CN101330922A

CN101330922A - 超敏的治疗

Info

Publication number: CN101330922A
Application number: CNA2006800474374A
Authority: CN
Inventors: 安德鲁·约翰·休伯特·吉尔林; 芭芭拉·简·约翰逊
Original assignee: CBio Ltd
Current assignee: CBio Ltd
Priority date: 2005-10-20
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2008-12-24
Also published as: WO2007045046A1; JP2009511610A; KR20080075505A; CA2626692A1; EP1951282A1; EP1951282A4; BRPI0617681A2; US20090087410A1

Abstract

本发明涉及一种抑制受试者体内超敏反应的方法，其中所述方法包含给予有效量的伴侣蛋白(10)。

Description

超敏的治疗

技术领域

本发明涉及通过给予有效治疗量的真核伴侣蛋白10(Cpn10)进行超敏的治疗，具体而言，本发明涉及真核Cpn10在超敏相关变应性病症(包括哮喘)的治疗中的用途。

背景技术

个体被特定抗原或者抗原组合致敏后，后续的暴露会引起极度的变应性反应，这可能是有害甚至是致命的。当适应性免疫应答以一种放大的或不当的形式出现的时候，经历该反应的所述个体就被称为是超敏的。

超敏反应是免疫应答不当作用的结果，可以由多种抗原诱发。当针对无害的环境抗原例如花粉或尘螨产生IgE应答的时候，会出现一种形式的超敏。IgE致敏的肥大细胞由此释放药理学介质，从而产生具有例如哮喘或鼻炎等症状的急性炎症反应。

本发明基于一项令人意外的发现，即真核Cpn10可以抑制超敏反应，包括哮喘。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供一种抑制受试者体内超敏反应的方法，其中所述方法包含给予有效量的真核伴侣蛋白10。

根据本发明的第二方面，提供一种用于治疗或预防受试者体内超敏反应相关的病症的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的真核伴侣蛋白10，其中所述伴侣蛋白10调节来自Toll样受体的信号传导。

根据本发明的第三方面，提供一种用于治疗或预防受试者体内超敏反应相关的病症的组合物，所述组合物包含有效量的真核伴侣蛋白10，和至少一种同步疗法。

根据本发明的第四方面，提供一种用于治疗或预防受试者体内超敏反应相关的病症的方法，所述方法包含给予有效量的根据本发明第三方面的组合物。

所述超敏反应可能涉及嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的激活，并且可能涉及Toll样受体(TLR)信号传导的激活。所述超敏反应可以反映高水平的嗜酸性粒细胞和免疫球蛋白E。

超敏反应的一个实例是炎症反应。更具体地，超敏反应的实例包括食物过敏、皮炎、变应性结膜炎、鼻炎、湿疹、过敏反应和气道炎症相关的呼吸系统疾病。这些呼吸系统疾病的实例包括哮喘，例如变应性哮喘、内源性哮喘和职业性哮喘。

TLR激活在从ARDS(急性呼吸窘迫综合征)到哮喘和COPD(慢性阻塞性肺病)的炎症性肺疾病的病原学中起重要作用。所述Toll样受体可以选自于：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。

真核伴侣蛋白10可以是天然来源的、重组产生的或者合成产生的伴侣蛋白10。所述真核伴侣蛋白10可以来源于哺乳动物。所述伴侣蛋白10可以是人伴侣蛋白10。

所述伴侣蛋白10可以包含如SEQ ID NO：1、2、3、4、7、9、11、13、15或17列出的多肽序列。所述伴侣蛋白10可以是乙酰化的或非乙酰化的。所述伴侣蛋白10可以没有或者基本上没有蛋白折叠活性。

所述真核伴侣蛋白10可以以编码伴侣蛋白10的多核苷酸的形式给药。所述编码伴侣蛋白10的多核苷酸可以位于一个遗传构建体中，并可操作地连接有一个启动子。

所述真核伴侣蛋白10可以由一条可包含SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18中所列序列的多核苷酸编码。

所述方法还可以包含给予至少一种其他试剂。所述试剂可以是免疫调剂。所述免疫调节剂可以是I型干扰素，例如IFNα或IFNβ。

所述同步疗法可以包括给予例如如下的试剂：抗炎化合物、支气管舒张化合物(bronchodilatory compound)或免疫抑制剂，或者它们的组合。

所述免疫抑制剂可以是免疫抑制药物或针对B或T淋巴细胞的特异性抗体，即抗例如IL-3、IL-5、IL-13、GM-CSF等细胞因子或介导所述细胞激活的表面受体(包括IgE和Fcε受体)的抗体。

所述免疫抑制药物可以是色甘酸盐(chromoglycalates)、茶碱(theophylline)、白三烯拮抗剂、抗组胺剂或者它们的组合。

根据所述第三方面的组合物还可以包含皮质类固醇。

上述的各方面和实施方案考虑了使用野生型和修饰形式的真核伴侣蛋白10(包括哺乳动物伴侣蛋白10，例如人伴侣蛋白10)，以及全长的伴侣蛋白10多肽和其保持免疫调节活性的片段或衍生物。

定义

在本说明书的上下文中，术语“包含”是指“主要包括，但不是排他的”。而且，单词“包含”的变形，例如动词形式的“包含”和第三人称单数动词形式的“包含”具有相应的相同意义。

本文使用的术语“治疗”、“疗法”和它们的变化形式是指下述任何和所有的应用：矫正疾病状态或症状；预防疾病形成；或者另外不管以何种方式预防、阻碍、延缓或反转疾病或其他不良症状的进程。

本文使用的术语“有效量”的含义包括试剂或化合物的无毒性但足以提供所需的治疗或预防效果的的量。所需的精确量随受试者的不同而不同，依赖的因素例如所治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、所治疗病症的严重度、给予的具体药剂以及给药模式等等。因此，不可能具体给出精确的“有效量”。然而，对于任何给定病例，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅仅使用常规实验而确定。

术语“多肽”是指由氨基酸通过肽键连接起来组成的多聚体。术语“多肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，然而就本发明而言“多肽”可以是全长蛋白的一部分。

本文使用的术语“多核苷酸”是指由以下单元组成的单链或双链的多聚体：脱氧核糖核苷酸碱基、核糖核苷酸碱基或已知类似物或者天然核苷酸，或者它们的混合物。

本文使用的术语“调节”、“调制”和它们的变化形式是指：存在本发明的特定调节分子或试剂的时候，一种分子的活性、产生、分泌或发挥功能的水平，比不存在所述调节分子或试剂的时候的其活性、产生、分泌或其他功能水平升高或降低。这些术语并不是指定量的升高或降低。所述调节可以是能够产生所需效果的任何幅度，并且可以是直接的或间接的。

本文使用的术语“免疫调节剂”是指由一种或多种细胞类型分泌的分子介导物，其在免疫应答的激活、维持、成熟、抑制、阻遏或强化中起作用。

附图和序列表说明

下面将参考附图通过仅作为非限制性实例的方式对本发明进行描述。

图1.绵羊支气管肺泡灌洗液(BAL)中计数的总细胞中嗜酸性粒细胞的百分数，所述绵羊(每组n＝5)经如下方式处理：(A)静脉内送递载体、0.5、4或16mg Cpn10；或者(B)将载体、0.5或4mg Cpn10直接送递至左肺叶，将载体送递至右肺叶；之后用房尘螨(HDM)激发。灌洗液样品取自HDM激发后48小时。

图2.A.4mg Cpn10静脉内注射给药组在HDM激发前(d0)和激发后(d7)的HDM特异性IgE水平。B.4mg Cpn10肺内给药组在HDM激发前(d0)和激发后(d7)的血清IgE的水平。

图3.在房尘螨(HDM)激发后48小时，来自两只绵羊的代表性的细支气管气道。所述绵羊在HDM激发前由肺内注入载体(1)或者单次静脉内注射4mgCpn10(2)。注意到侵润炎症细胞完全包围了载体对照绵羊的气道(箭头)，而在HDM激发前静脉内给予Cpn10的绵羊的气道中基本上没有上述细胞(x100H&E)。

图4.在房尘螨(HDM)激发后48小时，来自两只绵羊的代表性的终末细支气管。所述绵羊在HDM激发前由肺内输注载体(1)或者单次静脉内注射4mgCpn10(2)。注意到侵润炎症细胞包围了载体对照绵羊的气道(箭头)，而在HDM激发前静脉内给予Cpn10的绵羊的气道中基本上没有上述细胞(x100H&E)。

图5.在HDM激发和肺内给予载体后48小时，#6绵羊支气管气道的高倍显微照片(对照)。注意到PAS染色的红色粘液完全阻塞了支气管腺腔(箭头)。还注意到杯形细胞和上皮细胞超常增生以及粘液衬里的气道腔。(x400阿辛蓝PAS染色)

图6.在HDM激发和静脉内注射4mg Cpn10后48小时，#44绵羊支气管气道的显微照片。注意到支气管腺腔中基本上没有粘液，除了小区域的蓝色粘液位于该腺体的左侧(箭头)。也注意到杯形细胞和上皮细胞衬里的气道腔是更典型的未激发动物的气道腔。(x250阿辛蓝PAS染色)

序列表：SEQ ID NO：1示出野生型的人Cpn10(GenBank登记号X75821)的氨基酸序列。SEQ ID NO：2、3和4示出在N端有其他氨基酸残基的两种Cpn10氨基酸序列修饰形式。SEQ ID NO：5和6示出编码上述氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO：7示出含有移动环(mobile loop)缺失的另一种修饰形式的野生型人Cpn10。SEQ ID NO：8示出编码上述氨基酸序列的核苷酸序列。另外，SEQ ID NO：13、15和17示出含有移动环中的缺失的其他修饰形式的野生型人Cpn10。SEQ ID NO：14、16和18示出编码上述氨基酸序列的核苷酸序列。其他修饰形式的野生型的人Cpn10包括β发夹顶环(Beta hairpin roofloop)的缺失(SEQ ID NO：9)或者移动环和β发夹顶环都缺失(SEQ ID NO：11)。SEQ ID NO：10和12示出编码上述氨基酸序列的核苷酸序列。

具体实施方式

气道炎症对于哮喘发病机制非常重要，并且涉及嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞在肺组织和支气管肺泡空间的募集和激活(Busse et al，2001)。已显示房尘螨抗原是引起人变应性哮喘的最常见变应原，被致敏的个体产生特异性IgE和IgG的体液应答(Roche et al，1997)。合适的哮喘动物模型可将研究工作限定并控制在与人类疾病直接相关的方向上。

通过评估Cpn10在绵羊哮喘模型中的调节效果，对本发明进行举例说明。然而，应理解所述概念适用于其他超敏反应类型的病症。

以前的绵羊哮喘模型是基于线虫(蛔虫)变应原致敏的动物，以及被外推用于潜在抗哮喘药物的生理和药理效果评估的结果。最近已经确立使用房尘螨作为变应原的绵羊变应性肺炎症模型，这一模型与人变应性疾病直接相关。在该模型中，致敏的绵羊产生变应原特异性IgE应答，有嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和激活的淋巴细胞在肺组织和BAL中的募集，并与HDM变应原激发的人有类似的动力学(Bischof et al，2003)。

本发明提供一种用于抑制受试者体内超敏反应的方法，其中所述方法包括给予有效量的真核伴侣蛋白10。

Cpn10

根据本发明的各方面和实施方案，对需要治疗的受试者给予有效量的真核Cpn10(例如人Cpn10)，它也被称为热休克蛋白10kDa(Hsp10)。例如，如果待治疗的受试者是人，那么所述Cpn10多肽是人Cpn10多肽。本领域技术人员应理解，准确确定的依照本发明使用的Cpn10可以有所变化，这依赖于例如待治疗的物种等多种因素，从而选择的Cpn10可以源自于所治疗的物种。

所述Cpn10通常为重组Cpn10。Morton et al.，2000(Immunol Cell Biol78：603-607)、Ryan et al.，1995(J Biol Chem 270：22037-22043)和Johnsonet al.，2005(J Biol Chem 280：4037-4047)中描述的方法是合适的重组Cpn10蛋白制备方法的实例，但是技术人员应理解本发明并不受所使用的纯化或制备方法的限制，并且可以使用任何其他方法产生Cpn10以应用于根据本发明的方法和组合物中。

应用于本发明的真核Cpn10多肽或肽片段可以使用标准的重组核酸技术获得，也可以例如使用常规的液相和固相合成技术来合成。Cpn10肽可以通过使用一种或多种蛋白酶消化多肽产生，所述蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶。所述消化的肽片段可以通过例如高效液相色谱(HPLC)技术纯化。

本发明的实施方案也考虑给予编码真核Cpn10的多核苷酸。在这种情况下，所述多核苷酸一般可操作地连接有一个启动子，以使得在将所述多核苷酸给予受试者之后产生合适的多肽序列。所述多核苷酸可以通过载体给予受试者。所述载体可以是质粒载体、病毒载体或者任何其他适合于外源序列插入、导入真核细胞以及导入序列的表达的合适载体。所述载体通常为真核表达载体，并且可以包含表达控制和加工序列，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化信号和转录终止序列。所述用于给药的核酸构建体可以包括裸DNA，也可以是组合物的形式，并连同一种或多种可药用载体。

所述真核Cpn10多肽可以具有SEQ ID NO：1、2、3、4、7、9、11、13、15或17中列出的氨基酸序列。编码Cpn10的多核苷酸的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18中列出的序列，或者显示与其有足够的序列同一性以至于能与SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18的序列杂交的序列。在另外的实施方案中，所述多核苷酸的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18中列出的序列有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文使用的术语“多肽”和“多核苷酸”的范围包括它们的片段和变体。仅作为例子，在WO 95/15338和PCT/AU2006/001278(它们公开的内容通过引用的方式纳入本文)中描述的Cpn10的肽片段可以根据本发明的方面和实施方案使用。

术语“片段”是指编码全长Cpn10蛋白一部分的核酸序列，或者指作为全长Cpn10蛋白一部分的多肽序列。多肽形式的片段在性质上具有与全长蛋白相同的生物活性。根据本发明使用的Cpn10的生物活性片段通常可以具有相应全长蛋白的至少约50％的免疫调节活性，更通常地具有至少约60％的这种活性，更通常地具有至少约70％的这种活性，更通常地具有至少约80％的这种活性，更通常地具有至少约90％的这种活性，并且更通常地具有至少约95％的这种活性。

如本文进一步所述，本发明人也已经证明在Cpn10的N端添加甘氨酸残基会增加它的免疫调节活性。考虑到了乙酰基或与乙酰基结构同源的氨基酸(例如丙氨酸残基或甘氨酸残基)的存在会增加Cpn10的免疫调节活性。

本文使用的术语“变体”是指基本上相似的分子。通常，核酸序列变体编码的多肽具有在性质上相同的生物活性。通常，多肽序列变体也具有在性质上相同的生物活性。而且，这些多肽序列变体可以有至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性和70％、75％、80％、82％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性。

另外，变体多肽可以包括类似物，其中所述术语“类似物”所指的多肽为Cpn10的衍生物，所述衍生物包含一个或多个氨基酸的添加、缺失、置换，这样的多肽保持与天然Cpn10基本相同的功能。本领域公知，可以改变多肽中的某些氨基酸而同时不会改变所述多肽的活性(保守置换)。术语“保守氨基酸置换”是指在多肽链(蛋白的一级序列)中一个氨基酸置换或替换成另一个具有相似性质的氨基酸。例如，带电荷的氨基酸谷氨酸(Glu)置换为相似带电荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)是保守氨基酸置换。氨基酸添加可以通过以下方式得到：Cpn10多肽或其片段与另外的多肽或肽(例如多组氨酸标签)的融合、麦芽糖结合蛋白融合、谷胱甘肽S转移酶融合、绿色荧光蛋白融合、或添加FLAG或c-myc等表位标签。例如，野生型的人Cpn10多肽可以在N-端包含：添加的GSM三肽部分(SEQ ID NO：2；例如见WO 95/15338，其公开内容通过引用的方式纳入本文)或者添加的丙氨酸(A)残基(SEQ ID NO：3；WO 2004/041300，其公开内容通过引用的方式纳入本文)或者添加的甘氨酸(G)，SEQ ID NO：4(例如见PCT/AU2006/001278)。所述野生型的Cpn10多肽的N端可以包含也可以不包含起始甲硫氨酸。所述野生型的Cpn10多肽的N端或C端可以通过添加、缺失或置换一个或多个氨基酸残基进行修饰。

在另一个实例中，所述野生型的人Cpn10多肽可以缺失移动环(SEQ ID No：7)、缺失β发夹顶环(SEQ ID NO：9)或两者都缺失(SEQ ID NO：11)，可以参见例如PCT/AU2006/001278，其公开内容通过引用的方式纳入本文。另外，如SEQ ID NO：13、15或17所示，所述野生型的人Cpn10多肽可以在移动环中包含三肽的缺失(例如见PCT/AU2006/001278，其公开内容通过引用的方式纳入本文)。本发明也考虑使用编码这些修饰形式Cpn10的多核苷酸。

Cpn10变体可以通过Cpn10蛋白的诱变或者编码核酸的诱变形成，例如通过使用本领域技术人员熟知的方法进行的随机诱变或定向诱变。这些方法例如可以参见Current Protocols In Molecular Biology(Chapter 9)，Ausubelet al.，1994，John Wiley&Sons，Inc.，New York，其公开内容通过引用的方式纳入本文。变体和类似物也涵盖与其他化学部分复合的多肽、融合蛋白或另外的翻译后修饰的多肽。合适的修饰的实例记载于申请号为PCT/AU2005/000041的国际专利申请中，其公开内容通过引用的方式纳入本文。

另外，所述Cpn10多肽或其片段可以具有其他翻译后修饰，包括侧链修饰，例如乙酰化、脒基化(amidination)、氨甲酰化、还原烷基化和本领域技术人员已知的其他修饰等。

伴侣蛋白10变体的另一个实例为没有或基本上没有蛋白折叠活性的变体，这些修饰的实例记载于申请号为PCT/AU2006/001278的国际(PCT)专利申请中，其公开内容通过引用的方式纳入本文。

Cpn10的产生

根据本发明，Cpn10多肽可以通过本领域技术人员熟知的重组DNA和分子生物学的标准技术产生。例如，可以通过例如以下的标准文献获得指导：Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York，1989和Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences，1992。Morton etal.，2000(Immunol Cell Biol 78：603-607)、Ryan et al.，1995(J Biol Cheni270：22037-22043)和Johnson et al.，2005(J Biol Chem 280：4037-4047)中描述的方法是Cpn10多肽的合适纯化方法的实例，但是技术人员应理解本发明并不受所使用的纯化或产生方法的限制，并且可以使用任何其他方法产生Cpn10以应用于根据本发明的方法和组合物中。Cpn10肽可以通过用一种或多种蛋白酶消化多肽产生，所述蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoG lu-C和葡萄球菌V8蛋白酶。所述消化的肽片段可以通过例如高效液相色谱(HPLC)技术纯化。

本发明的Cpn10多肽的纯化可以被放大以用于大规模生产的目的。例如，如本文所述本发明人已经开发了一种通过大肠杆菌的批次发酵产生大量(克)的高纯度、临床级Cpn10多肽的生物过程。

本发明的Cpn10多肽以及其片段和变体也可以通过本领域普通技术人员熟知的液相和固相化学的标准方法合成。例如，这样的分子可以依照S teward和Young(Steward，J.M.&Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis.(2nd Edn.)Pierce Chemical Co.，Illinois，USA(1984))的固相化学方法合成。

通常，这种合成方法包含将一个或多个氨基酸或者被适当保护的氨基酸依次添加到逐渐延长的肽链上。通常，第一个氨基酸的氨基或者羧基被适当的保护基团保护。然后，所述被保护的氨基酸附着在惰性固体支持物上或者在溶液中使用，在适宜于酰胺键形成的条件下添加互补(氨基或羧基)基团被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从该新添加的氨基酸残基上去除所述保护基团，并且添加下一个(保护的)氨基酸，依此类推。在所有需要的氨基酸都被连接以后，任何剩余的保护基团，以及——在需要的情况下——任何固体支持物，被依次或同时去除以形成最终的多肽。

可通过相关领域技术人员熟知的技术对Cpn10多肽中的氨基酸进行改变。例如，可通过核苷酸取代技术进行氨基酸改变，所述取代技术包括在保持正确的阅读框的条件下核苷酸的添加、缺失或置换(保守的和/或非保守的)。示例性技术包括随机诱变、定向诱变、寡核苷酸介导的诱变、多核苷酸介导的诱变、通过使用现有的或设计的限制性内切酶位点使选择区域缺失和聚合酶链反应。

本发明的Cpn10多肽免疫调节活性的产生可能与形成所述Cpn10多肽的七聚体有关。就本发明而言，免疫调节活性的测试可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种进行。作为一个实例，Cpn10多肽的免疫调节活性可以通过以下方式确定：测量所述多肽调节来自Toll样受体TLR4的信号传导的能力，例如使用萤光素酶生物测定，并且一般在有例如脂多糖的TLR4激动剂存在的条件下进行。此外或另外，免疫调节活性可以使用其他体外、离体或体内的测定法确定，例如通过测定例如外周血单核细胞的细胞中NF-κB的产生或细胞因子的产生。

给药组合物和给药途径

通常，根据本发明的方法使用的合适的组合物可以依照本领域普通技术人员已知的方法和过程制备，并且相应地可以包括可药用的载体、稀释剂和/或辅剂。

根据本发明，所制备的Cpn10组合物可以仅包含Cpn10，或者为包含可药用载体、辅剂和/或稀释剂的药用组合物。或者，所述Cpn10组合物还可以包含免疫抑制剂。

所述免疫抑制剂可以是免疫抑制药物，或者是针对B或T淋巴细胞或介导它们激活的表面受体的特异性抗体。例如，所述免疫抑制药物可以是环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、麦考酚酸吗乙酯、甲氨喋呤、色甘酸盐、茶碱、白三烯拮抗剂、抗组胺剂，或者它们的组合。

另外，根据本发明使用的药物组合物还可以包含类固醇，例如皮质类固醇。

可以通过标准途径进行组合物的给药。通常，所述组合物可以通过肠胃外途径(例如静脉内注射、椎管内注射、皮下注射或肌内注射)、口服途径或局部途径给药。给药可以是全身性的、区域性的或局部的。在任何给定情况下使用的具体给药途径将依赖于多种因素，包括待治疗病症的性质、病症的严重程度和范围、被送递的具体化合物的所需剂量和所述化合物的潜在副作用。

通常，合适的组合物可以依照本领域普通技术人员已知的方法制备，并且可以包含可药用的稀释剂、辅剂和/或赋形剂。所述稀释剂、辅剂和赋形剂必须是“可接受的”，即与所述组合物的其他成分相容并对其受者无毒。

可药用的载体或稀释剂的实例是去矿质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生油(peanut oil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachis oil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如聚甲基硅氧烷、苯基聚硅氧烷(phenylpolysiloxane)和甲基苯基聚硅氧烷(methylphenyl polysolpoxane)；挥发性硅酮(volatile silicone)；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚烷撑二醇)或低级烷撑二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；西黄蓍胶或阿拉伯胶，和石油凝胶(petroleumjelly)。通常，所述一种或多种载体占组合物重量的10％-99.9％。

本发明的组合物可以是适宜注射给药的形式、适宜口服的制剂形式(例如胶囊剂、片剂、胶囊形片剂(caplet)、酏剂(elixir)等)、适宜外用给药的软膏、乳膏或洗剂形式、适宜作为滴眼剂送递的形式、适宜例如鼻内吸入和口腔吸入的吸入给药的气雾剂形式(例如液体或粉末)、适宜肠胃外给药(即皮下注射、肌内注射或静脉内注射)的形式。

对于作为可注射的溶液或悬浮液给药而言，无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体可以包括林格氏液(Ringer′s solution)、等渗盐水、磷酸盐缓冲液、乙醇和1，2-丙二醇。

一些适宜于口服的载体、稀释剂、赋形剂和辅剂的实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯胶、西黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服制剂可以包含合适的调味剂和着色剂。当使用胶囊剂形式的时候，所述胶囊剂可以用例如延缓胶囊剂崩解的单硬脂酸甘油酯(和二硬脂酸甘油酯的化合物包衣。

辅剂一般包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀细菌剂和缓冲剂。

供口服给药的固体形式可以包含人药和兽药实践中可接受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂(coating agent)、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂(time delay agent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕巴坦或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄胞胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油(oil of wintergreen)、樱桃、橙或覆盆子调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸(和/或其酯的聚合物和共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

供口服给药的液体形式除包含上述试剂以外还可以包含液体载体。合适的液体载体包括水、油(例如橄榄油、花生油(peanut oil)、芝麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachis oil)、椰子油)、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯，或它们的混合物。

供口服给药的悬浮剂还可以包含分散剂和/或助悬剂。合适的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙醇(acetyl alcohol)。合适的分散剂包括卵磷脂；例如硬脂酸的脂肪酸的聚氧乙烯酯(polyoxyethylene ester)；聚氧乙烯山梨糖醇(polyoxyethylene sorbitol)的单油酸酯或其二油酸酯或其硬脂酸酯或其月桂酸酯；聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylene sorbitan)单油酸酯或其二油酸酯或其硬脂酸酯或其月桂酸酯；诸如此类。

供口服给药的乳剂还可以包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上文给出的分散剂实例或者例如瓜尔胶、阿拉伯胶或西黄蓍胶的天然胶。

用于制备可肠胃外给药的组合物的方法对本领域技术人员是显而易见的，并详细记载于例如Remington′s Pharmaceutical Science，15th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pa.中，该出版物通过引用的方式纳入本文。

本发明的局部制剂包含活性成分以及一种或多种可接受的载体，并且任选地包含任何其他治疗成分。适宜局部给药的制剂包括适于渗透皮肤到达治疗部位的液体或半液体制品，例如搽剂、洗剂、乳膏、软膏剂或糊剂，以及适宜眼、耳或鼻给药的滴剂。

根据本发明的滴剂可以包含无菌水性或油性溶液或悬浮液。所述滴剂可以通过将所述活性成分溶解于含有杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他合适防腐剂的水溶液中制得，并且任选地包含表面活性剂。然后可以将所形成的溶液过滤使之澄清，转移至合适的容器中并灭菌。可以通过以下方式完成灭菌：高压灭菌或在90℃-100℃保持半小时，或者通过过滤，之后经无菌操作转移至一个容器内。可包含在所述滴剂中适合的杀细菌剂和杀真菌剂的实例有硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于油溶液制品的合适溶剂包括甘油、稀乙醇(diluted alcohol)和丙二醇。

根据本发明的洗剂包括那些适合应用于皮肤或眼的洗剂。眼用洗剂可以包含无菌水溶液并任选地包含杀细菌剂，可以通过与上述关于滴剂制品的方法类似的方法制备。用于皮肤的洗剂或搽剂也可以包含使皮肤速干并冷却皮肤的试剂(例如乙醇或丙酮)和/或增湿剂(例如甘油或者例如蓖麻油或花生油(arachis oil)的油)。

根据本发明的乳膏、软膏剂或糊剂是活性成分的外用半固体制剂。它们可以通过如下方式制备：将极细的或粉末形式的所述活性成分(单独或者在水性液体或非水性液体的溶液或悬浮液中)与油脂性基质(greasy basis)或非油脂性基质(non-greasy basis)混合。该基质可以包括烃，例如硬石蜡、软石蜡、液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂(metallic soap)；胶浆剂；天然来源的油，例如杏仁油、玉米油、花生油(arachis oil)、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或者例如硬脂酸或油酸的脂肪酸以及例如丙二醇或聚乙二醇(macrogol)的醇。

所述组合物可以掺合任何适合的表面活性剂，例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、或者例如山梨坦酯或其聚氧乙烯衍生物的非离子型表面活性剂。也可以包含助悬剂和例如羊毛脂的其他成分，所述助悬剂例如天然树胶、纤维素衍生物或例如硅酸二氧化硅(silicaceous silica)的无机材料。

所述组合物也可以以脂质体的形式给药。脂质体通常来自于磷脂或其他脂质物质，并通过分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。任何无毒、生理可接受且可代谢的能够形成脂质体的脂质都可以被使用。脂质体形式的所述组合物可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等等。优选的脂质为磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，可以是天然的，也可以是合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的，关于这方面具体可参见：Prescott编著，Methods in Cell Biology，第XIV卷，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，第33页等，其内容通过引用的方式纳入本文。

剂量

出于本发明的目的，分子和试剂可以作为组合物给予受试者，用于治疗或预防。在治疗应用中，将组合物给予已经患病的患者，给药剂量应足够治愈或者至少部分地阻滞所述疾病及其并发症。所述组合物应该提供能有效治疗所述患者的足够量的分子或试剂。

有效治疗剂量水平对任何具体患者而言将依赖于多种因素，包括：所治疗的病症及其严重程度；使用的分子或试剂的活性；使用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和日常饮食；给药时间；给药途径；所述分子或试剂的螯合(sequestration)率；治疗持续时间；治疗中结合使用或同时使用的药物，以及医学领域熟知的其他相关因素。

本领域技术人员将能够通过常规实验确定试剂或化合物的有效、无毒的量，该量是治疗可治疗的疾病所需的。

通常，有效剂量预计为每24小时每kg体重约0.0001mg-约1000mg；一般为每24小时每kg体重约0.001mg-约750mg；每24小时每kg体重约0.01mg-约500mg；每24小时每kg体重约0.1mg-约500mg；每24小时每kg体重约0.1mg-约250mg；每24小时每kg体重约1.0mg-约250mg。更普遍地，有效剂量范围预计为每24小时每kg体重约1.0mg-约200mg；每24小时每kg体重约1.0mg-约100mg；每24小时每kg体重约1.0mg-约50mg；每24小时每kg体重约1.0mg-约25mg；每24小时每kg体重约5.0mg-约50mg；每24小时每kg体重约5.0mg-约20mg；每24小时每kg体重约5.0mg-约15mg。

或者，有效剂量的上限可以是约500mg/m²。通常，有效剂量预计为约25-约500mg/m²，优选约25-约350mg/m²，更优选约25-约300mg/m²，还更优选约25-约250mg/m²，再更优选约50-约250mg/m²，并且还再更优选约75-约150mg/m²。

在治疗应用中，治疗通常贯穿于疾病状态的持续期。

而且，对本领域普通技术人员显而易见的是，个体剂量的最佳量和给药间隔将由以下因素决定：所治疗的疾病状态的性质和程度；给药形式、途径和部位；以及所治疗的具体个体的情况。这种最佳条件也可以通过常规技术确定。

对本领域普通技术人员还显而易见的是，最佳疗程(例如在确定的天数内每天给予的组合物剂量数)可以通过本领域技术人员使用常规的疗程确定试验确定。

Cpn10的激动剂和拮抗剂

本发明还考虑到Cpn10的激动剂和拮抗剂的用途以及筛选和产生这些激动剂和拮抗剂的方法。

Cpn10的激动剂和拮抗剂也可以根据它们对TLR信号传导和免疫调节剂分泌的作用进行专门地设计或筛选。

抗体可以作为Cpn10或其片段或类似物的激动剂或拮抗剂。优选从Cpn10多肽的不连续区域或片段——特别是那些赋予蛋白酶活性和/或配偶体或底物结合活性的区域或片段——制备合适的抗体。抗原Cpn10多肽包含至少约5个氨基酸，优选至少约10个氨基酸。

用于形成合适抗体的方法是本领域技术人员易于理解的。例如，抗Cpn10单克隆抗体(一般包含Fab部分)可以使用如下出版物中记载的杂交瘤技术制备：Antibodies-A Laboratory Manual，Harlow and Lane，eds.，Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.(1988)。

原则上，在制备针对Cpn10或其片段或类似物的单克隆抗体的时候，可以使用任何能够通过培养的连续细胞系产生抗体分子的技术。这些技术包括由Kohler et al.，1975，Nature，256：495-497最初开发的杂交瘤技术，以及三源杂交瘤技术(trioma technique)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today，4：72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Coleet al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，(1985))。永生的产生抗体的细胞可以通过融合之外的技术形成，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或者用EB病毒(Epstein-Barr virus)转染。参见例如M.Schreier et al.，″Hybridoma Techniques″(1980)；Hammerling et al.，″Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas″(1981)；Kennett et al.，″Monoclonal Antibodies″(1980)。

总之，一种产生可以生成单克隆抗体的杂交瘤的方法，即骨髓瘤细胞或其他自身延续性细胞系与来自哺乳动物脾的淋巴细胞融合，所述哺乳动物被其识别因子结合部分、识别因子、或其来源特异性的DNA结合部分超免疫。通过杂交瘤与该识别因子免疫反应的能力和它们在靶细胞中抑制特异转录活性的能力，对可产生有利于本发明实施的单克隆抗体的杂交瘤进行鉴定。

有利于本发明实施的单克隆抗体可以通过启动含有营养培养基的单克隆杂交瘤培养物产生，所述培养基中含有分泌合适抗原特异性抗体分子的杂交瘤。在合适条件下将所述培养物维持足够长的时间以使所述杂交瘤分泌抗体分子至培养基中。然后收集含所述抗体的培养基。接着可以通过公知技术进一步分离所述抗体分子。

类似地，本领域已知有多种方法可以用来产生多克隆抗体。为产生抗Cpn10的多克隆抗体，可以通过注射Cpn10或其片段或类似物对多种宿主动物进行免疫，所述宿主动物包括但不限于兔、鸡、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。而且，Cpn10多肽或其片段或类似物可以与免疫原性载体缀合，所述载体例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。也可以使用多种佐剂增加免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、例如氢氧化铝的矿物凝胶、表面活性物质例如溶血卵磷脂(lysolecithin)、普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子(polyanion)、肽、油乳剂(oil emulsion)、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的潜在有效的人类佐剂。

对所需抗体的筛选也可以通过本领域已知的多种技术完成。对抗体的免疫特异性结合的测定可以包括但不限于放射免疫测定(radioimmunoassay)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心免疫测定、免疫放射测定(immunoradiometricassay)、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白A测定和免疫电泳测定等等(参见例如Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York)。抗体结合的检测可以借助于一抗上的可探测标记。另外，所述抗体的检测也可以借助于其与适当标记的二抗或反应物的结合。本领域已知有多种方法用于检测免疫测定中的结合，这些方法在本发明的范围内。

抗Cpn10或其片段或类似物的抗体(或其片段)具有对于Cpn10的结合亲和力。所述抗体(或其片段)优选具有超过约10⁵M^-1的结合亲和力或亲合力，更优选超过约10⁶M^-1，再更优选超过约10⁷M^-1，并且最优选超过约10⁸M^-1。

为了得到合适量的根据本发明的抗体，可以使用无血清培养基分批发酵生产所述抗体。在发酵之后，可以通过一种组合了色谱法和病毒失活/去除步骤的多步骤方法纯化所述抗体。例如，可以首先通过蛋白A亲和色谱法分离所述抗体，然后用溶剂/洗涤剂处理以使任何有脂质包膜的病毒失活。进一步的纯化一般通过阴离子和阳离子交换色谱法，可以用于去除残留蛋白、溶剂/洗涤剂和核酸。可以使用凝胶过滤柱进一步纯化所纯化的抗体并配制于0.9％的盐水中。接着可以将该配制的批量制剂灭菌，过滤病毒并进行分装。

也考虑到了除抗体之外的激动剂和拮抗剂。可以通过某种分子作为激动剂与一种或多种TLR和/或它们的接头分子形成分子复合物的能力，来识别候选的激动剂或拮抗剂。此外，还可以通过某种分子作为拮抗剂阻止或破坏形成含有Cpn10和一种或多种TLR和/或它们的接头分子的分子复合物的能力，来识别候选拮抗剂。

本领域技术人员熟知用于识别和产生激动剂和拮抗剂的技术和方法，包括分子文库的筛选(例如，如组合文库等的合成化学文库)、结构数据库的计算机辅助筛选、计算机辅助建模和/或设计、或者检测分子结合相互作用的更传统的生物物理学技术。

下面将参照具体实施例描述本发明，这些实施例不应被解释为对本发明范围的任何形式的限制。

实施例

实施例1：Cpn10在绵羊房尘螨哮喘模型中的效力测试

气道炎症对于哮喘病发病机制非常重要，并且涉及嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞在肺组织和支气管肺泡空间的募集和激活(Busse et al，2001)。已显示房尘螨是引起人变应性哮喘的最常见变应原，被致敏的个体产生特异性IgE和IgG体液应答(Roche et al，1997)。合适的哮喘动物模型可将研究工作限定并控制在与人类疾病直接相关的方向上。

本文描述的实验考察了通过静脉内注射给药或者直接滴注至肺部的Cpn10是否能够影响致敏绵羊对房尘螨激发的变应性应答的临床和免疫表现。材料和方法

用溶解的房尘螨提取物免疫绵羊(n＝10)，并且选择高变应原特异性IgE应答和支气管肺泡灌洗液(BAL)嗜酸粒细胞增多的绵羊。然后用Cpn10(0.5、4或16mg)或载体通过以下方式处理动物：静脉内注射送递(n＝5)或使用光导纤维支气管镜术(fibre-optic bronchoscopy)直接送递到肺的一侧并将载体送递到另一侧，之后用HDM激发。HDM激发之后6小时、48小时和7天，收集支气管肺泡灌洗液和血样，用于细胞分类计数、BAL细胞因子定量和血清IgE定量。BAL细胞也被保存于RNA分离介质(Trizol)中，并冷冻用于后面的RT-PCR分析。

结果

总体而言，本文显示的结果表明，Cpn10在绵羊哮喘模型中对变应性炎症有显著的和剂量应答性的效果。

静脉内送递Cpn10

Cpn10的静脉内给药在6小时的时间点以剂量依赖方式导致BAL嗜中性粒细胞的减少。仅进行第二次HDM刺激(没有进行Cpn10处理)后6小时，所有6只静脉内注射组绵羊的BAL中存在的嗜中性粒细胞数目平均为34％。以组内平均值表示的嗜中性粒细胞百分数随着Cpn10剂量的升高而减小。在6小时的时间点，0.5mg、4mg和16mg剂量的Cpn10使得BAL液中的嗜中性粒细胞分别为15％、12％和8％。

Cpn10的静脉内给药在48小时的时间点以剂量依赖方式导致BAL嗜中性粒细胞的减少。仅进行第二次HDM刺激(没有进行Cpn10处理)后48小时，所有6只静脉内注射组绵羊的BAL中存在的嗜中性粒细胞数目平均为31％。以组内平均值表示的嗜中性粒细胞百分数总体上随着Cpn10剂量的升高而减小。在48小时的时间点，0.5mg、4mg和16mg剂量的Cpn10使得BAL液中的嗜中性粒细胞分别为15％、16％和11％。

肺内送递Cpn10

在大部分处理中，6小时和48小时时间点的绵羊个体左肺和右肺间的BAL嗜中性粒细胞的百分数有所差异。然而，在左肺(Cpn10处理)和右肺(载体处理)之间并没有一致的趋势。在大部分处理中，6和48小时时间点的绵羊个体左肺和右肺间的BAL嗜酸性粒细胞的百分数也不相同。除4mg Cpn10的剂量在激发后48小时的情况之外，在左肺(Cpn10处理)和右肺(载体处理)之间总体上没有一致的趋势。在给予4mg(总剂量)Cpn10至左肺和并进行HDM激发后48小时，每只绵羊左肺的BAL嗜酸性粒细胞百分数都比右肺对照低。来自肺内给药组所有绵羊的平均数据表明，在左肺局部注入4mg Cpn10可将左肺的嗜酸性粒细胞增多水平降到右肺(对照，载体处理)的50％。

基线IgE应答

每次HDM激发前(d0)和激发后七天(d7)评估血清IgE水平，结果如图5中所示。在无Cpn10(第1次和第2次HDM激发)的情况下，血清IgE水平在用HDM激发气道后明显升高。#23绵羊是唯一一只在初次HDM激发后没有显示高IgE应答的绵羊。与第1次HDM激发之前的基线IgE水平相比，在第2和第3次HDM激发之前观察到d0IgE水平轻微的升高；这些情况的每一种都可表明，在2周前的HDM激发后所述IgE水平慢慢向基线回归。

存在Cpn10时对HDM激发的IgE应答

无论任何剂量或送递方式，在HDM激发后7天进行评估时，Cpn10都对HDM特异性血清IgE应答有显著影响。给予Cpn10导致血清IgE应答的阻断，在第4次和第5次HDM激发时特别明显地维持在基线水平附近。

支气管肺泡灌洗液的嗜酸性粒细胞

在基线(d0)、气道HDM激发和药物处理后6小时和48小时采集BAL样品，并进行嗜酸性粒细胞计数。迄今为止的结果都显示在图1的曲线图中，并表示为HDM激发后48小时取样的灌洗液的总细胞中嗜酸性粒细胞的百分数。

在HDM激发之前静脉内注射给予Cpn10将导致在激发后48小时嗜酸性粒细胞募集峰值时的BAL嗜酸性粒细胞增多水平降低了最多达15倍。

当使用光导纤维支气管镜将Cpn10给予单侧的左肺并仅将载体给予右肺(对照)时，Cpn10处理的肺的BAL中的嗜酸性粒细胞百分数显示出比对照肺低4倍。

对HDM激发的血清免疫球蛋白应答

在给予载体或Cpn10并进行HDM激发后第0天和第7天收集血清。使用在Bischof et al，2003中详述的ELISA进行血清测试和HDM特异性IgE水平的评估，结果显示于图2。所述数据显示了在用载体对照给药的每次HDM激发后以及在给予4mg Cpn10和HDM激发后HDM特异性IgE的血清水平。

气道上皮、杯形细胞和支气管腺变化

杯形细胞

杯形细胞增生是由气道的变应性炎症引起的哮喘病理学的标志性特征。已知在变应原刺激之后每单位长度气道上皮上的杯形细胞的数量会增多。伴随着数量的增多，所述杯形细胞的体积也会增大，并且在用PAS/阿辛蓝组织染料染色时呈现大的多色细胞质。在PAS/阿辛蓝染色的组织玻片上进行气道上皮、杯形细胞和支气管腺的分析。对软骨支气管气道(cart ilaginousbronchial airway)和腺支气管气道(glandular bronchial airway)进行该项分析，这些气道的直径在1800和3300μm之间。

对HDM激发的绵羊肺内给予Cpn10：在肺内给予Cpn10的绵羊(n＝4只绵羊)的左肺和右肺中，每mm气道基底膜的杯形细胞平均数量都是33。所述杯形细胞较大并且充满蓝色和红色的染色颗粒(图5)。

对HDM激发的绵羊静脉内给予Cpn10：与肺内送递组相比，4mg Cpn10静脉内注射处理的绵羊的支气管上皮中杯形细胞较少。在静脉内注射给予Cpn10的绵羊(n＝6只绵羊)中每mm气道基底膜的杯形细胞平均数量是16。这一数量不到载体肺内处理组(每mm气道基底膜33个杯形细胞)的杯形细胞数量的一半。所述静脉内注射Cpn10组的杯形细胞总体上成熟度较低，因为它们比较小，更接近立方形，并且具有更少的细胞质染色。

上皮

已知被覆气道的上皮是哮喘病症中重要的组织部件，因为它形成对空气传播的外来物的第一道屏障。

对HDM激发的绵羊肺内给予Cpn10：在载体肺内给药组和Cpn10肺内给药组中，气道上皮都更接近柱状，并且在某些气道中有增生(图5)。

对HDM激发的绵羊静脉内给予Cpn10：与肺内组相比，所述气道上皮更接近立方形(图6)。

支气管腺

在变应原刺激之后，与支气管气道相关的腺体会被刺激而分泌粘液至腺体腔中。当用PAS/阿辛蓝组织染料染色的时候，所述粘液会被染成红色(指示中性粘蛋白)或蓝色(指示酸性粘蛋白)。

对HDM激发的绵羊肺内给予Cpn10：对PAS/阿辛蓝染色的组织玻片分析发现，两组肺内处理绵羊的支气管腺在HDM激发和Cpn10/载体处理后48小时分泌粘液(图5)。两只绵羊的粘液经PAS染色呈红色(图5)，而另两只绵羊的粘液基本上呈蓝色。对每只绵羊的所有可用于评分的支气管腺进行系统分析表明，载体处理肺中平均23％的支气管腺腔被粘液阻塞，Cpn10处理的肺中27％的支气管腺腔被阻塞(n＝4只绵羊)。

对HDM激发的绵羊静脉内给予Cpn10：与肺内组中观察到的现象相比，静脉内注射处理绵羊的腺腔中存在的粘液显著减少(图6)。对PAS/阿辛蓝染色的组织玻片分析发现，静脉内注射处理的绵羊的支气管腺在HDM激发和静脉内注射Cpn10处理48小时后有少量的腔粘液。所述粘液基本上呈蓝色(如图6)。对每只静脉内注射绵羊的所有可用于评分的支气管腺进行系统分析表明，平均4.8％的支气管腺腔被粘液阻塞(n＝6只绵羊)。

讨论

这项试验的数据清楚地显示，全身送递的Cpn10能够改善作为哮喘病理生理学基础的变应性炎症。嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和IgE抗体已知都是哮喘相关炎症的重要部分。该试验表明，Cpn10对HDM激发后的BAL中嗜酸性粒细胞增多和嗜中性粒细胞增多以及血清中HDM特异性IgE的水平有显著的缓冲效果。

对人哮喘相关的哮喘诱导变应原致敏的绵羊进行Cpn10给药的评估已经证明，在抗原激发后48小时支气管肺泡空间内的嗜酸性粒细胞累积以剂量应答的方式减少。HDM激发的绵羊BAL中的嗜酸性粒细胞增多与在人哮喘症中发现的嗜酸性粒细胞水平类似(Metzger et al，1987)。本研究中使用的模型的另一个特征是，与非变应性的和对照的绵羊相比，具有高的特异性IgE血清滴度的绵羊(即变应性的绵羊)与那些在局部用HDM激发的时候产生升高的和延长的BAL嗜酸性粒细胞增多的绵羊个体相关(Bischof，2003)。

静脉内注射Cpn10给药对变应性炎症的改善具有明显的剂量依赖性。高剂量(16mg)Cpn10最有效地减少BAL中嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分数。16mg Cpn10剂量也对激发后24和48小时血液嗜酸性粒细胞水平有显著的缓冲效果，作为对比的是在4mg Cpn10剂量和第二次仅用HDM激发的试验中在相同时间点计数的嗜酸性粒细胞。

在所述试验过程中Cpn10对绵羊没有表现出不良反应，其主要临床指征在整个实验周期中都保持在正常的生理范围内。这表明不论是通过静脉内注射途径送递还是通过肺内途径送递，绵羊均可以很好地耐受所有使用的Cpn10剂量。

通过动物死后进行的组织学分析观察到一些值得关注的结果。静脉内注射给予4mg Cpn10导致与变应性炎症相关的多种病理学参数显著降低。总体而言，静脉内注射处理的绵羊浸润至气道壁的炎症细胞更少，具有的成熟杯形细胞更少，杯形细胞的成熟度更低，并且在支气管腺腔中的粘液含量更少。载体(对照)和Cpn10肺注入的病理程度之间没有发现显著不同。肺内激发的绵羊的病理总体上类似于在仅用HDM激发的动物中观察到的结果。

总之，本项试验清楚地证明全身送递的Cpn10能够缓解哮喘的关键性炎症基础部分。

实施例2：用于治疗的组合物

根据在文中给出的实施本发明的最佳方式，下面给出具体的优选组合物。下文应被解释为仅是组合物的说明性示例，不能解释为对本发明范围的任何形式的限制。

实施例2(A)：用于肠胃外给药的组合物

用于肠胃外注射的组合物可以按如下方式制备：在10ml至2升的1％羧甲基纤维素中包含0.05mg至5g本文公开的合适的试剂或化合物。

类似地，用于静脉内输注的组合物可以包含250ml无菌林格氏液和0.05mg至5g本文公开的合适的试剂或化合物。

实施例2(B)：用于口服给药的组合物

合适的试剂或化合物的胶囊剂形式的组合物可以通过如下方式制备：在标准两节硬胶囊中填充500mg粉末形式的所述试剂或化合物、100mg乳糖、35mg滑石粉和10mg硬脂酸镁。

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Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu

1 5 10 15

Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met Leu

20 25 30

Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val

35 40 45

Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser Val

50 55 60

Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val

65 70 75 80

Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly AspIle Leu

85 90 95

Gl y Lys Tyr Val Asp

100

<210>2

<211>104

<212>PRT

<211>人类(Homo sapiens)

<400>2

Gly Ser Met Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp

1 5 10 15

Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly

20 25 30

Ile Met Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val

35 40 45

Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro

50 55 60

Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly

85 90 95

AspIl e Leu Gly Lys Tyr Val Asp

100

<210>3

<211>102

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<100>3

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met

20 25 30

Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser

50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys

65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile

85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp

100

<210>4

<211>102

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>4

Gly Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met

20 25 30

Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser

50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys

65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile

85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp

100

<210>5

<211>309

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>5

atggcaggac aagcgtttag aaagtttctt ccactctttg accgagtatt ggttgaaagg 60

agtgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attatgcttc cagaaaaatc tcaaggaaaa 120

gtattgcaag caacagtagt cgctgttgga tcgggttcta aaggaaaggg tggagagatt 180

caaccagtta gcgtgaaagt tggagataaa gttcttctcc cagaatatgg aggcaccaaa 240

gtagttctag atgacaagga ttatttccta tttagagatg gtgacattct tggaaagtac 300

gtagactga 309

<210>6

<211>312

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>6

atgggtgcgg gccaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt gctggttgaa 60

cgtagcgcgg cggaaaccgt gaccaaaggc ggcattatgc tgccggaaaa aagccagggc 120

aaagtgctgc aggcgaccgt ggttgcggtt ggcagcggca gcaaaggcaa aggcggcgaa 180

attcagccgg tgagcgtgaa agtgggcgat aaagtgctgc tgccggaata tggcggcacc 240

aaagtggtgc tggatgataa agattatttt ctgttccgcg atggcgatat tctgggcaaa 300

tatgtggatt ga 312

<210>7

<211>86

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>7

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

20 25 30

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser

35 40 45

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys

50 55 60

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile

65 70 75 80

Leu Gly Lys Tyr Val Asp

85

<210>8

<211>264

<212>DNA

<213>合成序列

<400>8

atggcggcgg gtcaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt tctggttgaa 60

cgtagcgcgg gcaaagttct gcaggcgacc gttgttgcgg ttggtagcgg cagcaaaggt 120

aaaggcggtg aaattcagcc ggttagcgtg aaagtgggcg ataaagttct gctgccggaa 180

tatggcggca ccaaagttgt gctggatgat aaagattact tcctgttccg cgatggtgat 240

atcctgggca aatacgtgga ttaa 264

<210>9

<211>95

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>9

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met

20 25 30

Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val

50 55 60

Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp

65 70 75 80

Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp

85 90 95

<210>10

<211>291

<212>DNA

<213>合成序列

<400>10

atggcggcgg gtcaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt tctggttgaa 60

cgtagcgcgg cggaaaccgt taccaaaggc ggtattatgc tgccggaaaa aagccagggt 120

aaagttctgc aggcgaccgt tgttgcggtt ggtagcggta gccagccggt tagcgtgaaa 180

gtgggcgata aagttctgct gccggaatat ggcggcacca aagttgtgct ggatgataaa 240

gattacttcc tgttccgcga tggtgatatc ctgggcaaat acgtggatta a 291

<210>11

<211>79

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>11

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

20 25 30

Val Gly Ser Gly Ser Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val

35 40 45

Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp

50 55 60

Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp

65 70 75

<210>12

<211>243

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>12

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60

aggagtgctg gaaaagtatt gcaagcaaca gtagtcgctg ttggatcggg ttctcaacca 120

gttagcgtga aagttggaga taaagttctt ctcccagaat atggaggcac caaagtagtt 180

ctagatgaca aggattattt cctatttaga gatggtgaca ttcttggaaa gtacgtagac 240

tga 243

<210>13

<211>102

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>13

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Phe

20 25 30

Ile Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser

50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys

65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile

85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp

100

<210>14

<211>312

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>14

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60

aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcattttca ttccagaaaa atctcaagga 120

aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180

attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240

aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300

tacgtagact ga 312

<210>15

<211>102

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>15

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Ile

20 25 30

Ile Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser

50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys

65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile

85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp

100

<210>16

<211>312

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>16

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60

aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcattataa ttccagaaaa atctcaagga 120

aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180

attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240

aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300

tacgtagact ga 312

<210>17

<211>110

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>17

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val

1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala

35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser

50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys

65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile

85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp Leu Glu His His His His His His

100 105 110

<210>18

<211>336

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>18

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60

aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcgaagagg aaccagaaaa atctcaagga 120

aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180

attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240

aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300

tacgtagacc tcgagcacca ccaccaccac cactga 336

Claims

1.一种抑制受试者体内超敏反应的方法，其中所述方法包含给予有效量的真核伴侣蛋白10。

2.权利要求1的方法，其中所述超敏反应涉及选自下列的细胞的激活：嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞。

3.权利要求1的方法，其中所述超敏反应涉及Toll样受体(TLR)信号传导的激活。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述超敏反应涉及高水平的嗜酸性粒细胞和免疫球蛋白E。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述超敏反应是炎症反应。

6.权利要求5的方法，其中所述超敏反应选自：食物过敏、皮炎、变应性结膜炎、鼻炎、湿疹、过敏反应和与气道炎症相关的呼吸系统疾病。

7.权利要求6的方法，其中所述呼吸系统疾病选自：哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、职业性哮喘、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)和COPD(慢性阻塞性肺病)。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述真核伴侣蛋白10包含选自SEQ IDNO：1、2、3、4、7、9、11、13、15或17的多肽序列。

9.权利要求8的方法，其中所述多肽序列由选自SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18的多核苷酸序列编码。

10.一种治疗或预防受试者体内超敏反应相关病症的方法，所述方法包含给予所述受试者有效量的伴侣蛋白10，其中所述伴侣蛋白10调节来自Toll样受体的信号传导。

11.权利要求10的方法，其中所述Toll样受体选自：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。

12.权利要求10或11的方法，其中所述真核伴侣蛋白10包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、7、9、11、13、15或17的多肽序列。

13.权利要求12的方法，其中所述多肽序列由选自SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18的多核苷酸序列编码。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述方法还包含给予至少一种其他试剂。

14.权利要求13的方法，其中所述试剂是免疫调节剂。

15.权利要求14的方法，其中所述所述免疫调节剂是I型干扰素。

16.权利要求15的方法，其中所述干扰素是IFNα或IFNβ。

17.一种治疗或预防受试者体内超敏反应相关病症的组合物，所述组合物包含有效量的伴侣蛋白10，以及一种免疫抑制剂。

18.权利要求17的组合物，其中所述免疫抑制剂选自抗炎化合物和支气管舒张化合物。

19.权利要求17的组合物，其中所述免疫抑制剂选自：环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、麦考酚酸吗乙酯、甲氨喋呤、色甘酸盐、茶碱、白三烯拮抗剂、抗组胺剂，或者它们的组合。

20.权利要求17-19任一项的组合物，其中所述免疫抑制剂是针对B或T淋巴细胞的特异性抗体。

21.权利要求17-20任一项的组合物，其中所述免疫抑制剂是针对B或T淋巴细胞表面受体的特异性抗体，所述受体介导所述细胞的激活。

22.权利要求17-21任一项的组合物，其中所述组合物还包含一种类固醇。

23.一种治疗或预防受试者体内超敏反应相关病症的方法，所述方法包含给予有效量的权利要求17-22任一项的组合物。

24.权利要求17-23任一项的组合物，其中所述真核伴侣蛋白10包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、7、9、11、13、15或17的多肽序列。

25.权利要求24的组合物，其中所述多肽序列由选自SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、16或18的多核苷酸序列编码。