detectaron en el suero de conejo los
anticuerpos anti-cpn10 mediante ELISA, utilizando
placas recubiertas inicialmente con cpn10 (5 \mug/ml) y un sistema
de detección de estreptavidina-biotina (Amersham).
En la figura 7, se muestran los títulos de anticuerpos (Ac) contra
cpn10 y contra la proteína de fusión completa (en este caso, se unió
a la placa GST/cpn10, 5 \mug/ml) en el suero del conejo nº 42. En
la figura 8, se ilustra la titulación de una muestra de suero contra
cpn10, tomada de este conejo tras la 4ª dosis de refuerzo.
Después, se utilizó este anticuerpo en un ensayo
de unión competitiva para la detección de cpn10, realizado tal como
sigue. Se incubó anti-suero, diluido a 1:32.000 y
1:64.000 (dilución final: diluyente de tampón fosfato de sodio 50
mM, pH 7,4, que contenía un 0,2% en p/v de gelatina), por separado
(durante la noche, a 4ºC) con diversas concentraciones de cpn10.
Estas mezclas se probaron entonces mediante ELISA tal como se
describió anteriormente, en placas recubiertas con cpn10 5
\mug/ml, tal como se ilustra en la figura 9. Se compararon los
valores de absorbancia de cada mezcla de anticuerpo/cpn10 con los
valores obtenidos para la misma dilución de anticuerpo incubado sin
cpn10. El grado de inhibición de la unión del anticuerpo a la placa
es proporcional a la cantidad de cpn10 en la mezcla original de
anticuerpo/cpn10; a partir de esto, puede construirse una curva
patrón, tal como se muestra en la figura 10.
Aunque el nº 42 no es lo suficientemente sensible
para detectar la concentración muy baja de cpn10, presente en el
suero, se han establecido técnicas que pueden:
(1) producir un anticuerpo
anti-cpn10 que muestra propiedades normales de
hiperinmunización; así, puede producirse un anticuerpo con mayor
avidez con técnicas conocidas para la mejora de la respuesta inmune;
y
(2) producir una respuesta en una técnica de
inmunoensayo habitual.
Con anticuerpos mejorados, puede desarrollarse la
aplicación de métodos conocidos para la mejora del sistema de
detección y el pretratamiento del suero para concentrar y purificar
parcialmente cpn10 (por ejemplo, mediante su aplicación a un
cartucho Sep-pak C_{18} [Waters] y la elución con
acetonitrilo al 80% en solución salina tamponada con Tris, o a cpn60
inmovilizada en presencia de ATP y elución con EDTA), esta técnica
sola o en combinación con otras técnicas de inmunoensayo, para la
detección de cpn10 en suero.
La prueba de inhibición de rosetas es no
cuantitativa y no puede utilizarse para determinar la concentración
de cpn10 en suero con exactitud. El ensayo puede utilizarse
semicuantitativamente comparando la dosis limitante de las muestras,
es decir, la mayor dilución de muestra que da una respuesta de
posición en el bioensayo. Debe tenerse mucho cuidado con este
enfoque puesto que otras sustancias en los fluidos biológicos
complejos, ellas mismas inactivas en el bioensayo, pueden influir en
la respuesta de los materiales activos.
Se ha determinado que el bioensayo puede detectar
hasta tan sólo 5-50 mg/ml de cpn10 pura (Cavanagh
et al., 1994, Eur. J. Biochem. 202
551-560). Basándose en la dosis limitante observada
de suero de mujeres embarazadas (habiéndose eliminado las sustancias
inhibitorias conocidas del suero de embarazo temprano) y animales e
individuos que portan un tumor, además de ratas 24 horas después de
hepatectomía parcial, es probable que la concentración de cpn10 del
suero esté en el intervalo de 0,1-100 pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se intercambiaron injertos de piel entre ratas
Lewis y DA consanguíneas (\sim 100 g) utilizando el siguiente
protocolo. Se suturó piel abdominal de espesor completo en un
defecto de tamaño similar creado en la región torácica lateral
utilizando técnicas habituales. Se injertaron un grupo de seis ratas
en una sesión, recibiendo cada rata un autoinjerto y un aloinjerto.
Dos ratas Lewis y 2 DA recibieron diariamente 2 inyecciones de cpn10
recombinante y una rata Lewis y una DA recibieron tampón, inyectado
alrededor del sitio de los injertos. Los diferentes grupos
recibieron diferentes dosis de cpn10. Se continuaron las inyecciones
durante 14 días. Los injertos se cubrieron con gasa con vaselina,
apósitos Melolin, envoltura de plástico y venda elástica
Co-flex. Después de 7 días, se examinaron los
injertos diariamente para determinar signos de necrosis. Se tomó el
día de rechazo como el día en que el 50% de la piel transplantada
había experimentado degradación necrótica.
Se inyectaron diversas dosis de cpn10
recombinante (véase la figura 11) por vía i.p. (intraperitoneal) a
ratones BALB/c (\sim 20 g) y se les hizo una sangría en diversos
momentos tras la administración, comenzando a los 15 minutos (tiempo
cero). Se probó el suero para determinar la actividad de cpn10 en la
prueba de inhibición de rosetas (véase Morton et al., 1987,
Current Topics in Developmental Biology 23
73-92) con células de bazo de ratones C57BL/6. Se
probaron ratones que recibieron cpn10 plaquetaria en paralelo. Se
determinó la vida media de la actividad de cpn10 en suero.
Los resultados se muestran en la tabla 2 y la
figura 11.
Hubo una prolongación significativa del tiempo de
supervivencia del injerto tras la inyección de cpn10 recombinante (p
< 0,001, prueba de la t de Student). Los resultados mostraron una
curva dosis-respuesta con forma de campana, estando
las dosis más eficaces en el intervalo de 2 a 20 \mug de cpn10 x
2/rata/día. Los experimentos enratones sugieren que esta cpn10
recombinante tiene una vida media más corta de la esperada en suero,
cuando se compara con cpn10 plaquetaria; la vida media de 1 \mug y
15 \mug de cpn10 recombinante en el suero de los ratones fue de
sólo 3 horas y 7 horas, respectivamente, comparado con cpn10
plaquetaria (5 \mug), que tenía una vida media de 4 días. Sin
embargo, estos resultados han demostrado que cpn10 puede prolongar
significativamente la viabilidad de los injertos de piel alogénicos
en ratas (véase la tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Es probable que los factores de crecimiento estén
implicados en el proceso de cicatrización, ya que su liberación
inicial desde las plaquetas es de fundamental importancia en la
reparación de heridas (Falange, 1993, J. Dermatol. Surg. Oncol.
19 716-720). Las plaquetas han demostrado ser
una fuente rica de cpn10 (cpn10; Canavagh et al., 1994, Eur.
J. Biochem. 222 551-560) y, por tanto, puede
ser uno de los factores de crecimiento implicados íntimamente en la
cicatrización de heridas. Se han llevado a cabo estudios para
determinar el efecto de cpn10 recombinante (cpn10r) aplicada
tópicamente sobre la cicatrización de defectos cutáneos de espesor
completo creados en rato-
nes.
nes.
Se anestesiaron ratones Quackenbush macho,
cruzados (de 8 semanas) con nembutal, se afeitaron, se les
esterilizó la piel con alcohol etílico al 70% v/v y se creó un
defecto de espesor completo (de 8 mm de diámetro) en la región
torácica lateral. Se aplicó 1 \mug de cpn10r en 5 \mul de
cloruro de sodio (solución salina) al 0,9% en p/v tamponada con
Tris, pH 7,4, solución salina tamponada con Tris sola (5 \mul) o
solución salina sola (5 \mul) directamente a la herida, que se
cubrió luego con gasa con vaselina, apósito Melolin no adherente y
se mantuvo en su sitio con una venda elástica
Co-flex. Dos veces al día, se anestesiaron
ligeramente los ratones con halotano (Fluothane, ICI), se retiraron
los apósitos, se aplicaron 5 \mul de la disolución apropiada y se
volvieron a colocar los apósitos en las heridas. A diversos
intervalos, es decir, 24 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6
días y 7 días, se sacrificaron grupos de ratones con halotano, se
extrajo tejido de la herida y circundante y se midió el área de la
herida.
Tras el tratamiento con cpn10r, hubo una
aceleración significativa de contracción de la herida, cuando se
compara con las heridas tratadas con tampón o solución salina
(figura 12). En las heridas tratadas con cpn10, la contracción de la
herida comenzó en el plazo de las primeras 24 horas, mientras que en
las heridas control, la contracción comenzó después de 2 días
(figura 12). A partir de los 3 días, no hubo una diferencia
significativa en el tamaño de la
herida.
herida.
Cpn10 aplicada tópicamente a heridas de espesor
completo en ratones, acelera la contracción y cicatrización,
pareciendo que comienza el proceso directamente tras la formación de
la herida. La contracción de la herida en los ratones control no se
vuelve evidente hasta al menos 48 horas después.
Normalmente, la cicatrización de una herida tiene
lugar en tres fases. La fase 1, la fase inflamatoria
(0-48 horas) empieza inmediatamente después de la
lesión y es el tiempo durante el cual las plaquetas activadas
secretan factores de crecimiento en el defecto, facilitando la
actividad de los fibroblastos y aumentando la actividad de las
células, por ejemplo, macrófagos, implicadas en los estadios
posteriores de cicatrización de la herida. La fase 2, la fase
proliferativa (2-6 días), empieza cuando aparecen
los primeros fibroblastos y las células epidérmicas se multiplican y
migran hasta el sitio de la herida. La fase 3 es la fase de
maduración.
La contracción de la herida no comienza
normalmente en la fase 1, también conocida como la fase de latencia.
Durante esta fase, la forma y el tamaño de la herida escindida están
influidos por fuerzas elásticas en la piel vecina. Estas fuerzas
aumentan el tamaño inicial del defecto y le dan una forma diferente
correspondiente a las líneas de tensión presentes en la piel. Tal
como se ha demostrado en los grupos de ratones tratados con tampón o
solución salina, las heridas se agrandaron durante las primeras 48
horas. Por el contrario, las heridas de los ratones tratados con
cpn10r se contrajeron durante este tiempo, lo que sugiere que la
administración de cpn10r directamente a la herida aceleró la
migración de fibroblastos y la deposición de colágeno en la zona de
la herida. Este hallazgo tendrá una enorme importancia en el
tratamiento de heridas, incluyendo quemaduras, ya que la contracción
acelerada de la herida disminuirá mucho la pérdida de fluidos y el
riesgo de infección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La encefalomielitis alérgica experimental (EAE)
es una enfermedad desmielinizante autoinmune del sistema nervioso,
inducida por la inoculación a los animales de proteína básica de la
mielina (MBP) del sistema nervioso central en adyuvante, y se
estudió ampliamente como un modelo animal de esclerosis múltiple
(Raine, 1984, Laboratory Investigation 50
608-635). Las características clínicas de EAE en la
rata, una especie estudiada comúnmente, son la espectacular pérdida
de peso durante la noche a partir del día 10 después de la
inoculación, seguido por debilidad en la cola y parálisis, debilidad
en las extremidades traseras y algunas veces parálisis. A veces
puede producirse debilidad de las extremidades delanteras y
parálisis (Pender, 1986, Jornal of Neurological Sciences 75
317-328). Se llevaron a cabo experimentos para
determinar si la administración de cpn10r a ratas, tras la
inoculación, influiría en la evolución de la enfermedad.
Modelo de EAE: se indujo EAE en ratas
Lewis hembra endogámicas (de \sim 10 semanas) tras la inoculación
con MBP en adyuvante de Freund en una almohadilla de la pata. En el
estudio se incluyeron tres grupos de ratas. Todas se inocularon el
día 0. El grupo 1 (n = 4) no recibió tratamiento y los animales no
se manejaron durante el periodo de incubación de la enfermedad (del
día 0 al día 8). El grupo 2 (grupo control; n = 5) recibió solución
salina tamponada con Tris (0,1 ml) i.p 2 veces al día desde el día 0
hasta el día 20. El grupo 3 (grupo de prueba; n = 5) recibió 15
\mug de cpn10r en recibió solución salina tamponada con Tris (0,1
ml) i.p 2 veces al día desde el día 0 hasta el día 20. A partir del
día 8, las ratas se pesaron y se examinaron diariamente durante 30
días.
\newpage
(I) La debilidad en la cola se clasificó tal como
sigue:
- 0
\;
= - sin debilidad;
- 1
\;
= - sólo debilidad de la parte distal de la cola, no pudiendo enrollarse la cola distal alrededor del dedo del examinador;
- 2
\;
= - debilidad de toda la cola pero pudiendo todavía la cola distal erguirse verticalmente frente a la gravedad;
- 3
\;
= - debilidad grave con sólo una mínima señal de movimiento de la cola;
- 4
\;
= - parálisis fláccida completa de la cola.
(II) La debilidad en las extremidades traseras se
clasificó así:
- 0
\;
= - sin debilidad;
- 1
\;
= - ligero arrastre de los dedos gordos de ambas patas traseras;
- 2
\;
= - grave arrastre de ambos pies traseros pero no del resto de las extremidades traseras;
- 3
\;
= - grave arrastre de ambas extremidades traseras, a menudo con ambas extremidades traseras desplazadas a un lado del cuerpo;
- 4
\;
= - parálisis fláccida total de las extremidades traseras.
(III) Se evaluaron las extremidades delanteras de
manera similar a las extremidades traseras.
La puntuación total fue la suma de las
puntuaciones en (I), (II) y (III).
El tiempo de aparición de la pérdida de peso y el
periodo de pérdida de peso máxima en los grupos que no recibieron
tratamiento o recibieron inyecciones de tampón solo (grupo control)
no difirieron significativamente (tabla 3). Sin embargo, la pérdida
de peso inicial se retrasó en el grupo que recibió cpn10 (grupo de
prueba), comparado con el grupo que no recibió tratamiento, como
también lo hizo el periodo de pérdida de peso máxima (tabla 3; p
< 0,01, distribución \chi^{2}). No hubo una diferencia
significativa entre las medias de la pérdida de peso máxima en los
tres grupos (tabla 3).
La administración de inyecciones i.p. 2 veces al
día a las ratas con la manipulación necesaria implicada no afectó al
tiempo de aparición o a la gravedad de la enfermedad pero prolongó
el transcurso de la enfermedad durante varios días (día 17 a día 18
tal como se muestra en la figura 13). Sin embargo, una diferencia
notable entre estos dos grupos fue la recidiva de enfermedad grave
en el grupo control en el día 22, persistiendo hasta el día 30. En
el grupo que no recibió tratamiento, sólo volvió a aparecer
enfermedad leve en 3 ratas en los días 27 y 28.
Como con la pérdida de peso temprana, la
debilidad y la parálisis se retrasaron en el grupo de prueba, que
recibió cpn10, comparado con el grupo control (figura 14; día 12, p
< 0,01; día 13, p < 0,05, prueba de la t heteroscedástica). En
el grupo de prueba durante el periodo desde los días 14 a 16, sólo
una rata desarrolló enfermedad grave, similar a lo desarrollado por
las ratas control. Las 4 ratas restantes desarrollaron enfermedad
leve durante este periodo (figura 15,
p < 0,95, prueba de la t heteroscedástica). No volvió a aparecer enfermedad grave en el grupo de prueba, durante el pe-
riodo de examen; una rata desarrolló enfermedad leve en el día 22 y las ratas restantes desde el día 27 hasta el día 30.
p < 0,95, prueba de la t heteroscedástica). No volvió a aparecer enfermedad grave en el grupo de prueba, durante el pe-
riodo de examen; una rata desarrolló enfermedad leve en el día 22 y las ratas restantes desde el día 27 hasta el día 30.
El propio tratamiento, es decir, administrar
fluido i.p. 2 veces al día a ratas, no afectó a la aparición o la
gravedad de la enfermedad pero prolongó ligeramente su transcurso de
tiempo. Además, volvió a aparecer enfermedad grave durante el
periodo de observación en las ratas que recibieron inyecciones
diarias de solución salina tamponada con Tris pero no en las ratas
que no recibieron tratamiento.
La observación más interesante realizada en este
estudio fue que el tratamiento de las ratas con cpn10 retrasó
significativamente la aparición y modificó las características
clínicas de la enfermedad en 4 de 5 ratas. También previno la
recidiva de la enfermedad grave durante el tiempo en que estos
animales estuvieron bajo observación.
Un aspecto adicional de la invención es el
tratamiento de la fertilidad y/o los abortos espontáneos con la
administración de cpn10. Esto es de importancia cuando el problema
surge de la carencia de cpn10. El apoyo experimental de más adelante
demuestra el requerimiento de cpn10 durante el desarrollo
embrionario.
Para producir la situación de concentración
reducida de cpn10, se produjeron anticuerpos
anti-cpn10 y se utilizaron. No existe un sistema de
modelo animal disponible. Por tanto, se deduce del apoyo
experimental que la administración de cpn10 para aumentar la
concentración de cpn10 durante la gestación, superará los problemas
mencionados anteriormente de infertilidad y aborto espontáneo.
Se sintetizaron péptidos para que correspondieran
a un fragmento N-terminal
(N-péptido, es decir,
Ac-AGQAFRKFLPLC) y un fragmento interno
(I-péptido, es decir, EKSQGKVLQATC) de cpn10.
Se conjugaron los péptidos a ovoalbúmina mediante
el reactivo heterobifuncional SPDP, siguiendo las instrucciones del
fabricante (Pharmacia-LKB Biotechnolkogy, Uppsala,
Suecia):
Se inmunizaron conejos adultos de Nueva Zelanda,
cruzados con uno de los conjugados con 4 inyecciones semanales
seguido por varios refuerzos mensuales.
Para la inyección, se dializó el antígeno en
solución salina al 0,9% (tubo de diálisis de Mr de corte de
12-15.000, Visking, Union Carbide, IL, EE.UU.) y se
emulsionó con un volumen igual de adyuvante de Freund (completo para
la primera inyección, incompleto posteriormente). Las inmunizaciones
fueron a través de la vía s.c. (subcutánea).
Se probaron antisueros en un ELISA frente a los
antígenos pertinentes (a saber, I-péptido o
N-péptido; ovoalbúmina) (5 mg/ml). Se detectó IgG
unida mediante el sistema de biotina-estreptavidina
(Amersham) con o-fenilen-diamina
como sustrato. Se leyó la absorbancia a 492 nm.
Se precipitó la IgG del antisuero mediante
sulfato de amonio al 45% y se determinó la concentración mediante
Lowry y electroforesis en gel. Se probaron las preparaciones de IgG
en un ELISA (tabla 4) frente al péptido inmunizante, conjugado a
albúmina sérica bovina. Las preparaciones también se probaron para
determinar su capacidad para neutralizar la actividad de suero de
gestación de ratón en la prueba de inhibición de rosetas. Se
incubaron diversas concentraciones de anticuerpo con un volumen
igual de suero, probándose luego las mezclas para determinar su
actividad en la prueba de inhibición de rosetas. Se determinó la
concentración inferior de anticuerpo que podía neutralizar
completamente la actividad (véase Cavanagh et al., 1994, Eur.
J. Biochem. 222 551-560). Diez pg de Ac
anti-N-péptido neutralizaron la
actividad de 1 ml de suero de gestación, mientras que se necesitaron
4 ng de Ac anti-I-péptido para la
neutralización completa.
Se enjaularon por parejas ratones Quackenbush
cruzados y maduros, machos y hembras, a las 7:30 a.m. y se separaron
a las 8:30 a.m. A los ratones hembra con tapón vaginal se les
inyectaron preparaciones de
anti-N-péptido/ovoalbúmina,
anti-I-péptido/ovoalbúmina o IgG
anti-ovoalbúmina a las 9:00 a.m. y a las 5:00 p.m.
en los días 1 (día de apareamiento) y 2 de gestación. La dosis de
IgG específica inyectada en el régimen de dosificación 2 se estimó
que era de aproximadamente 1 mg/ratón/día. En el día 7, se
sacrificaron los ratones con CO_{2}, se examinaron los úteros para
observar los embriones implantados y se contó el número de cuerpos
lúteos (CL). En cada grupo, el número de embriones/CL en los ratones
tratados con la IgG de prueba se comparó con el número que
recibieron la misma dosis de IgG control (prueba de
\chi^{2}).
Los resultados, mostrados en la tabla 5,
demuestran claramente que la neutralización de cpn10 en suero de
gestación puede afectar negativamente a la viabilidad embrionaria en
las fases tempranas de la gestación. La capacidad de los anticuerpos
para neutralizar la actividad en la prueba de inhibición de rosetas
es una observación in vitro de su capacidad in vivo
para afectar negativamente a la gestación.
En otro aspecto de la invención, un trabajo
adicional ha dilucidado ahora dos regiones de la molécula con
actividad biológica, correspondientes a las regiones
1-11 y 34-44 en la cpn10 de rata y
humana.
Se ha encontrado que un péptido que tiene la
secuencia de aminoácidos Ac-AGQAFRKFLPL, así como un
péptido que tiene la secuencia EKSQGKVLQAT, son activos en el ensayo
de inhibición de rosetas. Los anticuerpos producidos contra ambos
péptidos son activos como antagonistas de cpn10, tal como se
describe con detalle en la solicitud de patente internacional
PCT/AU94/00742 (WO95/15339). Ambos péptidos se preparan de manera
sintética.
Por tanto, la invención incluye dentro su alcance
las secuencias de aminoácidos:
- (i)
- AGQAFRKFLPL;
- (ii)
- Ac-AGQAFRKFLPL en la que Ac es acetilo;
- (iii)
- EKSQGKVLQAT
que pueden funcionar como centros activos de la
molécula de cpn10.
La invención también incluye dentro de su
alcance, moléculas (i), (ii) y (iii) que tienen una o más secuencias
de extremo A_{1} y A_{2}, es decir:
- (iv)
- A_{1}AGQAFRKFLPLA_{2};
- (v)
- AGQAFRKFLPLA_{2};
- (vi)
- A_{1}AGQAFRKFLPL;
- (vii)
- Ac-A_{1}AGQAFRKFLPLA_{2};
- (viii)
- Ac-AGQAFRKFLPLA_{2};
- (ix)
- Ac-A_{1}AGQAFRKFLPL;
- (x)
- A_{1}EKSQGKVLQATA_{2};
- (xi)
- EKSQGKVLQATA_{2};
- (xii)
- A_{1}EKSQGKVLQAT;
en las que A_{1} y A_{2} son secuencias de
aminoácidos que pueden añadirse a uno o cada extremo de las
moléculas (i) a (xii) y en las que Ac es acetilo.
En las moléculas (i) a (xii) anteriores, se
apreciará que tales moléculas también incluyen dentro de su alcance,
una adición, deleción o sustitución de un único aminoácido.
Con respecto al uso de cpn10 en cuanto al
tratamiento de una enfermedad autoinmune, las enfermedades
pertinentes que pueden tratarse mediante la administración de cpn10
incluyen diabetes mellitus insulino dependiente, artritis
reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren,
enfermedad de Graves y esclerosis múltiple. Esto es evidente a
partir de los datos de apoyo pertinentes con respecto al modelo de
rata de EAE proporcionado en el presente documento.
En relación con el uso de cpn10 con relación al
tratamiento de transplantes de órganos, los datos de apoyo
pertinentes facilitados en el presente documento se refieren al
modelo de injerto de piel en rata descrito en el presente
documento.
En relación con el uso de cpn10 con relación al
tratamiento de la infertilidad o la prevención del aborto
espontáneo, los datos de apoyo pertinentes se refieren al efecto del
anticuerpo de cpn10 sobre el desarrollo y la implantación
embrionarios en ratones.
En relación con el uso de cpn10 con relación a la
cicatrización de heridas y la reparación tisular o regeneración de
tejido, esto significa que cpn10 puede utilizarse en el tratamiento
de heridas, cirugía, traumatismos, úlceras cutáneas incluyendo
escaras de decúbito y úlceras diabéticas, enfermedades infecciosas
que implican el daño tisular y de órganos (por ejemplo, hepatitis),
enfermedad metabólica que implica daños tisulares y de órganos (por
ejemplo, cirrosis hepática) y enfermedad degenerativa que implica
daño tisular y de órganos. El apoyo de estas conclusiones se
facilita en el modelo de cicatrización en ratón al que se hace
referencia en el presente documento y los datos de regeneración
hepática tras hepatectomía parcial en ratas tratado en Quinn et
al., 1994, Hepatology 20 nº 5
1294-1302.
Los datos a los que se hace referencia en el
presente documento también proporcionan un claro apoyo al uso de
cpn10 en el tratamiento de estados inflamatorios incluyendo la
enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad infecciosa. Tales
datos tal como se describen en el presente documento incluyen
referencias extraídas del efecto inmunosupresor de cpn10 en los
modelos de EAE e injerto de piel en rata. Esto también está apoyado
por Rolfe et al., 1983, Clin. exp. Immunol. 51
42-52 y Nature 278 nº 5705
649-651, que muestran que EPF puede reducir la
hipersensibilidad de tipo retardado en ratones.
El uso de cpn10 en el tratamiento de enfermedad
alérgica incluyendo rinitis alérgica, asma, dermatitis atópica,
urticaria aguda e hipersensibilidad a los fármacos también está
apoyado por el efecto inmunosupresor de cpn10 en los modelos de EAE
e injerto de piel en rata. Esta conclusión también puede extraerse
de Rolfe et al., 1983, Clin. exp. Immunol. 51
45-52 y Noonan et al., 1979, Nature
278 nº 5705 649-651, que muestran el efecto
de EPF en la reducción de la hipersensibilidad de tipo retardado en
ratones.
El uso de cpn10 en relación con el diagnóstico de
tumores y/o la monitorización de pacientes tras la extirpación
quirúrgica de tumores está apoyado por la referencia de Quinn et
al., 1992, Cancer Immunol. Immunother. 34
265-271.
Con respecto a las dosis que pueden emplearse
concernientes a cpn10, una dosis conveniente sería del orden de
1-1000 \mug/kg de peso corporal y más
preferiblemente de 50-200 \mug/kg de peso
corporal.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
Actividad de cpn10 en la prueba de inhibición de
rosetas.
Tabla
2
Tiempo de supervivencia del injerto de piel.
- Valor de p cuando se compara con el grupo control que recibe tampón solo.
- * p < 0,001
Tabla
3
Tiempo de la pérdida de peso inicial y pérdida de
peso máxima en los tres grupos de tratamiento durante el transcurso
de la EAE.
- * distribución de \chi^{2}
- \cdot prueba de la t de Student
Tabla
4
Anticuerpos
anti-N-péptido,
anti-I-péptido y
anti-ovoalbúmina control probados en un ELISA frente
a N-péptido e I-péptido.
- * 1 en 1000 fue la menor dilución probada.
Tabla
5
Efecto de la inmunización pasiva de ratones de
apareamiento confirmado en los días 1 y 2 p.c. ("post coital",
después del coito), con anticuerpos contra los péptidos derivados de
cpn10, sobre el número de embriones implantados y cuerpos lúteos
presentes en el día 7 p.c.
- * (prueba de la t heteroscedástica).
Figura
1a
Purificación de EPF. Se fraccionaron plaquetas
humanas extraídas con calor (100 unidades) en
SP-Sephadex y heparina-Sefarosa,
luego se aplicaron a una columna TSK-Phenyl 5PW y
se fluyeron con un gradiente salino inverso. Se probaron las
fracciones en la prueba de inhibición de rosetas (basado en la
capacidad de EPF para aumentar la actividad de inhibición de rosetas
de un suero antilinfocítico inmunosupresor).
Figura
1b
Se fraccionaron las fracciones activas (?) de (a)
mediante RP-HPLC-1.
Figura
1c
Se fraccionaron las fracciones activas (?) de (b)
mediante RP-HPLC-2.
Figura
1d
Se fraccionaron las fracciones activas (?) de (c)
mediante RP-HPLC-3.
Figura
1e
Interacción del anticuerpo
anti-EPF monoclonal 5/341 inmovilizado con
fracciones activas de (d) y fracciones equivalentes de suero de
gestación humano, 6 días de gestación (10 ml): orina de gestación
humana, hasta 1 mes de gestación (10 litros); medio acondicionado
mediante ovarios de ratón hembra en celo (100) estimulados con
prolactina y medio acondicionado de embrión de ratón
(ovario-CM); suero sin medio acondicionado mediante
la línea celular de riñón bovino MDBK (MDBK-CM: ATCC
CCL 22, 10 litros); suero de rata obtenido 24 horas después de
hepatectomía parcial (post-pH, 10 ml); hígado de
rata obtenido 24 horas posteriormente-pH (40 g);
todos se fraccionaron como en de (a) a (d). Se probaron fracciones
de anti-EPF unidas y no unidas en la prueba de
inhibición de rosetas, se demostró la especificidad mediante
comparación con un experimento paralelo que utiliza un anticuerpo
irrelevante en el que la actividad no estaba unida.
Figura
2a
Análisis de EPF purificado a partir de 300
unidades de plaquetas humanas como en la figura 1A. Determinación
del tamaño monomérico. Se fraccionó EPG yodado mediante
SDS-PAGE,^{29} se cortó el gel (cortes de 2 mm d
ancho) y se comparó la distribución de la radiactividad y la
actividad biológica. (Recuadro) Teñido directo con azul de Coomassie
de la misma preparación.
Figura
2b
Espectro de masas por pulverización iónica
("ion-spray") de EPF, mostrado como iones
moleculares protonados múltiples. (recuadro) Reconstrucción por
ordenador como masa molecular.
Figura
2c
Secuencia de aminoácidos (código de una única
letra) de péptidos derivados de EPF humano, comparado con cpn10 de
rata (subrayado). EPF se digirió con endoproteinasa lys C y
endoproteinasa glu C, se separaron los péptidos resultantes mediante
RP-HPLC y se secuenciaron. Se muestra la secuencia
de los fragmentos individuales; todos excepto 74-101
se derivan del digesto con lys.
Figura
3
Interacción de EPF con cpn10 (groEL):
Figura
3a
Se analizaron las fracciones con pico en el
volumen excluido de una columna de permeación en gel TSK G3000SW,
tras la aplicación de una mezcla de cpn10-EPF +
Mg^{2+}-ATP, mediante SDS-PAGE
(Schagger et al., 1987) y se tiñeron con plata (Morrisey,
1981). Banda izquierda, +ATP; banda derecha, -ATP. (Cpn60 es un
decatetrámero, M, 840.000; límite de exclusión de la columna >
300.000. Las bandas de M_{r} superior en gel de sílice son formas
oligoméricas de groEL).
Figura
3b
Se mezcló cpn60 inmovilizada con suero de
gestación humana (6 días de gestación) en presencia o ausencia de
Mg^{2+}-ATP. Las fracciones no unidas y unidas
(éstas últimas recuperadas del gel mediante la eliminación de ATP
con EDTA) se probaron entonces en la prueba de inhibición de
rosetas. Los resultados se expresan como dosis limitante, la
dilución mayor de muestra que da un resultado positivo en la prueba
de inhibición de rosetas.
Figura
4
pRM1.
Figura
5
pRM2.
Figura
6
pRM3.
Figura
7
Preparación de anticuerpos contra cpn10.
Figura
8
Detección de anticuerpos
anti-cpn10 en suero de conejo mediante ELISA.
Figura
9
Ensayo de unión competitiva para cpn10.
Figura
10
% de inhibición de la unión de anticuerpos.
Figura
11
Transcurso de tiempo de cpn60 recombinante y
actividad de cpn10 plaquetaria en el suero de ratones tras inyección
i.p.
Figura
12
El efecto de cpn10r sobre la contracción de
heridas en ratones. Se crearon heridas (\sim 45 mm^{2}) en
ratones, se aplicó tópicamente 1 \mug de disoluciones de cpn10r o
control (5 \mul) 2 veces al día y se midió el tamaño de la zona de
la herida en los grupos de ratones en los tiempos indicados (medias
\pm DE); día 0, n = 10, día 1-día 3, n = 3, día
4-día 7, n = 2 * p < 0,05 comparado con el grupo
control de tampón.
Figura
13
Efecto del régimen de tratamiento sobre el
desarrollo de EAE en ratas.
Figura
14
Efecto de cpn10 sobre el desarrollo de EAE en
ratas.
Figura
15
Efecto de cpn10 sobre el desarrollo de EAE en
ratas.
<110> LA UNIVERSIDAD DE QUEENSLAND
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> CHAPERONINA 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B3208 AD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 95902003.3
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1994-11-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/AU 94/00740
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1994-11-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PM 2705
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1993-11-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PM 8234
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1994-09-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador donde R es A o G e Y es C
o T
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskiparraartart cyttrtcrtc
\hfill20
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<210> 3
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador para la Secuenciación en
reverso (RSP)
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
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<223> Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagt
\hfill17
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<210> 5
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador "corriente arriba"
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcggatcc atggcaggac aagcgtttag
\hfill30
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<210> 6
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<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador "corriente abajo"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatgaattc agtctacgta ctttcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN -
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu
Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr
Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> cpn10 humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\sa{Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\sa{Xaa Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro
Leu Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 12
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\sa{Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Pro Leu
Xaa}
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<210> 13
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
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<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN - N terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro
Leu Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN -
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN -
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN -
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro
Leu}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
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<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala
Thr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\sa{Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Proteína o péptido seleccionado del grupo que
consiste en:
- a)
- una chaperonina 10 (cpn10) de mamífero recombinante o sintética,
- b)
- una proteína modificada recombinante o sintética, que tiene la secuencia de aminoácidos:
- GSMAGQAFRKFLPLFDRVLVERSAAETVTKGGIMLPEKSQGKVLQATVEAVGSGSKGKGGEIQPVSVKEGDKVLLPEYGGTKVVLDDKDYFLFRDGDILGKYVD,
- c)
- un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: AGQAFRKFLPL,
- d)
- un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: Ac-AGQAFRKFLPL,
- e)
- un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: EKSQGKVLQAT
- f)
- un péptido que tiene la secuencia de c), d) o e) modificado por una adición, deleción o sustitución de un único aminoácido y que funciona como centros activos de la molécula de cpn10
para su uso como un fármaco.
2. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en la estimulación de la inumosupresión.
3. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en el tratamiento de enfermedades auntoinmunes.
4. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en el tratamiento de estados inflamatorios.
5. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en el tratamiento de enfermedades alérgicas.
6. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en la estimulación del crecimiento celular.
7. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en potenciar la cicatrización de heridas, la reparación
tisular o la regeneración tisular.
8. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en potenciar la viabilidad de un injerto de órgano o
piel.
9. Proteína o péptido según la reivindicación 1,
para su uso en la prevención de la infertilidad o la prevención de
un aborto espontáneo.
10. Péptido procedente de la proteína cpn10, que
funciona como centros activos de la molécula de cpn10, seleccionado
del grupo de:
- -
- AGQAFRKFLPL,
- -
- Ac-AGQAFRKFLPL y
- -
- EKSQGKVLQAT
11. Péptido procedente de la proteína cpn10 según
la reivindicación 10, que tiene una adición, deleción o sustitución
de un único aminoácido, y que funciona como centros activos de la
molécula de cpn10.
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