PT2121013E - Métodos para produção de vacinas à base de leveduras - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
"Métodos para produção de vacinas à base de leveduras" CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos de crescimento de culturas de levedura a um pH neutro para melhorar os rendimentos e certas caracteristicas de culturas de levedura. 0 método também se refere a composições produzidas por estes métodos.
ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO
As vacinas são uma das medidas mais rentáveis disponíveis para a indústria de cuidados de saúde. Permanece, contudo, uma necessidade urgente de desenvolvimento de vacinas seguras e eficazes, e adjuvantes, para uma variedade de doenças, incluindo as devidas a infecção por agentes patogénicos, cancros, defeitos genéticos e outras desordens do sistema imunitário. Publicações sobre vacinas, por exemplo, Rabinovich et ai., Science 265, 1401-1404 (1994), afirmam que existe ainda uma necessidade de vacinas seguras e estáveis ao calor que possam ser administradas oralmente e que apenas precisem de ser administradas poucas vezes, preferivelmente no início da vida. São também preferidas vacinas de combinação que possam proteger os indivíduos de mais do que uma doença, assim como vacinas que não requeiram um adjuvante e que possam eliciar imunidade mucosa. Até ao presente muito poucas vacinas, se alguma, cumprem todos estes critérios.
As vacinas de subunidade, cujo desenvolvimento foi tornado possível pela tecnologia do ADN recombinante, têm sido até agora decepcionantes pois exibem apenas imunogenicidade limitada. Um exemplo são os recentes testes clínicos de várias vacinas de subunidade para o HIV (vírus da imunodeficiência humana) que foram interrompidos devido não apenas a uma eficácia limitada das vacinas, mas também porque em alguns casos os indivíduos imunizados apresentaram progressão acelerada da doença quando foram subsequentemente expostos ao HIV; veja-se, por exemplo, Cohen, Science 264:1839(1994); e Cohen, Science 264: 660 (1994) . Uma desvantagem das vacinas de subunidade, assim como de vacinas de vírus morto e de vírus vivo recombinante, é que embora pareçam estimular uma forte resposta imunitária humoral, não conseguem eliciar imunidade celular protectora. Uma principal conclusão na conferência 1994 International AIDS Conference foi de que permanece uma necessidade de uma resposta mediada por células T citotóxicas para prevenir, ou reduzir, a infecciosidade do HIV, que até agora falta em vacinas na clinica. Em adição, as vacinas para o HIV testadas até hoje falharam em eliciar imunidade nas superficies mucosas onde ocorre principalmente a infecção pelo HIV.
Adicionalmente, os únicos adjuvantes aprovados para utilização nos Estados Unidos são os sais de alumínio hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, sendo que nenhum deles estimula a imunidade mediada por células. Em adição, as formulações de sais de alumínio não podem ser congeladas nem liofilizadas, e estes adjuvantes não são eficazes com todos os antigénios. Células de levedura foram utilizadas na produção de vacinas de proteínas de subunidade (US2006104986) , incluindo algumas das testadas nos supramencionados ensaios de vacinas para o HIV. A levedura foi também alimentada a animais antes da imunização para tentar sensibilizar a resposta imunitária de uma maneira não específica (i.e., para estimular a fagocitose assim como a produção de complemento e interferão). Os resultados foram ambíguos, e aqueles protocolos não geraram imunidade celular protectora; veja-se, por exemplo, Fattal-German et al., Dev. Biol. Stand. 77: 115-120 (1992) e Bizzini et al., FEMS-Microbiol. Immunol. 2: 155-167 (1990).
Para além das vacinas, muitas terapias com genes e fármacos requerem veículos de entrega eficientes e específicos para assegurar o maior benefício possível. A falta de um veículo de entrega adequado é um importante travão na aplicação de terapia génica e limita significativamente o potencial terapêutico de muitos fármacos. Por exemplo, relatórios recentes indicaram que vectores de adenovirus, que estão presentemente a ser testados na clínica para aplicações em terapia génica, estão a estimular respostas inflamatórias e imunitárias indesejáveis e não parecem estar a ser integrados da maneira desejada; veja-se, por exemplo, Engelhardt et al., Human Gene Therapy 5: 1217-1229 (1994) e referências aí citadas.
Outro grande obstáculo para a tecnologia das vacinas de levedura é o processo de fabrico. As células de levedura foram cultivadas nos laboratórios durante muitos anos e foram estabelecidas condições de cultura padrão. Veja-se, por exemplo, Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990). Os protocolos padrão de operação envolvem geralmente a cultura da levedura em meios que são ácidos, como medido pelos níveis de pH. Contudo, a cultura de levedura em meio ácido pode resultar na exibição pela levedura de diferentes propriedades biológicas que não são óptimas para utilização das leveduras como veículos portadores de antigénios para fins de imunomodulação ou produção de vacinas. Assim, existe uma necessidade de métodos para o crescimento de leveduras tais que a levedura exiba propriedades que as tornem mais bem adequadas para serem veículos portadores de antigénios. A invenção aqui divulgada baseia-se, em parte, na verificação de que embora as leveduras possam crescer em meios ácidos, as propriedades biológicas que as leveduras exibem quando crescem em meios ácidos não são tão desejáveis como quando as leveduras crescem em meios que têm níveis de pH neutro.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção, é proporcionada uma composição compreendendo uma levedura Saccharomyces, em que a levedura expressa um antigénio heterólogo, e em que a levedura foi cultivada num meio que é mantido a um nível de pH entre 5,5 e 8, de modo a que o pH do meio não caia abaixo de pH 5,5, para utilização num método para eliciar uma resposta imunitária num indivíduo, como profiláctico ou terapêutico para uma doença ou uma enfermidade. A invenção também proporciona um método de crescimento de uma levedura Saccharomyces compreendendo: (a) a cultura da levedura num meio que é mantido a um nível de pH entre 5,5 e 8, em que a levedura é cultivada de modo a que o pH do meio não caia abaixo de pH 5,5, em que a levedura é cultivada durante pelo menos três horas ou mais a um nível de pH entre 5,5 e 8, em que a levedura expressa um antigénio heterólogo; e (b) a formulação de uma composição compreendendo a referida levedura e um excipiente e/ou um transportador farmaceuticamente aceitáveis.
Descrevemos também um método para o crescimento de leveduras por cultura da levedura em meio em que o meio é mantido a um nível de pH entre 5,5 e 8 e em que a densidade da levedura é de pelo menos 0,5 unidade de levedura /mL.
Num aspecto da invenção, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em aspectos da invenção o meio é tamponado com succinato ou ácido succínico ou o meio pode adicionalmente conter Soytone. Em alguns casos, o antigénio heterólogo é expresso sobre a superfície da levedura.
Em alguns aspectos, o antigénio heterólogo é mais prontamente acessível para interacção com outras células ou agentes do que quando a levedura é crescida a um pH inferior a 5,5 . A composição pode ser proporcionada para utilização num método de indução de uma resposta do tipo Thl num indivíduo. Num aspecto, a resposta do tipo Thl é a produção de interferão-gama. Noutro aspecto, a resposta do tipo Thl é a produção de IL-12.
DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS A Figura 1 representa os efeitos dos níveis de pH do meio sobre o crescimento celular e também sobre os níveis de pH da cultura. A Figura 2 representa o efeito dos níveis de pH do meio sobre a espessura da parede celular. A Figura 3 representa os resultados de testes de diferentes tampões a um pH de cerca de 6,5. São mostrados os efeitos sobre o crescimento de células 75-15 e o pH da cultura. A Figura 4 representa o efeito de vários agentes tamponantes sobre a espessura da parede celular, como medida pela lise por glucanase. O meio de cultura foi tamponado utilizando succinato ou citrato para tamponar o meio de cultura a um nível de pH de cerca de 6,5. A Figura 5 representa os resultados de um estudo de formulação do meio em que foram testados vários aditivos quanto ao seu efeito sobre o crescimento e os niveis de pH. A Figura 6 representa os resultados de viabilidade celular da levedura como parte de um estudo de formulação do meio. A expressão na superfície de HA sobre a superfície celular da levedura foi medida utilizando citometria de fluxo. A Figura 7 representa os resultados de um estudo de formulação do meio sobre o crescimento celular e os perfis de pH em que foram testados vários aditivos. A Figura 8 representa os resultados de um ensaio Immunoblot de hemaglutinina (HA) libertável por levedura intacta que mostra a diferença na acessibilidade à HA quando a levedura é crescida em condições de pH neutro versus quando a levedura é crescida em condições de pH mais baixo. 0 Immunoblot é um Western blot de elutato de DTT de YEX e GI-8103. A Figura 9 representa o efeito da cultura de células de levedura a níveis de pH neutro e pH baixo sobre a secreção de citóquinas por células dendríticas que foram carregadas com células de levedura.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção aqui divulgada baseia-se na verificação de que o crescimento de levedura a um pH neutro, pelo menos pH 5,5, ou entre pH 5,5 e 8, ou entre pH 6 e 8, resulta numa levedura com características biológicas mais desejáveis. Algumas destas características desejáveis, que são detalhadas infra, incluem mas não se lhes limitando, a capacidade de crescer bem a densidade celular aumentada, mantendo a parede celular da levedura maleável e sensível a digestão por enzimas que digerem a parede celular, e exibir antigénios de uma maneira que os torna mais acessíveis a outras células e/ou agentes. Técnicas Gerais
Na prática da presente invenção serão empregues, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica, química do ácido nucleico e imunologia, que são bem conhecidas dos peritos na especialidade. Estas técnicas estão completamente explicadas na literatura, tal como em Method of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al. , eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook e Russell, 2001), (conjuntamente referidos aqui como "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluindo suplementos até 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (conjuntamente aqui referidos como "Harlow e Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000) e Vaccines, S. Plotkin e W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999) .
Definições
Como aqui se utiliza, o uso geral do termo "pH neutro" refere-se a urn nivel de pH de pelo menos 5,5. A gama de pH neutro pode ser entre cerca de pH 5,5 e cerca de pH 8, preferivelmente entre cerca de pH 6 e cerca de 8. Um perito na especialidade notará que podem ocorrer pequenas flutuações (e.g., dezenas ou centenas) quando se mede com um medidor de pH e, como tal, deverá ter isso em conta quando determina o nivel de pH num determinado momento.
Como aqui se utiliza, o uso geral do termo "antigénio" refere-se a qualquer molécula que possa ser reconhecida pelo sistema imunitário adaptativo. Num aspecto, um antigénio é uma molécula que se liga especificamente a um anticorpo. A molécula pode ser qualquer porção de uma proteína (péptido, proteína parcial, proteína de comprimento completo) em que a proteína é de ocorrência natural ou derivada sinteticamente, ou parte de uma composição celular (célula completa, lisado celular ou células rompidas), parte de um organismo (organismo completo, lisado ou células rompidas) ou um hidrato de carbono ou uma sua porção. 0 antigénio pode eliciar uma resposta imunitária humoral específica do antigénio por si próprio ou com a utilização de outro composto tal como um adjuvante (como células de levedura moídas). Noutro aspecto, um antigénio é reconhecido por linfócitos T (ou células T) no contexto de complexos principais de histocompatibilidade (MHC). Noutro aspecto, o antigénio pode actuar como toleragénio, contra o mesmo antigénio ou antigénios similares que se encontram no interior das células e tecidos do animal ao qual o antigénio é administrado.
Num aspecto da presente invenção, quando se refere a estimulação de uma resposta imunitária, o "antigénio" pode ser um "imunogénio". Os imunogénios são moléculas que podem eliciar uma resposta imunitária adaptativa, e.g., indução de produção de anticorpos. 0 imunogénio pode, em alguns casos, gerar células de memória que irão produzir anticorpos que reconhecem o antigénio por exposição futura ao antigénio. Como é bem conhecido de todos os peritos na especialidade nesta área, os imunogénios podem também ser reconhecidos por linfócitos T, embora a forma do imunogénio reconhecida por linfócitos T vá ser diferente da forma do imunogénio que o anticorpo reconhece. Métodos de Cultura de Leveduras A invenção proporciona métodos para a cultura de leveduras que produzem características desejáveis, tais como elevada expressão de um antigénio desejado, maleabilidade da parede celular e exibição do antigénio.
Estes métodos são amplamente aplicáveis a leveduras Saccharomyces. As leveduras são microorganismos unicelulares que pertencem a uma de três classes: Ascomycetes, Basidiomycetes e Fungi Imperfecti. Utilizam-se estirpes de leveduras Saccharomyces não patogénicas. Em ainda outros aspectos, utilizam-se Saccharomyces cerevisiae ou
Saccharomyces carlsbergensis. Entenda-se que a invenção não está limitada às espécies listadas acima e que um perito na especialidade pode aplicar os presentes ensinamentos a qualquer tipo de levedura. Noutro aspecto, utiliza-se a Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) na prática dos métodos da invenção. A S. cerevisiae é preferida devido à sua fácil manipulação molecular e por ser geralmente reconhecida como segura (em inglês "Generally Recognized As Safe" ou "GRAS") para utilização como aditivo alimentar (GRAS, FDA proposed Rule 62FR18938, Apr. 17, 1997) . 0 nivel de pH é importante na cultura da levedura. Um perito na especialidade notará que o processo de cultura inclui não apenas o inicio da cultura da levedura mas também a manutenção da cultura. A cultura da levedura pode ser iniciada a qualquer nivel de pH, contudo, como o meio de uma cultura de levedura tende a tornar-se mais ácido (i.e., diminui o pH) ao longo do tempo, tem que haver o cuidado de monitorizar o nivel de pH durante o processo de cultura. A levedura é crescida num meio a um nivel de pH entre 5,5 e 8. Em outros aspectos, a levedura é crescida a um nivel de pH de cerca de 5,5. Em outros aspectos, a levedura é crescida a um nivel de pH entre 6 e 8. Em alguns casos, a cultura da levedura é mantida a um nivel de pH entre 6 e 8. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida a um nivel de pH entre 6,1 e 8,1. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida a um nivel de pH entre 6,2 e 8,2. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida a um nivel de pH entre 6,3 e 8,3. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida a um nivel de pH entre 6,4 e 8,4. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida a um nivel de pH entre 5,5 e 8,5. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida a um nivel de pH entre 6,5 e 8,5. Em outros aspectos, a levedura é crescida a um nivel de pH cerca de 5,6, 5,7, 5,8 ou 5,9. Noutro aspecto, a levedura é crescida a um nivel de pH de cerca de 6. Noutro aspecto, a levedura é crescida a um nivel de pH de cerca de 6,5. Em outros aspectos, a levedura é crescida a um nivel de pH de cerca de 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 ou 7,0. Em outros aspectos, a levedura é crescida a um nivel de pH de cerca de 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8,0. Em outros aspectos, a levedura é crescida a um nível acima de 8 .
Num aspecto, a levedura é cultivada de modo a que o nível de pH do meio não caia abaixo de pH 5,5.
Noutro aspecto, o crescimento da levedura a pH neutro inclui a cultura das células de levedura durante pelo menos 3 horas ou mais.
Como feito notar acima, à medida que a levedura cresce e replica, as densidades celulares tornam-se maiores e o nível de acidez no meio de cultura aumenta. Como tal, recomenda-se que a levedura seja cultivada a um nível de pH de pelo menos 5,5 e/ou mantida a pelo menos pH 5,5 à medida que a densidade da levedura aumenta. Num aspecto, a levedura é crescida e/ou mantida entre um pH de 5,5 e 8 quando a densidade da levedura é de 0,5 unidades de levedura (YU)/ml ou mais. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida entre um pH de 5,5 e 8 quando a densidade da levedura é de pelo menos 0,6 YU/ml ou mais, preferivelmente 0,7 YU/ml ou mais, 0,8 YU/ml ou mais, 0,9 YU/ml ou mais, ou 1 YU/ml ou mais. Noutro aspecto, a levedura é crescida e/ou mantida entre um pH de 6 e 8 quando a densidade da levedura é de 0,5 YU/ml ou mais. Em outros aspectos, a levedura é crescida e/ou mantida entre um pH de 6 e 8 quando a densidade da levedura é de pelo menos 0,6 YU/ml ou mais, preferivelmente 0,7 YU/ml ou mais, 0,8 YU/ml ou mais, 0,9 YU/ml ou mais, ou 1 YU/ml ou mais.
Em alguns aspectos, é preferível no momento da colheita que a cultura da levedura esteja a um nível de pH neutro. Em alguns casos, a cultura da levedura, no momento da colheita, estará a um nível de pH entre 6 e 8. Em outros casos, a cultura da levedura, no momento da colheita, estará a um nível de pH entre 5,5 e 8. O meio de cultura pode ser levado a um nível de pH de pelo menos 5,5 por qualquer meio. Num aspecto, utiliza-se ácido succínico (e quaisquer formas relacionadas, e.g., o anião succinato) para tamponar o meio de cultura. Como adicionalmente detalhado nos Exemplos, a utilização de succinato para tamponar o meio de cultura a pelo menos pH 5,5 permite que a levedura tenha um tempo de duplicação de cerca de duas horas a duas horas e meia. 0 succinato está disponível de fontes comercialmente disponíveis (e.g., Sigma Chemicals). Em outros aspectos, o citrato pode ser utilizado para levar o meio a um pH de pelo menos 5,5. Um perito na especialidade será capaz de prontamente determinar outros agentes tamponantes que podem ser utilizados para levar o meio a um pH de pelo menos 5,5 enquanto mantendo a levedura viável. 0 conceito de agentes tamponantes para manter uma solução a um nível de pH estável é bem conhecido na técnica e como tal, não será discutido aqui em detalhe. Se o crescimento de leveduras de acordo com a invenção for utilizado para formulações farmacêuticas (e.g., vacinas), recomenda-se que se utilize material de qualidade para GMP.
Em adição, podem ser adicionados outros suplementos ao meio de cultura para melhorar o meio. Outros suplementos que são particularmente úteis para adicionar ao meio de cultura incluem Soytone. 0 Soytone está prontamente disponível de fontes comerciais (e.g., BD Difco). Como mostrado nos Exemplos e nas figuras, a adição de Soytone ao meio de cultura suporta maior densidade para crescimento a pH neutro. Adicionalmente, a adição de Soytone suporta a expressão de um antigénio de interesse, hemaglutinina (HA) do vírus influenza.
Podem ser adicionados outros aditivos à cultura da levedura para outros fins, tais como indução de expressão de genes heterólogos. Em alguns aspectos, utiliza-se cobre para induzir a expressão de hemaglutinina. Contudo, a utilização de cobre não é ideal a pH neutro. Assim, para controlo de genes indutíveis para serem expressos em levedura crescida a pH neutro recomenda-se um aditivo que não cobre.
Efeitos de pH neutro sobre a cultura da levedura A utilização de um pH neutro na cultura de levedura promove vários efeitos biológicos que são características desejáveis para utilização da levedura como veículo para imunomodulação e/ou eliciação de respostas imunitárias. Num aspecto, a cultura da levedura em pH neutro permite um bom crescimento da levedura sem qualquer efeito negativo sobre o tempo de duplicação (e.g., retardamento do tempo de duplicação). A levedura pode continuar a crescer até densidades elevadas sem perder a maleabilidade da sua parede celular.
Noutro aspecto, a utilização de um pH neutro, tal como um pH de pelo menos 5,5 ou entre pH 5,5 e 8, permite a produção de leveduras com paredes celulares maleáveis e/ou leveduras que possuem sensibilidade a enzimas que digerem a parede celular (e.g., glucanase) em todas as densidades de colheita. Como tal, a invenção proporciona métodos e composições de levedura com maleabilidade de parede celular como medido por ensaios tradicionais (e.g., sensibilidade a glucanase). Experiências anteriores estabeleceram que a levedura perde a sua sensibilidade à digestão por enzimas que digerem a parede celular a densidades de colheita de cerca de 0,5 YU (unidades de levedura)/ml. Como tal, uma vantagem é que comparações feitas com leveduras cultivadas em meios de crescimento padrão a 0,5 YU/ml podem ser utilizadas para comparação com crescimento a pH neutro a qualquer densidade. Esta caracteristica é desejável porque leveduras com paredes celulares flexíveis podem exibir respostas imunitárias únicas, tais como promoção da secreção de citóquinas (e.g., INF-gama) nas células que alojam a levedura. Outra razão porque um perito na especialidade utilizaria a metodologia do pH neutro é que esta permite maior acessibilidade aos antigénios localizados na parede celular. Isto é útil para uma maior imunogenicidade e também para a detecção de anticorpos de proteína expressa, medida por técnicas-padrão tais como citometria de fluxo.
Ainda outra caracteristica desejável que é observada na levedura cultivada a pH neutro é a expressão de antigénios de uma maneira que é benéfica para fins de imunomodulação. Num aspecto, as leveduras são utilizadas como veículos para a expressão do antigénio (vejam-se, por exemplo, as Patentes U.S. 5,830,463 e 7,083,787). O antigénio pode ser um antigénio nativo da levedura ou, alternativamente, um antigénio heterólogo que é expresso pela levedura. Em alguns aspectos, a utilização de levedura para expressão de antigénios é útil para o desenvolvimento de vacinas, profilácticos, e terapêuticos para combater várias doenças e enfermidades (e.g., doenças infecciosas ou cancro). Utilizando a metodologia do pH neutro, um perito na especialidade pode produzir levedura portadora de antigénio em que o antigénio está mais acessível a outras células (e.g., para funções co-estimulantes imunitárias ou regulação imunitária) ou a outros agentes (e.g., anticorpos para detecção) . Em adição, a utilização de pH neutro para alguns antigénios, tais como o antigénio HA de influenza, permite a libertação da HA ligada por dissulfureto por tratamento com ditiotreitol (DTT) que não é possível quando a levedura que expressa HA é cultivada em meios onde o pH cai abaixo de pH 5. Em alguns casos, isto ocorre quando o pH cai abaixo de pH 5 durante qualquer período de tempo. Em outros casos, isto ocorre quando o pH cai abaixo de pH 5 durante um ou alguns minutos ou uma ou mais horas.
Outra característica desejável que a levedura cultivada seguindo a metodologia do pH neutro exibe é a secreção de citóquinas do tipo Thl por células que foram expostas à levedura. Os exemplos de citóquinas do tipo Thl incluem, mas não se lhes limitando, interferão-gama, IL-12 e IL-2. Como adicionalmente detalhado nos Exemplos, as células dendríticas que foram carregadas com levedura que tinha sido crescida seguindo os protocolos do pH neutro exibem níveis aumentados de secreção e expressão de interferão-gama em comparação com levedura crescida em meios de pH baixo (ácido) . Não houve redução nos níveis de secreção de IL-12 quando se utilizaram os métodos de cultura a pH neutro. Como tal, um perito na especialidade pode utilizar as metodologias do pH neutro aqui divulgadas para fins de imunomodulação, e.g., indução de uma resposta do tipo Thl num indivíduo que está afectado por uma doença ou desordem que iria beneficiar de uma resposta do tipo Thl melhorada.
Composições de levedura crescida utilizando a metodologia do pH neutro A invenção também contempla composições compreendendo leveduras que são crescidas utilizando as metodologias do pH neutro aqui divulgadas. Num aspecto, a composição compreende levedura que expressa antigénios nativos, sobre a sua superfície ou internamente, ou ambas. Esta composição pode ser útil para vários fins, tais como a administração como adjuvante. Noutro aspecto, a composição compreende levedura que expressa antigénios heterólogos, na sua superfície ou internamente, ou ambas. Esta composição pode ser útil para vários fins, tais como a imunomodulação num indivíduo disso necessitado e o desenvolvimento de vacinas.
Estas composições podem também incluir excipientes e/ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir soluções, suspensões e emulsões estéreis, aquosas ou não aquosas. Os exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os transportadores aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, de Ringer lactada ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos (tais como os baseados em dextrose de Ringer), e semelhantes. Podem também estar presentes conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. A formulação de composições compreendendo levedura crescida sob condições de pH neutro com um excipiente farmaceuticamente aceitável é geralmente rotineira para um perito na especialidade.
Os exemplos que se seguem são proporcionados para ilustrar certos aspectos da invenção. Não se pretendem limitantes da invenção de nenhuma maneira.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Formulações de Meios para Levedura Vários tipos de meios podem ser utilizados para cultivar levedura e ser ajustados de modo a que o nível de pH seja neutro. São dados adiante vários exemplos de meios que podem ser utilizados, contudo, deve entender-se que a invenção não está limitada à utilização destes componentes de meios ou protocolos de meios.
Uma receita de meio padrão é o meio ULDM que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio UL2 que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio UL3 que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio UL4 que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio UDM que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio U2 que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio U3 que é como se segue:
Outra receita de meio padrão é o meio U4 que é como se segue:
As formulações de meios padrão podem ser suplementadas com aminoácidos adicionais. Os protocolos seguintes são formulações de meios exemplificativas. A formulação de meios ULDMaa é como se segue:
A formulação de meios UL2aa é como se segue:
A formulação de meios UL3aa é como se segue:
A formulação de meios UDMaa é como se segue:
A formulação de meios U2aa é como se segue:
A formulação de meios U3aa é como se segue:
Noutro aspecto, utiliza-se meio tamponado contendo succinato. Apresentam-se adiante exemplos de meios para levedura contendo succinato. A formulação de meios UDMS, ajustados a pH 6,9 é como se segue:
A formulação de meios U2S, ajustada a pH 6,9 é como se segue:
A formulação de meios U3S, ajustada a pH 6,9 é como se segue:
A formulação de meios U4S, ajustada a pH 6,9 é como se segue:
Exemplo 2. Efeito do pH do meio sobre o crescimento celular e o pH da cultura
Testou-se o efeito do pH do meio sobre o crescimento celular e o pH da cultura, como mostrado na Figura 1. Cresceram-se as células em meios U2 suplementados com tampão Bis-Tris, pH 7,2 ou tampão de fosfato, pH 7,2. Cresceram-se culturas de controlo em meios U2 sem tampão adicionado ao meio. Para as condições marcadas como controlo (igual ao meio a pH 5,5) ou meio a pH 7,2, o meio de crescimento para estes controlos foi ajustado a pH 5,5 ou a pH 7,2 com base (NaOH) antes da inoculação com a levedura. Incubaram-se as culturas a 30 °C e monitorizaram-se quanto à contagem de células e ao pH da cultura durante até 16 horas. Os resultados indicam que os tampões a vários niveis de pH afectaram as taxas de crescimento da levedura. Como mostrado na Figura 1, os tempos de duplicação variaram de 2,8 a 4,5 horas. O pH no meio não tamponado de pH 7 foi -5,5 a 2,0 YU/mL, o que indica a necessidade de alguma forma de agente tamponante para manter o pH a um nivel neutro.
Exemplo 3. Efeito do pH do Meio sobre a Espessura da Parede Celular
Testou-se o efeito do pH do meio para determinar se tinha algum efeito sobre a espessura da parede celular. Os meios e as condições de crescimento foram os mesmos que no Exemplo 1. Colheram-se as culturas a densidades variando de 0,5 a 2,0 YU/mL. Na legenda da Figura 2, a densidade quando as culturas foram colhidas está enumerada como o número que se segue ao hifen, e.g. controlo-0,6 significa células crescidas em meio não tamponado a pH 5,5, e depois colhidas quando as células atingiram a densidade de 0,6 YU/mL. As condições para os balões 1-3 (e.g. 1-0,5, 2-2,0 ou 3-1,0) estão enumeradas por baixo da figura e a densidade celular na colheita está marcada na legenda. O protocolo do ensaio de lise utilizado foi como se segue: (1) ressuspender 10YU de células lavadas em 1 mL de Tris- BME; (2) retirar uma amostra de "Tempo 0" e medir a DO a 600 nm; (3) adicionar 20 U de glucanase; (4) manter em rotação a 30°C; (5) a cada 10 minutos, retirar uma amostra e medir a DO.
Como se pode observar na Figura 2, a cultura de controlo (meio de pH~5,5) apresenta lise menos eficiente à medida que a densidade celular aumenta. 0 balão 2 mostra o efeito de meio a pH 7,2 sem tampão. 0 balão 2 mostra o efeito de meio a pH 7,2 com tampão Bis-Tris. 0 balão 3 mostra o efeito de meio a pH 7,2 com tampão de fosfato.
Assim, os resultados indicam que o crescimento de levedura tamponado a cerca de pH 5,5 ou mais mantém a parede celular maleável e sensível a digestão com enzimas que digerem a parede celular (e.g., produzindo esferoplastos com liticase/glucanase) a todas as densidades de colheita. Pelo contrário, com o processo padrão vulgarmente utilizado em muito laboratórios para leveduras, a sensibilidade foi perdida para densidades de colheita >0,5 YU/mL. Para facilidade de comparação, 0,5 YU/mL com meio de crescimento padrão é frequentemente utilizado para comparação com crescimento a pH neutro a qualquer densidade.
Exemplo 4. Construção de células 75-15
Uma proteína de fusão denominada TK75-15 foi manipulada para expressar a proteína HA de influenza sobre a parede celular utilizando a sequência de Aga2, conduzida pelo promotor TEF2 . Nesta construção, a proteína foi construída com a sequência de HA em posição C-terminal relativamente à sequência de Aga2. Esta proteína, quando expressa em células que também expressam Agalp (neste caso, conduzida pelo promotor CUP1) , localiza-se na parede celular externa da célula de levedura, assim como no citosol. A proteína de fusão compreendendo o antigénio HA de influenza é um único polipéptido com os seguintes elementos de sequência fundidos em enquadramento, do terminal N para o C (estando a sequência de aminoácidos da proteína de fusão aqui representada pela SEQ ID NO:l) : 1) a sequência de comprimento completo da proteína Aga2 de S. cerevisiae (posições 1 a 87 de SEQ ID NO:l), incluindo a sua sequência de sinal de direccionamento para o ER natural de 18 aminoácido (posições 1 a 18 de (SEQ ID NO:l; 2) um espaçador para separar a Aga2 do corpo de HA (posições 88 e 89) ; 3) a proteína HA de influenza sem a sua sequência de sinal (posições 90 a 600 de SEQ ID NO:l), e sem 36 resíduos C-terminais de HA, desse modo eliminando a sua âncora à membrana C-terminal e a cauda citoplasmática; 4) um espaçador triglicina para separar o corpo da proteína HA da marca de histidinas (posições 601-603 de SEQ ID NO:l); e 5) uma marca de hexa-histidina C-terminal (posições 604-609 de SEQ ID NO:l) . Uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão de SEQ ID NO:l está aqui representada por SEQ ID NO:2. Esta proteína de fusão e o Tarmogen que a expressa podem ser denominados 75-15. A sequência da proteína utilizada é como se segue (SEQ ID NO:1): MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQTPSPTLESTPYSLSTITILANGK 50 AMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFTSDIlClGYtlANN 100 STDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKG1APLQLGKCN1AGWL 150 LGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENG1CYPGDFJDYEELREQLSSVSSF 200 ERFETFPKESSWPNHNTNGVTA ACSHHGK.SS EYR NLLWLTEKEG SYPKLK 250 NSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKEQQNEYQNENAYVSVVTSNYNRRETP 300 EIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFG 350 SG11TSNASMHECNTKCQTPLGA1NSSLPYQNIHPVTIGERPKYVRSAKL 100 RMVTGLRNIPS1QSRCT.PGATAGE1EGGWTGM1DGWYGYHHQNEQGSGYA450 ADQKSTQNA1NG1TNKVNTV1EKMKTQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVD500 DGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFIIDSNMKNLYEKVKSQLKNNAKEIGN 550 GCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMG1YQ 000 GGGHHHHHH- A correspondente sequência de ácido nucleico é como se segue (SEQ ID NO:2):
1 ATGCAGTTAC TTCGCTGTTT TTCAATATTT TCTGTTA TiG CTTCAGTTTT 51 AGCACAGGAA CTGACAACTA TATGCGAGCA AATCCCCTCA CCAACiTTAG 101 AATCGACGCC GTACTCTTTG TCAACGACJΛ ClWmTGGC CAACGGGAAG 151 GCAATGCAAG GAGTTTTTGA ATATTACAAA TCAGTAACGT TTGTCAGTAA 201 TTGCGGTTCT CACCCCTCAA CAACTAGCAA AGGCAGCCCG ATAAACACAC 251 AGTATGTTTT TACTAGTGAC ACAATATGTA TAGGCTACCA TGCGAACAAT 301 TCAACCGACA CTGTTGACAC AGTACTCGAG AAGAATGTGA CAGTGACACA 351 CTCTGTTAAC CTGCTCGAAG ACAGCCACAA CGGAAAACTA TGTAGATTAA 401 AAGGAATAGC CCCACTACAA TTGGGGAAAT GTAACATCGC CGGATGGCTC 451 TTGGGGAATC CAGAATGCGA CCCACIGCIT CCAGTGAGAT CATGGTCCTA 501 CATTGTAGAA ACACCAAACT CTGAGAATGG AATATGTTAT CCAGGAGATT 551 TCATCGACTA TGAGGAGCTG AGGGAGCAAT TGAGCTCAGT GTCATCATTC 601 GAAAGATTCG AAATATTTCC CAAAGAAAGC TCATGGCCCA ACCACAACAG 651 AAACGGAGTA ACGGCAGCAT GCTCCCATGA GGGGAAAAGC AGTTTTTACA 701 GAAATTTGCT ATGGCTGACG GAGAAGGAGG GCTCATACCC AAAGCTGAAA 751 AA ITCrTATG TGAACAAAAA AGGGAAAGAA GTCCTTGTAC TGTGGGGTAT SOI TCATCACCCG TCTAACAGTA AGGAACAACA GAATCIOAT CAGAATGAAA 851 ATGCTTATGT CTCTGTAGTG ACTTCAAATT ATAACAGGAG ATTTACCCCG 901 GAAATAGCAG AAAGACCCAA AGTAAGAGAT CAAGCTGGGA GGATGAACTA 951 TTACTGGACC TTGCTAAAAC CCGGAGACAC AATAATATTT GAGGGAAATG 1001 GAAATCTA AT AGCACCAATG TATGCTTTCG CACTGAGTAG AGGCTTTGGG 1051 TCCGGCATCA TCACCTCAAA CGCATCAATG CATGAGTGTA ACACGAAGTG 1101 TCAAACACCC CTGGGAGCTA TAAACAGCAG TCTCCCTTAC CAGAATATAC 1151 ACCCAGTCAC AATAGGAGAG CGCCCAAAAT ACGTCAGGAG TGCCAAATTG 1201 AGGATGGTTA CAGGACTAAG GAACATTCCG TCCATTCAAT CCAGAGGTCT 125) ATTTGGAGCC ATTGCCGGTT TTATTGAAGG GGGATGGACT GGAATGA I AG 1301 ATGGATGGTÀ TGGTTATCAT CATCAGAATG AACAGGGATC AGGCTATGCA 1351 GCGGATCAAA AAAGCACACA AA ATGCCATT AACGGGATTA CAAACAAGGT 1401 GAACACTGTT ATCGAGAAAA TGAACATTCA ATTCACAGGT GTGGGTA A AG 1451 aattcaacaa attagaaaaa aggatggaaa atttaaataa aaaagttgat
1501 GATGGATTTC TGGACATTTG GACATATAAT GCAGAATTGT TAGTTCTACT 1551 GGAAAATGAA AGGACTCTGG ACTJ'CCATGA CTCAAATATG AAGAATCTGT 1601 ATGAGAAAGT AAAA.AGCCAA TT A A AG A AT A ATGCCAAAGA AATCGGAAAT 1651 GGATGTTTTG AGTTCTACCA CAAGTGTGAC AATGAATGCA TGGAAAGTGT 1701 AAGAAATGGG ACTTATGATT ATCCCAAATA TTCAGAAGAG TCAAAGTTGA 1751 ACAGGGAAAA GGTAGATGGA GTGAAATTGG AATCAATGGG GATCTATCAG 1801 GGTGGCGGGC ATGACCATCA CCATCACTAG TGA
Exemplo 5. O efeito de diferentes tampões (meio de pH 6,5) sobre o crescimento celular e o pH da cultura de 75-15
Testaram-se diferentes agentes tamponantes em células 75-15 para determinar os seus efeitos sobre o crescimento celular e também o efeito sobre o pH da cultura. Estes tampões estão mostrados na Figura 3 e incluíram succinato, citrato e carbonato. Nenhum dos tampões provocou a formação de precipitado. Todos os tampões utilizados se dissolveram bem em meios de crescimento padrão. 0 pH de todas as culturas de teste foi ajustado a pH 6,5 antes da inoculação com levedura.
Cresceram-se então as culturas em balões de agitação a 30°C durante até 15 horas. Observou-se um crescimento mínimo a nulo quando as células foram crescidas em tampão de carbonato. Como se pode observar na Figura 3, a utilização de diferentes agentes tamponantes afectou as taxas de crescimento. 0 crescimento foi mais rápido em pH neutro (pelo menos pH 5,5). Em particular, o meio com tampão de succinato teve o melhor desempenho em termos de tempo de duplicação (~2,5h de tempo de duplicação). Pelo contrário, quando as células de levedura foram crescidas a um pH inferior a 5,5 (condições mais ácidas), então o tempo de duplicação foi mais lento a ~3,5 h. 0 citrato tece um tempo de duplicação similar ( — 3,5 h) . 0 citrato a 0,05 M teve maior capacidade tamponante do que o succinato a 0,02 M. Nestas experiências todas as culturas receberam cobre a 0,35 mM para indução da expressão.
Exemplo 6. Efeito de vários agentes tamponantes sobre a lise celular A Figura 4 mostra os resultados de experiências conduzidas com diferentes agentes tamponantes tais como succinato e citrato. As culturas foram crescidas como descrito no Exemplo 1. A capacidade da levedura ser lisada pela glucanase foi medida utilizando o protocolo do ensaio de lise acima. A levedura na cultura de controlo (meio pH~5,2) apresentou uma lise menos eficiente pela glucanase à medida que a densidade celular aumentava (densidades celulares indicadas pelo número depois do hifen, como descrito acima para a Figura 2). Contudo, para os meios, tamponado com succinato e tamponado com citrato, a densidade celular no momento da colheita não teve nenhum efeito sobre a capacidade da levedura ser lisada por enzimas que digerem a parede celular no ensaio de lise descrito acima. A levedura nos meios tamponados com succinato e com citrato permaneceu susceptivel a lise a densidades celulares crescentes (e.g., 0,5 YU/ml, 0,9 YU/ml e 2,1 ou 2,2 YU/ml).
Exemplo 7. Estudo de formulação do meio
Testou-se a contribuição de outros agentes adicionados ao meio de cultura da levedura e os resultados estão mostrados na Figura 5. U2 ou U4 referem-se à composição básica do meio. Como a expressão de proteína está sob controlo do promotor CUP1 indutível por cobre, adiciona-se cobre a 0,35 mM ao meio para induzir as células de levedura a expressar a proteína HA. Soytone (Soy na Figura 5), é uma mistura complexa de nutrientes comercialmente disponível derivada por digestão péptica de feijão de soja. A adição de Soytone originou o mais rápido crescimento e o mais elevado rendimento (30 YU/mL). A utilização de ácido succínico 0,08 M apresentou melhor capacidade de tamponamento. Cresceram-se as células a 30°C durante os tempos indicados no eixo dos xx. A Figura 6 mostra os resultados do estudo de formulação do meio que utilizou a tecnologia de Guava Technologies para determinação da viabilidade celular. Cresceu-se a estirpe de levedura 75-15 que expressa Aga2-HA indutível por cobre a 30°C em balões de agitação. Quando é adicionado o cobre à cultura, a proteína Aga2-HA é expressa e irá surgir na superfície celular, o que representa o número de células de levedura que apresentam HA sobre a superfície (% de sinal positivo). A viabilidade celular pode também ser determinada utilizando outros métodos (e.g., hemocitómetro ou azul de Tripano). O sinal mais elevado foi observado com U2, mesmo a uma densidade celular de 8 YU/mL, que é superior à densidade celular a que as células tendam a retardar a sua taxa de crescimento. As culturas utilizando Soytone apresentaram um claro efeito da densidade celular, com densidades elevadas apresentando um declínio em proteína. A utilização de U4 originou um sinal global baixo. Estes resultados também demonstram a acessibilidade de detecção devido aos efeitos do pH sobre a parede celular e a capacidade de anticorpos específicos para HA detectarem a proteína expressa na superfície.
Conduziram-se experiências adicionais utilizando uma concentração de Soytone diferente. A Figura 7 ilustra os resultados. Não se observou diferença no crescimento ou no pH entre 0,5 g/1 e 1 g/1 de Soytone. Foi observado crescimento mais rápido em meio U4-YNB do que em meio U2.
Exemplo 8. Diferença na acessibilidade de HA quando a levedura é crescida em condições de pH neutro A acessibilidade de antigénios particulares relativamente a interacções com outros agentes, tais como um anticorpo para detecção, foi avaliada utilizando vários níveis de pH dos meios. A Figura 8 apresenta um ensaio Immunoblot de hemaglutinina de influenza (HA) libertável por levedura intacta quando as células de levedura foram crescidas a pH inferior a 5 e também quando a levedura foi crescida a um pH superior a 6. A levedura crescida a pH neutro torna a HA exibida na superfície muito mais acessível à detecção pelo anticorpo, como determinado pela coloração em citometria de fluxo, tanto em número de células que expressam HA como na quantidade de HA por célula. Em adição, a levedura crescida a pH neutro foi mais fácil de manipular para a libertação da HA ligada por dissulfureto por tratamento com ditiotreitol (agente redutor de dissulfureto) .
Exemplo 9. O efeito de pH neutro sobre a produção de citóquinas O efeito da cultura de levedura a pH neutro sobre a produção de citóquinas foi examinado utilizando células dendríticas (DC) carregadas com levedura YVEC (que não expressa um antigénio heterólogo) crescida em meio onde o pH foi, ou não, mantido acima de pH 5,5. Células dendríticas derivadas de medula óssea de ratinho foram carregadas com 10 leveduras por DC por incubação conjunta em meio RPMI durante 48 h a 37°C. Analisaram-se então os sobrenadantes quanto a citóquinas segregadas. A Figura 9 mostra os resultados destas experiências. O painel inferior mostra que existe um aumento marcado de secreção de IFN-gama pelas células dendríticas carregadas com a levedura crescida a um pH neutro (i.e., pelo menos 5,5 ou superior) que está ausente quando a levedura cresceu em meio onde o pH foi deixado cair abaixo de 5,5.
Lisboa, 2015-01-13
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo uma levedura Saccharomyces, em que a levedura expressa um antigénio heterólogo, e em que a levedura foi cultivada num meio que é mantido a um nivel de pH entre 5,5 e 8, de modo a que o pH do meio não caia abaixo de pH 5,5, para utilização num método para eliciar uma resposta imunitária num indivíduo, como profiláctico ou terapêutico para uma doença ou enfermidade.
- 2. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, para utilização na indução de uma resposta imunitária do tipo Thl num indivíduo que está afectado com uma doença ou desordem que irá beneficiar com uma resposta imunitária do tipo Thl aumentada.
- 3. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a doença ou enfermidade é uma doença infecciosa ou um cancro.
- 4. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio é tamponado com um agente tamponante.
- 5. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio é tamponado com succinato.
- 6. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o meio é tamponado com Bis-Tris, citrato ou fosfato.
- 7. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio é mantido a um nível de pH entre 6 e 8.
- 8. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o antigénio heterólogo é expresso sobre a superfície da levedura.
- 9. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
- 10. Método de crescimento de uma levedura Saccharomyces compreendendo: (a) cultura da levedura num meio que é mantido a um nivel de pH entre 5,5 e 8, em que a levedura é cultivada de modo a que o pH do meio não caia abaixo de pH 5,5, em que a levedura é cultivada durante pelo menos três horas ou mais a um nivel de pH entre 5,5 e 8, em que a levedura expressa um antigénio heterólogo; e (b) formulação de uma composição compreendendo a referida levedura e um excipiente e/ou um transportador farmaceuticamente aceitáveis.
- 11. Método da reivindicação 10, em que o meio é mantido a um nivel de pH entre 6 e 8.
- 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11 em que o meio é tamponado com um agente tamponante.
- 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que o meio é tamponado com succinato, Bis-Tris, citrato ou fosfato.
- 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, em que o método compreende adicionalmente a liofilização da levedura. Lisboa, 2015-01-13
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