TWI544075B - 製造以酵母菌為底之疫苗之改善方法 - Google Patents

Description

製造以酵母菌為底之疫苗之改善方法

本發明係關於使酵母菌培養物在中性pH值下生長以改善酵母菌培養物之產率及某些特徵的方法。本發明亦係關於藉由此等方法而製得之組合物。

疫苗為衛生保健行業可利用之最節約成本的措施之一。然而，仍急需開發用於多種疾病之安全且有效的疫苗及佐劑，該等疾病包括彼等因病原體感染所致之疾病、癌症、遺傳缺陷及其他免疫系統病症。例如Rabinovich等人，Science 265,1401－1404(1994),之關於疫苗之出版物指出仍需可口服投與且較佳在生命早期僅需投與幾次之安全且熱穩定的疫苗。亦較佳為可保護個體免於患上一種以上疾病之組合疫苗以及無需佐劑且可引起黏膜免疫性之疫苗。目前(若存在)極少疫苗滿足所有此等標準。

次單位疫苗之開發可能藉由重組DNA技術進行，其目前因僅顯示有限免疫原性而令人失望。一實例為若干HIV(人類免疫缺陷病毒)次單位疫苗之近期臨床測試，該等次單位疫苗不僅因其有限之功效，且亦因在某些情況下當經免疫之個體隨後暴露於HIV時展示加速疾病進展而停用。參見，例如Cohen,Science 264：1839(1994)；及Cohen,Science 264：660(1994)。次單位疫苗以及滅活病毒疫苗及重組活病毒疫苗之一缺點在於儘管其似乎刺激強的體液免疫反應，但其無法引發保護性細胞免疫。1994年國際AIDS大會之主要結論為仍需細胞毒性T細胞介導之反應以預防或降低目前缺少臨床疫苗之HIV感染。此外，目前所測試之HIV疫苗無法在原發性HIV感染發生之黏膜表面引起免疫性。

此外，美國僅批准使用之佐劑為鋁鹽、氫氧化鋁及磷酸鋁，其均不能刺激細胞介導之免疫。此外，鋁鹽調配物無法冷凍或凍乾，且此等佐劑並非對所有抗原均有效。

酵母菌細胞已用於製造包括上述HIV疫苗試驗中所測試之彼等疫苗中之某些的次單位蛋白質疫苗。亦已在免疫前將動物飼以酵母菌以試圖以非特異性方式引發免疫反應(亦即以刺激噬菌作用以及補體及干擾素之製造)。結果並不明確且該等方案未產生保護性細胞免疫；參見，例如Fattal－German等人，Dev.Biol.Stand. 77：115－120(1992)及Bizzini等人，FEMS Microbiol.Immunol. 2：155－167(1990)。

除疫苗之外，許多基因及藥物療法需要有效及特定傳遞媒劑以確保最大可能益處。缺少足夠的傳遞媒劑為應用基因療法之主要障礙且其顯著限制許多藥物之治療可能性。例如，近期之報導已指示目前基因療法應用的臨床所測試之腺病毒載體刺激不當免疫及發炎反應，且似乎不可以所需方式整合；參見，例如Engelhardt等人，Human Gene Therapy 5：1217－1229(1994)及其中列舉的參考文獻。

酵母菌疫苗技術之另一主要障礙為製造方法。酵母菌細胞已在實驗室中培養許多年，且已確立標準培養條件。參見，例如Methods of Enzymology ，第194卷，Guthrie等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)。標準操作方案通常包括在如pH值所量測為酸性之培養基中培養酵母菌。然而，在酸性培養基中培養酵母菌可能會產生顯示不同生物特性之酵母菌，其對於將酵母菌用作攜帶抗原之媒劑以用於免疫調節或製造疫苗而言並非最佳。因此，需要生長酵母菌之方法以便酵母菌顯示使其更適用作攜帶抗原之媒劑的特性。本文所揭示之發明部分係基於以下發現：儘管酵母菌可在酸性培養基中生長，但當在酸性培養基中生長時酵母菌所顯示的生物特性並非如當酵母菌在pH值為中性之培養基中生長時所顯示的生物特性般合意。

出於任何目的，所有專利、專利申請案及公開案之揭示內容藉此以引用的方式全部併入本文中。

本發明提供一種生長酵母菌之方法，其包含在pH值至少為5.5之培養基中生長酵母菌。本發明亦提供一種藉由在培養基中培養酵母菌來生長酵母菌之方法，其中該培養基之pH值係維持在於5.5與8之間。在本發明之一態樣中，酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )。在本發明之態樣中，培養基係經丁二酸鹽或丁二酸緩衝，或培養基可額外含有大豆蛋白腖。在本發明之其他態樣中，酵母菌引發免疫反應。在本發明之其他態樣中，酵母菌表現抗原，在某些情況下，抗原為異源抗原。在某些情況下，異源抗原係表現在酵母菌之表面上。

本發明提供包含藉由上文之任何方法及相關態樣所培養之酵母菌的組合物。

本發明提供藉由在培養基中培養含有用於表現抗原之表現系統的酵母菌來製造抗原表現性酵母菌之方法，其中培養基之pH值至少為5.5。本發明亦提供藉由培養含有用於表現抗原之表現系統的酵母菌來製造抗原表現性酵母菌之方法，其中培養基之pH值係維持在於5.5與8之間。在一態樣中，酵母菌為釀酒酵母。在其他態樣中，培養基係經丁二酸鹽或丁二酸緩衝，或培養基可額外含有大豆蛋白腖。在本發明之其他態樣中，酵母菌引發免疫反應。在本發明之其他態樣中，酵母菌表現抗原，在某些情況下抗原為異源抗原。在某些情況下，異源抗原係表現在酵母菌之表面上。在某些態樣中，異源抗原比酵母菌在小於5.5之pH值下生長時更易於與其他細胞或試劑發生相互作用。

本發明亦提供一種包含藉由上文所揭示之方法培養之酵母菌的組合物。

本發明亦提供一種藉由向個體投與包含抗原表現性酵母菌之組合物在個體中誘導Th1型反應之方法，其中酵母菌已在pH值至少為5.5之培養基中培養。

本發明亦提供一種藉由向個體投與包含抗原表現性酵母菌之組合物在個體中誘導Th1型反應之方法，其中酵母菌已在培養基中培養，其中培養基之pH值係維持在於5.5與8之間。在一態樣中，組合物包含裝載有在中性pH值下培養、維持或收集之酵母菌的樹突狀細胞。在另一態樣中，酵母菌為釀酒酵母。在其他態樣中，培養基係經丁二酸鹽或丁二酸緩衝，或培養基可額外含有大豆蛋白腖。在本發明之其他態樣中，酵母菌引發免疫反應。在本發明之其他態樣中，酵母菌表現抗原，在某些情況下抗原為異源抗原。在某些情況下，異源抗原係表現在酵母菌之表面上。在一態樣中，Th1型反應為γ干擾素產生。在另一態樣中，Th1型反應為IL－12產生。

本發明亦提供用於培養酵母菌之套組，其包含pH值至少為5.5之培養基及使用培養基培養酵母菌之說明書。本發明亦提供用於培養酵母菌之套組，其包含pH值維持在於5.5與8之間的pH值之培養基及使用培養基培養酵母菌之說明書。在其他態樣中，培養基係經丁二酸鹽或丁二酸緩衝，或培養基可額外含有大豆蛋白腖。在一態樣中，該套組額外包括酵母菌。在某些情況下，酵母菌係經冷凍或冷乾。在某些情況下，酵母菌已在pH值至少為5.5之培養基中培養，或已在培養基中培養，其中培養基之pH值係維持在於5.5與8之間的pH值。在其他情況下，酵母菌能夠複製。

本文所揭示之本發明係基於以下發現：在中性pH值、至少pH 5.5或pH 5.5與8之間(例如至少5.5或較佳至少約pH 6.0之pH值)下生長酵母菌得到具有更合意生物特徵之酵母菌。下文詳述之此等合意特徵中的某些包括(但不限於)以增加之細胞密度良好地生長細胞之能力、保持酵母菌細胞壁柔韌及對用細胞壁消化酶消化敏感，及以使得抗原更易為其他細胞及/或試劑所獲取之方式顯示抗原。

通用技術

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用熟習此項技術者所熟知之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學及免疫學之習知技術。以下文獻中已充分解釋此等技術，諸如Methods of Enzymology ，第194卷，Guthrie等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts ,Skinner，等人編，Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics：a laboratory course manual ,Rose等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces：Cell Cycle and Cell Biology ,Pringle等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces：Gene Expression ,Jones等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces：Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics ,Broach等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，第二版(Sambrook等人，1989)及Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，第三版(Sambrook及Russell,2001)(在本文中共同稱作"Sambrook")；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人編，1987，包括2001年之增刊)；PCR：The Polymerase Chain Reaction (Mullis等人編，1994)；Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Publications,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(本文中共同稱作"Harlow及Lane"),Beaucage等人編，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons,Inc.,New York,2000)及Vaccines ,S.Plotkin及W.Orenstein編，第三版(1999)。

定義

如本文所用，通常使用之術語"中性pH值"係指介於約pH 5.5與約pH 8之間、較佳介於約pH 6與約pH 8之間的pH值範圍。熟習此項技術者應理解當以pH計量測時可存在少量波動(例如十分之一或百分之一)。

如本文所用，通常使用之術語"抗原"係指可由適應性免疫系統所識別之任何分子。在一態樣中，抗原為與抗體特異性結合之分子。分子可為蛋白(肽、部分蛋白、全長蛋白)之任一部分(其中蛋白係天然產生或合成衍生的)或為分子組合物(全細胞、細胞溶胞物或分裂細胞)之一部分，有機體(全有機體、溶胞物或分裂細胞)之一部分，或為碳水化合物或其一部分。抗原自身或藉助於使用諸如佐劑(如酵母菌細胞碎片)之另一化合物可引發抗原特異性體液免疫反應。在另一態樣中，抗原係在主要組織相容性複合體(MHC)之環境中由T淋巴細胞(或T細胞)所識別。在另一態樣中，抗原可充當耐受原，對抗該抗原所投與之動物之細胞及組織中所遇到的相同或類似抗原。

在本發明之一態樣中，當提及刺激免疫反應時，"抗原"可為"免疫原"。免疫原為能夠引發例如誘導抗體產生之適應性免疫反應之分子。在某些情況下免疫原可產生將產生抗體之記憶分子，該等抗體在將來暴露於抗原時識別抗原。如熟習此項技術者所熟知，免疫原亦可由T淋巴細胞所識別，儘管由T淋巴細胞所識別之免疫原的形式將不同於抗體所識別之免疫原的形式。

培養酵母菌之方法

本發明提供用於培養產生諸如所需抗原之高表現、細胞壁柔韌性及抗原顯示之所需特性之酵母菌的方法。此等方法係廣泛應用於所有酵母菌。酵母菌為屬於以下3類之單核微生物：子囊菌(Ascomycetes )、擔子菌(Basidiomycetes )及半知菌類(Fungi Imperfecti )。儘管根據本發明可使用病原性酵母菌株或其非病原性突變體，但在一態樣中使用非病原性酵母菌株。非病原性酵母菌株之實例包括植酵母(Saccharomyces )、假絲酵母(Candida )、隱球菌(Cryptococcus )、漢森酵母(Hansenula )、刻魯維拉菌(Kluyveromyces )、畢赤酵母(Pichia )、紅酵母(Rhodotorula )、裂殖酵母(Schizosaccharomyces )及解脂耶氏酵母(Yarrowia )。在一態樣中，使用植酵母、假絲酵母、漢森酵母、畢赤酵母及裂殖酵母。在其他態樣中，使用釀酒酵母、啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis )、白色念珠菌(Candida albicans )、乳酒假絲酵母(Candida kefyr )、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis )、羅倫隱球酵母茵(Cryptococcus laurentii )、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )、漢遜氏酵母(Hansenula anomala )、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha )、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis )、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis )、乳酸馬克斯克魯維酵母變種(Kluyveromyces marxianus var.lactis )、甲醇酵母(Pichia pastoris )、耀紅酵母(Rhodotorula rubra )、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )及耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica )。應理解本發明並不侷限於上文所列物種且熟習此項技術者可將本文之教示應用於任何類型之酵母菌中。在另一態樣中，釀酒酵母(S.cerevisiae )係用於實踐本發明之方法。釀酒酵母較佳，此係由於其易於進行分子操縱且對於用作食物添加劑"普遍認為安全"或"GRAS"(GRAS，FDA於1997年4月17日提出之規程62FR18938)。

在本發明之某些態樣中，其係在pH值至少為5.5之培養基中生長酵母菌。在其他態樣中，其係在約5.5之pH值下生長酵母菌。在其他態樣中，其係在約5.6、5.7、5.8或5.9之pH值下生長酵母菌。在另一態樣中，其係在約6之pH值下生長酵母菌。在另一態樣中，其係在約6.5之pH值下生長酵母菌。在其他態樣中，其係在約6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0之pH值下生長酵母菌。在其他態樣中，其係在約7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0之pH值下生長酵母菌。在其他態樣中，酵母菌係維持在於5.5與8之間的pH值下。pH值在酵母菌之培養中係重要的。熟習此項技術者將可瞭解培養方法不僅包括酵母菌培養之開始，且亦包括培養物之維持。酵母菌培養可在任何pH值下開始，然而由於酵母菌培養之培養基傾向於隨時間而酸性增加(亦即pH值降低)，因此在培養方法過程中需謹慎監控pH值。在一態樣中，其係培養酵母菌使得培養基之pH值不降至低於5.5。在另一態樣中，其係培養酵母菌使得培養基之pH值不降至低於5.0。如此，酵母菌在pH值至少為5.5或以上之培養基中生長的時間愈長，關於獲得具有下文所描述之所需特徵的酵母菌之結果愈佳。在某些情況下，收集時酵母菌培養物之pH值為中性係較佳的。

在一態樣中，使用中性pH值方法生長酵母菌細胞意謂酵母菌細胞係在中性pH值下生長至少50%之酵母菌處於培養物中的時間。更佳者，酵母菌係在中性pH值下生長至少60%之酵母菌處於培養物中的時間、更佳為至少70%之酵母菌處於培養物中的時間、更佳為至少80%之酵母菌處於培養物中的時間且最佳為至少90%之酵母菌處於培養物中的時間。在另一態樣中，在中性pH值下生長包括在中性pH值下培養酵母菌細胞至少5分鐘，較佳係在中性pH值下培養至少15分鐘，更佳係在中性pH值下培養至少1小時，更佳係至少2小時，甚至更佳係至少3小時或更長。

可藉由任何方式使培養基之pH值為至少5.5。在一態樣中，使用丁二酸(及任何相關形式，例如陰離子丁二酸鹽)來緩衝培養基。如實例中進一步詳述，使用丁二酸鹽來將培養基緩衝為至少pH 5.5可使得酵母菌具有約2至2.5小時之倍增時間。丁二酸鹽係獲自市售來源(例如，Sigma Chemicals)。在其他態樣中，可使用檸檬酸鹽使培養基之pH值至少為5.5。熟習此項技術者將可輕易確定可用於使培養基之pH值為至少5.5而保持酵母菌存活的其他緩衝劑。將溶液保持在穩定pH值之緩衝劑的概念在此項技術中係已為熟知的，且因此在本文中不再詳細討論。若將根據本發明而生長之酵母菌用於醫藥調配物(例如疫苗)，則推薦使用GMP級材料。

此外，可向培養基中添加其他補充劑以改善培養基。添加至培養基中的尤其有助之其他補充劑包括大豆蛋白腖。大豆蛋白腖易於自商業來源(例如，BD Difco)獲得。如實例及圖中所示，向培養基中添加大豆蛋白腖支持在中性pH值下生長之更高密度。此外，添加大豆蛋白腖支持所關注抗原(流感病毒血球凝集素(HA))之表現。

可向酵母菌培養基中添加其他添加劑以用於其他目的，諸如誘導異源基因之表現。在某些態樣中，可使用銅來誘導血球凝集素之表現。然而，在中性pH值下使用銅由此用於控制待在中性pH值下生長之酵母菌中表現之可誘導基因並不理想。將推薦非銅添加劑。

中性pH值對酵母菌培養物之影響

使用中性pH值培養酵母菌促進若干生物學效應，該等生物學效應為使用酵母菌作為用於免疫調節及/或引發免疫反應之媒劑的所需特徵。在一態樣中，在中性pH值下培養酵母菌允許酵母菌在對倍增時間無任何負影響(例如，使倍增時間下降)之情況下長好生長。酵母菌可在不喪失其細胞壁柔韌性的情況下持續生長至高密度。

在另一態樣中，使用諸如至少5.5或介於pH 5.5與8之間的中性pH值允許製造在所有收集密度下均具有柔韌細胞壁之酵母菌及/或對細胞壁消化酶(例如葡聚糖酶)敏感之酵母菌。因此，本發明提供具有如傳統檢定(例如對葡聚糖酶之敏感性)所量測之細胞壁柔韌性的酵母菌之方法及組合物。先前實驗已確立在約0.5 YU(酵母菌單位)/ml之收集密度下酵母菌喪失其對用細胞壁消化酶消化之敏感性。因此，一優點為與在標準生長培養基中在0.5 YU/ml下培養酵母菌所進行之比較可用於與在任何密度下中性pH值生長之酵母菌的比較。此特點為需要的，此係由於具有可撓性細胞壁之酵母菌可顯示獨特的免疫反應，諸如促進細胞因子(例如INF－γ)在酵母菌所寄生之細胞中之分泌。熟習此項技術者使用中性pH值方法之另一原因在於其允許位於細胞壁上之抗原的更大獲取性。此適用於如藉由諸如流式細胞儀之標準技術所量測之更大免疫原性且亦適用於所表現蛋白之抗體偵測。

在中性pH值下培養之酵母菌中所觀察之另一所需特徵為抗原以有益於免疫調節目的之方式的表現。在一態樣中，將酵母菌用作抗原表現之媒劑(參見，例如美國專利第5,830,463及7,083,787號)。抗原可為酵母菌原生之抗原或另外為酵母菌所表現之異源抗原。在某些態樣中，使用酵母菌來表現抗原有助於開發疫苗、預防劑及治療劑以對抗各種疾病及病痛(例如感染性疾病或癌症)。使用中性pH值方法，熟習此項技術者可製造攜帶抗原之酵母菌，其中該抗原更易為其他細胞(例如，用於免疫共刺激功能或免疫調節)或其他試劑(例如，用於偵測之抗體)獲取。此外，使用中性pH值用於諸如流感HA抗原之某些抗原允許藉由以二硫蘇糖醇(DTT)處理而釋放二硫化物鍵結之HA，當表現HA之酵母菌在pH值降至低於pH 5之培養基中培養時此係不可能的。在某些情況下，當pH值降至低於pH 5歷時任何時間長度時此釋放發生。在其他情況下，當pH值降至低於pH 5歷時1或數分鐘或1或多個小時時此釋放發生。

遵循中性pH值方法培養之酵母菌所顯示的另一所需特徵為自已暴露至酵母菌的細胞分泌Th1型細胞因子。Th1型細胞因子之實例包括(但不限於)干擾素－γ、IL－12及IL－2。如實例中進一步詳述，如與在低(酸性)pH值培養基中所生長的酵母菌相比，裝載有遵循中性pH值方案生長之酵母菌之樹突狀細胞顯示增加之干擾素－γ分泌及表現水平。當使用中性pH值培養方法時，IL－12分泌之水平未降低。因此，熟習此項技術者可使用本文所揭示之中性pH值方法用於免疫調節目的，例如在患有將受益於增加之Th1型反應之疾病或病症的個體中誘導Th1型反應。

使用中性pH值方法學生長之酵母菌的組合物

本發明亦涵蓋包含使用本文所揭示之中性pH值方法學生長的酵母菌之組合物。在一態樣中，該組合物包含在酵母菌表面、內部或兩者中表現天然抗原之酵母菌。此組合物可適用於各種目的，諸如作為佐劑來投藥。在另一態樣中，該組合物包含在酵母菌表面、內部或兩者中表現異源抗原之酵母菌。此組合物可適用於各種目的，諸如在需要其之個體中免疫調節及開發疫苗。

此等組合物亦可包括醫藥學上可接受之賦形劑及/或載劑。醫藥學上可接受之載劑可包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油、及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理食鹽水及經緩衝之培養基。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer)右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏或固定油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液(諸如基於林格氏右旋糖之電解質補充液)及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及其類似物。包含在中性pH值條件下生長之酵母菌的組合物與醫藥學上可接受之賦形劑的調配對於熟習此項技術者而言通常為常規的。

本發明之套組

本發明涵蓋包含用於在中性pH值條件下培養酵母菌之培養基組份的套組。在一態樣中，該套組包括含有可用於使培養基之pH值為至少5.5的丁二酸鹽或丁二酸之培養基組份，及一套使用說明書。在另一態樣中，該套組進一步包括蛋白腖作為額外組份。在另一態樣中，該套組進一步包括酵母菌細胞。該等酵母菌細胞可經冷凍以使用本文所揭示之方案開始培養。在另一態樣中，酵母菌細胞可在經冷凍用於包裝為套組之一部分之前藉由本文所揭示之方法培養。在另一態樣中，酵母菌細胞可經凍乾且視情況包括於套組中。在另一態樣中，套組包含根據本文所揭示之方法製備的能夠複製之酵母菌。

提供以下實例以說明本發明之某些態樣。其不欲以任何方式限制本發明。

實例 實例1酵母菌培養基調配物

各種類型之培養基均可用於培養酵母菌，且其經調節以便pH值為中性。下文給出可使用之培養基的若干實例，然而應瞭解本發明並不侷限於使用此等培養基、組份或培養基方案。

一標準培養基配方為ULDM培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為UL2培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為UL3培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為UL4培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為UDM培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為U2培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為U3培養基，其係如下：

另一標準培養基配方為U4培養基，其係如下：

標準培養基調配物可用額外胺基酸來補充。以下方案為例示性培養基調配物。

ULDMaa培養基調配物係如下：

UL2aa培養基調配物係如下：

UL3aa培養基調配物係如下：

UDMaa培養基調配物係如下：

U2aa培養基調配物係如下：

U3aa培養基調配物係如下：

在另一態樣中，使用含有丁二酸鹽之經緩衝之培養基。含有丁二酸鹽之酵母菌培養基之實例係如下。pH值經調整為6.9之UDMS培養基調配物係如下：

pH值經調整為6.9之U2S培養基調配物係如下：

pH值經調整為6.9之U3S培養基調配物係如下：

pH值經調整為6.9之U4S培養基調配物係如下：

實例2培養基pH值對細胞生長及培養物pH值之影響

如圖1所示測試培養基pH值對細胞生長及培養物pH值的影響。在補充有Bis－Tris緩衝液、pH 7.2或磷酸鹽緩衝液、pH 7.2之U2培養基中生長細胞。在無緩衝液添加至培養基中的U2培養基中生長對照培養物。對於標記為對照(與培養基pH 5.5相同)或培養基pH 7.2之條件，在接種酵母菌之前用鹼(NaOH)將此等對照之生長培養基調節為pH 5.5或pH 7.2。在30℃下培育培養物且監控細胞數及培養物pH值，歷時多至16小時。結果指示在不同pH值下之緩衝液影響酵母菌之生長速率。如圖1所示，倍增時間之範圍在2.8至4.5小時內。在2.0 YU/mL下，未經緩衝之pH 7培養基之pH值為約5.5，其指示需要某種形式之緩衝液以將pH值保持在中性水平。

實例3培養基pH值對細胞壁厚度之影響

測試培養基pH值之作用以確定其是否對細胞壁厚度具有任何影響。生長培養基及條件係與實例1相同。在0.5至2.0 YU/mL範圍內之密度下收集培養物。在圖2之圖例中，收集培養物時之密度係列為破折號後的數字，例如對照－0.6意謂細胞在未經緩衝之培養基中在pH 5.5下生長，隨後當細胞達到0.6 YU/mL密度時將其收集。燒瓶1－3之條件(例如1－0.5、2－2.0或3－1.0)係列於圖下且在圖例中標記收集時的細胞密度。所用溶胞作用檢定方案係如下：(1)在1 ml Tris－BME中懸浮10 YU之洗滌細胞；(2)取出"0時刻"樣品且在600 nm下量測OD值；(3)添加20 U葡聚糖酶；(4)在30℃下旋轉；(5)每10分鐘取樣一次且量測OD值。

如圖2中可觀察到，當細胞密度增加時對照培養物(培養基pH值為約5.5)展示較低有效性之溶胞作用。燒瓶2展示無緩衝劑液之pH 7.2之培養基的作用。燒瓶2展示具有Bis－Tris緩衝液之pH 7.2之培養基的作用。燒瓶3展示具有磷酸鹽緩衝液之pH 7.2之培養基的作用。

因此，該等結果指示在所有收集密度下使經緩衝之酵母菌細胞以約5.5 pH或更高pH值生長保持細胞壁柔韌性及對用細胞壁消化酶消化之敏感性(例如，以溶壁酶/葡聚糖酶產生細胞質體)。相反，用許多酵母菌實驗室通常使用之標準方法，在>0.5 YU/mL之收集密度下喪失敏感性。為便於比較，標準生長培養基之0.5 YU/mL通常係用於與在任何密度下的中性pH值生長之比較。

實例4建構75－15細胞

將表示TK75－15之融合蛋白工程化以使用藉由TEF2啟動子驅動之Aga2序列在細胞壁上表現流感HA蛋白。在此建構體中，用C末端連接至Aga2序列之HA序列來建構蛋白。此蛋白當在亦表現Aga1p之細胞中表現時(在此情況下藉由CUP1啟動子驅動)定位於酵母菌細胞之外部細胞壁以及細胞溶質。包含流感HA抗原之融合蛋白為具有以下融合於N至C末端之框架中的序列元件之單一多肽(融合蛋白之胺基酸序列在本文中由SEQ ID NO：1表示)：1)全長釀酒酵母Aga2蛋白序列(SEQ ID NO：1之位置1至87)，其包括其天然18胺基酸ER標靶信號序列(SEQ ID NO：1之位置1至18)；2)將Aga2自HA主體分離之間隔子(位置88及89)；3)缺少其信號序列(SEQ ID NO：1之位置90至600)且缺少HA之36 C末端殘基，由此去除其C末端膜錨定及細胞質尾之流感HA蛋白；4)將HA蛋白主體自組胺酸標籤(SEQ ID NO：1之位置601－603)分離之三甘胺酸間隔子；及5)C末端六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO：1之位置604－609)。編碼融合蛋白SEQ ID NO：1之核酸序列在本文中係由SEQ ID NO：2表示。此融合蛋白及表現其之Tarmogen可稱作75－15。

所用蛋白序列係如下(SEQ ID NO：1)：

相應核酸序列係如下(SEQ ID NO：2)：

實例5不同緩衝液(pH 6.5培養基)對75－15細胞生長及培養物pH值之影響

對75－15細胞測試不同緩衝劑以測定其對細胞生長之影響以及對培養物pH值之影響。此等緩衝液係展示於圖3中且包括丁二酸鹽、檸檬酸鹽及碳酸鹽。該等緩衝液均未致使沉澱形成。所用之所有緩衝液均充分溶於標準生長培養基中。在以酵母菌接種前將所有測試培養物之pH值調整為6.5。接著使培養物在震盪燒瓶中在30℃下生長至多15小時。當細胞在碳酸鹽緩衝液中生長時，可見極少生長至無生長。如圖3中可見，不同緩衝劑之使用影響生長速率。在中性pH值(至少pH 5.5)中生長較快。尤其具有丁二酸鹽緩衝液之培養基就倍增時間(約2.5 h倍增時間)而言表現最佳。相反，若酵母菌細胞在小於5.5之pH值(酸性更強之條件)下生長，則倍增時間減緩為約3.5 h。檸檬酸鹽具有類似倍增時間(約3.5 h)。0.05 M之檸檬酸鹽比0.02 M之丁二酸鹽具有更大緩衝能力。在此等實驗中，所有培養物均接受0.35 mM銅用於誘導表現。

實例6各種緩衝劑對細胞溶解作用之影響

圖4展示以諸如丁二酸鹽及檸檬酸鹽之不同緩衝劑進行之實驗的結果。如實例1中所描述來生長培養物。使用上文之溶胞檢定方案量測葡聚糖酶溶解酵母菌之能力。當細胞密度增加時，對照培養物(pH約5.2)中之酵母菌展示較低有效性之葡聚糖酶溶胞作用(如上文圖2所描述，細胞密度係由破折號後之數字指示)。然而，對於經丁二酸鹽及檸檬酸鹽緩衝之培養基，收集時的細胞密度對上文所述之溶胞檢定中細胞壁消化酶溶解酵母菌之能力無任何影響。經丁二酸鹽及檸檬酸鹽緩衝之培養基中之酵母菌在增加之細胞密度(例如0.5 YU/ml、0.9 YU/ml及2.1或2.2 YU/ml)下仍維持易於溶解。

實例7培養基調配物研究

測試添加至酵母菌培養基中之其他試劑的作用，且結果展示於圖5中。U2或U4係指基本培養基組合物。由於蛋白表現係受銅可誘導之CUP1啟動子的控制，因此為待誘導以表現HA蛋白之酵母菌細胞而將0.35 mM銅添加至培養基中。大豆蛋白腖(圖5中之大豆)為藉由大豆之肽消化而衍生之市售的營養素複合混合物。添加大豆蛋白腖可得到最快生長及最高產量(30 YU/mL)。0.08 M丁二酸之使用展示較佳之緩衝能力。使細胞在30℃下生長歷時x軸上所指示之時間。

圖6展示培養基調配物研究之結果，其使用Guava技術測定細胞存活力。在30℃下於震盪燒瓶中生長表現銅可誘導之Aga2－HA之酵母菌株75－15。當將銅添加至培養物中時，Aga2－HA蛋白得以表現且其將出現於細胞表面上，此代表在表面上展示HA之酵母菌細胞的數目(陽性信號%)。亦可使用其他方法測定細胞存活力(例如，血球計或錐蟲藍)。用U2可觀察到最高信號，甚至在8 YU/mL之細胞密度下，其超過細胞傾向於減緩其生長速率之細胞密度。使用大豆蛋白腖之培養物展示明顯的細胞密度作用，其在高密度時展示蛋白下降。使用U4得到整體之低信號。此等結果亦證明偵測之可獲取性，此係歸因於pH值對細胞壁之作用及HA特異性抗體偵測表面表現蛋白之能力。

使用不同濃度之大豆蛋白腖進行其他實驗。圖7說明結果。未觀察到於0.5 g/l與1 g/l大豆蛋白腖之間的生長或pH值有差異。觀察到在U4－YNB培養基中比在U2培養基中更快速地生長。

實例8當酵母菌在中性pH值條件下生長時HA可獲取性之差異

使用不同pH值之培養基評估特定抗原對自諸如用於偵測之抗體的其他試劑之相互作用之可獲取性。圖8展示當酵母菌細胞在小於5之pH值下生長以及當酵母菌在高於6之pH值下生長時，來自完整酵母菌之可釋放之流感血球凝集素(HA)的免疫墨點檢定。如流式細胞儀染色所測定，在中性pH值下生長之酵母菌使得表面顯示之HA對於抗體偵測而言在表現HA之細胞數目與每個細胞HA之量方面更易獲取。此外，在中性pH值下生長之酵母菌更易於操縱以供藉由以二硫蘇糖醇(二硫鍵還原劑)處理來釋放以二硫鍵鍵結之HA。

實例9中性pH值對細胞因子產生之影響

使用裝載有在其中pH值維持或未維持在5.5以上的培養基中生長之YVEC酵母菌(未表現異源抗原)之樹突狀細胞(DC)來檢查在中性pH值下培養酵母菌對細胞因子產生之影響。藉由在37℃下在RPMI培養基中一起培育48h，以每個DC 10個酵母菌細胞裝載獲自小鼠骨髓之樹突狀細胞。隨後分析上清液之所分泌的細胞因子。圖9展示該等實驗之結果。下部圖片展示裝載有在中性pH值下(亦即至少5.5或更高)生長之酵母菌的樹突狀細胞之INF-γ分泌顯著增加，而當酵母菌在其中允許pH值降至低於5.5之培養基中生長時，無此現象發生。

圖1描述中等pH值對細胞生長之影響以及其對培養物之pH值的影響。

圖2描述中等pH值對細胞壁厚度之影響，藉由葡聚糖酶進行之溶胞作用。當密度增加時對照培養物(培養基pH約5.5)展示較低有效性之溶胞作用。燒瓶1=培養基pH 7.2，無緩衝液。燒瓶2=培養基pH 7.2，Bis-Tris緩衝液。燒瓶3=培養基pH 7.2，磷酸鹽緩衝液。

圖3描述在約6.5之pH值下測試不同緩衝劑之結果。展示對75-15細胞生長及培養物pH值之影響。

圖4描述各種緩衝劑對如由葡聚糖酶進行的溶胞作用所量測之細胞壁厚度的影響。使用丁二酸鹽或檸檬酸鹽來緩 衝培養基以將培養基緩衝至約6.5之pH值，藉由葡聚糖酶進行之溶胞作用。

圖5描述培養基調配物研究之結果，其中測試各種添加劑對生長及pH值的影響。

圖6描述作為培養基調配物研究之一部分的酵母菌細胞存活力之結果。使用流式細胞儀量測HA在酵母菌細胞表面上之表面表現。

圖7描述關於細胞生長及pH概況之培養基調配物研究之結果，其中測試各種添加劑。

圖8描述當酵母菌在中性pH條件下生長時對比當酵母菌在較低pH條件生長時，自展示血球凝集素(HA)可用性之差異之完整酵母菌的可釋放HA的免疫墨點檢定之結果。免疫墨點為來自YEX及GI-8103之DTT溶離液的西方墨點。

在pH 7而非pH<5下生長之細胞具有可由DTT釋放之糖基化表面HA圖9描述在中性及低pH值下培養酵母菌細胞對由已裝載有酵母菌細胞之樹突狀細胞進行的細胞因子之分泌的影響。

<110> 美商環球免疫公司<120> 製造以酵母菌為底之疫苗之改善方法<130> 595432001340 <140> 096103983 <141> 2007－02－02 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 609 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成建構體<400> 1 <210> 2 <211> 1833 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成建構體<400> 2

Claims (15)

1. 一種生長植酵母(Saccharomyces)之酵母菌之方法，其包含：在pH值維持在5.5與8之間的培養基中培養該酵母菌，使得該培養基之pH值不會降至低於5.5，其中該酵母菌表現異源抗原，且其中該酵母菌係在pH值在5.5與8之間培養至少3小時的時間。
2. 如請求項1之方法，其中該培養基之pH值維持在6與8之間。
3. 如請求項1或2之方法，其中該酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
4. 如請求項1或2之方法，其中該培養基係經緩衝劑來緩衝。
5. 如請求項1或2之方法，其中該培養基係經丁二酸鹽、丁二酸、Bis-Tris、檸檬酸鹽或磷酸鹽緩衝。
6. 如請求項1或2方法，其中該培養基係經丁二酸鹽或丁二酸緩衝。
7. 如請求項1或2之方法，其中該培養基額外含有大豆蛋白腖(soytone)。
8. 如請求項1或2之方法，其中該異源抗原係表現在該酵母菌之表面上。
9. 如請求項1或2之方法，其中該方法進一步包含凍乾該酵母菌。
10. 一種組合物，其包含藉由如請求項1或2之方法培養之酵 母菌，其係用於在個體中引發Th1型免疫反應，其中該酵母菌具有增進的細胞壁柔韌性、對細胞壁消化酶消化敏感及能誘發已暴露至該酵母菌的細胞分泌Th1型細胞因子之反應。
11. 一種如請求項10之組合物的用途，其係用於製造用於誘導Th1型反應之藥劑。
12. 如請求項11之用途，其中該組合物包含裝載有在中性pH值下培養之酵母菌的樹突狀細胞。
13. 如請求項11之用途，其中該Th1型反應包含干擾素γ產生。
14. 如請求項11之用途，其中該Th1型反應包含IL-12產生。
15. 一種製備植酵母之酵母菌組合物之方法，其包含：(a)在pH值維持在5.5與8之間的培養基中培養該酵母菌，因此該培養基之pH值不會降至低於5.5，其中該酵母菌表現異源抗原，且其中該酵母菌係在pH值在5.5與8之間培養至少3小時的時間；及(b)將包含該酵母菌的組合物與醫藥學上可接受之賦形劑及/或載劑調配成用於引發免疫反應以對抗疾病或病痛之預防劑或治療劑。