ES2289744T3 - Vehiculos de administracion a base de levaduras. - Google Patents

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A VEHICULOS DE LEVADURA Y A SU USO COMO COMO VEHICULOS DE SUMINISTRO.LOS VEHICULOS DE LEVADURA INCLUYEN UNA PARTE DE LEVADURA Y UN COMPUESTO HETEROLOGO. ESTOS VEHICULOS DE LEVADURA PUEDEN USARSE PARA PROTEGER ANIMALES DE LA ENFERMEDAD Y PARA LLEVAR COMPUESTOS A TIPOS DE CELULAS DADAS. EJEMPLOS DE VEHICULOS DE LEVADURA INCLUYEN VEHICULOS DE SUMINISTRO DE GENES, VEHICULOS DE SUMINISTRO DE MEDICAMENTOS Y VEHICULOS INMUNOMODULADORES. LOS VEHICULOS INMUNOMODULADORES SON CAPACES DE MODULAR UNA RESPUESTA INMUNE. CUANDO SE ESTIMULA UNA RESPUESTA INMUNE, ESTOS VEHICULOS DE LEVADURA PRODUCEN MEDIANTE LAS CELULAS UNA INMUNIDAD HUMORAL.

Description

Vehículos de administración a base de levaduras.
Esta invención se realizó al menos en parte con el apoyo del gobierno con el número de concesión AI 74747 concedido por el Instituto Nacional de la Salud. El gobierno tiene determinados derechos sobre esta invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vehículos de administración a base de levaduras y a su uso para administrar una variedad de compuestos a una variedad de tipos de células. Los vehículos de levadura de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, como vehículos de administración de fármacos, vehículos de administración de genes o vehículos de inmunomoduladores.
Antecedentes de la invención
Las vacunas son una de las medidas más rentables disponibles para la industria sanitaria. En ésta sigue habiendo, sin embargo, una necesidad urgente de desarrollar vacunas y adyuvantes seguros y eficaces para una variedad de enfermedades, incluyendo las debidas a infección por agentes patógenos, cánceres, defectos genéticos y otros trastornos del sistema inmunitario. Rabinovich et al., 1994, Science 265, 1401-1404, por ejemplo, exponen que todavía existe una necesidad de vacunas seguras y termoestables que puedan administrarse por vía oral y que necesitan administrarse solamente unas pocas veces, preferiblemente temprano en la vida. También se prefieren vacunas combinadas que puedan proteger a los individuos de más de una enfermedad, así como vacunas que no requieran un adyuvante y que puedan provocar inmunidad mucosa. Hasta la fecha muy pocas vacunas, si es que alguna, satisfacen todos estos
criterios.
Las vacunas de subunidades, el desarrollo de las cuales se hizo posible mediante la tecnología de ADN recombinante, han sido decepcionantes hasta la fecha ya que muestran solamente inmunogenicidad limitada. Un ejemplo son las pruebas clínicas recientes de varias vacunas de subunidades frente al VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) que se han parado debido no solamente a la eficacia limitada de las vacunas sino también porque en algunos casos los individuos inmunizados mostraban una progresión de la enfermedad acelerada cuando se exponían posteriormente al VIH; véase, por ejemplo, Cohen, 1994, Science 264, 1839; y Cohen, 1994, Science 264, 1660. Una desventaja de las vacunas de subunidades, así como de las vacunas de virus vivos recombinantes y de virus destruidos, es que mientras que parecen estimular una fuerte respuesta inmunitaria humoral, no provocan inmunidad celular protectora. Una conclusión principal de la International AIDS Conference (conferencia internacional del SIDA) de 1994 fue que sigue habiendo una necesidad de una respuesta mediada por células T citotóxicas para evitar, o reducir, la infectividad del VIH, que hasta la fecha falta en las vacunas en la práctica clínica. Además, las vacunas frente al VIH sometidas a prueba hasta la fecha no provocan inmunidad en las superficies mucosas en las que se produce la infección por VIH primaria.
Además, los únicos adyuvantes aprobados para su uso en los Estados Unidos son las sales de aluminio hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, ninguna de las cuales estimula la inmunidad mediada por células. Además, las formulaciones de sales de aluminio no pueden congelarse ni liofilizarse, y tales adyuvantes no son eficaces con todos los antígenos.
Se han usado levaduras en la producción de vacunas proteicas de subunidades, incluyendo algunas de las sometidas a prueba en los ensayos de vacunas frente al VIH mencionados anteriormente. También se han suministrado levaduras a animales antes de la inmunización para intentar introducir la respuesta inmunitaria de una manera no específica (es decir, estimular la fagocitosis así como la producción del complemento e interferón). Los resultados han sido ambiguos, y tales protocolos no han generado inmunidad celular protectora; véase, por ejemplo, Fattal-German et al., 1992, Dev. Biol. Stand. 77, 115-120; Bizzini et al., 1990, FEMS Microbiol. Immunol. 2, 155-167.
Además de las vacunas, muchos tratamientos de fármacos y genes requieren vehículos de administración eficaces y específicos para garantizar el mayor beneficio posible. La falta de un vehículo de administración adecuado es una barrera principal para la aplicación de terapia génica y limita de manera significativa el potencial terapéutico de muchos fármacos. Por ejemplo, informes recientes han indicado que los vectores adenovirus, que se están sometiendo a prueba en la actualidad en la práctica clínica para determinar aplicaciones de terapia génica, estimulan respuestas inflamatorias e inmunitarias indeseables y no parecen integrarse de una manera deseada; véase, por ejemplo, Engelhardt et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 1217-1229 y bibliografía citada en el mismo.
Como tal, sigue habiendo una necesidad de composiciones que modulen de manera eficaz la inmunidad, para estimular una respuesta inmunitaria, tal como en el caso de una vacuna, o bien para suprimir una respuesta inmunitaria indeseable, tal como una respuesta autoinmunitaria o una respuesta inflamatoria excesiva. También sigue habiendo una necesidad de vehículos de administración de fármacos y genes mejorados.
La presente invención incluye el descubrimiento sorprendente de que los compuestos portados por levaduras desencadenan inmunidad mediada por células, sin la necesidad de un adyuvante. Como tal, la presente invención incluye vacunas basadas en levaduras que satisfacen los criterios mencionados en la sección de antecedentes. Es decir, los vehículos de levadura de la presente invención que comprenden levaduras no patógenas que portan al menos un compuesto que puede modular una respuesta inmunitaria:
a)
son eficaces para estimular inmunidad mediada por células, así como humoral;
b)
son seguros;
c)
tienen larga caducidad (es decir, son estables en almacenamiento durante largos periodos de tiempo);
d)
pueden administrarse por vía oral;
e)
requieren muy pocas, si es que alguna, inmunizaciones de refuerzo;
f)
pueden ser vacunas combinadas porque pueden modificarse para portar múltiples compuestos;
g)
no requieren un adyuvante; y
h)
pueden provocar inmunidad en las superficies mucosas.
Según la presente invención, se proporciona el uso en la fabricación de una vacuna para la modulación de una respuesta inmunitaria mediada por células o una respuesta humoral en un animal, de un vehículo de levadura seleccionado de un microorganismo de levadura, un esferoplasto de levadura, un citoplasto de levadura, o una envuelta de levadura, portando dicha levadura al menos un compuesto heterólogo que comprende un antígeno o una citocina o una combinación de los mismos.
Los vehículos de levadura pueden administrar compuestos a un tipo de células que puede adsorber levadura o bien pueden modificarse para administrar de manera selectiva los compuestos a los tipos de células deseados.
Los compuestos heterólogos preferidos a incluir en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico, péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, compuestos protectores inorgánicos, otros compuestos protectores orgánicos y mezclas de tales compuestos. Los vehículos de levadura de la presente invención pueden incluir compuestos heterólogos que protegen a los organismos de una variedad de enfermedades, dependiendo de la naturaleza del compuesto, incluyendo defectos genéticos, enfermedades provocadas por agentes infecciosos y otros trastornos metabólicos.
Los vehículos de levadura preferidos de la presente invención pueden modular la respuesta inmunitaria de un organismo. Tales vehículos de levadura pueden diseñarse para estimular una respuesta inmunitaria protectora o bien para suprimir una respuesta inmunitaria perjudicial. Tales vehículos de levadura son particularmente útiles porque estimulan respuestas inmunitarias mediadas por células así como respuestas inmunitarias humorales.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 incluye gráficos que representan la proliferación in vitro de células T aisladas de ratones a los que se administraron vehículos de levadura de la presente invención.
La figura 2 representa una inmunotransferencia tipo Western de sueros aislados de ratones a los que se administraron vehículos de levadura de la presente invención.
La figura 3 incluye gráficos que representan la destrucción selectiva por células T citotóxicas generadas de ratones a los que se administraron vehículos de levadura de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención incluye vehículos de administración a base de levaduras (también denominados en el presente documento vehículos de levadura) y su uso para la administración in vitro, ex vivo y/o in vitro de compuestos a las células. Que los vehículos de levadura sean vehículos de administración particularmente útiles con determinadas ventajas no compartidas por otros vehículos de administración es un aspecto sorprendente de la presente invención, y los inventores no tienen conocimiento de ningún uso de levaduras como vehículos de administración anterior a la presente invención.
Los vehículos de administración a base de levaduras de la presente invención tienen varias ventajas que incluyen, pero no se limitan a, facilidad de manipulación usando técnicas genéticas clásicas y/o recombinantes, capacidad para dirigir compuestos a células que adsorben de manera natural células de levadura y capacidad para modificar mediante ingeniería genética levaduras para dirigir compuestos a otros tipos de células deseados. En una realización preferida, tales vehículos de levadura pueden unirse y fusionarse con el tipo de célula deseado para formar sincitios, administrando así el compuesto de una manera eficaz a un alto porcentaje de células seleccionadas como diana. Las cepas de levaduras no patógenas también representan vehículos de administración seguros, y se han designado varias cepas de levaduras, incluyendo Saccharomyces cerevisiae, por la Food and Drug Administration de los EE.UU. como que son GRAS (es decir, Generally Recognized as Safe, (generalmente reconocidas como seguras)) para su uso en productos alimenticios. Los vehículos de levadura de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de vías, tal como se discute en detalle más adelante, incluyendo por vía oral.
Los vehículos de levadura son también ventajosos porque pueden portar uno o más compuestos y pueden modificarse mediante ingeniería genética para portar una o más moléculas de ácido nucleico que pueden efectuar terapia génica y/o codificar una o más proteínas y/o moléculas de ARN. Un vehículo de levadura puede portar un compuesto dentro del vehículo de levadura, sobre la superficie de la membrana de la levadura, extendiéndose por la membrana de la levadura, en el periplasma de la levadura y combinaciones de los mismos. Como tal, al menos algo del compuesto permanece asociado al vehículo de levadura al menos hasta que el vehículo alcanza su diana o sitio de acción (por ejemplo, el torrente sanguíneo, el tejido intersticial o una célula), momento en el que también es posible que un compuesto portado por la levadura pueda liberarse, al menos en parte (por ejemplo, filtrarse) a partir del vehículo.
Una ventaja particularmente sorprendente, así como muy significativa de un vehículo de levadura de la presente invención es que, cuando se usa en una realización para modular (es decir, regular) la respuesta inmunitaria, la administración a un animal de un vehículo de levadura que porta antígeno induce al animal para que produzca una respuesta inmunitaria mediada por células así como humoral frente a ese antígeno, sin provocar además aparentemente efectos secundarios perjudiciales. Tal propiedad se ha buscado sin un gran éxito usando microorganismos muertos (por ejemplo, bacterias o virus), vacunas de subunidades, vacunas portadas en vehículos virales o bacterianos, y vacunas que incluyen un adyuvante. Aunque no se está limitado por la teoría, se cree que la parte de levadura del vehículo de levadura está actuando como un adyuvante para estimular la inmunidad en respuesta al antígeno y que debido a que la levadura está portando realmente el antígeno, la levadura puede efectuar inmunidad mediada por MHC de clase I (tal como se muestra, por ejemplo, mediante la producción de células T citotóxicas que pueden seleccionar como diana el antígeno) así como por MHC de clase II (tal como se muestra, por ejemplo, mediante la producción de anticuerpos) frente al antígeno. Debe observarse que, tal como se usa en el presente documento, un antígeno se refiere a cualquier compuesto que pueda producir una respuesta inmunitaria cuando se administra a un organismo, que conduce preferiblemente a una respuesta protectora. Los antígenos pueden incluir inmunógenos y tolerágenos.
Además, los vehículos de levadura de la presente invención no provocan aparentemente efectos secundarios significativos tal como otros adyuvantes acompañantes. Incluso los ratones inmunodeficientes (por ejemplo, SCID) a los que se administra un vehículo de levadura de la presente invención que comprende un gen gp160 de VIH insertado dentro de una cepa de levadura S. cerevisiae, no se ven afectados adversamente por el vehículo de levadura. Este hallazgo es particularmente relevante para el uso de los vehículos de levadura de la presente invención para proteger individuos inmunodeficientes así como inmunocompetentes de la enfermedad.
Además, tal como se analizará en detalle más adelante, los vehículos de levadura de la presente invención pueden modular una respuesta inmunitaria no sólo para estimular (es decir, provocar, producir y/o potenciar) una respuesta inmunitaria protectora sino también para suprimir (es decir, reducir, inhibir, bloquear) una respuesta inmunitaria sobreactiva o dañina. Dependiendo de cómo se modifican, los vehículos de levadura de la presente invención también pueden potenciar preferentemente, o amplificar, la inmunidad mediada por células en comparación con inmunidad humoral o viceversa.
Debe observarse que el término "un" o "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad. Como tal, pueden usarse los términos "un" (o "una"), "uno/a o más" y "al menos uno/a" de manera intercambiable en el presente documento. Según la presente invención, la parte de levadura del vehículo porta un compuesto, una característica a la que también se hace referencia en el presente documento como que el vehículo de levadura porta el compuesto. El compuesto portado por el vehículo de levadura (más específicamente por la parte de levadura) es heterólogo para la parte de levadura del vehículo, lo que significa que el compuesto deriva de una especie o subespecie de levadura u otro organismo que es diferente de la cepa (es decir, especie, subespecie) de levadura usada en la producción de la parte de levadura del vehículo. Un compuesto de este tipo comprende un antígeno y/o una citocina no encontrada de manera natural en la cepa de levadura usada en la producción del vehículo y, en una realización preferida, puede ser una molécula de ácido nucleico que es heteróloga para la cepa de levadura usada en la producción del vehículo, y/o un compuesto codificado por una molécula de ácido nucleico de este tipo (por ejemplo, una molécula de ARN o una proteína).
Tal como se usa en el presente documento, un vehículo de levadura de la presente invención incluye tanto una parte de levadura como un compuesto que es portado por la parte de levadura. Una parte de levadura de un vehículo de levadura de la presente invención se refiere a cualquier cepa o derivado de levadura y comprende un microorganismo de levadura (es decir, una célula de levadura que tiene todos sus componentes incluyendo una pared celular), un esferoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de una pared celular), un citoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de pared celular y núcleo) o una envuelta de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de pared celular, núcleo y citoplasma). Las envueltas de levadura se producen normalmente volviendo a sellar una célula lisada o permeabilizada y puede contener, pero no necesariamente, al menos alguno de los orgánulos de esa célula.
Puede usarse cualquier cepa de levadura para producir un vehículo de levadura de la presente invención. Las levaduras son microorganismos unicelulares que pertenecen a una de tres clases: Ascomycetes, Basidiomycetes y Fungi Imperfecti. Aunque se han usado en el pasado cepas de levaduras patógenas, o mutantes no patógenos de las mismas como adyuvantes o como modificadores de la respuesta biológica y pueden usarse según la presente invención, se prefieren cepas de levadura no patógenas. Los géneros preferidos de cepas de levadura incluyen Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia, prefiriéndose más Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia y Schizosaccharomyces, y siendo Saccharomyces particularmente preferido. Las especies preferidas de las cepas de levadura incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Debe apreciarse que varias de estas especies incluyen una variedad de subespecies, tipos, subtipos, etc. que se supone que se incluyen dentro de las especies mencionadas anteriormente. Las especies de levadura más preferidas incluyen S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris y S. pombe. Se prefiere particularmente S. cerevisiae debido a que es relativamente fácil de manipular y que es GRAS. Una realización de la presente invención es una cepa de levadura que puede replicar plásmidos en un número de copias relativamente alto, tal como la cepa cirº de S. cerevisiae.
Una enfermedad puede referirse a cualquier desviación de la salud normal de cualquier parte de un animal y como tal puede incluir estados en los que se manifiestan los síntomas de la enfermedad así como estados en los que se ha producido una desviación (por ejemplo, infección, mutación génica, etc) pero todavía no se manifiestan los síntomas. Los vehículos de levadura de la presente invención son particularmente útiles como vehículos para administrar compuestos para combatir una o más enfermedades que aquejan a un animal. Los ejemplos de enfermedades de las cuales proteger a un animal incluyen, pero no se limitan a, infecciones, defectos genéticos y otros trastornos metabólicos. Tales clases de enfermedades pueden conducir a crecimiento celular anómalo (por ejemplo, neoplasia benigna o maligna, síndromes hiperplásicos), procesos degenerativos y/o defectos inmunológicos así como a varias otras enfermedades.
Un agente infeccioso puede ser cualquier agente que pueda infectar a un animal y provocar enfermedad. Tal enfermedad puede desarrollarse rápidamente o después de un largo periodo de tiempo. Los agentes infecciosos adecuados contra los cuales proteger animales usando los vehículos de levadura de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, viroides, priones, virus, bacterias, hongos (incluyendo levaduras), protozoos (por ejemplo, amebas, flagelados y esporozoos), helmintos y ectoparásitos. Está dentro del alcance de la presente invención proteger a un animal frente a más de un agente infeccioso. También debe observarse que aunque algunos agentes infecciosos no se han clasificado dentro de uno de estos grupos de manera definitiva, tales agentes infecciosos se incluyen también en la presenente invención.
Los vehículos de levadura preferidos pueden proteger a un animal de la infección mediante agentes infecciosos que dañan, por ejemplo, los sistemas auditivo, dérmico, entérico, inmunitario, neurológico, oral/dental, reproductor, respiratorio y/o urinario de los animales. Tales agentes infecciosos incluyen, pero no se limitan a, adenovirus, arenavirus, bunyavirus, coronavirus, hepadnavirus, herpesvirus, mixovirus, virus oncogénicos, ortomixovirus, papovarivus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus, virus de la rabia, reovirus, rabdovirus, virus Rubella, togavirus, virus vegetales, Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma y Vibriocholerae así como otros agentes infecciosos que provocan infecciones oportunistas en animales que son inmunodeficientes o están inmunodeprimidos de otra manera. Los agentes infecciosos preferidos adicionales incluyen otros microorganismos dañinos encontrados en agua salobre, contaminantes de alimentos y heridas.
Los virus preferidos de los cuales proteger a los animales usando vehículos de levadura de la presente invención incluyen virus de Coxsackie, citomegalovirus, virus de Epstein-Barrr, flavivirus, virus de la hepatitis, herpesvirus, virus de la gripe, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma, virus de parainfluenza, parvovirus, virus de la rabia, virus sincitial respiratorio, retrovirus y virus de la varicela.
Se prefieren más los retrovirus, herpesvirus y virus de la hepatitis, siendo incluso más preferidos los virus de la leucemia, linfotróficos, del sarcoma y lentivirus, tal como lo son otros virus de inmunodeficiencia o tumorales. Los virus linfotróficos particularmente preferidos de los cuales proteger a los animales incluyen virus T-linfotróficos, tales como virus linfotróficos de células T humanas (HTLV, tal como HTLV-I y HTLV-II), virus de la leucemia bovina (VLB) y virus de la leucemia felina (VLF). Los lentivirus particularmente preferidos incluyen virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de simios (VIS), felina (VIF) y canina (VIC), siendo incluso más preferidos VIH-1 y VIH-2.
Los vehículos de levadura de la presente invención pueden transferir una molécula de ácido nucleico que comprende un gen, o una parte del mismo, a un tipo celular apropiado con el fin de corregir un defecto genético. Tal como se usa en el presente documento, los defectos genéticos incluyen mutaciones que afectan a la línea germinal así como mutaciones somáticas, tales como las que provocan muchas formas de cáncer así como enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos inmunodeficientes. Los vehículos de levadura de la presente invención pueden usarse para corregir cualquier defecto genético usando la propensión natural de las levaduras por determinados tipos celulares y/o, de manera apropiada, dirigiendo los vehículos de levadura a tipos celulares adicionales. Los defectos genéticos de los que proteger a los animales incluyen, pero no se limitan a, trastornos del factor sanguíneo, cánceres ligados a un defecto genético (incluyendo activación de oncogenes, pérdida de la función del gen supresor de tumores), fibrosis quística, enfermedad de Gaucher, hemoglobinopatías (tales como talasemias y anemia depranocítica), hipercolesterolemia, síndrome de Lesch Nyhan, distrofia muscular, trastornos de proteínas señalizadoras, enfermedad de Tay Sachs y combinaciones de tales defectos (es decir, mezclas o combinaciones de los mismos). Tal como se usa en el presente documento, la terapia génica incluye procedimientos para "activar" la expresión de genes deseados así como procedimientos para "desactivar" la expresión de genes dañinos. Como tal, la terapia génica incluye la introducción de regiones reguladoras y/o regiones codificantes en tipos celulares deseados con el fin de corregir defectos genéticos que resultan de la desregulación de la expresión génica así como de la pérdida de regiones codificantes funcionales.
Las enfermedades adicionales de las cuales proteger a un animal usando un vehículo de levadura de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, alergias, anemias, enfermedades autoinmunitarias, (por ejemplo, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide), cánceres, enfermedades cardiovasculares, enfermedad del injerto frente al huésped (EIFH), trastornos hematopoyéticos, enfermedades inmunodeficientes, enfermedades inmunoproliferativas, trastornos inmunosupresores, enfermedades inflamatorias, ictericia, trastornos mielosupresores, rechazo de aloinjertos o xenoinjertos, choque séptico, otros defectos inmunológicos y combinaciones de los mismos. Muchas de estas enfermedades pueden ser agudas o crónicas. Los ejemplos de enfermedades particulares de las cuales pueden protegerse los animales usando vehículos de levadura de la presente invención se describen en el presente documento. Debe indicarse que tales ejemplos están pensados sólo como tales y no limitan la amplia variedad de enfermedades contra las cuales los vehículos de levadura diseñados apropiadamente de la presente invención pueden proteger a animales.
Debe indicarse que cuando se usan vehículos de levadura vivos, es importante seleccionar compuestos heterólogos que no dañen sustancialmente a la levadura.
Puede lograrse la transformación de una molécula de ácido nucleico dentro de una célula de levadura mediante cualquier procedimiento por el cual una molécula de ácido nucleico puede insertarse dentro de la célula. Las técnicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. Las moléculas de ácido nucleico transformadas pueden integrarse dentro de un cromosoma de levadura o mantenerse en vectores extracromosómicos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos de vehículos de levadura que portan tales moléculas de ácido nucleico se describen en detalle en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un péptido comprende una secuencia de aminoácidos inferior o igual a aproximadamente 30 aminoácidos, mientras que una proteína comprende una secuencia de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos; las proteínas pueden ser multiméricas. Los péptidos y proteínas pueden derivatizarse de manera natural o bien sintética; tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, glicosilación, fosforilación, acetilación, miristilación, prenilación, palmitoilación, amidación y/o adición de glicerofosfatidilinositol. Los péptidos y proteínas pueden insertarse directamente dentro de los vehículos de levadura de la presente invención mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como electroporación, fusión de liposomas o sonicación en baño, o pueden producirse mediante moléculas de ácido nucleico transformadas en vehículos de levadura tal como se describió en el presente documento. Los péptidos y proteínas pueden ser de varios tipos, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, enzimas, proteínas reguladoras y toxinas.
Debe entenderse que los vehículos de levadura cargados incluyen vehículos de levadura dentro de los cuales se insertan moléculas de ácido nucleico, péptidos y/o proteínas usando técnicas conocidas tales como las descritas anteriormente.
Los antígenos preferidos a incluir como compuestos en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen antígenos virales, moléculas de superficie de células de mamíferos, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos de protozoos, antígenos de helmintos, antígenos de ectoparásitos y/o antígenos cancerígenos. Los compuestos particularmente preferidos a incluir en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen antígenos virales, antígenos cancerígenos, receptores de superficie de células de mamíferos y ligandos de tales receptores, así como moléculas de ácido nucleico que codifican tales compuestos y/o oligonucleótidos que bloquean la producción de tales compuestos.
Los compuestos preferidos a incluir en tales vehículos de levadura son antígenos virales tales como proteínas de la superficie viral y/o proteínas del núcleo viral (incluyendo proteínas estructurales y no estructurales), y/o moléculas de ácido nucleico que codifican para tales antígenos y/o oligonucleótidos que pueden bloquear la producción de tales antígenos. Los antígenos virales particularmente preferidos (o moléculas de ácido nucleico correspondientes a los mismos) incluyen los de virus tumorales y/o de inmunodeficiencia, y más preferiblemente los de VIH (por ejemplo VIH-1 o VIH-2), HTLV (por ejemplo, HTLV-I o HTLV-II), VIF o VLF.
Los ejemplos de antígenos virales que han de usarse en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las proteínas de la nucleocápsida env, gag, rev, tar, tat y la transcriptasa inversa de virus de inmunodeficiencia (por ejemplo, VIH, VIF); antígeno de superficie y antígeno del núcleo de VHB, antígenos de VHC, proteínas de la nucleocápsida del virus de la gripe; proteínas de la nucleocápsida del virus de parainfluenza; proteínas tipo E6 y E7 del virus del papiloma humano; LMP-1, LMP-2 y EBNA-2 del virus de Epstein-Barr, LAA y glicoproteína D del herpesvirus; así como proteínas similares de otros virus.
Los ejemplos de antígenos cancerígenos que han de usarse en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen pero no se limitan a, MAGF, PSA, CEA, HER2/nev, MART1, BCR-abl y formas oncogénicas mutantes de p53, ras, myc y RB-1.
Los ejemplos de moléculas de superficie de células de mamíferos que han de usarse en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen antígenos del CMH, anticuerpos y receptores de células T así como otros receptores y sus ligandos, tales como Fas, ligandos de Fas, ICAM-1, LFA-1, NCAM, selectina P y VCAM.
Otros compuestos antigénicos preferidos a incluir en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen compuestos que son antígenos derivados de agentes infecciosos adecuados y preferidos tal como se describió anteriormente así como compuestos que están ligados a enfermedades adicionales tal como se describió anteriormente, tales como antígenos tumorales. Los compuestos preferidos adicionales son compuestos (incluyendo compuestos proteínicos) que pueden suprimir una respuesta inmunitaria no deseada, o dañina, tal como la provocada, por ejemplo, por alérgenos, antígenos autoinmunitarios, agentes inflamatorios, antígenos implicados en EIFH, determinados cánceres, antígenos de choque séptico y antígenos implicados en el rechazo de trasplantes. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, antihistaminas, ciclosporina, corticosteroides, FK506, péptidos correspondientes a receptores de células T implicados en la producción de una respuesta inmunitaria dañina, ligandos de Fas (es decir, compuestos que se unen a receptores Fas celulares, induciendo de ese modo la apoptosis), complejos del CMH adecuados presentados de manera que efectúan tolerancia o anergia, receptores de células T y antígenos autoinmunitarios, preferiblemente en combinación con un modificador de la respuesta biológica que puede potenciar o suprimir la inmunidad celular y/o humoral. También se incluyen como compuestos preferidos moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente que son proteicos.
Tal como se usa en el presente documento, los compuestos que pueden modular una respuesta inmunitaria son compuestos que, particularmente cuando se administran como parte de un vehículo de levadura, pueden regular una respuesta inmunitaria con el fin de estimular una respuesta inmunitaria deseada (es decir, protectora) o de suprimir una respuesta inmunitaria que es dañina (es decir, que daña, perjudicial) para el organismo. La modulación también incluye la capacidad de cambiar entre respuestas inmunitarias principalmente humorales. Los vehículos de levadura se ajustan bien para usarse para modular una respuesta inmunitaria particularmente a la luz del descubrimiento de los inventores de que los vehículos de levadura de la presente invención pueden estimular la inmunidad humoral así como la mediada por células. Aunque se desconoce todavía por qué los compuestos antigénicos portados por los vehículos de levadura se procesan a través de la ruta basada en el CMH de clase I, la identificación de que los vehículos de levadura pueden estimular la inmunidad mediada por células es bastante ventajosa.
Los vehículos de levadura de la presente invención también pueden incluir compuestos modificadores de la respuesta biológica, o la capacidad de producir tales modificadores (es decir, portando genes que codifican tales modificadores). Se prefieren vehículos de levadura que incluyan al menos un antígeno y al menos un compuesto modificador de la respuesta biológica. Los modificadores de la respuesta biológica son compuestos que pueden modular las respuestas inmunitarias. Determinados modificadores de la respuesta biológica pueden estimular una respuesta inmunitaria protectora mientras que otros pueden suprimir una respuesta inmunitaria dañina. Determinados modificadores de la respuesta biológica potencian preferentemente una respuesta inmunitaria mediada por células mientras que otros potencian preferentemente una respuesta inmunitaria humoral (es decir, pueden estimular una respuesta inmunitaria en la que hay un nivel aumentado de inmunidad celular comparada con la humoral, o viceversa). Existen varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica para medir la estimulación o supresión de las respuestas inmunitarias, así como para diferenciar las respuestas inmunitarias celulares de las respuestas inmunitarias humorales.
Los modificadores de la respuesta biológica adecuados incluyen citocinas y otros moduladores del crecimiento, tales como, pero sin limitarse a, interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interferón gamma (IFN-gamma), factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) y/o factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta). La capacidad de un vehículo de levadura de expresar (es decir, de producir), y preferiblemente secretar IL-2, IL-12 y/o IFN-gamma potencia preferentemente la inmunidad mediada por células, mientras que la capacidad de un vehículo de levadura de expresar, y preferiblemente secretar IL-4, IL-5 y/o IL-10 preferentemente potencia la inmunidad humoral.
Una ventaja de la presente invención es que los vehículos de levadura de la presente invención pueden seleccionar como diana tipos de células deseadas, administrando de ese modo los compuestos esencialmente sólo en un subconjunto seleccionado de todos los tipos de células. Es decir, los vehículos de levadura pueden administrar sus compuestos a un tipo de célula deseada, pero esencialmente no a otros tipos de células, basándose, por ejemplo, en la capacidad del vehículo de levadura para reconocer moléculas de la superficie celular que están presentes sobre el tipo de célula deseada (es decir, tipo de célula seleccionada como diana) pero no están ausentes esencialmente de otros tipos de células (es decir, tipos de células no seleccionadas como diana). Es decir, el vehículo de levadura puede reconocer selectivamente el tipo celular seleccionado. En una realización, la capacidad inherente de las células de levadura que han de adsorberse por determinados tipos de células se basa en administrar compuestos portados por los vehículos de levadura de la presente invención a tales tipos de células. Tal como se usa en el presente documento, el término adsorber se refiere a la capacidad de un tipo de célula dada de captar vehículos de levadura de la presente invención mediante, por ejemplo, endocitosis o fagocitosis. En otra realización, los vehículos de levadura se modifican mediante ingeniería genética para dirigir compuestos a una variedad de tipos de células adicionales.
Tal como se usa en el presente documento, un tipo de célula se refiere a una clase de células (por ejemplo, linfocitos, células musculares, células epiteliales, etc) y pueden incluir células únicas, agregados de células, tejidos y órganos. El compuesto, que es portado por la parte de levadura del vehículo, es heterólogo para la parte de levadura. Se describen hasta el momento en el presente documento varios compuestos adecuados y preferidos.
A menos que se modifiquen para efectuar otra cosa, los vehículos de levadura de la presente invención pueden administrar compuestos a tipos de células que adsorben levaduras de manera natural. Los tipos de células seleccionadas como diana de manera natural incluyen, pero no se limitan a, células del linaje granulocítico-monocítico, linfocitos B y linfocitos T. Los ejemplos de células del linaje granulocítico-monocítico incluyen, pero no se limitan a, células dendríticas, histiocitos, células de Kupffer, células de Langerhans, otros macrófagos (incluyendo macrófagos alveolares, libres del bazo y fijados), microglía, neutrófilos, osteoclastos y células reticulo-endoteliales. Estos vehículos de levadura son particularmente preferidos para la estimulación de la inmunidad mucosa dado que estos vehículos pueden seleccionar como diana células ubicadas en las regiones epiteliales de un animal. Como tales, estos vehículos de levadura son particularmente adecuados para proteger animales de enfermedades que afectan a los tejidos epiteliales, tales como infecciones virales y cánceres epiteliales, incluyendo, pero sin limitarse a, cánceres cervicales, de colon y determinados cánceres de pulmón.
Los vehículos de levadura adicionales de la presente invención se modifican para administrar compuestos a uno o más tipos de células. Tales vehículos de levadura incluyen un componente heterólogo colocado sobre la membrana externa del vehículo de levadura (es decir, completamente sobre la membrana externa del vehículo de levadura o al menos parcialmente embebido dentro de la membrana) de tal manera que el componente puede dirigir (es decir, administrar selectivamente) el vehículo de levadura al/a los tipo(s) de células dadas. Tales componentes son de una especie o tipo que es diferente de la especie o subespecie de levadura usada en la producción del vehículo. Un componente heterólogo preferido es un componente de unión de un elemento (tal como un receptor, antígeno u otra entidad de la superficie celular) colocado sobre la superficie del tipo de célula dada que se está seleccionando como diana para la administración. Un elemento de este tipo está preferiblemente ausente de, o se encuentra sólo en pequeñas cantidades, en tipos de células que no se seleccionan como diana para la administración.
Los tipos de células preferidos para seleccionar como diana usando los vehículos de levadura que contienen el componente heterólogo de la presente invención incluyen células del tejido conjuntivo, células dendríticas, células endoteliales, células epiteliales, células de origen granulocítico-monocítico, células madre hematopoyéticas, hepatocitos, linfocitos, mioblastos, miocitos, neuronas, neutrófilos, pneumocitos, timocitos y combinaciones de los mismos. Las células epiteliales preferidas para seleccionar como diana incluyen células epiteliales genitales, intestinales, renales, mucosas y pulmonares. Los linfocitos preferidos para seleccionar como diana incluyen linfocitos B y linfocitos T. Los tipos de células particularmente preferidas para seleccionar como diana incluyen células que expresan los marcadores celulares CD4 o CD8 sobre sus superficies celulares, siendo incluso más preferidas las células que expresan CD4. Las células que tienen marcadores celulares CD4 incluyen células T cooperadoras, macrófagos y células reticulo-endoteliales; las células que tienen marcadores celulares CD8 incluyen células T citotóxicas.
Los componentes heterólogos para incluir en los vehículos de levadura de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que se unen selectivamente a elementos encontrados sobre la superficie de determinados tipos de células, asialoglicoproteínas (glicoproteínas que carecen de grupos de ácido siálico), proteínas c3d del complemento, ligandos de Fas, fusógenos, receptores de células T, otros receptores, ligandos de receptores (por ejemplo antígenos, citocinas y factores de crecimiento), transferrinas, proteínas de superficie virales (por ejemplo, proteínas virales que permiten a los virus infectar a sus respectivas células huésped), otras proteínas de la superficie celular, y mezclas de las mismas. Los componentes heterólogos preferidos incluyen anticuerpos, ligandos de Fas, ligandos de receptores y pro-
teínas de superficie virales, siendo particularmente preferidos los ligandos de Fas y las proteínas de superficie virales.
En una realización preferida, un vehículo de levadura que tiene un componente heterólogo que selecciona como diana un tipo de célula seleccionada puede producir (es decir, expresar) ese componente y colocar el componente sobre la membrana externa del vehículo de una manera adecuada para dirigir el vehículo a un tipo de célula deseada. Un vehículo de levadura de este tipo es un vehículo que está transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica el componente. La molécula de ácido nucleico está situada en el vehículo de levadura de tal manera que el componente puede expresarse por el vehículo de levadura; por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está operativamente unida (es decir, conectada) a una secuencia control de la transcripción. Se describen en el presente documento procedimientos para expresar moléculas de ácido nucleico heterólogas en vehículos de levadura.
Un vehículo de levadura preferido de la presente invención puede fusionarse con el tipo de célula al cual se está administrando un compuesto portado por el vehículo, efectuando de ese modo una administración particularmente eficaz del compuesto al tipo de célula. Un vehículo de levadura de este tipo incluye un componente heterólogo que puede efectuar la fusión con la membrana celular del tipo de célula seleccionada como diana. Tal como se usa en el presente documento, la fusión de un vehículo de levadura con un tipo de célula seleccionada como diana se refiere a la capacidad de la membrana celular de la levadura para fusionarse con la membrana del tipo de célula seleccionada como diana, conduciendo a la formación de sincitios. Tal como se usa en el presente documento, un sincitio es una masa multinucleada de protoplasmas producida por la fusión de células. Se ha mostrado que varias proteínas de superficie virales (incluyendo las de virus de inmunodeficiencia tales como VIH, virus de la gripe, poliovirus y adenovirus) y otros fusógenos (tales como los implicados en fusiones entre óvulos y esperma) pueden efectuar fusión entre dos membranas (es decir, entre membranas celulares de mamíferos y virales o entre membranas celulares de mamíferos). Por ejemplo, un vehículo de levadura que produce un componente heterólogo gp120/gp41 de VIH sobre su superficie puede fusionarse con un linfocito T CD4+. Está dentro del alcance de la presente invención aumentar el número de componentes heterólogos que pueden usarse en la producción de vehículos de levadura que pueden fusionarse con un tipo de célula dada produciendo un complejo entre un componente heterólogo que por sí mismo no puede fusionarse y un componente que puede inducir la fusión, tal como enganchando la transferrina a la proteína gp41 de VIH.
En una realización, una cepa de levadura se modifica mediante ingeniería genética para seleccionar como diana células seleccionadas como diana de manera natural por otras cepas de levadura o para preparar vacunas contra determinadas cepas de levadura patógenas. Por ejemplo, pueden modificarse mediante ingeniería genética moléculas de ácido nucleico que codifican antígenos de Candida o Chlamydia dentro de una cepa de S. cerevisiae de modo que se expresan los antígenos de Candida o Chlamydia y se incorporan dentro de la membrana de S. cerevisiae. El vehículo de levadura resultante, cuando se administra a un animal, puede estimular una respuesta inmunitaria protectora, incluyendo una respuesta inmunitaria mediada por células así como humoral frente, respectivamente, infección por Candida o Chlamydia.
Los vehículos de levadura de la presente invención pueden producirse usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los vehículos de levadura pueden cargarse con compuestos usando una variedad de técnicas adecuadas para el/los compuesto(s) que se está(n) cargando. Por ejemplo, tal como se ha descrito hasta el momento en el presente documento, pueden insertarse compuestos inorgánicos y varios compuestos orgánicos en los vehículos de levadura mediante difusión y/o transporte activo. Los péptidos y proteínas pueden cargarse en los vehículos de levadura mediante fusión de liposomas, electroporación o sonicación en baño.
Los vehículos de levadura preferidos de la presente invención son vehículos de levadura modificados mediante ingeniería genética (es decir, producidos de manera recombinante). Tales vehículos están transformados con una o más moléculas de ácido nucleico que pueden codificar ARN, péptidos o compuestos proteicos de la presente invención. Los vehículos de levadura también pueden estar transformados con moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas y/u otros factores permitiendo de ese modo que tales vehículos produzcan otros compuestos de la presente invención (por ejemplo, antibióticos o vitaminas). Determinados vehículos de levadura de la presente invención están transformados con una molécula de ácido nucleico que codifica un compuesto que va a administrarse a un organismo dado y con una molécula de ácido nucleico que codifica un componente heterólogo que puede dirigir el vehículo a un tipo de célula dada. En una realización, el compuesto y el componente heterólogo son la misma proteína (por ejemplo, una vacuna frente a un antígeno de la superficie viral dirigida a un tipo de célula propenso a la infección por un virus de
este tipo).
La transformación de partes de levadura de un vehículo de levadura puede lograrse usando técnicas conocidas, ejemplos de las cuales se describen en el presente documento. Los vehículos de levadura que pueden producir compuestos y componentes heterólogos incluyen microorganismos de levadura intactos y esferoplastos de levadura. También pueden producirse de manera recombinante citoplastos de levadura y envueltas de levadura transformando microorganismos de levadura intactos o esferoplastos de levadura con moléculas de ácido nucleico deseadas, que producen ARN, péptidos o compuestos proteicos en los mismos, y manipulando además los microorganismos o esferoplastos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica para producir vehículos de citoplastos o envueltas que contienen compuestos deseados.
Las moléculas de ácido nucleico transformadas dentro de los vehículos de levadura de la presente invención pueden incluir uno o más genes, o partes de los mismos. Tales moléculas de ácido nucleico pueden comprender regiones codificantes parciales o completas, regiones reguladoras o combinaciones de las mismas así como regiones que cuando se transcriben pueden interferir con la producción de proteínas. Una ventaja de las cepas de levadura es su capacidad para portar varias moléculas de ácido nucleico y que pueden producir varios ARN heterólogos y/o compuestos proteicos. Como tales, los vehículos de levadura de la presente invención pueden diseñarse para proteger a un animal de más de una enfermedad o para portar más de un compuesto para otros usos. Un número preferido de compuestos para producirse mediante un vehículo de levadura de la presente invención oscila desde aproximadamente uno hasta aproximadamente 5, prefiriéndose más desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 compuestos. Se prefiere particularmente un vehículo de levadura que incluye las siguientes clases de genes: un gen que codifica una vacuna, un gen que codifica un modificador de la respuesta biológica y un gen que codifica un componente heterólogo adecuado para seleccionar como diana un tipo de célula deseada.
Un péptido o proteína codificados por una molécula de ácido nucleico dentro de una vehículo de levadura puede ser una proteína de longitud completa, o puede ser una proteína funcionalmente equivalente en la que se han delecionado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, acetilado, glicosilado, fosforilado, unido mediante un anclaje de glicerofosfatidilinositol (GPI) aminoácidos, de tal modo que la proteína modificada tiene una función biológica sustancialmente similar a la de la proteína natural. Pueden lograrse modificaciones mediante técnicas conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, modificaciones directas en la proteína o modificaciones en el gen que codifica la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante o clásicas para efectuar mutagénesis dirigida o aleatoria. Pueden seleccionarse proteínas funcionalmente equivalentes usando ensayos establecidos para medir la actividad biológica de la proteína.
La expresión de un ARN, péptido o compuesto proteico en un vehículo de levadura de la presente invención se logra usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. En resumen, se inserta una molécula de ácido nucleico que codifica un compuesto deseado en un vector de expresión de tal manera que la molécula de ácido nucleico está operativamente conectada a una secuencia control de la transcripción con el fin de poder efectuar expresión constitutiva o bien regulada de la molécula de ácido nucleico cuando se transforma en una célula huésped de levadura. Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más compuestos pueden ser uno o más vectores de expresión operativamente unidos a una o más secuencias control de la transcripción.
En el presente documento, una molécula recombinante se refiere a una molécula de ácido nucleico operativamente unida a al menos una secuencia control de la transcripción en un vector de expresión. En el presente documento, un vector de expresión se refiere a un vector de ADN o ARN que puede transformar una célula huésped y efectuar la expresión de la molécula de ácido nucleico operativamente unida. Tales vectores también pueden replicarse preferiblemente dentro de la célula huésped, a un número de copias alto o bien bajo dependiendo de sus características inherentes.
Las secuencias control de la transcripción, que pueden controlar la cantidad de proteína producida, incluyen secuencias que controlan el inicio, elongación y terminación de la transcripción. Son secuencias control de la transcripción particularmente importantes las que controlan el inicio de la transcripción, tales como las secuencias promotoras y de activación en sentido 5'. Puede usarse cualquier promotor de levadura apropiado en la presente invención y los expertos en la técnica conocen una variedad de tales promotores. Los promotores preferidos para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, promotores de genes que codifican las siguientes proteínas de levadura: alcohol deshidrogenasa I (ADH1) o II (ADH2), fosfoglicerato cinasa (PGK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; también denominada TDH3, para la triosa fosfato deshidrogenasa), galactoquinasa (GAL1), galactosa-1-fosfato uridil-transferasa (GAL7), UDP-galactosa epimerasa (GAL10), citocromo c_{1} (CYC1) y fosfatasa ácida (PHO5), prefiriéndose más promotores híbridos tales como los promotores ADH2/GAPDH y CYC1/GAL10, y prefiriéndose incluso más el promotor ADH2/GAPDH, que se induce cuando las concentraciones de glucosa en la célula son bajas (por ejemplo, de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 0,2 por ciento). Asimismo, se conocen varias secuencias de activación en sentido 5' (UAS), también denominadas potenciadores. Las secuencias de activación en sentido 5' preferidas para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, las UAS de genes que codifican las siguientes proteínas: CYC1, ADH2, GAL1, GAL7 y GAL10, así como otras UAS activadas por el producto génico de GAL4, prefiriéndose particularmente la UAS de ADH2. Dado que el UAS de ADH2 se activa por el producto génico de ADR1, es preferible sobreexpresar el gen de ADR1 cuando un gen heterólogo está operativamente unido al UAS de ADH2. Las secuencias de terminación de la transcripción preferidas para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen las secuencias de terminación de los genes del factor \alpha, GAPDH y CYC1.
Las secuencias control de la transcripción preferidas para expresar genes en levaduras metiltróficas incluyen las regiones control de la transcripción de los genes que codifican la alcohol oxidasa y la formiato deshidrogenasa.
Las moléculas de ácido nucleico usadas en la presente invención también pueden incluir secuencias de secreción endógenas o heterólogas así como secuencias de anclaje transmembrana, según sea apropiado. Por ejemplo, se prefiere secretar compuestos modificadores de la respuesta biológica, mientras que se prefiere anclar componentes heterólogos en la membrana del vehículo de levadura. La selección y el uso de tales secuencias puede lograrse usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Las condiciones eficaces para la producción de vehículos de levadura recombinantes de la presente invención incluyen un medio eficaz en el que puede cultivarse una cepa de levadura. Un medio eficaz es normalmente un medio acuoso que comprende hidratos de carbonos asimilables, fuentes de nitrógeno y fosfato, así como sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas y factores de crecimiento. El medio puede comprender nutrientes complejos o puede ser un medio mínimo definido. Las cepas de levadura de la presente invención pueden cultivarse en una variedad de recipientes, incluyendo, pero sin limitarse a, biorreactores, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas petri. El cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido en oxígeno apropiados para la cepa de levadura. Tales condiciones de cultivo se conocen bien dentro de la experiencia de un experto habitual en la técnica (véase, por ejemplo, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).
Los vehículos de levadura pueden recuperarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo los procedimientos descritos en el presente documento. Los vehículos de levadura pueden formularse en composiciones de la presente invención usando varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden secarse composiciones que contienen vehículo de levadura mediante liofilización o mediante exposición a nitrógeno líquido o nieve carbónica. También pueden prepararse composiciones que comprenden vehículos de levadura envasando las levaduras en una torta o un comprimido, tal como se realiza para las levaduras usadas en operaciones de horneado o fabricación de cerveza.
Con el fin de administrar un vehículo de levadura a un animal, pueden usarse composiciones secas para administración oral. Los vehículos de levadura también pueden mezclarse con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón isotónico que se tolera por el animal al que va a administrarse el vehículo. Los ejemplos de tales excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank y otras soluciones salinas acuosas fisiológicamente equilibradas. También pueden usarse vehículos no acuosos, tales como aceites fijos, aceite de sésamo, oleato de etilo o triglicéridos. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen agentes potenciadores de la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Los excipientes también pueden contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Los ejemplos de tampones incluyen tampón fosfato, tampón bicarbonato y tampón Tris, mientras que los ejemplos de conservantes incluyen timerosal, m- u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Las formulaciones convencionales pueden ser inyectables líquidos o bien sólidos que pueden tomarse en un líquido adecuado como una suspensión o disolución para inyección. Por tanto, en una formulación no líquida, el excipiente puede comprender, por ejemplo, dextrosa, seroalbúmina humana y/o conservantes a los que puede añadirse agua o solución salina estériles antes de la administración.
Una ventaja particular de la presente invención es que los vehículos de levadura no necesitan administrarse con un inmunopotenciador tal como un adyuvante o un vehículo, dado que la parte de levadura del propio vehículo parece funcional como tal. Sin embargo, esta característica no impide el uso de inmunopotenciadores en las composiciones de la presente invención.
Los adyuvantes son normalmente sustancias que potencian generalmente la respuesta inmunitaria de un animal frente a un antígeno específico. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund; otros componentes de la pared celular bacteriana; sales a base de aluminio; sales a base de calcio; sílice; polinucleótidos; toxoides; proteínas séricas; proteínas de la cubierta viral; otras preparaciones derivadas de bacterias; interferón gamma; adyuvantes de copolímero de bloque, tales como adyuvante Titermax de Hunter (CytRx^{TM}, Inc. Norcross, GA); adyuvantes Ribi (disponibles de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); y saponinas y sus derivados, tales como Quil A (disponible de Superfos Biosector A/S, Dinamarca).
Los vehículos son normalmente compuestos que aumentan la semivida de una composición terapéutica en el animal tratado. Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, formulaciones poliméricas de liberación controlada, implantes biodegradables, liposomas, aceites, ésteres y glicoles.
La vacuna o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un animal in vivo o bien ex vivo, o puede administrarse a células in vitro. Tal como se usa en el presente documento, la administración in vivo se refiere a la administración de una composición que comprende un vehículo de levadura directamente a un animal. Tal administración puede ser sistémica, mucosa y/o proximal con respecto a la ubicación del tipo de célula seleccionada como diana. Los ejemplos de vías para administrar un vehículo de levadura in vivo incluyen las vías auditiva, bronquial, genital, inhalatoria, nasal, ocular, oral, parenteral, rectal, tópica, transdérmica y uretral. La administración auditiva puede incluir gotas para los oídos, la administración nasal puede incluir gotas nasales y la administración ocular puede incluir gotas oculares. La administración oral puede incluir sólidos y líquidos que pueden tomarse por la boca. La administración parenteral puede incluir las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutánea, por catéter auricular y por catéter venoso. Se prefiere la administración oral, dado que particularmente la administración oral es útil en el desarrollo de inmunidad mucosa y dado que las composiciones que comprenden vehículos de levadura pueden prepararse fácilmente para administración oral, por ejemplo, como comprimidos o cápsulas, así como formularse en productos alimenticios y de bebida. También se prefieren otras vías de administración que modulan la inmunidad mucosa, particularmente en el tratamiento de infecciones virales, cánceres epiteliales, trastornos inmunosupresores y otras enfermedades que afectan a la región epitelial. Tales vías incluyen las vías bronquial, intradérmica, intramuscular, nasal, otras inhalatorias, rectal, subcutánea, tópica, transdérmica, vaginal y uretral.
La administración ex vivo de un vehículo de levadura se refiere a un procedimiento que incluye las etapas de poner en contacto una población de células extraídas de un animal con una composición que comprende un vehículo de levadura de la presente invención en condiciones tales que el vehículo de levadura se adsorbe por los tipos de células seleccionadas como diana y devolver las células puestas en contacto al animal. Un procedimiento de administración de este tipo es particularmente útil en el tratamiento de células implicadas en la hematopoyesis y la respuesta inmunitaria así como en el tratamiento de tumores.
La administración in vitro de un vehículo de levadura se refiere a la administración de un vehículo de levadura de la presente invención a una población de células (que también pueden incluir tejidos u organismos) en cultivo. Un procedimiento de este tipo es particularmente útil para determinar si un vehículo de levadura específico será eficaz in vivo o ex vivo en proyectos de investigación. Las células que se tratan in vitro pueden mantenerse en cultivo o transferirse a un animal.
Los procedimientos para preparar y administrar composiciones mediante estas vías los conocen bien los expertos en la técnica. Las composiciones de la presente invención se administran de una manera eficaz que depende del uso de la composición. Por ejemplo, con el fin de proteger a un animal de una enfermedad, se administra una composición de la presente invención al animal de una manera eficaz de modo que la composición puede proteger a ese animal de esa enfermedad. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse a animales o plantas antes de la enfermedad con el fin de prevenir la enfermedad y/o pueden administrarse a animales después de la aparición de la enfermedad con el fin de tratar la enfermedad. Por ejemplo, pueden usarse vehículos de levadura de la presente invención como agentes preventivos (profilácticos) y/o como agentes inmunoterapéuticos.
Los protocolos aceptables para administrar las composiciones de una manera eficaz incluyen tamaño de dosis individual, número de dosis, frecuencia de administración de la dosis y modo de administración. Los expertos en la técnica pueden lograr la determinación de tales protocolos. Una dosis única adecuada es una dosis que puede administrar eficazmente un compuesto que está portando el vehículo de levadura a un tipo de célula dada cuando se administra una o más veces durante un periodo de tiempo adecuado. Por ejemplo, una dosis única preferida de un vehículo de levadura de la presente invención es desde aproximadamente 1 x 10^{5} hasta aproximadamente 5 x 10^{7} equivalentes de células de levadura por kilogramo de peso corporal del organismo al que se está administrando la composición. Se administran preferiblemente "refuerzos" de una composición de vehículo de levadura cuando el compuesto portado por el vehículo de levadura ya no funciona eficazmente. Por ejemplo, si ya no está modulándose eficazmente una respuesta inmunitaria de un organismo, puede administrarse una o más dosis adicionales de una composición de la presente invención que puede modular la respuesta inmunitaria deseada. Tales composiciones pueden administrarse desde aproximadamente 2 semanas hasta aproximadamente varios años después de la administración original. Un programa de administración preferido es uno en el que se administran desde aproximadamente 1 x 10^{5} hasta aproximadamente 5 x 10^{7} equivalentes de células de levadura de una composición por kg de peso corporal del organismo desde aproximadamente una hasta aproximadamente 4 veces durante un periodo de tiempo de desde aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 6 meses. Los ejemplos de procedimientos para administrar vehículos de levadura de la presente invención a animales se proporcionan en la sección de ejemplos.
Una composición que puede efectuar terapia génica incluye un vehículo de levadura que está modificado mediante ingeniería genética para efectuar terapia génica estable en el tipo de célula seleccionada como diana, pudiendo, por ejemplo, efectuar la integración del gen en el genoma del huésped, manteniendo la célula fusionada como un heterocarionte o usando otros mecanismos para mantener de manera estable el gen en el tipo de célula tratada. Una composición de este tipo se administra a un organismo in vivo o ex vivo usando técnicas tales como las desarrolladas para otros vehículos de administración de genes. Los vehículos de administración de levadura son ventajosos porque pueden formar sincitios con las células a las que están transfiriendo el gen deseado para efectuar terapia génica y pueden dirigirse a tipos de células particulares, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede corregirse un defecto genético que conduce a fibrosis quística usando un vehículo de levadura que porta un gen CFTR funcional (regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística) que se dirige a células terminalmente diferenciadas colocadas de manera proximal con respecto a la capa externa del pulmón. También debe observarse que los genes que codifican proteínas que se secretan en fluidos corporales no necesitan dirigirse a un tipo de célula específica.
Las composiciones de vehículo de levadura de la presente invención pueden administrarse a cualquier animal adecuado, incluyendo cualquier animal propenso a cualquier enfermedad a partir de la cual pueda diseñarse un vehículo de levadura de la presente invención para proteger al animal. Los animales preferidos para tratar incluyen vertebrados y artrópodos, prefiriéndose más los mamíferos, anfibios, aves, peces e insectos. Los animales incluso más preferidos para tratar incluyen seres humanos, primates, animales de compañía (es decir, mascotas) y animales importantes en la agricultura (es decir, ganado), prefiriéndose particularmente los seres humanos, simios, gatos, reses, perros, hurones, gorilas, ratones, monos, cerdos, conejos, ratas y ovejas.
Según una realización adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende:
a)
un vehículo de levadura seleccionado de un microorganismo de levadura, un esferoplasto de levadura, un citoplasto de levadura o una envuelta de levadura, comprendiendo dicho vehículo de levadura un compuesto heterólogo que comprende un antígeno o una citocina o una combinación de los mismos; y
b)
un excipiente farmacéuticamente aceptable para la administración a un animal.
Una composición de este tipo puede usarse en la administración del compuesto a un organismo o a células en cultivo usando procedimientos descritos en el presente documento.
Preferiblemente, el vehículo comprende además un componente heterólogo colocado sobre la membrana externa del vehículo de levadura de tal manera que el componente puede dirigir el vehículo de levadura a un tipo de célula dada. Los componentes heterólogos adecuados se describen en el presente documento. Tales vehículos de levadura pueden incluir más de un componente heterólogo y/o más de un compuesto heterólogo. Tales composiciones pueden incluir también otros elementos, incluyendo, pero sin limitarse a, un excipiente, adyuvante y/o vehículo, ejemplos de los cuales se describen en el presente documento.
Preferiblemente, el/los componente(s) heterólogo(s) y compuesto(s) heterólogo(s) se producen cada uno por el vehículo de levadura. Un vehículo de levadura de este tipo está transformado con molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) un componente heterólogo y un compuesto heterólogo de tal manera que la levadura puede expresar el componente heterólogo y el compuesto heterólogo (que pueden ser un ARN o un compuesto proteico). Otro vehículo de levadura preferido es un vehículo de levadura que puede expresar un componente heterólogo y que también porta una molécula de ácido nucleico que puede efectuar terapia génica (es decir, un vehículo de administración de genes).
La composición incluye preferiblemente un vehículo de levadura que porta al menos dos compuestos heterólogos dos compuestos heterólogos que pueden proteger a un animal de una enfermedad. Se describen en el presente documento compuestos adecuados. Tales composiciones también pueden incluir otros elementos tales como excipientes, adyuvantes y vehículos. Los vehículos de levadura también pueden incluir componentes heterólogos que pueden dirigir los vehículos a determinados tipos de células. Los vehículos de levadura incluidos en esta realización incluyen vehículos de levadura transformados que pueden producir uno o más de los compuestos heterólogos.
Preferiblemente, al menos uno de los compuestos heterólogos es un compuesto que puede modular una respuesta inmunitaria, tal como un compuesto que puede estimular una respuesta inmunitaria o un compuesto que puede suprimir una respuesta inmunitaria. Una realización preferida es un vehículo de levadura que porta un antígeno y un modificador de la respuesta biológica. Otra realización preferida es un vehículo de levadura que porta un antígeno, un modificador de la respuesta biológica y un componente heterólogo que puede dirigir el vehículo de levadura a un tipo de célula dada.
Una realización de la presente invención es un vehículo de levadura que comprende una cepa de levadura que puede producir una proteína precursora heteróloga que tiene un sitio de procesamiento de aminoácidos dibásicos, en el que la cepa de levadura puede procesar correctamente la proteína precursora en al menos una proteína de rotura. Los ejemplos de tales proteínas precursoras incluyen varias proteínas precursoras de hormonas y proteínas precursoras de la proteína de la envuelta viral que requieren rotura mediante una endoproteasa de aminoácidos dibásicos como una etapa en el proceso de maduración. Los ejemplos de tales proteínas precursoras (incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas precursoras de virus de la inmunodeficiencia, virus linfotróficos, virus de la hepatitis y virus del herpes) se describen en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/088.322, igual que la referencia
anterior.
La levadura produce una proteína denominada endoproteasa Kex2 que se mostró en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/088,322, igual que la referencia anterior, que puede efectuar la rotura de proteínas precursoras heterólogas que tienen un sitio de procesamiento de aminoácidos dibásicos. Como tal, una cepa de levadura que puede expresar una proteína precursora de la envuelta viral puede efectuar la rotura de una proteína precursora de este tipo y expresar la(s) proteína(s) de la envuelta madura sobre la membrana de la levadura. Los vehículos de levadura de la presente invención que pueden producir una proteína precursora heteróloga también pueden modificarse mediante ingeniería genética para producir una endoproteasa de tipo Kex2 heteróloga, tal como la proteasa que rompe de manera natural la proteína precursora heteróloga. Tales vehículos de levadura pueden, pero no necesitan, modificarse para no producir más una endoproteasa Kex2 de levaduras funcional. Los detalles con respecto a la producción de tales vehículos de levadura se describen en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/088.322, igual que la referencia anterior. Usados según la presente invención, tales vehículos de levadura pueden estimular una respuesta inmunitaria frente a agentes infecciosos.
Un ejemplo de la capacidad de un vehículo de levadura de la presente invención para provocar una respuesta inmunitaria es el siguiente. Un vehículo de levadura transformado con una proteína precursora de la superficie viral, tal como con gp160 de VIH, cuando se administra a un animal, provoca tanto respuestas mediadas por células como respuestas humorales frente a las proteínas de la envuelta de VIH sin tener que incluir un adyuvante. Se observan tanto respuestas de proliferación de células T (indicativas de cebado de células T auxiliares) como potente actividad de células T citotóxicas CD8+ (indicativa de inmunidad mediada por células), apoyando el concepto de que los vehículos de levadura pueden conducir a la presentación de antígenos a través de las rutas del CMH tanto de clase I como de clase II. Los vehículos de levadura particularmente preferidos para su uso para proteger a un animal frente a la infección por VIH incluyen AFY435-gp160-SF2(c), una célula de S. cerevisiae intacta modificada para expresar la proteína precursora de la envuelta gp160 de VIH-1_{SF2} y AFY435-gp160-SF2(s), un esferoplasto equivalente de otra manera a AFY435-gp160-SF2(c). Se describen detalles de tales realizaciones en la sección de ejemplos.
Otra realización de la presente invención es un vehículo de levadura que puede estimular una respuesta inmunitaria para destruir células cancerígenas. Un vehículo de levadura de este tipo contiene (y preferiblemente expresa) proteínas, o péptidos de las mismas, que se encuentran sustancialmente sólo sobre o en células cancerígenas, incluyendo proteínas que provocan cáncer porque han mutado (por ejemplo, ras). Cuando se administra a un animal, un vehículo de levadura de este tipo induce una respuesta inmunitaria que incluye la producción de células T citotóxicas que pueden destruir células que expresan proteínas correspondientes a las proteínas o péptidos de las mismas portados por el vehículo de levadura, es decir, células cancerígenas.
Determinados vehículos de levadura de la presente invención son particularmente útiles para suprimir o reducir las respuestas inmunitarias dañinas. En una realización, un vehículo de levadura de la presente invención expresa sobre su superficie de membrana péptidos apropiados correspondientes a receptores de células T presentes sobre células implicadas en la producción de una respuesta inmunitaria dañina en un animal. La administración de un vehículo de levadura de este tipo al animal da como resultado la producción de células T citotóxicas dirigidas contra células que expresan los receptores de células T, suprimiendo de ese modo las respuestas inmunitarias generadas por tales células. Los procedimientos para identificar péptidos apropiados y el uso de otros vehículos de administración para efectuar una respuesta de este tipo se describen en, por ejemplo, Bourdette et al., 1994, J. Immunol. 152, 2510-2519 y Chou et al., 1994, J. Immunol. 152, 2520-2529. Los vehículos de levadura son particularmente útiles para un enfoque de este tipo debido a su capacidad para generar una respuesta mediada por células fuerte así como una respuesta humoral. Puede tomarse un enfoque similar para reducir las respuestas inmunitarias ineficaces o dañinas inducidas por parásitos, tumores o virus con el fin de engañar al sistema inmunitario del individuo enfermo; es decir, usando un vehículo de levadura que puede inducir una respuesta de células T citotóxicas contra células T o células B implicadas en la producción de anticuerpos dañinos y/o no protectores.
En otra realización, un vehículo de levadura de la presente invención expresa sobre su membrana celular un ligando de Fas y, como tal, puede destruir células que expresan una molécula denominada Fas (CD95). Fas es una glicoproteína que se encuentra sobre determinados tipos de células, incluyendo linfocitos T activados y células cancerígenas, incluyendo células de leucemia y linfoma; véase, por ejemplo Suda et al., 1993, Cell 75, 1169-1178. El uso de levadura como un vehículo de administración para ligandos de Fas con el fin de destruir tipos de células seleccionadas como diana es ventajoso dado que, por ejemplo, los ligandos de Fas pueden presentarse de una manera similar a como se presentan de manera natural, que es agregados aparentemente sobre una membrana celular, tal como sobre una células T citotóxica.
Otra realización de la presente invención es un vehículo de levadura que expresa moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) sobre su membrana celular. Está dentro del alcance de la presente invención tener vehículos de levadura que portan moléculas del CMH vacías que pueden cargarse in vitro, así como moléculas del CMH formando complejos con péptidos, usando, por ejemplo, técnicas similares a las usadas para expresar moléculas del CMH vacías y formando complejos en baculovirus; véase, por ejemplo, Stern et al., 1992, Cell 68, 465-477. Tales vehículos de levadura pueden usarse para modular respuestas inmunitarias, tales como delecionar o inactivar células T implicadas en respuestas autoinmunitarias y otras respuestas inmunitarias dañinas.
Se proporcionan los siguientes resultados experimentales para fines de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Las técnicas de biología molecular y celular usadas en los siguientes ejemplos son conocidas por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989; y Guthrie et al. (eds.), igual que la referencia anterior.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe la producción de determinados vehículos de levadura de la presente invención.
Se produjo S. cerevisiae AFY435-gp160-SF2, también denominada S. cerevisiae GPY60:p\alpha/env, tal como se describe en el ejemplo 1 de la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/088.322, igual que la referencia anterior. En resumen, se ligó el gen de la envuelta (env) que codifica la proteína precursora de la envuelta gp160 (aproximadamente 825 aminoácidos) de VIH-1_{SF2} (Sanchez-Pescador et al., 1985, Science 227, 484-492) a una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de factor \alpha y un segmento líder de aproximadamente 86 aminoácidos para formar un fragmento líder \alpha/gen env (\alpha/env) en el que la secuencia señal del gen env se sustituyó por la señal de factor \alpha y las secuencias líder de una manera similar al procedimiento mediante el cual se conectó el factor de crecimiento epidérmico a la señal de factor \alpha y las secuencias líder en Brake et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 4642-4646. El segmento de factor \alpha, también denominado líder \alpha-F, incluía también un sitio de procesamiento de aminoácidos dibásicos en su extremo terminal carboxilo. El gen de fusión \alpha/env se unió operativamente a un promotor de ADH2/GAPDH y secuencias de terminación de la transcripción del factor \alpha de S. cerevisiae y se conectó con otras secuencias de vectores de expresión lanzadera de levadura para formar una molécula recombinante p\alpha/env, también denominada pBS8. La molécula recombinante p\alpha/env contiene secuencias control de la replicación bacterianas y de levaduras (2 \mu) así como un gen bacteriano que codifica resistencia a ampicilina (Amp), y genes de levaduras leu2-d auxotrófico y URA3 prototrófico.
Se transformó la molécula recombinante p\alpha/env en varias cepas de S. cerevisiae, incluyendo GPY60, una cepa Mat\alpha pep4::URA3 prb leu2 his4 ura3 trp1 que se describe en Baker et al., 1988, Cell 54, 335-344. La cepa transformada se denomina S. cerevisiae GPY60:p\alpha/env, o S. cerevisiae AFY435-gp160-SF2. Un vehículo de levadura que comprende la célula de levadura intacta AFY435-gp160-SF2 se denominó AFY435-gp160-SF2(c). Un vehículo de levadura que comprende un esferoplasto de AFY435-gp160-SF2 se denominó AFY435-gp160-SF2(s).
El ejemplo 1 de la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/088.322, igual que la referencia anterior, también demuestra (a) que S. cerevisiae AFY435-gp160-SF2 producía la proteína precursora de la envuelta gp160 de VIH-1 y que podía procesar gp160 en gp120 y gp41 in vivo de una manera similar a la que las células de mamíferos procesan gp160, y (b) que S. cerevisiae AFY435-gp160-SF2 expresaba al menos una parte de las proteínas gp120 y gp141 rotas sobre su superficie celular.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra que los vehículos de levadura de la presente invención pueden estimular respuestas inmunitarias mediadas por células así como humorales en animales.
A. Vehículos de levadura
Se sometieron a prueba vehículos de levadura de S. cerevisiae de esferoplastos y células intactas modificados para expresar la proteína precursora de la envuelta gp160 de VIH-1_{SF2} en ratones para determinar su capacidad para estimular la inmunidad humoral y/o mediada por células contra VIH. Específicamente, se sometieron a prueba los vehículos de levadura S. cerevisiae AFY435-gp160-SF2(c) y S. cerevisiae AFY435-gp160-SF2(s) (producidos tal como se describió en el ejemplo 1), al igual que los siguientes controles: vector(c) AFY433 de célula intacta de S. cerevisiae y vector(s) AFY433 de esferoplasto de S. cerevisiae que eran comparables a AFY435-gp160-SF2(c) y AFY435-gp160-SF2 (s), respectivamente, excepto que el vector(c) AFY433 y el vector(s) AFY433 se transformaron con el vector solo en lugar de con el vector que contenía gp160.
B. Administración de vehículos de levadura a animales y recuperación de células de ganglios linfáticos y del bazo
A cada uno de 5 grupos de dos ratones Balb/c se les inyectó por vía intraperitoneal una vez a la semana durante un total de tres semanas 100 microlitros (\mul) de tampón de inyección (sorbitol 1,4 M, cloruro de magnesio 5 mM, Tris 10 mM, pH 7,4) que contenía lo siguiente: para el grupo 1 (ratones 1 y 2), nada; para el grupo 2 (ratones 3 y 4), aproximadamente 2 x 10^{7} células de vector(c) AFY433; para el grupo 3 (ratones 5 y 6), aproximadamente 2 x 10^{7} esferoplastos de vector(s) AFY433; para el grupo 4 (ratones 7 y 8), aproximadamente 2 x 10^{7} células AFY435-gp160-SF2(c); y para el grupo 5 (ratones 9 y 10), aproximadamente 2 x 10^{7} esferoplastos AFY435-gp160-SF2(s). Catorce días después de su tercera inmunización, se sacrificaron todos los ratones mediante inhalación de dióxido de carbono.
Se obtuvo sangre de los ratones mediante punción cardiaca y se dejó coagular a temperatura ambiente. Se usó el suero para análisis de inmunotransferencia de tipo Western e inmunoprecipitación.
Se obtuvieron células del bazo y del ganglio linfático (LN) mesentérico en condiciones asépticas y se obtuvieron suspensiones de células únicas presionando suavemente los órganos a través de tamices de malla de nylon. Se agruparon las células del bazo y del ganglio linfático a partir de ratones individuales y se resuspendieron en medio de cultivo de tejidos TCM (RPMI 1640 (disponible de Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el 7,5% de suero de ternero fetal, L-glutamina, L-piruvato, vitaminas, aminoácido no esenciales, gentamicina y 2 mercaptoetanol). No había diferencias aparentes en la recuperación de células de ninguno de los ratones, tal como se muestra en la tabla 1.
TABLA 1 Recuperación de células de ratones a los que se inyectó levadura o esferoplastos
1
Se dividieron las células del bazo y del ganglio linfático uniformemente en tres grupos. Se lavó el primer grupo y se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (disponible de Life Technologies) y se colocó en placas petri a las que se habían adsorbido inmunoglobulinas de cabra anti-ratón. Tras la incubación en hielo durante aproximadamente 30 minutos, se eliminaron con cuidado las células no adherentes (aproximadamente el 90% de células T), se lavaron y se resuspendieron en TCM para su uso en ensayos de proliferación de células T como células de ganglios linfáticos y del bazo enriquecidas en células T. La recuperación de tales células se indica en la tabla 1 en la columna titulada "placas de Ig posteriores". El segundo grupo de células se irradió con rayos gamma (2000R) para su uso en ensayos de proliferación de células T como células irradiadas. El tercer grupo de células se dejó sin tratar para la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL).
En todos los experimentos, se calcularon los datos como la media \pm DE para determinaciones por triplicado para cada punto de muestra. Para los ensayos de proliferación, los datos se expresan como un índice de estimulación (I. E) en el que un I.E. de 100 es equivalente a la proliferación observada con células T obtenidas de ratones no inmunizados. Por tanto, un I.E. de 150 representa una respuesta que está un 50% por encima del fondo. Para ensayos de CTL, los datos se expresan como citolisis corregida, lo que tiene en cuenta la destrucción de fondo o espontánea.
C. Infección de células con virus vaccinia recombinante
Se incubaron aproximadamente 1 x 10^{6} células de leucemia de ratón P815 durante toda la noche en TCM con aproximadamente 1 x 10^{6} unidades formadoras de placa (ufp) de virus vaccinia recombinante que expresaba \beta-galactosidasa (Vac-lac) o bien con aproximadamente 1 x 10^{6} ufp de virus vaccinia recombinante que expresaba gp160-SF2 de VIH (Vac-SF2; disponible del Dr. D. Kuritzkes, University of Colorado Health Sciences Center, Denver, CO) para producir células infectadas denominadas P815-Vac-lac y P815-Vac-SF2, respectivamente. De manera similar, se incubaron aproximadamente 1 x 10^{6} células de fibroblasto de ratón BC10ME durante toda la noche en TCM con aproximadamente 1 x 10^{6} ufp de virus vaccinia recombinante que expresaba \beta-galactosidasa (Vac-lac) o bien con aproximadamente 1 x 10^{6} ufp de virus vaccinia recombinante que expresaba gp160-SF2 de VIH (Vac-SF2) para producir células infectadas denominadas BC10ME-Vac-lac y BC10ME-Vac-SF2, respectivamente. Se sedimentaron las células infectadas mediante centrifugación y se resuspendieron en TCM. Para los ensayos de proliferación, se calentaron células BC10ME hasta 50ºC durante 30 min para inactivar cualquier virus vivo y para proporcionar y para proporcionar una fuente de lisado de células que contiene antígeno. Para los ensayos de CTL, se marcaron las células P815 infectadas citoplásmicamente con 100 \muCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} y se diluyeron hasta 5 x 10^{4}/ml en TCM.
D. Estimulación de una respuesta inmunitaria humoral
Se realizaron de la siguiente manera ensayos de proliferación de células T para detectar la estimulación de la respuesta inmunitaria humoral en ratones a los que se les administró vehículos de levadura que expresaban gp160 de la presente invención. Se diluyeron células de ganglios linfáticos y del bazo enriquecidas en células T, producidas tal como se describió en el ejemplo 2B, hasta 4 x 10^{6} células/ml en TCM. Se diluyeron células de ganglios linfáticos y del bazo no fraccionadas, irradiadas, producidas tal como se describió en el ejemplo 2B, hasta 4 x 10^{6} células/ml en TCM. Se mezclaron 1:1 las células T enriquecidas y las células irradiadas del mismo ratón de tal modo que la concentración final de cada tipo de células era de aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml. Se colocaron 100 \mul de las mezclas de células T en pocillos individuales de placas de fondo redondo de 96 pocillos que contenían cada uno 100 \mul de las concentraciones de antígenos o mitógenos tal como se indica en la tabla 2.
TABLA 2 Antígenos o mitógenos usados en el ensayo
3
Se establecieron ensayos por triplicado y se valoró la proliferación de células T mediante incorporación de timidina; en los días 3 y 6, se añadieron 25 \mul de ^{3}HTdR (40 \muCi/ml) a cada pocillo. Aproximadamente 18 horas después, se recogieron los pocillos en filtros de fibra de vidrio y se contaron en un contador de centelleo.
Los resultados de los ensayos de proliferación de células T se muestran en la tabla 3.
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7 
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En los datos de proliferación mostrados en la tabla 3, es importante indicar que todos los ratones respondieron de manera comparable a los estímulos mitogénicos proporcionados por los anticuerpos anti-CD3 y anti-TCR y la concanavalina A. Se incluyeron estos mitógenos en el ensayo para estimar si se añadía a los cultivos el mismo número de células T de respuesta de cada ratón. En los pocillos que contenían células del ratón 3 hubo una carencia de respuesta a cualquier estímulo por razones desconocidas.
Se representan también en la figura 1 algunos de los resultados de los ensayos de proliferación de células T. La figura 1A representa los resultados de la proliferación de células T en el día 3 en respuesta a la proteína gp120 de la cepa IIIb de VIH (es decir, proteína gp120-IIIb). La figura 1B representa los resultados de la proliferación de células T en el día 3 en respuesta a lisados de células BC10ME infectadas con Vac-SF2. La figura 1C representa los resultados de la proliferación de células T en el día 6 en respuesta a la proteína gp120-IIIb. La figura 1D representa los resultados de la proliferación de células T en el día 6 en respuesta a lisados de células BC10ME infectadas con Vac-SF2. La figura 1E representa los resultados de la proliferación de células T en el día 3 en respuesta a la levadura control de vector AFY433 intacta (es decir, vector(c) AFY433 de S. cerevisiae). La figura 1F representa los resultados de la proliferación de células T en el día 6 en respuesta a levadura control de vector AFY433 intacta.
Las células T de ratones inmunizados con levadura intacta viva que expresaba gp120-SF2 de VIH (ratones 7 y 8) o con esferoplastos que expresaban gp120-SF2 de VIH (ratones 9 y 10) proliferaron en respuesta a gp120, mientras que las células T de animales no inmunizados (ratones 1 y 2) o de animales inmunizados con levadura control intacta viva (ratones 3 y 4) o esferoplastos (ratones 5 y 6) no proliferaron en respuesta a gp120; véase la tabla 3 y las figuras 1A a 1D. Las células T aisladas de los ratones 7, 8, 9 y 10 respondieron a gp160 de VIH en forma de proteína purificada (véase la tabla 3 y las figuras 1A y 1C) o bien como lisados de células infectadas con un virus vaccinia recombinante que codificaba gp160-SF2 (véase la tabla 3 y las figuras 1B y 1D). Se observaron las respuestas tanto en el día 3 como en el día 6. Es de particular interés que incluso aunque los ratones se inmunizaron contra gp160 derivada de la cepa SF2 de VIH, sus células T mostraron una respuesta baja pero significativa frente a la proteína gp120 aislada de la cepa IIIb de VIH.
Los resultados mostrados en las figuras 1E y 1F indican que las células T aisladas de cada uno de los ratones inmunizados (es decir, los ratones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) respondieron a la levadura intacta de vector(c) AFY433 control de una manera dependiente de la dosis. La respuesta en el día 6 era muy alta. Tales células T también respondieron al vector(s) AFY433 así como a los vehículos de levadura AFY435-gp160-SF2(c) y AFY435-gp160-SF2(s); véase la tabla 3.
La respuesta inmunitaria global generada por los ratones en respuesta a la administración del vector(c) AFY433, vector(s) AFY433, AFY435-gp160-SF2(c) y AFY435-gp160-SF2(s) se determinó mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western de suero recogido de cada uno de los ratones, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se muestran los resultados en la figura 2. Brevemente, los carriles 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 21 representan carriles de un gel que se cargaron cada uno con aproximadamente 100 \mug de proteínas de lisados de levaduras AFY435-gp160-SF2; mientras que los carriles 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 representan carriles de un gel que se cargaron cada uno con aproximadamente 100 \mug de lisados de levaduras de vector AFY433. Se inmunotransfirieron los carriles numerados con muestras de suero de los siguientes ratones: carril 1, del ratón 1; carriles 2 y 3, del ratón 2; carriles 4 y 5, del ratón 3; carriles 6 y 7, del ratón 4; carriles 8 y 9, del ratón 5; carriles 10 y 11, del ratón 6; carriles 12 y 13, del ratón 7; carriles 14 y 15, del ratón 8; carriles 16 y 17, del ratón 9; y carriles 18 y 19, del ratón 10. Los carriles 20 y 21 se inmunotransfirieron con antisuero recogido de un conejo inmunizado con una proteína de fusión gp120. Este estudio indicó que los ratones inmunizados fabricaron anticuerpos frente a una variedad de proteínas derivadas de levaduras y que el patrón de proteínas reconocido por el suero de ratón dependía de si los ratones se habían inmunizado con levadura intacta o esferoplastos. Las respuestas inmunitarias humorales generadas por los ratones 7, 8, 9 y 10 en respuesta a gp160 no pudieron distinguirse en esta inmunotransferencia de tipo Western debido a la alta reactividad de fondo de los antisueros generados en respuesta a otros antígenos de levaduras, y debido a la relativamente baja abundancia de gp160 recuperada de lisados de levaduras en este experimento.
En resumen, los vehículos de levadura introducidos sistémicamente en los ratones estimularon una respuesta inmunitaria vigorosa contra el vehículo de levadura, incluyendo la producción de células T que podían proliferar en respuesta a la proteína heteróloga portada por el vehículo de levadura.
E. Estimulación de una respuesta inmunitaria mediada por células
Se realizaron ensayos de CTL para detectar la estimulación de la respuesta inmunitaria mediada por células en ratones a los que se administró vehículos de levadura que expresaban gp160 de la presente invención. Se generaron CTL mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Brevemente, se colocaron aproximadamente 40 x 10^{6} células de ganglios linfáticos y del bazo no fraccionadas, sin irradiar, en matraces que contenían aproximadamente 1 x 10^{7} vehículos de AFY435-gp160-SF2(c) más aproximadamente 1 x 10^{7} vehículos de levadura AFY435-gp160-SF2(s) en un total de 10 ml de TCM y se cultivaron durante 7 días. Se establecieron los matraces por duplicado consiguiendo uno el 5% de sobrenadantes libres de células a partir de células de bazo de rata estimuladas con concanavalina A (CAS) como una fuente de factores de crecimiento de células T al comienzo del periodo de cultivo. En el día 5, se añadió CAS al 5% a todos los matraces. Se recogieron los CTL mediante centrifugación en gradiente de densidad de ficoll/hypaque y se resuspendieron en TCM para su uso.
Se realizó el ensayo de CTL según técnicas convencionales. Brevemente, se diluyeron los CTL hasta concentraciones de aproximadamente 2 x 10^{7} células/ml y aproximadamente 1 x 10^{7} células/ml en TCM. Se mezclaron juntos 100 \mul de CTL y 100 \mul de células diana marcadas con ^{51}Cr, por triplicado, en placas de 96 pocillos de fondo en V. Se determinó la citolisis mediante la liberación de cromo radiactivo a partir de las células diana tras 4 horas de incubación a 37ºC.
Se sometieron a ensayo los CTL sobre cinco poblaciones de células diana: P815, P815-Vac-Lac, P815-Vac-SF2, BC10ME y BC10MEgp160-IIIb (células BC10ME transfectadas modificadas para expresar gp160-IIIb). Se obtuvieron los valores de porcentaje de lisis para cada combinación de CTL-célula diana a dos proporciones de efector:diana (E:D). Usando procedimientos convencionales para los ensayos de CTL, se corrigieron los datos para la lisis no específica sobre P815-Vac-lac para P815-Vac-SF2 y sobre BC10ME para BC10ME-gp160-IIIb. Se muestran los resultados en la tabla 4.
TABLA 4 Datos del ensayo de CTL
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Los CTL generados a partir de ratones inmunizados con los vehículos de levadura AFY435-gp160-SF2(c) y AFY435-gp160-SF2(s) pudieron destruir células diana que expresaban gp160-SF2 y, en un grado mucho menor, células que expresaban gp160-IIIb. La destrucción mostraba una dosis-respuesta en términos de proporción de E:D en la que a mayor proporción de E:D, se destruían más células diana. La destrucción de células P815-Vac-SF2 por CTL generados a partir de ratones inmunizados con los vehículos de levadura AFY435-gp160-SF2(c) y AFY435-gp160-SF2(s) se muestra en la figura 3. Las figuras 3A y 3B ilustran resultados de ensayos separados en los que se añadió CAS, respectivamente, en el día 5 y en el día 1.
No se muestran datos para los CTL derivados de los ratones 3 y 5, dado que se recuperaron muy pocas células de estos matraces. No obstante, los datos son convincentes de que pueden usarse levadura intacta y/o esferoplastos derivados de levaduras que expresan una proteína heteróloga para cebar células T in vitro e in vivo para destruir células que expresan la proteína heteróloga.
Los resultados obtenidos en este estudio controlado se correlacionan bien con los resultados obtenidos en experimentos piloto anteriores. En los ensayos anteriores, los CTL generados a partir de ratones inmunizados con los vehículos de levadura AFY435-gp160-SF2(c) o bien AFY435-gp160-SF2(s) pudieron destruir células P815-Vac-SF2, mientras que los CTL derivados de ratones no inmunizados no pudieron hacerlo. Tanto en el estudio piloto como en el controlado, el grado de destrucción fue similar, y parecía que los animales a los que se inyectó levadura intacta dieron lugar a CTL más fuertes que los ratones a los que se inyectó esferoplastos.
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F. Los resultados notificados en este ejemplo indican que los vehículos de levadura de la presente invención pueden cebar células T de ratón para que respondan a una proteína heteróloga. Por ejemplo:
(a) Células T aisladas del bazo y ganglios linfáticos de ratones a los que se inyectó por vía intraperitoneal vehículos de levadura que expresaban la proteína de la envuelta de VIH gp160-SF2 proliferaron in vitro en respuesta a extractos de células infectadas con un virus vaccinia recombinante que codifica gp160-SF2. Las células T derivadas de ratones no inmunizados o ratones que se habían inmunizado con levadura recombinante que contenía ADN de vector pero no ADN que codificaba gp160-SF2 no proliferaron en respuesta a tales extractos celulares.
(b) Las células del bazo y de ganglios linfáticos de ratones inmunizados con vehículos de levadura que expresaban la proteína de la envuelta de VIH gp160-SF2 contenían precursores de células T citotóxicas que, tras la estimulación in vitro, pudieron destruir específicamente células infectadas con un virus vaccinia recombinante que codificaba gp160-SF2. Las células T derivadas de ratones no inmunizados o ratones que se habían inmunizado con levadura que contenía ADN de vector pero no ADN que codificaba gp160-SF2 no contenían precursores de CTL cebados por gp160-SF2.
(c) Las células T de ratones inmunizados con vehículos de levadura que expresaban la proteína de la envuelta de VIH gp160-SF2 también proliferaron en un grado menor pero significativo, en respuesta a proteína gp120 purificada derivada de un clado de VIH diferente, IIIb (LAI). Los CTL derivados de estos animales también mostraron una reactividad cruzada demostrable frente a células que expresaban gp120-IIIb. Estos resultados sugieren que los vehículos de levadura que expresan una proteína gp160 de VIH pueden inducir inmunidad por reactividad cruzada frente a proteínas gp160 de otros aislados de VIH.
(d) Los ratones a los que se inyectó esferoplastos derivados de levadura AFY435-gp160-SF2 intacta también respondieron en los ensayos de proliferación y citotóxicos frente a la proteína gp160-SF2 así como frente a la proteína gp120-IIIb, sugiriendo que podrían usarse esferoplastos para la inmunización en lugar de levadura intacta.
(e) La inmunización con levadura intacta o esferoplastos no requirió la administración de un adyuvante. Los ratones a los que se inyectó por vía intraperitoneal la levadura intacta o esferoplastos no mostraron ningún efecto adverso incluso tras inyecciones repetidas.
En resumen, no sólo se provocaron respuestas de proliferación de células T (indicativas de cebado de células T cooperadoras) sino que también se indujo actividad de CTL (indicativa de inmunidad mediada por células). El cebado de la actividad de CTL sugiere un manejo único de la levadura por el sistema inmunitario (demostrado para levadura intacta y esferoplastos) que da como resultado la presentación del antígeno mediante tanto la clase II (para células T cooperadoras) como la clase I (para precursores de CTL). El cebado de ambos tipos de células T se produjo en ausencia de adyuvante, sugiriendo que los vehículos de levadura pueden funcionar como sus propios adyuvantes. Además, los ratones inmunizados no mostraron reacciones frente al adyuvante típicas (es decir, efectos secundarios no deseados) tras la inyección de levadura intacta o esferoplastos, demostrando la seguridad de los vehículos de levadura de la presente invención.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra que un vehículo de levadura de la presente invención es seguro, incluso en un animal inmunocomprometido, tal como en un ratón SCID que es deficiente tanto en linfocitos T como B.
Se inyectó a dos ratones CB.17^{scid} (disponibles de Jackson Labs, Bar Harbor, ME) por vía intraperitoneal aproximadamente 2 x 10^{7} AFY435-gp160-SF2(c) en 100 \mul de tampón de inyección. Se inyectó a dos ratones CB.17^{scid} adicionales aproximadamente 2 x 10^{7} AFY435-gp160-SF2(s) en 100 \mul de tampón de inyección. Los ratones inmunizados no mostraron reacciones adversas en el sitio de inyección o cambios en la salud global durante un periodo de 10 días durante el cual los ratones se controlaron diariamente.
En el día 10 tras la inyección, se sacrificaron los ratones mediante inhalación de dióxido de carbono. Se realizó lavado peritoneal usando 5 ml de PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato). Se aplicaron aproximadamente 200 \mul del lavado de cada ratón a placas petri separadas que contenían medio rico (por ejemplo medio de dextrosa de patata de levadura) o medio definido selectivo para el crecimiento de levaduras. Se incubaron las placas petri a temperatura ambiente durante 7 días, tiempo durante el cual no se observó sobrecrecimiento de levadura. Las placas control que contenían muestras de las preparaciones de levaduras usadas para las inyecciones mostraron crecimiento, indicando que se había inyectado a los ratones levadura viva.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra que un vehículo de levadura de la presente invención es seguro y estimula la proliferación de células T específicas de antígeno en animales primates grandes.
A. Vacunación de monos macacos
Se vacunaron nueve macacos de cola de cerdo (Macaca nemestrina) según un programa en el que se inyectó semanalmente a parejas de macacos de cola de cerdo durante tres semanas 10 millones o 50 millones de levaduras recombinantes que expresaban la glicoproteína gp160-SF2 de VIH o bien no la expresaban. Un único macaco sirvió como control sin inyectar. Se muestra el protocolo de vacunación usado en la tabla 5. Se realizaron las vacunaciones según los protocolos descritos en el ejemplo 3. Se administraron las vacunaciones por vía intraperitoneal en el día 1. Se administraron las vacunas 1/2 por vía intramuscular y 1/2 por vía subcutánea en el brazo derecho en el día 8. Se administraron las vacunas 1/2 por vía intramuscular y 1/2 por vía subcutánea en el brazo izquierdo en el día 15. No se observaron reacciones adversas en el sitio de las inyecciones.
TABLA 5 Protocolo de vacunación en macacos de cola de cerdo
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B. Aislamiento de linfocitos de macaco
Se recogieron aproximadamente 7 ml de sangre periférica de cada mono en el momento de cada inmunización. Se dejaron coagular 2 ml para obtener suero para su uso en análisis de ELISA y de inmunotransferencia de tipo Western para detectar la presencia de anticuerpos anti-gp160-SF2. Se usaron los 5 ml restantes para el aislamiento de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) para ensayos de CTL y proliferación de células T. Se mezclaron inmediatamente los 5 ml de sangre con heparina libre de conservantes, se diluyó 1:1 con medio de cultivo de tejidos (TCM) que consistía en RPMI 1640 complementado con el 7,5% de suero de ternero fetal inactivado por calor, L-glutamina, L-piruvato, aminoácidos no esenciales, vitaminas, gentamicina y 2-mercaptoetanol. Se estratificaron cuidadosamente las células diluidas sobre 95% de Histiopaque 1077:5% de RPMI 1640. Se eliminaron las PBMC de la superficie de contacto, se lavaron dos veces y se resuspendieron en TCM para su uso en ensayos in vitro.
Aproximadamente 69 días después de la última vacunación, se sacrificaron los animales, momento en el cual se extrajo sangre periférica, los ganglios linfáticos axilares y el bazo. Se obtuvieron aproximadamente 50 ml de sangre de cada animal y se recogieron los ganglios linfáticos axilares y los bazos. Se prepararon suspensiones celulares a partir de los bazos y ganglios linfáticos cortando los órganos en partes pequeñas seguido de la homogenización usando un homogenizador Dounce. Se aislaron las células mononucleares tal como se describió de manera inmediatamente anterior. Se realizaron todas las manipulaciones celulares en presencia de heparina libre de conservantes para evitar la coagulación.
C. Ensayo de proliferación de células T
Se realizaron ensayos de proliferación de células T usando PBMC aisladas de cada animal según el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se usaron sobrenadantes de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) de macacos, estimuladas durante 24 horas en presencia de 5 \mug/ml de concanavalina A (Con A), como una fuente de factores de crecimiento de células T para las células T de mono en el ensayo de proliferación de células T.
Las células PBMC, de ganglios linfáticos y del bazo obtenidas de los animales antes de la primera vacunación respondieron vigorosamente a los estímulos mitogénicos (índices de estimulación >50 en respuesta a Con A y PHA) y respondieron (I.E. <5) a levaduras recombinantes tratadas con calor sin expresión de gp160-SF2 de VIH ("levadura^{-}") o levaduras recombinantes con expresión de gp160-SF2 de VIH ("levadura^{+}") (datos no mostrados). Aproximadamente dos semanas después de la primera vacunación, las células aisladas a partir de los destinatarios de la vacuna demostraron claramente una respuesta de proliferación potenciada de una manera dependiente de la dosis (basada en números crecientes de levaduras administradas) frente a levadura viva o calentada, comparado con el mono número 9 que no se había vacunado. Se incubaron los linfocitos de macaco aislados durante dos días o bien cuatro días en presencia de factores de crecimiento de células T. Los resultados de estos ensayos de proliferación realizados tras el sacrificio usando poblaciones de células PBMC, de ganglios linfáticos y de bazo de macacos se presentan en la tabla 6. Los datos se presentan como índices de estimulación \pm D.E. usándose la proliferación de fondo para calcular los valores de I.E. presentados como cuentas por minuto \pm D.E.
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Tal como puede observarse en los datos de la tabla 6, a los 69 días tras el final de la vacunación, las poblaciones de células PBMC, de ganglios linfáticos y de bazo aisladas de monos vacunados con levadura^{-} o levadura^{+}, conservaban cada una la capacidad de responder a antígenos de levadura de una manera dependiente de la dosis. De manera importante, las poblaciones de linfocitos de monos vacunados con levadura^{+}, pero no con levadura^{-}, también respondieron a gp120-SF2 purificada (levadura y derivada de CHO), indicando de ese modo que la proliferación de células T observada era específica de antígeno. Por tanto, los resultados indican que tanto la levadura^{-} control como la levadura^{+} inducen una respuesta de células T en los monos. Sin embargo, la levadura^{+} sola induce una respuesta de células T específica de gp120-SF2. Juntos, los resultados confirman la seguridad y eficacia de los vehículos de levadura de la presente invención en un estudio con animales grandes usando primates.
Estos experimentos demuestran la seguridad de los vehículos de levadura de la presente invención, incluso en animales inmunodeficientes.
Aunque se han descrito en detalle diversas realizaciones de la presente invención, es evidente que a los expertos en la técnica se les ocurrirán modificaciones y adaptaciones de esas realizaciones.

Claims (37)

1. El uso de un vehículo de levadura en la fabricación de una vacuna para la modulación de una respuesta inmunitaria mediada por células o una respuesta inmunitaria humoral en un animal, seleccionándose el vehículo de levadura de un microorganismo de levadura, un esferoplasto de levadura, un citoplasto de levadura o una envuelta de levadura, portando dicho vehículo de levadura al menos un compuesto heterólogo que comprende un antígeno o una citocina o una combinación de los mismos.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho vehículo de levadura está transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica dicho compuesto heterólogo, y en el que dicho vehículo de levadura ha expresado dicho compuesto heterólogo.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho vehículo de levadura se ha cargado con dicho compuesto heterólogo.
4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho vehículo de levadura porta al menos dos compuestos heterólogos.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho vehículo de levadura está transformado con moléculas de ácido nucleico que codifican dichos compuestos heterólogos, y en el que dicha levadura ha expresado dichos compuestos heterólogos.
6. El uso según la reivindicación 4, en el que uno de dichos compuestos comprende una citocina.
7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho compuesto heterólogo es un antígeno.
8. El uso según la reivindicación 7, en el que dicho antígeno comprende uno o más de los siguientes: un antígeno viral, una molécula de superficie de células de mamíferos, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, un antígeno de protozoo, un antígeno de helminto, un antígeno de ectoparásito o un antígeno cancerígeno.
9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho vehículo de levadura se selecciona de un microorganismo de levadura, un esferoplasto de levadura o un citoplasto de levadura.
10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho vehículo de levadura es un microorganismo de levadura.
11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho vehículo de levadura es de una levadura no patógena.
12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho vehículo de levadura es de una levadura de los géneros Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces o Yarrowia.
13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vehículo de levadura es de una levadura de los géneros Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, o Schizosaccharomyces.
14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vehículo de levadura es de una levadura de las especies Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris o Schizosaccharomyces pombe.
15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vehículo de levadura es de una levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae.
16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho vehículo de levadura comprende además un componente heterólogo sobre la membrana externa de dicho vehículo de levadura de modo que dicho componente puede dirigir dicho vehículo de levadura a un tipo de célula dado, en el que dicho componente heterólogo comprende uno o más de los siguientes: un anticuerpo, una proteína de la superficie celular, un ligando de Fas, un ligando de receptor o una proteína de la superficie viral.
17. El uso según la reivindicación 16, en el que dicho vehículo de levadura está transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica dicho componente heterólogo, y en el que dicha levadura ha expresado dicho componente heterólogo.
18. El uso según la reivindicación 16, en el que dicho tipo de célula comprende células seleccionadas de una o más de las siguientes: células conjuntivas, células dendríticas, células endoteliales, células epiteliales, células de origen granulocítico, células madre hematopoyéticas, hepatocitos, linfocitos, mioblastos, miocitos, neuronas, neutrófilos, pneumocitos o timocitos.
19. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho vehículo de levadura puede fusionarse con una célula a la cual se está administrando dicho compuesto.
20. El uso según la reivindicación 19, en el que dicha célula comprende células conjuntivas, células dendríticas, células endoteliales, células epiteliales, células de origen granulocítico, células madre hematopoyéticas, hepatocitos, linfocitos, mioblastos, miocitos, neuronas, neutrófilos, pneumocitos, timocitos o mezclas de los mismos.
21. El uso según la reivindicación 19, en el que dicha célula comprende células seleccionadas de uno o más de los siguientes: linaje granulocítico-monocítico, linfocitos B o linfocitos T.
22. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho vehículo de levadura se selecciona de un microorganismo de levadura o un esferoplasto de levadura, en el que dicho vehículo de levadura ha expresado una proteína precursora heteróloga que tiene un sitio de procesamiento de aminoácidos dibásicos, y en el que dicho vehículo de proteína puede procesar correctamente dicha proteína precursora en una proteína de rotura.
23. El uso según la reivindicación 22, en el que dicho vehículo de levadura comprende una cepa de levadura deficiente en endoproteasa Kex2 que puede producir una endoproteasa de procesamiento de aminoácidos dibásicos heteróloga que puede romper dicha proteína precursora.
24. El uso según la reivindicación 22, en el que dicho vehículo de levadura es de levadura de la especie S. cerevisiae.
25. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha vacuna es para provocar una respuesta inmunitaria frente a una enfermedad provocada por un agente infeccioso.
26. El uso según la reivindicación 25, en el que dicho agente infeccioso se selecciona de uno o más de los siguientes: viroides, priones, virus, bacterias, hongos, protozoos, helmintos y ectoparásitos.
27. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que dicha vacuna es para modular una respuesta inmunitaria frente a una o más de las siguientes: alergias, anemias, enfermedades autoinmunitarias, cánceres, enfermedades cardiovasculares, trastornos hematopoyéticos, enfermedades de inmunodeficiencia, enfermedades inmunoproliferativas, enfermedades inmunosupresoras, enfermedades inflamatorias o rechazo de trasplantes.
28. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que dicha vacuna estimula una respuesta inmunitaria mediada por células.
29. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que dicha vacuna estimula una respuesta inmunitaria humoral.
30. Una composición farmacéutica que comprende:
(a)
un vehículo de levadura seleccionado de un microorganismo de levadura, un esferoplasto de levadura, un citoplasto de levadura o una envuelta de levadura, comprendiendo dicho vehículo de levadura al menos un compuesto heterólogo que comprende un antígeno o una citocina o una combinación de los mismos; y
(b)
un excipiente farmacéuticamente aceptable para la administración a un animal.
31. La composición farmacéutica según la reivindicación 30, en la que dicho vehículo de levadura está transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica dicho compuesto heterólogo, y en el que dicho vehículo de levadura ha expresado dicho compuesto heterólogo.
32. La composición farmacéutica según la reivindicación 30, en la que dicho vehículo de levadura se ha cargado con dicho compuesto heterólogo.
33. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en la que dicho vehículo de levadura porta al menos dos compuestos heterólogos.
34. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, en la que dicho compuesto es un antígeno seleccionado de uno o más de los siguientes: un antígeno viral, una molécula de superficie de células de mamífero, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, un antígeno de protozoo, un antígeno de helminto, un antígeno de ectoparásito o un antígeno cancerígeno.
35. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en la que dicho vehículo de levadura es de levadura seleccionada de los géneros Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces o Yarrowia.
36. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en la que dicho vehículo de levadura es de la levadura seleccionada de las especies Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris y/o Schizosaccharomyces pombe.
37. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36, en la que dicho vehículo de levadura comprende además un componente heterólogo sobre la membrana externa de dicho vehículo de levadura de tal manera que dicho componente puede dirigir dicho vehículo de levadura a un tipo de célula dado, en la que dicho componente heterólogo comprende uno o más de los siguientes: un anticuerpo, una proteína de la superficie celular, un ligando de Fas, un ligando de receptor o una proteína de la superficie viral.
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