BR112020011849A2 - composições de vacina e métodos de produção das mesmas - Google Patents

Abstract

São aqui reveladas proteínas de fusão compreendendo uma proteína de trombostasina truncada tendo pelo menos 85% de homologia de sequência para uma proteína de trombostasina, no qual a proteína de trombostasina tem uma supressão de carbóxi terminal; e uma proteína parceira de fusão que é uma proteína de não-trombostasina. Adicionalmente reveladas são composições de vacina de proteína de trombostasina tendo uma supressão de carbóxi terminal, e métodos para inibição de uma resposta a uma proteína de trombostasina em um hospedeiro em necessidade desta, compreendendo as proteínas de fusão reveladas, ou composições de vacina. Adicionalmente revelados são métodos para a preparação de uma composição de proteína de fusão.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES DE VACINA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DAS MES- MAS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade e benefício do Pedido Provisório U.S. No. 62/598.658, intitulado Trombostasinas para Produ- ção de Vacina de Mosca do Chifre, depositado em 14 de dezembro de 2017, os conteúdos do qual são incorporados em sua totalidade para todas as propostas.

ANTECEDENTES

[002] A mosca do chifre é um problema maior que afeta o gado nos Estados Unidos e outras partes do mundo similar a América Lati- na. É estimado que o impacto econômico na produção agropecuária nos Estados Unidos é maior do que $1 bilhão por ano.

[003] A mosca do chifre produz em sua saliva uma toxina deno- minada Trombostasina. Esta toxina, uma vez que injetada após a mor- dida, interfere com a coagulação do sangue do gado causando ane- mia, e permitindo que a mosca sugue o sangue facilmente. Uma vaci- na de trombostasina é um método pelo qual a atividade biológica da Trombostasina pode ser neutralizada. Quando injetada no animal, a vacina é eficaz somente após uma resposta imune a TS ser induzida, e quando anticorpos produzidos em resposta à vacinação protege con- tra rompimento da função de coagulação normal nos locais da mordi- da.

[004] Ensaios de vacina realizados no gado em 2004 e 2005 consistiram das proteínas de TS produzidas em E. coli através de tec- nologia de DNA recombinante. Vacinas foram preparadas usando iso- formas de TS recombinantes TB8 e TS9 (Cupp et al, 2004, Cupp et al, 2005)) e inoculadas por rota intramuscular de vacinação para induzir uma resposta de anticorpo. O gado, injetado com a vacina contendo as isoformas de TS, desenvolveu anticorpos específicos para TS, e entrada de sangue diminuída pelas moscas de chifre foi observada em comparação ao gado vacinado com ovalbumina. Em um ensaio de- monstrado reportado em 2010, o gado vacinado com as isoformas re- combinantes de TB8 e TS9 novamente desenvolveu anticorpos espe- cíficos para TS, e demonstraram uma diminuição significante na entra- da de sangue pelas moscas de chifre durante um quadro de tempo de alimentação de 20 minutos.

[005] Enquanto que estes estudos sugerem sucesso de uma va- cina de Trombostasina, métodos de produzir efetivamente a vacina em quantidades suficientes para proporcionar a vacina em uma base de maior escala não se encontram disponíveis. Especificamente, antes da invenção da Requerente, não era possível coletar antígeno bastante a partir da mosca para produzir uma vacina comercial, desse modo, limi- tando a capacidade de produzir uma vacina eficaz para o controle da mosca do chifre e seu efeito nas populações de gado. A presente in- venção procura alcançar uma ou mais das necessidades antes menci- onadas na técnica.

BREVE SUMÁRIO

[006] Aqui reveladas são proteínas de fusão compreendendo uma proteína de trombostasina truncada tendo pelo menos 85% de homologia de sequência para uma proteína de trombostasina, no qual a proteína de trombostasina tem uma supressão de carbóxia terminal; e uma proteína parceira de fusão que é uma proteína de não- trombostasina. Adicionalmente reveladas são proteínas de trombosta- sina de composições de vacina compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, e métodos para inibição de uma resposta a uma pro- teína de trombostasina em um hospedeiro em necessidade desta, compreendendo as proteínas de fusão reveladas, ou composições de vacina. Adicionalmente revelados são métodos para a preparação de uma composição de proteína de fusão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[007] Este pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou publicação do pedido de patente com de- senho(s) em cor serão fornecidas pelo Escritório após requisição e pa- gamento da taxa necessária.

[008] Aqueles técnicos no assunto compreenderão que os dese- nhos, descritos abaixo, são para proposta ilustrativa somente. Os de- senhos não são previstos para limitar o escopo dos presentes ensina- mentos em qualquer modo.

[009] A FIG 1 representa titulações de anticorpo após injeção de MBPTS9, PAFTS9NS, PAFTB8 e PAFTB8NS5.

[0010] A FIG 2 representa a capacidade de anticorpos inibirem a atividade anticoagulante da Trombostasina contida nas glândulas sali- vares da mosca do chifre.

[0011] A FIG 3 representa o retardo no tempo de recalcificação induzido pelo teste de saliva da mosca do chifre.

DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES

[0012] A menos que de outro modo notado, termos são para se- rem compreendidos de acordo com o uso convencional por aqueles técnicos no assunto relevante. Em caso de conflito, o presente docu- mento, incluindo definições, controlará. Métodos preferidos e materiais são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática ou teste da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, paten- tes e outras referências aqui mencionados são incorporados por refe- rência em sua totalidade. Os materiais, métodos, e exemplos aqui re- velados são ilustrativos somente, e não previstos para serem limitan- tes.

[0013] Conforme aqui usado e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um" "e," e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto determine claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, referência a "um método" inclui uma pluralidade de tais mé- todos, e referência a "uma dose" inclui referência a uma ou mais doses e equivalentes destas conhecidas àqueles técnicos no assunto, e as- sim por diante.

[0014] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular conforme deter- minado por um dos técnicos no assunto, que dependerão, em parte, de como o valor é medido ou determinado, por exemplo, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais do que 1 desvio padrão, para a prática na técnica. Alter- nativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, ou até 10%, ou até 5%, ou até 1% de um dado valor. Alternativamente, parti- cularmente com relação a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de grandeza, de preferência, dentro de 5 vezes, e, mais de preferência, dentro de 2 vezes, de um valor. Onde valores particulares são descritos no pedido e reivindica- ções, a menos que de outro modo citado, o termo "cerca de" signifi- cando dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular de- ve ser assumido.

[0015] Conforme aqui usado, o termo "quantidade eficaz" significa a quantidade de um ou mais componentes ativos que é suficiente para mostrar um efeito desejado. Isto inclui ambos efeitos terapêuticos e profiláticos. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, admi- nistrado sozinho, o termo se refere àquele ingrediente sozinho. Quan- do aplicado a uma combinação, o termo se refere a quantidades com- binadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, se administrados em combinação, em série ou simultaneamente.

[0016] "Identidade de sequência", conforme aqui usado, indica uma sequência de ácido nucleico que tem a mesma sequência de áci- do nucleico como uma sequência de referência, ou tem uma percenta- gem especificada de nucleotídeos que são os mesmos na correspon- dente localização dentro de uma sequência de referência quando as duas sequências são otimamente alinhadas. Por exemplo, uma se- quência de ácido nucleico ou de amino ácido pode ter pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade ao ácido nucleico de referência, ou sequência de amino ácido. O comprimento de sequências de comparação geral- mente será pelo menos 5 nucleotídeos contíguos, ou pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotí- deos contíguos, ou a sequência de nucleotídeo ou de amino ácido de comprimento total. A identidade de sequência pode ser medida usando software de análise de sequência na configuração padrão (por exem- plo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Grupo, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705). Tal software pode corresponder com sequências similares por atribuição de graus de homologia a várias substituições, supressões, e outras modificações.

[0017] Antes da invenção da Requerente, não foi possível coletar bastante antígenos a partir da mosca do chifre para produzir uma va- cina comercial. Uma solução possível é clonar e expressar a proteína em, por exemplo E.coli usando um vetor de plasmídeo. Apesar de mui- tas tentativas, contudo, a Requerente descobriu que não foi possível produzir bastante antígenos usando os genes de Trombostasina de comprimento total.

[0018] Aqui reveladas são proteínas de fusão que podem compre- ender uma proteína de trombostasina truncada tendo pelo menos 85% de homologia de sequência para uma proteína de trombostasina, no qual a proteína de trombostasina compreende uma supressão de car- bóxi terminal; e uma proteína parceira de fusão que pode compreender um componente de proteína de não-trombostasina. Por "proteína par- ceira de fusão" é significativo uma sequência de amino ácido que é fundida à proteína de trombostasina, e que pode ser usada para aper- feiçoar o rendimento da proteína de fusão durante o processo de pro- dução. Geralmente, e conforme aqui contemplado, a proteína parceira de fusão é contígua com a proteína de trombostasina, em que a prote- Ína parceira de fusão e proteína de trombostasina são parte de uma única sequência. As sequências podem, em certos aspectos, usarem sequência ligadora adicional que conecta a proteína parceira de fusão e proteína de trombostasina.

[0019] Em um aspecto, a proteína parceira de fusão é uma proteí- na de não-trombostasina, em que ela não compreende uma sequência tendo uma identidade de sequência substancial para uma proteína de trombostasina. Em um aspecto, a proteína de trombostasina truncada pode ser como imunogênica em mamíferos como uma proteína de trombostasina não-truncada nativa. Em outros aspectos, a imunogeni- cidade pode ser substancialmente a mesma como proteína de trom- bostasina não-truncada nativa. Em um aspecto, a proteína de trombos- tasina truncada produz anticorpos biologicamente ativos que interfe- rem com a atividade anticoagulante de trombostasina natural da mos- ca do chifre.

[0020] Em um aspecto, a proteína de trombostasina pode ser se- lecionada de TS9 (SEQ ID NO: 1), TS10 (SEQ ID NO: 2), TB8 (SEQ ID NO: 3), TS8 (SEQ ID NO: 4), TS2 (SEQ ID NO: 5), GTS 1 (SEQ ID NO: 6), GTS 2 (SEQ ID NO: 7), GTS 3 (SEQ ID NO: 8), GTS 4 (SEQ ID NO: 9), GTS 5 (SEQ ID NO: 10), GTS 6 (SEQ ID NO: 11), e GTS 7 (SEQ ID NO: 12). Em um aspecto, a porção remanescente da proteína de trombostasina truncada (isto é, a sequência que permanece após uma supressão N terminal) pode ser pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência selecionada de qualquer de SEQ ID NOs: 1-12, no qual uma proteína de trombos- tasina é capaz de ser ligada por um anticorpo que se liga especifica- mente a uma proteína de trombostasina selecionada de SEQ ID NOs: 1-12.

[0021] Em um aspecto, a supressão de carbóxi terminal pode ser uma supressão de pelo menos 5 aminoácidos, ou pelo menos 6 ami- noácidos, ou pelo menos 7 aminoácidos, ou pelo menos 8 aminoáci- dos, ou pelo menos 9 aminoácidos, ou pelo menos 10 aminoácidos, ou pelo menos 11 aminoácidos, ou pelo menos 12 aminoácidos, ou pelo menos 13 aminoácidos, ou pelo menos 14 aminoácidos, ou pelo me- nos 15 aminoácidos, ou pelo menos 16 aminoácidos, ou pelo menos 17 aminoácidos, ou pelo menos 18 aminoácidos, ou pelo menos 19 aminoácidos, ou pelo menos 20 aminoácidos, ou de cerca de 10 a 35 aminoácidos, ou de cerca de 15 a 30 aminoácidos, ou cerca de 20 a cerca de 25 aminoácidos, ou cerca de 30 aminoácidos. Em um aspec- to, a proteína de trombostasina truncada pode ser selecionada de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, e uma combinação des- tas.

[0022] Em um aspecto, a proteína parceira de fusão pode ser se- lecionada de proteína de ligação de maltose (MBP), proteína para fu- são de antígeno (PAF), proteína reativa C (CRP), ou um fragment des- ta, B-galactosidase, glutationa-S-transferase, poli-histidina, proteína básica de mielina (MBP1-9), ou um fragmento desta, ovalbumina de clara de ovo de galinha (OVA), e combinações destas. Proteínas par- ceira de fusão adequadas para as proteínas da invenção são bem co- nhecidas àqueles técnicos na área e incluem, entre outras, B- galactosidase, glutationa-S-transferase, poli-histidina e proteína de |i-

gação de maltose.

[0023] Em um aspecto, uma composição de vacina é revelada. À composição de vacina pode compreender uma sequência de trombos- tasina tendo uma supressão na extremidade terminal C, no qual referi- da supressão é os últimos 35 aminoácidos, os últimos 34 aminoácidos, os últimos 33 aminoácidos, os últimos 32 aminoácidos, os últimos 31 aminoácidos, os últimos 30 aminoácidos, os últimos 29 aminoácidos, os últimos 28 aminoácidos, os últimos 27 aminoácidos, os últimos 26 aminoácidos, os últimos 25 aminoácidos, os últimos 24 aminoácidos, os últimos 23 aminoácidos, os últimos 22 aminoácidos, os últimos 21 aminoácidos, ou os últimos 20 aminoácidos. A composição de vacina pode compreender adicionalmente uma proteína parceira de fusão.

[0024] Em um aspecto, a composição de vacina pode compreen- der uma pluralidade de proteínas de fusão compreendendo uma prote- ína de trombostasina, por exemplo, uma pluralidade de proteínas de fusão incluindo uma proteína TS9 truncada, uma proteína TS10 trun- cada, ou uma ou ambas de uma proteína TB8 truncada ou proteína TS8 truncada. Em um aspecto, a composição de vacina pode compre- ender uma proteína de trombostasina truncada e sequência de proteí- na parceira de fusão de SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, ou uma combina- ção destas.

[0025] Em um aspecto, a proteína de fusão da composição de va- cina pode estar presente em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta biológica em um hospedeiro. A composição de vacina pode compreender adicionalmente um transportador farmaceuticamen- te aceitável, e/ou um adjuvante. Conforme aqui usado, o termo "adju- vante" tipicamente se refere a uma classe de substância que pode aumentar a grandeza da resposta imune induzida pela proteína de fu- são conjugada além daquela que seria esperada, ou a partir da proteí-

na sozinha, ou a partir da proteína transportadora de fusão conjugada conforme aqui descrito na ausência de um adjuvante.

Em uma concre- tização, o transportador farmaceuticamente aceitável inclui um adju- vante.

Não existe limitação específica nos tipos dos adjuvantes, exem- plos dos quais podem incluir, mas não são limitados a, adjuvante de gel de alumínio, adjuvante de óleo (por exemplo, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, e assim por diante), ou qualquer combinação destes.

Adjuvantes adequados serão conheci- dos aos técnicos no assunto.

Exemplos não-limitantes de adjuvantes adequados incluem sais de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumí- nio, fosfato de alumínio e potássio sulfato de alumínio (também referi- do como Alum)), lipossomas, virossomas, emulsões de água em óleo ou emulsões de óleo em água (por exemplo, adjuvante de Freund, Montanide&G, MF596 e ASO3), 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídeo A (MPL) e adjuvantes contendo MPL (por exemplo, AS01, ASO02 e ASO04) e adjuvantes à base de saponina.

Adjuvantes à base de saponina in- cluem saponinas ou derivados de saponina de, por exemplo, Quillaja saponaria, Panax ginseng Panax notoginseng, Panax quinquefolium, Platycodon grandiflorum, Polygala senega, Polygala tenuifolia, Quillaja brasiliensis, Astragalus membranaceus e Achyranthes bidentata.

Adju- vantes à base de saponina exemplares incluem iscoms, matriz de is- com, adjuvante ISCOMATRIXTY, adjuvante Matrix MTY, adjuvante Ma- trix CT", adjuvante Matrix Q'Y, adjuvante AbISCOG-100, adjuvante AbISCOG-300, ISCOPREPTY, um derivado de ISCOPREPTY, adjuvan- te contendo ISCOPREP'TY ou um derivado de ISCOPREPTY, QS-21, um derivado de QS-21, e um adjuvante contendo QS-21 ou um deri- vado de QS21. A composição de vacina conforme aqui descrita pode também estar associada com agentes imumodulatórios, incluindo, por exemplo, citocinas, quimiocinas, e fatores de crescimento.

Misturas de dois ou mais adjuvantes dentro da mesma composição de vacina são também aqui contempladas.

Transportadores farmaceuticamente acei- táveis adequados (por exemplo, excipientes, diluentes, etc.) serão co- nhecidos aos técnicos no assunto.

Por exemplo, uma variedade de transportadores aquosos (farmaceuticamente aceitáveis) podem ser usados, tal como água tamponada, salina 0,4%, glicina 0,3%, ácido hialurônico e similares.

Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização bem conhecidas, convencionais, ou po- dem ser filtradas estéreis.

As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso à medida que é ou liofilizada, a preparação liofili- zada sendo combinada com uma solução estéril antes da administra- ção.

As composições podem adicionalmente compreender substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme requerido para con- dições fisiológicas aproximadas, tais como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de tonicidade, agentes de molha- mento, e similares, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, sorbitano mono- laurato, trietanolamina oleato, sucrose, ou outros carbohidratos, entre muitos outros.

Métodos adequados para preparação de compostos parenteralmente administráveis serão conhecidos ou aparentes àque- les técnicos na área.

A composição farmacêutica pode estar em uma forma adequada para administração parenteral (por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa), ou em uma forma de aero- sol adequada para administração por inalação, tal como por inalação intranasal ou inalação oral.

As composições farmacêuticas aqui descri- tas podem também ser fornecidas em um kit.

O kit pode compreender componentes adicionais para auxiliar na realização dos métodos con- forme aqui descritos, tais como dispositivo(s) de administração, excipi- ente(s), e/ou diluente(s). Os kits podem incluir recipientes para aloja- mento dos vários componentes e instruções para uso dos componen- tes de kit em tais métodos.

[0026] A vacina ou composições farmacêuticas, conforme aqui descritas, são tipicamente administradas em uma "quantidade eficaz"; isto é, uma quantidade eficaz para induzir qualquer um ou mais entre outros de um efeito terapêutico ou profilático. Técnicos no assunto se- riam capazes, por experimentação de rotina, de determinar uma quan- tidade não tóxica eficaz para incluir em uma composição farmacêutica, ou para ser administrada para o resultado desejado. Em geral, a vaci- na e/ou composições farmacêuticas, conforme aqui reveladas, podem ser administradas em uma maneira compatível com a rota de adminis- tração e características físicas do recipiente e, de tal modo que indu- zem o(s) efeito(s) desejado(s) (isto é, terapeuticamente eficaz, imuno- gênica e/ou protetora). Por exemplo, a dosagem apropriada pode de- pender de uma variedade de fatores incluindo, mas não limitados a, características físicas do indivíduo (por exemplo, idade, peso, sexo). Em alguns exemplos, pode ser desejável ter várias ou múltiplas admi- nistrações da vacina e/ou composições farmacêuticas, conforme aqui descritas. Por exemplo, as composições podem ser administradas 1, 2,3,4,5,6,7,8, 9,10, ou mais vezes. As administrações podem ser de cerca de intervalos de um dia a cerca de intervalos de doze sema- nas, e, em certas concretizações, de cerca de intervalos de uma a cer- ca de quatro semanas. Re-administração periódica pode ser requerida para alcançar um resultado terapêutico desejável, tal como uma redu- ção no tamanho do tumor e/ou a redução na ocorrência de metástase. Será também aparente aos técnicos no assunto que o curso ótimo de administração pode ser determinado usando curso convencional de tratamento, ou testes de eficácia ou de determinação de estado imune.

[0027] Em um aspecto, a proteína de fusão ou composição de va- cina conforme aqui reveladas podem ser injetadas intramuscularmen- te, subcutaneamente, ou qualquer outra rota de administração.

[0028] Em um aspecto, um método para inibição de uma resposta a uma proteína de trombostasina em um hospedeiro em necessidade desta é revelado. Neste aspecto, o método pode compreender a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma prote- ína de fusão ou composição de vacina conforme aqui descritas ao hospedeiro. O hospedeiro pode ser um mamífero, em particular, gado.

[0029] Em um aspecto, um método para preparação de uma com- posição de proteína de fusão mutante de supressão de trombostasina é revelado. O método pode compreender as etapas de gerar um plas- mídeo para expressão de uma ou mais proteínas de fusão conforme aqui revelado; fazer com que o plasmídeo expresse a uma ou mais proteínas de fusão no interior de uma célula hospedeira; e coleta da uma ou mais proteínas de fusão de referida célula hospedeira. Em um aspecto, a proteína de fusão pode ser produzida em E. coli. Em outros aspectos, a proteína de fusão pode ser produzida em qualquer sistema de produção de célula, tal como, por exemplo, bactérias, fungos, inse- tos, ou células de mamífero. Em um aspecto, a proteína de fusão pode ser produzida por síntese química de peptídeo.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0030] Em um aspecto, agentes ativos aqui proporcionados podem ser administrados em uma forma de dosagem selecionada de forma de dosagem unitária intravenosa ou subcutânea ou intramuscular, oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, e subcutânea. Em algumas concretizações, agentes ativos aqui proporcionados podem ser formu- lados em preparações líquidas para, por exemplo, administração oral. Formas adequadas incluem suspensões, xaropes, elixires, e similares. Em algumas concretizações, formas de dosagem unitárias para admi- nistração oral incluem comprimidos e cápsulas. As formas de dosagem unitárias configuradas para administração uma vez ao dia; contudo, em certas concretizações, pode ser desejável configurar a forma de dosagem unitária para administração duas vezes ao dia, ou mais.

[0031] Em um aspecto, composições farmacêuticas são isotônicas com o sangue ou outro fluido corpóreo do recipiente. A isotonicidade das composições pode ser alcançada usando tartrato de sódio, propi- leno glicol, ou outros solutos inorgânicos ou orgânicos. Um exemplo inclui cloreto de sódio. Agentes de tamponamento podem ser empre- gados, tal como ácido acético e sais, ácido cítrico e sais, ácido bórico e sais, e ácido fosfórico e sais. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactatado, ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem fluido e reabastecedores de nutriente, reabastecedores de eletrólito (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer), e similares.

[0032] A viscosidade das composições farmacêuticas pode ser mantida no nível selecionado usando um agente de espessamento farmaceuticamente aceitável. Metilcelulose é útil porque ela é pronta- mente e economicamente disponível, e é fácil de operar. Outros agen- tes de espessamento adequados incluem, por exemplo, goma xanta- na, carboximetil celulose, hidroxipropil celulose, carbômero, e simila- res. Em algumas concretizações, a concentração do espessador de- penderá do agente de espessamento selecionado. Uma quantidade pode ser usada que alcançará a viscosidade selecionada. Composi- ções viscosas são normalmente preparadas de soluções pela adição de tais agentes de espessamento.

[0033] Um conservante farmaceuticamente aceitável pode ser em- pregado para aumentar a vida útil das composições farmacêuticas. Benzil álcool pode ser adequado, embora uma variedade de conser- vantes incluindo, por exemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol, ou cloreto de benzalcômio, pode também ser empregada. Uma concen- tração adequada do conservante é tipicamente de cerca de 0,02% a cerca de 2% baseado no peso total da composição, embora quantida- des maiores ou menores possam ser desejáveis dependendo do agen-

te selecionado. Agentes de redução, tal como descrito acima, podem ser vantajosamente usados para manter boa vida útil da formulação.

[0034] Em um aspecto, agentes ativos aqui proporcionados podem ser em mistura com um transportador adequado, diluente, ou excipien- te, tal como água estéril, salina fisiológica, glicose, ou similares, e po- dem conter substâncias auxiliares tais como agentes de molhamento ou de emulsificação, agentes de tamponamento de pH, aditivos de in- tensificação de gelação ou viscosidade, conservantes, agentes de aromatização, cores, e similares, dependendo da rota de administra- ção e da preparação desejada. Ver, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition (June 1, 2003) e "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Pub. Co.; 18th e 19th editions (Dezembro de 1985, e junho de 1990, respectivamente). Tais preparações podem incluir agentes de comple- xação, fons de metal, compostos poliméricos, tais como ácido poliacé- tico, ácido poliglicólico, hidrogéis, dextran, e similares, lipossomas, mi- croemulsões, micelas, vesículas unilamelar ou multilamelar, espectros de eritrócito, ou esferoblastos. Lipídeos adequados para formulação lipossomal incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sul- fatídeos, lisolecitina, fosfolipídeos, saponina, ácidos de bile, e simila- res. A presença de tais componentes adicionais pode influenciar o es- tado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de remoção in vivo, e são, desse modo, escolhidos de acordo com a aplicação prevista, tal que as características do transportador são pro- vidas à rota selecionada de administração.

[0035] Para administração oral, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um comprimido, suspensão aquosa ou suspensão de óleo, pó dispersível ou grânulo, emulsão, cápsula dura ou macia, xarope ou elixir. Composições previstas para uso oral po- dem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a manufatura de composições farmacêuticas, e podem incluir um ou mais dos seguintes agentes: edulcorantes, agentes de aromatização, agentes de coloração, e conservantes.

Suspensões aquosas podem conter o ingrediente ativo em mistura com excipientes adequados para a manufatura de suspensões aquosas.

Lubrimayts, tais como ácido esteárico ou sais de magnésio ou cálcio deste, poli- tetrafluoroetioleno, parafina líquida, óleos vegetais e ceras, sulfato lau- ril de sódio, sulfato lauril de magnésio, polietileno glicol, amido, talco, sílica prirogênica, silicoaluminato hidratado, e similares, podem ser in- cluídos em formulações de comprimido.

Surfactantes podem também serem empregados, por exemplo, detergentes aniônicos tais como sul- fato lauril sódio, dioctil sódio sulfosuccinato e dioctil sódio sulfonato, catiônicos tal como cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, ou detergentes não iônicos tais como óleo de rícino polioxietileno hi- drogenado, glicerol monoestearato, polisorbatos, éster ácido graxo de sucrose, metil celulose, ou carboximetil celulose.

Formulações de libe- ração controlada podem ser empregadas no qual o agente ativo ou análogo(s) deste é incorporado em uma matriz inerte que permite libe- ração por ou difusão ou mecanismos de lixiviação.

As matrizes que degeneram lentamente podem também serem incorporadas na formu- lação.

Outros sistemas de distribuição podem incluir sistemas de dis- tribuição de liberação regulada, liberação retardada, ou liberação sus- tentada.

Revestimentos podem ser usados, por exemplo, materiais não entéricos tais como metil celulose, etil celulose, hidroxietil celulo- se, metilhidroxi-etil celulose, hodroxopropil celulose, hidroxipropil-metil celulose, sódio carbóxi-metil celulose, providona e os polietilenos gli- cóis, ou materiais entéricos tais como ésteres de ácido ftálico.

Coran- tes ou pigmentos podem ser adicionados para identificação ou para caracterizar combinações diferentes de doses de agente ativo.

Quan- do administrado oralmente na forma líquida, um transportador líquido tal como água, petróleo, óleos de origem animal ou de planta, tal como óleo de amendoim, óleo mineral, óleo de soja, ou óleo de gergelim, ou óleos sintéticos, podem ser adicionados ao(s) ingrediente(s) ativo(s). Solução de salina fisiológica, dextrose, ou outra solução de sacarídeo, ou glicóis, tais como etileno glicol, propileno glicol, ou polietileno glicol são também transportadores líquidos adequados. As composições farmacêuticas podem também estarem na forma de emulsões de óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, tal como óleo de oliva ou óleo de amendoim, um óleo mineral, tal como parafina líquida, ou uma mistura destes. Agentes de emulsificação adequados incluem gomas que ocorrem naturalmente, tal como goma acácia e goma tra- gamayth, fosfatídeos que ocorrem naturalmente, tal como lecitina de soja, ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidri- dos de hexitol, tal como sorbitan mono-oleato, e produtos de conden- sação destes ésteres parciais com óxido de etileno, tal como polioxieti- leno sorbitan mono-oleato. As emulsões podem também conter agen- tes edulcorantes e de aromatização.

[0036] A distribuição pulmonar do agente ativo pode também ser empregada. O agente ativo pode ser distribuído aos pulmões enquanto que inalando e atravessa sobre o revestimento epitelial do pulmão pa- ra a corrente sanguínea. Uma ampla faixa de dispositivos mecânicos designados para distribuição pulmonar de produtos terapêuticos pode ser empregada, incluindo, mas não limitados a, nebulizadores, inalado- res de dose medida, e inaladores de pó, todos dos quais são familiares àqueles técnicos no assunto. Estes dispositivos empregam formula- ções adequadas para a dispensa de agente ativo. Tipicamente, cada formulação é específica ao tipo de dispositivo empregado, e pode en- volver o uso de um material propelente apropriado, em adição aos di- luentes, adjuvantes, e/ou transportadores úteis na terapia. Em algu- mas concretizações, um agente ativo aqui proporcionado pode ser administrado por injeção intravenosa, parenteral, ou outra injeção, a forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável livre de piro- gênio ou suspensão oleaginosa. Suspensões podem ser formuladas de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica usando agen- tes de dispersão ou de molhamento adequados e agentes de suspen- são. A preparação de soluções aquosas aceitáveis com pH, isotonici- dade, estabilidade, adequados, e similares, está dentro do estado da técnica. Em algumas concretizações, uma composição farmacêutica para injeção pode incluir um veículo isotônico tal como 1,3-butanodiol, água, solução de cloreto de sódio isotônica, solução de Ringer, solu- ção de dextrose, dextrose e solução de cloreto de sódio, solução de Ringer lactatada, ou outros veículos conforme são conhecidos na téc- nica. Em adição, óleos fixos estéreis podem ser empregados conven- cionalmente como um solvente ou meio de suspensão. Para esta pro- posta, qualquer óleo fixo fraco pode ser empregado incluindo sintético mono ou diglicerídeos. Em adição, ácidos graxos, tal como ácido olei- co, podem, do mesmo modo, serem usados na formação de prepara- ções injetáveis. As composições farmacêuticas podem também conter estabilizadores, conservantes, tampões, antioxidantes, ou outros aditi- vos conhecidos àqueles técnicos no assunto.

[0037] A duração da injeção pode ser ajustada dependendo de vários fatores, e pode compreender uma única injeção administrada sobre o curso de uns poucos segundos ou menos, a 0,5, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas ou mais de administração intravenosa contí- nua.

[0038] Em algumas concretizações, agentes ativos aqui proporcio- nados podem adicionalmente empregar componentes adjuntos con- vencionalmente encontrados nas composições farmacêuticas em seu modo estabelecido na técnica e em seus níveis estabelecidos na téc-

nica. Desse modo, por exemplo, as composições podem conter mate- riais farmaceuticamente ativos compatíveis adicionais para terapia de combinação, tais como inseticidas ou reguladores de crescimento de inseto e similares, fármacos antianêmicos tais como dextrano de ferro, sulfato ferroso, EPO, deferoxamina, ácido fólico, e vitamina B12, ou podem conter materiais úteis na formulação fisicamente de várias for- mas de dosagem, tais como excipientes, corantes, agentes de espes- samento, estabilizadores, conservantes, ou antioxidantes.

[0039] Em algumas concretizações, os agentes ativos aqui propor- cionados podem ser fornecidos a um médico de administração ou ou- tro profissional de cuidado da saúde na forma de um kit. O kit é uma embalagem que aloja um recipiente que contém o(s) agente(s) em uma composição farmacêutica adequada, e instruções para adminis- tração da composição farmacêutica a um indivíduo. O Kit pode opcio- nalmente também conter um ou mais agentes terapêuticos adicionais atualmente empregados para tratamento de um ou mais estados de doença, conforme aqui descritos. Por exemplo, um Kit contendo uma ou mais composições compreendendo agentes ativos aqui fornecidos em combinação com um ou mais agentes ativos adicionais pode ser provido, ou composições farmacêuticas separadas contendo um agen- te ativo conforme aqui fornecido e agentes terapêuticos adicionais po- dem ser proporcionados. O kit pode também conter doses separadas de um agente ativo aqui fornecido para administração em série ou se- quencial. O kit pode opcionalmente conter uma ou mais ferramentas diagnósticas e instruções para uso. O kit pode conter dispositivos de distribuição adequados, por exemplo, seringas, e similares, junto com instruções para administração do(s) agente(s) ativo(s) e qualquer outro agente terapêutico. O Kkit pode opcionalmente conter instruções para armazenagem, reconstituição (se aplicável), e administração de qual- quer ou todos agentes terapêuticos incluídos. Os kits podem incluir uma pluralidade de recipientes que refletem o número de administra- ções a serem dadas a um indivíduo. Exemplos

[0040] Os seguintes exemplos não limitantes são proporcionados para adicionalmente ilustrar concretizações da invenção aqui revelada. Deve ser apreciado por aqueles técnicos no assunto que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam abordagens que foram verificadas funcionarem bem na prática da invenção, e, desse modo, podem ser considerados para constituir exemplos de modos para sua prática. Contudo, aqueles técnicos no assunto devem, à luz da presente revelação, apreciar que muitas mudanças podem ser fei- tas nas concretizações específicas que são reveladas, e ainda obter um provável ou similar resultado sem fugir do espírito e escopo da in- venção.

[0041] Exemplo 1. Os seguintes rendimentos foram obtidos com os seguintes sistemas em frascos ou fermentadores: [BLATEScherichiacol pveXICHB-TSO | o | [BL2T Escherichia col pVEXKENtagTB8 | o

[0042] Na produção de proteína recombinante típica, a proteína recombinante representará 15-30% da proteína total presente. Fer- mentações da cepa Rosetta TS9 produziram concentrações de TS9 em qualquer lugar de 0,1 a 0,4% da proteína total. O aumento deste construto ou outro construto de TS9 ou TB8 similar, requereria um aumento significante na produção de titulação de fermentação de mo- do a torná-lo um processo economicamente viável. Consequentemen- te, novas descobertas foram necessárias de modo a superar este pro- blema técnico maior para produção de proteína de trombostasina re- combinante.

[0043] Dados coletados pela Requerente elucidaram adicional- mente os efeitos tóxicos da Trombostasina em sistemas biológicos. Durante procedimentos para clonar e expressar as isoformas de Trombostasina em sistemas de expressão altamente regulados para grande escala de produção de proteínas recombinantes, dependendo do sistema de expressão, foi verificado que todas as quatro isoformas de Trombostasina (TB8, TS8, TS9, ou TS10) quando clonadas em vá- rios hospedeiro/sistemas de expressão de plasmídeo causam morte da célula, lises, ou crescimento aberrante.

[0044] De modo a superar este problema, genes de proteína de fusão foram adicionados aos genes TS em um vetor de expressão de E. coli. Duas proteínas de fusão proporcionam resultados similares re- sumidos na Tabela abaixo para duas isoformas de Trombostasina TS9 e TB8. À medida que os rendimentos foram não foram ainda altos bas- tante para uso comercial, uma pequena supressão foi feita na porção terminal C do gene de Trombostasina. Em um aspecto, a supressão pode ser cerca de 30 aminoácidos (em um aspecto, a supressão pode ser LRARFNKFMA KFTSLFGRRR GVDVPNAAHH (SEQ ID NO 24) para TS9). Surpreendentemente, esta supressão impulsiona a produ- ção da proteína em frascos de cultura de tecido e fermentador. Proteí- nas de fusão exemplares incluem MBP e PAF. MBP suporta proteína de ligação de maltose, e é bem conhecido na técnica, ver, por exem- plo, di Guan, C; Li, P; Riggs, PD; Inouye, H (1988). "Vectors that facili- tate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein". Gene. 67 (1): 21-30. PAF (Proteins for Antigen Fusion) é um exemplo de outra proteína de fusão que pode ser usada com a presente revelação.

dução Frasco Fermentador se | so | mutoponre | [O rarTISo | omam | Tomam | [E vepTso | tomam | mp SS | pressão [| Pares | om | | ParreeNS | asma |

[0045] Sequência de aminoácidos exemplares das proteínas re- centemente criadas são como segue. Deve ser compreendido por um técnico no assunto que uma composição adequada pode incluir algu- ma variação enquanto que ainda mantendo função, por exemplo, inclu- indo sequências tendo identidade de sequência para as sequências reveladas de cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou qualquer faixa do prece- dente.

[0046] MBPTS9: Comprimento de proteína = 556 MW= 61501.0. A sequência de MBP é indicada em negrito. A sequência de PAF é indicada em negrito/itálicos. Texto regular representa a proteína de trombostasina. MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVIVEH —PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI IFWAHDRFGG

YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIYNK DLLPNPPKTW EEIPALDKEL KAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI! KNKHMNADTD YSIAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK VNYGVTIVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL GAVALKSYEE ELAKDPRIAA —“TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGIEGRISE FGS QNVLSGR —RQHGAQGLSG YSGDNDWGYY GEAGAPGSDY SGSSGQWAPL DFDYNSLPGL SGYNHEQQDY EEDSYRHVRS AGPITLOQLDD — DDDDDSGIPI FEMDDEDEDS — NDNOQKFPLSF

ERFPENEKNQ EGLRARFNKF MAKFTSLFGR RRGVDVPNAA HHHHHH (SEQ ID NO 16)

[0047] PAFTS9 Comprimento de proteína = 304 Peso molecular

34101.2. MKLTIESTPF NVAEGKEVLL LVHNLPQHLF

GYSWYKGERV DGNRQIIGYV IGTQAQATPGP AYSGREIIYP NASLLIQNII QNDTGFYTLH VIKSDLVNEE ATGQFRVYPE LPKPSISSNN SKPVEDKDAV AFTCEPETQD A QNVLSGRRQ

HGAQGLSGYS GDNDWGYYGE AGAPGSDYSG SSGQWAPLDF DYNSLPGLSG —YNHEQQDYEE DSYRHVRSAG PITLQLDDDD DDDSGIPIFE — MDDEDEDSND NQKFPLSFER FPENEKNQEG LRARFNKFMA KFTSLFGRRR GVDVPNAAHH HHHH (SEQ ID NO 17)

[0048] PAFTSO9ON5 Comprimento de proteína = 276 MW = 30892.0.

MKLTIESTPF NVAEGKEVLL LVHNLPQHLF GYSWYKGERV DGNRQIIGYV IGTAQATPGP AYSGREIIYP NASLLIQNII QNDTGFYTLH VIKSDLVNEE ATGQFRVYPE LPKPSISSNN SKPVEDKDAV AFTCEPETQD A QNVLSGRRQ HGAQGLSGYS

GDNDWGYYGE AGAPGSDYSG SSGQWAPLDF DYNSLPGLSG YNHEQQDYEE — DSYRHVRSAG PITLAQLDDDD DDDSGIPIFE MDDEDEDSND NQKFPLSFER FPENEKNQEG HHHHHH (SEQ ID NO 18)

[0049] PAFTB8 Comprimento de proteína = 304 MW=34040.2.

MKLTIESTPF NVAEGKEVLL LVHNLPQHLF GYSWYKGERV DGNRQIIGYV IGTQQATPGP AYSGREIIYP NASLLIQNII QNDTGFYTLH VIKSDLVNEE ATGQFRVYPE LPKPSISSNN SKPVEDKDAV AFTCEPETQD A QNLVSGRRQ HGAQGLSGYS GDNDWGYYGE AGAPGSDYSG SSGQWAPLDF DYNSLPGLSG YNHEQQDYEE — DSYRHVRSAG PITLOQLDDDD DDDSGIPIFE

MDDEDVDSND NOKFPLSFER FPENEKNQVG LRARFNKFMA KFTSLFGRRR GVNVPNAAHH HHHH (SEQ ID NO 19)

[0050] PAFTB8N5 Comprimento de proteína = 276 MW =30833.0.

MKLTIESTPF NVAEGKEVLL LVHNLPQHLF GYSWYKGERV DGNRQIIGYV IGTQQATPGP AYSGREIIYP NASLLIQNII QNDTGFYTLH VIKSDLVNEE ATGQFRVYPE LPKPSISSNN SKPVEDKDAV AFTCEPETQD A QNLVSGRRQ HGAQGLSGYS

GDNDWGYYGE AGAPGSDYSG SSGQWAPLDF DYNSLPGLSG YNHEQQDYEE — DSYRHVRSAG PITLOQLDDDD DDDSGIPIFE MDDEDVDSND NQOKFPLSFER FPENEKNOQVG HHHHHH (SEQ ID NO 20)

[0051] Um processo similar pode ser aplicado a todas as isoformas de Trombostasin, por exemplo:

[0052] MBPTSO9ON5 Comprimento de proteina = 528 MW =

58292.8. MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVIVEH —PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI IFWAHDRFGG

YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIY-NK DLLPNPPKTW EEIPALDKEL KAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI! KNKHMNADTD YSIAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK VNYGVTIVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL GAVALKSYEE ELAKDPRIAA —“TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGIEGRISE FGS QNVLSGR — RQHGAQGLSG YSGDNDWGYY GEAGAPGSDY

SGSSGQWAPL DFDYNSLPGL SGYNHEQQDY EEDSYRHVRS AGPITLOQOLDD — DDDDDSGIPI FEMDDEDEDS NDNQKFPLSF ERFPENEKNQ EGHHHHHH (SEQ ID NO 21)

[0053] MBPTS1ON5 Comprimento de proteína = 528 MW =

58262.8. MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVIVEH —PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI IFWAHDRFGG

YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIYNK DLLPNPPKTW EEIPALDKEL HKAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI! KNKHMNADTD YSIAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK VNYGVTIVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL GAVALKSYEE ELAKDPRIAA —“TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGIEGRISE FGS QNVLSGR — RQOHGAQGLSG YSGDNDWGYY GEAGAPGSDY

SGSSGQWAPL DFDYNSLPGL SGYNHEQQDY EEDSYRHVRS AGPITLOLDD — DDDDDSGIPI FEMDDEDEDS — NDNQKFPLSF ERFPENEKNQ VGHHHHHH (SEQ ID NO 22)

[0054] MBPTB8N5 Comprimento de proteina = 528 MW =

58232.8. MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVIVEH —PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI IFWAHDRFGG

YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIYNK DLLPNPPKTW EEIPALDKEL KAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI! KNKHMNADTD YSIAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK VNYGVTIVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL GAVALKSYEE ELAKDPRIAA —“TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGIEGRISE FGS QNLVSGR — RQOHGAQGLSG YSGDNDWGYY GEAGAPGSDY

SGSSGQWAPL DFDYNSLPGL SGYNHEQQDY EEDSYRHVRS AGPITLOLDD — DDDDDSGIPI FEMDDEDVDS — NDNOQKFPLSF ERFPENEKNQ VGHHHHHH (SEQ ID NO 23)

[0055] MPBTS8NS5 tem a mesma composição do que MBPTSONS5,

a diferença entre TS9 e TS8 é removida com a supressão.

[0056] MBPTS9, PAFTS9ONS, PAFTB8 e PAFTB8NS5 foram mistu- rados com um adjuvante comercial ENABL (Vaxliant Laboratories) e injetados em 12 coelhos duas vezes no Dia 1 e 21. Amostras de san- gue foram coletadas no Dia 1, 21 e 42, os soros separados e as titula- ções de anticorpo determinadas por ELISA. Os resultados são mostra- dos na FIG 1. Outros adjuvantes conhecidos na técnica podem ser usados, incluindo, por exemplo, hidróxido de Al e adjuvante de freund. Na FIG 1, a primeira barra indica dia 1, a segunda barra indica dia 21, a terceira barra indica dia 42. Todos os antígenos testados foram mui- to imunogênicos, gerando anticorpos para Trombostasina após so- mente uma injeção. Surpreendentemente, a supressão de gene não afeta a produção de anticorpo.

[0057] Finalmente, os anticorpos foram testados para a capacida- de de inibir a atividade anticoagulante da Trombostasina contida nas glândulas salivares das moscas de chifre usando o retardo no tempo de recalcificação induzido pelo teste de saliva da mosca do chifre (RCT). Brevemente amostra ou tampão de controle, diluídos em 50 mM de Tris, pH 7,4 a 37ºC, NaCl 0,15 M, 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e polietileno glicol 0,1%) 8000 (PEG 8000) (tampão TSBP) foram adicionados para plasma normal de referência (Accuclot, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO); a mistura foi incubada a 37 ºC por 3 min antes da adição de solução de CaCl2 (10 mM de concen- tração final). O tempo entre a adição de CaCb e o primeiro sinal da formação de massa (coágulo) foi registrado como tempo de coagula- ção. Os resultados são resumidos na FIG 2, no qual Tratamento O: controle negativo, coagulação normal; Tratamento 1: vacinado com MBPTSS9 + saliva; Tratamento 2: vacinado com PAFTS9NS5 + saliva; Tratamento 5: vacinado com PAF TB8 + saliva; Tratamento 9: não- vacinado + saliva; Tratamento 10: saliva de controle positivo somente.

Todas as vacinas inibem a ação da saliva da mosca do chifre. Trata- mento 2 (o antígeno truncado de TS9N5) tem o maior efeito. O grupo não-vacinado não foi diferente do controle positivo. A supressão de gene da Trombostasina na extremidade terminal C dos genes supera a toxicidade da célula e aumenta a produção das proteínas a níveis co- mercialmente aceitáveis sem mudar a imunogenicidade ou os antíge- nos ou atividade biológica dos anticorpos gerados por estes antígenos. Exemplo 2.

[0058] PROPOSTA - A proposta deste experimento é avaliar a ca- pacidade de uma vacina experimental usando antígenos de trombos- tasina truncada para gerar anticorpo no gado. A vacina, composta de 3 antígenos de TS truncados recombinantes com adjuvante, será injeta- da intramuscularmente em animais de teste. O anticorpo produzido será avaliado para sua capacidade de neutralizar a atividade anticoa- gulante da saliva de moscas de chifre.

[0059] VACINA — A saliva da mosca do chifre, Haematobia irritans irritans contém proteínas de trombostasina que impedem coagulação do sangue do hospedeiro mordido, permitindo que a mosca continue a retirar sangue. A vacina descrita neste exemplo contém 3 proteínas recombinantes identificadas como MBPpTS9N5 (SEQ ID NO: 21), MBPpTS10N5 (SEQ ID NO:22) e MBPpTB8 N5 (SEQ ID NO: 23). MBP é uma proteína de fusão usada para intensificar a imunogenici- dade da vacina, e TS9, TS10 e TB8 são isotipos das proteínas de trombostasina comumente encontradas na saliva das moscas de chifre nos Estados Unidos. A vacina estimula o sistema imune a produzir an- ticorpos que atenuam os efeitos anticoagulantes da saliva da mosca do chifre.

ADMINISTRAÇÃO DA VACINA

[0060] Rota de exposição — Injeção intramuscular de proteínas recombinantes suspensas em um tampão de salina com um adjuvante licenciado adicionado ENABL de VaxLiant.

[0061] Níveis de dose — 100 ug de cada da proteína acima men- cionada misturada em um adjuvante.

[0062] Tabela de dose — 3 grupos: grupo A vacinado no dia O, grupo B vacinado no dia O e dia 21, grupo C agindo como controle.

BEZERROS

[0063] Espécie & raça - Bos torus e provavelmente Angus ou cru- zamento Angus

[0064] Sexo — machos castrados ou fêmeas intactas

[0065] Fonte — Fazenda de bezerro local

[0066] Idade/Peso — 4-6 meses de idade, 300-500 |bs

[0067] Número — 11

CUIDADO E GESTÃO ANIMAL

[0068] Período de aclimatação — 3-4 semanas

[0069] Alojamento — Curral

[0070] Ambiente — Aberto e fechado

[0071] Dieta & água- Rotina pela New Mexico State University

[0072] Cuidado veterinário — Conforme provido pela New Mexico State University

[0073] PROJETO EXPERIMENTAL - 11 bezerros são usados nes- te experimento e randomizados em dois grupos de quatro e um grupo de controle de três. Uma vacina experimental consistindo de 3 trom- bostasinas truncadas recombinantes com adjuvante é administrada por injeção intramuscular nos seguintes tratamentos:

[0074] 1. Dose única da vacina, dia O

[0075] 2. Dose de preparação de vacina, dia O e impulsionado no dia 21

[0076] 3. Controle; 1 ml de salina estéril, dias 0 e 21

[0077] Sangue é retirado nos dias O, 21 e 35. Soro é para ser se- parado em 5 volumes de % cc e congelado. Titulações de anticorpo para os antígenos de vacina são determinadas em soros coletados em cada dia que o sangue é retirado. Titulações de soro de anticorpos pa- ra os antígenos de vacina são determinados por um teste ELISA.

[0078] DESCRIÇÃO E PREPARAÇÃO DA VACINA - Antígeno(s) recombinante(s) purificado(s) e adjuvantes são suspensos em um agente de suspensão de salina apropriado.

CUIDADO COM O ANIMAL PÓS VACINAÇÃO

[0079] Saúde Geral — Bezerros serão observados diariamente pa- ra eventos adversos relacionados a vacinação e saúde total.

[0080] Coleta de sangue — Sangue é coletado a partir da veia ju- gular usando um tubo vacutainer e uma agulha calibre 16, enquanto que o animal é limitado em uma calha de aperto. O soro é separado e processado para uso adicional em teste de anticorpo.

ANÁLISE DO SANGUE

[0081] Perfil do sangue — Sangue é retirado em tubos vacutainer com rolha vermelho que permitem separação de componentes celula- res e de fluido do sangue.

[0082] Preservação do soro — O soro separado é dividido em pe- quenos volumes (1/2 cc) em recipientes separados e congelado a -75 graus F.

[0083] Determinação da titulação de anticorpo — Anticorpos contra os antígenos na vacina são titulados usando um teste ELISA. Os antígenos usados no teste são os três antígenos truncados e quar- to proteínas de trombostasina de comprimento total TS5, TS8, TS9 e TS10.

[0084] Retardo no tempo de recalcificação induzido pelo teste de saliva da mosca do chifre (RCT): Brevemente, amostra ou tam- pão de controle, diluído em 50mM de Tris, pH 7,4 a 37C, 0,1 de NaCl, 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de polietileno glicol 8000 (PEG 8000) (tampão de TSBP) são adicionados ao plasma nor-

mal de referência (Acculot Sigma Chemical Company, St Louis MO). À mistura é incubada a 37ºC por 3 minutos antes da adição de solução de CaCl2 (10OmMM de concentração final. O tempo entre a adição de CaCl7 e o primeiro sinal da formação de massa (coágulo) foi registrado como tempo de coagulação).

[0085] Os resultados são mostrados na FIG 3 e na Tabela abaixo. Os dados mostram um número de efeitos positivos: 1. As proteínas truncadas são antigênicas, produzindo com sucesso anticorpos no ga- do apesar das modificações. 2. Um efeito impulsionador é observado após uma vacinação primária e, em seguida, uma vacinação impulsio- nadora. 3. Os antígenos truncados parecem produzir anticorpos que reagem com os antígenos de comprimento total, indicando que anti- corpos para os antígenos de comprimento total ou os antígenos trun- cados reagirão com o isotipo particular de trombostasina na saliva; os anticorpos inibem o efeito biológico da trombostasina e diferentes antí- genos podem ser usados em combinação sem interferir com a produ- ção de anticorpo. A Requerente adicionalmente verifica que as titula- ções de anticorpo ELISA são tais que a comercialização da vacina é possível. Em um aspecto, duas vacinações podem ser usadas - uma vacinação primária e uma vacinação impulsionadora.

[0086] Inibição do efeito anticoagulante Coágulo Saliva | Médias | =| 11385 | 13895 | 251 | o

EN RR O O [768 [| 6 [ms 3 | 8 |

Coágulo Saliva [7 [| 6 [ms [3 [| [médias | T nosts | 15895 | 19375 | o

EN RR O O [médias [| Tent | 1877333 [976333333 gado vacinado foram mais efetivas no rompimento do TS em saliva de mosca do chifre do que foram as amostras de soro dos controles. Sur- preendentemente, o soro do gado vacinado somente uma vez parece ser mais efetivo do que aquele do gado vacinado duas vezes, mas a diferença não foi estatisticamente significante (análise de análise de variação p=0,186). Referências:

[0088] MS Cupp et al. Evaluation of a recombinant salivary gland protein (thrombostasin) as a vaccine candidate to disrupt blood-feeding by horn flies. Vaccine 22: 2285-2297 (2004).

[0089] MS Cupp et al. Vaccination of cattle with recombinant sali- vary proteins of horn flies (Haematobiairritansirritans). Proc of World Assoc for Adv of Vet Parasit (WAAVP) Abstract 94 (2005).

[0090] MS Cupp et al Salivary gland thrombostasin isoforms diffe- rentially regulate blood uptake of horn flies on control e thrombostasin - vaccinated cattle. J. Med. Entomol. 47: 610-617 (2010).

[0091] Todas as percentagens e razões são calculadas por peso,

a menos que de outro modo indicado.

[0092] Todas as percentagens e razões são calculadas baseadas na composição total, a menos que de outro modo indicado.

[0093] Deve ser compreendido que toda limitação numérica máxi- ma dada através de todo este relatório descritivo inclui toda limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas aqui. Toda limitação numérica mínima dada através de todo o relatório descritivo incluirá toda limitação numérica mais alta, como se tais limitações numéricas mais altas fossem ex- pressamente escritas aqui. Toda faixa numérica dada através de todo este relatório descritivo inclui toda faixa numérica mais estreita que cai dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéri- cas mais estreitas fossem todas expressamente escritas aqui.

[0094] As dimensões e valores aqui revelados não são para serem compreendidos como sendo estritamente limitados aos valores numé- ricos exatos recitados. Ao invés, a menos que de outro modo especifi- cado, cada tal dimensão é prevista para significar ambos o valor reci- tado e uma faixa funcionalmente equivalente que circunda este valor. Por exemplo, uma dimensão revelada como "20 mm" é prevista para significar "cerca de 20 mm".

[0095] Todo documento aqui citado, incluindo qualquer patente referenciada cruzada ou relacionada ou pedido, é, desse modo, aqui incorporado por referência em sua totalidade, a menos que expressa- mente excluído ou, de outro modo, limitado. A citação de qualquer do- cumento não é uma admissão que é técnica anterior com relação a qualquer invenção revelada ou reivindicada aqui, ou que ela sozinha, ou em qualquer combinação com qualquer outra referência ou referên- cias, ensina, sugere ou revela qualquer tal invenção. Adicionalmente, de modo que qualquer significado ou definição de um termo neste do- cumento conflite com qualquer significado ou definição do mesmo ter-

mo em um documento incorporado por referência, o significado ou de- finição atribuída a este termo neste documento deve governar.

[0096] Enquanto que concretizações particulares da presente in- venção foram ilustradas e descritas, seria óbvio àqueles técnicos no assunto que várias outras mudanças e modificações podem ser feitas sem fugir do espírito e escopo da invenção. É, portanto, previsto cobrir nas reivindicações em anexo todas tais mudanças e modificações que estejam dentro do escopo desta invenção.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de compreen- der a. uma proteína de trombostasina truncada tendo pelo menos 85% de homologia de sequência para uma proteína de trom- bostasina, no qual referida proteína de trombostasina compreende uma supressão de carbóxi terminal; e b. uma proteína parceira de fusão compreendendo um componente de proteína de não trombostasina.

2. Proteína de trombostasina truncada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que referida proteína de trombostasina truncada é como imunogênica em mamíferos como uma proteína de trombostasina não truncada nativa.

3. Proteína de trombostasina truncada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que referida proteína de trombostasina truncada produz anticorpos biologicamente ativos que interferem com a atividade anticoagulante de trombostasina natu- ral da mosca do chifre.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que referida proteína de trombostasina é sele- cionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 12.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que referida proteína de trombostasina trun- cada é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência seleci- onada de SEQ ID NOs: 1-14, no qual referida proteína de trombostasi- na é reconhecível por um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de trombostasina selecionada de SEQ ID NOs: 1-14.

6. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que referida su- pressão de carbóxi terminal é uma supressão de pelo menos 5 amino- ácidos, ou pelo menos 6 aminoácidos, ou pelo menos 7 aminoácidos, ou pelo menos 8 aminoácidos, ou pelo menos 9 aminoácidos, ou pelo menos 10 aminoácidos, ou pelo menos 11 aminoácidos, ou pelo me- nos 12 aminoácidos, ou pelo menos 13 aminoácidos, ou pelo menos 14 aminoácidos, ou pelo menos 15 aminoácidos, ou de cerca de 10 a aminoácidos, ou de cerca de 15 a 30 aminoácidos, ou cerca de 20 a cerca de 25 aminoácidos, ou cerca de 30 aminoácidos.

7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que referida proteína de trombostasina trunca- da é selecionada de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, e combinações destas.

8. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que referida prote- íÍna parceira de fusão é selecionada de proteína de ligação de maltose (MBP), proteína para fusão de antígeno (PAF), proteína reativa C (CRP), ou um fragmento desta, B-galactosidase, glutationa-S- transferase, poli-histidina, proteína básica de mielina (MBP1-9) ou um fragmento desta, ovalbumina de clara de ovo de galinha (OVA), e combinações destas.

9. Composição de vacina compreendendo uma sequência de trombostasina compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, caracterizada pelo fato de que referida supressão é os últimos 35 ami- noácidos, os últimos 34 aminoácidos, os últimos 33 aminoácidos, os últimos 32 aminoácidos, os últimos 31 aminoácidos, os últimos 30 aminoácidos, os últimos 29 aminoácidos, os últimos 28 aminoácidos, os últimos 27 aminoácidos, os últimos 26 aminoácidos, os últimos 25 aminoácidos, os últimos 24 aminoácidos, os últimos 23 aminoácidos,

os últimos 22 aminoácidos, os últimos 21 aminoácidos, ou os últimos aminoácidos.

10. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma proteína parceira de fusão.

11. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que referida composição de vacina compreende uma pluralidade de proteínas de fusão compreendendo uma proteína de trombostasina compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, de preferência no qual referida pluralidade de proteí- nas de fusão compreendem uma proteína TS9 compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, uma proteína TS10 compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, e uma ou ambas de uma proteína TB8 compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, ou uma pro- teína TS8 compreendendo uma supressão de carbóxi terminal, mais de preferência no qual referida composição de vacina compreende SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, ou uma combinação destas.

12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9, 10, ou 11, caracterizada pelo fato de que referida proteína de fusão está presente em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta biológica em um hospedeiro.

13. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9, 10, 11, ou 12, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um transportador farmaceuticamente aceitável.

14. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um adjuvante.

15. Método para inibição de uma resposta a uma proteína de trombostasina em um hospedeiro em necessidade desta, caracteri-

zado pelo fato de compreender administrar uma quantidade tarapeutu- camente eficaz da proteína de fusão, ou composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a referido hospedeiro, de preferência, no qual referido hospedeiro é um mamiífe- ro, de preferência no qual referido hospedeiro é gado.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que referida proteína de fusão, ou composição de vaci- na, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedents, é in- jetada intramuscularmente, subcutaneamente, ou qualquer outra rota de administração.

17. Método para preparação de uma composição de proteí- na de fusão, caracterizado pelo fato de compreender a. gerar um plasmídeo para expressão da proteína de fu- são de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes; b. fazer com que o plasmídeo expresse referida proteína de fusão no interior de uma célula hospedeira; e c. coletar a proteína de fusão de referida célula hospedei- ra.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que referida proteína de fusão é produzida em E.coli.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que referida proteína de fusão é produzida em qual- quer sistema de produção de célula, de preferência, bactérias, fungos, insetos ou células de mamífero.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que referida proteína de fusão é produzida por síntese química de peptídeo.