BRPI0617681A2 - tratamento de hipersensibilidade - Google Patents

Abstract

<B>TRATAMENTO DE HIPERSENSIBILDADE<D>.A presente invenção refere-se a um método para inibição de uma reação de hipersensibilidade em um indivíduo, no qual referido método compreende administrar uma quantidade eficaz de chaperonina 10.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMEN-TO DE HIPERSENSIBILDADE".Campo Técnico

A presente invenção refere-se ao tratamento de hipersensibili-dade pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dechaperonina eucariótico 10 (CpnIO) e, em particular, a invenção refere-se aouso de Cpn eucariótico 10 para tratamento de condições alérgicas associa-das com hipersensibilidade, incluindo asma.Antecedentes

A sensibilidade de um indivíduo a um antígeno ou combinaçãoparticular de antígenos, onde exposição subseqüente causa reações alérgi-cas extremas, pode ser danosa e mesmo fatal. Quando uma resposta imuneadaptativa ocorre em uma forma exagerada ou imprópria, o indivíduo queexperimenta a reação é referido como sendo hipersensível.

As reações de hipersensibilidade são o resultado de respostasimunes que agem inapropriadamente, e podem ser provocadas por muitosantígenos. Uma forma de hipersensibilidade ocorre quando uma respostaIgE é dirigida contra antígenos ambientais inócuos, tais como pólen ou áca-ros de poeira. A liberação resultante de mediadores farmacológicos por célu-

Ias de haste sensíveis a IgE produz uma reação inflamatória aguda com sin-tomas, tais como asma ou rinite.

A presente invenção reflete a descoberta surpreendente queCpn eucariótico 10 pode inibir reações de hipersensibilidade, incluindo asma.Sumário

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, éprovido um método para inibição de uma reação de hipersensibilidade emum indivíduo, no qual referido método compreende administrar uma quanti-dade eficaz de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, 4, 7, 9, 11,13, 15 e 17.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, éprovido um método para tratar ou prevenir uma enfermidade associada àreação de hipersensibilidade em um indivíduo, o método compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo compre-endendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo con-sistindo em SEQ ID NO: 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 e 17, no qual o polipeptídeomodula sinalização a partir de um receptor similar a Toll.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, éprovida uma composição para tratar ou prevenir uma enfermidade associadaà reação de hipersensibilidade em um indivíduo, a composição compreen-dendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo compreendendo uma se-qüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ IDNO: 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 e 17, junto com um agente imunossupressor.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é pro-vido um método para tratar ou prevenir uma enfermidade associada à rea-ção de hipersensibilidade em um indivíduo, o método compreendendo admi-nistrar uma quantidade eficaz da composição de acordo com o terceiro as-pecto da invenção.

A reação de hipersensibilidade pode envolver a ativação de ba-sófilos, eosinófilos, células de haste, neutrófilos e linfócitos, e podem envol-ver ativação de sinalização de receptor similar a Toll (TLR). A reação de hi-persensibilidade pode refletir níveis altos de eosinófilos e imunoglobulina E.

Um exemplo de uma reação de hipersensibilidade é uma reaçãoinflamatória. Mais especificamente, exemplos de uma reação de hipersensi-bilidade incluem alergia a alimento, dermatite, conjuntivite alérgica, rinite,eczema, doenças de anafilaxia e respiratória associadas com inflamação davia aérea. Exemplos destas doenças respiratórias incluem asma, tais comoasma alérgica, asma intrínseca e asma ocupacional.

A ativação de TLR desempenha um papel importante na etiolo-gia de doenças inflamatórias do pulmão variando de ARDS (síndrome deangústia respiratória aguda) para asma, e COPD (doença pulmonar obstruti-va crônica). Os receptores similares a Toll podem ser selecionados a partirdo grupo consistindo em: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7,TLR8, TLR9 e TLR10.A chaperonina eucariótica 10 pode ser uma chaperonina 10 na-turalmente derivada, recombinantemente produzida, ou sinteticamente pro-duzida. A chaperonina 10 pode ser de origem mamífera. A chaperonina 10pode ser uma chaperonina 10 humana.

A chaperonina 10 pode compreender a seqüência de polipeptí-deo conforme colocada em SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17. Achaperonina 10 pode ser acetilada ou não-acetilada. A chaperonina 10 podecarecer ou substancialmente carecer de atividade de dobramento de proteína.

A chaperonina eucariótica 10 pode ser administrada na forma deum polinucleotídeo que codifica chaperonina 10. O polinucleotídeo que codi-fica chaperonina 10 pode estar localizado em uma construção genética, ope-ravelmente ligada a um promotor.

A chaperonina eucariótica 10 pode ser codificada por um polinu-cleotídeo que pode compreender a seqüência conforme colocada em SEQID NO:5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18.

Os métodos podem compreender adicionalmente a administra-ção de pelo menos uma agente adicional. O agente pode ser um imunomo-dulador. O imunomodulador pode ser um interferon tipo 1, tal como IFNa ou ΙΡΝβ.

A terapia concomitante pode incluir administração de agentes,tais como compostos antiinflamatórios, compostos bronco dilatadores ouagentes imunossupressores, ou uma combinação destes.

O agente imunossupressor pode ser um fármaco imunossupres-sora, ou um anticorpo específico direcionado contra linfócitos B ou T, umanticorpo contra uma citoquina, por exemplo, IL-3 IL-5, GM-CSF, ou recepto-res de superfície que mediam sua ativação, incluindo IgE, e FcEpsiIonRe-ceptor.

O fármaco imunossupressora pode ser cromoglicalatos, teofilina,leucotrieno, antagonista, antihistamina, ou uma combinação destes.

A composição de acordo com o terceiro aspecto pode compre-ender adicionalmente um corticosteróide.Os aspectos e concretizações acima contemplam o uso de for-mas tipo selvagem e modificadas de chaperonina eucariótica 10, incluindochaperonina 10 de mamífero, e, por exemplo, chaperonina 10 humana, bemcomo polipeptídeos e fragmentos de chaperonina 10 de comprimento total, ederivados destes, que retêm atividade imunomodulatória.

Definições

No contexto deste relatório descritivo, o termo "compreendendo"significa "incluindo principalmente, mas não necessariamente somente". A-lém disso, variáções da palavra "compreendendo", tais como "compreende",e "compreendem", têm significados correspondentemente variados.

Conforme aqui usado, os termos "tratamento", "tratando" e vari-ações destes, referem-se a qualquer e todo uso que remedia um estado dedoença ou sintomas, previne o estabelecimento de doença ou, de outro mo-do, previne, evita, retarda ou reverte à progressão da doença ou outros sin-tomas indesejáveis de qualquer modo.

Conforme aqui usado, o termo "quantidade eficaz" inclui, dentrode seu significado, uma quantidade não-tóxica, mas suficiente, de um agenteou composto para proporcionar o efeito terapêutico ou profilático desejado. Aquantidade exata requerida variará de indivíduo para indivíduo, dependendode fatores tais como a espécie sendo tratada, a idade e condições gerais doindivíduo, a severidade das condições sendo tratadas, o agente particularsendo administrado e o modo de administração, e assim por diante. Dessemodo, não é possível especificar uma "quantidade eficaz" exata. Contudo,para qualquer caso dado, uma "quantidade eficaz" apropriada pode ser de-terminada por um técnico no assunto usando somente experimentação derotina.

O termo "polipeptídeo" significa um polímero composto de ami-noácidos ligados juntos por ligações de peptídeo. Os termos "polipeptídeo" e"proteína" são usados permutavelmente aqui, embora, para a proposta dapresente invenção, um "polipeptídeo" pode constituir uma porção de umaproteína de comprimento total.

O termo "polinucleotídeo", conforme aqui usado, refere-se a umpolímero de trançado simples ou de trançado duplo de deoxirribonucleotí-deo, bases de ribonucleotídeo, ou análogos conhecidos ou nucleotídeos na-turais, ou misturas destes.

Conforme aqui usado, os termos "modulação", "modula", e vari-ações destes, referem-se ao aumento ou diminuição do nível de atividade,produção, secreção ou funcionamento de uma molécula na presença deuma molécula modulatória particular ou agente da invenção, comparados aonível de atividade, produção, secreção, ou outro funcionamento desta naausência da molécula modulatória ou agente. Estes termos não implicamquantificação do aumento ou diminuição. A modulação pode ser de qualquergrandeza suficiente para produzir o resultado desejado, e pode ser direta ouindireta.

O termo "imunomodulador", conforme aqui usado, refere-se aum mediador molecular secretado por um ou mais tipos de célula, e que de-sempenha um papel na ativação, manutenção, maturação, inibição, supres-são ou aumento de uma resposta imune.Breve Descrição dos Desenhos e Listagem de Seqüência

A presente invenção será agora descrita, por meio de exemplonão-limitativo somente, com referência aos desenhos acompanhantes.

Figura 1. Percentagem de eosinófilos fora de células totais con-tadas na lavagem interna broncoalveolar (BAL) de ovelha (n = 5 por grupo)tratados com veículo, 0,5, 4 ou 16 mg de Cpn 10 distribuída i.v. (A) ou veícu-lo, 0,5 ou 4 mg de Cpn 10 distribuída diretamente no lóbulo esquerdo do pul-mão, com veículo distribuído no lóbulo direito (B), seguido por impugnaçãocom ácaro de pó de residência (HDM). As amostras de lavagem foram to-madas 48 horas pós impugnação de DDM.

Figura 2. A. Níveis de IgE específicos de HDM pré-(dO) e pós-(d7) impugnação de HDM em grupo i.v. seguindo administração de 4 mg deCpn 10. B. Níveis de soro de IgE pré-(dO) e pós-(d7) impugnação de HDMem grupo intrapulmão seguindo administração de 4 mg Cpn 10.

Figura 3. Vias aéreas bronquiolar representativas de duas ove-lhas 40 horas após impugnação de ácaro de pó de residência (HDM). Asovelhas foram administradas, ou por infusão intra-pulmonar de veículo (1),ou por injeção simples iv de 4 mg de Cpn 10 antes de impugnação de HDM(2). Nota-se que a infiltração das células inflamatórias que circundam com-pletamente a via aérea no veículo controla a ovelha (seta) que são grande-mente ausentes na via aérea da ovelha dada IV Cpn 10 antes de impugna-ção de HDM (xlOOH&E).

Figura 4. Bronquíolos terminais representativos de duas ovelhas48 horas após impugnação de ácaro de pó de residência (HDM). As ovelhasforam administradas, ou por infusão intra-pulmonar de veículo (1), ou porinjeção simples iv de 4 mg de Cpn 10 antes de impugnação de HDM (2). No-ta-se que a infiltração das células inflamatórias que circundam completamen-te a via aérea no veículo controla a ovelha (seta) que é grandemente ausen-te na via aérea da ovelha dada IV Cpn 10 antes de impugnação de HDM(xlOOH&E).

Figura 5. Micrografia de alta energia de uma via aérea bronquialem ovelha #6 48 horas após impugnação de HMD, e administração de umintrapulmonar de veículo (1). Nota-se que a mucosa vermelha manchada dePAS oclui o lúmen da glândula bronquial (seta). Também nota-se globet ehiperplasia de célula epitelial e mucosa revestindo o lúmen da via aérea.(x400 Alcian blue PAS stained).

Figura 6. Micrografia de uma via aérea bronquial de ovelha #4448 horas após impugnação de HDM, e uma injeção iv de 4 mg de Cpn 10.Nota-se que os Iumens da glândula bronquial são grandemente desprovidosde mucosa à parte de uma pequena região da mucosa azul no lado esquer-do da glândula (seta). Também nota-se o globet e célula epitelial revestindoo lúmen da via aérea são mais típicos de um animal não-impugnado. (x250Alcian blue PAS stained).

Listagem de seqüência: a seqüência de aminoácido de Cpn 10humana tipo selvagem (N9 de Acesso no GenBank X75821) é provida emSEQ ID NO:1. As seqüências de aminoácido de duas formas modificadas deCpn 10, com resíduos adicionais de aminoácido no terminal-N, são providasem SEQ ID Nos: 2, 3 e 4. A seqüência de nucleotídeo que codifica a mesmaé provida em SEQ ID NO: 5 e 6. Outra forma modificada de Cpn 10 humanatipo selvagem compreende a retirada do laço móvel em SEQ ID NO:7. A se-qüência de nucleotídeo que codifica a mesma é provida em SEQ ID NO:8.

Adicionalmente a isto, outras formas modificadas de Cpn 10 humana tiposelvagem compreendem retiradas dentro do laço móvel conforme providaem SEQ ID Nos: 13, 15 e 17. As seqüências de nucleotídeo que codificam amesma é provida em SEQ ID NO: 14, 16 e 18. Formas adicionais modifica-das de Cpn 10 humana tipo selvagem compreendem a retirada do laço detopo em forma de grampo de cabelo Beta (SEQ ID NO:9), ou a retirada deambos os laço móvel e o laço de topo em forma de grampo de cabelo Beta(SEQ ID NO:11). As seqüências de nucleotídeo que codificam a mesma éprovida em SEQ ID N0s:10 e 12.

Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas

As reações de hipersensibilidade são o resultado de respostasimunes que agem inapropriadamente, e podem ser provocadas por muitosantígenos. Uma forma de hipersensibilidade ocorre quando uma resposta deIgE é direcionada contra antígenos ambientais inócuos, tais como pólen ouácaros de poeira. A liberação resultante de mediadores farmacológicos porcélulas de haste sensitivas a IgE produz uma reação inflamatória aguda comsintomas tais como asma e rinite.

A inflamação da via aérea é central à patogênese de asma, eenvolve o recrutamento e ativação de eosinófilos, neutrófilos e linfócitos notecido do pulmão, e espaços broncoalveolares (Busse et al, 2001). O antíge-no de ácaro de pó de residência tem sido mostrado ser o alérgeno mais co-mum que causa asma alérgica em seres humanos, com os indivíduos sensi-bilizados desenvolvendo respostas específicas de IgE e humorais de IgG(Roche et al. 1997). O modelo animal apropriado de asma permitiria que in-vestigações definidas e controladas fossem conduzidas com relevância dire-ta à doença humana.

A presente invenção é exemplificada pela avaliação dos efeitosde modulação de Cpn 10 em um modelo de ovelha de asma. Contudo, seriaapreciado que o conceito seja aplicável a outras enfermidades tipo reaçãode hipersensibilidade.

Os modelos de ovelha anteriores de asma são baseados emanimais sensíveis a alérgenos de nematódeo (Ascaris), e os resultados ex-trapolaram a avaliação de efeitos fisiológicos e farmacológicos de fármacospotenciais antiasma. Um modelo de inflamação alérgica do pulmão em ove-lha usando ácaro de pó de residência como um alérgeno com relevânciadireta à doença alérgica humana foi recentemente estabelecido. Neste mo-delo, a ovelha sensibilizada desenvolveu respostas de IgE específicas dealérgeno com recrutamento de neutrófilos, eosinófilos e linfócitos ativados notecido do pulmão, e BAL com cinéticas similares a seres humanos impugna-dos com alérgeno de HDM (Bischof et al, 2003).

A presente invenção proporciona um método para inibição deuma reação de hipersensibilidade em um indivíduo, no qual referido métodocompreende a administração de uma quantidade eficaz de chaperonina eu-cariótica 10.

Cpn 10

De acordo com os aspectos e concretizações da presente inven-ção, um indivíduo em necessidade de tratamento é administrado com umaquantidade eficaz de eucariótico, por exemplo, Cpn humana, também co-nhecida como proteína de choque térmico 10kDa(HspIO). Por exemplo, oindivíduo a ser tratado é um humano, e, conseqüentemente, o polipeptídeode Cpn 10 é um polipeptídeo de Cpn 10 humano. Aqueles técnicos no as-sunto apreciarão que a identidade precisa da Cpn 10 usada de acordo com apresente invenção pode variar em um número de fatores, por exemplo, aespécie a ser tratada, tal que a Cpn 10 pode ser selecionada de modo a serderivada da espécie a ser tratada.

Tipicamente, a Cpn 10 é Cpn 10 recombinante. Os métodosdescritos em Morton et ai, 2000 (lmmunol Cell Biol 78:603-607), Ryan et al.,1995 (J Biol Chem 270:22037-22043) e Johnson et al., 2005 (J BiolChem:4037-4047) são exemplos de métodos de produção adequados paraproteína de Cpn 10 recombinante, embora um técnico no assunto apreciaráque a presente invenção não é limitada pelo método de purificação ou deprodução usado, e qualquer outro método pode ser usado para produzir Cpn10 para uso de acordo com os métodos e composições da presente inven-ção.

Polipeptídeos de Cpn 10 eucariótica e fragmentos de peptídeopara uso de acordo com a presente invenção podem ser obtidos usando-setécnicas de ácido nucléico recombinante padrões, ou podem ser sintetiza-dos, por exemplo, usando-se técnicas de síntese de fase líquida e sólidaconvencionais. Os peptídeos de Cpn 10 podem ser produzidos por digestãode um polipeptídeo com uma ou mais proteinases, tais como endoLys-C,endoArg-C, endo-Glu-C e staphylococcus V8-protease. Os fragmentos depeptídeo digeridos podem ser purificados por, por exemplo, técnicas croma-tográficas líquidas de alto desempenho (HPLC).

As concretizações da invenção também contemplam a adminis-tração de um polinucleotídeo que codifica Cpn 10 eucariótica. Em tais situa-ções, o polinucleotídeo é tipicamente operavelmente ligado a um promotortal que a seqüência de polipeptídeo apropriada é produzida em seguida àadministração ao indivíduo. O polinucleotídeo pode ser administrado aosindivíduos em um vetor. O vetor pode ser um vetor de plasmídeo, um vetorviral, ou qualquer outro veículo adequado adaptado para a inserção de se-qüência estranhas, sua introdução nas células eucarióticas e a expressãodas seqüências introduzidas. Tipicamente, o vetor é um vetor de expressãoeucariótico, e pode incluir seqüências de controle e processamento de ex-pressão, tais como um promotor, um intensificador, locais de ligação de ri-bóssomo, sinais de polialdenilação, e seqüências de terminação de transcri-ção. A construção de ácido nucléico a ser administrada pode compreenderDNA desprotegido, ou pode estar na forma de uma composição, junto comum ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

O polipeptídeo de Cpn 10 eucariótica pode ter seqüência de a-minoácido, conforme colocado em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 ou17. A seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo que codifica Cpn 10 podeser conforme colocado em SEQ ID NO: 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18, ou reve-la identidade de seqüência suficiente desta para hibridizar para as seqüên-cias de SEQ ID NO: 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18. Em concretizações alterna-tivas, a seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo pode compartilhar pelomenos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 96%, 97%, 98% ou 99% deidentidade com as seqüências colocadas em SEQ ID NO: 5, 6, 8, 10, 12, 14,16 ou 18.

Dentro do escopo dos termos, "polipeptídeo" e "polinucleotídeo",conforme aqui usados, são fragmentos e variantes destes. Por meio de e-xemplo somente, fragmentos de peptídeo de Cpn 10, conforme descritos noWO 95/15338 e PCT/AU2006/001278, a descrição dos quais sendo incorpo-rada aqui por referência, podem ser usados de acordo com aspectos e con-cretizações da presente invenção.

O termo "fragmento" refere-se a uma seqüência de ácido nucléi-co e polipeptídeo que codifica um constituinte, ou é um constituinte de prote-ína de com Cpn 10 de comprimento total. Em termos do polipeptídeo, ofragmento possui atividade biológica qualitativa em comum com a proteínade comprimento total. Um fragmento biologicamente ativo de Cpn 10 usadode acordo com a presente invenção pode tipicamente possuir pelo menoscerca de 50% da atividade imunomodulatória da proteína de comprimentototal correspondente, mais tipicamente pelo menos 60% de tal atividade,mais tipicamente pelo menos 70% de tal atividade, mais tipicamente pelomenos 80% de tal atividade, mais tipicamente pelo menos 90% de tal ativi-dade, e mais tipicamente pelo menos 95% de tal atividade.

Conforme adicionalmente aqui descrito, os presentes inventoresdemonstraram também que a adição de um resíduo de glicina ao terminal Nde Cpn 10 aumenta a atividade imunomodulatória. É contemplado que a pre-sença de um grupo acetil, ou aminoácido que compartilha homologia estrutu-ral a um grupo acetil, tal como um resíduo de alanina, ou um resíduo de gli-cina, aumentam a atividade imunomodulatória da Cpn 10.

O termo "variante", conforme aqui usado, refere-se a moléculassubstancialmente similares. Geralmente, variantes de seqüência de ácidonucléico codificam polipeptídeos que possuem atividade biológica qualitativaem comum. Geralmente, variantes de seqüência de polipeptídeo tambémpossuem atividade biológica qualitativa em comum. Adicionalmente, estasvariantes de seqüência de polipeptídeo podem compartilhar pelo menos40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência, e 70%, 75%, 80%, 82%,85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência.

Adicionalmente, um polipeptídeo variante pode incluir análogos,no qual o termo "análogo" significa um polipeptídeo que é um derivado deCpn 10, cujo derivado compreende adição, retirada, substituição de um oumais aminoácidos, tal que o polipeptídeo retém substancialmente a mesmafunção como Cpn 10 nativa. É bem conhecido na técnica que alguns amino-ácidos podem ser mudados dentro de um polipeptídeo sem alterar a ativida-de do polipeptídeo (substituições conservativas). O termo "substituição deaminoácido conservativa" refere-se a um substituição ou reposição de umaminoácido por outro aminoácido com propriedades similares dentro de umacadeia de polipeptídeo (seqüência principal de uma proteína). Por exemplo,a substituição de ácido glutâmico de aminoácido carregado (GIu) pelo ácidoaspártico de aminoácido carregado (Asp) seria uma substituição de aminoá-cido conservativa. Adições de aminoácido podem resultar da fusão de umpolipeptídeo de Cpn 10, ou fragmento deste, com um segundo polipeptídeoou peptídeo, tal como uma etiqueta de polihistidina, fusão de proteína deligação de maltose, fusão de glutationa S transferase, fusão de proteína fluo-rescente verde, ou a adição de uma etiqueta de epítope, tal como FLAG ouc-myc. Por exemplo, o polipeptídeo de Cpn 10 humana tipo selvagem podecompreender uma porção de tripeptídeo GSM adicional no terminal C (SEQID NO:2; ver, por exemplo, WO 95/15338, a descrição do qual sendo incor-porada aqui por referência), ou uma alanina adicional (A) reside no terminal-N (SEQ ID NO:3; WO 2004/041300, a descrição do qual sendo incorporadaaqui por referência), ou uma glicina adicional (G) no terminal-N, SEQ IDNO:4 (ver, por exemplo, PCT/AU2006/001278). O polipeptídeo de Cpn 10tipo selvagem pode ou não pode incluir a metionina de iniciação no terminal-N. O polipeptídeo de Cpn 10 tipo selvagem pode ser modificado no terminal-N ou no terminal-C pela adição, retirada ou substituição de um ou mais resí-duos de aminoácido.

Em outro exemplo, o polipeptídeo de Cpn 10 humano tipo selva-gem pode carecer do laço móvel (SEQ ID NO:7), laço de topo em forma degrampo de cabelo Beta (SEQ ID NO:9), ou ambos (SEQ ID NO:11), que po-dem ser observados, por exemplo, em PCT/AU20061278, a descrição doqual sendo incorporada aqui por referência. Em adição, o polipeptídeo deCpn 10 humano tipo selvagem pode conter retiradas de tripeptídeo no laçomóvel conforme colocado em SEQ ID NO: 13, 15 ou 17 (ver, por exemplo,PCT/AU2006/001278, a descrição do qual sendo incorporada aqui por refe-rência. A presente invenção também contempla o uso de polinucleotídeosque codificam tais formas modificadas de Cpn 10.

Variantes de CpnIO podem ser geradas por mutagênese de umaproteína de Cpnl 0, ou mutagênese de um ácido nucléico de codificação, talcomo por mutagênese aleatória, ou mutagênese de local dirigido usando-semétodos bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Tais métodos podemser encontrados, por exemplo, em Current Protocols In Molecular Biology(Capítulo 9), Ausubel et ai, 1994, John Wiley & Sons, Inc., New York, a des-crição do qual sendo incorporada aqui por referência. Variantes e análogostambém envolvem polipeptídeos complexados com outras porções químicas,proteínas de fusão, ou, de outro modo, pós-tranlacionalmente modificados.Exemplos de modificações adequadas são descritos no Pedido de PatenteInternacional N0 PCT/AU2005/000041, a descrição do qual sendo incorpora-da aqui por referência.

Adicionalmente, o polipeptídeo de Cpn10, ou fragmento deste,pode possuir outras modificações pós-translacionais, incluindo modificaçõesde cadeia lateral, tais como, por exemplo, acetilação, amidinação, carbamoi-lação, alquilação redutiva, e outras modificações, conforme são conhecidasàqueles técnicos no assunto.

Um exemplo adicional de uma variante de chaperonina 10 é umque carece ou substancialmente carece de atividade de dobramento de pro-teína, e exemplos de tais modificações são descritos no Pedido de PatenteInternacional (PCT) PCT/AU2006/001278, a descrição do qual sendo incor-porada aqui por referência.

Produção de CpnIO

De acordo com a presente invenção, polipeptídeos de CpnIOpodem ser produzidos usando-se técnicas padrão de DNA recombinante ebiologia molecular que são bem conhecidas àqueles técnicos no assunto.Orientação pode ser obtida, por exemplo, de textos padrões, tais comoSambrook et aí., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har-bor, New York, 1989, e Ausubel eí a/., Current Protocols in Molecular Bio-logy, Greene Publ. Assoc. e Wiley-lntersciences, 1992. Métodos descritosem Morton et ai, 2000 (Immunol Cell Biol 78:603-607), Ryan et ai, 1995 (JBiol Chem 270:22037-22043) e Johnson et ai, 2005 (J Biol Chem 280:4037-4047) são exemplos de métodos de purificação adequados para polipeptí-deos de Cpn10, embora o técnico no assunto apreciará que a presente in-venção não é limitada pelo método de purificação ou produção usado, equalquer outro método pode ser usado para produzir CpnIO para uso de a-cordo com os métodos e composições da presente invenção. Peptídeos deCpnIO podem ser produzidos por digestão de um polipeptídeo com uma oumais proteinases, tais como andoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C e staphylo-coccus V8-protease. Os fragmentos de peptídeo digeridos podem ser purifi-cados por, por exemplo, técnicas cromatográficas líquidas de alto desempe-nho (HPLC).

A purificação de polipeptídeos de CpnIO da invenção pode serprovida para proposta de produção de larga escala. Por exemplo, conformeaqui descrito, os presentes inventores desenvolveram um bioprocesso paraa produção de grandes quantidades (grama) de polipeptídeos de ConIO degrau clínico altamente puros, por fermentação de batelada em E. coli.

Os polipeptídeos de CpnIO da presente invenção, bem comofragmentos e variantes destes, podem ser sintetizados por métodos padrãode química de fase líquida e sólida bem conhecidos àqueles técnicos no as-sunto. Por exemplo, tais moléculas podem ser sintetizadas seguindo os pro-cedimentos de química de fase sólida de Steward and Young (Steward, J. M.& Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis. (2nd Edn.) Pierce ChemicalCo., Illinois, USA (1984).

Em geral, tal método de síntese compreende a adição seqüenci-al de um ou mais aminoácidos, ou aminoácidos protegidos adequados paraum desenvolvimento de cadeia de peptídeo. Tipicamente, ou grupo amino oucarboxila do primeiro aminoácido é protegido por um grupo de proteção ade-quado. O aminoácido protegido é então ou fixado a um suporte sólido inerte,ou utilizado na solução pela adição do próximo aminoácido na seqüênciatendo o grupo complementar (amino ou carboxila) adequadamente protegi-do, e sob condições adequadas para formação da ligação de amida. O grupode proteção é então removido a partir deste resíduo de aminoácido recente-mente adicionado e o próximo aminoácido (protegido) é adicionado, e assimpor diante. Após todos os aminoácidos desejados tiverem sido ligados,quaisquer grupos de proteção remanescentes, e se necessário qualquer su-porte sólido, são removidos seqüencialmente ou concorrentemente paraproduzir o polipeptídeo final.

Mudanças de aminoácido em polipeptídeos de CpnIO podem serefetuadas por técnicas bem conhecidas àqueles técnicos no assunto. Porexemplo, mudanças de aminoácido podem ser efetuadas por técnicas desubstituição de nucleotídeo que incluem a adição, retirada ou substituição denucleotídeos (conservativa e/ou não-conservativa) sob a condição que a es-trutura de leitura correta é mantida. Técnicas exemplares incluem mutagê-nese aleatória, mutagênese de local direcionado, mutagênese mediada poroligonucleotídeo, ou mediada por polinucleotídeo, retirada de região(ões)selecionada(s) através do uso de locais de enzima existentes ou projetados,e a reação de cadeia de polimerase.

A geração de atividade imunomodulatória pelo polipeptídeo deCpnIO da invenção pode envolver a formação de heptâmeros dos polipeptí-deos de Cpn10. O teste de atividade imunodulatória para a proposta da pre-sente invenção pode ser, via qualquer uma de um número de técnicas co-nhecidas àqueles técnicos no assunto. Conforme exemplificado aqui, a ativi-dade imunomodulatória de polipeptídeos de CpnIO pode ser determina ape-la medição da capacidade do polipeptídeo modular a sinalização do receptorsimilar a Toll TLR4, por exemplo, usando um bioensaio de luciferase, e, tipi-camente, na presença de um agosnístico de TLR4, tal como um Iipopolissa-carídeo. Alternativamente ou em adição, a atividade imunomodulatória podeser determina usando-se outros ensaios in vitro, ex vivo ou in vivo, por e-xemplo, via medição de produção de NF-kB, ou a produção de citoquinasnas células, tais como células mononucleares de sangue periférico.

Composições e rotas de administração

Em geral, composições adequadas para uso de acordo com osmétodos da presente invenção podem ser preparadas de acordo com osmétodo e procedimentos que são conhecidos àqueles técnicos no assunto e,conseqüentemente, podem incluir um veículo farmaceuticamente aceitável,diluente e/ou adjuvante.

De acordo com a presente invenção, uma composição de CpnIOpode ser preparada compreendendo CPnIO sozinho, ou como uma compo-sição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável,diluente e/ou adjuvante. Alternativamente, a composição de CpnIO podeadicionalmente compreender um agente imunossupressor.

O agente imunossupressor pode ser uma fármaco imunossu-pressora, ou um anticorpo específico direcionado contra linfócitos B ou T, oureceptores de superfície que medeiam sua ativação. Por exemplo, o fármacoimunossupressor pode ser ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolatomofetil, metotrexato, cromoglicatos, teofilina, antagonista de leucotrieno, ouanti-histamina, ou uma combinação destes.

Em adição, a composição farmacêutica para uso de acordo coma invenção pode ainda adicionalmente compreender um esteróide, tal comocorticosteróide.

As composições podem ser administradas por rotas padrões.Em geral, as composições podem ser administradas por rota parenteral (porexemplo, intravenosa, intraespinhal, subcutânea ou intramuscular), oral, outópica. A administração pode ser sistêmica, regional ou local. A rota particu-lar de administração a ser usada em qualquer dada circunstância dependeráde um número de fatores, incluindo a natureza da condição a ser tratada, aseveridade e extensão da condição, a dosagem requerida do composto par-ticular a ser distribuído, e os efeitos colaterais potenciais do composto.

Em geral, composições adequadas podem ser preparadas deacordo com os métodos que são conhecidos àqueles técnicos no assunto, epodem incluir um diluente farmaceuticamente aceitável, adjuvante e/ou exci-piente. Os diluentes, adjuvantes e excipientes devem ser "aceitáveis" emtermos de serem compatíveis com os outros ingredientes da composição, enão danosos ao recipientes destes.

Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis, ou diluen-tes, são água desmineralizada ou destilada; solução salina, óleo baseadosem vegetal, tais como óleo de amendoim, óleo de girassol, óleo de oliva,óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleos de gergelim, tais comoóleo de amendoim, óleo de girassol, óleo de oliva, óleo de semente de algo-dão, óleo de milho, óleo de gergelim, óleo de arachis, ou óleo de coco; óleosde silicone, incluindo polissiloxanos, tais como metil polissiloxano, fenil polis-siloxano e metilfenil polissiloxano; silicones voláteis; óleos minerais, tais co-mo parafina líquida, parafina macia, ou esqualano; derivados de celulose,tais como metil celulose, etil celulose, carboximetilcelulose, carboximetilcelu-lose de sódio ou hidroxipropilmetilcelulose; alcanóis inferiores, por exemplo,etanol ou iso-propanol; aralcanóis, polialquileno glicóis inferiores, ou alquile-no glicóis inferiores, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, etile-no glicol, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, ou glicerina; ésteres de ácidograxo, tais como palmitato de isopropila, miristato de isopropila, ou oleato deetila; polivinilpirrolidona; ágar; carregenina; goma de tragacanto ou gomaacácia, e geléia de petróleo. Tipicamente, o veículo ou veículos formarão de10% a 99,09% por peso das composições.

As composições da invenção podem estar em uma forma ade-quada para administração por injeção, na forma de uma formulação adequa-da para ingestão oral (tais como cápsulas, comprimidos, comprimidos reves-tidos, elixires, por exemplo) na forma de um ungüento, creme ou joção ade-quados para administração tópica, em uma forma adequada para distribui-ção como uma gota no olho, em uma forma de aerossol (tal como líquido oupó), adequados para administração por inalação, tal como por inalação nasalou inalação oral, èm uma forma desejável para administração parenteral, istoé, injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa.

Para administração como uma solução injetável ou suspensão,diluentes parenteralmente aceitáveis não-tóxicos ou veículos podem incluir,solução de Ringer, salina isotônica, salina tamponada por fosfato, etanol, e1,2-propileno glicol.

Alguns exemplos de veículos adequados, diluentes, excipientese adjuvantes para uso oral, incluem óleo de amendoim, parafina líquida, car-boximetilcelulose de sódio, metilcelulose, alginato de sódio, goma de acácia,goma tragacanto, dextrose, sucrose, sorbitol, manitol, gelatina e lectin. Emadição, estas formulações orais podem conter agentes aromatizantes e colo-rantes adequados. Quando usados na forma de cápsula, as cápsulas podemser revestidas com compostos, tais como monoestearato de glicerina ou di-estearato de glicerila que retardam a desintegração.

Adjuvantes incluem tipicamente emolientes, emulsificadores,agentes de espessamento, conservantes, bactericidas e agentes de tampo-namento.

Formas sólidas para administração oral podem conter Iigantesaceitáveis na prática farmacêutica humana e veterinária, adoçantes, agentesde desintegração, diluentes, aromatizantes, agentes de revestimento, agen-tes lubrificantes e/ou agentes de retardamento de tempo. Ligantes adequa-dos incluem goma acácia, gelatina, amido de milho, goma de tragacanto,alginato de sódio, carboximetilcelulose ou polietileno glicol. Adoçantes ade-quados incluem sacarose, lactose, glicose, aspartame ou sacarina. Agentesdesintegrantes adequados incluem amido de milho, metilcelulose, polivinilpir-rolidona, goma guar, goma de xantano, bentonita, ácido algínico ou ágar.Diluentes adequados incluem lactose, sorbitol, manitol, dextrose, caulim,celulose, carbonato de cálcio, silicato de cálcio ou fosfato de dicálcio. Agen-tes aromatizantes incluem óleo de hortelã-pimenta, óleo de pirola, aromati-zante de cereja, laranja ou framboesa. Agentes de revestimento adequadosincluem polímeros ou copolímeros de ácido acrílico e/ou ácido metacrílicoe/ou seus ésteres, ceras, álcoois graxos, zeina, shellac ou glúten. Preserva-tivos adequados incluem benzoato de sódio, vitamina E1 alfa-tocoferol, ácidoascórbico, metil parabeno, propil parabeno, ou bissulfito de sódio. Lubrifican-tes adequados incluem estearato de magnésio, ácido esteárico, oleato desódio, cloreto de sódio, ou talco. Agentes de retardamento de tempo ade-quados incluem monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila.

Formas líquidas para administração oral podem conter, em adi-ção aos agentes acima, um veículo líquido. Veículos líquidos adequadosincluem água, óleos, tais como óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo degergelim, óleo de girassol, óleo de archis, óleo de coco, parafina líquida, eti-Ieno glicol, propileno glicol, polietileno glicol, etanol, propanol, isopropanol,glicerol, álcoois graxos, triglicerídeos, ou misturas destes.

Suspensões para administração oral podem compreender adi-cionalmente agentes dispersantes e/ou agentes de suspensão. Agentes desuspensão adequados incluem sódio carboximetilcelulose, metilcelulose,hidroxipropilmetil-celulose, poli-vinil-pirrolidona, alginato de sódio ou acetilálcool. Agentes de dispersão adequados incluem lecitina, polioxietileno éste-res de ácidos graxos, tais como ácido esteárico, polioxietileno sorbitol mono-ou di-oleato, -estearato ou -laurato, polioxietileno sorbitano mono- ou di-oleato, -estearato ou -laurato, e similares.

As emulsões para administração oral podem compreender adi-cionalmente um ou mais agentes de emulsificação. Agentes de emuísifica-ção adequados incluem agentes dispersantes conforme exemplificados aci-ma, ou gomas naturais, tais como goma guar, goma acácia ou goma de tra-gacanto.

Métodos para preparação de composições parenteralmente ad-ministráveis são aparentes àqueles técnicos no assunto, e são descritos emmaiores detalhes em, por exemplo, Remingtons's Pharmaceutical Science,15a edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa., desse modo incorpora-do por referência.

As formulações tópicas da presente invenção compreendem umingrediente ativo junto com um ou mais veículos aceitáveis, e opcionalmentequaisquer outros ingredientes terapêuticos. Formulações adequadas paraadministração tópica incluem preparações líquidas ou semilíquidas adequa-das para penetração através da pele ao local onde tratamento é requerido,tais como paliativos, loções, cremes, ungüentos ou pastas, e gotas adequa-das para administração ao olho, ouvido ou nariz.

Gotas de acordo com a presente invenção podem compreendersoluções ou suspensões aquosas ou oleosas estéreis. Estas podem ser pre-paradas pela dissolução do ingrediente ativo em uma solução aquosa de umagente bactericida e/ou fungicida, e/ou qualquer outro conservante adequa-do, e adicionalmente incluindo um agente ativo de superfície. A solução re-sultante pode, em seguida, ser clareada por filtração, transferida para umrecipiente adequado, e esterilizada. A esterilização pode ser efetuada por:autoclave ou manutenção a 90°C-100°C por meia hora, ou por filtração, se-guido pela transferência para um recipiente por uma técnica asséptica. E-xemplos de agentes bactericida e fungicida adequados para inclusão nasgotas são nitrato ou acetato fenilmercúrico (0,002%), cloreto de benzalcônio(0,01%) e acetato de cloroxidina (0,01%). Solventes adequados para a pre-paração de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluído, e propilenoglicol.

Loções de acordo com a presente invenção incluem aquelas a-dequadas para aplicação à pele ou ao olho. Uma loção de olho pode com-preender uma solução aquosa estéril opcionalmente contendo um bacterici-da, e pode ser preparada por métodos similares àqueles acima em relação àpreparação de gotas. Loções ou paliativos para aplicação à pele podemtambém incluir um agente para acelerar a secagem e arrefecer a pele, talcomo um álcool ou cetona, e/ou umidificador, tal como glicerol, ou óleo, taiscomo óleo de rícino ou óleo de arachis.

Cremes, ungüentos ou pastas, de acordo com a presente inven-ção, são formulações semi-sólidas do ingrediente ativo para aplicação exter-na. Eles podem ser produzidos pela mistura do ingrediente ativo na formafinamente dividida ou pó, sozinha ou em solução ou suspensão, em um lí-quido aquoso ou não-aquoso, com uma base de graxa ou sem graxa. A basepode compreender hidrocarbonetos, tais como parafina dura, macia ou líqui-da, glicerol, cera de abelha, um sabão metálico; uma mucilagem; um óleo deorigem natural, tal como óleo de amêndoa, milho, arachis, rícino ou oliva;gordura cie lã ou seus derivados, ou um ácido graxo, tais como ácido esteá-rico ou ácido oléico, junto com um álcool, tal como propileno glicol ou ma-crogóis.

As composições podem incorporar qualquer tensoativo adequa-do, tais como tensoativos aniônico, catiônico ou não-iônico, tais como sorbi-tano ésteres, ou derivados de polioxietileno destes. Agentes de suspensão,tais como gomas naturais, derivados de celulose, ou materiais inorgânicos,tais como sílicas silicaceosas, e outros ingredientes, tais como lanolina, po-dem também ser incluídos.

As composições podem também ser administradas na forma delipossomos. Os Iipossomos são geralmente derivados de substâncias fosfo-lipídeas, ou outros lipídeos, e são formados por cristais líquidos hidratadosmono- ou multilamelar, que são dispersos em um meio aquoso. Qualquerlipídeo não-tóxico, fisiologicamente aceitável e metabolizável de formação delipossomos, pode ser usado. As composições em forma de Iipossomo po-dem conter estabilizadores, conservantes, excipientes e similares. Os lipí-deos preferidos são os fosfolipídeos e as fosfatidil colinas (lecitins), ambosnatural e sintético. Métodos para formar lipossomos são conhecidos na téc-nica, e em relação a esta referência específica são produzidos em: Prescott,Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y.(1976), p. 33 et seq., o conteúdo do qual sendo incorporado aqui por refe-rência.Dosaqens

Para a proposta da presente invenção, moléculas e agentes po-dem ser administrados a indivíduos como composições, ou terapeuticamen-te, ou preventivamente. Em uma aplicação terapêutica, as composições sãoadministradas a um paciente que já sofrem de uma doença, em uma quanti-dade suficiente para curar, ou pelo menos parcialmente reprimir, a doença esuas complicações. A composição deve proporcionar uma quantidade damolécula ou agente suficiente para tratar efetivamente o paciente.

O nível de dose terapeuticamente eficaz para qualquer pacienteparticular dependerá de uma variedade de fatores incluindo: da enfermidadea ser tratada e a severidade da enfermidade; da atividade da molécula ouagente empregado; da composição empregada; da idade, do peso corpóreo,da saúde geral, sexo e dieta do paciente; do tempo de administração; darota de administração; da taxa de seqüestro da molécula ou agente; da du-ração do tratamento; fármacos usadas em combinação ou co-incidentaiscom o tratamento, junto com outros fatores relacionados bem conhecidos namedicina.

Um técnico no assunto seria capaz, por experimentação de roti-na, de determinar uma quantidade não-tóxica eficaz de agente ou compostoque seria requerida para tratar doenças aplicáveis.

Geralmente, uma dosagem eficaz é esperada estar na faixa decerca de 0,0001 mg a cerca de 1000 mg por kg de peso corpóreo por 24 ho-ras; tipicamente, cerca de 0,001 mg a cerca de 750 mg por kg de peso cor-póreo por 24 horas; cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg por kg de pesocorpóreo por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 500 mg por kg de pesocorpóreo por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 250 mg por kg de pesocorpóreo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 250 mg por kg de pesocorpóreo por 24 horas. Mais tipicamente, uma faixa de dose eficaz é espera-da estar na faixa de cerca de 1,0 mg a cerca de 200 mg por kg de peso cor-póreo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 100 mg por kg de peso cor-póreo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 50 mg por kg de peso corpó-reo por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 25 mg por kg de peso corpóreopor 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 20 mg por kg de peso corpóreo por24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 15 mg por kg de peso corpóreo por 24horas.

Alternativamente, uma dosagem eficaz pode ser até cerca de500mg/m2. Geralmente, uma dosagem eficaz é esperada estar na faixa decerca de 25 a cerca de 500mg/m2, preferivelmente cerca de 25 a cerca de350mg/m2, mais preferivelmente cerca de 25 a cerca de 300mg/m2, aindamais preferivelmente cerca de 25 a cerca de 250mg/m2, ainda mais preferi-velmente cerca de 50 a cerca de 250mg/m2, e ainda mais preferivelmentecerca de 75 a cerca de 150mg/m2,

Tipicamente, em aplicações terapêuticas, o tratamento seria pa-ra a duração do estado da doença.

Adicionalmente, será aparente a um técnico no assunto que aquantidade adicional e espaçamento de dosagens individuais serão determi-nados pela natureza e extensão da doença sendo tratada, a forma, rota elocal de administração, e a natureza do indivíduo particular sendo tratado.Também, tais condições ótimas podem ser determinadas por técnicas con-vencionais.

Será aparente a um técnico no assunto que o curso ótimo detratamento, tais como, o número de doses da composição dado por dia paraum número definido de dias, pode ser determinado por aqueles técnicos noassunto usando-se curso convencional de testes de determinação de trata-mento.

Agonísticos e antagonistas de CpnIO

A presente invenção também contempla o uso de agonísticos eantagonistas de Cpn10, e métodos de classificação e produção de tais ago-nísticos e antagonistas.

Agonísticos e antagonistas de CpnIO podem ser especificamen-te designados ou classificados de acordo com seu efeito sob sinalização deTLR e secreção de imunomodulador.

Anticorpos podem agir como agonísticos e antagonistas deCpn10, ou fragmentos ou análogos destes. Anticorpos preferivelmente ade-quados são preferidos a partir de regiões discretas ou fragmentos do poli-peptídeo de Cpn 10, em particular aqueles envolvidos em conferir atividadede protease e/ou co-participante ou ligação de substrato. Um polipeptídeo deCpnIO antigênico contém pelo menos 5, e preferivelmente pelo menos 10aminoácidos.

Métodos para a geração de anticorpos adequados serão pron-tamente apreciados por aqueles técnicos no assunto. Por exemplo, um anti-corpo monoclonal anti-CprrlO, tipicamente contendo porções de Fab, podeser preparado usando-se a tecnologia de hibridoma descrita em Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Labora-tory, N.Y. (1988).

Na essência, na preparação de anticorpos monoclonais direcio-nados a Cpn10, ou fragmento, ou análogo deste, qualquer técnica que pro-porciona a produção de moléculas de anticorpo por linhas de célula contí-nuas na cultura, pode ser usada. Estas incluem a técnica de hibridoma origi-nalmente desenvolvida por Kohler et al., 1975, Nature, 256:495-497, bemcomo a técnica de trioma. A técnica de hibridoma de célula B humana (Koz-bor et ai, 1983, Immunology Today, 4:72), e a técnica de EBV-hibridomapara produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., em MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Icc., (1985)). Linhasde células de produção de anticorpo imortais podem ser criadas por técnicasoutras que fusão, tais como transformação direta de linfócitos B com DNAoncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M.Schreier et al., "Hybridoma Techniques* (1980); Hammerling et al, "Mono-clonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981); Kennet et al, "MonoclonalAntibodies" (1980).

Em resumo, um meio de produzir um hibridoma do qual o anti-corpo monoclonal é produzido, um mieloma ou outra linha de célula de auto-perpetuação, é fundido com linfócitos obtidos a partir do pulmão de um ma-mífero hiperimunizado com uma porção de ligação de fator de reconheci-mento deste, um fator de reconhecimento, ou uma porção de ligação deDNA de origem específica deste. Os hibridomas que produzem um anticorpomonoclonal úteis na prática desta invenção são identificados por sua capaci-dade de imunorreagir com o presente fator de reconhecimento, e sua capa-cidade de inibir atividade transcricional especificada em células alvos.

Um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invençãopode ser produzido pela iniciação de uma cultura de hibridoma monoclonalcompreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que secreta mo-léculas de anticorpo da especificidade de antígeno apropriada. A cultura émantida sob condições, e por um período de tempo suficiente para o hibri-doma secretar as moléculas de anticorpo no meio. O meio contendo anticor-po é então coletado. As moléculas de anticorpo podem, em seguida, ser adi-cionalmente isoladas por técnicas bem conhecidas.

Similarmente, existem vários procedimentos conhecidos na téc-nica que podem ser usados para a produção de anticorpos monoclonais.Para a produção de anticorpo monoclonal anti-Cpn10, vários animais hospe-deiros podem ser imunizados por injeção com Cpn10, ou um fragmento ouanálogo deste, incluindo, mas não limitados a, coelhos, galinhas, camun-dongos, ratos, ovelhas, cabras, etc. Adicionalmente, o polipeptídeo deCpn10 ou fragmento ou análogo deste, pode ser conjugado a um veículoimunogênico, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA), ou hemocianinade lapa de buraco de fechadura (KLH). Também, vários adjuvantes podemser usados para aumentar a resposta imunológica, incluindo, mas não limi-tada a, de Freund1S (completa ou incompleta), géis minerais, tais como hi-dróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitina,polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianins delapa de buraco de fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencial-mente úteis, tais como BCG (bacilos Calmette-Guerin) e Corynebacteriumparvum.

A classificação para o anticorpo desejado pode também ser efe-tuada por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Ensaios paraligação imunoespecífica de anticorpos podem incluir, mas não estão limita-dos a, rádio-imunoensaios, ELISAs (ensaio imunoabsorvente ligado à enzi-ma), imunoensaios intercalados, ensaios imuno-radiométricos, reações deprecipitação de difusão de gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios insitu, manchas de Western, reações de precipitação, ensaios de aglutinação,ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaiosde proteína A, e ensaios de imunoeletroforese, e similares (ver, por exemplo,Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1,John Wiley & Sons, Inc., New York). A ligação do anticorpo pode ser detec-tada em virtude de uma etiqueta detectável no anticorpo primário. Alternati-vãmente, o anticorpo pode ser detectado em virtude de sua ligação com umanticorpo secundário ou reagente que é apropriadamente etiquetado. Umavariedade de métodos é conhecida na técnica para detectar ligação em umimunoensaio, e estão dentro do escopo da presente invenção.

O anticorpo (ou fragmento deste) elevado contra Cpn10, ou umfragmento ou análogo deste, tem afinidade de ligação para Cpn10. Preferi-velmente, o anticorpo (ou fragmento deste) tem afinidade de ligação, ou avi-dez, maiores do que cerca de 105 M"1, mais preferivelmente maiores do quecerca de 106 M"1, mais preferivelmente ainda maiores do que cerca de 107 M",e, mais preferivelmente, maiores do que cerca de 108 M"1.

Em termos de obtenção de uma quantidade adequada de umanticorpo de acordo com a presente invenção, pode-se manufaturar o(s) an-ticorpo(s) usando-se fermentação em batelada com meio livre de soro. Apósfermentação, o anticorpo pode ser purificado via um procedimento de etapasmúltiplas incorporando etapas de cromatografia e inativação/remoção viral.Por exemplo, o anticorpo pode ser primeiro separado por cromatografia deafinidade de Proteína A e, em seguida, tratado com solvente/detergente parainativar quaisquer vírus envelopados por lipídeo. Purificação adicional, tipi-camente por cromatografia de troca de ânion e cátion, pode ser usada pararemover proteínas residuais, solventes/detergentes, e ácidos nucléicos. Oanticorpo purificado pode ser adicionalmente purificado e formulado em0,9% de salina usando-se colunas de filtração de gel. A preparação de mas-sa formulada pode, em seguida, ser esterilizada e viral filtrado e dispensado.

Agonísticos e antagonistas outros que anticorpos são tambémcontemplados. Um agonístico e antagonista candidato podem ser identifica-dos por uma capacidade de formar um complexo molecular com um ou maisdos TLR1S, e/ou suas moléculas adaptadoras como um agonístico. Adicio-nalmente, um antagonista candidato pode ser identificado por uma capaci-dade de prevenir ou interromper formação de um complexo molecular com-preendendo Cpn10, e um ou mais dos TLR1S e/ou suas moléculas adaptado-ras para agirem como um antagonista.

Técnicas e procedimentos para identificação e produção de a-gonísticos e antagonistas são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto,incluindo classificação de bibliotecas de moléculas, tais como bibliotecasquímicas sintéticas, tais como bibliotecas combinatoriais, classificação auxi-liada por computador de bases de dados estruturais, modelagem /ou dese-nho auxiliado por computador, ou técnicas biofísicas mais tradicionais quedetectam interações de ligação molecular.

A presente invenção será agora descrita com referência a e-xemplos específicos, que não devem ser construídos, de qualquer modo,como limitando o escopo da invenção.Exemplos

Exemplo 1: Teste de eficácia de CpnIO em um modelo de asma de ácaro depó de residência de ovelha

A inflamação da via aérea é central à patogênese de asma, eenvolve o recrutamento e ativação de eosinófilos, células de haste, neutrófi-Ios e linfócitos no tecido de pulmão, e espaços broncoalveolares (Besse etai., 2001). O ácaro de pó de residência foi mostrado ser a causa alérgenamais comum de asma alérgica em seres humanos, com indivíduos sensíveisdesenvolvendo respostas de igE específicos e IgG humorais (Roche et al.,1997). O modelo de animal aproximado de asma permitiria que investiga-ções definidas e controladas fossem conduzidas com relevância direta à do-ença humana.

Modelos de ovelha anteriores de asma são baseados em ani-mais sensíveis a alérgenos de nematode (Ascaris), e os resultados extrapo-lam a avaliação de efeitos fisiológicos e farmacológicos de fármacos antias-ma potenciais. Um modelo de inflamação alérgica de pulmão em ovelha u-sando ácaro de pó de residência como um alérgeno com relevância direta àdoença alérgena humana foi recentemente estabelecido. Neste modelo, ove-lhas sensíveis desenvolveram resposta alérgena-específica de IgE com re-crutamento de neutrófilos, eosinófilos e linfócitos ativados no tecido de pul-mão, e BAL com cinéticas similares a humano impugnado com alérgeno deHDM (Bischof et al, 2003).

Os experimentos aqui descritos consideram-se CpnIO adminis-trados, via injeção intravenosa ou instilado diretamente no pulmão, podemafetar as manifestações clínicas e imunológicas de resposta alérgica à im-pugnação de ácaro de pó de residência em ovelha sensível.

Materiais & Métodos

Ovelhas (n = 10) foram imunizadas com extrato de ácaro de póde residência solubilizado, e selecionadas para respostas alérgeno-específicas de IgE e eosinofilia de lavagem broncoalveolar (BAL). Os ani-mais foram, em seguida, tratados com ou CpnIO (0,5, 4 ou 16 mg), ou veícu-lo distribuído, via injeção intravenosa (n=5), ou distribuído diretamente emum lado do pulmão, e veículo no outro lado do pulmão antes de impugnaçãocom HDM usando-se broncoscopia de fibra ótica. O fluido de lavagem bron-coalveolar e amostras de sangue foram coletados em 6 e 48 horas e 7 diasde pós impugnação de HDM para enumeração de contagens de célula dife-rencial, quantificação de BAL citoquina, e quantificação de IgE de soro. Ascélulas de BAL foram também armazenadas em meio de isolamento de RNA(Trizol), e congeladas para análise subseqüente de RT-PCR.

Resultados

Em geral, os resultados aqui presentes mostram que CpnIO temum efeito dramático e de dose responsiva na inflamação alérgica em ummodelo de ovelha de asma.

Distribuição intravenosa de Cpn10

A administração intravenosa de Cpn10 resulta em uma reduçãode neutrófilos de BAL no ponto de tempo de 6 horas em uma maneira de-pendente da fármaco. O número de neutrófilos presente em BAL 6 horasapós a 2- impugnação de HDM sozinha, sem tratamento de Cpn10, foi umamédia de 34% entre todas as 6 ovelhas no grupo intravenoso. A percenta-gem de neutrófilos, expressa como uma média de grupo, declinou com oaumento da dose de Cpn10. No ponto de tempo de 6 horas, as doses de 0,5mg, 4 mg e 16 mg de Cpn10 resultou em 15%, 12% e 8% de neutrófilos, emfluido de BAL, respectivamente.

A administração intravenosa de CpnIO resultou em uma reduçãode neutrófilos de BAL no ponto de tempo de 48 horas em uma maneira de-pendente da fármaco. O número de neutrófilos presente em BAL 48 horasapós a 2r impugnação de HDM sozinha, sem tratamento de Cpn10, foi umamédia de 31% entre todas as 6 ovelhas no grupo intravenoso. A percenta-gem de eosinófiios, expressa como uma média de grupo, geralmente decli-nou com o aumento da dose de Cpn10. No ponto de tempo de 48 horas, asdoses de 0,5 mg, 4 mg e 16 mg de CpnIO resultou em 15%, 16% e 11% deeosinófiios, em fluido de BAL, respectivamente.

Distribuição intrapulmonar de Cpn10

As percentagens de neutrófilos de BAL nos pontos de tempo de6 e 48 horas diferem entre püímões direito e esquerdo de ovelhas individuaisatravés da maioria dos tratamentos. Contudo, não existe tendência consis-tente entre os pulmões esquerdo (tratado com Cpn10) e direito (tratado comveículo). As percentagens de eosinófiios de BAL nos pontos de tempo de 6 e48 horas também diferem entre os pulmões direito e esquerdo de ovelhasindividuais através da maioria dos tratamentos. Geralmente não existe ten-dência consistente entre os pulmões esquerdo (tratado com Cpn10) e direito(tratado com veículo), com a exceção da dose de Cpn10 de 4 mg em 48 ho-ras de pós-impugnação. A percentagem de eosinófiios de BAL em cada ove-lha foi mais baixa no pulmão esquerdo 48 horas após impugnação de DHM,e administração de 4 mg (dose total) de CpnIO para o pulmão esquerdocomparado ao pulmão de controle direito. A média de dados de todas asovelhas no grupo i.l. mostra que a infusão local de 4 mg de CpnIO para opulmão esquerdo reduziu o nível de eosinófiios naquele pulmão para 50% dopulmão esquerdo (controle, tratado com veículo).

Respostas de IaE de linha base

Níveis de IgE de soro foram avaliados antes de (dO) e sete diasapós (d7) cada uma das impugnações de HDM, conforme mostrado na Figu-ra 5. Na ausência de Cpn 10 (1ã e 2- impugnações de HDM, os níveis de IgEde soro foram claramente elevados seguindo impugnação de via aérea comHDM. Ovelha #23 era somente a ovelha que não mostra uma alta respostade IgE alta seguindo a impugnação de HDM inicial. Comparados aos níveisde IgE de linha base antes da jI- impugnação de HDM, níveis de IgE dO Ie-vemente elevados foram notados antes das 2- e 3- impugnações de HDM.Em cada caso, isto pode refletir um retorno vagaroso para linha base se-guindo impugnação de HDM 2 semanas antes.

Respostas de IgE para impuqnação de HDM na presença de CpnIO

Cpn10, indiferente da dose ou modo de distribuição, tem um e-feito marcado na resposta de IgE de soro de HDM específico conforme ava-liado em 7 dias pós impugnação de HDM. A administração de CpnIO resul-tou no bloqueio de resposta de IgE de soro, com manutenção em níveis delinha base próximos particularmente evidentes com as 4ã e 5ã impugnaçõesde HDM.

Eosinófilos de lavagem broncoalveolar

BAL foi amostrado na linha de base (Oh), 6 horas e 48 horaspós-impugnação de HDM de via aérea e tratamento de fármaco e númerosde eosinófilos contados. Os resultados até agora são grafados na Figura 1como percentagem de eosinófilos da população de célula total no fluido delavagem amostrado em 48 horas pós impugnação de HDM.

Injeção intravenosa de Cpn 10 administrada antes da impugna-ção de HDM em até redução de 15 vezes em eosinófilos de BAL no pico derecrutamento de eosinófilo em 48 horas pós impugnação.

Quando CpnIO é administrado unilateralmente no pulmão es-querdo, com veículo somente dado ao pulmão direito (controle) usando-sebroncoscópio, uma redução de 4 vezes na percentagem de eosinófilos noBAL a partir do pulmão tratado com CpnIO versus o pulmão de controle émostrada.

Respostas de imunoqlobulina de soro para impugnação de HDM.

Soro foi coletado no dia 0 e dia 7 seguindo administração de ouveículo ou CpnIO e impugnação de HDM. Os soros foram então testados eníveis de IgE específicos de HDM avaliados usando-se ELISA conforme de-talhado em Bischof et al, 2003, com os resultados aqui apresentados comona Figura 2. Os dados indicam níveis de soro de IgE específico de HDM,seguindo cada uma da impugnação de HDM com administração de controlede veículo, e seguindo 4 mg de CpnIO e impugnação de HDM.Mudanças no epitélio de via aérea, célula qloblet e glândula bronquial

A hiperplasia de célula globlet é uma característica de indicaçãode patologia de asma que é induzida por inflamação alérgica das vias aé-reas. Após provocação alérgena, o número de células globlet por unidade decomprimento de epitélio de via aérea é sabido aumentar. Concomitante comum aumento no meio, as células globlet também aumentam de tamanho, erevelam grandes citoplasmas coloridos quando manchados com manchashistológicas azul de PAS/Alcian. A análise do epitélio de via aérea, célulasgloblet e glândulas bronquiais foram realizadas em lâminas histológicasmanchadas de azul PAS/Alcian. Esta análise foi realizada em vias aéreasbronquiais cartilaginosas e glandulares que estão entre 1800 e 3300 μm dediâmetro.

Administração intrapulmonar de Cpn1O em ovelha HDM-impugnada: O número médio de células globlet por mm de membrana defundamento de via aérea foi 33 em ambos pulmões esquerdo e direito deovelha administrada intrapulmonarmente com CpnIO (n=4 ovelhas). As célu-las globelet eram maiores e cheias de grânulos de manchas azuis e verme-lhas.

Administração intravenosa de Cpn1O em ovelha HDM-impugnada: Comparados aos grupos de distribuição intrapulmonares, exis-tem poucas células globlet no epitélio bronquial de ovelha tratada com 4 mgde CpnIO via a i.v. rota. O número médio de células globlet por mm demembrana de fundamento de via aérea foi 16 na ovelha administrada i.v.com CpnIO (n=6 ovelhas). Isto é menos do que metade do número de célu-las globlet do veículo tratado no grupo intrapulmonar (33 células globlet pormm de membrana de fundamento de via aérea). As células globelet no i.v.grupo de CpnIO eram geralmente menos maduras, em que elas eram meno-res, mais cubóides, e tinham menos manchamento citoplásmico.

Epitélio

O epitélio que reveste as vias aéreas é conhecido por ser com-ponente importante nas condições de asma, visto que ele forma uma primei-ra barreira de revestimento contra materiais estranhos.Administração intravenosa de Cpn10 em ovelha HDM-impugnada: Em contraste ao grupo intrapulmonar, o epitélio da via aéreanão era mais cubóide (Figura 6).

Glândulas bronquiais

As glândulas associadas com vias aéreas bronquiais podem serestimuladas para secretarem mucosa e lúmens de glândula após provoca-ção alérgena. Quando manchada com corantes histológicos PAS/Alcian A-zul, a mucosa se mancha de vermelho (indicando mucinas neutras), ou azul(indicando mucinas ácidos).

Administração intrapulmonar de CpnIO em ovelha HDM-impugnada: A análise de lâminas histológicas manchadas de azulPAS/Alcian revelou que as glândulas bronquiais de ambos os grupos de ove-lha tratados intrapulmonarmente estavam secretando muco 48 horas apósimpugnação de HDM e tratamento de CpnlO/veículo (Figura 5). O muco emduas ovelhas foi manchado de PAS vermelho (Figura 5), enquanto nas ou-tras duas ovelhas o muco era predominantemente azul. Uma análise siste-mática de todas as glândulas bronquiais disponíveis a serem classificadasem cada ovelha indicarem que na média o lúmen glandular bronquial foi 23%ocluído com mucosa em pulmões tratados com veículo, e 27% ocluído empulmões tratados com CpnIO (n=4 ovelhas).

Administração intravenosa de CpnIO em ovelha HDM-impugnada: Existe marcadamente menos mucosa presente nos Iumensglandulares de ovelha tratada i.v. comparado àqueles observados nos gru-pos intrapulmonares (Figura 6). A análise de lâminas histológicas mancha-das de azul PAS/Alcian revelou que as glândulas bronquiais de ovelha trata-da i.v. tinham pequenas quantidades de muco Iuminal 48 horas após impug-nação de HDM e tratamento com Cpn10. O muco era predominantementeazul na cor (por exemplo, Figura 6). Uma análise sistemática de todas asglândulas bronquiais disponíveis a serem classificadas na ovelha i.v. tratadaindicou que na média o lúmen glandular bronquial foi 4,8% ocluído com mu-cosa (n=6 ovelhas).Discussão

Os dados a partir deste ensaio mostram claramente que GpnIOsistematicamente distribuído tem a capacidade de melhorar inflamação alér-gica que suporta a patofisiologia de asma. Os neutrófilos, eosinófilos e anti-corpos de IgE são bem conhecidos como sendo componentes importantesde inflamação associada com asma. Este ensaio mostra que CpnIO tem e-feitos de amortecimento significantes em eosinofilia e neutrofilia no BAL1 eno nível de IgE específico de HDM no soro após impugnação de HDM.

A avaliação de administração de CpnIO em ovelha sensível aalérgeno de indução de asma relevante a asma humana tem demonstradouma redução responsiva de dose em eosinófilos que se acumulam no espa-ço broncoalveolar em 40 horas impugnação pós-antígeno. A eosinofilia noBAL de ovelha de impugnação de HDM é similar ao nível de eosinófilo en-contrado em asmáticos humanos (Metzger et al, 1987). Outra característicado modelo usado neste estudo é que a ovelha que revela títulos de soro deIgE específico alto (isto é, ovelha alérgica) se correlaciona com aqueles indi-víduos que geram eosinofilia de BAL prolongada quando impugnada local-mente com HDM1 comparado com ovelha não-alérgica e de controle (Bis-chof, 2003).

A administração i.v. de Cpnl 0 tem claros efeitos dependentes dadose de atenuação de inflamação alérgica. A dose alta de Cpn10 (16 mg) foia mais eficaz na redução da percentagem de neutrófilos e eosinófilos emBAL. A dose de 16 mg de Cpn10 também tem um efeito de amortecimentosignificante no nível de eosinófilos no sangue 24 e 48 horas após impugna-ção comparado a eosinófilos contados nos mesmos pontos de tempo para adose de 4 mg e os segundos ensaios de impugnação sozinhos de HDM.

A CpnIO parece não ter efeitos externos na ovelha através detodo o ensaio conforme seus sinais clínicos principais permanecem dentroda faixa fisiológica normal através de todo período de experimentos. Isto in-dica que CpnIO é bem tolerada na ovelha em todas as doses usadas, indife-rente de se distribuição é através de i.v. ou i.l. rotas.

A análise histológica do animal no pós-morte resultou em algu-mas observações interessantes. A administração i.v. de 4 mg de CpnIO re-sultou em uma redução marcada de um número de parâmetros de patologiaassociados com inflamação alérgica. Em geral, ovelha tratada com i.v. temmenos infiltração de células inflamatórias nas paredes da via aérea, tempoucas e menos células globlet maduras, e tem teor inferior de mucosa nosIumens glandulares bronquiais. Parece existir pouca diferença entre a exten-são de patologia entre pulmões infundidos com veículo (controle) e Cpn10.Em geral, ovelha impugnada intrapulmonarmente tem patologia similar àque-la vista nos animais impugnados de HDM sozinhos.

Em resumo, este ensaio demonstra claramente que CpnIO sis-tematicamente distribuído tem a capacidade de atenuar os componentesinflamatórios suportando chaves de asma.

Exemplo 2: Composições para tratamento

De acordo com o melhor modo de realizar a invenção aqui pro-vida, composições preferidas específicas são esboçadas abaixo. Os seguin-tes são para ser construídos como exemplos meramente ilustrativos decomposições, e não uma limitação do escopo da presente invenção de qual-quer modo.

Exemplo 2(A): Composições para administração parenteral

Uma composição para injeção parenteral pode ser preparadapara conter 0,05 mg a 5 mg de um agente adequado ou composto conformeaqui revelado em 10 mis a 2 litros de 1% de carboximetilcelulose.

Similarmente, uma composição para infusão intravenosa podecompreender 250 ml de solução estéril de Ringer, e 0,05 mg a 5 mg de umagente adequado, ou composto conforme aqui revelado.

Exemplo 2(B): Composição para administração oral

Uma composição de um agente adequado ou composto na for-ma de uma cápsula pode ser preparada pelo enchimento de uma cápsula degelatina dura de duas peças padrão com 500 mg do agente ou composto, naforma de pó, 100 mg de lactose, 35 mg de talco, e 10 mg de estearato demagnésio.Referências

Busse WW, Lemnaske RF Jr. Asthma. N Engl J Méd 2001 ;344-350-62.

Roche N, Chinet TC, Huchon GJ, Allergic and nonallergic inter-actions between house dust mite allergens and airway mucosa. Eur Respir J1997;10:719-26.

Bisehof RJ, Snibson K, Shaw R, Meeusen ENT. Induetion of al-lergie inflammation in the Iungs of sensitized sheep after local challenge withhouse dust mite. Clin Exp Allergy 2003;33:367-75.

Metzger WJ, Zavala D, Richerson HB et al. Local allergen chal-lenge and bronchoalveolar Iavabe of allergic asthmatic lungs. Description ofthe model and local airway inflammation. Am Rev Respir Dis 1987;135:433-40.LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> CBio Limited

<120> TRATAMENTO DE HIPERSENSIBILIDADE

<130> 740815C

<160> 18

<170 > Patentln versão 3.2

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu1 5 10 15

Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Xle Met Leu20 25 30

Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val35 40 45

Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser Val50 55 60

Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val65 70 75 80Val Leu Asp Asp Lya Aep Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Aep Xle Iieu85 90 95

Gly Lys Tyr Val Asp100

<210> 2

<211> 104

<212> PRT

<213> Bomo sapiens

<400> 2

Gly Ser Met Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp1 5 10 15

Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly20 25 30

Ile Met Leu Pro Glu Lys Ser Gla Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val35 40 45

Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro50 55 60

Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly65 70 75 80

Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly85 90 95

Asp Xle Beu Gly Lys Tyr Val Aap100

<210> 3<211><212> PRT<213> Homo Bapiens

<400> 3

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Het20 35 40

Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys65 70 75 80

Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile85 90 95Leu Gly Lys Tyr Val Asp100

<210> 4

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gly Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Meb20 25 30

Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp100<210> 5

<211> 309

<212> DNA

<213> Eomo sapiens

<400> 5

atggcaggac aagogtttag aaagtttctt ccactctttg accgagtatt ggttgaaagg 60

agfcgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attatgcttc cagaaaaatc tcaaggaaaa 120

gtattgcaag caacagtagt cgctgttgga tcgggttcta aaggaaaggg tggagagatt 180

caaccagtta gcgtgaaagt tggagataaa gttcttctcc cagaatabgg aggcaccaaa 240

gtagttctag atgacaagga ttatttccta tttagagatg gtgacattct tggaaagtac 300

gtagaotga 309

<210> 6

<211> 312

<212> DMA

<213> Homo sapiens

<400> 6

atgggtgcgg gceaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt gctggttgaa 60

cgtagcgcgg cggaaaccgt gaccaaaggc ggcattatgc tgccggaaaa aagccagggc 120

aaagtgctgc aggcgaccgt ggttgcggtt ggcagcggca gcaaaggcaa aggcggcgaa 180

attcagccgg tgagcgtgaa agtgggcgat aaagtgetgc fcgccggaata tggcggcaco 240

aaagtggtgc tggatgataa agattatttt otgttccgcg atggcgatat tctgggcaaa 300

tatgtggatt ga 312<210> 7

<211> 86

<212> PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 7

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Airg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala20 25 30

Val Gly Ser Oly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser35 40 45

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys50 55 60

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile65 70 75 80

Leu Gly Lys Tyr Val Asp85

<210> 8

<211> 264

<212> DNA

<213 > Sintético<400> 8

atggcggcgg gfccaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt tctggttgaa 60

cgtagcgcgg gcaaagttct gcaggcgace gttgttgcgg ttggtagcgg cagcaaaggt 120

aaaggcggtg aaattcagcc ggttagcgtg aaagtgggcg ataaagttct gctgccggaa 180

tatggcggca ccaaagttgt gctggatgat aaagattacfc tcctgttccg cgatggtgat 240

atcctgggca aatacgbgga ttaa 264

<210> 9

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo eapiens

<400> 9

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lye Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met20 25 30

Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val50 55 60

Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp65 70 75 8042

Tyr Phe Leu Phe Arg Aap Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp

85 90 95

<210> 10

<211> 291

<212> DKA

<213 > Sintético

<400> 10

atggcggcgg gtcaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt tctggttgaa 60

cgtagcgcgg cggaaaccgt taccaaaggc ggtattatgc tgccggaaaa aagccagggt 120

aaagttctgo aggcgaccgt tgttgcggtt ggtagcggta gccagccggt tagcgtgaaa 180

gtgggcgata aagttctgct gccggaatat ggcggcacca aagttgtgct ggatgataaa 240

gabtacttcc tgttccgcga tggtgatatc ctgggcaaat acgtggatta a 291

<210> 11

<211> 79

<212> PRT

<213 > Eomo sapie&s

<400> 11

Ala Ala GlyGln Ala Pha Arg Lys Phe Leu Pro Leu Pha Asp Arg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Gly Lys Val Leu Gla Ala Thr Val Val Ala20 25 30

Val Gly Ser Gly Ser Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val35 40 45

Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp

50 55 60

Tyr Pbe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp

65

70

75

<210> 12

<211> 243

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60aggagtgctg gaaaagtatt gcaagcaaca gtagtcgctg ttggafccggg ttctcaacca 120

gttagcgtga aagttggaga taaagttctt ctcccagaat atggaggcac caaagtagtt 180

ctagatgaca aggattattt cctatttaga gatggtgaca ttcttggaaa gtacgtagac 240

tga 243

<210> 13

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val1 5 10 15Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Xle Phe 20 25 30

Xle Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala 35 40 45

Val Gly Ser Gly Ser Lye Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln JPro Val Ser 50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Xle 85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp 100

<210> 14

<211> 312

<212> DHA

<213> Homo sapiens

<400> 14

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60

aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcattttca ttccagaaaa atctcaagga 120

aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180

attcaaccag fctagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240aaagtagtfcc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaagtaegtagact ga

<210> 15<211> 102<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Pbe Leu Pro Leu Pbe Asp Arg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Tbr Lye Gly Gly Ile Ile20 25 30

Ile Pro Glu Lys Ser Glxx Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 45

Val Gly Sar Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Gln Ile Gln Pro Val Ser50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Tbr Lye65 70 75 80

Val Val Leu Asp Aep Lye Asp Tyr Pbe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp100<210> 16

<211> 312

<212> DNA

<213> Eono sapiens

<400> 16

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagt attggttgaa 60

aggagtgctg ctgaaactgt aacoaaagga ggcattataa ttccagaaaa atctcaagga 120

aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180

attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240

aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300

tacgtagact ga 312

<210> 17

<211> 110

<212> PHT

<213> Hono sapiens

<400> 17

Ala Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val1 5 10 15

Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Glu Glu20 25 30

Glu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 45Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser50 55 60

Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Tbr Lys65 70 75 80

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile85 90 95

Leu Gly Lys Tyr Val Asp Leu Glu Eis His Hls His Hls His100 105 110

<210> 18

<211> 336

<212> DMA

<213> Homo sapiens

<400> 18

atggcagcag gacaagcgtt tagaaagttt cttccactct ttgaccgagfc attggttgaa 60

aggagtgctg ctgaaactgt aaccaaagga ggcgaagagg aaccagaaaa atctcaagga 120

aaagtattgc aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt ctaaaggaaa gggtggagag 180

attcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240

aaagtagttc tagatgacaa ggattatttc ctatttagag atggtgacat tcttggaaag 300

tacgtagaec tcgagcacca ccaccaccac cactga 336

Claims (23)

1. Método de inibir uma reação de hipersensibiiidade em um in-divíduo, no qual o referido método compreende administrar uma quantidadeeficaz de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, 4, 7, 9, 11, 13,-15 e 17.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido po-lipeptídeo é codificado por uma seqüência de aminoácido selecionada a par-tir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual a rea-ção de hipersensibiiidade envolve a ativação de células selecionadas a partirdo grupo compreendendo: basófilos, eosinófilos, células de haste, neutrófilose linfócitos.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, no qual a reação de hipersensibiiidade envolve a ativação de sinalizaçãode receptor similar a Toll (TLR).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, no qual a reação de hipersensibiiidade envolve níveis altos de eosinófilose imunoglobulina E.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, no qual a reação de hipersensibiiidade é uma reação inflamatória.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, no qual a reação de hipersensibiiidade é selecionada a partir do grupocompreendendo: alergia a alimento, dermatite, conjuntivite alérgica, rinite,eczema, doenças de anafilaxia e respiratória associadas com inflamação davia aérea.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, no qual a doençarespiratória é selecionada a partir do grupo compreendendo: asma, asmaalérgica, asma intrínseca, asma ocupacional, ARDS (síndrome de angústiarespiratória aguda) e COPD (doença pulmonar obstrutiva crônica).

9. Método para tratamento ou prevenção de uma enfermidadeassociada à reação de hipersensibiiidade em um indivíduo, o método com-preendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptí-deo compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo compreendendo SEQ ID NO: 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 e 17, no qual o poli-peptídeo modula sinalização a partir de um receptor similar a Toll.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, no qual o receptorsimilar a Toll é selecionado a partir do grupo compreendendo: TLR1, TLR2,TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 e TLR10.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, no qual referidaseqüência de polipeptídeo é codificada por uma seqüência de polipeptídeoselecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14,-16 ou 18.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-11, no qual o método compreende adicionalmente a administração de pelomenos um agente adicional.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, no qual o agenteé um imunomodulador.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, no qual o imu-nomodulador é um interferon tipo 1.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual o interfe-ron é IFNa ou IFNp.

16. Composição para tratamento ou prevenção de uma enfermi-dade associada à reação de hipersensibilidade em um indivíduo, a composi-ção compreendendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo compreen-dendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consis-tindo em SEQ ID NO: 3, 4, 7, 9, 11, 13, 15 e 17, junto com um agente imu-nossupressor.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, no qual oagente imunossupressor é selecionado a partir do grupo consistindo emcompostos antiinflamatórios e compostos broncodilatadores.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, no qual oagente imunossupressor é selecionado a partir do grupo compreendendo:ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, micofenolato, mofetil, metotrexato, cro-moglicalatos, teofilina, antagonistas leucotrienos, e antihistamina, ou umacombinação destes.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 16, no qual oagente imunossupressor é um anticorpo específico direcionado contra linfó-citos B ou T.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, no qual oanticorpo específico é direcionado contra receptores de superfície de linfóci-to B ou T que mediam ativação de linfócito B ou T.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 16 a 19, no qual a composição compreende adicionalmente um este-róide.

22. Método para tratar ou prevenir uma enfermidade associada àreação de hipersensibilidade em um indivíduo, o método compreendendoadministrar uma quantidade eficaz da composição de acordo com qualqueruma das reivindicações 16 a 21.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 16, no qual aseqüência de polipeptídeo é codificada por uma seqüência de polinucleotí-deo selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12,-14, 16 ou 18.