BRPI0807828B1

BRPI0807828B1 - Composição compreendendo leveduras e usos das mesmas, bem como método para o crescimento de leveduras e kit para o cultivo de leveduras

Info

Publication number: BRPI0807828B1
Application number: BRPI0807828-9A
Authority: BR
Inventors: Franzusoff Alex; Quick Deborah
Original assignee: Globeimmune, Inc.
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2018-05-29
Also published as: US9066893B2; CA2676783A1; KR20150006022A; SI2121013T1; SG171577A1; CN101687030B; DK2121013T3; SG10201405420QA; JP2010517537A; WO2008097863A2; IL200176A; EP2121013B1; BRPI0807828B8; JP2014223072A; BRPI0807828A2; PL2121013T3; JP5570819B2; US20100189749A1; KR101555641B1; PT2121013E

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO LEVEDURAS E USOS DAS MESMAS, BEM COMO MÉTODO PARA O CRESCIMENTO DE LEVEDURAS E KIT PARA O CULTIVO DE LEVEDURAS (51) Int.CI.: A61K 39/39; A61K 36/06; C07K 14/395 (30) Prioridade Unionista: 02/02/2007 US 60/899,281 (73) Titular(es): GLOBEIMMUNE, INC.

(72) Inventor(es): ALEX FRANZUSOFF; DEBORAH QUICK

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COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO LEVEDURAS E USOS DAS MESMAS, BEM COMO MÉTODO PARA O CRESCIMENTO DE LEVEDURAS E KIT PARA O

CULTIVO DE LEVEDURAS

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica a prioridade da

Patente U.S. N° de Série 60/899.281, depositada em 2 de fevereiro de 2008, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada aos métodos de crescimento de culturas de levedura em um pH neutro para aprimorar os rendimentos e certas características de culturas de levedura. O método também está relacionado às composições produzidas por esses métodos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As vacinas são uma das medidas com melhor relação custo-benefício disponíveis para a indústria da assistência médica. Permanece, no entanto, uma necessidade urgente do desenvolvimento de vacinas e adjuvantes seguras e eficazes para diversas doenças, incluindo aquelas causadas por infecção por agentes patogênicos, cânceres, defeitos genéticos e outros distúrbios do sistema imunológico. Publicações sobre vacinas, por exemplo, Rabinovich e cols., Science 265, 1.401-1.404 (1994), estabelecem que ainda há necessidade de vacinas seguras e termoestáveis que possam ser administradas oralmente e que só precisem ser administradas poucas vezes, de preferência no início da vida. Também são preferidas vacinas combinadas que possam proteger os indivíduos contra mais de uma doença, assim como vacinas que não necessitem de um adjuvante e que

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2/39 possam despertar imunidade mucosa. Até hoje, muito poucas vacinas, se é que elas existem, satisfazem a todos esses critérios.

As vacinas de subunidade, cujo desenvolvimento tornou5 se possível pela tecnologia de DNA recombinante, têm sido decepcionantes até hoje, na medida em que exibem imunogenicidade apenas parcial. Um exemplo é o teste clínico recente de várias vacinas de subunidade para o HIV (vírus da imunodeficiência humana) que foi interrompido, não apenas pela eficácia limitada das vacinas, mas também porque, em alguns casos, os indivíduos imunizados mostraram progressão acelerada da doença quando foram expostos subseqüentemente ao HIV; veja, por exemplo, Cohen, Science 264:1839(1994); e Cohen, Science 264: 660 (1994). Uma desvantagem das vacinas de subunidade, assim como das vacinas de vírus morto e vírus vivo recombinante, é que, embora elas pareçam estimular uma forte resposta imunológica humoral, elas não despertam imunidade celular protetora. Uma conclusão importante da Conferência

Internacional sobre AIDS 1994 foi que continua sendo necessária uma resposta mediada por células T citotóxicas para evitar ou reduzir a infectividade do HIV, o que, até hoje, não existe nas vacinas na clínica. Além disso, as vacinas para HIV testadas até hoje não despertaram imunidade nas superfícies mucosas onde primariamente ocorre a infecção pelo HIV.

Além disso, os únicos adjuvantes aprovados para uso nos Estados Unidos são os sais de alumínio, hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, e nenhum dos dois estimula a imunidade mediada por células. Além disso, as formulações

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3/39 de sal de alumínio não podem ser congeladas ou liofilizadas, e esses adjuvantes não são eficazes com todos os antígenos.

Células de leveduras têm sido usadas na produção de 5 vacinas de proteína de subunidade, incluindo algumas daquelas testadas nos experimentos de vacina para HIV mencionados anteriormente. Leveduras também têm sido administradas aos animais antes da imunização para tentar sensibilizar a resposta imunológica de uma forma inespecífica (ou seja, para estimular a fagocitose, bem como a produção de complemento e interferon). Os resultados foram ambíguos, e esses protocolos não geraram imunidade celular protetora; veja, por exemplo, Fattal-German e cols., Dev. Biol. Stand. 77: 115-120 (1992) e Bizzini e cols., FEMS Microbiol. Immunol. 2: 155-167 (1990).

Além de vacinas, muitas terapias gênicas e farmacológicas exigem veículos de liberação eficientes e específicos para assegurar o maior benefício possível. A ausência de um veículo de liberação adequado é uma barreira importante para a aplicação de terapia gênica e limita significativamente o potencial terapêutico de muitos fármacos. Por exemplo, relatos recentes indicaram que vetores de adenovírus, que atualmente estão sendo testados na clínica para aplicações de terapia gênica, estimulam respostas imunológicas e inflamatórias indesejáveis e parece que não se integram de uma forma desejada; veja, por exemplo, Engelhardt e cols., Human Gene Therapy 5: 1.2171.229 (1994) e referências nele citadas.

Outro obstáculo importante para a tecnologia de vacina de levedura é o processo de fabricação. Foram cultivadas

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4/39 células de levedura nos laboratórios por muitos anos, e foram estabelecidas condições de cultura padronizadas. Veja, por exemplo, “Methods of Enzymology”, Vol. 194, Guthrie e cols., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990). Protocolos de operação padronizados geralmente envolvem o cultivo de leveduras em meio que seja ácido, como medido pelos níveis de pH. No entanto, o cultivo de leveduras em meio ácido pode fazer com que as leveduras exibam propriedades biológicas diferentes que não são as ideais para a utilização de leveduras como veículos que conduzem antígeno para fins de imunomodulação ou para a produção de vacinas. Dessa forma, são necessários métodos para o crescimento de levedura, de tal forma que a levedura exiba propriedades que as torne mais bem adequadas para serem veículos que conduzem antígeno. A invenção aqui revelada se baseia, em parte, na descoberta de que, embora as leveduras possam crescer em meio ácido, as propriedades biológicas que as leveduras exibem quando crescidas em meio ácido não são tão desejáveis quanto quando crescem em meio que esteja em níveis de pH neutro.

A revelação de todas as patentes, pedidos de patente e publicações aqui citadas é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece um método para o crescimento de leveduras por cultivo das leveduras em um meio, em que o meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8 por pelo menos 50% do tempo em que as leveduras estão em cultura. A invenção também fornece um método para o crescimento de leveduras por cultivo das leveduras em um meio, em que o

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5/39 meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8 e em que a densidade da levedura é de pelo menos 0,5 unidade de levedura/ml.

Em outro aspecto, a invenção permite o crescimento de 5 leveduras por cultivo das leveduras em um meio com um nível de pH de pelo menos 5,5. A invenção também fornece um método para o crescimento de leveduras por cultivo das leveduras em um meio, em que o meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8. Em um aspecto da invenção, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em aspectos da invenção, o meio é tamponado com succinato ou ácido succínico, ou o meio pode adicionalmente conter soytone. Em outros aspectos da invenção, a levedura desperta uma resposta imunológica. Em outros aspectos da invenção, a levedura expressa um antígeno; em alguns casos, o antígeno é um antígeno heterólogo. Em alguns casos, o antígeno heterólogo é expresso na superfície da levedura.

A invenção fornece uma composição que compreende levedura cultivada por qualquer um dos métodos e aspectos relacionados acima.

A invenção fornece um método para a produção de leveduras que expressam antígeno por cultivo de leveduras que contêm um sistema de expressão para expressão do antígeno em um meio, em que o pH do meio é de pelo menos

5,5. A invenção também fornece um método para a produção de leveduras que expressam antígeno por cultivo de leveduras que contêm um sistema de expressão para expressão do antígeno, em que o meio é mantido em um nível de pH entre

5,5 e 8. Em um aspecto, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outros aspectos, o meio é tamponado com

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6/39 succinato ou ácido succínico, ou o meio pode adicionalmente conter soytone. Em outros aspectos da invenção, a levedura desperta uma resposta imunológica. Em outros aspectos da invenção, a levedura expressa um antígeno; em alguns casos, o antígeno é um antígeno heterólogo. Em alguns casos, o antígeno heterólogo é expresso na superfície da levedura. Em alguns aspectos, o antígeno heterólogo é mais facilmente acessível para interação com outras células ou agentes do que quando a levedura é desenvolvida em um pH abaixo de

5,5.

A invenção também fornece uma composição que compreende levedura cultivada pelo método revelado acima.

A invenção também fornece um método de indução de uma resposta do tipo Th1 em um indivíduo por administração ao indivíduo de uma composição que compreende leveduras que expressam antígeno, em que as leveduras foram cultivadas em um meio com um nível de pH de pelo menos 5,5.

A invenção também fornece um método de indução de uma resposta do tipo Th1 em um indivíduo por administração ao indivíduo de uma composição que compreende leveduras que expressam antígeno, em que as leveduras foram cultivadas em um meio, em que o meio é mantido em um nível de pH entre

5,5 e 8. Em um aspecto, a composição compreende células dendríticas carregadas com leveduras que foram cultivadas, mantidas ou coletadas em um pH neutro. Em outro aspecto, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outros aspectos, o meio é tamponado com succinato ou ácido succínico, ou o meio pode adicionalmente conter soytone. Em outros aspectos da invenção, a levedura desperta uma resposta imunológica.

Em outros aspectos da invenção, a levedura expressa um

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7/39 antígeno; em alguns casos, o antígeno é um antígeno heterólogo. Em alguns casos, o antígeno heterólogo é expresso na superfície da levedura. Em um aspecto, a resposta do tipo Th1 é a produção de interferon gama. Em outro aspecto, a resposta do tipo Th1 é a produção de IL12 .

A invenção também fornece um kit para o cultivo de leveduras que compreende meio, em que o pH do meio é de pelo menos 5,5, e instruções para o uso do meio para o cultivo de leveduras. A invenção também fornece um kit para o cultivo de leveduras que compreende meio, em que o pH do meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8, e instruções para o uso do meio para o cultivo de leveduras. Em outros aspectos, o meio é tamponado com succinato ou ácido succínico, ou o meio pode adicionalmente conter soytone. Em um aspecto, o kit adicionalmente inclui levedura. Em alguns casos, a levedura é congelada ou liofilizada. Em alguns casos, a levedura foi cultivada em um meio de pelo menos pH 5,5, ou foi cultivada em um meio em que o pH do meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8. Em outros casos, a levedura é capaz de replicação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 retrata os efeitos de níveis de pH do meio sobre o crescimento celular e também sobre os níveis de pH da cultura.

A Figura 2 retrata o efeito de níveis de pH do meio sobre a espessura da parede celular.

A Figura 3 retrata os resultados de testes de diferentes tampões em um pH de cerca de 6,5. São mostrados os efeitos sobre o crescimento de células 75-15 e o pH da

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8/39 cultura .

A Figura 4 retrata o efeito de vários agentes de tamponamento sobre a espessura da parede celular, como medido por lise por glucanase. O meio de cultura foi tamponado usando succinato ou citrato para tamponar o meio de cultura até um nível de pH de cerca de 6,5.

A Figura 5 retrata os resultados de um estudo de formulação de meio em que vários aditivos foram testados quanto aos seus efeitos sobre o crescimento e os níveis de pH.

A Figura 6 retrata os resultados para a viabilidade de uma célula de levedura como parte de um estudo de formulação de meio. A expressão de superfície de HA na superfície da célula de levedura foi medida com a utilização de citometria de fluxo.

A Figura 7 retrata os resultados de um estudo de formulação de meio sobre o crescimento celular e os perfis de pH no qual foram testados vários aditivos.

A Figura 8 retrata os resultados de um ensaio 20 imunoblot de hemaglutinina (HA) que pode ser liberada por leveduras intactas que mostram a diferença na acessibilidade à HA quando as leveduras são desenvolvidas em condições de pH neutro versus quando as leveduras são desenvolvidas em condições de pH mais baixo. O imunoblot é um western blot de eluído de DTT de YEX e GI-8103.

A Figura 9 retrata o efeito do cultivo de células de leveduras em níveis de pH neutros e baixos sobre a secreção de citocinas por células dendríticas que foram carregadas com células de leveduras.

0 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

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A invenção aqui revelada se baseia na descoberta de que o crescimento de leveduras em um pH neutro, pelo menos um pH de 5,5 ou entre pH 5,5 e 8, ou entre pH 6 e 8, resulta em leveduras com características biológicas mais desejáveis. Algumas dessas características desejáveis, que serão detalhadas infra, incluem, sem limitação, a habilidade para crescerem bem em uma densidade celular aumentada, mantendo a parede celular da levedura flexível e sensível à digestão com enzimas de digestão da parede celular, e a apresentação de antígenos de uma forma que os torna mais acessível a outras células e/ou agentes.

Técnicas gerais

A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de forma diferente, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica, química de ácido nucléico e imunologia, que são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Essas técnicas são explicadas em sua totalidade na literatura, por exemplo, “Methods of Enzymology”, Vol. 194, Guthrie e cols., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); “Biology and activities of yesats”, Skinner, e cols., eds., Academic Press (1980); “Methods in yeast genetics: a laboratory course manual”, Rose e cols., Cold Spring Harbor Laboratory

Press (1990); “The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology”, Pringle e cols., eds., Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1997); “The Yeast Saccharomyces: Gene Expression”, Jones e cols., eds., Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1993); “The Yeast Saccharomyces: Genome

Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics”, Broach e

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10/39 cols., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook e cols., 1989) e “Molecular Cloning: A Laboratory

Manual”, terceira edição (Sambrook e Russell, 2001) (aqui citados de forma comum como “Sambrook”); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel e cols., eds., 1987, incluindo suplementos até 2001); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis e cols., eds., 1994); Harlow e Lane (1988) “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring

Harbor Publications, Nova York; Harlow e Lane (1999) “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (aqui citados de forma comum como “Harlow e Lane”), Beaucage e cols. eds., “Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry”, John Wiley &

Sons, Inc., Nova York, 2000) e “Vaccines”, S. Plotkin e W. Orenstein, eds. , 3^a edição (1999).

Definições

Como aqui usado, o uso geral do termo “pH neutro” refere-se a um nível de pH de pelo menos 5,5. O faixa do pH neutro pode estar entre um pH de aproximadamente 5,5 e um pH de aproximadamente 8, de preferência entre um pH de aproximadamente 6 e de aproximadamente 8. Aqueles habilitados na técnica perceberão que podem ocorrer pequenas flutuações (por exemplo, dezenas ou centenas) quando se mede com um medidor de pH e, dessa forma, isso deve ser considerado quando se determina o nível de pH em certo momento.

Como aqui usado, o uso geral do termo “antígeno” refere-se a qualquer molécula que possa ser reconhecida pelo sistema imunológico adaptativo. Em um aspecto, um

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11/39 antígeno é uma molécula que se liga especificamente a um anticorpo. A molécula pode ser qualquer porção de uma proteína (peptídeo, proteína parcial, proteína de comprimento total) em que a proteína é de ocorrência natural ou derivada sinteticamente, ou parte de uma composição celular (célula inteira, lisado celular ou células rompidas), parte de um organismo (organismo inteiro, lisado celular ou células rompidas) ou um carboidrato ou uma porção deste. O antígeno pode despertar uma resposta imunológica humoral antígeno-específica por si próprio ou com o uso de outro composto como, por exemplo, um adjuvante (como células de leveduras esmagadas). Em outro aspecto, um antígeno é reconhecido por linfócitos T (ou células T) no contexto de complexos de histocompatibilidade principais (MHCs). Em outro aspecto, o antígeno pode atuar como um tolerógeno, contra o mesmo antígeno ou contra antígenos similares que são encontrados dentro das células e tecidos do animal ao qual o antígeno é administrado.

Em um aspecto da presente invenção, quando é feita referência à estimulação de uma resposta imunológica, o “antígeno” pode ser um “imunógeno”. Imunógenos são moléculas que podem despertar uma resposta imunológica adaptativa, por exemplo, indução de produção de anticorpos.

O imunógeno pode, em alguns casos, gerar células de memória que produzirão anticorpos que reconhecem o antígeno mediante exposição futura ao antígeno. Como é sabido por aqueles habilitados na técnica, os imunógenos também podem ser reconhecidos por linfócitos T, embora a forma do imunógeno reconhecida por linfócitos T vá ser diferente da

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12/39 forma do imunógeno que o anticorpo reconhece.

Métodos de cultivo de leveduras

A invenção fornece métodos para o cultivo de leveduras que produzem características desejáveis, tais como alta expressão de um antígeno desejado, flexibilidade da parede celular e apresentação de antígeno.

Esses métodos são amplamente aplicáveis a todas as leveduras. Leveduras são microorganismos unicelulares que pertencem a uma de três classes: Ascomycetes,

Basidiomycetes e Fungi Imperfecti. Embora as cepas de levedura patogênicas, ou mutantes não patogênicas destas, possam ser usadas de acordo com a presente invenção, em um aspecto, são usadas cepas de leveduras não patogênicas. Exemplos de cepas de leveduras não patogênicas incluem

Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula,

Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces e Yarrowia. Em um aspecto, são usados Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia e Schizosaccharomyces. Ainda em outros aspectos, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha,

Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra,

Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. Entende-se que a invenção não se limita à lista de espécies acima, e que aqueles habilitados na técnica podem aplicar os ensinamentos aqui apresentados em qualquer tipo de levedura. Em outro aspecto, é usado Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para a prática dos métodos da

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13/39 invenção. S. cerevisiae é preferido em função de sua facilidade para manipulação molecular e por ser “Reconhecido Geralmente como Seguro” ou “GRAS” para uso como aditivos alimentares (GRAS, “FDA proposed Rule”

62FR18938, 17 de abril de 1997) .

O nível de pH é importante no cultivo de leveduras.

Aqueles habilitados na técnica observarão que o processo de cultivo inclui não apenas o início da cultura de leveduras, mas também a manutenção da cultura. A cultura de leveduras pode ser iniciada em qualquer nível de pH; no entanto, na medida em que o meio de uma cultura de levedura tende a se tornar mais ácido (ou seja, reduzindo o pH) ao longo de tempo, deve-se tomar cuidado para monitorar o nível de pH durante o processo de cultivo.

Em alguns aspectos da invenção, a levedura é desenvolvida em um meio em um nível de pH de pelo menos 5,5. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida em um nível de pH de cerca de 5,5. Em outros aspectos, a levedura

é desenvolvida em	um	nível de	pH entre	5,5	e	8. Em	alguns
20 casos,	a cultura	de	levedura	é mantida	em	um	nível	de	pH
entre	5,5 e 8.		Em outros aspectos,	a	levedura	é
desenvolvida em um	nível de	pH entre	6	e 8	. Em	alguns
casos,	a cultura	de	levedura	é mantida	em	um	nível	de	pH

entre 6 e 8. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida 25 e/ou mantida em um nível de pH entre 6,1 e 8,1. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida e/ou mantida em um nível de pH entre 6,2 e 8,2. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida e/ou mantida em um nível de pH entre 6,3 e

8,3. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida e/ou 30 mantida em um nível de pH entre 6,4 e 8,4. Em outros

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14/39 aspectos, a levedura é desenvolvida e/ou mantida em um nível de pH entre 5,5 e 8,5. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida e/ou mantida em um nível de pH entre 6,5 e 8,5. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida em um nível de pH de cerca de 5,6, 5,7, 5,8 ou 5,9. Em outro aspecto, a levedura é desenvolvida em um nível de pH de cerca de 6. Em outro aspecto, a levedura é desenvolvida em um nível de pH de cerca de 6,5. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida em um nível de pH de cerca de 6,

6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida em um nível de pH de cerca de 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,

7,9 ou 8,0. Em outros aspectos, a levedura é desenvolvida em um nível acima de 8.

Em um aspecto, levedura é cultivada de tal forma que o nível de pH do meio não caia abaixo do pH 5,5. Em alguns casos, a queda abaixo do pH 5,5 não dura mais do que 5 minutos. Em outros casos, a queda abaixo do pH 5,5 não dura mais do que 10 minutos, de preferência 20, 30, 40, 50 ou 60 minutos. Em outros casos, a queda abaixo do pH 5,5 não dura mais do que 1 hora. Em outro aspecto, a levedura é cultivada de tal forma que o nível de pH do meio não caia abaixo de 5,0. Em alguns casos, a queda abaixo do pH 5,0 não dura mais do que 5 minutos. Em outros casos, a queda abaixo do pH 5,0 não dura mais do que 10 minutos, de preferência 20, 30, 40, 50 ou 60 minutos. Em outros casos, a queda abaixo do pH 5,0 não dura mais do que 1 hora. Dessa forma, quanto mais tempo as leveduras crescem em um meio que possui pH de pelo menos 5,5 ou acima, melhores serão os resultados em termos da obtenção de leveduras com as

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15/39 características desejáveis descritas infra.

Em um aspecto, o uso de métodos de pH neutro para o crescimento de células de leveduras significa que as células de leveduras crescem em pH neutro por pelo menos

50% do tempo em que as leveduras estão em cultura. É mais preferível que as leveduras cresçam em pH neutro por pelo menos 60% do tempo em que estão em cultura, mais preferivelmente pelo menos 70% do tempo em que estão em cultura, mais preferivelmente pelo menos 80% do tempo em que estão em cultura e, mais preferivelmente ainda, pelo menos 90% do tempo em que estão em cultura.

Em outro aspecto, o crescimento de leveduras em pH neutro inclui o cultivo de células de leveduras por pelo menos cinco minutos em pH neutro, de preferência pelo menos

15 minutos em pH neutro, mais preferivelmente pelo menos uma hora em pH neutro, mais preferivelmente pelo menos duas horas, ainda mais preferivelmente, pelo menos três horas ou mais.

Como observado anteriormente, à medida que as leveduras crescem e se replicam, as densidades celulares se tornam maiores e o nível de acidez no meio de cultura se eleva. Dessa forma, recomenda-se que as leveduras sejam cultivadas em um nível de pH de pelo menos 5,5 e/ou que sejam mantidas em um pH de pelo menos 5,5 à medida que a densidade de leveduras aumenta. Em um aspecto, as leveduras são desenvolvidas e/ou mantidas entre um pH de 5,5 e 8 quando a densidade de leveduras for de 0,5 unidade de levedura (YU)/ml ou maior. Em outros aspectos, as leveduras são desenvolvidas e/ou mantidas entre um pH de 5,5 e 8 quando a densidade de leveduras for de pelo menos 0,6 YU/ml

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16/39 ou maior, de preferência 0,7 YU/ml ou maior, 0,8 YU/ml ou maior, 0,9 YU/ml ou maior, ou 1 YU/ml ou maior. Em outro aspecto, as leveduras são desenvolvidas e/ou mantidas entre um pH de 6 e 8 quando a densidade de leveduras for de 0,5

YU/ml ou maior. Em outros aspectos, as leveduras são desenvolvidas e/ou mantidas entre um pH de 6 e 8 quando a densidade de leveduras for de pelo menos 0,6 YU/ml ou maior, de preferência 0,7 YU/ml ou maior, 0,8 YU/ml ou maior, 0,9 YU/ml ou maior, ou 1 YU/ml ou maior.

Em alguns aspectos, é preferível, no momento da coleta, que a cultura de levedura esteja em um nível de pH neutro. Em alguns casos, a cultura de levedura, no momento da coleta, estará em um nível de pH entre 6 e 8. Em outros casos, a cultura de levedura, no momento da coleta, estará em um nível de pH entre 5,5 e 8.

O meio de cultura pode ser levado a um nível de pH de pelo menos 5,5 por qualquer meio. Em um aspecto, é usado ácido succínico (e quaisquer formas relacionadas, por exemplo, o ânion succinato) para o tamponamento do meio de cultura. Como mais detalhado nos Exemplos, o uso de succinato para tamponar o meio de cultura até um pH de pelo menos 5,5 permite que as leveduras tenham um tempo de duplicação de cerca de duas horas para duas horas e meia. O succinato é disponível por fontes comercialmente disponíveis (por exemplo, Sigma Chemicals). Em outros aspectos, pode ser usado citrato para levar o meio até um pH de pelo menos 5,5. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de determinar facilmente outros agentes de tamponamento que podem ser usados para levar o meio até um pH de pelo menos 5,5, mantendo as leveduras viáveis. O

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17/39 conceito de agentes de tamponamento para manter uma solução em um nível estável de pH é bem conhecido na técnica e, dessa forma, não será aqui discutido em detalhe. Caso as leveduras desenvolvidas de acordo com a invenção estejam sendo usadas para formulações farmacêuticas (por exemplo, vacinas), recomenda-se que seja usado material de grau GMP (Good Manufacturing Practice - “Boas Práticas de Fabricação”).

Além disso, podem ser adicionados outros suplementos 10 ao meio de cultura para aprimorar o meio. Outros suplementos que são particularmente úteis para serem adicionados ao meio de cultura incluem soytone. Soytone é facilmente disponível por fontes comerciais (por exemplo, BD Difco) . Como mostrado nos Exemplos e nas figuras, a adição de soytone ao meio de cultura apóia uma densidade maior para o crescimento em pH neutro. Além disso, a adição de soytone apóia a expressão de um antígeno de interesse, hemaglutinina (HA) do vírus influenza.

Outros aditivos podem ser acrescentados à cultura de levedura para outras finalidades, por exemplo, indução de expressão de genes heterólogos. Em alguns aspectos, é usado cobre para induzir a expressão de hemaglutinina. No entanto, o uso de cobre não é ideal em pH neutro e, dessa forma, para o controle de genes indutíveis a serem expressos em leveduras desenvolvidas em pH neutro; seria recomendado um outro aditivo que não cobre.

Efeitos do pH neutro sobre a cultura de leveduras O uso de um pH neutro no cultivo de leveduras promove vários efeitos biológicos que são características desejáveis para utilização das leveduras como veículos para

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18/39 imunomodulação e/ou desenvolvimento de respostas imunológicas. Em um aspecto, o cultivo das leveduras em pH permite um bom crescimento da levedura, sem nenhum efeito negativo sobre o tempo de duplicação (por exemplo, redução do tempo de duplicação) . As leveduras podem continuar a crescer em altas densidades, sem perda de sua flexibilidade da parede celular.

Em outro aspecto, o uso de um pH neutro, por exemplo, um pH de pelo menos 5,5 ou um pH entre 5,5 e 8, permite a produção de leveduras com paredes celulares flexíveis e/ou leveduras que possuem uma sensibilidade às enzimas de digestão da parede celular (por exemplo, glucanase) em todas as densidades de coleta. Dessa forma, a invenção fornece métodos e composições de leveduras com flexibilidade da parede celular, como medida por ensaios tradicionais (por exemplo, sensibilidade à glucanase). Experimentos prévios estabeleceram que as leveduras perdiam sua sensibilidade à digestão com enzimas de digestão da parede celular em densidades de coleta de cerca de 0,5 YU (unidades de levedura)/ml. Dessa forma, uma vantagem é que podem ser feitas comparações feitas com levedura cultivada em meio de crescimento padrão a 0,5 YU/ml para comparação com crescimento em pH neutro em qualquer densidade. Essa característica é desejável, pois leveduras com paredes celulares flexíveis podem exibir respostas imunológicas únicas como, por exemplo, promoção da secreção de citocinas (por exemplo, INF-gama) nas células que abrigam a levedura. Outra razão que explica por que aqueles habilitados na técnica utilizariam a metodologia de pH neutro é que ela permite uma acessibilidade maior aos antígenos localizados

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19/39 na parede celular. Isso é útil para uma maior imunogenicidade e também para a detecção por anticorpos de proteínas expressas, medida por técnicas padronizadas como, por exemplo, citometria de fluxo.

Ainda outra característica desejável que é observada em leveduras cultivadas em pH neutro é a expressão de antígenos de uma forma que é benéfica para fins de imunomodulação. Em um aspecto, as leveduras são usadas como veículos para a expressão de antígeno (veja, por exemplo,

Patentes U.S. Nos, 5.830.463 e 7.083.787). O antígeno pode ser um antígeno nativo às leveduras ou, alternativamente, um antígeno heterólogo que é expresso pelas leveduras. Em alguns aspectos, o uso de levedura para expressão de antígenos é útil para o desenvolvimento de vacinas, substâncias profiláticas e substâncias terapêuticas para o combate a várias doenças e enfermidades (por exemplo, doenças infecciosas ou câncer). Com a utilização da metodologia de pH neutro, aqueles habilitados na técnica podem produzir leveduras que abrigam antígeno, em que o antígeno é mais acessível às outras células (por exemplo, para funções imunes co-estimuladoras ou regulação imune) ou a outros agentes (por exemplo, anticorpos para detecção). Além disso, o uso do pH neutro para alguns antígenos, por exemplo, o antígeno HA de influenza, permite a liberação da

HA ligada por dissulfeto por tratamento com ditiotreitol (DTT), o que não é possível quando a levedura que expressa HA é cultivada em meio onde o pH cai abaixo de 5. Em alguns casos, isso ocorre quando o pH cai abaixo de 5 por qualquer período de tempo. Em outros casos, isso ocorre quando o pH cai abaixo de pH 5 por um ou poucos minutos ou uma ou mais

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20/39 horas .

Outra característica desejável que as leveduras cultivadas de acordo com as metodologias de pH neutro exibem é a secreção de citocinas do tipo Th1 pelas células que foram expostas às leveduras. Exemplos de citocinas do tipo Th1 incluem, sem limitação, interferon gama, IL-12 e IL-2. Como será mais detalhado nos Exemplos, células dendríticas que foram carregadas com leveduras desenvolvidas de acordo com os protocolos de pH neutro exibem níveis aumentados de secreção e expressão interferon gama, quando comparadas com leveduras desenvolvidas em meio com pH baixo (ácido) . Não houve redução nos níveis de secreção de IL-12 quando se utilizam os métodos de cultivo com pH neutro. Dessa forma, aqueles habilitados na técnica podem utilizar as metodologias de pH neutro aqui reveladas para fins de imunomodulação, por exemplo, de indução de uma resposta do tipo Th1 em um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio que se beneficiaria de uma resposta do tipo Th1 intensificada.

0 Composições de leveduras desenvolvidas com o uso da metodologia de pH neutro

A invenção também contempla composições que compreendem leveduras que são desenvolvidas com o uso das metodologias de pH neutro aqui reveladas. Em um aspecto, a composição compreende leveduras que expressam antígenos nativos, em sua superfície ou internamente, ou ambos. Essa composição pode ser útil para várias finalidades, por exemplo, administração como um adjuvante. Em outro aspecto, a composição compreende leveduras que expressam antígenos heterólogos, em sua superfície ou internamente, ou ambos.

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Essa composição pode ser útil para várias finalidades, por exemplo, para imunomodulação em um indivíduo que necessita desta e para o desenvolvimento de vacinas.

Essas composições também podem incluir excipientes 5 e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir soluções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como, por exemplo, azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis como, por exemplo, oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem repositores de líquidos e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles que se baseiam na dextrose de Ringer), e semelhantes. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. A formulação das composições que compreendem leveduras desenvolvidas sob condições de pH neutro com um excipiente farmaceuticamente aceitável é geralmente rotineira para aqueles habilitados na técnica.

Kits da invenção

A invenção contempla kits que compreendem componentes do meio para o cultivo de leveduras sob condições de pH neutro. Em um aspecto, o kit inclui componentes do meio que contém succinato ou ácido succínico que podem ser usados

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22/39 para levar o meio até um pH de pelo menos 5,5 e um conjunto de instruções para sua utilização. Em outro aspecto, o kit ainda inclui soytone como um componente adicional. Em outro aspecto, o kit ainda inclui células de leveduras. As células de leveduras podem ser congeladas para o início de uma cultura com o uso dos protocolos aqui revelados. Em outro aspecto, as células de leveduras podem já terem sido cultivadas pelos métodos aqui revelados, antes de serem congeladas para embalagem como parte do kit. Em outro aspecto, as células de leveduras podem ser liofilizadas e opcionalmente ser incluídas no kit. Em outro aspecto, o kit compreende leveduras preparadas de acordo com os métodos aqui revelados que são capazes de replicação.

Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar certos aspectos da invenção. Eles não têm a intenção de limitar a invenção de forma alguma.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Formulações de meio de leveduras

Vários tipos de meios podem ser usados para o cultivo 20 de leveduras e podem ser ajustados de tal forma que o nível de pH seja neutro. Vários exemplos de meios que podem ser usados são apresentados abaixo; no entanto, deve-se entender que a invenção não se limita ao uso desses componentes do meio ou protocolos do meio.

Uma receita de meio padronizada é o meio ULDM, que é a seguinte:

Componente	g/l	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100, 0	EMD AX13853

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OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 02	0,4	Sigma A9795
Triptofano	0, 02	0,4	JTBaker 2092
Histidina	0, 02	0,4	JTBaker N327
Monoidrato de glicose	25, 0	500, 0	EMD 1.08342.2500

Outra receita de meio padronizada é o meio UL2, que é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0,4	0,8	Sigma A9795
Triptofano	0,4	0,8	JTBaker 2092
Histidina	0,4	0,8	JTBaker N327
Monoidrato de glicose	15, 0	300, 0	EMD 1.08342.2500

Outra receita de meio padronizada é o meio UL3, que é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	2,5	50,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	7,5	150,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	10, 0	200,0	Difco
Adenina	0, 06	1,2	Sigma A9795
Triptofano	0, 06	1,2	JTBaker 2092
Histidina	0, 06	1,2	JTBaker N327

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Monoidrato de glicose	22,5	450, 0	EMD 1.08342.2500
Outra receita de meio padronizada é o meio UL4, que é
a seguinte:
Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	3,4	68, 0	Difco 233520
Sulfato de amônio	10, 0	200,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	13,4	268,0	Difco
Adenina	0, 08	1,6	Sigma A9795
Triptofano	0, 08	1,6	JTBaker 2092
Histidina	0, 08	1,6	JTBaker N327
Monoidrato de glicose	30, 0	600, 0	EMD 1.08342.2500

Outra receita de meio padronizada é o meio UDM, que é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 02	0,4	Sigma A9795
Triptofano	0, 02	0,4	JTBaker 2092
Histidina	0, 02	0,4	JTBaker N327
Leucina	0, 03	0,6	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	25, 0	500, 0	EMD 1.08342.2500
Outra receita de meio padronizada é seguinte:	o meio U2, que é a
Componente	g/i	20 l	Fonte

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YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 04	0, 8	Sigma A9795
Triptofano	0, 04	0, 8	JTBaker 2092
Histidina	0, 04	0,8	JTBaker N327
Leucina	0, 06	1,2	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	15, 0	300, 0	EMD 1.08342.2500

Outra receita de meio padronizada é o meio U3, que é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	2,5	50,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	7,5	150,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	10, 0	200,0	Difco
Adenina	0, 06	1,2	Sigma A9795
Triptofano	0, 06	1,2	JTBaker 2092
Histidina	0, 06	1,2	JTBaker N327
Leucina	0, 09	1,8	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	22,5	450, 0	EMD 1.08342.2500

Outra receita de meio padronizada é o meio U4, que é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	3,4	68,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	10, 0	200, 0	EMD AX13853

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OU
YNB sem aminoácidos	13,4	268,0	Difco
Adenina	0, 08	1,6	Sigma A9795
Triptofano	0, 08	1,6	JTBaker 2092
Histidina	0, 08	1,6	JTBaker N327
Leucina	0, 12	2,4	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	30, 0	600, 0	EMD 1.08342.2500

Essas formulações padronizadas de meios podem ser suplementadas com aminoácidos adicionais.

Os protocolos seguintes são formulações de meios exemplares.

A formulação de meio ULDMaa é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1—¹ ^1	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 02	0,4	Sigma A9795
Triptofano	0, 04	CO o	JTBaker 2092
Histidina	0, 04	co o	JTBaker N327
Monoidrato de glicose	25, 0	500, 0	EMD 1.08342.2500

A formulação de meio UL2aa é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco

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Adenina	0, 04	0, 8	Sigma A9795
Triptofano	0, 06	1,2	JTBaker 2092
Histidina	0, 06	1,2	JTBaker N327
Monoidrato de glicose	15, 0	300, 0	EMD 1.08342.2500

A formulação de meio UL3aa é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	2,5	50,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	7,5	150,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	10, 0	200,0	Difco
Adenina	0, 06	1,2	Sigma A9795
Triptofano	0, 08	1,6	JTBaker 2092
Histidina	0, 08	1,6	JTBaker N327
Monoidrato de glicose	22,5	450, 0	EMD 1.08342.2500

A formulação de meio UDMaa é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 02	0,4	Sigma A9795
Triptofano	0, 04	0,8	JTBaker 2092
Histidina	0, 04	0,8	JTBaker N327
Leucina	0, 06	1,2	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	25, 0	500, 0	EMD 1.08342.2500
A formulação de meio U2aa é a seguinte:
Componente	g/i	20 l	Fonte

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YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 04	0,8	Sigma A9795
Triptofano	0, 06	1,2	JTBaker 2092
Histidina	0, 06	1,2	JTBaker N327
Leucina	0, 09	1,8	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	15, 0	300, 0	EMD 1.08342.2500

A formulação de meio U3aa é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácido	2,5	50,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	7,5	150,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	10, 0	200,0	Difco
Adenina	0, 06	1,2	Sigma A9795
Triptofano	0, 08	1,6	JTBaker 2092
Histidina	0, 08	1,6	JTBaker N327
Leucina	0, 12	2,4	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	22,5	450, 0	EMD 1.08342.2500

Em outro aspecto, é usado meio tamponado contendo succinato. Exemplos de meios de levedura que contêm succinato são apresentados abaixo. A formulação de meio

UDMS, ajustada até o pH 6,9, é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	1,7	34,0	Difco 233520

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Sulfato de amônio	5, 0	100, 0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 02	0,4	Sigma A9795
Triptofano	0, 02	0,4	JTBaker 2092
Histidina	0, 02	0,4	JTBaker N327
Leucina	0, 03	0,6	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	25, 0	500,0	EMD 1.08342.2500
Ácido succínico	9, 45	189, 0	EMD SX 1040-3

A formulação de meio U2S, ajustada até o pH 6,9, é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de	1—¹ ^1	34,0	Difco 233520
amônio e aminoácidos
Sulfato de amônio	5, 0	100,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	6,7	134,0	Difco
Adenina	0, 04	CO o	Sigma A9795
Triptofano	0, 04	co o	JTBaker 2092
Histidina	0, 04	co o	JTBaker N327
Leucina	0, 06	1,2	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	15, 0	300,0	EMD 1.08342.2500
Ácido succínico	9, 45	189, 0	EMD SX 1040-3

A formulação de meio U3S, ajustada até o pH 6,9, é a seguinte:

Componente	g/i	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	2,5	50,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	7,5	150, 0	EMD AX13853

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30/39

OU
YNB sem aminoácidos	10, 0	200,0	Difco
Adenina	0, 06	1,2	Sigma A9795
Triptofano	0, 06	1,2	JTBaker 2092
Histidina	0, 06	1,2	JTBaker N327
Leucina	0, 09	1,8	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	22,5	450,0	EMD 1,08342,2500
Ácido succínico	9, 45	189, 0	EMD SX 1040-3

A formulação de meio U4S, ajustada até o pH 6,9, é a seguinte:

Componente	g/l	20 l	Fonte
YNB sem sulfato de amônio e aminoácidos	3,4	68,0	Difco 233520
Sulfato de amônio	10, 0	200,0	EMD AX13853
OU
YNB sem aminoácidos	13,4	268,0	Difco
Adenina	0, 08	1,6	Sigma A9795
Triptofano	0, 08	1,6	JTBaker 2092
Histidina	0, 08	1,6	JTBaker N327
Leucina	0, 12	2,4	JTBaker 2083
Monoidrato de glicose	30, 0	600,0	EMD 1,08342,2500
Ácido succínico	9, 45	189, 0	EMD SX 1040-3

Exemplo 2 - Efeitos do pH do meio sobre o crescimento celular e o pH da cultura

Os efeitos do pH do meio sobre o crescimento celular e o pH da cultura foram testados, como mostrado na Figura 1. As células cresceram em meio U2 suplementado com tampão de Bis-Tris, pH 7,2, ou tampão de fosfato, pH 7,2. Culturas de controle cresceram em meio U2, sem tampão adicionado ao

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31/39 meio. Para as condições marcadas como controle (as mesmas que o pH 5,5 do meio) ou pH 7,2 do meio, o meio de crescimento para esses controles foi ajustado até o pH 5,5 ou o pH 7,2 com base (NaOH), antes da inoculação com a levedura. As culturas foram incubadas a 30°C e monitoradas quanto à contagem de células e pH da cultura por até 16 horas. Os resultados indicam que tampões em níveis de pH variáveis afetaram as taxas de crescimento das leveduras.

Como mostrado na Figura 1, os tempos de duplicação variaram 10 de 2,8 a 4,5 horas. O pH no meio não tamponado com pH 7 foi de aproximadamente 5,5 a 2,0 YU/ml, o que indica a necessidade de alguma forma de agente de tamponamento para manter o pH em um nível neutro.

Exemplo 3 - Efeito do pH do meio sobre a espessura da parede celular

Foi testado o efeito do pH do meio para determinar se ele teve algum efeito sobre a espessura da parede celular. O meio e as condições de crescimento foram iguais aos do Exemplo 1. As culturas foram coletadas em densidades que variam de 0,5 a 2,0 YU/ml. Na legenda da Figura 2, a densidade quando as culturas foram coletadas está listada como o número após o símbolo das linhas, por exemplo, controle - 0,6 significa células desenvolvidas em meio não tamponado em pH 5,5, e depois coletadas quando as células alcançaram uma densidade de 0,6 YU/ml. As condições para os frascos 1-3 (por exemplo, 1-0,5, 2-2,0 ou 3-1,0) estão listadas abaixo da figura, e a densidade celular na coleta está marcada na legenda. O protocolo do ensaio de lise usado foi o seguinte: (1) re-suspender 10 YU de células lavadas em 1 ml de Tris-BME; (2) retirar uma amostra do

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32/39 “Tempo 0” e medir a OD a 600 nm; (3) adicionar 20 U de glucanase; (4) girar a 30°C; (5) a cada 10 minutos, retirar uma amostra e medir a OD.

Como pode ser observado na Figura 2, a cultura de 5 controle (pH do meio - 5,5) mostra lise menos eficiente à medida que a densidade celular aumenta. O Frasco 2 mostra o efeito do meio em pH 7,2 sem tampão. O Frasco 2 mostra o efeito do meio em pH 7,2 com tampão de Bis-Tris. O Frasco 3 mostra o efeito do meio em pH 7,2 com tampão de fosfato.

Dessa forma, os resultados indicam que o crescimento de leveduras tamponadas em cerca de pH 5,5 ou mais mantém a parede celular flexível e sensível à digestão com enzimas de digestão da parede celular (por exemplo, que formam esferoplastos com liticase/glucanase) em todas as densidades de coleta. Em contraste, com o processo-padrão comumente usado em muitos laboratórios de leveduras, a sensibilidade era perdida em densidades de coleta >0,5 YU/ml. Para facilitar a comparação, 0,5 YU/ml com meio de crescimento padronizado é freqüentemente usado para comparação com crescimento em pH neutro em qualquer densidade.

Exemplo 4 - Construção de células 75-15

Foi projetada uma proteína de fusão denominada TK75-15 para expressar a proteína de HA proteína de influenza na parede celular com a utilização da seqüência Aga2, conduzida pelo promotor TEF2. Nessa construção, a proteína foi construída com a seqüência de HA do terminal seqüência em relação à seqüência Aga2. Essa proteína, quando expressa em células que também expressam Aga1p (nesse caso, conduzidas pelo promotor CUP1), se localiza na parede

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33/39 celular externa da célula de leveduras, assim como no citosol. A proteína de fusão que compreende o antígeno de HA de influenza é um polipeptídeo simples com os seguintes elementos de seqüência fundidos in frame do terminal N para o terminal C (a seqüência de aminoácidos da proteína de fusão sendo aqui representada pelo ID. DE SEQ. N°: 1): 1) a seqüência de proteína de comprimento total de S. cerevisiae Aga2 (posições 1 a 87 do ID. DE SEQ. N°: 1), incluindo sua seqüência sinalizadora natural dirigida ao ER de 18 aminoácidos (posições 1 a 18 do ID. DE SEQ. N°: 1; 2), um espaçador para separar a Aga2 do corpo da HA (posições 88 e 89); 3) proteína de HA de influenza desprovida de sua seqüência sinalizadora (posições 90 a 600 od ID. DE SEQ. N°: 1), e desprovida de 36 resíduos do terminal C de HA eliminando, dessa forma, sua âncora de membrana do terminal C e sua cauda citoplasmática; 4) um espaçador de triglicina para separar o corpo da proteína de HA do tag de histidina (posições 601-603 do ID. DE SEQ. N°: 1); e 5) um tag de hexahistidina no terminal C (posições 604-609 do ID. DE

SEQ. N°: 1). Uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica a proteína de fusão do ID. DE SEQ. N°: 1 é aqui representada pelo ID. DE SEQ. N°: 2. Essa proteína de fusão e o Tarmogen que a expressa podem ser denominados 75-15.

A seqüência de proteína usada é a seguinte (ID. DE

SEQ. N°: 1):

MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGK 50

AMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFTSDTICIGYHANN 100

STDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWL 150

LGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSF 200

ERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLK 250

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NSYVNKKGKEVLVLWGIUMPSNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTP 300

EIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFG 350

SGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGERPKYVRSAKL 400

RMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYA 450

ADQKSTQNAINGITNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVD 500

DGFLDIVVTYNAELLVLLENERTLDFHDSNMKNLYEKVKSQLKNNAKEIGN 550

GCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQ 600

GGGHHHHHH*

A seqüência de ácidos nucléicos correspondente é a seguinte (ID. DE SEQ. N°: 2):

ATGCAGTTAC TTCGCTGTTT TTCAATATTT TCTGTTATTG CTTCAGTTTT

AGCACAGGAA CTGACAACTA TATGCGAGCA AATCCCCTCA CCAACTTTAG

	101	AATCGACGCC
	151	GCAATGCAAG
15	201	TTGCGGTTCT
	251	AGTATGTTTT
	301	TCAACCGACA
	351	CTCTGTTAAC
	401	AAGGAATAGC
20	451	TTGGGGAATC
	501	CATTGTAGAA
	551	TCATCGACTA
	601	GAAAGATTCG
	651	AAACGGAGTA
25	701	GAAATTTGCT
	751	AATTCTTATG
	801	TCATCACCCG
	851	ATGCTTATGT
	901	GAAATAGCAG
30	951	TTACTGGACC

GTACTCTTTG TCAACGACTA

GAGTTTTTGA ATATTACAAA

CACCCCTCAA CAACTAGCAA

TACTAGTGAC ACAATATGTA

CTGTTGACAC AGTACTCGAG

CTGCTCGAAG ACAGCCACAA

CCCACTACAA TTGGGGAAAT

CAGAATGCGA CCCACTGCTT

ACACCAAACT CTGAGAATGG

TGAGGAGCTG AGGGAGCAAT

AAATATTTCC CAAAGAAAGC

ACGGCAGCAT GCTCCCATGA

ATGGCTGACG GAGAAGGAGG

TGAACAAAAA AGGGAAAGAA

TCTAACAGTA AGGAACAACA

CTCTGTAGTG ACTTCAAATT

AAAGACCCAA AGTAAGAGAT

TTGCTAAAAC CCGGAGACAC

CTATTTTGGC	CAACGGGAAG
TCAGTAACGT	TTGTCAGTAA
AGGCAGCCCC	ATAAACACAC
TAGGCTACCA	TGCGAACAAT
AAGAATGTGA	CAGTGACACA
CGGAAAACTA	TGTAGATTAA
GTAACATCGC	CGGATGGCTC
CCAGTGAGAT	CATGGTCCTA
AATATGTTAT	CCAGGAGATT
TGAGCTCAGT	GTCATCATTC
TCATGGCCCA	ACCACAACAC
GGGGAAAAGC	AGTTTTTACA
GCTCATACCC	AAAGCTGAAA
GTCCTTGTAC	TGTGGGGTAT
GAATCTCTAT	CAGAATGAAA
ATAACAGGAG	ATTTACCCCG
CAAGCTGGGA	GGATGAACTA
AATAATATTT	GAGGCAAATG

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	1001	GAAATCTAAT	AGCACCAATG	TATGCTTTCG	CACTGAGTAG	AGGCTTTGGG
	1051	TCCGGCATCA	TCACCTCAAA	CGCATCAATG	CATGAGTGTA	ACACGAAGTG
	1101	TCAAACACCC	CTGGGAGCTA	TAAACAGCAG	TCTCCCTTAC	CAGAATATAC
	1151	ACCCAGTCAC	AATAGGAGAG	CGCCCAAAAT	ACGTCAGGAG	TGCCAAATTG
5	1201	AGGATGGTTA	CAGGACTAAG	GAACATTCCG	TCCATTCAAT	CCAGAGGTCT
	1251	ATTTGGAGCC	ATTGCCGGTT	TTATTGAAGG	GGGATGGACT	GGAATGATAG
	1301	ATGGATGGTA	TGGTTATCAT	CATCAGAATG	AACAGGGATC	AGGCTATGCA
	1351	GCGGATCAAA	AAAGCACACA	AAATGCCATT	AACGGGATTA	CAAACAAGGT
	1401	GAACACTGTT	ATCGAGAAAA	TGAACATTCA	ATTCACAGCT	GTGGGTAAAG
10	1451	AATTCAACAA	ATTAGAAAAA	AGGATGGAAA	ATTTAAATAA	AAAAGTTGAT
	1501	GATGGATTTC	TGGACATTTG	GACATATAAT	GCAGAATTGT	TAGTTCTACT
	1551	GGAAAATGAA	AGGACTCTGG	ACTTCCATGA	CTCAAATATG	AAGAATCTGT
	1601	ATGAGAAAGT	AAAAAGCCAA	TTAAAGAATA	ATGCCAAAGA	AATCGGAAAT
	1651	GGATGTTTTG	AGTTCTACCA	CAAGTGTGAC	AATGAATGCA	TGGAAAGTGT
15	1701	AAGAAATGGG	ACTTATGATT	ATCCCAAATA	TTCAGAAGAG	TCAAAGTTGA
	1751	ACAGGGAAAA	GGTAGATGGA	GTGAAATTGG	AATCAATGGG	GATCTATCAG
	1801	GGTGGCGGGC	ATCACCATCA	CCATCACTAG	TGA

Exemplo 5 - O efeito de diferentes tampões (meio de pH 6,5) sobre o crescimento de células 75-15 e o pH da cultura

Diferentes agentes de tamponamento foram testados sobre células 75-15 para determinar seus efeitos sobre o crescimento celular e também o efeito sobre o pH da cultura. Esses tampões são mostrados na Figura 3, e incluíram succinato, citrato e carbonato. Nenhum dos tampões causou a formação de precipitados. Todos os tampões usados se dissolveram bem no meio de crescimento padronizado. O pH de todas as culturas de teste foi ajustado até o pH 6,5, antes da inoculação com levedura. As culturas foram então desenvolvidas em frascos em agitação a

30°C por até 15 horas. Foi observado um crescimento mínimo

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36/39 ou ausência de crescimento quando as células cresceram em tampão de carbonato. Como pode ser observado na Figura 3, o uso de diferentes agentes de tamponamento afetou as taxas de crescimento. O crescimento foi mais rápido em pH neutro (pH de pelo menos 5,5). Em particular, o meio com tampão de succinato obteve o melhor desempenho em termos de tempo de duplicação (tempo de duplicação de aproximadamente 2,5 horas). Em contraste, caso as células de leveduras crescessem em pH menor do que 5,5 (condições mais ácidas), o tempo de duplicação era mais lento, de aproximadamente

3,5 horas. O citrato teve tempo de duplicação similar (aproximadamente 3,5 horas). Citrato a 0,05 M teve a maior capacidade de tamponamento do que succinato a 0,02 M. Nesses experimentos, todas as culturas receberam 0,35 mM de cobre para indução de expressão.

Exemplo 6 - Efeito de vários agentes de tamponamento sobre a lise celular

A Figura 4 mostra os resultados de experimentos realizados com diferentes agentes de tamponamento como, por exemplo, succinato e citrato. As culturas cresceram da forma descrita no Exemplo 1. A habilidade das leveduras para serem lisadas por glucanase foi medida com o uso do protocolo de ensaio de lise acima. As leveduras na cultura de controle (pH do meio de aproximadamente 5,2) mostraram lise menos eficiente por glucanase à medida que a densidade celular aumentava (densidades celulares indicadas pelo número após o hífen, como descrito acima para a Figura 2). No entanto, tanto para o meio tamponado com succinato quanto para o meio tamponado com citrato, a densidade celular no momento da coleta não teve nenhum efeito sobre a

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37/39 habilidade das leveduras para serem lisadas por enzimas digestivas da parede celular no ensaio de lise descrito acima. As leveduras no meio tamponado com succinato e citrato permaneceram suscetíveis à lise em densidades celulares crescentes (por exemplo, 0,5 YU/ml, 0,9 YU/ml e 2,1 ou 2,2 YU/ml).

Exemplo 7 - Estudo de formulação do meio

A contribuição de outros agentes adicionados ao meio de cultura de leveduras foi testada, e os resultados são mostrados na Figura 5. U2 ou U4 refere-se à composição básica do meio. Na medida em que a expressão de proteína está sob controle do promotor indutível por cobre CUP1, 0,35 mM de cobre é adicionado ao meio para que as células de leveduras sejam induzidas a expressar a proteína de HA.

Soytone (Soja na Figura 5) é uma mistura complexa de nutrientes disponível comercialmente derivada por digestão péptica de grãos de soja. A adição de soytone gerou um crescimento mais rápido e o maior rendimento (30 YU/ml). O uso de 0,08 M de ácido succínico mostrou uma melhor capacidade de tamponamento. As células cresceram a 30°C pelos tempos indicados no eixo x.

A Figura 6 mostra os resultados para o estudo de formulação de meio que usou Tecnologias Guava para determinação da viabilidade celular. A cepa de levedura 7525 15 que expressa Aga2-HA indutível por cobre cresceu a 30°C em frascos em agitação. Quando o cobre é adicionado à cultura, a proteína Aga2-HA é expressa e se apresenta na superfície celular, o que representa o número de células de leveduras que mostram HA na superfície (sinal positivo %) .

A viabilidade celular também pode ser determinada com a

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38/39 utilização de outros métodos (por exemplo, hemocitômetro ou azul Tripano) . O maior sinal foi observado com U2, até mesmo em uma densidade celular de 8 YU/ml, que é bem mais

	do que	a densidade celular	na	qual	as	células	tendem	a
5	reduzir	a velocidade de	sua	taxa	de	crescimento.	As
	culturas	que usam soytone	mostraram	um	efeito	nítido	de

densidade celular, com densidades elevadas mostrando um declínio na proteína. O uso de U4 gerou, no geral, um sinal baixo. Esses resultados também demonstram a acessibilidade da detecção por causa dos efeitos que o pH possui sobre a parede celular e sobre a habilidade de anticorpos

específicos	para HA	para detectar	a proteína	expressa	na
superfície.
Foram	feitos	experimentos	adicionais	usando	uma
15 concentração	diferente de soytone.	A Figura 7	ilustra	os

resultados. Não foram observadas diferenças no crescimento ou pH entre 0,5 g/l e 1 g/l de soytone. Um crescimento mais rápido foi observado em meio U4-YNB do que em meio U2.

Exemplo 8 - Diferença de acessibilidade à HA quando as leveduras crescem em condições de pH neutro

A acessibilidade de antígenos específicos às interações por outros agentes, por exemplo, um anticorpo para detecção, foi avaliada utilizando-se níveis variáveis de pH do meio. A Figura 8 mostra um ensaio imunoblot de hemaglutinina (HA) de influenza liberada por leveduras intactas quando as células de leveduras cresceram em um pH menor do que 5 e também quando as leveduras cresceram em um pH maior do que 6. O crescimento das leveduras em pH neutro torna a HA exibida na superfície bem mais acessível à detecção de anticorpo, como determinado por coloração por

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39/39 citometria de fluxo, tanto em número de células que expressam HA quanto pela quantidade de HA por célula. Além disso, as leveduras que cresceram em pH neutro foram mais fáceis de serem manipuladas para a liberação da HA ligada por dissulfeto por tratamento com ditiotreitol (agente redutor de dissulfeto).

Exemplo 9 - O efeito do pH neutro sobre a produção de citocina

O efeito do cultivo de leveduras em pH neutro sobre a produção de citocina foi examinado com o uso de células dendríticas (DC) carregadas com leveduras YVEC (que não expressam um antígeno heterólogo) desenvolvidas em meio onde o pH era ou não mantido acima de 5,5. Células dendríticas de camundongo derivadas da medula óssea foram carregadas com 10 leveduras por DC por incubação em conjunto em meio RPMI por 48 horas a 37°C. Os sobrenadantes foram então analisados quanto às citocinas secretadas. A Figura 9 mostra os resultados desses experimentos. O painel inferior mostra que há um aumento acentuado da secreção de

IFN-gama por células dendríticas carregadas com as leveduras desenvolvidas em um pH neutro (ou seja, pelo menos 5,5 ou mais) que está ausente quando as leveduras são desenvolvidas em meio onde se deixou que o pH caísse abaixo de 5,5.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada por compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz das leveduras derivadas da Saccharomyces, em que as leveduras expressam um antígeno

5 heterólogo, as quais foram cultivadas em um meio, em que o meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8, de forma que o pH do meio não é deixado cair abaixo de pH 5,5.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que parede celular da levedura é

10 mais flexível e sensível à digestão com enzimas de digestão da parede celular do que uma levedura cultivada em um meio que o pH é deixado cair abaixo de 5,5.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a levedura induz mais

15 produção de interferon gama por células dendríticas do que levedura cultivada em um meio que o pH é deixado cair abaixo de 5,5.
4. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o meio é tamponado com

20 succinato ou ácido succínico.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o meio é mantido em um nível de pH entre 6 e 8.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das 25 reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
7. Método para o crescimento de leveduras, caracterizado por compreender:

a) cultivo das leveduras em um meio que é mantido em 30 um nível de pH entre 5,5 e 8;

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b) crescimento da levedura em um pH neutro por pelo menos (i) 80% ou (ii) 90% do tempo em que as leveduras estão em cultura;

c) manutenção do cultivo da levedura de modo que o pH 5 do meio não caia para um pH abaixo de 5,5; ou d) manutenção do cultivo da levedura de modo que o pH

do meio não caia para um pH abaixo de 5,5 por mais do que (i) 5 minutos, (ii) 10 minutos, (iii) 20 minutos, (iv) 30 minutos, (v) 40 minutos, (iv) 50 minutos, ou (vii) 60

10 minutos.
8. Método, caracterizado pelo de pH entre 6 e 8.
9. Método, caracterizado pelo antígeno heterólogo
10. Método, caracterizado pelo

de acordo com a reivindicação 7, fato de que o meio é mantido em um nível de acordo com a reivindicação 7, fato de que a levedura expressa um de acordo com a reivindicação 7,

fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

20
11. Uso de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser na fabricação de medicamento para induzir uma resposta imune em um indivíduo.
12. Uso de uma composição farmacêutica como definida

25 em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser na fabricação de medicamento para induzir uma resposta imune do tipo Th1 em um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio que se beneficiaria de uma resposta imune do tipo Th1 intensificada.

30
13. Kit para o cultivo de leveduras caracterizado por

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3/3 compreender um meio, em que o pH do meio é mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8 e instruções para o uso do meio para o cultivo de leveduras.
14. Kit, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o meio é tamponado com succinato ou ácido succínico.
15. Kit, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o meio adicionalmente contém soytone.
16. Kit, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o kit adicionalmente inclui leveduras.
17. Kit, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a levedura é congelada ou liofilizada.

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