KR20080075505A

KR20080075505A - 과민증의 치료 방법

Info

Publication number: KR20080075505A
Application number: KR1020087012006A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 존 허버트 기어링; 바바라 제인 존슨
Original assignee: 씨바이오 리미티드
Priority date: 2005-10-20
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2008-08-18
Also published as: WO2007045046A1; JP2009511610A; CN101330922A; BRPI0617681A2; CA2626692A1; EP1951282A4; EP1951282A1; US20090087410A1

Abstract

본 발명은 피험체의 과민 반응을 저해하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의 샤페로닌 (10)을 투여하는 단계를 포함한다.

Description

과민증의 치료 방법{TREATMENT OF HYPERSENSITIVITY}

본 발명은 치료상 유효량의 진핵생물생물 샤페로닌 10(Cpn10)을 투여하여 과민증을 치료하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 천식을 비롯한 과민증과 연관된 알레르기성 상태의 치료를 위한 진핵생물생물 Cpn10의 용도에 관한 것이다.

특정 항원 또는 항원의 조합에 대한 개체의 감수성은, 그 항원에 대한 후속 노출이 심한 알레르기성 반응을 유발하여, 해롭고 심지어는 치명적일 수 있다. 후천성 면역 반응이 비정상적이거나 또는 부적절한 형태로 일어날 때, 이 반응을 경험한 개체를 지나치게 과민성이라고 말한다.

과민 반응은 부적절하게 작용하는 면역 반응의 결과이며, 여러 가지 항원들에 의해 유발될 수 있다. 과민증의 한가지 형태는 IgE 반응이 꽃가루 또는 먼지 진드기와 같은 독 없는 환경성 항원에 대항할 때 일어난다. IgE-감작된 비만 세포에 의한 약리학적 매개자의 결과적인 방출은 천식 또는 비염과 같은 증상을 가진 급성 염증 반응을 초래한다.

본 발명은 진핵생물생물 Cpn10이 천식을 비롯한 과민 반응을 저해할 수 있다는 놀라운 발견을 반영한다.

개요

본 발명의 제1 측면에 따르면, 피험체의 과민 반응을 저해하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 유효량의 진핵생물생물 샤페로닌 10을 투여하는 단계를 수반한다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 피험체의 과민 반응과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 피험체에게 유효량의 진핵생물생물 샤페로닌 10을 투여하는 단계를 포함하고, 이때 샤페로닌 10은 Toll양 수용체로부터의 신호 전달을 조절한다.

본 발명의 제3 측면에 따르면, 피험체의 과민 반응과 연관된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 1 이상의 병행 요법과 함께 유효량의 진핵생물생물 샤페로닌 10을 포함한다.

본 발명의 제4 측면에 따르면, 피험체의 과민 반응과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

과민 반응은 호염구, 호산구, 비만 세포, 호중구 및 림프구의 활성화를 포함할 수 있고, Toll양 수용체(TLR) 신호 전달의 활성화를 포함할 수 있다. 과민 반응은 고 농도의 호산구 및 면역글로불린 E를 반영할 수 있다.

과민 반응의 예는 염증 반응이다. 보다 구체적으로, 과민 반응의 예로는 식품 알레르기, 피부염, 알레르기성 결막염, 비염, 습진, 아나필락시스 및 기도 염증과 연관된 호흡기 질환이 있다. 이러한 호흡기 질환의 예로는 알레르기성 천식, 내 인성 천식 및 직업성 천식과 같은 천식이 있다.

TLR 활성화는 ARDS(급성 호흡 곤란 증후군)에서 천식에 이르는 염증 폐질환 및 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)의 병인론(aetiology)에 있어서 중요한 역할을 한다. Toll양 수용체는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR10을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다.

진핵생물생물 샤페로닌 10은 자연적으로 유래하거나, 재조합 생성되거나 또는 합성으로 생성된 샤페로닌 10일 수 있다. 진핵생물생물 샤페로닌 10은 포유류 기원의 것일 수 있다. 샤페로닌 10은 인간 샤페로닌 10일 수 있다.

샤페로닌 10은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17에서 나열한 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 샤페로닌 10은 아실화 또는 비아실화될 수 있다. 샤페로닌 10은 단백질 접힘 활동이 약하거나 실질적으로 약할 수 있다.

진핵생물생물 샤페로닌 10은 샤페로닌 10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 형태로 투여할 수 있다. 샤페로닌 10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 실시가능하게 연결된 유전 구조에 위치할 수 있다 .

진핵생물생물 샤페로닌 10은 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18에 나열한 바와 같은 서열을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.

방법은 1 이상의 첨가제의 투여를 더 포함할 수 있다. 이 작용제는 면역조절제일 수 있다. 면역조절제는 IFNα 또는 IFNβ와 같은 I형 인터페론일 수 있다.

병행 요법은 항염증 화합물, 기관지확장 화합물 또는 면역억제제, 또는 이들의 조합과 같은 작용제의 투여를 포함할 수 있다.

면역억제제는 B 또는 T 림프구에 대해 유도된 면역억제 약물 또는 특정 항체, 사이토카인(예를 들어, IL-3 IL- 5, IL-13, GM-CSF, 또는 이들의 활성화를 매개하는 IgE를 비롯한 표면 수용체) 및 Fc엡실론리셉터(FcEpsilonReceptor)에 대해 유도된 항체일 수 있다.

면역억제 약물은 크로모글리칼레이트, 테오필린, 루코트리엔 길항제, 항히스타민 또는 이들의 조합일 수 있다.

제3 측면에 따른 조성물은 코르티코스테로이드를 더 포함할 수 있다.

전술한 측면들 및 구체예들은 포유류 샤페로닌 10, 및 예를 들어 인간 샤페로닌 10뿐 아니라 전체 길이의 샤페로닌 10 폴리펩티드 및 면역조절제의 활성을 보유하는 단편들 또는 이의 유도체들을 비롯한 진핵생물생물 샤페로닌 10의 야생형 및 변형 형태의 용도를 고려한다.

정의

명세서의 문맥에서, 용어 "포함"은 "원칙적으로 포함하나, 반드시 단독은 아님"을 의미한다. 게다가, 단어 "포함"의 어미 변화, 예컨대 "포함하다(단수)" 및 "포함하다(복수)"는 그에 따라 변화된 의미를 가진다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는 것" 및 이의 어미 변화는, 질환 상태 또는 증상을 치료하거나, 질환의 정착을 방지하거나, 또는 다른 방법으로 질환의 진행을 예방하거나, 또는 임의의 방식으로 기타 바람직하지않은 증 상을 예방하고, 방해하고, 늦추거나 역전시키는 임의의 용도 및 모든 용도를 가리킨다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "유효량"은 이의 의미 내에 비독성이나 목적하는 치료 효과 또는 예방 효과를 제공하기에 충분한 작용제 또는 화합물의 양을 포함한다. 필요한 정확한 양은 치료할 종류, 피험체의 나이 및 일반적인 조건, 치료할 상태의 심각성, 투여할 특정 작용제 및 투여 방식 등과 같은 요인에 따라 피험체마다 다양할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명시하는 것은 가능하지 않다. 하지만, 임의의 주어진 경우에, 적당한 "유효량"은 단지 일상적인 실험을 이용하여 당업자가 결정할 수 있다..

용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산으로 구성된 중합체를 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서 "폴리펩티드"는 전체 길이의 단백질의 부분을 구성할 수 있지만, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 교체가능하게 사용한다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체, 리보뉴클레오티드 염기 또는 알려진 유사체 또는 천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 가리킨다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "조절", "조절하다" 및 이의 어미 변화는, 조절 분자 또는 작용제의 부재하에 분자의 활성, 생성, 분비 또는 작용 정도에 비해, 본 발명의 특정 조절 분자 또는 작용제의 존재하에 분자의 활성, 생성, 분비 또는 작용 정도를 증가 또는 감소시키는 것을 가리킨다. 이러한 용어들은 증가 또 는 감소의 정량을 내포하지는 않는다. 조절은 목적하는 결과를 산출하기에 충분한 임의의 크기일 수 있으며, 직접 또는 간접적일 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같이 용어 "면역조절제"는 1종 이상의 세포 유형에 의해 분비되고, 면역 반응의 활성화, 지속, 성숙, 저해, 억제 또는 증대에서 역할을 하는 분자 조절자를 가리킨다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 단지 비제한적인 실시예에 의해 본 발명을 기술하고자 한다.

도 1은 i.v.로 전달된 비히클, Cpn10 0.5 mg, 4 mg, 또는 16 mg으로 처리하거나(A), 또는 우측 엽(B)으로 전달된 비히클과 함께, 폐의 좌측 엽으로 직접 전달된 비히클, Cpn10 0.5 mg 또는 4 mg으로 처리하고, 집 먼지 진드기(HDM)로 항원 공격한 양(그룹당 n=5)의 기관지폐포 세척(BAL)에서 계수된 총 세포수 중 호산구 퍼센트이다. HDM 항원 공격 48시간 후에 세척(lavage) 샘플을 취하였다.

도 2에서 A는 Cpn10 4 mg을 i.v. 투여한 그룹에서 HDM 항원 공격 0일(d0) 전 및 7일 후(d7)의 HDM-특이적 IgE 농도이다. B는 Cpn10 4 mg을 폐 내 투여한 그룹에서 HDM 항원 공격 0일(d0) 전 및 7일 후(d7)의 혈청 IgE 농도이다.

도 3은 집 먼지 진드기(HDM) 항원 공격 48시간 후 2마리 양의 대표적인 기관지 기도이다. HDM 항원 공격(2) 전에 양에게 비히클을 폐 내 주입하거나(1), 또는 Cpn10 4 mg을 단독으로 iv 주사에 의해 투여하였다. HDM 항원 공격 전에 Cpn10을 IV 투여한 양의 기도에서는 비히클 대조구 양에서 기도를 둘러싼 침투성 염증 세 포(화살표)가 거의 없는 것을 주목(x100 H&E).

도 4는 집 먼지 진드기(HDM) 항원 공격 48시간 후 2마리 양의 대표적인 말단 세기관지이다. HDM 항원 공격(2) 전에 양에게 비히클의 폐 내 주입하거나(1), 또는 Cpn10 4 mg을 단독으로 iv 주사에 의해 투여하였다. HDM 항원 공격 전에 Cpn10을 IV 투여한 양의 기도에서는, 비히클 대조구 양에서 기도를 둘러싼 침투성 염증 세포(화살표)가 거의 없는 것을 주목(x100 H&E).

도 5는 HDM-항원 공격 및 비히클(대조구)의 폐 내 투여 48시간 후 #6 양의 기관지 기도의 고 출력 현미경 사진이다. 기관지선 루멘을 완전하게 폐색하는 PAS 염색된 레드 점액질(화살표)에 주목. 또한 배상 세포와 상피 세포 비대증 및 기도 루멘 안쪽의 점액질에 주목(x400 알시안 블루 PAS 염색함).

도 6은 HDM-항원 공격 및 Cpn10 4 mg의 iv 주사 48시간 후 #44 양의 기관지 기도의 현미경사진이다. 기관지선의 좌측면에 위치한 작은 영역의 블루 점액질(화살표) 이외의 점액질이 크게 결여된 것에 주목. 또한 기도 루멘 안쪽의 배상 및 상피 세포는 더욱 전형적인 항원 공격 안한 동물에서 보다 일반적임을 주목(x250 알시안 블루 PAS 염색함)

서열 목록: 야생형 인간 Cpn10의 아미노산 서열(GenBank Accession No. X75821)은 서열 번호 1에 제시된다. N-말단에 추가의 아미노산 잔기를 가진, 2개의 변형된 형태의 Cpn10 아미노산 서열은 서열 번호 2, 3 및 4에 제시된다. 동일한 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5 및 6에 제시된다. 다른 변형된 형태의 야생형 인간 Cpn10은 서열 번호 7에 나열한 바와 같이 이동성 루프의 결실을 포함한다. 동일한 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 8에 제시된다. 이것 말고도, 다른 변형된 형태의 야생형 인간 Cpn10은 서열 번호 13, 15 및 17에 제시된 바와 같은 이동성 루프 내에 결실을 포함한다. 동일한 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 14, 16 및 18에 제시된다. 추가의 변형된 형태의 야생형 인간 Cpn10은 베타 헤어핀 지붕 루프의 결실(서열 번호 9) 또는 이동성 루프 및 베타 헤어핀 지붕 루프 둘 다의 결실(서열 번호 11)을 포함한다. 동일한 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10 및 12에 제시된다.

과민 반응은 부적당하게 작용하는 면역 반응의 결과로서, 여러 가지 항원들에 의해 유발될 수 있다. 과민증의 한가지 형태는 IgE 반응이 꽃가루 또는 먼지 진드기와 같은 독 없는 환경성 항원에 대항할 때 일어난다. IgE-감작된 비만 세포에 의한 약리학적 매개자의 결과적인 방출은 천식 또는 비염과 같은 증상을 가진 급성 염증 반응을 초래한다.

기도 염증은 천식의 병인에 중점을 두며, 폐 조직 및 기관지폐포 공간 안으로 호산구, 비만 세포, 호중구 및 림프구의 보충 및 활성화를 포함한다(Busse et al, 2001). 집 먼지 진드기 항원은 인간에게서 알레르기성 천식을 일으키는 가장 일반적인 알레르겐으로서, 감작된 개체는 특정 IgE 및 IgG 체액성 반응을 나타낸다(Roche et al, 1997). 천식에 걸린 적당한 동물 모델로 인간 질환에 대한 직접적인 관련성을 가지고 한정되고 조절된 조사를 수행하도록 하였다.

본 발명은 천식에 걸린 양 모델에서 Cpn10의 조절 효과의 평가를 실예로 들었다. 하지만, 기타 과민 반응 유형 병에 적용가능함을 인지할 것이다.

이전의 천식에 걸린 양 모델은 선충류(Ascaris) 알레르겐에 감작된 동물을 기본으로 하고, 그 결과들로 잠재적인 항천식 약물의 생리학적 효과 및 약리학적 효과의 평가를 추정하였다. 인간 알레르기성 질환에 직접적인 관련성을 가진 알레르겐으로서 집 먼지 진드기를 사용한 양에서 알레르기성 폐 염증의 모델을 최근에 정립하였다. 이 모델에서, 감작된 양은 HDM 알레르겐으로 항원 공격한 인간과 유사한 속도로 폐 조직 및 BAL 안으로 호중구, 호산구 및 활성화된 림프구가 보충된 알레르겐-특정 IgE 반응을 나타낸다(Bischof et al, 2003).

본 발명은 피험체의 과민 반응을 저해하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 진핵생물생물 샤페로닌 10을 투여하는 단계를 포함한다.

Cpn10

본 발명의 측면 및 구체예에 따르면, 치료가 필요한 피험체에게 유효량의 진핵생물생물, 예를 들어 열 충격 단백질 10 kDa(Hsp10)로 알려진 인간 Cpn10을 투여한다. 예를 들어, 치료받을 피험체는 인간이고, 이에 따라 Cpn10 폴리펩티드는 인간 Cpn10 폴리펩티드이다. 당업자라면 본 발명에 따라 사용된 Cpn10의 정확한 동일성은 다수의 인자, 예컨대 치료받을 종에 따라 다양해질 수 있음(치료받을 종으로부터 유도하기 위하여 Cpn10을 선택할 수 있음)을 이해할 것이다.

일반적으로, Cpn10은 재조합 Cpn10이다. 문헌[Morton et ah, 2000(Immunol Cell Biol 78:603-607), Ryan et ah, 1995(J Biol Chem 270:22037-22043) 및 Johnson et ah, 2005(J Biol Chem 280:4037-4047)에 기재된 방법들은 재조합 Cpn10 단백질에 대한 적절한 생성 방법의 예이지만, 당업자라면 사용된 정제 또는 생성 방법에 의해 본 발명이 한정되지 않으며, 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 사용을 위해 Cpn10을 생성하는 데 임의의 다른 방법이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 진핵생물생물 Cpn10 폴리펩티드 및 펩티드 단편들은 표준 재조합 핵산 기술을 이용하여 얻거나, 또는 예를 들어 통상적인 액상 또는 고상 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다. Cpn10 펩티드는 엔도Lys-C, 엔도Arg-C, 엔도Glu-C 및 스테필로코커스 V8-프로테아제와 같은 1 이상의 프로테이나제를 사용한 폴리펩티드의 소화에 의해 생성할 수 있다. 소화된 펩티드 단편은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC) 기술로 정제할 수 있다.

본 발명의 구체예는 또한 진핵생물생물 Cpn10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 고려한다. 이러한 상황에서, 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 작동가능하게 프로모터에 연결되어, 피험체에게 폴리뉴클레오티드를 투여함에 따라 적당한 폴리펩티드 서열이 생성되도록 한다. 폴리뉴클레오티드는 벡터로 피험체에게 투여할 수 있다. 벡터는 외래 서열의 삽입, 진핵생물생물 세포로의 이들의 도입 및 도입된 서열의 발현에 적응된 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 또는 임의의 기타 적절한 비히클일 수 있다. 일반적으로 벡터는 진핵생물생물 발현 벡터이고, 발현 대조구 및 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호 전달 및 전사 종결 서열와 같은 프로세싱 서열을 포함할 수 있다. 투여할 핵산 구조는 그대로의(naked) DNA를 포함할 수 있거나, 또는 1 이상의 약학적 허용 담체를 가진 조성물의 형태일 수 있다.

진핵생물 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17에 나열된 아미노산 서열을 가질 수 있다. Cpn10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18에 나열된 바와 같을 수 있거나, 또는 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18의 서열에 교배시키기에 충분한 서열 동일성을 나타낸다. 대안적인 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18에 나열한 서열과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 공유할 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같이 용어 "폴리펩티드" 및 "폴리뉴클레오티드"의 범주 내에, 단편 및 이의 변이체가 있다. 오직 예로서, WO 95/15338 및 PCT/AU2006/001278(그 내용이 참고로 본원에 포함됨)에 기재된 Cpn10의 펩티드 단편은 본 발명의 측면 및 구체예에 따라 사용할 수 있다.

용어 "단편"은 전체 길이의 Cpn10 단백질의 구성요소를 암호화하거나, 구성요소인 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 가리킨다. 폴리펩티드에 있어서, 단편은 전체 길이의 단백질과 공통된 정성적 생물학적 활성을 가진다. 본 발명에 따라 사용된 Cpn10의 생물학적 활성 단편은 전형적으로 상응하는 전체 길이의 단백질 면역조절제 활성의 약 50% 이상, 더욱 전형적으로 상기 활성의 약 60% 이상, 더욱 전형적으로 상기 활성의 약 70% 이상, 더욱 전형적으로 상기 활성의 약 80% 이상, 더욱 전형적으로 상기 활성의 약 90% 이상, 더욱 전형적으로 상기 활성의 약 95% 이상을 가진다.

본원에서 더 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 또한 Cpn10의 N 말단에 대한 글리신 잔기의 추가가 면역조절 활성을 증대시킨다는 것을 입증하였다. 아세틸기 또는 알라닌 잔기 또는 글리신 잔기와 같이 아세틸 기에 대한 구조적 상동을 공유하는 아미노산의 존재가 Cpn10의 면역조절 활성을 증대시킨다는 것이 예상된다.

본원에서 사용한 바와 같이 용어 "변이체"는 실질적으로 유사한 분자에 관한 것이다. 일반적으로, 핵산 서열 변이체는 공통된 정성적 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화한다. 일반적으로, 폴리펩티드 서열 변이체는 또한 공통된 정성적 생물학적 활성을 가진다. 더욱이, 이들 폴리펩티드 서열 변이체는 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성 및 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 유사성을 고유할 수 있다.

또한, 변이체 폴리펩티드는 유사체를 포함할 수 있는데, 여기서 용어 "유사체"는 Cpn10의 유도체인 폴리펩티드를 의미하고, 상기 유도체는 폴리펩티드가 본래의 Cpn10과 같이 실질적으로 동일한 기능을 보유하도록 하는 1 이상의 아미노산의 추가, 결실, 치환을 포함한다. 몇몇 아미노산이 폴리펩티드(보존적인 치환)의 활성을 변경하지 않고 폴리펩티드 내에서 변화할 수 있음은 당업계에 공지되어 있다. 용어 "보존적인 아미노산 치환"은 폴리펩티드 사슬(단백질의 1차 서열) 내에 유사한 특성을 가진 다른 아미노산에 대한 하나의 아미노산의 치환 또는 교체를 가리킨다. 예를 들어, 유사하게 하전된 아미노산 아스파르트산(Asp)에 대한 하전된 아미노산 글루탐산(Glu)의 치환은 보존적인 아미노산 치환이 될 것이다. 아미노산 추가는 제2 폴리펩티드 또는 펩티드와 Cpn10 폴리펩티드 또는 이의 단편의 융합, 예컨대 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 융합, 글루타티온 S 전이 효소 융합, 형광 단백질 융합, 또는 FLAG 또는 c-myc와 같은 에피토프 태그의 추가로부터 기인할 수 있다. 예를 들어, 야생형 인간 Cpn10 폴리펩티드는 N-말단에서 추가의 GSM 트리펩티드 부분(서열 번호 2; 예를 들어 WO 95/15338 참조, 그 내용이 본원에 참고로서 포함됨) 또는 N-말단에서 추가의 알라닌(A) 잔기(서열 번호 3; WO 2004/041300, 그 내용이 본원에 참고로서 포함됨), 또는 N-말단에서 추가의 글리신(G), 서열 번호 4(예를 들어 PCT/AU2006/001278 참고)를 포함할 수 있다. 야생형 Cpn10 폴리펩티드는 N 말단에 시발 메티오닌을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 야생형 Cpn10 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서 1 이상의 아미노산 잔기의 추가, 결실, 또는 치환에 의해 변형될 수 있다.

다른 실시예에서, 야생형 인간 Cpn10 폴리펩티드는 예를 들어 PCT/AU2006/001278(그 내용이 본원에 참고로서 포함됨)에서 관찰될 수 있는 이동성 루프(서열 번호 7), 베타-헤어핀 지붕 루프(서열 번호 9) 또는 둘 다(서열 번호 11)가 부족할 수 있다. 또한, 야생형 인간 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 13, 15 또는 17(예를 들어 PCT/AU2006/001278 참조, 그 내용이 본원에 참고로서 포함됨)에 나열된 이동성 루프에 트리펩티드 결실을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 형태의 Cpn10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 사용을 고려한다.

Cpn10 변이체는 Cpn10 단백질의 돌연변이 생성 또는 암호화 핵산의 돌연변이 생성, 예컨대 당업자에게 공지된 방법을 이용한 무작위 돌연변이 생성 또는 자리 지정 돌연변이 생성에 의해 발생할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Current Protocols In Molecular Biology(Chapter 9), Ausubel et al, 1994, John Wiley & Sons, Inc., New York, 그 내용이 본원에 참고로서 포함됨]에서 발견할 수 있다. 변이체 및 유사체는 또한 다른 화학적 부분과 복합체를 형성한 폴리펩티드, 융합 단백질을 포함하거나 또는 다른 번역 후에 변형된다. 적절한 변형의 예는 국제 특허 출원 PCT/AU2005/000041(그 내용이 본원에 참고로서 포함됨)에 기재되어 있다.

또한, Cpn10 폴리펩티드 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 바와 같이, 예를 들어 아세틸화, 아미드화, 카바모일화, 환원적 알킬화 및 기타 변형과 같은 곁사슬 변형을 비롯한 다른 번역 후 변형을 가질 수 있다.

샤페로닌 10 변이체의 추가 예는 단백질 접힘 활성이 약하거나 또는 실질적으로 약한 것으로, 이러한 변형의 예는 국제(PCT) 특허 출원 PCT/AU2006/001278(그 내용이 본원에 참고로서 포함됨)에 기재되어 있다.

Cpn10 의 생성

본 발명에 따르면, Cpn10 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 재조합 DNA 및 분자 생물학의 표준 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 지침은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992]과 같은 표준 내용으로부터 얻을 수 있다. 문헌[Morton et al, 2000(Immunol Cell Biol 78:603-607), Ryan et al., 1995(J Biol Cheni 270:22037-22043) and Johnson et al, 2005(J Biol Chem 280:4037-4047)]에 기재된 방법은 Cpn10 폴리펩티드에 대한 적절한 정제 방법의 예이지만, 당업자들은 사용된 정제 또는 생성의 방법에 의해 본 발명이 제한되지 않으며, 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 Cpn10 및 조성물을 제조하는 데 임의의 다른 방법을 사용할 수 있음을 이해할 것이다. Cpn10 펩티드는 엔도Lys-C, 엔도Arg-C, 엔도Glu-C 및 스태필로코커스 V8-프로테아제와 같은 1 이상의 프로테이나제를 사용한 폴리펩티드의 소화에 의해 제조될 수 있다. 소화된 펩티드 단편은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC) 기술에 의해 정제할 수 있다.

본 발명의 Cpn10 폴리펩티드의 정제는 대용량 생성 목적을 위해 규모화할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재한 바와 같이 본 발명자들은 E. coli에서 배치 발효에 의한 고 순도의 대량(그램)의 생성물인, 임상 단계의 Cpn10 폴리펩티드를 생성하기 위한 생물학적 제법을 개발하였다.

본 발명의 Cpn10 폴리펩티드뿐 아니라, 이의 단편 및 변이체는 또한 당업자에게 공지된 액상 또는 고상 화학의 표준 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어 이러한 분자들은 문헌[Steward and Young (Steward, J. M. & Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis. (2nd Edn.) Pierce chemical Co., Illinois, USA (1984)]의 고상 화학 절차에 따라 합성할 수 있다.

일반적으로, 이러한 합성 방법은 자라나는 펩티드 사슬에 대한 1 이상의 아미노산 또는 적절히 보호된 아미노산의 연속적인 추가를 포함한다. 전형적으로, 제1 아미노산의 아미노기 또는 카복실기 중 하나는 적절한 보호기에 의해 보호한다. 그 다음 보호된 아미노산을 비활성 고체 지지체에 부착하거나 또는 적절히 보호하고 아미드 결합을 형성하기에 적절한 상태 하에서 상보적인(아미노 또는 카복실) 기를 가지는 서열에 다음의 아미노산을 추가함으로써 용액에서 이용한다. 그 다음 이 새롭게 첨가된 아미노산 잔기로부터 보호기를 제거하고, 다음의(보호된) 아미노산을 첨가한다. 모든 목적하는 아미노산을 결합시킨 후, 임의의 남아있는 보호기, 및 필요한 경우 임의의 고체 지지체를 연속해서 또는 동시에 제거하여 최종 폴리펩티드를 생성한다.

Cpn10 폴리펩티드에서 아미노산 변화는 관련 분야의 당업자들에게 공지된 기술에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 변화는 적당한 판독 프레임을 달성한다는 조건하에 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 치환(보존적 및/또는 비보존적)을 비롯한 뉴클레오티드 교체 기술에 의해 실시할 수 있다. 실예가되는 기술은 무작위 돌연변이 생성, 자리 지정 돌연변이 생성, 올리고뉴클레오티드 조절되거나 또는 폴리뉴클레오티드 조절된 돌연변이 생성, 존재하거나 가공된 제한 효소 부위, 및 중합효소 사슬 반응을 이용하여 선택된 영역(들)의 결실을 포함한다.

본 발명의 Cpn10 폴리펩티드에 의한 면역조절 활성의 산출은 Cpn10 폴리펩티드의 헵타머(heptamer)의 형성을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 면역조절 활성의 시험은 당업자에게 알려진 다수의 기술 중 임의의 하나에 의해서일 수 있다. 본원에서 예로 들 바와 같이, Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성은 Toll양 수용체 TLR4로부터의 신호 전달을 조절하는 예를 들어 루시페라제 생물검정법을 이용한, 전형적으로 지질다당류와 같은 TLR4 작용제의 존재하에 폴리펩티드의 작용을 측정함으로써 결정한다. 대안적으로 또는 추가로, 면역조절 활성은 체외, 생체 외 또는 생체 내에서 다른 생물검정법을 이용하여, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포와 같은 세포에서 NF-kB 생성 또는 사이토카인의 생성의 측정을 통해 측정할 수 있다.

조성물 및 투여 경로

일반적으로, 본 발명의 방법에 따라 사용하기에 적절한 조성물은 당업자들에게 공지된 방법 및 절차에 따라 제조할 수 있으며, 그에 따라 약학적 허용 담체, 희석제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, Cpn10 조성물은 단지 Cpn10만을 포함하도록 제조하거나, 또는 약학적 허용 담체, 보조제 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물로서 제조할 수 있다. 대안적으로, Cpn10 조성물은 면역억제제를 더 포함할 수 있다.

면역억제제는 면역억제 약물 또는 B 또는 T 림프구에 대한 특정 항체, 또는 이들의 활성화를 매개하는 표면 수용체일 수 있다. 예를 들어, 면역억제 약물은 사이클로스포린, 타크로리무스, 시로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이토, 크로모글리칼레이트, 테오필린, 루코트리엔 길항제 또는 항히스타민, 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 또한 코르티코스테로이드와 같은 스테로이드를 더 포함할 수 있다.

조성물은 표준 경로에 의해 투여할 수 있다. 일반적으로, 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥 내, 척수 내, 피하 또는 근육 내), 경구 또는 국소적인 경로로 투여할 수 있다. 투여는 전신, 부위별 또는 국부적일 수 있다. 임의의 주어진 환경에서 사용된 투여의 특정 경로는 치료할 병태의 특성, 병태의 심각성 및 범위, 전달될 특정 화합물의 필요량 및 화합물의 잠재적인 부작용을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.

일반적으로, 적절한 조성물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있고, 약학적 허용 희석제, 보조제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 희석제, 보조제 및 부형제는 조성물의 다른 성분들과 융화하는 것에 의해 "허용"되어야 하고, 이의 수급자에게 해롭지 않아야 한다.

약학적 허용 담체 또는 희석제의 예는 탈염수 또는 증류수; 식염수; 식물성 오일, 예컨대 땅콩 오일, 홍화유, 올리브 오일, 면실유, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 홍화유, 올리브 오일, 면실유, 옥수수 오일, 호마유, 낙화생유 또는 야자유와 같은 호마 오일류; 실리콘 오일, 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산과 같은 폴리실록산; 휘발성 실리콘; 액체 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알렌과 같은 미네랄 오일; 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스과 같은 셀룰로오스 유도체; 저급 알칸올, 예를 들어 에탄올 또는 이소-프로판올; 저급 아랄칸올; 저급 폴리알켈린 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에텔 올레에이트와 같은 지방산 에스테르; 폴리비닐피리돈; 아가; 캐러기난; 트래거캔스 고무 또는 아카시아 고무를 비롯한 실리콘 오일 및 바세린(petroleum jelly)이다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 10 중량%∼99.9 중량%의 조성물을 형성할 것이다.

본 발명의 조성물은 주사에 의한 투여에 적절한 형태, 경구 섭취에 적절한 제형의 형태(예컨대 캡슐, 정제, 캐플릿, 엘릭시르), 국소적 투여에 적절한 연고, 크림 또는 로션의 형태, 점안제로서 운반하기에 적절한 형태, 비강 흡입 또는 경구 흡입과 같은 흡입에 의한 투여에 적절한 에어로졸 형태(예컨대 액체 또는 가루), 비경구 투여, 즉 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사에 적절한 형태일 수 있다.

주입가능한 용액 또는 현탁액으로서 투여를 위해, 비독성 비경구적 허용 희석제 또는 담체는 링거액, 등장 염수, 인산염 완충 염수, 에탄올 및 1,2-프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.

경구 사용을 위한 적절한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제의 몇몇 예는 땅콩 오일, 액체 파라핀, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로오스, 소듐 알지네이트, 아카시아 고무, 트래거캔스 고무, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함한다. 또한, 이들 경구 제형들은 적절한 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 캡슐 형태로 사용할 때, 캡슐은 분해를 지연시키는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 화합물로 코팅할 수 있다.

보조제는 전형적으로 완화제, 유화제, 농후제, 방부제, 살충제 및 완충제를 포함한다.

경구 투여용 고체 형태는 인간 및 수의 약학적 기준에 허용되는 결합제, 감미료, 분해제, 희석제, 향미제, 코팅제, 방부제, 윤활제 및/또는 지연제를 함유할 수 있다. 적절한 결합제는 아카시아 고무, 젤라틴, 옥수수 전분, 트래거캔스 고무, 소듐 알지네이트, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적절한 감미료는 수크로스, 락토스, 글루코스, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적절한 분해제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 구아 고무, 크산탄 고무, 벤토나이트, 알긴산 또는 아가를 포함한다. 적절한 희석제는 락토스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 카올린, 셀룰로오스, 탄산칼슘, 규산칼슘 또는 인산칼슘을 포함한다. 적절한 향미제는 페퍼민트 오일, 살리실산 메틸(oil of wintergreen), 체리, 오렌지 또는 라스베리 향미제를 포함한다. 적절한 코팅제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 이들의 에스테르의 중합체 또는 공중합체, 왁스, 지방성 알코올, 제인, 셀락 또는 글루텐을 포함한다. 적절한 방부제는 벤조산 나트륨, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 이황산 나트륨을 포함한다. 적절한 윤활제는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 올레산 나트륨, 염화나트륨 또는 탈크를 포함한다. 적절한 지연제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.

경구 투여용 액체 형태는 상기 작용제 외에도 액체 담체를 함유할 수 있다. 적절한 액체 담체는 물, 올리브유, 땅콩 오일, 호마유, 해바라기 오일, 홍화유, 낙화생유, 코코넛 오일과 같은 오일, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방성 알코올, 트리글리세라이드 또는 이의 혼합물을 포함한다.

경구 투여용 현탁액은 분산 작용제 및/또는 현탁 작용제를 더 포함할 수 있다. 적절한 현탁 작용제는 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 소듐 알지네이트 또는 아세틸 알코올을 포함한다. 적절한 분산제는 리세틴, 스테아르산, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 또는 디올레에이트, 모노스테아레이트 또는 디스테아레이트 또는 모노라우레이트 또는 디라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 또는 디올레에이트, 모노스테아레이트 또는 디스테아레이트 또는 모노라우레이트 또는 디라우레이트 등과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함한다.

경구 투여용 에멀션은 1 이상의 유화제를 더 포함할 수 있다. 적절한 유화제는 전술한 분산제 또는 구아 고무, 아카시아 고무 또는 트랜거캔스 고무와 같은 천연 고무를 포함한다.

비경구적으로 투여가능한 조성물의 제조 방법은 당업자에게 공지된 것이며, 예를 들어, 문헌[ Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 본원에 참고로서 포함됨]에 보다 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 국소적 제형은 1 이상의 허용 담체, 및 경우에 따라 임의의 다른 치료상 성분과 함께 활성 성분을 포함한다. 국소적 투여에 적절한 제형들은 치료가 필요한 부위의 피부를 통한 침투에 적절한 바르는 약, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코 투여에 적절한 점약과 같은 액체 또는 반액체 제제를 포함한다.

본 발명에 따른 점약은 멸균 수용액 또는 유성액 또는 현탁액을 포함한다. 이것들은 살충제 및/또는 살균제 및/또는 임의의 다른 적절한 방부제, 및 경우에 따라 표면 활성제를 포함하는 수용액에 활성 성분을 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 그 다음 얻어진 용액을 여과로 맑게 하고, 적절한 용기에 옮겨 멸균하였다. 멸균은 여과에 의해 90℃∼100℃에서 30분간 오토클래이브 처리 또는 유지하는 단계, 무균 기술에 의해 용기로 옮기는 단계로 달성할 수 있다. 점약의 함유물로 적절한 살충제 및 살균제의 예는 페닐수은산 질산염 또는 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로헥시딘 아세테이트(0.01%)이다. 유성액의 제조를 위한 적절한 용매는 글리세롤, 희석 알코올 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.

본 발명에 따른 로션은 피부나 눈에 적용하기에 적절한 것들을 포함한다. 눈 로션은 경우에 따라 살충제를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 점약의 제조와 관련하여 전술한 것과 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 바르는 약은 또한 피부를 건조하게 고정하는 작용제 및 피부를 차갑게 하는 작용제, 예컨대 알코올 또는 아세톤, 및/또는 글리세롤, 또는 피마자유 또는 낙화생유 등의 오일과 같은 모이스쳐를 포함한다.

본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외부의 적용을 위한 활성 성분의 반고체 제형이다. 그것들을 미분 또는 분말 형태로 활성 성분과 혼합하거나, 단독으로 또는 수성 또는 비수성 유체, 기름기 있는 또는 기름기 없는 주성분에 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있다. 상기 주성분은 경성, 연성 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속 비누와 같은 탄화수소; 점액; 아몬드, 옥수수, 낙화생, 피마자 또는 올리브 오일과 같은 천연 기원 오일; 울 지방 또는 이의 유도체, 또는 프로필렌 글리콜 또는 매크로골(macrogol)과 같은 알코올과 함께 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 포함할 수 있다.

조성물은 음이온성, 양이온성, 또는 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 비이온성 계면활성제 등의 임의의 적절한 계면활성제를 포함할 수 있다. 천연 고무, 셀룰로오스 유도체 또는 금속성 실리카와 같은 무기 물질, 및 라놀린과 같은 기타 성분 등의 현탁제를 또한 포함할 수 있다.

조성물은 또한 리포솜의 형태로 투여할 수 있다. 리포솜은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 성분으로부터 유도되고, 수성 배지에 분산된 단층 또는 다층의 수소화 액체 결정에 의해 형성될 수 있다. 리포솜을 형성할 수 있는 임의의 비독성, 생리학적 허용 및 대사성 지질을 사용할 수 있다. 리포솜 형태의 조성물은 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴), 천연 및 합성 둘 다이다. 리포솜을 형성하는 방법은 당업계에 공지된 것으로 이 특정 문헌[Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y. (1976), p. 33 et seq.]과 관련이 있고, 그 내용이 본원에 참고로 포함된다.

투여량

본 발명의 목적을 위해, 분자 및 작용제를 치료상 또는 예방상 조성물로서 피험체에게 투여할 수 있다. 치료상 사용에 있어서, 이미 질환을 겪고 있는 환자에게 질환 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로 조성물을 투여한다. 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 분자 또는 작용제를 제공하여야 한다.

임의의 특정 환자에게 치료상 효과적인 용량 정도는 의학에서 알려진 다른 연관 인자와 함께 다양한 인자: 치료할 병 및 이 병의 심각성; 사용한 분자 또는 작용제의 활성; 사용한 조성물; 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 분자 또는 작용제의 제거 속도; 치료의 기간; 치료하면서 병용하거나 동시에 사용한 약물에 따라 달라질 것이다.

당업자는 일상적인 실험에 의해 적용가능한 질환을 치료하는 데 요구되는 작용제 또는 화합물의 효과적인 비독성 양을 결정할 수 있다.

일반적으로, 효과적인 투여량은 24시간마다 체중(kg) 당 약 0.0001 mg∼약 1000 mg; 전형적으로, 24시간마다 체중(kg) 당 약 0.001 mg∼약 750 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 0.01 mg∼약 500 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 0.1 mg∼약 500 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 0.1 mg∼약 250 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 1.0 mg∼약 250 mg의 범위일 것으로 예상된다. 더욱 전형적으로, 효과적인 용량 범위는 24시간마다 체중(kg) 당 약 1.0 mg∼약 200 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 1.0 mg∼약 100 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 1.0 mg∼약 50 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 1.0 mg∼약 25 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 5.0 mg∼약 50 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 5.0 mg∼약 20 mg; 24시간마다 체중(kg) 당 약 5.0 mg∼약 15 mg의 범위일 것으로 예상된다.

대안적으로, 효과적인 투여량은 약 500 mg/m²이하일 수 있다. 일반적으로, 효과적인 투여량은 약 25 mg/m²∼약 500 mg/m², 바람직하게는 약 25 mg/m²∼약 350 mg/m², 더욱 바람직하게는 약 25 mg/m²∼약 300 mg/m², 또 더욱 바람직하게는 약 25 mg/m²∼약 250 mg/m², 더 더욱 바람직하게는 약 50 mg/m²∼약 250 mg/m², 또 더 더욱 바람직하게는 약 75 mg/m²∼약 150 mg/m²의 범위일 것으로예상된다.

전형적으로, 치료상 적용에서, 치료는 질환 상태의 지속기간 동안일 것이다.

또한, 개체별 최선의 투여량과 투여간격은 치료할 질환의 특성 및 범위, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료할 특정 개체의 특성에 의해 결정할 수 있음은 당업자에게 명백한 것이다. 또한, 이러한 최적의 상태는 통상적인 기술로 결정할 수 있다.

한정된 수일 동안 1 일당 주어진 조성물의 용량과 같은 최적의 치료 과정은 통상적인 과정의 치료 결정 시험을 이용하여 기술자가 확인할 수 있음은 또한 당업자들에게 명백할 것이다.

Cpn10 작용제 및 길항제

본 발명은 또한 Cpn10의 작용제 및 길항제의 사용 및 이러한 작용제 및 길항제의 스크리닝 및 생성 방법에 관한 것이다.

Cpn10 작용제 및 길항제는 TLR 신호 전달 및 면역조절제 분비에 대한 이들의 효과에 따라 특별히 디자인하거나 스크리닝할 수 있다.

항체는 Cpn10의 작용제 또는 길항제, 또는 이의 단편 또는 유사체로서 작용할 수 있다. 바람직하게는 적절한 항체는 Cpn10 폴리펩티드의 분리된 영역 또는 단편, 특히 프로테아제 활성 및/또는 파트너 또는 기질 결합을 수여하는 것과 관련이 있는 것들로부터 제조한다. 항원성 Cpn10 폴리펩티드는 약 5개 이상, 바람직하게는 약 10개 이상의 아미노산을 함유한다.

적절한 항체를 산출하는 방법은 당업자들이 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 전형적으로 Fab 부분을 함유하는 항Cpn10 단일클론 항체는 문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)]에 기재된 하이브리도마 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본질적으로, Cpn10, 또는 이의 단편 또는 유사체로 향하는 단일클론 항체의 제조에 있어서, 배양에서 연속적인 세포계에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 이것들은 문헌[Kohler et ah, 1975, Nature, 256:495-497]에 의해 근원적으로 개발된 하이브리도마 기술뿐 아니라, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al, 1983, Immunology Today, 4:72), 및 인간 단일클론 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77- 96, Alan R. Liss, Inc., (1985))을 포함한다. 불변의, 항체생성 세포계는 융합과는 다른 5가지 기술, 예컨대 종양 DNA를 이용한 B 림프구의 직접적인 변형, 또는 엡스타인바 바이러스의 감염에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [M. Schreier et al, "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al, "Monoclonal Antibodies" (1980)]을 참조.

요컨대, 단일클론 항체가 생성되는 하이브리도마를 생성하는 수단은, 골수종 또는 다른 자가영속 세포계를 이의 인식 인자 결합 부분, 또는 인식 인자, 또는 이의 기원-특정 DNA-결합 부분과 고도면역된 포유동물의 비장으로부터 얻어진 림프구와 융합한다. 본 발명을 수행하는 데 유용한 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마는 인식 인자와 면역반응하는 능력 및 표적 세포에서 특이적 전사 활성을 저해하는 능력에 의해 규명된다.

본 발명을 수행하는 데 유용한 단일클론 항체는 적당한 항원 특이성의 항체 분자를 분비하는 하이브리도마를 함유하는 영양 배지를 포함하는 단일클로 하이브리도마 배양을 시작함으로써 생성할 수 있다. 배양을 하이브리도마가 항체 분자를 배지에 분비하기에 충분한 조건 하에서 충분한 시간 동안 유지한다. 그 다음 항체를 함유하는 배지를 수집한다. 그 후 공지된 기술로 항체 분자를 더 단리할 수 있다.

유사하게, 다클론 항체의 생성에 사용할 수 있는 당업계에 알려진 여러 가지 절차들이 있다. 항Cpn10 다클론 5 항체의 생성을 위해, 여러 숙주 동물은 Cpn10, 또는 이의 단편 또는 유사체를 주사하여 면역시킬 수 있으며, 토끼, 닭, 쥐, 래트, 양, 염소 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, Cpn10 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유사체는 면역성 담체, 예를 들어, 보빈 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합할 수 있다. 또한, 면역학적 반응을 증가시키기 위해 여러 가지 보조제를 사용할 수 있으며, 프로인트(완성 및 미완성), 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀과 같은 표면 활성 성분, 및 BCG(결핵 예방 접종) 및 작은와포자충(bacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

목적하는 항체에 대한 스크리닝은 또한 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 수행할 수 있다. 항체의 면역특이적 결합에 대한 분석법은 방사선면역분석법, ELISA(효소결합 면역흡착제 분석법), 샌드위치 면역분석법, 면역방사분석의 분석법, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석법, 원위치 면역분석법, 웨스턴 블롯, 침전 반응, 교착 분석법, 보체 결합 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법, 및 면역전기영동 분석법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(예를 들어, 문헌 [Ausubel et ah, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). 항체 결합은 1차 항체 상에 검출가능한 표지에 의해 검출할 수 있다. 대안적으로, 항체는 적당히 표지 부수적인 항체 또는 시약과 이의 결합에 의해 검출할 수 있다. 다양한 방법들은 면역분석법에서 결합을 검출하기 위한 분야에 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에 있다.

Cpn10 또는 이의 단편 또는 유사체에 반하여 배양된 항체(또는 이의 단편)는 Cpn10에 대한 결합 친화도를 가진다. 바람직하게는, 항체(또는 이의 단편)는 약 10⁵ M^-1보다 큰, 더욱 바람직하게는 약 10⁶M^-1보다 큰, 더욱 바람직하게는 약 10⁷ M^-1보다 훨씬 큰, 가장 바람직하게는 약 10⁸M^-1보다 큰 결합 친화도 또는 결합성을 가진다.

본 발명에 따른 적절한 양의 항체를 얻음으로써, 혈청 유리 배지를 가진 배치 발효를 이용하여 항체(들)를 제조할 수 있다. 항체를 발효 후, 크로마토그래피 및 바이러스성 비활성화/제거 단계를 포함하는 다단계 절차에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 우선 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 분리한 후, 임의의 지질 외피보유 바이러스를 비활성화하는 용매/표백제로 처리할 수 있다. 전형적으로 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 추가 정제는 잔여 단백질, 용매/표백제 및 핵산을 제거하는 데 사용할 수 있다. 정제된 항체는 겔 여과 칼럼을 이용하여 추가 정제하고 0.9% 염수로 조제할 수 있다. 그 다음 제조된 벌크 조제물을 멸균하고, 바이러스 여과하고 분배할 수 있다.

또한, 항체가 아닌 작용제 및 길항제에 관한 것이다. 후보 작용제 또는 길항제는 1 이상의 TLR, 및/또는 이들의 어댑터 분자와 작용제로서 분자 착물을 형성하는 능력에 의해 규명할 수 있다. 또한, 후보 길항제는 Cpn10, 및 길항제로서 작용하는 1 이상의 TLRs 및/또는 이들의 어댑터 분자를 포함하는 분자 착물의 형성을 방지 또는 파괴하는 능력에 의해 규명할 수 있다.

결합 라이브러리와 같은 합성 화학물 라이브러리와 같은 분자 라이브러리의 스크리닝, 구조적 데이터베이스의 컴퓨터 보조 스크리닝, 컴퓨터 보조 모델링 및/또는 디자인, 또는 분자 결합 상호작용을 검출하는 더욱 전통적인 생물물리학적 기술을 비롯한 작용제 및 길항제를 규명 및 생성하기 위한 기술 및 절차들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.

이하, 본 발명을 특정 실시예와 관련하여 기술하지만, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 양의 집 먼지 진드기 천식 모델에서 Cpn10 의 효능 시험

기도 염증은 천식의 병인에 중심이며, 폐 조직 및 기관지폐포 공간으로의 호산구, 비만 세포, 호중구 및 림프구의 보충 및 활성화를 포함한다(Busse et al, 2001). 특정 IgE 및 IgG 체액성 반응을 나타내는 감작된 개체를 볼 때, 집 먼지 진드기가 인간에게서 알레르기성 천식을 유발하는 가장 일반적인 알레르겐으로 보인다(Roche et al, 1997). 천식의 적당한 동물 모델로 인간 질환과 직접 관련하여 한정되고 조절된 연구를 수행할 수 있다.

천식의 이전 양 모델은 선충류(Ascaris) 알레르겐에 감작된 동물을 기본으로 하고, 그 결과들로 잠재적인 항천식 약물의 생리학적 효과 및 약리학적 효과의 평가를 추정하였다. 인간 알레르기성 질환과 직접적인 관련이 있는 알레르겐으로서 집 먼지 진드기를 이용한 양의 알레르기성 폐 염증의 모델을 최근에 설계하였다. 이 모델에서, 감작된 양은 폐 조직으로의 호중구, 호산구 및 활성화된 림프구의 보충 및 HDM 알레르겐으로 항원 공격한 인간과 유사한 키네틱을 가진 BAL과 알레르겐-특정 IgE 반응을 나타낸다(Bischof et al, 2003).

정맥내 주사에 의해 투여되는지 또는 폐로 직접 스며들게 하여 투여되는지를 고려한 본원에 기재된 실험들은 감작된 양의 집 먼지 진드기 항원 공격에 대한 알레르기성 반응의 임상 및 면역학적 발현에 영향을 미칠 수 있다.

재료 & 방법

용해된 집 먼지 진드기 추출물로 양(n=10)을 면역시키고, 높은 알레르겐-특이적 IgE 반응 및 기관지폐포 세척(BAL) 호산성으로 선택하였다. 그 다음 동물을 정맥내 주사(n=5)로 전달된 Cpn10(0.5, 4, 또는 16 mg) 또는 비히클, 또는 광섬유(fibre-optic) 기관지경을 이용하여 HDM으로 항원 공격하기 이전에 폐의 한쪽 면으로의 직접적인 전달된 비히클 및 폐의 다른 쪽으로 전달된 비히클 중 하나로 처리하였다. 차별적인 세포 개체수, BAL 사이토카인 정량화, 및 혈청 IgE 정량화의 계산을 위해 6∼48 시간 및 7일 지난 HDM 항원 공격에서 기관지폐포 세척액 및 혈액 샘플을 수집하였다. BAL 세포를 또한 RNA 단리 배지(트리졸)에 저장하고, 다음의 RT-PCR 분석을 위해 냉동시켰다.

결과

일반적으로, 본원에 나타낸 결과들은 Cpn10이 천식의 양 모델에서 알레르기성 염증에 대한 극적이고 투여량 의존적 효과를 가진다는 것을 보여준다.

Cpn10 의 정맥 내 전달

Cpn10의 정맥 내 투여는 투여량 의존적 방식으로 6시간 시점에서 BAL 호중구의 감소를 초래하였다. Cpn10 치료 없이 오로지 두 번째 HDM 항원 공격 후 6시간에 BAL 중에 존재하는 호중구의 수는 정맥 내 그룹에 있는 모든 6 마리의 양 사이에서 평균 34%이었다. 그룹 평균으로서 나타낸 호중구의 퍼센트는 Cpn10의 투여량이 증가할수록 감소한다. 6시간의 시점에서, 0.5 mg, 4 mg 및 16 mg 투여량의 Cpn10은 각각 BAL 유액에서 15%, 12% 및 8% 호중구를 초래한다.

Cpn10의 정맥 내 투여는 투여량 의존적 방식으로 48시간의 시점에서 BAL 호 중구의 감소를 초래하였다. Cpn10 치료 없이 오로지 두 번째 HDM 항원 공격 후 48시간에 BAL 중에 존재하는 호산구의 수는 정맥 내 그룹에 있는 모든 6 마리의 양 사이에서 평균 31%이었다. 그룹 평균으로서 나타낸 호산구의 퍼센트는 Cpn10의 투여량이 증가할수록 감소한다. 48시간의 시점에서, 0.5 mg, 4 mg 및 16 mg 투여량의 Cpn10은 각각 BAL 유액에서 15%, 16% 및 11% 호산구를 초래한다.

Cpn10 폐 내 전달

6시간 및 48시간의 시점에서 BAL 호중구의 퍼센트는 대부분의 치료를 거친 개별적인 양의 우측 폐와 좌측 폐 사이에서 차이가 있었다. 하지만, 좌측(Cpn10 처리) 및 우측(비히클 처리) 폐 사이에 일정한 경향은 없었다. 6시간 및 48시간의 시점에서 BAL 호산구의 퍼센트도 또한 대부분의 치료를 거친 개별적인 양의 우측 폐와 좌측 폐 사이에서 차이가 있었다. 48 h 후 항원 공격에서 4 mg의 Cpn10 투여량을 제외하고는, 대체로 좌측(Cpn10 처리) 및 우측(비히클 처리) 폐 사이에 일정한 경향은 없었다. 각각의 양에서 BAL 호산구의 퍼센트는, 우측 대조구 폐에 비해 HDM 항원 공격 후 48시간에 4 mg(총 투여량)의 Cpn10을 투여한 좌측 폐에서 더 낮았다. 폐 내(i.l.) 그룹의 모든 양으로부터 평균 낸 데이터는 좌측 폐에 4 mg의 Cpn10을 국부 주입한 것이 호산구 증가증을 우측 폐(대조구, 비히클 처리)의 50%로 감소시킨 것을 보여준다.

IgE 반응의 기준선

도 5에 나타낸 바와 같이, 각각의 HDM 항원 공격 0일(d0) 및 7일(d7) 이전에 혈청 IgE 농도를 측정하였다. Cpn10(첫 번째 및 두 번째 HDM 항원 공격)의 부재 시, 혈청 IgE 농도는 HDM을 사용한 기도 항원 공격에 따라 분명하게 증가했다. 양 #23은 초기의 HDM 항원 공격에 따른 높은 IgE 반응을 나타내지 않은 유일한 양이었다. 첫 번째 HDM 항원 공격 전의 IgE 농도 기준선에 비해, 두 번째 및 세 번째 HDM 항원 공격 이전에 d0 IgE 농도가 살짝 증가하였다; 각각의 경우에 이것은 2주 전 HDM 항원 공격에 따른 기준선으로의 느린 복귀를 반영할 수 있다.

Cpn10 의 존재하에 HDM 항원 공격 에 대한 IgE 반응

투여량 또는 전달 방식과 상관없이, Cpn10은 7일 후 HDM 항원 공격에서 측정된 바와 같이 HDM-특이적 혈청 IgE 반응에 대해 두드러진 효과를 나타내었다. Cpn10의 투여는 혈청 IgE 반응을 막아, 4번째 및 5번째 HDM 항원 공격으로 특히 명백한 기준선 농도 근처에서 유지하였다.

기관지폐포 세척 호산구

BAL을 기준선(0h), 6h 및 48h 후 기도 HDM 항원 공격에서 샘플링하고, 약물 치료 및 계산된 호산구의 수를 세었다. 데이터에 대한 결과들은 48시간 후 HDM 항원 공격에 샘플링한 세척액의 총 세포 개체수 중 호산구 퍼센트로서 도 1에 그래프로 나타내었다.

HDM 항원 공격 이전에 투여된 Cpn10의 정맥 내 주사는 BAL에서 48시간 후 항원 공격에서 호산구 보충 피크의 호산구 증가증을 최대 15배 감소시키는 결과를 초래하였다.

Cpn10를 좌측 폐로 일방적으로 투여하고 광섬유 기관지경을 이용하여 단지 우측(대조구) 폐에만 주어진 비히클을 투여할 때, 대조구 폐에 대해 Cpn10-처리한 폐로부터 BAL에서 호산구 퍼센트가 4배 감소하였다.

HDM 항원 공격 에 대한 혈청 면역글로불린 반응

비히클 또는 Cpn10과 HDM 항원 공격 중 하나의 투여를 수행하여 0일 및 7일에 혈청을 수집하였다. 그 다음 혈청들을 시험하여, 문헌[Bischof et al, 2003]에 기재된 ELISA를 사용하여 HDM-특정 IgE 농도를 평가하고, 그 결과들을 본원에 도 2로서 나타내었다. 데이터는 비히클 대조구를 투여한 HDM 항원 공격을 수행하고, 4 mg Cpn10 및 HDM 항원 공격을 수행한 HDM-특정 IgE의 혈청 농도를 가리킨다.

기도 상피, 배상 세포 및 기관지선 변화

배상 세포

배상 세포 비대증은 기도의 알레르기성 염증에 의해 유발되는 천식 병리학의 뚜렷한 특성이다. 알레르겐 자극 후, 기도 상피세포의 단위 길이당 배상 세포의 수는 증가하는 것으로 알려져 있다. 수가 증가함에 따라, 배상 세포 또한 크기가 증가하고, 조직학적 염색으로 염색할 때 복합적인 컬러의 세포질을 나타낸다. PAS/알시안 블루 염색한 조직학적 슬라이드 상에서 기도 상피세포, 배상 세포 및 기관지선의 분석을 수행하였다. 이 분석은 직경이 1800∼3300 ㎛인 연골성 및 선이 있는 기관지의 기도 상에서 수행하였다.

HDM -항원 공격 양에게 Cpn10 의 폐 내 투여: 기도 기저막의 mm당 배상 세포의 평균 수는 좌측 및 Cpn10을 폐 내 투여한 양(n=4 양)의 폐에서 33이었다. 배상 세포는 크고 전체 블루 및 레드 염색된 입자들이었다(도 5).

HDM -항원 공격 양에게 Cpn10 의 정맥 내 투여: 폐 내 전달 그룹에 비해, i.v. 경로를 통해 4 mg의 Cpn10으로 처리한 양의 기관지 상피세포에서 배상 세포가 더 적다. 기도 기저막 mm당 배상 세포의 평균 수는 i.v. Cpn10을 투여한 양(n=6 양)에서 16이었다. 비히클 처리한 폐 내 그룹(기도 기저막 mm당 33 배상 세포)의 배상 세포 수의 절반보다 적다. i.v. Cpn10 그룹의 배상 세포는 일반적으로 덜 성숙해서, 더 작고, 더욱 입방형이고, 세포질 염색이 덜 된다.

상피세포

기도의 안쪽을 대는 상피세포는 공기로 운반되는 이물질에 대한 1차 장벽을 형성함으로써 천식 증상에서 중요한 조직 성분으로 알려져 있다.

HDM -항원 공격 양에게 Cpn10 의 폐 내 투여: 비히클 및 Cpn10 폐 내 그룹 둘 다에서, 기도 상피세포는 더욱 원주형이고 어느 정도 기도 증식성이었다(도 5).

HDM -항원 공격 양에게 Cpn10 의 정맥내 투여: 폐 내 그룹과 반대로, 기도 상피세포가 더욱 입방형이었다(도 6).

기관지선

알레르겐 자극 후 기관지 기도와 연관이 있는 선을 자극하여 선 루멘으로 점액을 분비할 수 있다. PAS/알시안 블루 조직적 염료로 염색할 때, 점액질은 레드(중성 무친을 표시) 또는 블루(산 무친을 표시) 염색될 수 있다.

HDM -항원 공격 양에게 Cpn10 의 폐 내 투여: PAS/알시안 블루 염색된 조직적 슬라이드의 분석을 통해, 폐 내 처리한 두 그룹 양의 기관지선이 HDM 항원 공격 및 Cpn10/ 비히클 치료 후 48시간에 점액질을 분비한다는 것을 밝혀냈다(도 5). 2마리 양에서 점액질이 PAS로 레드 염색된 한편(도 5), 다른 2마리 양에서 점액질이 두드 러지게 블루로 염색되었다. 각각의 양에서 평가될 수 있는 모든 기관지선의 체계적 분석은 평균적으로 기관지선 루멘이 비히클 처리한 폐에서 점액질로 23% 폐색되고, Cpn10 처리한 폐(n=4 양)에서 27% 폐색되는 것을 보여주었다.

HDM -항원 공격 양에게 Cpn10 의 정맥 내 투여: i.v. 처리한 양의 선 루멘에 존재하는 점액이 폐 내 그룹에서 관찰된 것에 비래 확연하게 적었다(도 6). PAS/알시안 블루 염색된 조직적 슬라이드를 분석하여 i.v. 처리한 양의 기관지선이 HDM 항원 공격 및 i.v. Cpn10 치료 48시간 후 적은 양의 루멘 점막을 가지는 것을 밝혀냈다. 점액질은 두드러지게 블루 색깔이었다(예를 들어, 도 6). i.v. 처리한 양에서 측정가능한 모든 기관지선의 체계적 분석은 평균적으로 기관지선 루멘이 점액질로 4.8% 폐색되는 것을 보여주었다(n=6 양).

고찰

이 실험으로부터 얻은 데이터는, 전신에 전달된 Cpn10이 천식의 병리생리학의 기초가 되는 알레르기성 염증을 완화시키는 능력을 가진다는 것을 보여준다. 호중구, 호산구 및 IgE 항체는 모두 천식과 연관된 염증의 중요한 성분으로 알려져 있다. 이 실험은 HDM 항원 공격 후 BAL에서의 호산구 증가증 및 호중구 증가증 및 혈청에서 HDM-특이적 IgE의 농도에 대한 확연한 억제 효과를 가진다는 것은 보여준다.

인간 천식과 연관된 천식 유발 알레르겐에 감작된 양으로의 Cpn10 투여 평가는 항원 항원 공격 48시간 후에 기관지폐포 공간에 축적하는 호산구가 투여량에 반응하여 감소한다는 것을 보여준다. HDM-항원 공격한 양의 BAL에서 호산구 증가증은 인간 천식환자에게서 관찰되는 호산구의 농도와 유사하다(Metzger et al, 1987). 이 연구에 사용된 모델의 다른 특성은 비알레르기성 및 대조구 양에 비해 높은 특정 IgE 혈청 적정 농도를 나타내는 양(즉, 알레르기성 양)이 국부적으로 HDM으로 항원 공격될 때 증가되고 연장된 BAL 호산구 증가증을 산출한다는 것이다(Bischof, 2003).

Cpn1의 i.v. 투여는 알레르기성 염증을 감소시키는 명백한 투여량 의존적 효과를 가진다. 높은 Cpn10 투여량(16 mg)이 BAL에서 호중구 및 호산구의 퍼센트를 감소시키는 데 가장 효과적이었다. 4 mg 투여량 및 두번째 HDM만 항원 공격한 실험에 대해 동일한 시점에서 계수한 호산구에 비해, 16 mg의 Cpn10 투여량은 또한 항원 공격 24시간 및 48시간 후에 혈액 호산구의 농도에 대한 확연한 억제 효과를 가졌다.

Cpn10은 실험 기간에 걸쳐 표준 생리학적 범위 내에 유지된 양의 주요 임상적 징후를 볼 때, 실험을 거친 양에 대해 부적당한 효과를 가지지 않는 것으로 보였다. 이것은 Cpn10을 i.v. 또는 i.l. 경로를 통해서 전달하든지 상관없이 투여한 모든 양에 대해서 양이 잘 견딘다는 것을 나타낸다.

후 검시에서 동물의 조직적 분석은 몇 가지 흥미로운 주안점을 초래하였다. Cpn10 4 mg의 i.v. 투여는 알레르기성 염증과 연관된 다수의 병상 변수들을 확연하게 감소시켰다. 대체로, i.v. 처리된 양은 기도벽으로의 염증 세포 침입이 적게 하고, 덜 성숙한 배상 세포를 적게하고, 기관지선의 루멘에 점액질 함유량을 감소시켰다. 비히클(대조구) 및 Cpn10 주입된 폐 사이의 병상 범위에서 차이점은 거의 보 이지 않았다. 대체로 폐 내 항원 공격한 양은 HDM-항원 공격한 동물에서만 발견되는 유사한 병상을 가졌다.

요컨대, 이 실험은 Cpn10이 천식의 염증 성분의 기초를 이루는 핵심을 감소시키는 능력을 가진다는 것을 명백하게 증명하였다.

실시예 2: 치료용 조성물

본원에서 제공한 발명을 수행하는 최선의 방식에 따라, 하기에 특히 바람직한 조성물의 윤곽을 나타내었다. 후술하는 내용은 조성물의 단지 설명을 위한 실시예를 든 것일 뿐, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 2(A): 비경구 투여용 조성물

비경구 주사용 조성물은 10 ㎖∼2 ℓ의 1% 카복시메틸셀룰로스 중 본원에 개시된 적절한 작용제 또는 화합물 0.05 mg∼5 g을 함유하도록 제조할 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입용 조성물은 멸균 링거액 250 ㎖, 및 본원에 개시된 적절한 작용제 또는 화합물 0.05 mg∼5 g을 포함할 수 있다.

실시예 2(B): 경구 투여용 조성물

캡슐 형태인 적절한 작용제 또는 화합물의 조성물은 표준 2조각의 단단한 젤라틴 캡슐을, 분말 형태의 작용제 또는 화합물 500 mg, 락토스 100 mg, 탈크 35 mg 및 스테아르산 마그네슘 10 mg으로 충진하여 제조할 수 있다.

참고 문헌

Busse WW, Lemanske RF Jr. Asthma. N Engl J Med 2001; 344:350-62.

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Bischof RJ, Snibson K, Shaw R, Meeusen ENT. Induction of allergic inflammation in the lungs of sensitized sheep after local challenge with house dust mite. Clin Exp Allergy 2003; 33:367-75.

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Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly 85 90 95 Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp 100 <210> 3 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met 20 25 30 Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 35 40 45 Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser 50 55 60 Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys 65 70 75 80 Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile 85 90 95 Leu Gly Lys Tyr Val Asp 100 <210> 4 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met 20 25 30 Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 35 40 45 Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser 50 55 60 Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys 65 70 75 80 Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile 85 90 95 Leu Gly Lys Tyr Val Asp 100 <210> 5 <211> 309 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggcaggac aagcgtttag aaagtttctt ccactctttg accgagtatt ggttgaaagg 60 agtgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attatgcttc cagaaaaatc tcaaggaaaa 120 gtattgcaag caacagtagt cgctgttgga tcgggttcta aaggaaaggg tggagagatt 180 caaccagtta gcgtgaaagt tggagataaa gttcttctcc cagaatatgg aggcaccaaa 240 gtagttctag atgacaagga ttatttccta tttagagatg gtgacattct tggaaagtac 300 gtagactga 309 <210> 6 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgggtgcgg gccaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt gctggttgaa 60 cgtagcgcgg cggaaaccgt gaccaaaggc ggcattatgc tgccggaaaa aagccagggc 120 aaagtgctgc aggcgaccgt ggttgcggtt ggcagcggca gcaaaggcaa aggcggcgaa 180 attcagccgg tgagcgtgaa agtgggcgat aaagtgctgc tgccggaata tggcggcacc 240 aaagtggtgc tggatgataa agattatttt ctgttccgcg atggcgatat tctgggcaaa 300 tatgtggatt ga 312 <210> 7 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Arg Ser Ala Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 20 25 30 Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser 35 40 45 Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys 50 55 60 Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile 65 70 75 80 Leu Gly Lys Tyr Val Asp 85 <210> 8 <211> 264 <212> DNA <213> Synthetic <400> 8 atggcggcgg gtcaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt tctggttgaa 60 cgtagcgcgg gcaaagttct gcaggcgacc gttgttgcgg ttggtagcgg cagcaaaggt 120 aaaggcggtg aaattcagcc ggttagcgtg aaagtgggcg ataaagttct gctgccggaa 180 tatggcggca ccaaagttgt gctggatgat aaagattact tcctgttccg cgatggtgat 240 atcctgggca aatacgtgga ttaa 264 <210> 9 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 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Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val 35 40 45 Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp 50 55 60 Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp 65 70 75 <210> 12 <211> 243 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60 aggagtgctg gaaaagtatt gcaagcaaca gtagtcgctg ttggatcggg ttctcaacca 120 gttagcgtga aagttggaga taaagttctt ctcccagaat atggaggcac caaagtagtt 180 ctagatgaca aggattattt cctatttaga gatggtgaca ttcttggaaa gtacgtagac 240 tga 243 <210> 13 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Phe 20 25 30 Ile Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 35 40 45 Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser 50 55 60 Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys 65 70 75 80 Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile 85 90 95 Leu Gly Lys Tyr Val Asp 100 <210> 14 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60 aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcattttca ttccagaaaa atctcaagga 120 aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180 attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240 aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300 tacgtagact ga 312 <210> 15 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Ile 20 25 30 Ile Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 35 40 45 Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser 50 55 60 Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys 65 70 75 80 Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile 85 90 95 Leu Gly Lys Tyr Val Asp 100 <210> 16 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60 aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcattataa ttccagaaaa atctcaagga 120 aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180 attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240 aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300 tacgtagact ga 312 <210> 17 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 35 40 45 Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser 50 55 60 Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys 65 70 75 80 Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile 85 90 95 Leu Gly Lys Tyr Val Asp Leu Glu His His His His His His 100 105 110 <210> 18 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60 aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcgaagagg aaccagaaaa atctcaagga 120 aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180 attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240 aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300 tacgtagacc tcgagcacca ccaccaccac cactga 336

Claims

유효량의 진핵생물 샤페로닌 10을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에게서 과민 반응을 저해하는 방법.
제1항에 있어서, 과민 반응은 호염구, 호산구, 비만 세포, 호중구 및 림프구를 포함하는 군에서 선택되는 세포의 활성화를 수반하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 과민 반응은 Toll양 수용체(TLR) 신호 전달의 활성화를 수반하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 과민 반응은 고 농도의 호산구 및 면역글로불린 E를 수반하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 과민 반응은 염증 반응인 방법.
제5항에 있어서, 과민 반응은 식품 알레르기, 피부염, 알레르기성 결막염, 비염, 습진, 아나필락시스 및 기도 염증과 연관된 호흡기 질환을 포함하는 군에서 선택되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 호흡기 질환은 천식, 알레르기성 천식, 내인성 천식, 직업성 천식, ARDS(급성 호흡 곤란 증후군) 및 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)를 포함하는 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵생물 샤페로닌 10은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17을 포함하는 군에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18을 포함하는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인 방법.
피험체의 과민 반응과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 샤페로닌 10을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 샤페로닌 10이 Toll양 수용체로부터의 신호 전달을 조절하는 것인 방법.
제10항에 있어서, Toll양 수용체는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR10을 포함하는 군에서 선택되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 진핵생물 샤페로닌 10은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17을 포함하는 군에서 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18을 포함하는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 첨가제의 투여를 더 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 첨가제는 면역조절제인 방법.
제15항에 있어서, 면역조절제는 I형 인터페론인 방법.
제16항에 있어서, 인터페론은 IFNα 또는 IFNβ인 방법.
피험체의 과민 반응과 연관된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물로서, 면역억제제와 함께 유효량의 샤페로닌 10을 포함하는 조성물.
제18항에 있어서, 면역억제제는 항염증 화합물 및 기관지확장 화합물을 포함 하는 군에서 선택되는 것인 조성물.
제18항에 있어서, 면역억제제는 사이클로스포린, 타크로리무스, 시로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트, 크로모글리칼레이트, 테오필린, 루코트리엔 길항제, 및 항히스타민, 또는 이의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 것인 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제는 B 또는 T 림프구에 대해 유도된 특이적 항체인 조성물.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제는 활성화를 매개하는 B 또는 T 림프구 표면 수용체에 대해 유도된 특이적 항체인 조성물.
제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 스테로이드를 더 포함하는 조성물.
피험체의 과민 반응과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 샤페로닌 10은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17을 포함하는 군에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18을 포함하는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인 조성물.