EA014353B1 - Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант - Google Patents

Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант Download PDF

Info

Publication number
EA014353B1
EA014353B1 EA200801307A EA200801307A EA014353B1 EA 014353 B1 EA014353 B1 EA 014353B1 EA 200801307 A EA200801307 A EA 200801307A EA 200801307 A EA200801307 A EA 200801307A EA 014353 B1 EA014353 B1 EA 014353B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
adjuvant
composition
vaccine
influenza
antigen
Prior art date
Application number
EA200801307A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801307A1 (ru
Inventor
Пьер Вандепапелье
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37876836&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA014353(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB0525321.6A external-priority patent/GB0525321D0/en
Priority claimed from GB0609902A external-priority patent/GB0609902D0/en
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200801307A1 publication Critical patent/EA200801307A1/ru
Publication of EA014353B1 publication Critical patent/EA014353B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A61K39/1045—Moraxella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
    • C12N2710/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16771—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложена доза для человека иммуногенной композиции, содержащей антиген или антигенный препарат в комбинации с адъювантом, содержащим иммунологически активную сапониновую фракцию, выделенную из коры Quillaja saponaria molina и представленную в форме липосомы, и липополисахарид, где указанная сапониновая фракция и указанный липополисахарид присутствуют в указанной дозе для человека на уровне ниже 30 мкг. Согласно настоящему изобретению также предложена адъювантная композиция в объеме, подходящем для дозы для человека, содержащая 1-30 мкг липополисахарида и 1-30 мкг иммунологически активной сапониновой фракции, представленной в форме липосомы.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к улучшенным вакцинным композициям, способам их изготовления и их применению в медицине. В частности, данное изобретение относится к адъювантным вакцинным композициям, где адъювант представляет собой липосомную композицию, содержащую сапонин и липополисахарид. Кроме того, настоящее изобретение относится к противогриппозным вакцинным композициям и режимам вакцинации с целью иммунизации против заболевания гриппом.
Предшествующий уровень техники
Потребность в новых композициях или вакцинах с повышенной иммуногенностью существует всегда. В качестве одной из стратегий использовали адъюванты с целью изучения и усиления иммунного ответа, вызванного любым данным антигеном.
Липополисахариды (ЬР8) представляют собой основную поверхностную молекулу и располагаются исключительно во внешнем слое наружной мембраны грамотрицательных бактерий. ЬР8 препятствуют деструкции бактерий под действием сывороточных комплементов и фагоцитарных клеток и вовлечены в адгезию при колонизации. ЬР8 представляют собой группу родственных по структуре сложных молекул приблизительно размером 10000 Да и состоят из трех ковалентно связанных областей:
(1) О-специфическая полисахаридная цепь (О-антиген) на внешней области;
(2) коровая олигосахаридная центральная область;
(3) липид А - лежащая глубоко внутри область, которая служит в качестве гидрофобного якоря, она содержит глюкозаминовые дисахаридные единицы, несущие жирные кислоты с длинной цепью.
Было показано, что биологические активности ЬР8, такие как летальная токсичность, пирогенность и адъювантность, связаны с группировкой липида А. И, наоборот, иммуногенность ассоциируется с О-специфическим полисахаридным компонентом (О-антиген). Давно известно, что как ЬР8, так и липид А обладают сильными адъювантными эффектами, но высокая токсичность этих молекул мешает их применению в вакцинных композициях. Поэтому было сделано значительное усилие по снижению токсичности ЬР8 или липида А с одновременным сохранением их адъювантности.
Мутант Н595 8а1тоие11а тшпс501а был выделен в 1966 году из культуры родительского гладкого штамма (ЬибегЦ/ е1 а1. 1966 Апп. N. Υ. Асаб. 8с1. 133: 349-374). Отобранные колонии подвергали скринингу на чувствительность к лизису набором фагов и для следующего исследования отбирали только те колонии, которые демонстрировали узкий диапазон чувствительности (чувствительны только к одному или двум фагам). Эта работа привела к выделению сильно шероховатого мутантного штамма, который оказался дефектен в отношении биосинтеза ЬР8 и был назван 8.тшпе501а Н595.
По сравнению с другими ЬР8, ЬР8, продуцируемые мутантом 8.1шппе501а Н595, имеют относительно простую структуру:
(1) они не содержат О-специфическую область - свойство, отвечающее за изменение от гладкого фенотипа дикого типа к мутантному шероховатому фенотипу и приводящее к потере вирулентности;
(2) коровая область является очень короткой - это свойство увеличивает чувствительность штамма к ряду химических реагентов;
(3) группировка липида А значительно ацилирована, до 7 жирных кислот включительно.
4'-Монофосфориллипид А (МРЬ), который может быть получен кислотным гидролизом ЬР8, эстрагированного из сильно шероховатого мутантного штамма грамотрицательных бактерий, сохраняет адъювантные свойства ЬР8, демонстрируя токсичность, сниженную более чем в 1000 раз (что измерено с использованием летальной дозы на куриных эмбрионах) (1ойи5оп е1 а1. 1987 Неу. 1пГес1. Όίδ. 9 8ирр1.: 8512-8516). Обычно ЬР8 кипятят с обратным холодильником в растворах минеральной кислоты средней силы (например, 0,1 М НС1) в течение периода времени приблизительно 30 мин. Этот способ приводит к дефосфорилированию по положению 1 и декарбоксилированию по положению 6' и получению МРЬ.
3-О-Деацилированный монофосфориллипид А (30-МРБ). который может быть получен мягким щелочным гидролизом МРЬ, обладает еще более сниженной токсичностью вновь с сохранением адъювантности, см. и8 4912094 (Н1Ь1 1ттииосйет1са15). Щелочной гидролиз обычно проводят в органическом растворителе, таком как смесь хлороформ/метанол, путем насыщения водным раствором слабого основания, такого как 0,5 М карбонат натрия, при рН 10,5.
Дополнительная информация по получению 30-МРБ доступна, например, в И8 4912094 и \νϋ 02/078637 (Сопха Сотрогайоц).
Сапонины Ош11а)а представляют собой смесь тритерпеновых гликозидов, экстрагированных из коры дерева Ош11а)а Еаропапа. Неочищенные сапонины интенсивно применяют в качестве адъювантов в ветеринарии. 0ш1-А представляет собой частично очищенный водный экстракт содержащего сапонин Ош11а)а материала. 0821 представляет собой очищенную с использованием НРЬС нетоксичную фракцию 0υί1 А, и способ его получения описан (как для 0А21) в патенте США № 5057540.
В качестве примера были разработаны противогриппозные вакцины и вакцины против вируса папилломы человека (НРУ) с адъювантами.
Вирус гриппа является одним из наиболее распространенных в мире вирусов, поражающих как людей, так и домашний скот. Грипп приводит к экономическому бремени, заболеваемости и даже смертности, которые являются значительными.
- 1 014353
Вирус гриппа представляет собой заключенный в оболочку РНК-содержащий вирус с размером частицы приблизительно 125 нм в диаметре. По существу, он состоит из внутреннего нуклеокапсида или сердцевины из рибонуклеиновой кислоты (РНК), ассоциированной с нуклеопротеином, окруженного вирусной оболочкой с бислойной липидной структурой и внешними гликопротеинами. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из матриксных белков, а внешний слой - главным образом из липидного материала хозяина.
Вирус гриппа содержит два поверхностных антигена - гликопротеины нейраминидазу (ΝΑ) и гемагглютинин (НА), которые находятся в виде шипов длиной 10-12 нм на поверхности частиц. Эти поверхностные белки, в частности гемагглютинин, определяют антигенную специфичность подтипов вируса гриппа.
Эти поверхностные антигены постепенно, иногда быстро, подвергаются некоторым изменениям, приводящим к антигенному разнообразию вируса гриппа. Эти антигенные изменения, называемые дрейф и шифт, являются непредсказуемыми и могут оказывать сильное воздействие с иммунологической точки зрения, поскольку они в конечном счете приводят к появлению новых штаммов вируса гриппа, что позволяет вирусу ускользать от иммунной системы и вызывать хорошо известные, почти ежегодные эпидемии.
Штаммы вируса гриппа, которые каждый сезон подлежат включению в противогриппозную вакцину, определяются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в содружестве с национальными службами здравоохранения и производителями вакцин.
НА представляет собой наиболее важный антиген в определении серологической специфичности разных штаммов вируса гриппа. Этот белок 75-80 кДа содержит многочисленные антигенные детерминанты, некоторые из которых находятся в участках, последовательности которых различаются у разных штаммов (штамм-специфические детерминанты), а другие - в участках, являющихся общими для многих молекул НА (общие детерминанты).
Вирусы гриппа являются причиной эпидемий почти каждую зиму с уровнями заболеваемости для вируса типа А или В до 40% в течение 6-недельного периода. Гриппозная инфекция вызывает различные болезненные состояния: от бессимптомной инфекции через слабую инфекцию верхних дыхательных путей до тяжелой вирусной пневмонии. Обычные эпидемии гриппа вызывают увеличение случаев пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует увеличение частоты госпитализации или смертности. Тяжесть заболевания определяется главным образом возрастом реципиента, его иммунным статусом и местом инфекции.
Пожилые люди 65 лет и старше особенно уязвимы, с ними связывают 80-90% всех случаев ассоциированной с гриппом смерти в развитых странах. Индивидуумы с хроническими заболеваниями также скорее всего будут испытывать такие осложнения. Маленькие дети также могут страдать тяжелым заболеванием. Поэтому эти группы особенно нуждаются в защите. Кроме этих групп риска, службы здравоохранения также рекомендуют вакцинировать здоровых взрослых людей, которые находятся в контакте с пожилыми людьми.
Вакцинация играет критическую роль в регулировании ежегодных эпидемий гриппа. Доступные в настоящее время противогриппозные вакцины представляют собой либо инактивированную, либо живую аттенуированную противогриппозную вакцину (Ди-вакцину). В состав инактивированных Ди-вакцин входят три возможные формы антигенного препарата: инактивированный цельный вирус, субвирионы, когда очищенные вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки (так называемая сплит-вакцина), или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина). Эти инактивированные вакцины вводят внутримышечно (в/м) или интраназально (и/н).
Противогриппозные вакцины всех видов обычно представляют собой трехвалентные вакцины. Как правило, они содержат антигены двух штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В. Стандартная 0,5-мл инъекционная доза в большинстве случаев содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма, как измерено простой радиальной иммунодиффузией (8ΚΌ) (Д.М. \Уооб е! а1., Ап Дтртоуеб кшд1е табДа1 пптипоббТикюп 1сс11пк|ис Дог 1йе аккау оД тПиепха йаетадд1ибηίη апйдеи: абарДабоп Дог ро!епсу беДегтшаДоп оД шасДуаДеб \\!ю1е уДик апб киЬипй уасстек. Д. Βίο1. 8Дапб. 5 (1977), 237-247; Д.М. \Уооб е! а1., 1п1егпа1юпа1 соПаЬогаДуе к!ибу оД ктд1е табДа1 бДДикюп апб 1ттипое1ес1горНогек1к ДесДшциек Дог Ле аккау оД ДаетаддЛДшп апДдеп оД тПиепха уДик. Д. Вю1. 81апб. 9 (1981), 317-330).
Доступные в настоящее время противогриппозные вакцины считаются безопасными для всех возрастных групп (Эе ЭопаЮ е! а1. 1999, УассДпе, 17, 3094-3101). Однако имеется мало указаний на то, что существующие противогриппозные вакцины работают у маленьких детей в возрасте до двух лет. Кроме того, приведенные в работах коэффициенты эффективности вакцин в предупреждении типичного подтвержденного гриппозного заболевания составляют 23-72% для пожилых людей, что значительно ниже коэффициентов эффективности 60-90%, приведенных для более молодых взрослых людей (ОоуаетД, 1994, Д. Ат. Меб. Аккос., 21, 166-1665; Отокк, 1995, Апп. ДпДетп. Меб. 123, 523-527). Показано, что эффективность противогриппозной вакцины коррелирует с сывороточными титрами антител, ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ), к данному вирусному штамму, и в нескольких исследованиях обнаружено, что
- 2 014353 более пожилые люди демонстрируют более низкие ΗΙ-титры после иммунизации вирусом гриппа, чем более молодые взрослые люди (Мигакко, 2002, Ехрептеи1а1 дегои!о1оду, 37, 427-439).
Следовательно, все еще существует потребность в новых вакцинах с повышенной иммуногенностью. Композиция вакцинного антигена с высокоэффективными адъювантами представляет собой возможный подход к усилению иммунных ответов на субвирионные антигены.
Субъединичная противогриппозная вакцина с адъювантом МЕ59 в форме эмульсии типа масло-вводе имеется в продаже и продемонстрировала свою способность индуцировать более высокий титр антител, чем титр, полученный с использованием безадъювантной субъединичной вакцины (Эе ЭопаЮ е1 а1. 1999, Уассте, 17, 3094-3101). Однако в более поздней публикации та же самая вакцина не продемонстрировала улучшенный профиль по сравнению с безадъювантной сплит-вакциной (Ршд-ВагЬега е1 а1., 2004, Уаеете, 23, 283-289).
В порядке пояснения, во время межпандемических периодов циркулируют вирусы гриппа, которые родственны вирусам предшествующей эпидемии. Эти вирусы распространяются среди людей с разными уровнями иммунитета к инфекциям, полученного в предшествующий период жизни. Такая циркуляция в течение периода обычно 2-3 лет стимулирует отбор новых штаммов, которые изменились в достаточной степени для того, чтобы вновь вызвать эпидемию у населения в целом; этот процесс обозначается термином антигенный дрейф. Дрейфующие варианты могут оказывать разные воздействия в разных сообществах, регионах, странах или континентах в течение какого-либо одного года, однако через несколько лет их суммарное воздействие часто будет аналогичным. Другими словами, пандемия гриппа имеет место тогда, когда появляется новый вирус гриппа, против которого у человеческой популяции нет иммунитета. Обычные эпидемии гриппа вызывают увеличение случаев пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует увеличение коэффициентов госпитализации или смертности. Пожилые люди или люди с хроническими заболеваниями почти наверняка будут подвержены таким осложнениям, а маленькие дети также могут страдать тяжелым заболеванием.
С непредсказуемыми интервалами возникают новые вирусы гриппа с подтипом ключевого поверхностного антигена, представляющего собой гемагглютинин, полностью отличающимся от подтипа в штаммах, циркулирующих в предыдущем сезоне. И здесь, полученные антигены могут отличаться на 20-50% от соответствующего белка штаммов, которые ранее циркулировали среди людей. Это может приводить к ускользанию вируса от иммунитета населения и установлению пандемий. Это явление названо антигенным шифтом. Полагают, что, по меньшей мере, в прошлом пандемии происходили тогда, когда вирус гриппа из разных видов, как, например, птичий вирус гриппа или вирус гриппа свиньи, пересекал видовой барьер. Если такие вирусы обладают способностью распространяться от субъекта к субъекту, то они могут распространиться по всему миру в пределах от нескольких месяцев до 1 года, что приводит к пандемии. Например, в 1957 г. (пандемия азиатского гриппа (Лиа Е1и)) вирусы подтипа Η2Ν2 вытеснили вирусы Η1Ν1, которые циркулировали в человеческой популяции, по меньшей мере, с 1918 г., когда впервые был выделен данный вирус. Н2 НА и N2 ΝΑ подвергались антигенному дрейфу в промежутке между 1957 и 1968 гг. до тех пор, пока НА не был вытеснен в 1968 г. (пандемия гонгконгского гриппа (Ноид-Коид Е1и)) в результате появления подтипа вируса гриппа Η3Ν2, после чего N2 ΝΑ продолжал дрейфовать вместе с Н3 НА (Ыака_рта е1 а1., 1991, ЕрИетю1. 1пГес1. 106, 383-395).
Свойствами штамма вируса гриппа, которые делают его способным вызывать вспышку пандемии, являются следующие: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином штаммов, циркулирующих в настоящий момент, что может сопровождаться или не сопровождаться изменением в подтипе нейраминидазы; он обладает способностью передаваться горизонтально в человеческой популяции; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не проявлялся в человеческой популяции в течение продолжительного периода времени, возможно, в течение нескольких десятилетий, как, например Н2. Или же он может представлять собой гемагглютинин, не циркулировавший в человеческой популяции раньше, например Н5, Н9, Н7 или Н6, которые обнаружены у птиц. В любом случае большинство или, по меньшей мере, большая часть популяции или даже вся популяция раньше не сталкивались с данным антигеном и являются иммунологически наивной по отношению к нему.
Папилломавирусы представляют собой небольшие ДНК-содержащие онкогенные вирусы, обладающие высокой видовой специфичностью. К настоящему времени описано более 100 индивидуальных генотипов папилломавирусов человека (ПРУ). Как правило, ΗΡν специфичны либо к поверхности кожи (например, №У-1 и -2), либо к поверхностям слизистых оболочек (например, ΗΡν-6 и -11), и обычно вызывают образование доброкачественных опухолей (бородавок), которые существуют в течение нескольких месяцев или лет. Такие доброкачественные опухоли могут причинять беспокойство индивидуумам, однако, за некоторыми исключениями, они не представляют угрозы для жизни.
Некоторые ΗΡν также ассоциированы с видами рака. Очень сильной положительной связью между ΗΡν и раком человека является связь, существующая между ΗΡν-16 и ΗΡν-18 и цервикальной карциномой. Цервикальный рак представляет собой самое распространенное злокачественное новообразование в развивающихся странах, и каждый год в мире регистрируется приблизительно 500000 новых случаев. В настоящее время технически возможно активно бороться с первичными инфекциями ΗΡν-16 и даже с
- 3 014353 установленными видами НРУ-16-содержащего рака, используя вакцины. Для обзора перспектив профилактической и терапевтической вакцинации против НРУ-16 см. Сакоп 1., Сйп. 1ттипо111сг.. 1994, 1(4), 293-306 и Надепекее М.Е., 1пГесйопк ίη Мебюте, 1997, 14(7), 555-556, 559-564.
Несмотря на наличие небольших вариаций, все описанные геномы НРУ имеют по меньшей мере восемь ранних генов, от Е1 до Е8, и два поздних гена Ь1 и Ь2. В дополнение к этому, расположенный выше по течению регуляторный участок содержит регуляторные последовательности, которые, повидимому, контролируют большинство транскрипционных событий генома НРУ.
Вакцины на основе Ь1 НРУ раскрыты в \\'О 94/00152, \\'О 94/20137, \\'О 93/02184 и \\'О 94/05792. Такая вакцина может содержать антиген Ь1 в виде мономера, капсомера или вирусоподобной частицы (УЪР). Способы получения УЪР хорошо известны в данной области техники и включают подходы разборки-сборки УЪР для достижения повышенной гомогенности, например, как описано в \УО 9913056 и И8 6245568. Такие частицы дополнительно могут содержать белки Ь2. Вакцины на основе Ь2 описаны, например, в \УО 93/00436. Другие подходы к созданию вакцин против НРУ основаны на использовании ранних белков, таких как Е7, или слитых белков, таких как Ь2-Е7.
Все еще имеется потребность в улучшенных вакцинах, особенно в случае гриппа и при конкретных пандемиях вируса гриппа и для пожилого населения или в случае НРУ-вакцин.
Адъюванты, содержащие комбинации липополисахарида и сапонинов 0ш11а_)а, были описаны ранее, например в ЕР 0671948. В этом патенте продемонстрирован сильный синергизм, когда липополисахарид (30-МРЙ) был скомбинирован с сапонином Ош11а)а (0821). В настоящее время обнаружено, что хорошие адъювантные свойства могут быть достигнуты при использовании комбинаций липополисахарида и сапонина 0ш11а_)а в качестве иммуностимуляторов в адъювантной композиции, даже если эти иммуностимуляторы присутствуют в низком количестве в дозе для человека.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген или его антигенный препарат в комбинации с адъювантной композицией, содержащей иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарид.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат в комбинации с сапониновым адъювантом, представленным в форме липосомы. В конкретном воплощении этого аспекта иммуногенная композиция дополнительно содержит производное липида А, такое как 30-МРЙ.
Подходящим образом сапониновый адъювант в форме липосомы согласно изобретению содержит активную фракцию сапонина, полученного из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, такую как 0821, и стерин, такой как холестерин, в соотношении сапонин:стерин от 1:1 до 1:100 мас./мас.
В частности, указанная иммуногенная композиция содержит антиген с СИ4 Т-клеточным эпитопом. Альтернативно, указанная иммуногенная композиция содержит антиген с В-клеточным эпитопом.
Изобретение также относится к применению вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом гриппа.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов вируса папилломы человека или их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом папилломы человека.
Изобретение также относится к применению цитомегаловирусного антигена или антигенов либо их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения цитомегаловирусной инфекции и/или заболевания.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов 8йер1ососсик рпеитошае либо их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных 81герЮсосспк рпеитошае.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов Р1актобшт Га1с1рагит либо их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных Р1актобшт ГаЮрагит.
- 4 014353
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов вируса ветряной оспы либо его антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа. представленную в форме липосомы, и липополисахарида в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом ветряной оспы.
В другом аспекте предложено применение (а) антигена или его антигенного препарата и (б) адъюванта, как он определен выше, в изготовлении иммуногенной композиции для индуцирования у человека по меньшей мере одного, или по меньшей мере двух, или всех показателей из следующего: (1) усиленного СИ4 Т-клеточного иммунного ответа против указанного антигена или его антигенного препарата; (2) усиленного гуморального иммунного ответа против указанного антигена или его антигенного препарата, (3) усиленного ответа В-клеток памяти против указанного антигена или его антигенного препарата.
В частности, указанным антигеном является антиген или антигенный препарат вируса гриппа (ИРУ), цитомегаловируса (СМУ), вируса ветряной оспы (νζν), 81гер1ососеи5 рпеитошае или малярии, а указанным человеком является индивидуум или популяция с ослабленным иммунитетом, такие как взрослый человек из группы с высоким риском, пожилой человек или ребенок в возрасте менее двух лет. В конкретном воплощении предложено применение антигена или его антигенного препарата и адъюванта, который определен в данном описании, в изготовлении иммуногенной композиции для вакцинации человека, в частности пожилого человека, против патогена, из которого происходит антиген в данной иммуногенной композиции. Конкретно, указанным антигеном является антиген или антигены либо антигенный препарат вируса гриппа, вируса папилломы человека, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, §!гер1ососси5 рпеитошае, Р1а§тобшт рагакйе.
Кроме того, предложен способ вакцинации, включающий доставку антигена или антигенной композиции, в частности антигена или антигенного препарата вируса гриппа или НРУ, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, 81гер1ососсн5 рпеитошае, Р1а§тобшт рагакйе, и адъюванта, который определен выше, индивидууму или популяции, нуждающимся в этом.
В конкретном воплощении иммуногенная композиция способна индуцировать усиленный СИ4 Т-клеточный иммунный ответ против указанного антигена или его антигенного препарата и, в частности, также способна индуцировать либо гуморальный иммунный ответ, либо усиленный ответ В-клеток памяти или оба ответа по сравнению с ответом, полученным с безадъювантным(ой) антигеном или антигенной композицией. Конкретно, указанный СИ4 Т-клеточный иммунный ответ включает индукцию перекрестно-реактивного СИ4 Т-хелперного ответа. Конкретно, указанный гуморальный иммунный ответ включает индукцию перекрестно-реактивного гуморального иммунного ответа.
В другом воплощении предложены способ или применение, как определено выше, для защиты против инфекции или заболевания, вызываемых патогеном, представляющим собой вариант патогена, из которого происходит антиген в иммуногенной композиции.
В другом воплощении предложены способ или применение, как определено выше, для защиты против инфекций или заболевания, вызываемых патогеном, содержащим антиген, являющийся вариантом того антигена в иммуногенной композиции.
В конкретном воплощении предложено применение антигена, в частности вируса гриппа или НРУ, или его антигенного препарата, в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных иммуногенной композицией, содержащей антиген, в частности вирус гриппа или НРУ, или его антигенный препарат, в комбинации с адъювантом, который приведен в данном описании.
В конкретном воплощении композиция, используемая для ревакцинации, может дополнительно содержать адъювант.
В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит антиген, который имеет общие СИ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном или антигенной композицией, используемыми для предшествующей вакцинации. Конкретно, иммуногенная композиция для ревакцинации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СИ4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или антигенным препаратом этого вируса, используемыми для первой вакцинации.
В одном из аспектов проводят ревакцинацию субъектов, которые были вакцинированы против вируса гриппа предыдущего сезона. Обычно ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев. В другом аспекте проводят ревакцинацию субъектов, которые были вакцинированы композицией, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, где по меньшей мере один штамм ассоциирован со вспышкой пандемии или может быть связан с пандемией.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа в изготовлении иммуногенной композиции, которая определена в данном описании, для защиты против инфекции вирусом гриппа, вызванной вариантным штаммом вируса гриппа.
Изобретение также относится к способу вакцинации, включающему доставку вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта, как определено в данном описании.
- 5 014353
В другом аспекте предложен способ вакцинации отдельного человека или человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, таких как взрослые люди из группы с высоким риском или пожилые люди, включающий введение противогриппозной иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат в комбинации с адъювантом, как определено в данном описании.
В еще одном воплощении изобретения предложен способ ревакцинации людей, ранее вакцинированных противогриппозной иммуногенной композицией, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат по меньшей мере из одного из штаммов вируса гриппа в комбинации с адъювантом, как определено в данном описании, включающий введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, как с адъювантом, так и без адъюванта. Изобретение также относится к способу изготовления иммуногенной композиции, включающему комбинирование сапонинового адъюванта в форме липосомы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом и возможно с ЗИ-МРЬ.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны далее в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений.
Описание графических материалов
Фиг. 1 - схематическое представление получения препарата МРЬ.
Фиг. 2 - гуморальный ответ против различных штаммов вируса гриппа после иммунизации хорьков исследуемыми композициями: тест на ингибирование гемагглютинации (СМТ(средние геометрические титры) ± ДИ 95) до и после гетерологичного примирования (Η1Ν1 А/81оскйо1т/24/90), после иммунизации (Η1Ν1 А/№\\' Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 А/Рапата/2007/99 и В/8йапдбопд/7/97) и после гетерологичного контрольного заражения (Η3Ν2 АЖуотшд/3/2003).
Фиг. 3 - исследование на хорьках: титрование вирусов в назальных смывах после контрольного заражения (42-е сутки).
Фиг. 4 - исследование на мышах: гуморальный ответ против трех вакцинных штаммов вируса гриппа после иммунизации мышей исследуемыми композициями: тест на ингибирование гемагглютинации (6МТ ± ДИ 95) через 21-е сутки после иммунизации (Η1Ν1 Λ/№\ν Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 АЖуотшд/3/2003 и В/Лапд§ц/10/2003).
Фиг. 5 - исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунный ответ: Е1и-специфичные ответы СИ4+ Т-клеток на 7-е сутки после иммунизации.
Фиг. 6 - исследование на мышах: СМ1 для СИ4 ответа согласно тесту все по два на пул антигенов на 0- и 21-е сутки.
Фиг. 7. СМТ на 0- и 21-е сутки для ΗΙ-антител.
Фиг. 8. Частота встречаемости местных и общих симптомов у людей (общих и с оценкой 3), наблюдаемая в течение 7-дневного периода контрольного наблюдения после иммунизации адъювантными противогриппозными композициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 9. Гуморальные ответы на Ь1 ИРУ 16 и 18 у мышей после иммунизации адъювантными ИРУкомпозициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 10. Клеточно-опосредованный иммунный ответ у мышей: окрашивание внутриклеточных цитокинов - СИ4+ Т-клетки УЪР16 и 18 после иммунизации адъювантными КРУ-композициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 11. Продуцирование специфических В-клеток памяти после иммунизации адъювантными ПРУ-композициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 12. Доклинические результаты сравнения адъювантных вакцин на основе 8.рпеитошае на мышах; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 13. Анти-дВ ЕЬ18А-титры после иммунизации морских свинок адъювантной вакциной на основе дВ; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 14. Титры анти-СМУ-нейтрализующих антител после иммунизации морских свинок адъювантной вакциной на основе дВ; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 15. Анти-дВ ЕШЗА-титры после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе дВ.
Фиг. 16. Титры анти-СМУ-нейтрализующих антител после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе дВ.
Фиг. 17. Исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунитет - СМУ-специфические СИ4+ и СИ8+ клетки после повторной стимуляции пулом дВ пептидов (через 7 суток после второй иммунизации).
Фиг. 18. Исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунитет - СМУ-специфические СИ4+ клетки после повторной стимуляции двумя разными дозировками пула дВ пептидов (через 21-е сутки после второй иммунизации).
- 6 014353
Фиг. 19. Исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунитет - СМУ-специфические СЭ8+ клетки после повторной стимуляции двумя разными дозировками пула дВ пептидов (через 21-е сутки после второй иммунизации).
Фиг. 20. Средние геометрические титры (СМТ) антител к циркумспорозоитному белку (С8Р) после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе КТ8.8; сравнение адъювантов, имеющих иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 21. Средние геометрические титры (СМТ) антител против поверхностного антигена вируса гепатита В (НВк) после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе КТ8.8; сравнение адъювантов с иммуностимуляторами в двух разных концентрациях.
Фиг. 22. Экспрессия ех νίνο 1Ь-2 (интерлейкин-2) и/или ΙΡΝ (интерферон)-гамма
С8Р-специфическими СЭ4 и СЭ8 Т-клетками после иммунизации адъювантной иммуногенной композицией на основе КТ8.8; сравнение адъювантов с иммуностимуляторами в двух разных концентрациях.
Фиг. 23. Экспрессия ех νίνο 1Ь-2 и/или ΙΡΝ-γ НВк-специфическими СЭ4 и СЭ8 Т-клетками после иммунизации адъювантной иммуногенной композицией на основе КТ8.8; сравнение адъювантов с иммуностимуляторами в двух разных концентрациях.
Фиг. 24. Гуморальные ответы у мышей после иммунизации адъювантной трехвалентной противогриппозной сплит-вакциной (Λ/№\ν Са1еёоша. ААУуотшд. В/Лаидки); иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 25. Клеточно-опосредованный иммунный ответ у мышей после иммунизации адъювантной трехвалентной противогриппозной вакциной (Λ/№\ν Са1еёоша. ЛАУуоттд. В/Лаидки); иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 26. Доклинические результаты сравнения на мышах вакцин на основе дЕ νζν с адъювантом Л801В или Л801Е.
Фиг. 27. Титры вирусов в назальных смывах у хорьков после примирования и контрольного заражения антигенами вируса гриппа - иммунизация либо простой, либо адъювантной композициями Λ/№\ν Са1еёоша. ЛАУуотшд. В/Лаидки. содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 28. Мониторинг температуры тела у хорьков после примирования и контрольного заражения антигенами вируса гриппа. Иммунизация либо простой. либо адъювантной композициями Λ/№\ν Са1еёоша. ЛАУуотшд. В/Лаидки. содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 29. Анти-Н1-титры для штаммов А в трехвалентной вакцинной композиции после иммунизации и контрольного заражения антигенными препаратами вируса гриппа. Иммунизация либо простой. либо адъювантной композициями Λ/№\ν Са1еёоша. ЛАУуотшд. В/Лаидки. содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 30. Анти-Н1-титры для В/Лаидки и дрейфующего штамма. используемого для контрольного заражения. после иммунизации и контрольного заражения антигенными препаратами вируса гриппа. Иммунизация либо простой. либо адъювантной композициями Λ/№\ν Са1еёоша. ААУуотшд. В/Лаидки. содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Подробное описание
Авторы настоящего изобретения открыли. что адъювантная композиция. содержащая сапонин. представленный в форме липосомы. и липополисахарид. в которой каждый иммуностимулятор представлен на уровне. равном или ниже 30 мкг на дозу для человека. может усилить иммунные ответы на антигенный препарат. в то же самое время имея более низкую реактогенность. чем некоторые композиции предшествующего уровня техники. в которых иммуностимуляторы были представлены в более высоких уровнях на дозу для человека.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили. что противогриппозная композиция. содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом. содержащим сапонин. представленный в форме липосомы. и возможно дополнительно с производным липида А. таким как 3Ό-ΜΡΕ. способна усиливать СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против указанного антигена или антигенной композиции по сравнению с таковым. полученным с использованием безадъювантного вируса или его антигенного препарата. Композиции с сапонином в качестве адъюванта. представленным в форме липосомы. предпочтительно используют для индукции СЭ4 Т-клеточных ответов против вируса гриппа. способных определять эпитопы вируса гриппа. представленные молекулами класса II МНС (главный комплекс гистосовместимости). Авторы настоящего изобретения обнаружили. что в качестве мишени эффективно воздействовать на клеточно-опосредованную иммунную систему для того. чтобы усилить иммунный ответ против гомологичных и дрейфующих штаммов вируса гриппа (после вакцинации и инфекции).
Конкретным воплощением настоящего изобретения является то. что композиции для применения в настоящем изобретении могут быть способны обеспечить у людей улучшенную серопротекцию против гриппа после ревакцинации. как оценено по числу субъектов-людей. удовлетворяющих коррелятам защиты для гриппа. Кроме того. другим конкретным воплощением является то. что композиция для применения в настоящем изобретении также будет способна индуцировать более высокий ответ В-клеток памяти после первой вакцинации субъекта-человека и более высокий гуморальный ответ после ревакци- 7 014353 нации по сравнению с безадъювантной композицией.
Адъювантные противогриппозные композиции согласно изобретению имеют несколько преимуществ:
1) повышенную иммуногенность: они позволят восстановить слабый иммунный ответ у пожилых людей (в возрасте старше 50 лет, обычно в возрасте старше 65 лет) до уровней, наблюдаемых у молодых людей (антительные и/или Т-клеточные ответы);
2) улучшенный профиль перекрестного иммунитета: увеличенный перекрестный иммунитет против вариантных (дрейфующих) штаммов вируса гриппа;
3) они также позволят уменьшить дозировку антигена для получения аналогичного ответа, тем самым гарантируя увеличенный потенциал в чрезвычайных обстоятельствах (пандемии, например).
В другом аспекте изобретения авторы изобретения открыли, что адъювантная композиция, которая определена в данном описании, демонстрирует результаты по иммуногенности как в отношении продуцирования антител, так и в отношении частоты встречаемости после вакцинации специфичных к вирусу гриппа ί.Ό4. которые эквивалентны или иногда превышают результаты, полученные с применением безадъювантной вакцины. Этот эффект особенно ценен для пожилого населения и может быть достигнут при применении адъюванта, который определен в данном описании, содержащего пониженную дозу иммуностимуляторов. В дополнение к этому показано, что симптомы реактогенности показали тенденцию к увеличению в группе получавших вакцину, дополненную адъювантом с самой высокой концентрацией иммуностимуляторов, по сравнению с группой получавших адъювантную вакцину, в которой иммуностимуляторы представлены в более низкой концентрации.
Эти полученные данные могут быть применены к другим формам тех же антигенов и к другим антигенам.
Сапониновый адъювант.
Адъювантная композиция по изобретению содержит сапониновый адъювант, представленный в форме липосомы.
Особенно подходящим сапонином для применения в настоящем изобретении является Οιιίΐ А и его производные. 0ш1 А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дерева 0ш11а)а каропапа то1ша, и впервые был описан Эа1кдаагб и др. в 1974 г. (8арошп абщуапГк, АгсЫу. £иг άίο декатГе У1гик£огксйипд, Уо1. 44, 8ргтдег Уег1ад, Вег1ш, р. 243-254) как обладающий адъювантной активностью. Очищенные фрагменты Οιιί1 А были выделены с помощью НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография), что сохраняет адъювантную активность без токсичности, связанной с 0ш1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известные как 0Л7 и 0Л21). 08-21 является природным сапонином из коры 0ш11а)а каропапа то1ша, который индуцирует СЭ8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), Тй1-клетки и преобладающий 1дО2а антительный ответ, и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения.
В подходящем воплощении настоящего изобретения сапониновый адъювант в иммуногенной композиции представляет собой производное 0ш1 А каропапа то1ша, предпочтительно иммунологически активную фракцию 0ш1 А, такую как 08-17 или 08-21, наиболее подходит 08-21. В одном из воплощений композиции по изобретению содержат иммунологически активную сапониновую фракцию, по существу, в чистой форме. Предпочтительно композиции по изобретению содержат 0821, по существу, в чистой форме, иначе говоря, чистота 0821 составляет по меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%.
В конкретном воплощении 0821 предложен в своей менее реактогенной композиции, где он блокирован экзогенным стерином, таким как, например, холестерин. Существует несколько конкретных форм менее реактогенных композиций, где 0821 блокирован экзогенным холестерином. В конкретном воплощении сапонин/стерин находится в форме липосомной структуры (\УО 96/33739, пример 1). В этом воплощении липосомы соответственно содержат нейтральный липид, например фосфатидилхолин, который соответственно не является кристаллическим при комнатной температуре, например фосфатидилхолин яичного желтка, диолеоилфосфатидилхолин (ЭОРС) или дилаурилфосфатидилхолин. Липосомы также могут содержать заряженный липид, который увеличивает стабильность структуры липосома0821 для липосом, составленных из насыщенных липидов. В этих случаях количество заряженного липида составляет соответственно 1-20% мас./мас., предпочтительно 5-10%. Соотношение стерина и фосфолипида составляет 1-50% (моль/моль), наиболее подходит 20-25%.
Подходящие стерины включают β-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, эргокальциферол и холестерин. В одном конкретном воплощении адъювантная композиция в качестве стерина содержит холестерин. Такие стерины хорошо известны в данной области, например холестерин описан в Мегск 1пбех, 11-е изд., с. 341, как стерин природного происхождения, обнаруженный в животном жире.
Адъювантные композиции по изобретению, содержащие 0821 и стерин, в частности холестерин, демонстрируют пониженную реактогенность при сравнении с композициями, в которых стерин отсутствует, при сохранении адъювантного эффекта. Исследования реактогенности могут быть проведены согласно способам, описанным в \УО 96/33739. Используемый согласно изобретению стерин означает экзогенный стерин, т. е. стерин, который не является эндогенным для организма, из которого готовят анти
- 8 014353 генный препарат, а его добавляют к антигенному препарату или позже в момент изготовления композиции. Обычно стерин может быть добавлен в процессе последующего изготовления композиции антигенного препарата с сапониновым адъювантом путем использования, например, сапонина в форме, блокированной стерином. Соответственно экзогенный стерин приводят в ассоциацию с сапониновым адъювантом, как описано в \УО 96/33739.
Когда активной сапониновой фракцией является 0821. соотношение О821:стерин обычно будет составлять порядка 1:100-1:1 (мас./мас.), соответственно 1:10-1:1 (мас./мас.) и предпочтительно 1:5-1:1 (мас./мас.). Соответственно имеется избыток стерина, при этом соотношение О821:стерин составляет по меньшей мере 1:2 (мас./мас.). В одном из воплощений соотношение О821:стерин равно 1:5 (мас./мас.). Удобно, когда стерином является холестерин.
Другие полезные сапонины выделены из растений Ле8си1и8 Ырроса81апит или ОуорЫ11а 81ти1Ыит. Другие сапонины, описанные в литературе, включают эсцин (езсш), который был описан в Мегск шйех (12-е изд.: входной номер 3737) в виде смеси сапонинов, представленных в семенах дерева конского каштана обыкновенного, латинское название: Ле8си1и8 Ырроса81апит. Описано его выделение с использованием хроматографии и очистки (Ией1ег, Лг/пе1тЦ1е1-Еог8с11. 4, 213 (1953)) и с использованием ионообменных смол (ЕтЬппд и др., И8 3238190). Фракции эсцина были очищены и показана их биологическая активность (УозЫка^а М., е! а1. (Сйет. Рйатт. Ви11. (Токуо), 1996, Лид; 44(8): 1454-1464)). Сапоалбин (зароа1Ь1п) из ОурзорЫНа 81ш1Ыит (В. УосЫеп е! а1., 1968, 1. Рйатт. Ве1д., 42, 213-226) также был описан, например, в связи с образованием 18СОМ (иммуностимулирующий комплекс).
Ключевым аспектом настоящего изобретения является то, что иммунологически активный сапонин, предпочтительно представляющий собой 0821, может быть использован в более низких количествах, чем полагали ранее для оказания полезного действия, целесообразно ниже 30 мкг, например от 1 до 30 мкг, на дозу иммуногенной композиции для человека.
Следовательно, согласно изобретению предложена доза иммуногенной композиции для человека, содержащей иммунологически активный сапонин, предпочтительно 0821, на уровне 30 мкг или меньше, например от 1 до 30 мкг.
В одном из воплощений иммуногенная композиция представлена в объеме, подходящем для дозы для человека, при этом доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 25 мкг, например 20-30 мкг, соответственно 21-29 мкг, или 22-28 мкг, или 23-27 мкг, или 24-26 мкг, или 25 мкг. В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 10 мкг, например 5-15 мкг, соответственно 6-14 мкг, например 7-13 мкг, или 8-12 мкг, или 9-11 мкг, или 10 мкг.
В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 5 мкг, например 1-9 мкг, или 2-8 мкг или соответственно 3-7 мкг, или 4-6 мкг, или 5 мкг.
Подходящее количество 0821 составляет, например, любое количество из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мкг (мас./об.) на дозу иммуногенной композиции для человека.
Под термином доза для человека (или человеческая доза) понимают дозу, которая представлена в объеме, подходящем для применения человеку. Обычно она составляет от 0,3 до 1,5 мл. В одном из воплощений доза для человека равна 0,5 мл. В другом воплощении доза для человека составляет выше 0,5 мл, например 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В другом воплощении доза для человека составляет от 1 до 1,5 мл. Изобретение характеризуется тем, что каждая доза для человека содержит 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, Р821.
Согласно изобретению также предложена адъювантная композиция, содержащая 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, 0821. Обычно такая адъювантная композиция будет представлена в объеме, подходящем для дозы для человека. Когда для комбинирования с жидкой формой антигенной композиции адъювант находится в жидкой форме, композиция адъювантов будет содержаться в объеме, подходящем для дозы для человека, составляющем приблизительно половину от предполагаемого конечного объема дозы для человека, например объем 360 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,7 мл или объем 250 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,5 мл. Композиция адъювантов разбавляется при комбинировании с антигенной композицией с получением конечной дозы вакцины для человека. Конечный объем такой дозы, несомненно, будет варьировать в зависимости от первоначального объема композиции адъювантов и объема антигенной композиции, добавленной к композиции адъювантов. В альтернативном воплощении жидкий адъювант используется для повторного растворения лиофилизованной антигенной композиции. В этом воплощении объем композиции адъювантов, подходящий для дозы для человека, приблизительно равен конечному объему дозы для человека. Жидкую композицию адъювантов добавляют во флакон, содержащий лиофилизованную антигенную композицию. Конечная доза для человека может варьировать от 0,5 до 1,5 мл. В конкретном воплощении доза для человека равна 0,5 мл, в этом воплощении вакцинная композиция по изобретению будет содержать 0821 на уровне, равном или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, в дозе для человека 0,5 мл, кроме того в этом воплощении композиция адъювантов по изобретению будет содержать 0821 на уровне, равном или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, на 250 мкл композиции адъювантов или на 500 мкл композиции адъювантов в зависимости от
- 9 014353 того, предназначена ли композиция адъювантов для комбинирования с жидкой или лиофилизованной антигенной композицией соответственно.
Конкретно, при комбинировании с антигеном вируса гриппа 0821 может быть использован, например, в количестве 1-100 мкг (мас./об.) на дозу композиции, предпочтительно в количестве 10-50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 0821 равно, например, любому количеству из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Более предпочтительно, количество 0821 варьирует от 25 до 75 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции будет изменяться в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мл. Типичная вакцинная доза составляет 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В предпочтительном воплощении конечная концентрация 50 мкг 0821 содержится в 1 мл вакцинной композиции или 25 мкг на 0,5 мл вакцинной дозы. В других предпочтительных воплощениях конечная концентрация 35,7 или 71,4 мкг 0821 содержится в 1 мл вакцинной композиции. Конкретно, объем вакцинной дозы 0,5 мл содержит 25 или 50 мкг 0821 на дозу.
Доза 0821 соответственно способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящим количеством 0821 является такое, которое улучшает иммунологический потенциал композиции по сравнению с безадъювантной композицией или по сравнению с композицией, дополненной другим количеством адъюванта 0821, оставаясь при этом приемлемым с точки зрения профиля реактогенности.
Адъювант 3Ό-ΜΡΕ.
Кроме того, композиция содержит дополнительный адъювант, представляющий собой липополисахарид, подходящим образом нетоксичное производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (3Ό-ΜΡΕ).
3Ό-ΜΡΕ продается под наименованием МРБ фирмой С1ахо8тййК1те ΒίοΙοβίοαΕ Ν.Α. и во всем документе обозначается как МРБ или 3Ό-ΜΡΕ. См., например, патенты США № 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094. 3Ό-ΜΡΕ стимулирует главным образом СЭ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΡΝ-γ (ТЫ). 3Ό-ΜΡΕ может быть получен согласно способам, раскрытым в СВ 2220211 А. С химической точки зрения это смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы 3Ό-ΜΡΕ. Небольшие частицы 3Ό-ΜΡΕ имеют такой размер частиц, что их можно подвергать стерилизации фильтрованием через фильтр 0,22 мкм. Такие способы получения описаны в \УО 94/21292.
Ключевым аспектом настоящего изобретения является то, что липополисахарид, предпочтительно представляющий собой 3Ό-ΜΡΕ, может быть использован в более низких количествах, чем полагали ранее для оказания полезного действия, соответственно на уровне 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг на дозу иммуногенной композиции для человека.
Соответственно согласно изобретению предложена доза иммуногенной композиции для человека, содержащая липополисахарид, предпочтительно 3Ό-ΜΡΕ, на уровне 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг.
В одном из воплощений доза иммуногенной композиции для человека содержит 3Ό-ΜΡΕ на уровне приблизительно 25 мкг, например 20-30 мкг, соответственно 21-29 мкг, или 22-28 мкг, или 23-27 мкг, или 24-26 мкг, или 25 мкг.
В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 3Ό-ΜΡΕ на уровне приблизительно 10 мкг, например 5-15 мкг, соответственно 6-14 мкг, например, 7-13 мкг, или 8-12 мкг, или 9-11 мкг, или 10 мкг.
В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 3Ό-ΜΡΕ на уровне приблизительно 5 мкг, например 1-9 мкг, или 2-8 мкг, или соответственно 3-7 мкг, или 4-6 мкг, или 5 мкг.
Подходящее количество 3Ό-ΜΡΕ равно, например, любому количеству из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мкг (мас./об.) на дозу иммуногенной композиции для человека.
В одном из воплощений объем дозы для человека равен 0,5 мл. В другом воплощении иммуногенная композиция представлена в объеме, подходящем для дозы для человека, который превышает 0,5 мл, например 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мл. В другом воплощении доза для человека составляет от 1 до 1,5 мл. Изобретение характеризуется тем, что каждая доза для человека содержит 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, 3Ό-ΜΡΕ.
Согласно изобретению также предложена композиция адъювантов, содержащая 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, 3Ό-ΜΡΕ. Обычно такая композиция адъювантов будет содержаться в объеме, подходящем для дозы для человека. Когда для комбинирования с жидкой формой антигенной композиции адъювант находится в жидкой форме, композиция адъювантов будет содержаться в объеме, подходящем для дозы для человека, составляющем приблизительно половину от предполагаемого конечного объема дозы для человека, например объем 360 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,7 мл или объем 250 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,5 мл. Композиция адъювантов разбавляется при комбини
- 10 014353 ровании с антигенной композицией с получением конечной дозы иммуногенной композиции для человека. Конечный объем такой дозы, несомненно, будет варьировать в зависимости от первоначального объема композиции адъювантов и объема антигенной композиции, добавленной к композиции адъювантов. В альтернативном воплощении жидкая композиция адъювантов используется для растворения лиофилизованной антигенной композиции. В этом воплощении объем композиции адъювантов, подходящий для дозы для человека, приблизительно равен конечному объему дозы для человека. Жидкую композицию адъювантов добавляют во флакон, содержащий лиофилизованную антигенную композицию. Конечная доза для человека может варьировать от 0,5 до 1,5 мл. В конкретном воплощении доза для человека составляет 0,5 мл, в этом воплощении вакцинная композиция по изобретению будет содержать уровень 3Ό-ΜΡΕ, равный или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, на 0,5 мл дозы для человека, кроме того, в этом воплощении композиция адъювантов по изобретению будет содержать уровень 3Ό-ΜΡΕ, равный или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, на 250 мкл композиции адъювантов или на 500 мкл композиции адъювантов в зависимости от того, предназначена ли композиция адъювантов для комбинирования с жидкой или лиофилизованной антигенной композицией соответственно.
Когда иммуногенная композиция содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, композиция адъювантов, содержащая сапонин в форме липосомы, возможно дополнительно содержит производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно 3Ό-ΜΡΕ. В этом воплощении 3Ό-ΜΡΕ может быть использован, например, в количестве 1-100 мкг (мас./об.) на дозу композиции, предпочтительно в количестве 10-50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 3Ό-ΜΡΕ равно, например, любому количеству из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Более предпочтительно, количество 3Ό-ΜΡΕ варьирует от 25 до 75 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции будет изменяться в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мл. Типичная вакцинная доза составляет 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мл. В одном из воплощений конечная концентрация 50 мкг 3Ό-ΜΡΕ содержится в 1 мл вакцинной композиции или 25 мкг в 0,5 мл вакцинной дозы. В другом воплощении конечная концентрация 35,7 или 71,4 мкг 3Ό-ΜΡΕ содержится в 1 мл вакцинной композиции. Конкретно, объем вакцинной дозы 0,5 мл содержит 25 или 50 мкг 3Ό-ΜΡΕ на дозу.
Доза 3Ό-ΜΡΕ приемлемым образом способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящим количеством 3Ό-ΜΡΕ является такое, которое улучшает иммунологический потенциал композиции по сравнению с безадъювантной композицией или по сравнению с композицией, дополненной другим количеством адъюванта ΜΡΕ, оставаясь при этом приемлемым с точки зрения профиля реактогенности.
Подходящими композициями по изобретению являются такие, где липосомы первоначально получают без ΜΡΕ (как описано в АО 96/33739) и затем добавляют ΜΡΕ, приемлемо в виде небольших частиц размером менее 100 нм или в виде частиц, которые допускают их стерилизацию фильтрованием через мембрану 0,22 мкм. Поэтому ΜΡΕ не содержится внутри мембраны везикул (известен как наружный ΜΡΕ (ΜΡΕ ои!)). Композиции, в которых ΜΡΕ содержится внутри мембраны везикул (известный как внутренний ΜΡΕ (ΜΡΕ ίη)), также образуют аспект изобретения. Антиген может содержаться внутри мембраны везикул или содержаться снаружи мембраны везикул. Соответственно растворимые антигены находятся снаружи, а гидрофобные или липидизированные антигены содержатся либо внутри, либо снаружи мембраны.
В одном из воплощений композиция адъювантов по изобретению содержит как липополисахарид, так и иммунологически активный сапонин. В конкретном воплощении изобретения липополисахаридом является 3Ό-ΜΡΕ, а иммунологически активным сапонином является 0821. В другом воплощении изобретения композиция адъювантов состоит, по существу, из липополисахарида и иммунологически активного сапонина в липосомной композиции. Соответственно в одной форме этого воплощения композиция адъювантов состоит, по существу, из 3Ό-ΜΡΕ и 0821. возможно со стерином, которым предпочтительно является холестерин.
В другом воплощении изобретения композиция адъювантов содержит в липосомной композиции липополисахарид и иммунологически активный сапонин в комбинации с одним или более чем одним другим иммуностимулятором или адъювантом. Соответственно в одной форме этого воплощения липополисахаридом является 3Ό-ΜΡΕ, а иммунологически активным сапонином является 0821.
В конкретном воплощении 0821 и 3Ό-ΜΡΕ находятся в одной и той же конечной концентрации на дозу иммуногенной композиции для человека. В одном аспекте этого воплощения доза иммуногенной композиции для человека содержит конечный уровень 25 мкг 3Ό-ΜΡΕ и 25 мкг 0821. В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит конечный уровень по 10 мкг каждого из ΜΡΕ и 0821. В другом конкретном воплощении предложена композиция адъювантов, имеющая объем 250 мкл и содержащая уровень 25 мкг 3Ό-ΜΡΕ и 25 мкг ф821 или по 10 мкг каждого из ΜΡΕ и ф821.
- 11 014353
Антигены, которые могут быть использованы с композициями адъювантов по настоящему изобретению, включают вирусные, паразитические, бактериальные или опухолеассоциированные антигены, например вирус гриппа или его антигенный препарат, для применения согласно настоящему изобретению, который может представлять собой расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса. В альтернативном воплощении препарат вируса гриппа может содержать другой тип антигена инактивированного вируса гриппа, такого как инактивированный цельный вирус, или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина), или виросому вируса гриппа. В еще одном воплощении вирус гриппа может представлять собой препарат живого аттенуированного вируса гриппа.
Расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса для применения согласно настоящему изобретению представляет собой приемлемым образом инактивированный вирусный препарат, в котором вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки. Расщепленный вирус или антигенные препараты такого расщепленного вируса соответственно приготавливают путем фрагментации цельного вируса гриппа, либо инфекционного, либо инактивированного с использованием солюбилизирующих концентраций органических растворителей или детергентов и последующего удаления всего или основного количества солюбилизирующего агента и некоторого количества или большей части вирусного липидного материала. Под антигенным препаратом такого расщепленного вируса понимают препарат расщепленного вируса, который возможно подвергался некоторой очистке по сравнению с расщепленным вирусом, при этом сохранив большинство антигенных свойств компонентов расщепленного вируса. Например, при получении на куриных эмбрионах расщепленный вирус может быть очищен от загрязняющих яичных белков или при получении в клеточной культуре расщепленный вирус может быть очищен от примесей клеток хозяина. Антигенный препарат расщепленного вируса может содержать антигенные компоненты более чем одного вирусного штамма. Вакцины, содержащие расщепленный вирус (так называемые противогриппозные сплит-вакцины) или антигенные препараты расщепленного вируса, обычно содержат остаточные матриксные белки и нуклеопротеины, и иногда липиды, а также мембранные оболочечные белки.
Такие противовирусные сплит-вакцины обычно будут содержать большинство или все вирусные структурные белки, хотя нет необходимости в тех же пропорциях, в которых они присутствуют в цельном вирусе.
Альтернативно, вирус гриппа может быть в форме цельновирионной вакцины. Это может служить доказательством преимущества над вакциной на основе расщепленного вируса в пандемической ситуации, поскольку снимает сомнения относительно возможности успешного получения расщепленной противовирусной вакцины для нового штамма вируса гриппа. Что касается некоторых штаммов, то традиционные детергенты, используемые для получения расщепленного вируса, могут повреждать вирус и делать его непригодным для применения. И хотя всегда имеется возможность использования разных детергентов и/или разработки другого способа получения сплит-вакцин, для этого необходимо время, которого может быть не достаточно в пандемической ситуации. В дополнение к большей уверенности при использовании подхода с применением цельного вируса также имеется более значительная способность к продуцированию такой вакцины по сравнению с расщепленным вирусом, поскольку значительные количества антигена теряются в процессе дополнительных стадий очистки, необходимых для изготовления подходящей сплит-вакцины.
В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме очищенной субъединичной противогриппозной вакцины. Субъединичные противогриппозные вакцины обычно содержат два основных оболочечных белка НА и ΝΑ и могут иметь дополнительное преимущество над цельновирионными вакцинами, поскольку они обычно менее реактогенны, в частности, для молодых вакцинируемых субъектов. Субъединичные вакцины могут быть получены либо рекомбинантно, либо очищены из разрушенных вирусных частиц.
В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме виросомы. Виросомы представляют собой сферические однослойные везикулы, которые содержат функциональные вирусные оболочечные гликопротеины НА и ΝΑ в аутентичной конформации, интеркалированные в фосфолипидную бислойную мембрану виросом.
Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат может быть получен из куриных эмбрионов или тканевых культур.
Например, антиген вируса гриппа или его антигенные препараты по изобретению могут быть получены традиционным способом с использованием яиц с развивающимся эмбрионом посредством выращивания вируса гриппа в яйцах и очистки собранной аллантоисной жидкости. Яйца могут быть собраны в больших количествах в короткий срок. Альтернативно, они могут быть получены с помощью любого из новых способов производства с использованием клеток или клеточной культуры для выращивания вируса или экспрессии рекомбинантных поверхностных антигенов вируса гриппа. Подходящие клеточные субстраты для выращивания вируса включают в себя, например, клетки почки собаки, такие как МОСК или клетки из клона МЭСК, МЭСК-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как АСМК-клетки (клетки почки африканской зеленой мартышки), включая клетки Уего, подходящие линии клеток свиньи или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящих для продуцирования вируса гриппа с целью
- 12 014353 изготовления вакцин. Подходящие клеточные субстраты также включают в себя человеческие клетки, например, клетки МКС-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничены клеточными линиями; например, также включены первичные клетки, такие как эмбриональные фибробласты кур и линии клеток птиц.
Антиген вируса гриппа или его антигенный препарат может быть получен любым из множества коммерчески используемых способов, например с помощью способа с расщеплением вируса гриппа (сплит-Г1и-способа), описанного в патентах № ΌΌ 300833 и ΌΌ 211444, включенных в данное описание посредством ссылки. Традиционно сплит-Г1и получали, используя обработку растворителем/детергентом, таким как три-н-бутилфосфат или диэтиловый эфир в комбинации с Тетееи™ (известную как Твинэфирное расщепление), и этот способ все еще используют в некоторых производственных установках. Другие используемые в настоящее время расщепляющие агенты включают в себя детергенты, или протеолитические ферменты, или соли желчных кислот, например дезоксихолат натрия, как описано в патенте № ΌΌ 155875, включенном в данное описание посредством ссылки. Детергенты, которые могут быть использованы в качестве расщепляющих агентов, включают в себя катионные детергенты, например цетилтриметиламмония бромид (СТАВ), другие ионные детергенты, например лаурилсульфат, тауродезоксихолат, или неионные детергенты, которые описаны выше, включая Тритон Х-100 (например, в способе, описанном в Ь1па е1 а1., 2000, Вю1одюак, 28, 95-103) и Тритон Ν-101 или комбинации любых двух или более детергентов.
Способ приготовления сплит-вакцины может включать множество разных стадий фильтрации и/или других стадий разделения, таких как стадии ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, зонального центрифугирования и хроматографии (например, ионообменной), в разнообразных комбинациях и возможно стадию инактивации, например, с помощью нагревания, формальдегида или β-пропиолактона или УФ, которая может быть проведена до или после расщепления. Способ расщепления может быть осуществлен в виде периодического, непрерывного или полунепрерывного способа. Предпочтительный способ расщепления и способ очистки иммуногенной сплит-композиции описан в \\'О 02/097072.
Предпочтительные сплит-Г1и-вакцинные антигенные препараты по изобретению содержат остаточное количество Твина 80 и/или Тритона Х-100, остающееся после процесса производства, хотя их можно добавить или довести их концентрацию после приготовления расщепленного антигена. Предпочтительно, когда присутствуют и Твин 80, и Тритон Х-100. Предпочтительные диапазоны конечных концентраций этих неионных поверхностно-активных веществ в вакцинной дозе составляют:
Твин 80: 0,01-1%, более предпочтительно приблизительно 0,1% (об./об.);
Тритон Х-100: 0,001-0,1 (% мас./об.), более предпочтительно 0,005-0,02% (мас./об.).
В конкретном воплощении конечная концентрация Твина 80 варьирует от 0,025 до 0,09% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген предложен в виде 2-кратной концентрированной смеси, в которой концентрация Твина 80 варьирует от 0,025 до 0,2% (мас./об.) и которую необходимо в два раза разбавлять после приготовления конечной композиции с адъювантом (или с буфером в контрольной композиции).
В другом конкретном воплощении конечная концентрация Тритона Х-100 варьирует от 0,004 до 0,017% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген предложен в виде в 2 раза более концентрированной смеси, концентрация Тритона Х-100 в которой варьирует от 0,005 до 0,034% (мас./об.) и которую необходимо разбавить в два раза для приготовления конечной композиции с адъювантом (или с буфером в контрольной композиции).
Предпочтительно препарат вируса гриппа приготавливают в присутствии низкого уровня тиомерсала или предпочтительно в отсутствие тиомерсала. Предпочтительно полученный препарат вируса гриппа стабилен в отсутствие ртутьорганических консервантов, в частности препарат не содержит никакого остаточного тиомерсала. Препарат вируса гриппа, в частности, содержит антиген гемагглютинин, стабилизированный в отсутствие тиомерсала или при низких уровнях тиомерсала (обычно 5 мкг/мл или меньше). Конкретно, стабилизацию штамма вируса гриппа В осуществляют, используя производное альфатокоферола, такое как альфа-токоферола сукцинат (также известный как витамина Е сукцинат, т.е. УЕ8). Такие препараты и способы их приготовления раскрыты в \О 02/097072.
Предпочтительная композиция содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена, приготовленных из рекомендованных ВОЗ штаммов вируса гриппа соответствующего сезона.
Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант по изобретению содержатся в одном и том же контейнере. Это называют как прием одного флакона. Предпочтительно такой флакон представляет собой предварительно заполненный шприц. В альтернативном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант по изобретению содержатся в отдельных контейнерах или флаконах и быстро смешиваются до или во время введения субъекту. Это называют как прием двух флаконов. Например, когда вакцина представляет собой 2-компонентную вакцину с общим объемом дозы 0,7 мл, концентрированные антигены (например, концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены) находятся в одном флаконе (335 мкл) (контейнер для анти
- 13 014353 генов), а предварительно заполненный шприц содержит адъювант (360 мкл) (контейнер для адъювантов). В момент инъекции содержимое флакона, содержащего концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены, извлекают из данного флакона с помощью шприца, содержащего адъювант, с последующим легким перемешиванием содержимого шприца. Перед инъекцией использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 530 мкл. В этом примере одна доза восстановленной адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 530 мкл.
В одном аспекте изобретения, касающемся поливалентной композиции, по меньшей мере один штамм вируса гриппа в указанной поливалентной иммуногенной композиции, которая определена в данном описании, ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. Такой штамм также может быть назван ниже в тексте как пандемические штаммы. В частности, когда вакцина является поливалентной вакциной, такой как двухвалентная, или трехвалентная, или четырехвалентная вакцина, по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. Подходящие штаммы представляют собой Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7 и Η2Ν2, но не ограничиваются этим.
Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат удобным образом является поливалентным, например двухвалентным, или трехвалентным, или четырехвалентным. Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат является трехвалентным или четырехвалентным, имея антиген от трех разных штаммов вируса гриппа, при этом по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой.
Свойствами штамма вируса гриппа, которые делают его способным вызывать пандемическую вспышку, являются следующие: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином штаммов, циркулирующих в настоящий момент; он обладает способностью передаваться горизонтально в человеческой популяции; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не проявлялся в человеческой популяции в течение продолжительного периода времени, возможно в течение нескольких десятилетий, такой как Н2. Или же он может представлять собой гемагглютинин, не циркулировавший в человеческой популяции раньше, например Н5, Н9, Н7 или Н6, которые обнаружены у птиц. В любом случае большинство, или по меньшей мере большая часть популяции, или даже вся популяция раньше не сталкивалась с данным антигеном и является иммунологически наивной по отношению к нему.
Обычно некоторые группы имеют повышенный риск заражения гриппом в пандемической ситуации. Особенно восприимчивы пожилые люди, хронически больные люди и маленькие дети, однако многие молодые и явно здоровые люди также находятся в группе риска. Что касается вируса гриппа Н2, то часть популяции, рожденная после 1968 г., имеет повышенный риск. Для этих групп важно получить эффективную защиту как можно более быстро и простым способом.
Другой группой людей, которые находятся в группе повышенного риска, являются путешественники. Сейчас люди путешествуют больше, чем когда-либо раньше, а регионы, где появляется большинство новых вирусов, Китай и Юго-Восточная Азия стали популярными местами для путешествий в последние годы. Такое изменение в характере путешествий дает возможность новым вирусам передаваться по всему земному шару за несколько недель, а не месяцев или лет.
Таким образом, для этих групп людей существует особая необходимость в вакцинации с целью защиты против гриппа в пандемической ситуации или возможной пандемической ситуации. Подходящие штаммы представляют собой Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7 и Η2Ν2, но не ограничиваются этим.
Возможно композиция может содержать более трех валентностей, например три непандемических штамма плюс пандемический штамм. Альтернативно композиция может содержать три пандемических штамма. Предпочтительно композиция содержит три пандемических штамма.
Кроме того, примерами антигенов для иммуногенной композиции по изобретению являются стрептококковые антигены, например антигены стрептококка группы А или стрептококка группы В, но наиболее предпочтительно 81гер1ососсик рпеитошае. Наиболее предпочтительно используют по меньшей мере один белковый и/или по меньшей мере один сахаридный антиген. По меньшей мере один белковый антиген 81гер1ососси5 рпеитошае наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из пневмолизина, РкрА или его вариантов с делецией трансмембранных областей, РкрС или его вариантов с делецией трансмембранных областей, РкаА или его вариантов с делецией трансмембранных областей, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, СЬрА или его вариантов с делецией трансмембранных областей, РЫА, Р111Э. РЫБ, РЫБ, 8ркА, Бу!В, Бу!С, Бу!А, 8р125, 8р101, 8р128, 8р130 и 8р133 или их иммунологически функционального эквивалента (например, слитых доменов вышеупомянутых белков, таких как, например, слитые белки РЫОЕ, описанные в \УО 01/98334 и \УО 03/54007).
Некоторые композиции описаны в \УО 00/56359, \УО 02/22167 и \УО 02/22168 (включены в данное описание посредством ссылки).
Антиген может содержать капсульные сахаридные антигены (предпочтительно конъюгированные с белком-носителем), где сахариды (наиболее предпочтительно полисахариды) получены по меньшей мере из четырех серотипов пневмококков. В одном воплощении эти четыре серотипа включают 6В, 14, 19Е и
- 14 014353
23Р. В другом воплощении по меньшей мере 7 серотипов включены в композицию, например серотипы, полученные из серотипов 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В другом воплощении по меньшей мере 10 серотипов включены в композицию, например композиция в одном из воплощений включает в себя капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (предпочтительно конъюгированные с белком-носителем). В другом воплощении иммуногенная композиция содержит капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В предпочтительном воплощении изобретения включены по меньшей мере 13 сахаридных антигенов (предпочтительно конъюгированные с белком-носителем), хотя согласно изобретению также рассматриваются дополнительные сахаридные антигены, например 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р).
Несмотря на то что вышеупомянутые сахариды предпочтительно представлены в своей полноразмерной, нативной полисахаридной форме, следует понимать, что также могут быть использованы меньшие по размеру полисахариды, которые все еще являются иммуногенными (см., например, ЕР 497524 и 497525), при необходимости связанные с белком-носителем.
Для предупреждения/облегчения пневмонии у пожилого (старше 55 лет) населения и воспаления среднего уха у младенцев (до 18 месяцев включительно) и детей (обычно от 18 месяцев до 5 лет) предпочтительное воплощение изобретения заключается в комбинировании поливалентного сахарида 81гер1ососси8 риеитошае, как он описан в данном изобретении, с белком 81герЮсосси5 риеитошае, предпочтительно выбранным из группы перечисленных выше белков. Комбинацию пневмококковых белков также можно предпочтительно использовать, как описано ниже.
Пневмококковые белки.
Антигены 81гер1ососси5 риеитошае предпочтительно выбраны из группы, состоящей из белка семейства полигистидиновых триад (Ρ111). белка Ьу1-семейства, холин-связывающего белка, белков, имеющих мотив ^ΡXТС (где X представляет собой любую аминокислоту), белков, имеющих мотив сигнальной последовательности II типа ЬХХС (где X представляет собой любую аминокислоту), и белков, имеющих мотив сигнальной последовательности Ι типа. Предпочтительными примерами среди этих категорий (или мотивов) являются следующие белки (либо их укороченный или иммунологически функциональный эквивалент).
Р1Л (полигистидиновые триады) семейство содержит белки ΡΡΐΑ, ΡΕίΒ, ΡΕίΌ и ΡΕίΕ. Это семейство характеризуется липидизированной последовательностью, двумя доменами, разделенными пролинобогащенным участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно вовлеченными в связывание металла или нуклеозида либо ферментативную активность, (3-5)-участками с двойной спиралью, консервативным Ν-концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестируемых штаммах пневмококков. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и №Е5епа. Предпочтительные члены данного семейства включают ΡΕίΛ, ΡΕίΒ и ΡΕίΌ. Более предпочтительно ΡΕίΛ или ΡΕίΌ. Однако понятно, что термины ΡΕί А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также к их существующим в природе (и искусственным) вариантам, имеющим гомологию последовательностей, которая по меньшей мере на 90% идентична белкам из ссылок. Предпочтительно она идентична по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно идентична на 97%.
Что касается белков ΡΕΐ, то ΡΕίΑ раскрыт в \УО 98/18930, где он также обозначен как 8р36. Как указано выше, он является белком семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив II типа БХХС.
ΡΕίΌ раскрыт в \УО 00/37105, где он также обозначен как 8р036Э. Как указано выше, он также является белком семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив II типа БХХС.
ΡΕίΒ раскрыт в \УО 00/37105, где он также обозначен как 8р036В.
Другим членом ΡΕίΒ-семейства является С3-деградирующий полипептид, который раскрыт в \УО 00/17370. Это также белок семейства полигистидиновых триад, и он имеет сигнальный мотив II типа БХХС.
Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в \УО 98/18930.
Укороченный ΡΕίΒ (приблизительно 79 кДа) раскрыт в \УО 99/15675, который также считается членом ΡΕίX-семейства.
ΡΕίΕ раскрыт в \УО 00/30299 и обозначен как ВУН-3.
8р§А представляет собой холин-связывающий белок (СЕр), раскрытый в \УО 98/39450.
Еу1-семейство представляет собой мембраносвязанные белки, ассоциированные с лизисом клеток. Ν-концевой домен содержит холин-связывающий домен(домены), однако Бу1-семейство не имеет всех признаков, обнаруженных у семейства холин-связывающих белков (СЕр), указанного ниже, и, таким образом, для настоящего изобретения Еу1-семейство считается отличающимся от СЕр-семейства. В противоположность СЕр-семейству, С-концевой домен содержит каталитический домен белков Еу1-семейства. Это семейство включает в себя Бу1А, В и С. Что касается ЕуРсемейства, то Бу1А раскрыт в Коиба е1 а1., Еиг. 1. Β^осΕет., 164: 621-624 (1987). Бу® раскрыт в XVО 98/18930, где он также обозначен как 8р46.
- 15 014353
ЬуГС также раскрыт в АО 98/18930, где он также обозначен как 8р91. Предпочтительным членом этого семейства является ЬуГС.
Другим предпочтительным воплощением являются усеченные структуры ЬуГ-семейства (в частности, ЬуГЛ), где ЬуГ определен выше, а усеченные структуры относятся к белкам, у которых отсутствует 50% холин-связывающего участка или более. Предпочтительно у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок.
8р125 является примером пневмококкового поверхностного белка с якорным мотивом к клеточной стенке ΕΡΧΤΟ (где X представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок из этого класса пневмококковых поверхностных белков с таким мотивом полезен в контексте данного изобретения и, следовательно, считается дополнительным белком по изобретению. Сам 8р125 раскрыт в АО 98/18930 и также известен как ΖιηρΒ - цинксодержащая металлопротеиназа.
8р101 раскрыт в АО 98/06734 (где он имеет ссылочный № у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью I типа.
8р133 раскрыт в АО 98/06734 (где он имеет ссылочный № у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью I типа.
8р128 и 8р130 раскрыты в АО 00/76540.
Белки, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно выбраны из группы ΡΗίΌ, ΡΙιΐΛ и Ρ111Ε или комбинации 2 или всех 3 этих белков (т.е. ΡΗΐΆ+Ό, А+Е, Ό+Ε или А+Ό+Ε).
Другие пневмококковые белковые антигены, которые могут быть включены, представляют собой один или более из группы, состоящей из пневмолизина (также обозначенного как ΡΕ; предпочтительно подвергнутого детоксикации путем химической обработки или мутации) [АО 96/05859, АО 90/06951, АО 99/03884], ΡδηΑ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (Веггу & ΡαΙοη, 1пГесГ. 1ттип., 1996, Эес., 64(12): 5255-62), Ρ8рΑ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (И8 5804193, АО 92/14488, АО 99/53940), Ρφί’ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (АО 97/09994, АО 99/53940), члена семейства холин-связывающих белков (СЬр) [например, СЬрА и его вариантов с делецией трансмембранных областей (АО 97/41151; АО 99/51266)], глицеральдегид-3фосфат-дегидрогеназы (1пГесГ. 1ттип. 1996, 64: 3544), Η8Ρ70 (белок теплового шока) (АО 96/40928), РсрА (8апс11ех-Веа1о е! а1., ΕΕΜ8 ΜκτοΜοΙ. Еей., 1998, 164: 207-14), М-подобного белка (8В заявка на патент № ЕР 0837130) и адгезина 18627 (8В заявка на патент № ЕР 0834568). Настоящее изобретение также охватывает иммунологически функциональные эквиваленты или усеченные структуры таких белков (как определено выше).
Что касается семейства холин-связывающих белков, то члены этого семейства первоначально были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно было очистить холин-аффинной хроматографией. Все холин-связывающие белки связаны нековалентными связями с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и мембраносвязанной липотейхоевой кислоты. В своей структуре они имеют несколько участков, общих для всего семейства, хотя точная природа белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьировать. В общем случае холинсвязывающие белки содержат Ν-концевой участок (Ν), консервативные повторяющиеся участки (К1 и/или К2), пролин-обогащенный участок (Р) и консервативный холин-связывающий участок (С), составленный из множественных повторов, который составляет приблизительно половину белка. Используемый в данной заявке термин семейство холин-связывающих белков (СЬр) относится к белкам, выбранным из группы, состоящей из холин-связывающих белков, которые идентифицированы в АО 97/41151, Ρ^Α, 8р§А, ΡίψΕ’, СЬрА, СЬрЭ и СЬрС. СЬрА раскрыт в АО 97/41151. СЬрЭ и СЬрС раскрыты в АО 00/29434. Ρφί’ раскрыт в АО 97/09994. ΡЬсΑ раскрыт в АО 98/21337. Предпочтительно холин-связывающие белки выбраны из группы, состоящей из СЬрА, ΡЬсΑ, 8р§А и ΡίψΟ’.
Когда СЬр является дополнительно используемым белком, он может представлять собой усеченный СЬр, где СЬр определен выше, а усеченный относится к белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка (С) или более. Предпочтительно у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок. Более предпочтительно, когда у таких усеченных белков отсутствуют (1) холинсвязывающий участок, а также (2) часть Ν-концевой половины данного белка, при этом остается по меньшей мере один повторяющийся участок (К1 или К2). Еще более предпочтительно, когда усеченная структура имеет 2 повторяющихся участка (К1 и К2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются ΝΚ1χΚ2, Κ1χΚ2, ΝΚ1χΚ2Ρ и Κ1χΚ2Ρ, как проиллюстрировано в АО 99/51266 или АО 99/51188, однако другие холин-связывающие белки, у которых отсутствует аналогичный холинсвязывающий участок, также считаются входящими в объем данного изобретения.
Кроме того, в композициях по изобретению могут быть использованы химерные белки (или слитые структуры) - усеченный СЬр-усеченный БуГ. Предпочтительно они содержат ΝΚ1χΚ2 (или К1хК2, или ΝΚ1χΚ2Ρ, или Κ1χΚ2Ρ) СЬр и С-концевую часть (СГегт, т.е. в которой отсутствуют холин-связывающие домены) БуГ (например, БуГССГетт или 8р91СГегт). Более предпочтительно СЬр выбран из группы, состоящей из СЬрА, ΡЬсΑ, 8р§А и Ρφί’. Еще более предпочтительно, когда он представляет собой СЬрА. Предпочтительно, когда БуГ представляет собой БуГС (также обозначенный как 8р91).
- 16 014353
Также может быть использован усеченный РкрА или РкаА, у которого отсутствует холинсвязывающий домен (С) и который экспрессируется в виде белка, слитого с Ьу1. Предпочтительно, когда Ьу1 представляет собой Ьу1С.
В пневмококковой композиции можно комбинировать разные пневмококковые белки по изобретению. Предпочтительно, когда белки комбинации по изобретению выбраны из 2 или более (3 или 4) разных категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности II типа ЬХХС (где X представляет собой любую аминокислоту, например полигистидинтриадного (РИ1) семейства), холинсвязывающие белки (СЬр), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности I типа (например, 8р101), белки, имеющие мотив ЬРХТС (где X представляет собой любую аминокислоту, например 8р128, 8р130), токсины (например, Р1у) и т. д. Предпочтительными примерами среди этих категорий (или мотивов) являются белки, упомянутые выше, или их иммунологически функциональные эквиваленты. Токсин+РЫ, токсин+СЬр, Р111+СЬр и токсин+Р111+СЬр являются предпочтительными комбинациями категорий.
Предпочтительные полезные комбинации включают РЬί^+NΚ1χΚ2, химерные или слитые белки РЫ^+NΚ1χΚ2-8р91 С1егт, РНЮ+Р1у, РНЮ+8р128, РЫР+РкаА, РЫР+РкрА, РЫА+NΚ1χΚ2, химерные или слитые белки РЫА+NΚ1χΚ2-8р91Сΐе^т, РЫА+Р1у, Р1ПА+8р 128, РЫА+РкаА, РЫА+РкрА, NΚ1χΚ2+^уΐС, NΚ1χΚ2+Р5рА, NΚ1χΚ2+Р5аА, NΚ1χΚ2+8р128, К1хК2+Ьу1С, К1хК2+РкрА, К1хК2+РкаА, К1хК2+8р128, РТхРЗ+РЫР, К1хК2+РЫА, но не ограничиваются этим. Предпочтительно, когда ΝΚ1χΚ2 (или К1хК2) происходит из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно, когда он происходит из СЬрА.
Особенно предпочтительная комбинация пневмококковых белков содержит Р1у (либо его усеченный или иммунологически функциональный эквивалент)+РЬ1О (либо его усеченный или иммунологически функциональный эквивалент), возможно с ИЙТхР! (или К1хК2, или NΚ1χΚ2Р, или К1хК2Р). Предпочтительно, когда ΝΕΡΗΣ (или К1хК2, или ΝΗ^Η^, или К1хК2Р) происходит из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно, когда он происходит из СЬрА.
Антиген может представлять собой пневмококковый сахаридный конъюгат, содержащий полисахаридные антигены, происходящие по меньшей мере из четырех серотипов, предпочтительно по меньшей мере семи серотипов, более предпочтительно по меньшей мере десяти серотипов и по меньшей мере одного, но предпочтительно 2, 3 или 4 белков 81тер1ососси5 р^итшие, предпочтительно выбранных из группы белков, описанных выше. Предпочтительно, когда один из белков представляет собой Р111Э (или его иммунологически функциональный эквивалент) и/или Р1у (или его иммунологически функциональный эквивалент).
Проблема, связанная с полисахаридным подходом к вакцинации, заключается в том, что полисахариды рег ке являются слабыми иммуногенами. Для преодоления этой проблемы сахариды можно конъюгировать с белковыми носителями, которые обеспечивают фоновый Т-клеточный хелперный ответ. Поэтому предпочтительно, чтобы используемые в данном изобретении сахариды были связаны с таким белковым носителем. Примеры таких носителей, которые в настоящее время обычно используют для получения сахаридных иммуногенов, включают дифтерийные и столбнячные анатоксины (ΌΤ, ΌΤ СКМ197 и ТТ соответственно), гемоцианин лимфы улитки (КЕН), ОМРС (белок С наружной мембраны) из №тешпдЦ|б15 и очищенное белковое производное туберкулина (РРР).
Предпочтительным носителем для иммуногенных композиций (или вакцин) на основе пневмококковых сахаридов является белок Ό НаеторЫ1ик тПиепхае (ЕР-В-594610) или его фрагменты. Фрагменты, подходящие для применения, включают фрагменты, охватывающие Т-хелперные эпитопы. В частности, фрагмент белка Ό будет предпочтительно содержать Ν-концевую часть, составляющую 1/3 данного белка. Носитель белок Ό полезен в качестве носителя в композициях, где конъюгировано много пневмококковых сахаридных антигенов. Предпочтительно один или более пневмококковых сахаридов в комбинации могут быть конъюгированы на белке Ό.
Другим предпочтительным носителем для пневмококкового сахарида является сам пневмококковый белок (который определен выше в разделе Пневмококковые белки по изобретению).
Сахарид может быть связан с белком-носителем любым известным способом (например, по ЫкЬйе, патент США № 4372945 и по Агтог и др., патент США № 4474757). Конъюгирование предпочтительно осуществляют с использованием СР АР (тетрафторборат 1-циано-4-(диметиламино)пиридиния) (νθ 95/08348).
Предпочтительно, когда соотношение белок:сахарид (масса:масса) в конъюгатах составляет 0,3:1-1:1, более предпочтительно 0,6:1-0,8:1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,7:1.
Особенно предпочтительные композиции по изобретению содержат один или более конъюгированных пневмококковых сахаридов и один или более пневмококковых белков по изобретению.
Кроме того, пневмококковые сахариды и белки можно стабильно хранить в виде нерасфасованных компонентов, адсорбированных на фосфате алюминия в жидкой форме.
В другом аспекте изобретения вакцинная композиция может содержать антиген цитомегаловируса человека (НСМУ). НСМУ является ДНК-содержащим вирусом человека, принадлежащим семейству герпесвирусов, и он представляет собой основную причину врожденных дефектов у новорожденных и
- 17 014353 также является причиной серьезных медицинских состояний у пациентов с ослабленным иммунитетом. Клиническое заболевание вызывает ряд симптомов, включая лихорадку, гепатит, пневмонит и инфекционный мононуклеоз.
В одном из воплощений антиген ΗСМУ представляет собой химерный слитый белок или его иммуногенное производное, содержащее участок гликопротеина ΗСМУ, слитого с участком гликопротеина Η8ν (вируса простого герпеса). Гликопротеином ΗСМУ обычно является (белок) дВ, а гликопротеином Η8ν - обычно дЭ, в частности дИ типа 2 (дИ2) Ηδν. Слияние обычно происходит между аминокислотой в Ν-концевой части участка белка дВ ΗСМУ и аминокислотой на С-концевой части белка дИ Ηδν. В обоих белковых компонентах слитого белка, как в дВ ΗСМУ, так и в дИ Ηδν, может отсутствовать мембраноякорный домен.
Участок белка дВ ΗСМУ может содержать нерасщепляемую форму дВ ΗСМУ. Соответственно этого достигают путем изменения одной или более аминокислот в сайте расщепления белка, например путем замены Агд458 и Агд459 на С1и и ТЬг соответственно. Участок белка Ηδν может содержать сигнальную последовательность дИ2 (аминокислоты 1-25) и возможно аминокислоты 26-52 дИ2 и/или последовательность из дИ2, представляющую собой РЕП8АЬЬЕПРЕП или ее функциональные эквиваленты, которые могут быть короче или длиннее. К слитому белку могут быть добавлены другие последовательности из дИ Ηδν, например, на С-конце белка дВ ΗСМУ.
В одном из воплощений слитый белок содержит аминокислоты 1-52 белка дЭ2 Ηδν, слитого с остатками 28-685 белка дВ ΗСМУ. Слитый таким образом белок обозначен как дВ685* ΗСМУ. В другом воплощении аминокислотная последовательность РЕП8АЬЬЕПРЕП, происходящая из внутренней последовательности дИ2, может быть включена в С-концевую часть белка дВ685* ΗСМУ с получением белка, обозначенного дВ685** ΗСМУ. Эти специфические слитые белки описаны более подробно в \\'О 95/31555.
Другим иммуногеном, подходящим для применения в качестве вакцины на основе ΗСМУ, является рр65, матриксный белок ΗСМУ, который описан в \О 94/00150 (Сйу о£ Ηоре).
В другом воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции содержат антиген или антигенный препарат, полученный из вируса папилломы человека (ΗΓΥ), который считается ответственным за генитальные бородавки (ЯРУ 6 или ΗРУ 11 и другие) и/или вирусов ЯРУ, ответственных за цервикальный рак (№У16, №У18 и др.).
В одном из воплощений формы профилактических или терапевтических композиций против генитальных бородавок содержат частицы или капсомеры Ь1 и слитые белки, содержащие один или более антигенов, выбранных из белков Е1, Е2, Е5, Е6, Е7, Ь1 и Ь2 №У.
В одном из воплощений формы слитого белка представляют собой:
Ь2Е7, как раскрыто в \О 96/26277, и белок Э(1/3)-Е7, раскрытый в СВ 9717953.5 (РСТ/ЕР98/05285).
Предпочтительные профилактические или терапевтические композиции против цервикальных инфекции или рака, вызванных ΗРУ, могут содержать антигены №У 16 или 18. Например, мономеры антигена Ь1 или Ь2, либо антигены Ь1 или Ь2, представленные вместе в виде вирусоподобной частицы (УЪР), либо сам белок Ь1, представленный один в УЬР или капсомерной структуре. Такие антигены, вирусоподобные частицы и капсомер известны рег 8е. См., например, \О 94/00152, \О 94/20137, \О 94/05792 и \О 93/02184.
Дополнительные ранние белки, такие как, например, Е7, Е2 или предпочтительно Е5, могут быть включены сами по себе или в виде слитых белков; особенно предпочтительные воплощения включают УЪР-содержащие слитые белки Ь1Е7 (\О 96/11272).
В одном из воплощений антигены ДОУ 16 содержат ранние белки Е6 или Е7 в слитой форме с носителем белком Ό с образованием слияний белок Э-(Е6 или Е7) ДОУ 16 или их комбинации или комбинаций Е6 или Е7 с Ь2 (\О 96/26277).
Альтернативно, ранние белки Е6 и Е7 ДОУ 16 или 18 могут быть представлены в одной молекуле, предпочтительно в виде слияния: белок Э-Е6/Е7. Такая композиция возможно может содержать либо один, либо оба белка Е6 и Е7 ДОУ 18, предпочтительно в форме слитого белка: белок Э-Е6 или белок Э-Е7, или слитого белка: белок Э-Е6/Е7.
Композиция по настоящему изобретению дополнительно может содержать антигены из других штаммов ДОУ, предпочтительно из ДОУ 31 или 33.
Онкогенные штаммы №У включают №У 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68. Таким образом, композиция по настоящему изобретению может содержать антигены из одного или более таких штаммов №У в дополнение к №У16 и/или №У18.
УЬР или капсомеры Ь1 ДОУ, полезные в изобретении, могут содержать полноразмерный Ь1 или иммуногенный фрагмент Ь1 или состоять из них. Если УЬР или капсомер содержит иммуногенный фрагмент Ь1 или состоит из него, то подходящие иммуногенные фрагменты Ь1 ДОУ включают усеченные структуры Ь1, мутанты Ь1, полученные в результате делеций, замен или вставок. Такие иммуногенные фрагменты соответственно способны усиливать иммунный ответ, который способен распознавать белок Ь1, например вирусоподобную частицу, из того штамма ДОУ, из которого белок Ь1 получен.
- 18 014353
Подходящие иммуногенные фрагменты Ь1 включают усеченные белки Ь1. В одном аспекте усечение удаляет сигнал ядерной локализации. В другом аспекте усечение представляет собой С-концевое усечение. В следующем аспекте С-концевое усечение удаляет немногим более 50 аминокислот, например немногим более 40 аминокислот. Если Ь1 происходит из НРУ 16, то в другом аспекте С-концевое усечение удаляет 34 аминокислоты из Ь1 НРУ 16. Если Ь1 происходит из НРУ 18, то в другом аспекте С-концевое усечение удаляет 35 аминокислот из Ь1 НРУ 18.
Подходящие усеченные последовательности Ь1 НРУ 16 и 18 приведены в АО 06/114312.
Кроме того, последовательность НРУ 16 может представлять собой последовательность, раскрытую в АО 9405792 или И8 6649167, например, соответственным образом усеченную. Подходящие усеченные структуры усечены по положению, эквивалентному обсужденному выше, как оценено путем сравнения последовательностей.
Альтернативная последовательность НРУ 18 раскрыта в АО 9629413, которая может быть соответственным образом усечена. Подходящие усеченные структуры усечены по положению, эквивалентному описанному выше, как оценено путем сравнения последовательностей.
Другие последовательности НРУ 16 и НРУ 18 хорошо известны в данной области техники и могут подходить для применения в настоящем изобретении.
Если белок Ь1 происходит из другого штамма НРУ, могут быть использованы С-концевые усечения, соответствующие таковым, приготовленным для НРУ 16 и НРУ 18, на основании выравниваний последовательностей ДНК или белков. Подходящие усечения белков Ь1 НРУ 31 и 45 приведены в АО 06/114312.
Кроме того, могут быть приготовлены подходящие усеченные структуры, например, из НРУ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68, в одном аспекте, путем удаления С-концевых участков белка Ь1, эквивалентных описанным выше, как оценено путем выравнивания последовательностей.
Белок Ь1 или его иммуногенный фрагмент по изобретению возможно может быть в форме слитого белка, как, например, слитая конструкция белка Ь1 с Ь2 или ранним белком.
Белок Ь1 НРУ существует соответственно в форме капсомера или вирусоподобной частицы (УЪР). В одном аспекте в настоящем изобретении могут быть использованы УЪР НРУ. УЪР НРУ и способы приготовления УЪР хорошо известны в данной области техники. УЪР обычно конструируют из вирусных структурных белков Ь1 и возможно Ь2, см., например АО 9420137, И8 5985610, АО 9611272, и8 6599508В1, И8 6361778В1, ЕР 595935. Любая подходящая УЪР НРУ, которая обеспечивает перекрестный иммунитет, такая как УЪР на основе Ь1 или Ь1+Ь2, может быть использована в настоящем изобретении.
Предпочтительно УЪР представляет собой только Ь1-УЬР.
Композиция по изобретению может содержать комбинацию Ь1-УЬР НРУ 16 и Ь1-УЪР НРУ 18, или комбинацию Ь1-УЬР НРУ из НРУ 16, 18, 31 и 45, или более многочисленные комбинации и включает в себя Ь1-УЬР НРУ 16 и 18 или НРУ 16, 18, 31 и 45 или более многочисленные комбинации, где Ь1 является возможно усеченным, как описано в данном изобретении.
В конкретном воплощении изобретения с антигенами НРУ 16 и/или 18 используют один или более дополнительных антигенов из типов НРУ, вызывающих рак, которые выбраны из следующих типов НРУ: НРУ 31, 45, 33, 58 и 52. Как описано в данном изобретении, антиген в каждом случае может представлять собой Ь1, например в форме Ь1-УЬР или капсомеров. Таким образом, антигены НРУ для использования в композициях, способах и применениях, описанных в данном изобретении, могут содержать Ы-УЪР или капсомеры из НРУ 16, 18, 31, 45, 33, 58 и 52 или состоять из них. Ы-УЪР могут представлять собой только Ы-УЪР или быть в комбинации с другим антигеном, как, например, Ь2 в УЪР на основе Ы+Ь2. Белок Ь1 может быть соответственно усеченным, как описано в данном изобретении.
Образование УЪР можно оценить с использованием стандартных методик, таких как, например, электронная микроскопия и динамическое лазерное светорассеяние.
УЪР может содержать полноразмерный белок Ы. В одном аспекте белок Ы, используемый для образования УЪР, представляет собой усеченный белок Ы, как описано выше.
УЪР могут быть приготовлены в любом подходящем клеточном субстрате, таком как дрожжевые клетки или клетки насекомых, например в бакуловирусной экспрессирующей системе, и методики приготовления УЪР хорошо известны в данной области техники, как, например, АО 9913056, и8 6416945В1, и8 6261765В1 и И86245568 и приведенные там ссылки, полное содержание которых тем самым включено посредством ссылки.
УЪР могут быть приготовлены с использованием методик разборки и сборки, что может обеспечить получение более стабильных и/или гомогенных УЪР на основе папилломавируса. Например, в МсСаЛйу е! а1., 1998, ОнапШаБуе ОЦаккетЫу апй ВеазкетЫу о£ Нитап РарШотауииз Туре 11 Уиик 11ке РагБсЫ ίη Уйго, Б. Упо1оду 72(1): 33-41 описывается разборка и сборка УЪР на основе рекомбинантных Ь1 НРУ 11, очищенных из клеток насекомых с целью получения гомогенного препарата УЪР. В АО 9913056 и и8 6245568 также описываются процессы разборки/сборки для приготовления УЪР на основе НРУ.
- 19 014353
В одном аспекте УЪР на основе НРУ получают, как описано в \УО 9913056 или υδ 6245568.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать антигены или антигенные препараты, полученные из паразитов, вызывающих малярию, таких как Р1абшо6шш ГаШрагит или Р1абто6шт νίν-ιχ. Например, возможные антигены, происходящие из Р1абто6шт ГаШрагит, включают циркумспорозоитный белок (С8 белок), ΒΤδ,δ, М8Р1, М8Р3, Ь8Л1, Ь8Л3, АМА1 и ТКАР. К.Т8 представляет собой гибридный белок, содержащий, по существу, всю С-концевую часть циркумспорозоитного (С8) белка из Р.Га1с1рагит, присоединенную посредством четырех аминокислот рге82-части поверхностного антигена вируса гепатита В к поверхностному (8)-антигену вируса гепатита В (НВУ). Его полная структура раскрыта в международной заявке на патент № РСТ/ЕР92/02591, опубликованной под № \УО 93/10152, утверждающей приоритет заявки на патент Великобритании № 9124390.7. При экспрессии в дрожжах К.Т8 продуцируется в виде липопротеиновой частицы, а при совместной экспрессии с δ-антигеном из НВУ продуцируется комбинированная частица, известная как ΚΤδ,δ. Антигены ТКАР описаны в международной заявке на патент № РСТ/СВ89/00895, опубликованной под № \УО 90/01496. Предпочтительным воплощением настоящего изобретения является вакцина против малярии, где антигенная композиция содержит комбинацию антигенов ΚΤ'δ,δ и ТКАР. Другие плазмодийные антигены, являющиеся вероятными кандидатами в компоненты поливалентной вакцины против малярии, представляют собой МδР1, АМА1, МδР3, ЕВА, ОЬиКР, КАР1, КАР2, секвестрин (бециебШп), РГЕМР1, РГ332, Ь8А1, 1ААУ δΤАКР, δΑΕδΑ, РГЕХР1, РГб25, РГб28, РΕδ27/25, РГб16, РГб48/45, РГб230 из Р.Гаарагит и их аналоги в видах Р1абтобшт. Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой композицию, содержащую белок ΚΤ'δ,δ или Сδ или его фрагмент, такой как часть Сδ в Κ^^δ, в комбинации с одним или более дополнительными малярийными антигенами, которые могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из ΜΓδ1, МδР3, АМА1, ББА1 или ББА3. Возможные антигены из РлАах включают циркумспорозоитный белок (ί,'δ белок) и белок, связывающий антиген Даффи (ЭнГГу). и его фрагменты, как, например, РνКII (см., например, \УО 02/12292).
Другие возможные антигены, которые могут быть использованы в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, включают стрептококковые антигены, как, например, из стрептококка группы А или стрептококка группы В.
Другие антигены соответственно происходят из ВИЧ-1 (такие как антиген Е4 или его фрагменты либо дад или его фрагменты, например р24, 1а1, пеГ, др120 или др160 или фрагменты любого из них), герпесвирусов человека, таких как или его производные или немедленный ранний белок, например 1СР27 из Ηδν1 или Ηδν2, цитомегаловируса (в особенности человека), такого как дВ или его производные, ротавируса (включая живые аттенуированные вирусы), вируса Эпштейна-Барра (такие как дВ 350 или его производные), вируса ветряной оспы (такие как др1, II и 1Е63) или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (например, поверхностный антиген вируса гепатита В или его производное), вирус гепатита А, вирус гепатита С и вирус гепатита Е, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (КБУ) (такие белки, как Е, Ν, М и С или их производные), вирус парагриппа, вирус кори, вирус паротита, вирусы папилломы человека (например, НРУ6, 11, 16, 18), флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или вирус гриппа (цельный живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный на куриных эмбрионах или клетках МЭСК, или цельные Ди-виросомы (как описано в К. С1иск, Уассте, 1992, 10, 915-920), или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки НА, ΝΓ, NΑ или М либо их комбинации); или происходят из бактериальных патогенов, таких как №1ббепа брр., включая Ν. допоттйеа и Ктешпдйтбщ (например, капсульные сахариды и их конъюгаты, трансферрин-связывающие белки, лактоферрин-связывающие белки, РИС, адгезины); δ.руодеηеб (например, М белки или их фрагменты, протеаза С5А, липотейхоевые кислоты), δ.ада1асΐ^ае, δ.тиΐаηб; Н.бисгеуц Могахе11а брр., включая М.са1атгйа11б, также известный как Вгап1ате11а са1аггйайб (например, высоко- и низкомолекулярные адгезины и инвазины); Вот6е!е11а брр., включая В.рег1нбб1б (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, филаментозный гемагглютинин, аденилатциклаза, фимбрии), В.ратарейибб1б и В.ЬтопсЫберДса; МусоЬас1етшш брр., включая М.1иЬегси1об1б (например, ЕδΑΤ6, антиген 85 А, -В или -С), М.Ьоν^б, М.1ергае, Μ;ινίιιιη, М.рага1иЬегси1об1б, М.бтедтаДб; Ьедюпе11а брр., включая Ь.рпеиторЫ1а; ЕбсйепсЫа брр., включая энтеротоксичный штамм Е.со11 (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагический штамм Е.со11, энтеропатогенный штамм Е.со11 (например, шигаподобный токсин или его производные); У1Ьтю брр., включая У.с1ю1ега (например, холерный экзотоксин или его производные); δЫде11а брр., включая δ.боηηе^. δ.άубепΐе^^ае, δ.ίΉχικπί; Уегаша брр., включая У.еШетосойДса (например, белок Уор), У.ребДб, У.рбен6о1иЬегси1об1б; Сашру1оЬас1ет брр., включая С.)ещш (например, токсины, адгезины и инвазины) и Е.сой; δа1тоηе11а брр., включая δ.ίурЫ, δ.ра^аίурЫ, δ.сйо1е^аебшб, διπ^πΐί^; Е1б1ег1а брр., включая Ь.топосу1одепеб; НейсоЬас1ег брр., включая Н.ру1оп (например, уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); Рбеиботопаб брр., включая Р.аетидшоба; δίарйу1ососсиб брр., включая δΐΗΟΌν^, δ.ер^άе^т^ά^б; Етегососсиб брр., включая Е.ГаесаПб, Е.Гаесшт; С1обЙбшт брр., включая С.1е1аш (например, столбнячный токсин и его производное), С.Ьо1и1тиш (например, ботулинический токсин и его производное), С.ФГДсПе (например, клостридические токсины А или В и их
- 20 014353 производные); ВасШик крр., включая В.апДДтасДк (например, ботулинический токсин и его производные); СотупеЬасДепит крр., включая С.бДрДДДепае (например, дифтерийный токсин и его производные); ВоттеДа крр., включая В.ЬигдбогДгп (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА. ЭЬрВ). В.даппД (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА. ЭЬрВ), В.аГхеШ (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА, ЭЬрВ), В.апбегкопи (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА, ОЬрВ), В.ДегткД; ЕДтДсДДа крр., включая Е.ецш, и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; КДскеДДкДа крр., включая К.ДскеДДкД; СЫатубДа крр., включая С.ДтасДотаДк (например, МОМР (основной белок наружной мембраны), гепарин-связывающие белки), С.рпеитошае (например, МОМР, гепаринсвязывающие белки), С.ркДДДасД; ЬерДокрДга крр., включая Д.кИеггодапк; Тгеропета крр., включая Т.раШбит (например, редкие белки наружной мембраны), Т.бепДсо1а, Т.ДуобукепДепае; или происходят из паразитов, таких как Р1актобшт крр., включая Р.Да1сДрагит; Тохор1акта крр., включая Т.допби (например, 8АС2, 8АС8, Тд34); ЕпДатоеЬа крр., включая Е.ДДкДо1уДса; ВаЬекДа крр., включая В.тюгоД; Тгурапокота крр., включая Т.сги/ί; СДагбДа крр., включая С.1атЬДа; ЬекДташа крр., включая Ь.та.)ог, РпеитосукДк крр., включая Р.саппД; ТпсДотопак крр., включая Т.уадтаДк; 8сДДкокДота крр., включая 8.тапкош; или происходят из дрожжей, таких как СапбДба крр., включая С.а1ЬДсапк; СгурДососсик крр., включая С.пеоДогтапк.
Другие предпочтительные специфические антигены М.ДиЬегси1окДк представляют собой, например, ТЬ Ка12, ТЬ Η9, ТЬ Ка35, ТЬ38-1, Егб 14, ПРУ, МТ1, М8Ь, тТТС2 и ДТСС1 (№О 99/51748), МДЬ72Е и М72. Белки М.ДиЬегси1окДк также включают слитые белки и их варианты, где по меньшей мере два, предпочтительно три полипептида М.ДиЬегси1окДк слиты в белок большего размера. Предпочтительные слияния включают Ка12-ТЬН9-Ка35, Етб14-ПРУ-МТ1, ПРУ-МТ1-М8Б, Етб14-ПРУ-МТ1-М8Ь-тТСС2, Етб14-ПРУ-МТ1-М8Ь, ПРУ-МТ1-М8Ь-тТСС2, ТЬН9-ОРУ-МТ1 (№О 99/51748). Конкретная последовательность Ка12-ТЬД9-Ка35, которая может быть упомянута, определена как 8 ЕС ΙΌ NО: 6 в XVО 2006/117240, вместе с вариантами, в которых 8ет 704 этой последовательности мутирован до аминокислоты, отличающейся от серина, например до А1а, и их производными, включающими Ν-концевую НДкметку соответствующей длины (например, 8ЕО ΙΌ NО: 2 или 4 в VО 2006/117240).
Типичные антигены СЫатубДа кр., например С.ДтасДотаДк, выбраны из СТ858, СТ089, СТ875, МОМР, СТ622, РтрП (предполагаемый мембранный белок Ό), РтрС и их фрагментов, 8νΚ и иммуногенных фрагментов любого из них (таких как РтрПрб и РтрСрб) и их комбинаций. Предпочтительные комбинации антигенов включают в себя СТ858, СТ089 и СТ875. Конкретные последовательности и комбинации, которые могут быть использованы, описаны в VО 2006/104890.
Предпочтительные бактериальные композиции содержат антигены, происходящие из НаеторДДик крр., включая НлпПиепхае типа В, например, РКР (полирибозил-рибитол-фосфатный капсульный полисахарид) и его конъюгаты, нетипируемый штамм НлпДиепхае, например ОМР26 (белок наружной мембраны 26), высокомолекулярные адгезины, Р5, Р6, белок Ό и липопротеин Ό, и фимбрин и фимбриновые пептиды (патент США № 5843464) или их многокопийные варианты или слитые белки.
Производные поверхностного антигена вируса гепатита В хорошо известны в данной области и включают, среди прочего, такие 8-антигены, как Рге81, Рге82, описанные в заявках на европейский патент ЕР-А-414374; ЕР-А-0304578 и ЕР 198-474. В одном предпочтительном аспекте вакцинная композиция по изобретению содержит антиген ВИЧ-1, представляющий собой дВ120, особенно когда он экспрессирован в клетках СНО (клетки яичника китайского хомячка). В другом воплощении композиция по изобретению содержит дП2Д, который определен выше.
Данные композиции также могут содержать противоопухолевый антиген и быть полезными для иммунотерапевтического лечения видов рака. Например, антиген может представлять собой антигены отторжения опухоли для таких видов рака, как рак предстательной железы, молочной железы, колоректальный рак, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак почки или меланома. Типичные антигены включают МАСЕ 1, 3 и МАСЕ 4 или другие антигены МАОЕ (меланомные антигены), как, например, раскрытые в VО 99/40188, РКАМЕ (ртеДегепДа1 апДдеп оД те1апота; предпочтительный антиген меланомы), ВАСЕ (В-меланомный антиген), Баде (Ь-меланомный антиген) (также известный как ΝΥ Еок 1), 8АСЕ (кагсота апДдеп; антиген саркомы) и НАСЕ (ДеНсаке апДдеп; геликазный антиген) ^О 99/53061) или САСЕ (С-меланомный антиген) (КоЬЬДпк апб Ка^акатД, 1996, СиттепД ОрДпюпк Дп 1ттипо1оду, 8, р. 628-636; Уап беп Еупбе еД а1., 1пДегпаДопа1 Доита1 оД СДпДса1 & ЬаЬотаДогу КекеагсД (представлен на рассмотрение, 1997); Соггеа1е еД а1. (1997), Доита1 оД №Допа1 Сапсег 1пкДДиДе, 89, р. 293). В действительно сти, эти антигены экспрессируются в широком диапазоне типов опухолей, таких как меланома, карцинома легкого, саркома и карцинома мочевого пузыря.
Антигены МАСЕ для применения в настоящем изобретении могут быть экспрессированы в виде слитого белка с энхансером экспрессии или иммунологическим партнером слияния. В частности, белок МАСЕ может быть слит с белком Ό НаеторДДик иДиеп/ае В или его липидизированным производным. В частности, партнер слияния может содержать первую 1/3 белка Ό. Такие конструкции раскрыты в \ν() 99/40188.
Другие опухолеспецифические антигены включают К8А (Дитап абепосатстота-аккосДаДеб апДдеп; антиген, ассоциированный с аденокарциномой человека) (СА733) опухолеспецифические ганглиозиды, такие как СМ2 и СМ3 или их конъюгаты с белками-носителями, но не ограничиваются этим; или ука
- 21 014353 занный антиген может представлять собой сам пептидный гормон, такой как полноразмерный гонадотропин-рилизинг-гормон (СпКН, \νϋ 95/20600), короткий пептид, состоящий из 10 аминокислотных остатков, полезный в лечении многих видов рака или в иммунологической кастрации.
В предпочтительном воплощении используют простатические антигены, такие как простатический специфический антиген (Р8А), РАР (простатическая кислая фосфатаза), Р8СА (ргок!аке к!еат се11 апбдеп; антиген простатных стволовых клеток) ^ΝΑδ, 95(4), 1735-1740, 1998), Р8МА (ргок!а!е кресгбс тетЬгаие апбдеп; мембранный антиген предстательной железы) или антиген, известный как простаза.
Простаза представляет собой специфическую для предстательной железы сериновую протеазу (трипсиноподобную), состоящую из 254 аминокислот, с консервативной для сериновых протеаз каталитической триадой Н-Ό-δ и аминоконцевой препропептидной последовательностью, указывающей на возможную секреторную функцию (Р. №1коп, Ьи Саи, С. Регдикоп, Р. Мокк, К. Сейпак, Ь. Нооб & К. ναηά. Мо1еси1аг с1ошпд апб сйагас!епкабоп о£ ргок!аке, ап апбгодеп-геди1а!еб кеппе рго!еаке χνίΐΐι ргок!а!е гек1пс1еб ехргеккюп, в Ргос. №111. Асаб. δα. И8А (1999), 96, 3114-3119). Описан предполагаемый сайт гликозилирования. Предсказанная структура очень близка по структуре к другим известным сериновым протеазам, показывая, что зрелый полипептид сворачивается в единичный домен. Зрелый белок состоит из 224 аминокислот с одним эпитопом А2, который, как показано, подвергается природному процессингу.
Нуклеотидная последовательность простазы и выведенные полипептидная последовательность и гомологи описаны Регдикоп и др. (Ргос. №б. Асаб. δα. И8А, 1999, 96, 3114-3119) и в международных заявках на патент νθ 98/12302 (и также в соответствующем выданном патенте США 5955306), νθ 98/20117 (и также в соответствующих выданных патентах США 5840871 и США 5786148) (простата-специфический калликреин) и νθ 00/04149 (Р703Р).
Согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие простазные белковые слитые структуры на основе белка простазы и его фрагментов и гомологов (производные). Такие производные подходят для применения их в терапевтических вакцинных композициях, подходящих для лечения опухолей предстательной железы. Обычно фрагмент будет содержать по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 смежных аминокислот, как раскрыто в приведенных выше в качестве ссылки патенте и заявках на патент.
Другой предпочтительный антиген предстательной железы известен как Р50Ш, последовательность ГО ΝΟ: 113 из νθ 98/37814. Его иммуногенные фрагменты и части, содержащие по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 смежных аминокислот, раскрыты в приведенной выше в качестве ссылки заявке на патент. См., например, Рδ108 (νθ 98/50567).
Другие антигены предстательной железы известны из νθ 98/37418 и νθ 004149. Еще один представляет собой δΤΕΑР (к1х бапктетЬгапе ерййейа1 апбдеп о£ ргок!а!е; шестой трансмембранный антиген простаты) ^А8, 96, 14523-14528, 7-12, 1999).
Другие опухолеспецифические антигены, полезные в контексте настоящего изобретения, включают Р1и-1 (1. Бю1. Сйет., 274 (22), 15633-15645, 1999), НΑδН-1 (йитап асйае!е-кси!е йото1од-1), НакН-2, СпрЮ ^а1отоп е1 а1., Вюаккаук, 199, 21, 61-70, патент США № 5654140), криптин (спрбп) (патент США № 5981215). Кроме того, антигены, особенно подходящие для терапии рака, также включают тирозиназу и сурвивин (кигуМп).
Пептиды на основе муцина, такие как Мис 1, см., например, в υδ 5744144, υδ 5827666, νθ 88/05054, υδ 4963484. Конкретно рассматриваются происходящие из Мис 1 пептиды, содержащие по меньшей мере одну повторяющуюся единицу пептида Мис 1, предпочтительно по меньшей мере два таких повтора, которая распознается антителом δМ3 (υδ 6054438). Другие пептиды, происходящие из муцина, включают пептид из Мис 5.
Антиген по изобретению может представлять собой антиген рака молочной железы, такой как йег 2/№и, маммаглобин (патент США № 5668267), или антиген, раскрытый в νθ 00/52165, νθ 99/33869, νθ 99/19479, νθ 98/45328. Антигены Нег 2 пей раскрыты, среди прочего, в патенте США № 5801005. Предпочтительно Нег 2 пей содержит целый внеклеточный домен (содержащий приблизительно с 1 по 645 аминокислоту) или его фрагменты и по меньшей мере иммуногенную часть или целый внутриклеточный домен, содержащий приблизительно 580 С-концевых аминокислот. В частности, внутриклеточная часть должна содержать домен фосфорилирования или его фрагменты. Такие конструкции раскрыты в νθ 00/44899. Особенно предпочтительная конструкция известна как Εί'Ό РЭ, другая известна как Εί'Ό РЭ, см. νθ 00/44899. Нег 2 пей, который использован в данном описании, может происходить из крысы, мыши или человека.
Данные композиции могут содержать антигены, ассоциированные с опухолеподдерживающими механизмами (например, ангиогенезом, опухолевой инвазией), например, бе 2, УЕСР (сосудистый эндотелиальный фактор роста).
Можно предвидеть, что в композициях по настоящему изобретению могут быть использованы антигены, происходящие из Воггейа кр. Например, антигены могут включать нуклеиновую кислоту, антиген, происходящий из патогена, или антигенные препараты, рекомбинантно полученные белок или пептиды и химерные слитые белки. В частности, антиген представляет собой θкрΑ. θкрΑ может представлять собой полностью зрелый белок в липидизированной форме как в клетке-хозяине (Е.сой), обозначен
- 22 014353 ный как Ыро-ОкрА, или его нелипидизированное производное. Такие нелипидизированные производные включают нелипидизированный слитый белок Ы81-ОкрА, который имеет первые 81 Ν-концевую аминокислоту неструктурного белка (N81) вируса гриппа и полный белок ОкрА, а другой - МЭР (мурамилдипептид)-ОкрА, представляющий собой нелипидизированную форму ОкрА, несущую 3 дополнительные Ν-концевые аминокислоты.
Композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики или терапии аллергии. Такие вакцины будут содержать аллерген-специфические (например, Эег р1) и аллергеннеспецифические антигены (например, пептиды, происходящие из 1дЕ человека, включая к1ап\уог111 декапептид (ЕР 0477231 В1), но не ограничиваясь этим).
Композиции по настоящему изобретению также могут быть использованы для профилактики или терапии хронических расстройств, отличных от аллергии, рака или инфекционных заболеваний. Такими хроническими расстройствами являются такие заболевания, как атеросклероз и болезнь Альцгеймера.
Композиции по настоящему изобретению, в частности, подходят для иммунотерапевтического лечения таких заболеваний, как хронические состояния и виды рака, а также для терапии хронических инфекций. Соответственно композиции по настоящему изобретению особенно подходят для иммунотерапии инфекционных заболеваний, таких как туберкулез (ТВ), вирусные инфекции СПИД и гепатит В (НерВ).
Кроме того, что касается СПИДа, предложен способ лечения индивидуума, чувствительного к СПИДу или страдающего от него. Этот способ включает введение вакцины по настоящему изобретению индивидууму, тем самым уменьшая снижение ί.Ό4+ Т-клеток, вызываемое последующей ВИЧинфекцией, или замедляя либо останавливая снижение количества ί.Ό4+ Т-клетоку индивидуума, уже инфицированного ВИЧ.
Другие антигены включают в себя бактериальные (предпочтительно капсульные) сахариды, отличные от (или в дополнение к) таких пневмококковых антигенов, описанных выше. Полисахаридные антигены удобно хранить в жидкой нерасфасованной форме, адсорбированной на фосфате алюминия, следовательно, напрямую создавать вакцинные композиции по изобретению путем смешивания указанной жидкой нерасфасованной формы с адъювантом по изобретению экстемпорально. Предпочтительно, чтобы другие бактериальные сахариды были выбраны из группы, состоящей из капсульного сахарида КтешпдШШк серогруппы А (МепА), капсульного сахарида КтешпдШШк серогруппы С (МепС), капсульного сахарида КтешпдИШк серогруппы У (МепУ), капсульного сахарида НтептщЦбй серогруппы ^У-135 (МепХУ), капсульного сахарида группы I стрептококков группы В, капсульного сахарида группы II стрептококков группы В, капсульного сахарида группы III стрептококков группы В, капсульного сахарида группы IV стрептококков группы В, капсульного сахарида группы У стрептококков группы В, капсульного сахарида 5 типа 81арйу1ососсик аигеик, капсульного сахарида 8 типа 81арйу1ососсик аигеик, У1 сахарида из 8а1топе11а 1урЫ, КтешпдИШк ЬР8, М.са1аггйа11к ЬР8 и Н.тПиепхае ЬР8. Под ЬР8 понимают либо нативный липополисахарид (или липоолигосахарид), либо липополисахарид, в котором липидная часть А была подвергнута детоксикации любым из множества известных способов (см., например, \УО 97/18837 или \УО 98/33923), либо любую молекулу, содержащую О-полисахарид, происходящий из указанного ЬР8. Под Ν. тешпдШбй ЬР8 понимают один или более из 12 известных иммунотипов (Ь1, Ь2, Ь3, Ь4, Ь5, Ь6, Ь7, Ь8, Ь9, Ь10, Ь11 или Ь12).
Особенно предпочтительными комбинациями являются композиции, содержащие:
1) конъюгированный Н1Ь, конъюгированный МепА и конъюгированный МепС;
2) конъюгированный Н1Ь, конъюгированный МепУ и конъюгированный МепС;
3) конъюгированный Н1Ь и конъюгированный МепС и
4) конъюгированный МепА, конъюгированный МепС, конъюгированный МепУ и конъюгированный Меп\У-135.
Количество Р8 в каждом из приведенных выше конъюгатов может составлять 5 или 10 мкг каждого на 0,5 мл дозы для человека. Предпочтительно Н1Ь, МепА, МепС, Меп\У-135 и МепУ представляют собой ТТ-конъюгаты.
Проблема, связанная с полисахаридным подходом к вакцинации, заключается в том, что полисахариды рег ке являются слабыми иммуногенами. Для преодоления этой проблемы сахариды по изобретению можно конъюгировать с белковыми носителями, которые обеспечивают фоновый Т-клеточный хелперный ответ. Поэтому предпочтительно, чтобы используемые в данном изобретении сахариды были связаны с таким белковым носителем. Примеры таких носителей, которые в настоящее время обычно используют для получения сахаридных иммуногенов, включают дифтерийные и столбнячные анатоксины (ΌΤ, СКМ197 из ΌΤ и ТТ соответственно), гемоцианин лимфы улитки (КЕН), белок Ό из НаеторЫ1ик тПиеп/ае (ЕР-В-594610), ОМРС из КтешпдИШк и очищенное белковое производное туберкулина очищенный от белка туберкулин (РРЭ).
Сахарид может быть связан с белком-носителем любым известным способом (например, по Ь1кЫ1е, патент США № 4372945 и по Агтог и др., патент США № 4474757). Конъюгирование предпочтительно осуществляют с использованием СПАР (\УО 95/08348).
- 23 014353
Предпочтительно, когда соотношение белок:сахарид (масса:масса) в конъюгатах составляет 0,3:1-1:1, более предпочтительно 0,6:1-0,8:1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,7:1.
В настоящее изобретение включены комбинации антигенов, которые обеспечивают защиту против пневмококка и другого патогена. Многие педиатрические вакцины в настоящее время дают в виде комбинированной вакцины с тем, чтобы уменьшить количество инъекций, которые должен получить ребенок. Таким образом, что касается педиатрических вакцин, то другие антигены из других патогенов могут быть приготовлены вместе с пневмококковыми вакцинами по изобретению. Например, вакцины по изобретению могут быть приготовлены вместе (или введены по отдельности, но в одно и то же время) с хорошо известной трехвалентной комбинированной вакциной, содержащей дифтерийный анатоксин (ΌΤ), столбнячный анатоксин (ТТ) и коклюшные компоненты [обычно подвергнутый детоксикации коклюшный анатоксин (РТ) и филаментозный гемагглютинин (РНА) возможно с пертактином (РКЫ) и/или агглютинином 1+2], например, с имеющейся в продаже вакциной ΙΝΡΆΝΚΙΧ-ОТРа™ (8тййК1теВеесНат Вю1одка1к), которая содержит антигены ΌΤ, ТТ, РТ, РНА и РИН или с цельным клеточным коклюшным компонентом, например, который поставляется на рынок фирмой 8тйЪК1теВеесйат Вю1одюа1к 8.А. под названием Тгйаппх™. Комбинированная вакцина также может содержать другой антиген, такой как поверхностный антиген гепатита В (НВкАд), антигены вируса полиомиелита (например, трехвалентный инактивированный вирус полиомиелита - 1РУ), белки наружной мембраны Могахе11а са!аггйайк, белки нетипируемого штамма Наеторййик тПием/ае, белки В наружной мембраны КтешпдШФк.
Примерами предпочтительных белковых антигенов Могахе11а са!аггйайк, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения воспаления среднего уха), являются: ОМР106 [№О 97/41731 (Ап!ех) и \\'О 96/34960 (РМС)]; ОМР21; ЬЬрА и/или ЬЬрВ [№О 98/55606 (РМС)]; ТЬрА и/или ТЬрВ [№О 97/13785 и XV О 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1ттеп М.Е., е! а1. (1993), 1пГес1. 1шщип., 61: 2003-2010]; ИкрА1 и/или ИкрА2 |\УО 93/03761 (Университет Техаса)]; ОтрСЭ; НакИ (РСТ/ЕР99/03824); РИО (РСТ/ЕР99/03823); ОМР85 (РСТ/ЕР00/01468); Йро06 (СВ 9917977.2); Йро10 (СВ 9918208.1); Кро11 (СВ 9918302.2); 11ро18 (СВ 9918038.2); Р6 (РСТ/ЕР99/03038); Ό15 (РСТ/ЕР99/03822); Отр1А1 (РСТ/ЕР99/06781); Н1у3 (РСТ/ЕР99/03257) и ОтрЕ.
Примеры антигенов нетипируемых штаммов Наеторййик шВиепгае, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения воспаления среднего уха), включают в себя белок фимбрин [(И8 5766608 - О1ио 81а1е ИекеагсН Роипйайоп)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например, ЬВ1 (Г)-пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или XVО 99/64067]; ОМР26 ^О 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (Государственный университет Нью-Йорка)]; ТЬрА и/или ТЬрВ; Н1а; НкГ; Нт47; НГ; Нш1; 111т\2; Нт^3; Нтм4; Нар; Ό15 (№О 94/12641); белок Ό (ЕР 594610); Р2 и Р5 (νθ 94/26304).
Другие рассматриваемые комбинации представляют собой пневмококковый сахарид и белок по изобретению в комбинации с вирусными антигенами, например из вируса гриппа (аттенуированного, расщепленного или субъединичного [например, поверхностные гликопротеины нейраминидаза ^А) и гемагглютинин (НА). См., например, СНа1оирка I. е! а1., Еиг. 1оигпа1 Сйп. МюгоЬюк 1пГес!. Эй. 1996, 15: 121-127]), из И8У (например, антигены Р и С или слияния Р/С, см., например, 8с1ший1 А.С. е! а1., к У1го1., Мау 2001, р. 4594-4603), из Р1У3 (вирус парагриппа 3) (например, белки НN и Р, см. 8с1ший1 е! а1., выше), вируса ветряной оспы (например, аттенуированного; гликопротеины Ι-У и т.д.) и из любого (или всех) компонента(ов) ММИ (вакцина против кори, эпидемического паротита, краснухи).
Предпочтительная комбинированная педиатрическая вакцина, рассматриваемая в настоящем изобретении для повсеместного лечения или предупреждения воспаления среднего уха, содержит один или более сахаридных антигенов 81гер1ососсик рпеитошае (предпочтительно конъюгированных с белком Ό); один или более пневмококковых белков (предпочтительно таких, которые описаны выше) и один или более экспонированных на поверхности антигенов Могахе11а са!аггйайк и/или нетипируемого штамма НаеторЫ1ик тПиепхае.
Белок Ό может быть предпочтительно использован в качестве белкового носителя для пневмококковых сахаридов (которые упомянуты выше), и поскольку он сам является иммуногеном, способным продуцировать опосредованную В-клетками защиту против нетипируемого штамма Н.шЛиепгае (п!Н1). Антигены Могахе11а са!аггйайк или нетипируемого штамма НаеторЫ1ик тПиепхае могут быть включены в вакцину в субъединичной форме или могут быть добавлены в виде антигенов, представленных на поверхности везикул (пузырьков) наружной мембраны, приготовленных из бактерий.
- 24 014353
Иммуногенные свойства иммуногенной композиции. используемой для вакцинации по настоящему изобретению
В настоящем изобретении имуногенная композиция предпочтительно способна индуцировать усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против по меньшей мере одного из составляющих антигенов или антигенной композиции по сравнению с СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом. полученным при использовании соответствующей композиции. которая является безадъювантной. т.е. не содержит какого-либо экзогенного адъюванта (обозначенной в данном описании также как простая композиция). В конкретном воплощении. когда иммуногенная композиция представляет собой композицию на основе вируса гриппа и когда препарат противогриппозной вакцины происходит из нескольких штаммов вируса гриппа. один из которых является пандемическим штаммом. указанный усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ направлен против пандемического штамма вируса гриппа.
Под усиленным СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом подразумевают. что более высокий СЭ4ответ получают у млекопитающего после введения адъювантной иммуногенной композиции по сравнению с иммунным ответом. полученным после введения такой же композиции без адъюванта. Например. более высокий СЭ4 Т-клеточный ответ получают у пациента-человека после введения иммуногенной композиции. содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом по изобретению. по сравнению с ответом. индуцированным после введения иммуногенной композиции. содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат. который является безадъювантным. Такая композиция будет преимущественно использоваться для индуцирования СЭ4 Т-клеточного ответа против вируса гриппа. способного определять эпитопы вируса гриппа. представленные молекулами класса II МНС.
В частности. но не исключительно. указанный усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ получают у иммунологически непримированного пациента. т.е. пациента. который является серонегативным в отношении указанного вируса гриппа или антигена. Эта серонегативность может быть следствием того. что указанный пациент никогда не сталкивался с таким вирусом или антигеном (так называемый наивный пациент) или. альтернативно. не давал реакции на указанный антиген после встречи с ним. В конкретном аспекте указанный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ получают у субъекта с ослабленным иммунитетом. такого как пожилой человек. обычно в возрасте 65 лет или старше. или взрослый человек моложе 65 лет с высоким риском медицинского состояния (взрослый человек из группы с высоким риском). или ребенок в возрасте менее двух лет.
Усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ можно оценить путем измерения количества клеток. продуцирующих любой из следующих цитокинов:
клеток. продуцирующих по меньшей мере два разных цитокина (СО40Б. [Ц-2. ΓΕΝ-γ. ΤΝΕ-α (фактор некроза опухоли));
клеток. продуцирующих по меньшей мере СО40Б и другой цитокин (4Е-2. ΤΝΕ-α. ΣΕΝ-γ); клеток. продуцирующих по меньшей мере ^-2 и другой цитокин (СО40Б. ΤΝΕ-α. ΞΕΝ-γ); клеток. продуцирующих по меньшей мере ΖΕΝ-γ и другой цитокин (4Е-2. ΤΝΕ-α. СО40Б); клеток. продуцирующих по меньшей мере ΤΝΕ-α и другой цитокин (4Е-2. СО40Б. ΧΕΝ-γ). Усиленным СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом считается такой ответ. когда количество клеток. продуцирующих любой из вышеупомянутых цитокинов. будет более высоким после введения адъювантной композиции по сравнению с введением безадъювантной композиции. Обычно будут выполнены по меньшей мере одно. предпочтительно два из пяти условий. упомянутых в данном описании выше. В конкретном воплощении клетки. продуцирующие все четыре цитокина. будут представлены в большем количестве в адъювантной группе по сравнению с безадъювантной группой.
Усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ. обусловленный адъювантной противогриппозной композицией по настоящему изобретению. в идеальном случае может быть получен после однократного введения. Подход с использованием однократной дозы будет чрезвычайно подходящим. например. в ситуации быстро развивающейся эпидемии. В некоторых случаях. особенно для пожилого населения. или в случае маленьких детей (в возрасте младше 9 лет). которых первый раз вакцинируют против гриппа или в случае пандемии полезным может быть введение двух доз одинаковой композиции в течение сезона. Вторую дозу указанной одинаковой композиции (рассматриваемой еще как композиция для первой вакцинации) можно вводить во время действия первичного иммунного ответа и через адекватный промежуток времени. Обычно вторую дозу такой композиции дают через несколько недель или приблизительно один месяц. например 2. 3. 4. 5 или 6 недель после первой дозы. чтобы помочь примировать иммунную систему неотвечающих или слабоотвечающих индивидуумов.
В другом воплощении введение указанной иммуногенной композиции индуцирует усиленный ответ В-клеток памяти у пациентов. которым введена адъювантная иммуногенная композиция. по сравнению с ответом В-клеток памяти. индуцированным у индивидуумов. иммунизированных безадъювантной композицией. Подразумевается. что усиленный ответ В-клеток памяти означает увеличенную частоту встречаемости В-лимфоцитов периферической крови. способных к дифференцировке в антителосекретирующие плазматические клетки после встречи с антигеном. как измерено посредством стимуляции дифференцировки ίη νίίΐΌ.
- 25 014353
В другом воплощении введение указанной иммуногенной композиции индуцирует усиленный гуморальный ответ у пациентов, которым введена адъювантная иммуногенная композиция, по сравнению с гуморальным ответом, индуцированным у индивидуумов, иммунизированных безадъювантной композицией. Указанный гуморальный иммунный ответ может быть измерен согласно любой из методик, приведенных подробно в примере I и особенно в разделах Ι.1 (Ι.1.1), Ι.2 (Ι.2.1) и Ι.3 (Ι.3.5.2). Если иммуногенная композиция представляет собой композицию по основе вируса гриппа, конкретный указанный гуморальный ответ получают против гомологичных и гетерологичных штаммов. В частности, указанный гетерологичный гуморальный иммунный ответ означает гуморальный ответ между штаммами вируса гриппа и обозначается как перекрестно-реактивный гуморальный иммунный ответ. Указанный перекрестно-реактивный гуморальный иммунный ответ включает индукцию ответа против штамма вируса гриппа, представляющего собой вариант (дрейфующий штамм) штамма вируса гриппа, используемого для вакцинации. Пример такого ответа проиллюстрирован в примере ΙΙΙ.3.1 и на фиг. 2.
В конкретном воплощении введение указанной адъювантной иммуногенной композиции индуцирует по меньшей мере два из следующих ответов: (1) усиленный ί.Ό4 Т-клеточный иммунный ответ; (2) усиленный ответ В-клеток памяти; (3) усиленный гуморальный ответ против по меньшей мере одного из компонентов многокомпонентного антигена(ов) или антигенной композиции по сравнению с тем и другим иммунным ответом, полученным при использовании соответствующей композиции, которая является безадъювантной, т.е. не содержит какого-либо экзогенного адъюванта (обозначенной в данном описании также как простая композиция).
В еще одном конкретном воплощении вакцинация композицией для первой вакцинации, адъювантной, не оказывает измеримого воздействия на СО8-ответ.
Конкретным воплощением изобретения является то, что композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат, изготовленный с сапониновым адъювантом, представленным в форме липосомы, в частности сапонин 0821 в блокированной холестерином форме, эффективна в стимулировании Т-клеточных ответов у человеческой популяции с ослабленным иммунитетом. В одном из воплощений указанный адъювант дополнительно содержит 3Ό-ΜΡΕ. В частности, введение однократной дозы иммуногенной композиции для первой вакцинации, как описано в данном изобретении, способно обеспечить улучшенную серопротекцию, как оценено посредством коррелятов защиты для противогриппозных вакцин после ревакцинации пожилого населения против гриппа по сравнению с вакцинацией безадъювантной противогриппозной вакциной. Заявленная адъювантная композиция также способна индуцировать усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против вируса гриппа по сравнению с ответом, полученным при использовании безадъювантной композиции. Это наблюдение может быть связано с повышенной реактивностью после вакцинации или инфекции по отношению к антигенной стимуляции вирусом гриппа. Кроме того, это также может быть связано с перекрестной реактивностью, т. е. более высокой способностью отвечать на вариантные штаммы вируса гриппа. Такой усиленный ответ может быть особенно полезен для человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, такой как пожилое население (в возрасте 65 лет и старше) и, в частности, пожилое население из группы с высоким риском. Это может приводить к снижению коэффициента общей заболеваемости и смертности и предупреждению неотложной госпитализации в случае пневмонии других гриппозоподобных заболеваний. Это также может быть полезно для детской популяции (в возрасте менее 5 лет, предпочтительно менее 2 лет).
Кроме того, это позволяет индуцировать ί.Ό4 Т-клеточный ответ, который является более стабильным во времени, например все еще присутствует через 1 год после первой вакцинации, по сравнению с ответом, индуцированным безадъювантной композицией.
В конкретном аспекте ί.Ό4 Т-клеточный иммунный ответ, такой как усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, полученный у непримированного субъекта, включает индукцию перекрестнореактивного ί.Ό4 Т-хелперного ответа. В частности, увеличивается количество перекрестно-реактивных ί.Ό4 Т-клеток. Под перекрестно-реактивным СЭ4-ответом понимают распознавание СЭ4 Т-клетками общих эпитопов среди штаммов вируса гриппа.
Обычно доступные противогриппозные вакцины эффективны только против инфицирующих штаммов вируса гриппа, имеющих гемагглютинины с похожими антигенными характеристиками. Если инфицирующий (циркулирующий) вирус гриппа был подвергнут минорным изменениям (таким как точечная мутация или накопление точечных мутаций, приводящее к аминокислотным изменениям, например, в поверхностных гликопротеинах, в частности гемагглютинине (антигенный дрейфующий вариант вирусного штамма)), то вакцина все еще может обеспечивать некоторую защиту, хотя она может обеспечивать только ограниченную защиту, поскольку вновь созданные варианты могут ускользать от иммунитета, индуцированного предшествующей инфекцией вируса гриппа или вакцинацией. Антигенный дрейф ответственен за ежегодные эпидемии, которые происходят в течение периодов времени между пандемиями (\11еу & 8ке11е1. 1987, Аии. Кеу. Вюскеш. 56, 365-394). Индукция перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток дает дополнительное преимущество для композиции по изобретению в том, что она может также обеспечивать перекрестную защиту, другими словами, защиту против гетерологичных инфекций, т.е. инфекций, вызываемых циркулирующим штаммом вируса гриппа, который является вариантом (например, дрейфующим) штамма вируса гриппа, содержащегося в иммуногенной композиции. Это может
- 26 014353 иметь преимущество, когда циркулирующий штамм трудно культивировать на куриных эмбрионах или продуцировать в клеточной культуре, что делает использование дрейфующего штамма рабочей альтернативой. Это также может иметь преимущество в случаях, когда субъект получал первую и вторую вакцинацию с интервалом в несколько месяцев или год и когда штамм вируса гриппа в иммуногенной композиции, используемой для второй иммунизации, представляет собой дрейфующий вариантный штамм штамма, используемого в композиции, используемой для первой вакцинации.
Следовательно, адъювантная противогриппозная иммуногенная композиция, которая определена в данном описании, имеет большую способность индуцировать серопротекцию и перекрестно-реактивные СЭ4 Т-клетки у вакцинируемых пожилых субъектов. Это свойство может быть связано с повышенной способностью отвечать на вариантный штамм штамма, присутствующего в иммунстенной композиции. Это может служить доказательством важного преимущества в пандемической ситуации. Напримерб поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция, содержащая какой-либо из штаммов Н5, Н2, Н9, Н7 или Н6 или несколько штаммов из них, может обеспечивать повышенную способность отвечать на пандемический вариант, т. е. дрейфующий штамм указанного пандемического штамма(ов), либо после следующей далее вакцинации указанным дрейфующим штаммом, либо после инфекции указанным дрейфующим штаммом.
Детекция перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток после вакцинации противогриппозной вакциной.
СЭ4 Т-клетки, которые способны распознавать как гомологичные, так и дрейфующие штаммы вируса гриппа, названы в настоящем документе перекрестно-реактивными. Адъювантные противогриппозные композиции, описанные в данном изобретении, способны демонстрировать гетеросубтипическую перекрестную реактивность, поскольку наблюдается перекрестная реактивность против дрейфующих штаммов вируса гриппа. Как указано выше, способность пандемической вакцинной композиции быть эффективной против дрейфующих пандемических штаммов может служить доказательством важности этого свойства в случае пандемий.
Согласно вышеприведенным наблюдениям у человека идентифицированы СЭ4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вируса гриппа (6е1бег С. е! а1. 1998, 1п1. 1ттипо1. 10(2): 211-22; СеИег С.М. е! а1. 1996, 1. Уно1., 70(7): 4787-90; 6е1бег СМ. е! а1. 1995, 1. Уно1., 1995, 69(12): 7497-506).
В конкретном воплощении адъювантная композиция может приносить дополнительную пользу, обеспечивая лучшую защиту против циркулирующих штаммов, подвергнутых более значительному изменению (такому как генетическая рекомбинация, например, между двумя разными видами) в гемагглютинине (антигенный шифт), против которых доступные в настоящее время вакцины не эффективны.
Ревакцинация и композиция, использованная для ревакцинации (бустерная композиция).
В одном из воплощений изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных иммуногенной композицией, заявленной в данном описании.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата из первого пандемического штамма вируса гриппа в изготовлении адъювантной иммуногенной композиции, как определено в данном описании, для защиты против инфекции вирусом гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, являющимся вариантом указанного первого штамма вируса гриппа.
В другом аспекте изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении противогриппозной иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных адъювантной противогриппозной композицией, заявленной в данном описании, или адъювантной противогриппозной композицией, содержащей вариантный штамм вируса гриппа, при этом адъювант является таким, как он определен в данном описании.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ вакцинации человеческой популяции или отдельного человека против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против вариантного штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку (1) первой композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа и адъювант, как определено в данном описании, и (2) второй иммуногенной композиции, содержащей вариантный штамм вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа. В конкретном воплощении указанный первый штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. В другом конкретном воплощении указанный вариантный штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. В частности, ревакцинацию осуществляют с использованием противогриппозной композиции, содержащей по меньшей мере один штамм, который является циркулирующим пандемическим штаммом. Как примирующая композиция, так и бустерная композиция могут быть поливалентными, т. е. могут содержать по меньшей мере два штамма вируса гриппа. Если композиция(и) является(ются) поливалентной(ыми), то по меньшей мере один штамм ассоциирован с вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Обычно ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой(ых) вакцинации(й), предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев.
- 27 014353
Иммуногенная композиция для ревакцинации (бустерная композиция) может содержать любой тип антигенного препарата. либо инактивированный. либо живой аттенуированный. Она может содержать один и тот же тип антигенного препарата. например расщепленный вирус гриппа или его антигенный препарат. или представлять собой цельновирионную вакцину или вакцину на основе очищенных НА и ΝΑ (субъединичную). что и иммуногенная композиция. используемая для первой вакцинации. Альтернативно. бустерная композиция может содержать другой тип антигена вируса гриппа. отличающийся от используемого для первой вакцинации. Предпочтительно используют расщепленный вирус. Бустерная композиция может быть адъювантной или безадъювантной. Безадъювантная бустерная композиция может представлять собой Б1иаπx™/α-Κ^x®/1ηί1икρ1^ΐ®. которую вводят внутримышечно. Данная композиция содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена. приготовленных из рекомендованных ВОЗ штаммов вируса гриппа соответствующего сезона.
Бустерная композиция может быть адъювантной или безадъювантной. В конкретном воплощении бустерная композиция содержит сапониновый адъювант. который определен в данном описании.
В конкретном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации (также называемая в данном описании ниже бустерная композиция) содержит вирус гриппа или его антигенный препарат. который имеет общие СЭ4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом. используемым для первой вакцинации. Считается. что общий СЭ4 Т-клеточный эпитоп означает пептиды/последовательности/эпитопы из разных антигенов. которые могут распознаваться одной и той же СЭ4-клеткой (см. примеры описанных эпитопов в СеИег С. е1 а1.. 1998. ШЕ Iттиηο1. 10(2): 211-22; СеИег С.М.. е1 а1.. 1996. I Уто1. 70(7): 4787-90; Се1ёег С.М. е1 а1.. 1995. I У1го1. 69(12): 7497-506).
В одном из воплощений изобретения бустерная композиция представляет собой одновалентную противогриппозную композицию. содержащую штамм вируса гриппа. который ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. В частности. указанный штамм в бустерной композиции представляет собой циркулирующий пандемический штамм. Подходящими штаммами являются Η5Ν1. Η9Ν2. Η7Ν7 и Η2Ν2. но не ограничиваются этим. Указанный штамм может быть тем же. или одним из. что и присутствующие в композиции. используемой для первой вакцинации.
В альтернативном воплощении указанный штамм может представлять собой вариантный штамм. т.е. дрейфующий штамм. штамма. присутствующего в композиции. используемой для первой вакцинации. В другом конкретном воплощении бустерная композиция представляет собой поливалентную противогриппозную вакцину. В частности. если бустерная композиция является поливалентной вакциной. такой как двухвалентная. трехвалентная или четырехвалентная вакцина. то по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть связан с пандемической вспышкой. В конкретном воплощении два или более штаммов в бустерной композиции являются пандемическими штаммами. В другом конкретном воплощении по меньшей мере один пандемический штамм в бустерной композиции представляет собой штамм того же типа или является одним из них. что и присутствующие в композиции. используемой для первой вакцинации. В альтернативном воплощении по меньшей мере один штамм может представлять собой вариантный штамм. т.е. дрейфующий штамм. по меньшей мере одного пандемического штамма. присутствующего в композиции. используемой для первой вакцинации. В частности. по меньшей мере один штамм в бустерной композиции является циркулирующим пандемическим штаммом. Бустерная композиция может быть или не быть адъювантной.
Обычно бустерную композицию. если ее используют. применяют на следующий сезон гриппа. например приблизительно через один год после первой иммуногенной композиции. Бустерную композицию также можно использовать каждый последующий год (третья. четвертая. пятая вакцинация и т.д.). Бустерная композиция может быть такой же. как и композиция. используемая для первой вакцинации. Удобно. когда бустерная композиция содержит вирус гриппа или его антигенный препарат. который является вариантным штаммом вируса гриппа. используемого для первой вакцинации. В частности. штаммы вируса гриппа или их антигенный препарат выбирают в соответствии с эталонным веществом. распределяемым Всемирной организацией здравоохранения. так что они адаптированы к штамму вируса гриппа. который циркулирует в год ревакцинации.
Антиген вируса гриппа или антигенная композиция. используемые при ревакцинации. предпочтительно содержат адъювант соответственно. как описано выше. Адъювантом может быть сапонин. представленный в форме липосомы. как описано в данном изобретении выше. который является предпочтительным. возможно содержащим дополнительный адъювант. такой как 30-МРБ.
В одном аспекте ревакцинация индуцирует любое одно. предпочтительно два или все. из следующего: (1) усиленный СО4-ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата; или (2) усиленный ответ В-клеток памяти; или (3) усиленный гуморальный ответ по сравнению с эквивалентным ответом. индуцированным после первой вакцинации с применением безадъювантного вируса гриппа или его антигенного препарата. Предпочтительно. когда иммунологический ответ(ы). индуцированный после ревакцинации с применением адъювантного вируса гриппа или его антигенного препарата. как определено в данном описании. оказывается (оказываются) выше соответствующего ответа. индуцированного после ревакцинации безадъювантной композицией. Предпочтительно. когда иммунологические ответы. инду
- 28 014353 цированные после ревакцинации с применением безадъювантного, предпочтительно расщепленного, вируса гриппа, выше у популяции, первый раз вакцинированной адъювантной композицией вируса гриппа, предпочтительно расщепленного, по сравнению с соответствующим ответом у популяции, первый раз вакцинированной безадъювантной композицией расщепленного вируса гриппа, предпочтительно расщепленного.
В конкретном воплощении ревакцинация субъектов бустерной композицией, содержащей вирус гриппа и сапониновый адъювант в форме липосомы, как определено в данном описании выше, показывает более высокие титры антител по сравнению с соответствующими значениями в группе людей, первый раз вакцинированных безадъювантной композицией и ревакцинируемых безадъювантной композицией. Эффект адъюванта на усиление антительного ответа на ревакцинацию особенно важен для пожилого населения, у которого, как известно, имеется низкий ответ на вакцинацию или инфекцию вирусом гриппа. Связанная с адъювантной композицией польза также была отмечена в отношении усиления 0Ό4 Т-клеточного ответа после ревакцинации.
Конкретно, адъювантная композиция по изобретению способна индуцировать лучшую перекрестную реактивность против дрейфующего штамма (штамм вируса гриппа из следующего сезона гриппа) по сравнению с защитой, обеспечиваемой контрольной вакциной. Указанная перекрестная реактивность демонстрирует более продолжительную персистенцию по сравнению с полученной с применением безадъювантной композиции. Эффект адъюванта в повышении перекрестной реактивности против дрейфующего штамма важен в пандемической ситуации.
В другом воплощении изобретение относится к режиму вакцинации, согласно которому первую вакцинацию осуществляют противогриппозной композицией, предпочтительно композицией расщепленного вируса гриппа, содержащей по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который потенциально мог бы вызвать вспышку пандемии, а ревакцинацию осуществляют циркулирующим штаммом, или пандемическим штаммом, или классическим штаммом.
С.’О4-эпитоп в НА.
Этот антигенный дрейф главным образом свойственен эпитопным участкам вирусных поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (ИА). Известно, что любое различие в 0Ό4- и В-клеточных эпитопах среди разных штаммов вируса гриппа, используемое вирусом для ускользания от адаптивного ответа иммунной системы хозяина, будет играть важную роль в вакцинации против гриппа, и это действительно имеет место.
У человека идентифицированы 0Ό4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вируса гриппа (см., например: СеИег С. е1 а1., 1998, Шк Iттиηо1. 10(2): 211-22; Се1бег Ο.Μ. е1 а1., 1996, 1. У1го1. 70(7): 4787-90 и СеИег С-Μ. е1 а1., 1995, 1. У1го1., 69(12): 7497-506).
В конкретном воплощении ревакцинацию осуществляют путем использования бустерной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие 0Ό4 Т-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Таким образом, данное изобретение относится к применению иммуногенной композиции, содержащей пандемический вирус гриппа или его антигенный препарат и сапонин в форме липосомы, в частности 0821, в форме, подвергнутой детоксикации холестерином, возможно с 3Ό-ΜΡΕ, в изготовлении компонента мультидозовой вакцины для первой вакцинации, причем мультидозовая вакцина дополнительно содержит, в виде повторной иммунизирующей дозы, вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие 0Ό4 Т-клеточные эпитопы с антигеном пандемического вируса гриппа или антигенным препаратом этого вируса, присутствующим в дозе, введенной при первой вакцинации.
Способы вакцинации.
Иммуногенные композиции по изобретению можно вводить любым подходящим способом доставки, таким как интрадермальный, через слизистые, например интраназальный, пероральный, внутримышечный или подкожный. Другие способы доставки хорошо известны в данной области.
Для адъювантной иммуногенной композиции предпочтительным является внутримышечный способ доставки.
Интрадермальная доставка представляет собой другой подходящий способ. Для интрадермальной доставки может быть использовано любое подходящее устройство, например устройства с короткой иглой, такие как устройства, описанные в И8 4886499, И8 5190521, И8 5328483, И8 5527288, И8 4270537, и8 5015235, и8 5141496, И8 5417662. Интрадермальные вакцины также можно вводить посредством устройств, ограничивающих эффективную длину проникновения иглы внутрь кожи, таких как устройства, описанные в УО 99/34850 и ЕР 1092444, которые включены в данное описание посредством ссылки, и их функциональных эквивалентов. Кроме того, подходят устройства с безыгольным впрыскиванием, с помощью которых доставляют жидкие вакцины в дерму посредством безыгольного инжектора для жидкостей или посредством иглы, которой прокалывают роговичный слой и создают струю, достигающую дерму. Устройства с безыгольным впрыскиванием описаны, например, в И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, УО 97/37705 и УО 97/13537.
- 29 014353
Кроме того, подходят баллистические устройства для доставки порошков/частиц, в которых используется сжатый газ для ускорения прохождения вакцины в порошковой форме через внешние слои кожи в дерму. Кроме того, в классическом способе интрадермального введения манту могут быть использованы традиционные шприцы.
Другим подходящим способом введения является подкожный способ. Любое подходящее устройство может быть использовано для подкожной доставки, например, классическая игла. Предпочтительно используют действие безыгольного инжектора, как, например, опубликовано в АО 01/05453, АО 01/05452, АО 01/05451, АО 01/32243, АО 01/41840, АО 01/41839, АО 01/47585, АО 01/56637, АО 01/58512, АО 01/64269, АО 01/78810, АО 01/91835, АО 01/97884, АО 02/09796, АО 02/34317. Более предпочтительно, когда указанное устройство предварительно заполнено жидкой вакцинной композицией.
Альтернативно, вакцину вводят интраназально. Обычно вакцину вводят местно в носоглоточную область, предпочтительно без осуществления распыления в легкие. Желательно использовать устройство для интраназальной доставки, которое доставляет вакцинную композицию в носоглоточную область, без или по существу без ее проникновения в легкие.
Предпочтительными устройствами для интраназального введения вакцин по изобретению являются распылительные устройства. Подходящие имеющиеся в продаже назальные распылительные устройства включают Лссизргау™ (Вес!оп Эюкткоп). Небулайзеры продуцируют очень мелкий аэрозоль, который может легко вдыхаться в легкие, и, следовательно, он не достигнет эффективно слизистых оболочек носа. Следовательно, небулайзеры не являются предпочтительными.
Предпочтительными распылительными устройствами для интраназального применения являются устройства, эффективность которых не зависит от давления, прилагаемого пользователем. Эти устройства известны как устройства с пороговым давлением. Жидкость высвобождается из сопла только тогда, когда приложено пороговое давление. Эти устройства позволяют легче достичь получения аэрозоля с регулярным размером капелек. Устройства с пороговым давлением, подходящие для применения в настоящем изобретении, известны в данной области техники и описаны, например, в АО 91/13281 и ЕР 311863 В и ЕР 516636, которые включены в данное описание посредством ссылки. Такие устройства имеются в продаже от фирмы РГегйег СтЬН и также описаны в Воттег, В. РЬагтасеийса1 Тес1то1оду Еигоре, 8ер! 1999.
Предпочтительные интраназальные устройства продуцируют капельки (измеренные с использованием воды в качестве жидкой фазы) в диапазоне 1-200 мкм, предпочтительно 10-120 мкм. Ниже 10 мкм существует риск вдохнуть их, следовательно, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капелек менее 10 мкм. Капельки более 120 мкм не разбрызгиваются так же хорошо, как более мелкие капельки, поэтому желательно иметь не более чем приблизительно 5% капелек, превышающих 120 мкм.
Доставка двойной дозы представляет собой дополнительный предпочтительный признак системы интраназальной доставки для применения с вакцинами по изобретению. Устройства для двойного дозирования содержат две субдозы разовой вакцинной дозы, по одной субдозе для введения в каждую ноздрю. Обычно две субдозы находятся в одном отсеке, и конструкция устройства позволяет осуществлять эффективную доставку одной субдозы в данный момент времени. Альтернативно, для введения вакцины по изобретению может быть использовано монодозирующее устройство.
Альтернативно, в настоящее изобретение также включен способ эпидермальной или трансдермальной вакцинации.
В конкретном аспекте настоящего изобретения адъювантная иммуногенная композиция для первого введения может быть введена внутримышечно, а бустерная композиция, либо адъювантная, либо нет, может быть введена другим способом, например интрадермальным, подкожным или интраназальным. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция, содержащая конкретный антиген вируса гриппа или его антигенный препарат для первого введения, может содержать стандартное количество НА, составляющее 15 мкг на штамм вируса гриппа, а бустерная противогриппозная композиция может содержать низкую дозу НА, т.е. менее 15 мкг, и в зависимости от способа введения может быть введена в меньшем объеме.
Популяции для вакцинирования.
Целевой популяцией для вакцинирования может быть человек с ослабленным иммунитетом. Люди с ослабленным иммунитетом обычно обладают меньшей способностью отвечать на антиген, в частности на антиген вируса гриппа, по сравнению со здоровыми взрослыми.
Предпочтительно, когда целевой популяцией является популяция, не примированная против гриппа, либо являющаяся наивной (например, в отношении пандемического штамма), либо ранее не дававшая реакции на инфекцию или вакцинацию вирусом гриппа. Предпочтительно, когда целевой популяцией являются пожилые люди соответственно в возрасте 65 лет и старше, более молодые взрослые люди из группы высокого риска (т.е. в возрасте от 18 до 64 лет), как, например, люди, работающие в лечебнопрофилактических учреждениях, или молодые взрослые люди с таким фактором риска, как сердечнососудистое и легочное заболевание или диабет. Другой целевой популяцией являются все дети в возрасте 6 месяцев и старше, особенно дети в возрасте 6-23 месяцев, которые демонстрируют относительно высо
- 30 014353 кий коэффициент госпитализации, связанной с гриппом. Предпочтительно, когда целевой популяцией являются пожилые люди в возрасте старше 65 лет.
Режимы, дозирование и дополнительные критерии эффективности вакцинациию
Соответственно в большинстве случаев иммуногенные композиции по настоящему изобретению представляют собой стандартную инъекционную дозу 0,5 мл, и в случае противогриппозной композиции она содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма вируса гриппа, как измерено простой радиальной иммунодиффузией (8ΚΌ) (1.М. \ооб е1 а1., 1. Вю1. 81апб. 5 (1977), 237-247; ЛМ. \ооб е1 а1., 1 Вю1. 81апб. 9 (1981), 317-330). Соответственно объем вакцинной дозы будет составлять от 0,5 до 1 мл, в частности стандартный объем вакцинной дозы 0,5 или 0,7 мл. В случае противогриппозных вакцин небольшую корректировку объема дозы можно проводить стандартным образом в зависимости от концентрации НА в первоначальном нерасфасованном образце.
Соответственно указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу антигена НА, например любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 мкг НА на штамм вируса гриппа.
Предпочтительно, чтобы вакцинная доза по изобретению, в особенности низкая вакцинная доза, могла быть представлена в меньшем объеме, чем традиционные инъекционные сплит-£1ц-вакцины, который обычно составляет приблизительно 0,5, 0,7 или 1 мл на дозу. Дозы малого объема по изобретению составляют предпочтительно ниже 500 мкл, более предпочтительно ниже 300 мкл и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 200 мкл или меньше на дозу.
Таким образом, предпочтительная вакцинная доза малого объема, соответствующая одному аспекту изобретения, представляет собой дозу, содержащую низкую дозу антигена в малом объеме, например приблизительно 15 мкг НА, или приблизительно 7,5 мкг НА, или приблизительно 3,0 мкг НА (на штамм) в объеме приблизительно 200 мкл.
Лекарственное средство против гриппа по изобретению предпочтительно удовлетворяет конкретным международным критериям для вакцин.
Для определения эффективности противогриппозных вакцин приняты международные стандарты. Официальные критерии Европейского Союза (ЕС) для эффективной вакцины против гриппа приведены ниже в таблице. Теоретически, чтобы удовлетворять требованиям Европейского Союза, противогриппозная вакцина должна удовлетворять только одному из критериев, приведенных в этой таблице, для всех штаммом вируса гриппа, включенных в вакцину. Композиции по настоящему изобретению соответственно удовлетворяют по меньшей мере одному из таких критериев.
Однако на практике будет необходимо, чтобы все штаммы удовлетворяли по меньшей мере двум или всем трем критериям, в частности, что касается новой вакцины, такой как новая вакцина для доставки посредством другого способа. В некоторых случаях может быть достаточно двух критериев. Например, может быть приемлемо, чтобы двум из трех критериев удовлетворяли все штаммы, в то время как третьему критерию удовлетворяли несколько, но не все штаммы (например, два из трех штаммов). Требования для взрослого населения (18-60 лет) и пожилого населения (старше 60 лет) различны.
18-60 лет Старше 60 лет
Уровень сероконверсии* >40% > 30%
Фактор конверсии** >2,5 >2,0
Уровень защиты*** > 70% > 60%
* Уровень сероконверсии определяют как процент вакцинированных субъектов, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров ингибирования гемагглютинина (ΗΙ) после вакцинации для каждого вакцинного штамма.
** Для каждого вакцинного штамма фактор конверсии определяют как кратность увеличения сывороточных средних геометрических титров (СМТ) ΗΙ после вакцинации.
*** Уровень защиты определяют как процент вакцинированных с сывороточным ΗΙ-титром >1:40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма) и обычно принимают как показатель защиты.
В следующем аспекте согласно изобретению предложен способ создания вакцины против заболеваний, о которых известно, что их можно лечить посредством СЭ4+ Т-клеточной активации, включающий:
1) выбор антигена, содержащего СЭ4+ эпитопы; и
2) объединение указанного антигена с сапониновым адъювантом в форме липосомы, как определено в данном описании выше, где указанная вакцина после введения указанному млекопитающему способна индуцировать усиленный СЭ4 Т-клеточный ответ у указанного млекопитающего.
Содержание всех ссылок в настоящем изобретении, включая заявки на патент и выданные патенты, включено в данное описание во всей полноте посредством ссылки.
- 31 014353
Во избежание неясности, авторы изобретения подразумевают, что термины содержащие, содержат и содержит в данном описании возможно заменять в каждом случае соответственно на термины состоящий из, состоят из и состоит из.
Данное изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
В примере I описаны способы иммунологического считывания, используемые в исследованиях на мышах, хорьках и людях.
В примере II описано приготовление липосомного адъюванта ΜΡΕ/φ821.
В примере III показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на хорьках.
В примере IV показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на наивных и примированных С57ВЕ6 мышах.
В примере V показано сравнение адъювантной противогриппозной вакцины с 3Ό-ΜΡΕ в двух разных концентрациях на мышах.
В примере VI показано сравнение адъювантной противогриппозной вакцины с 3Ό-ΜΡΕ в двух разных концентрациях на пожилых людях.
В примере VII показана доклиническая оценка адъювантной вакцины ΗΡν на мышах.
В примере VIII показана доклиническая оценка адъювантных и безадъювантных иммуногенных композиций против цитомегаловируса.
В примере IX показана доклиническая оценка адъювантной вакцинной композиции на основе КТ8,8 с 3Ό-ΜΡΕ в двух разных концентрациях.
В примере X показана клиническая оценка адъювантной вакцины на основе КТ8,8 с 3Ό-ΜΡΕ в двух разных концентрациях.
Пример I. Способы иммунологического считывания.
I.!. Методы на мышах.
1.Е1. Тест на ингибирование гемагглютинации.
Методика тестирования.
Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (НЕ). Принцип Ш-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Инактивированные нагреванием образцы сыворотки предварительно обрабатывали каолином и КВС цыпленка для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:20, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 10.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли для Ш-титров после вакцинации, используя иМ8ТАТ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
критерий Шапиро-Уилка (8йар1го-А11к) для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп;
критерий Кохрейна (Сосйгап) с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
двусторонний дисперсионный анализ, выполненный на группах;
Н8Э-критерий Тьюки для множественных сравнений.
ЕЕ2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Эта методика позволяет осуществить количественное определение антиген-специфических Т-лимфоцитов на основе продуцирования ими цитокинов: эффекторные Т-клетки и/или эффекторные Т-клетки памяти продуцируют ΞΕΝ-γ и/или центральные Т-клетки памяти продуцируют Ш-2. На 7-е сутки после иммунизации собирают РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови).
Лимфоидные клетки повторно стимулируют ίη νίίΐΌ в присутствии ингибитора секреции (брефелдина). Эти клетки затем подвергают традиционной иммунофлуоресцентной процедуре с использованием флуоресцентных антител (к СЭ4, СЭ8, ΞΕΝ-γ и !Б-2). Результаты выражают как частоту встречаемости цитокин-позитивных клеток среди СЭ4/СЭ8 Т-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов Т-клеток осуществляли на РВМС через 7 суток после второй иммунизации. Осуществляли забор крови от мышей и объединяли в гепаринизированной среде КΡΜI (Ко§те11 Гагк Μетο^^а1 !п8111и1е)+АНН (добавки). Что касается крови, суспензии ЕВБ (лимфоциты периферической крови), разведенные КΡΜI+Αάά, наслаивали на градиент ^утрйο1уГе-Μатта1 согласно рекомендованному протоколу (центрифугирование 20 мин при 2500 об/мин и комнатной температуре). Мононуклеарные клетки с границы раздела фаз удаляли, промывали 2χ в КΡΜI+Αάά и РВМС-суспензии доводили до 2χ106 клеток/мл, используя КΡΜI с
- 32 014353
5% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8).
Антигенную стимуляцию ш νίΙΐΌ РВМС осуществляли в конечной концентрации 1х106 клеток/мл (пробирка для ЕАС8) с использованием трехвалентной расщепленной Ии-вакцины на микрогранулах (5 мкг НА/штамм) или цельного И (\У1ю1е И) (1 мкг НА/штамм) и затем инкубировали 2 ч при 37°С с добавлением анти-СО28 и анти-СЭ49б (1 мкг/мл в обоих случаях).
Добавление этих двух антител усиливало пролиферацию и продуцирование цитокинов под действием активированных Т- и ΝΚ-клеток и могло дать совместный стимулирующий сигнал для индуцирования СТЬ.
В дополнение к этому, РВМС также стимулировали в течение ночи с использованием ВМОС (1х105 клеток/мл), импульсно обработанных трехвалентной сплит-йи-вакциной (30 мкг НА/штамм) или \У1ю1е И (5 мкг НА/штамм), которые приготавливали посредством импульсной обработки ВМОС, расщепленной Ии-вакциной (Ии-сплит) (60 мкг/НА штамм) или трехвалентной Ии \У1ю1е И (10 мкг НА/штамм) в течение 6 ч при 37°С. После стадии повторной антигенной стимуляции РВМС инкубируют в течение ночи при 37°С в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) для ингибирования секреции цитокинов.
Окрашивание на ΙΡΝ-γ/ΙΕ-2/ί.Ό4/ί.Ό8 осуществляли следующим образом. Клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 1% ЕС8, содержащего 2% Ис-блокирующего реагента (1/50; 2.462). После 10 мин инкубации при 4°С добавляли 50 мкл смеси анти-СО4-РЕ (2/50) и анти-СЭ8 регСр (3/50) и инкубировали 30 мин при 4°С. После промывки в РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 1% ЕС8 клетки подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл Су!ойх-Су!орегт (набор от ВО (Веск!оп Оккшкоп)) и инкубировали 20 мин при 4°С. Клетки затем промывали, используя Регт \Уак11 (набор от ВО), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси анти-ШЫ^-АРС (аллофикоцианин) (1/50)+анти-1Ь-2-ИТС (флуоресцеинизотиоцианат) (1/50), разведенных в Регт \Уак11. После инкубации минимум 2 ч максимум в течение ночи при 4°С клетки промывали Регт \Уак11 и ресуспендировали в РВ8 с 1% ЕС8+1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием ЕАС8 (йиоге8сепсе-асйуа!еб се11 койег, клеточный сортер с активацией флуоресценцией). Живые клетки сортировали (Е8С/88С (прямое и угловое светорассеяние)) и сбор данных осуществляли приблизительно на 50000 событий (лимфоцитов) или 35000 событий на СЭ4+ Т-клетках. Проценты ΙΕΝ-γ+ или 1Ь-2+ рассчитывали на отсортированных популяциях СО4+ и СО8+.
Ι.2. Методы с использованием хорьков.
1.2.1. Тест на ингибирование гемагглютинации.
Методика тестирования.
Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ). Принцип ΗΙ-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Образцы сыворотки первоначально обрабатывали 25%-ным раствором нейраминидазы (КОЕ) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации, используя отверстия для прочтения. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли для ΗΙ-титров (41-е сутки до контрольного заражения), используя υΝΙ8ΤΛΤ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения в группах;
критерий Кохрейна с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
критерий взаимодействия одностороннего АNОУА (дисперсионного анализа);
ΗδΟ-критерий Тьюки для множественных сравнений.
Ι.2.2. Назальные смывы.
Назальные смывы получали путем введения 5 мл РВ8 в обе ноздри бодрствующим животным. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнеры для образцов на сухом льду.
- 33 014353
Титрование вирусов в назальных смывах.
Все назальные образцы сначала подвергали стерилизации фильтрованием через фильтры δρίη X (Сойаг) для удаления любого бактериального загрязнения. По 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных смывов переносили в титрационные микропланшеты, содержащие по 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл клеток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 5-7 суток. Через 6-7 суток инкубации культуральную среду осторожно удаляют, добавляют по 100 мкл 1/20 \8Т-1-содержащей среды и инкубируют в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового красителя, образующегося в результате восстановления \8Т-1 жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству находящихся в лунке жизнеспособных клеток по окончании анализа титрования вирусов и определяется количественно путем измерения поглощения в каждой лунке на соответствующей длине волны (450 нм). Начало отсчета определяют как среднее значение ΟΌ (оптическая плотность) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ΟΌ (0,3 ΟΌ соответствует ±3 8Феу (стандартное отклонение) ΟΌ для неинфицированных контрольных клеток). Положительный балл определяют, когда ΟΌ находится ниже начала отсчета и, наоборот, отрицательный балл определяют, когда ΟΌ находится выше начала отсчета. Титры вирусного шеддинга определяли согласно Кеед аид Миеиск и выражали в виде 1од ТС'Ю51. (доза заражения 50% культуры ткани)/мл.
Ι.3. Анализы оценки иммунного ответа у людей.
Ι.3.1. Анализ ингибирования гемаглютинации.
Иммунный ответ определяли путем измерения ΗΙ-антител, используя способ, описанный Центром ВОЗ по совместному изучению гриппа (\ΗΟ СоПаЬогаЧид СеШге Гог тПнеи/а), Центрами по контролю заболеваемости, Атланта, США (1991).
Измерение титров антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки с помощью стандартизированного и комплексно утвержденного микрометода с использованием 4 единиц ингибирования гемагглютинации (4 ШИ) соответствующих антигенов и 0,5%-ной суспензии куриных эритроцитов. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли тепловой обработкой и обработкой разрушающим рецепторы ферментом.
Полученные образцы сыворотки оценивали по уровням ΗΙ-антител. Начиная с исходного разведения 1:10, приготавливали серии разведений (в 2 раза) до конечного разведения включительно, составляющего 1:20480. За конечную точку титрования принимали наибольшее разведение, при котором наблюдали полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух повторах.
Ι.3.2. Анализ ингибирования нейраминидазы.
Анализ осуществляли в сенсибилизированных фетуином титрационных микропланшетах. Приготавливали серии 2-кратных разведений антисыворотки и смешивали со стандартизированным количеством вируса гриппа А Η3Ν2, Η1Ν1 или вируса гриппа В. Тест основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления концевой нейраминовой кислоты в-О-галактоза-Ы-ацетилгалактозамин становится доступным. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (ΗΚΡ) агглютинин из арахиса АгасЫк куродаеа, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связанного агглютинина может быть определено и количественно измерено в реакции с субстратом пероксидазы тетраметилбензидином (ТМВ). Наибольшее разведение антител, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50% указывали как ΝΙ-титр.
Ι.3.3. Анализ нейтрализующих антител.
Измерения нейтрализующих антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки. Нейтрализацию вируса содержащимися в сыворотке антителами определяли в микроанализе нейтрализации. В данном анализе использовали сыворотки без дополнительной обработки. Каждую сыворотку тестировали в трех повторах. Стандартизированное количество вируса смешивали с последовательными разведениями сыворотки и инкубировали для обеспечения связывания антител с вирусом. Далее к смеси вируса и антисыворотки добавляли клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток МОСК, и инкубировали при 33°С. По окончании периода инкубации репликацию вируса визуализировали, используя гемагглютинацию эритроцитов цыпленка. Титр сыворотки, соответствующий 50%-ной нейтрализации, рассчитывали по методу Кеед и Миеиск.
Ι.3.4. Клеточно-опосредованный иммунитет оценивали с использованием проточной цитометрии цитокинов (СЕС).
Антигенспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клетки периферической крови могут быть повторно стимулированы 1и νίΙΐΌ к продуцированию Ш-2, СО40Ь, ΤΝΕ-α и ΙΕΝ, если их инкубировать с их соответствующим антигеном. В результате количество антигенспецифических ί.Ό4 и СЭ8 Т-клеток можно подсчитать с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также продуцирования внутриклеточных цитокинов. В настоящем исследовании в качестве антигена для повторной стимуляции специфических к вирусу гриппа Т-клеток использовали антиген вакцинного вируса гриппа, а также пептиды конкретного белка вируса гриппа. Результаты вы
- 34 014353 ражали в виде частоты встречаемости цитокин-позитивных СР4 или СР8 Т-клеток в СР4 или СР8 Т-клеточной субпопуляции.
1.3.5. Статистические методы.
1.3.5.1. Первичные конечные точки.
Процент, интенсивность и связь с вакцинацией указанных местных и общих признаков и симптомов в течение 7 суток периода контрольного наблюдения (т.е. в день вакцинации и в течение 6 последующих суток) после вакцинации и в целом.
Процент, интенсивность и связь с вакцинацией непредусмотренных местных и общих признаков и симптомов в течение 21 суток периода контрольного наблюдения (т.е. в день вакцинации и в течение 20 последующих суток) после вакцинации и в целом.
Случаи серьезных неблагоприятных событий в течение всего исследования.
Ι.3.5.2. Вторичные конечные точки.
В отношении гуморального иммунного ответа наблюдаемые переменные:
на 0- и 21-е сутки: титры сывороточных ингибирующих гемагглютинацию (Н1) антител и ΝΙ-антител, тестируемые по отдельности против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (анти-НШ1-, анти-Н3№- и анти-В -антитела);
на 0- и 21-е сутки: титры нейтрализующих антител, тестируемых отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине;
вторичные переменные (с доверительными интервалами 95%):
средние геометрические титры (СМТ) сывороточных Н1-антител с доверительными интервалами 95% (ДИ 95%) до и после вакцинации;
уровни сероконверсии* с ДИ 95% на 21-е сутки;
факторы конверсии** с ДИ 95% на 21-е сутки;
уровни серопротекции*** с ДИ 95% на 21-е сутки;
СМТ сывороточных ΝΙ-антител (с доверительными интервалами 95%) для всех временных точек.
*Уровень сероконверсии, определенный как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных Н1-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма.
**Фактор конверсии, определенный как кратное увеличение сывороточных СМТ Н1 на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма.
***Уровень защиты, определенный как процент вакцинированных с сывороточным Н1-титром, равным 40, после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принимают в качестве показателя защиты.
В отношении клеточно-опосредованного иммунного (СМ1) ответа наблюдаемая переменная:
на 0- и 21-е сутки: частота встречаемости цитокин-позитивных СР4/СР8-клеток на 106 в разных тестах.
В каждом тесте количественно определяли ответ СР4/СР8 Т-клеток на пептидный антиген вируса гриппа (рГ) (точная природа и происхождение этих антигенов нуждается в представлении/объяснении);
антиген расщепленного вируса гриппа (кГ);
антиген цельного вируса гриппа (\\'Г).
Вторичные переменные:
клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (СР40Ь, 1Ь-2, ΙΕΝ-γ, ΊΝΕ-ο.); клетки, продуцирующие по меньшей мере СР40Ь и другой цитокин (1Ь-2, ΙΕΝ-α, ΊΝΕ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΕ-2 и другой цитокин (СР40Ь, ΙΕΝ-α, ΊΝΕ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΕΝ-γ и другой цитокин (ΙΕ-2, ΤNΕ-α, СР40Ь);
клетки, продуцирующие по меньшей мере Т№-а и другой цитокин (ΙΕ-2, СР40Ь, ΙΕΝ-γ).
Ι.3.5.3. Анализ иммуногенности.
Анализ иммуногенности осуществляли для всей группы вакцинированных. Для каждой подвергаемой обработке группы подсчитывали следующие параметры (с доверительными интервалами 95%):
средние геометрические титры (СМТ) Ш- и ΝΙ-антител на 0- и 21-е сутки;
средние геометрические титры (СМТ) нейтрализующих антител на 0- и 21-е сутки;
факторы конверсии на 21-е сутки;
уровни сероконверсии (8С) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных Ш-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками;
уровни защиты на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных с сывороточным Штитром, равным 1:40;
частота встречаемости СР4/СР8 Т-лимфоцитов, секретируемых в ответ, суммировалась (описа
- 35 014353 тельная статистика) для каждой вакцинированной группы, для каждой временной точки (0-, 21-е сутки) и для каждого антигена (пептид вируса гриппа (р£), расщепленный вирус гриппа (к£) и цельный вирус гриппа (\\Г));
описательная статистика индивидуального различия между ответами во временные точки после и до (РокРРге) для каждой вакцинированной группы и каждого антигена (р£, к£ и \\Г) в каждом из 5 разных тестов.
Для сравнения обнаруженных различий между 3 группами использовали непараметрический критерий (критерий Краскела-Уоллиса (КгиккаН-^аШк)) и статистическое значение р рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 разных тестов. Все критерии значимости были двусторонними. Значения р, меньшие или равные 0,05, считали статистически значимыми.
Пример II. Приготовление МРЬ/0821-содержащего липосомного адъюванта.
П.1. Приготовление жидкой суспензии МРЬ.
Партию жидкого МРЬ (как использовано во всем документе, это сокращенный вариант для 3П-МРЬ, т.е. 3-О-деацилированного монофосфориллипида А) приготавливают из лиофилизованного порошка 30-МРЬ. Жидкий МРЬ представляет собой стабильную концентрированную (приблизительно 1 мг/мл) водную дисперсию неочищенного вещества, которое готово к применению в вакцинной или адъювантной композиции. Схематическое представление способа приготовления приведено на фиг. 1.
Для максимального размера партии 12 г приготовление партии жидкого МРЬ осуществляют в стерильных стеклянных контейнерах. Процесс диспергирования МРЬ состоит из следующих стадий:
суспендировать порошок МРЬ в воде для инъекций;
провести дезагрегацию любых больших агрегатов путем нагревания (термической обработки); уменьшить размер частиц до диапазона от 100 до 200 нм посредством микрофлюидизации;
провести предварительную фильтрацию препарата на модуле для предварительной фильтрации 8айос1еап, 0,8/0,65 мкм;
провести стерилизацию фильтрованием препарата при комнатной температуре (модуль 8айоЬгап Р; 0,22 мкм).
Порошок МРЬ лиофилизуют посредством микрофлюидизации, получая стабильную коллоидную водную дисперсию (размер частиц МРЬ допускает стерильную фильтрацию). Лиофилизованный порошок МРЬ диспергируют в воде для инъекций с целью получения грубой суспензии 10 мг/мл. Затем суспензию подвергают термической обработке при перемешивании. После охлаждения до комнатной температуры начинают процесс микрофлюидизации для уменьшения размера частиц. Микрофлюидизацию осуществляют, используя установку МюгоПшбюк М110ЕН, посредством непрерывной циркуляции дисперсии через камеру для микрофлюидизационных взаимодействий, при определенном давлении для минимального количества проходов (количество циклов: пт1п). Продолжительность микрофлюидизации, представленную количеством циклов, рассчитывают на основе измеренной скорости потока и объема дисперсии. На данном оборудовании при указанном давлении полученная скорость потока может варьировать от одной камеры взаимодействия к другой и на протяжении срока службы конкретной камеры взаимодействия. В представленном примере используемая камера взаимодействия имеет тип Р20У МюгоПшбюк. Поскольку эффективность микрофлюидизации связана с парой давление-скорость потока, продолжительность процесса может меняться от одной партии к другой. Время, необходимое для 1 цикла, рассчитывают на основе скорости потока. Нужно иметь в виду, что скорость потока представляет собой скорость потока, измеренную с использованием воды для инъекций непосредственно перед введением МРЬ в установку. Один цикл определяют как время (в минутах), необходимое для одного прохождения суммарного объема МРЬ через установку. Время, необходимое для получения п циклов, рассчитывают следующим образом:
п х количество МРЬ для обработки (мл)/скорость потока (мл/мин).
Таким образом, в соответствии с этим подбирают количество циклов. Минимальное количество циклов выполнения (пт1п) описано для предпочтительных используемых оборудования и камер взаимодействия. Общее количество циклов работы определяют по результату измерения размеров частиц, выполненного после пт1п циклов. На основе литературных данных определяют предельный размер частиц (б[1т). Измерение осуществляют посредством методики фотонно-корреляционной спектроскопии (РС8) и б11т выражают в виде одномодального результата (2атегаде). Если получено значение ниже этого предела, то микрофлюидизация может быть остановлена после пт1п циклов. Выше этого предела микрофлюидизацию продолжают до тех пор, пока не будет получено удовлетворительное уменьшение размера, в течение максимум 50 следующих циклов.
Если фильтрацию не осуществляют непосредственно после микрофлюидизации, то диспергированный МРЬ хранят при температуре от 2 до 8°С, ожидая передачи на участок для фильтрации.
После микрофлюидизации дисперсию разбавляют водой для инъекций и подвергают стерилизации фильтрованием через фильтр 0,22 мкм в ламинарном потоке. Конечная концентрация МРЬ равна 1 мг/мл (0,80-1,20 мг/мл).
- 36 014353
ΙΙ.2. Приготовление МР^/^δ21-содержащего липосомного адъюванта.
Этот адъювант, называемый Αδ01, содержит 30-МРЬ и 0δ21 в блокированной холестерином форме, и его приготавливали, как описано в νθ 96/33739, которая включена в данное описание посредством ссылки. В частности, адъювант Αδ01 приготавливали, по существу, как в примере 1.1 из νθ 96/33739. Адъювант Αδ01В содержит липосомы, которые, в свою очередь, содержат диолеоилфосфатидилхолин (^θРС), холестерин и 30-МРЬ [в количестве 1000 мкг ^θРС, 250 мкг холестерина и 50 мкг 30-МРЬ; каждое значение приведено приблизительно на одну вакцинную дозу], Οδ21 [50 мкг/доза], фосфатный буфер с №1С1 и воду до объема 0,5 мл. Адъювант Αδ01Ε содержит те же ингредиенты, что и Αδ01В, но в более низкой концентрации в количестве 500 мкг ^θРС, 125 мкг холестерина, 25 мкг 30-МРЬ и 25 мкг Ρδ21, в фосфатном буфере с №1С1 и воде до объема 0,5 мл.
В процессе образования липосом, содержащих МРЬ, ^ΘРС (диолеилфосфатидилхолин), холестерин и МРЬ растворяют в этаноле. После выпаривания растворителя под вакуумом образуется липидная пленка. Добавляют забуференный фосфатом физиологический раствор (9 мМ Nа2НРθ4, 41 мМ КН2Рθ4, 100 мМ №1С1) при рН 6,1 и смесь подвергают предварительной гомогенизации, затем гомогенизации высокого давления при 15000 фунт-сила/кв.дюйм (103 МПа) (приблизительно 15-20 циклов). В результате этого получаются липосомы, которые подвергают стерилизации фильтрованием через мембрану 0,22 мкм на стерильном (класс 100) участке. Стерильный продукт затем распределяют по стерильным стеклянным контейнерам и хранят в холодной комнате (от 2 до 8°С).
Полученные таким образом липосомы содержат МРЬ внутри мембраны (воплощение МРЬ ш из νθ 96/33739).
Οδ21 добавляют в водный раствор до желаемой концентрации.
Пример ΙΙΙ. Доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на хорьках.
ΙΙΙ.1. Обоснование и задачи.
Грипп в модели хорьков близко имитирует грипп у людей, это касается как чувствительности к инфекции, так и клинического ответа.
Хорек весьма чувствителен к инфекции как вирусом гриппа А, так и В без предварительной адаптации вирусных штаммов. Следовательно, это дает превосходную модельную систему для исследований защиты, обеспечиваемой посредством вводимых противогриппозных вакцин.
В этом исследовании изучали эффективность различных трехвалентных сплит-вакцин, адъювантных или безадъювантных, в отношении облегчения симптомов заболевания (температура тела) и выделения вируса в составе назальных секретов хорьков, подвергшихся контрольному заражению гомологичными штаммами.
Задача этого эксперимента заключалась в том, чтобы продемонстрировать эффективность адъювантной противогриппозной вакцины по сравнению с обычной (безадъювантной) вакциной.
Определяли такие конечные точки:
1) первичную конечную точку: уменьшение выделения вируса в составе назальных смывов после гомологичного контрольного заражения;
2) второстепенные конечные точки: анализ гуморального ответа по Н1-титрам.
ΙΙΙ.2. План эксперимента.
Ш.2.1. Обработка/группа (табл. 1).
Самок хорьков (Мик1е1а рнЮгшк £иго) в возрасте 14-20 недель получали от МКАУ СопкиИапсу (НатркЫге, υΐ<). Хорьков примировали на 0-е сутки гетеросубтипическим штаммом Н1М А^Юск1ю1т/24/90 (4 1од ТСГО50/мл). На 21-е сутки хорькам посредством внутримышечной инъекции вводили полную человеческую дозу (НО) (500 мкг вакцинной дозы, 15 мкг НА/штамм) комбинации НШ1 А/№\\' Са1ебоша/20/99, №N2 А/Рапата/2007/99 и В^йапдбопд/7/97. Затем осуществляли контрольное заражение хорьков на 42-е сутки через интраназальный путь гетеросубтипическим штаммом №N2 АЖуотшд/3/2003 (4,5 1од ТСН),./мл).
Таблица 1
Труппа Антиген(ы) + дозировка Композиция + дозировка Примечания (режим/путь /заражение) Ιη/Ρο Другие обработки
1 Трехвалентная Простая Полная НО: 15 мкг НА/штамм в/м; 21-е сутки Ш Примирование Η1Ν1 (А/81оскПо1т/24 /90) на 0-е сутки
2 Трехвалентная с МР1-О521 в липосомах Полная НО. 15 мкг НА/штамм в/м; 21-е сутки Ш Примирование Η1Ν1 (А/51оскНо1т/24 /90) на 0-е сутки
хорьков/группа.
1п=индивидуально/Ро=пул.
- 37 014353
ΙΙΙ.2.2. Приготовление вакцинных композиций (табл. 2).
Композиция 1: трехвалентная простая (безадъювантная) расщепленная композиция.
10-кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция 2: трехвалентная противогриппозная расщепленная с МРГ^821 в липосомах.
10-кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. К композиции добавляют премикс так называемого ^^§21-ΜР^^η и затем перемешивают в течение минимум 15 мин. Премикс ^^821-ΜΡ^^η представляет собой смесь липосом (приготовленных из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), МРЬ (2 мг/мл)) и иммуностимулятора ^821. Премикс инкубируют в течение минимум 15 мин перед добавлением к трехвалентной сплит-смеси. Концентрация МРЬ и ^821 в конечной композиции составляет 50 мкг на 500 мкл. Композицию хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: в каждую композицию добавляют 10-кратный концентрированный РВ8 для достижения изотоничности и однократной концентрации в конечном объеме. Объем Н2О рассчитывают для достижения заданного объема.
Таблица 2
Конечный состав композиций 1 и 2 (композиции, приготовленные с использованием расщепленных штаммов (для 500 мкл))
Композиция Антиген Твин 80 Тритон Х-100 УЕЗ ЦОРС Холестерин МРЬ <2321
1 Η1Ν1: 15 мкг Η3Ν2: 15мкг В: 17,5 мкг 375 мкг 55 МКГ 50 мкг
2 Η1Ν1:15 мкг Η3Ν2:15 мкг В; 17,5 мкг 375 мкг 55 мкг 50 мкг 1 мг 250 мкг 50 мкг 50 мкг
ΙΙΙ.2.3. Результаты считывания (табл. 3).
Таблица 3
Результат считывания Временная точка Тип образца Способ анализа
Выделение вируса Начиная с 1-х суток и в течение 7 суток после контрольного заражения Назальные смывы Титрование
Анти-ΗΙантитела (ΗΙтитры) До, после примирования, после иммунизации, после контрольного заражения Образцы сыворотки Тест на ингибирование гемагглютинации
ΙΙΙ.3. Результаты.
Схематическое представление результатов приведено на фиг. 1 и 2.
ΙΙΙ.3.1. Гуморальный иммунитет (фиг. 1).
Активность в отношении ингибирования гемагглютинации против вакцинных штаммов Η3Ν2 (вакцинный штамм А/Рапата/2007/99 и штамм для контрольного заражения АЖуоттд/3/2003) детектировали в образцах сыворотки от 6 животных на группу на 17-е сутки после интраназального гетерологичного примирования, на 21-е сутки после иммунизации и на 13-е сутки после контрольного заражения.
Титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа определяли, используя тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ), как подробно представлено в примере 1.2.1. Сделаны следующие выводы:
для двух штаммов Α/Η3Ν2 и для всех групп после иммунизации наблюдали увеличение ΗΙ-титров во всех вакцинированных группах;
после иммунизации А/Рапата/2007/99 более высокие статистически значимые антиА/Рапата/2007/99 ΗΙ-титры наблюдали для трехвалентной сплит-вакцины с адъювантом ΜΡ^/^821 в липосомах по сравнению с трехвалентной простой сплит-вакциной;
после иммунизации А/Рапата/2007/99 только трехвалентная сплит-композиция с адъювантом МРЬ^821 в липосомах оказалась способной значительно увеличить ΗΙ-титры к гетерологичному штамму А/\Ууоттд/3/2003 (перекрестная реактивность перед контрольным заражением этим дрейфующим штаммом);
после контрольного заражения А/\Ууотшд/3/2003 существенное увеличение антиА/\Ууотшд/3/2003 ΗΙ-титров наблюдали как для трехвалентной обычной сплит-композиции, так и для трехвалентной сплит-композиции с адъювантом МРЬ^821 в липосомах;
- 38 014353 для штаммов Λ/Νο\ν Са1ебоша/20/99 и В/8йапдбопд/7/97 более высокие статистически значимые ΗΙ-титры наблюдали при использовании трехвалентной сплит-вакцины с адъювантом МРБ/Ц821 в липосомах по сравнению с трехвалентной простой сплит-вакциной.
ΙΙΙ.3.2. Вирусный шеддинг (фиг. 3).
Титрование вирусов в назальных смывах осуществляли на 6 животных на группу, как подробно описано в примере Ι.2.3. Назальные смывы получали путем введения 5 мл РВ8 в обе ноздри бодрствующим животным. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнеры для образцов на -80°С.
Через 2-е суток после контрольного заражения более низкое статистически значимое выделение вируса наблюдали при использовании трехвалентной сплит-композиции с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах по сравнению с трехвалентной простой сплит-композицией.
На 49-е сутки (через 7 суток после контрольного заражения) в назальных смывах вирус не обнаруживался.
ΙΙΙ.3.3. Вывод эксперимента.
Более высокие гуморальные ответы (ΗΙ-титры) наблюдали при использовании трехвалентной сплит-композиции с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах по сравнению с трехвалентной обычной сплиткомпозицией для всех 4 штаммов.
После иммунизации А/Рапата/2007/99 только трехвалентная сплит-композиция с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах оказалась способной значительно увеличить ΗΙ-титры к гетерологичному штамму А/\Ууоттд/3/2003 (перекрестная реактивность перед контрольным заражением этим штаммом).
Композиции с МРЬ/0821 в липосомах продемонстрировали дополнительную пользу в отношении эффективности защиты на хорьках (более низкое выделение вируса после гетерологичного контрольного заражения). По-видимому, перекрестная реакция, наблюдаемая после иммунизации трехвалентной сплит-композицией с МРЬ/0821 в липосомах, против дрейфующего штамма, использованного для контрольного заражения, коррелирует с защитным эффектом, наблюдаемым на этих хорьках.
Пример Ιν. Доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на примированных С57ВК6 мышах.
Ιν.1. План эксперимента и задача.
Для этого эксперимента использовали С57ВК6 мышей, примированых гетерологичными штаммами.
Задача состояла в сравнении гуморального (ΗΙ-титры) и СМ! ДС8, окрашивание внутриклеточных цитокинов) иммунных ответов, индуцированных имеющейся в продаже от С1ахо8тййК1те трехвалентной сплит-вакциной (Р1иапх™) по сравнению с трехвалентной субъединичной вакциной (вакцина АдпрраГ™ от СЫтоп), а также СМI ответа, полученного с использованием этих вакцин с адъювантом липосомами, содержащими только 3Ό-ΜΡΤ, только ЭО821 (0821 в липосомах, т.е. подвергнутый детоксикации 0821) или МРЬ/0821 в липосомах. С целью получения той же композиции, что и в вакцине Р1иат1х, в приведенном ниже примере композиции приготавливали, исходя из нерасфасованных расщепленных моноформ, а не из имеющихся в продаже дозировок Р1иапх. Приготовленные композиции обозначали как Р1иапх-подобные.
Ιν.Ι.1. Обработка/группа.
Самок С57ВК6 мышей в возрасте 6-8 недель получали от Иаг1ап Иог51. Нидерланды. Мышей примировали на 0-е сутки гетеросубтипическими штаммами (по 5 мкг НА-содержащих цельных инактивированных Η1Ν1 А/Веутд/262/95, Η3Ν2 А/Рапата/2007/99, В/Сйапдбопд/7/97). На 28-е сутки мышам вводили посредством внутримышечной инъекции 1,5 мкг НА-содержащей трехвалентной сплиткомпозиции (Λ/№\ν Са1ебоша/20/99, А/^уотшд/3/2003, В/Лапдки/10/2003), простой или адъювантной (см. группы в табл. 4-6).
Таблица 4
Гр. Антиген/Композиция Другая обработка
1 Трехвалентная сплит*/обычная (безадъювантная) = Яиапх-подобная Гетерологичное примирование на 0-сутки
2 Трехвалентная сплит* / липосомы, содержащие 30-ΜΡί. Гетерологичное примирование на О-сутки
3 Трехвалентная сплит* / 00521 Гетерологичное примирование на 0-сутки
4 Трехвалентная сплит* / МРЬ/0521 в липосомах Гетерологичное примирование на 0-сутки
5 Аддпра!™ (субъединичная) Гетерологичное примирование на 0-сутки
6 Аддпра!™ (субъединичная) / липосомы, содержащие 30-ΜΡί Гетерологичное примирование на 0-сутки
7 Аддпра!™ (субъединичная) / 00521 Гетерологичное примирование на 0-сутки
8 Аддпра(™ (субъединичная) / ΜΡί70821 в липосомах Гетерологичное примирование на 0-сутки
9 РВ8 Гетерологичное примирование на 0-сутки
* Р1иапх-подобная. 16 мышей/группа.
- 39 014353
1У.1.2. Приготовление вакцинных композиций.
Композиция для группы 1.
10-кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 2.
10-кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. Добавляют концентрированные липосомы, содержащие 3И-МРЬ (приготовленные из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), 3О-МРЬ (2 мг/мл)), для достижения конечной концентрации МРЬ, равной 50 мкг на дозу. Затем композицию перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 3.
10-кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. Затем добавляют премикс, приготовленный из липосом (приготовленных из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл)) и 0821, обозначаемого как ΌΟ821, для достижения концентрации 0821, равной 50 мкг на дозу. Этот премикс инкубируют по меньшей мере в течение 15 мин перед добавлением к смеси трехвалентной сплит-композиции. Композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 4.
10-кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. Затем добавляют смесь, приготовленную из липосом, содержащих 3О-МРЬ (приготовленных из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), 3О-МРЬ (2 мг/мл)), и 0821 для достижения концентраций 0821 и МРЬ, равных по 50 мкг на дозу. Эту смесь инкубируют по меньшей мере в течение 15 мин перед добавлением к смеси трехвалентной сплиткомпозиции. Так называемую трехвалентную сплит-МРЬ/0821 в липосомах композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: в каждую композицию для групп 1-4 добавляют 10-кратный концентрированный РВ8 для достижения изотоничности и однократной концентрации в конечном объеме. Объем Н2О рассчитывают для достижения заданного объема.
Композиция для группы 5.
Одну дозу Аддпра1™ смешивают с равным объемом РВ8тоб (модифицированный РВ8), рН 7,4. Композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 6.
Смешивают РВ8, рН 7,4, и одну дозу Аддпра1™. Затем при перемешивании добавляют липосомы, содержащие 3О-МРЬ (приготовленные из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), 3О-МРЬ (2 мг/мл)), для достижения 50 мкг МРЬ в дозе. Композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: РВ8 добавляют для достижения изотоничности в конечном объеме. Аддпра1 составляет половину объема композиции.
Композиция для группы 7.
Смешивают РВ8, рН 7,4, и одну дозу Аддпра1™. Затем при перемешивании добавляют премикс липосом (приготовленных из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл)) и 0821, обозначаемого как ΌΟ821, для достижения 50 мкг 0821 в дозе. Этот премикс инкубируют в течение по меньшей мере 15 мин перед добавлением. Композицию перемешивают минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: добавляют РВ8 для достижения изотоничности в конечном объеме. Аддпра1™ составляет половину объема композиции.
- 40 014353
Композиция для группы 8.
Смешивают РВ8, рН 7,4, и одну дозу Лддпра1™. Премикс так называемого 00821-МРЫп добавляют при перемешивании к композиции. Премикс 00821-МРип представляет собой смесь липосом (приготовленных из ИОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), МРЬ (2 мг/мл)) и иммуностимулятора 0821. Этот премикс инкубируют в течение по меньшей мере 15 мин перед добавлением к смеси Лддпра1/РВ8. Количество МРЬ и 0821 в композиции равно по 50 мкг каждого. Композицию перемешивают минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: добавляют РВ8 для достижения изотоничности в конечном объеме. Лддпра1 составляет половину объема композиции.
Таблица 5
Конечный состав композиций 1-4, приготовленных с использованием расщепленных штаммов (для 1 мл)
Г руппа Антиген Твин 80 Тритон Х-100 УЕЗ ООРС Холестерин МРБ 0321
1 Η1Ν1:15 мкг Η3Ν2:15 мкг В: 17,5 мкг 750 мкг 110 мкг 100 мкг
2 Аналогично 1 Анал, 1 110 мкг 100 мкг 1 мг 250 мкг 50 мкг
3 Аналогично 1 Анал. 1 110 мкг 100 мкг 1 мг 250 мкг - 50 мкг
4 Аналогично 1 Анал. 1 110 мкг 100 мкг 1 мг 250 мкг 50 мкг 50 мкг
Таблица 6
Конечный состав композиций 5-8, приготовленных с использованием вакцины Лддпра1™ (1 мл)
Группа Антиген ООРС Холестерин МРЬ 0521
5 1 доза вакцины Аддпра1 - - - -
6 Аналогично 5 1 мг 250 мкг 50 мкг -
7 Аналогично 5 1 мг 250 мкг - 50 мкг
8 Аналогично 5 1 мг 250 мкг 50 мкг 50 мкг
1У.1.3. Результаты считывания (табл. 7).
Таблица 7
Результат считывания Временная точка Тип образца Ιη/Ρο Способ анализа
Анти-Н1-антитела (Н(-титры) На 21-е сутки после иммунизации (на 49-е сутки) Образцы сыворотки Ιη Тест на ингибирование гемагглютинации
СО4, СО8, Ιί-2, ΙΡΝ-γ (РАС5) На 7-е сутки после иммунизации (на 35-е сутки) РВЬ Ро Окрашивание внутриклеточных цитокинов (1С5)
1п=индивидуально/Ро=пул.
1У.2. Результаты.
1У.2.1. Гуморальный ответ (Н1-титры через 21-е сутки после иммунизации).
Гуморальные ответы по Н1-титрам - фиг. 4.
Активность в отношении ингибирования гемагглютинации против трех вакцинных штаммов (Л/Ыете Са1ейоша/20/99, Л/Ауотшд/3/2003, В/Лапд§и/10/2003) детектировали в образцах сыворотки от 8 животных на группу на 21-е сутки после иммунизации.
По сравнению с мышами, иммунизированными РВ8, увеличение в Н1-титрах наблюдали после иммунизации всеми Иц-вакцинами-кандидатами, протестированными на всех трех штаммах (трехвалентная сплит-вакцина или трехвалентная субъединичная вакцина).
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые Н1-титры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентной сплит-вакциной с адъювантом только ΌΟ821 или МРЬ/0821 в липосомах, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной расщепленной Ии-вакциной, обычной или с адъювантом в виде липосом, содержащих только ЛЭ-МРО Ранжирование гуморального ответа было следующим:
(МРЬ/0821 в липосомах=только ΌΟ821)>(липосомы, содержащие только 3П-МРЬ=обычная вакцина)>РВ8.
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые Н1-титры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентной субъединичной вакциной со следующим адъювантом: только ΌΟ821, липосомы, содержащие только 3П-МРЬ, или МРЬ/0821 в липосомах, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной обычной сплит-вакциной. Ранжирование гуморального ответа было следующим:
(МРЬ/0821 в липосомах=только О0821=липосомьг содержащие только 3П-МРЬ)>обычная вакцина>РВ8.
Трехвалентная сплит-вакцина и трехвалентная субъединичная вакцина индуцировали похожие Н1-титры для композиций без адъюванта или с адъювантом: только ΌΟ821 или МРЬ/0821 в липосомах.
- 41 014353
Ш.2.2. Клеточно-опосредованный иммунный ответ (60'8 на 7-е сутки после иммунизации).
0Ό4 Т-клеточные ответы - фиг. 5.
РВМС от 8 мышей/группа собирали на 7-е сутки после иммунизации и тестировали в 4 пулах по 2 мыши/группа. Что касается общего количества специфических к цельному Р1и-вирусу СЭ4+ Т-клеток (экспрессирующих ГЕ-2, ΓΕΝ-γ и оба цитокина) какой бы ни была композиция, идентичные СО4+ Т-клеточные ответы наблюдали для трехвалентной сплит-вакцины и трехвалентной субъединичной вакцины;
более высокие СО4+ Т-клеточные ответы наблюдали для трехвалентных композиций (сплит- или субъединичных) с адъювантом ΜΡΕ/Ο821 в липосомах по сравнению с трехвалентными композициями (сплит- или субъединичными), обычными или с адъювантами липосомами, содержащими только 3ΌΜΡΕ или только ΌΟ821.
Что касается клеточного ответа, индуцированного трехвалентной композицией (сплит- или субъединичной), то имеет место синергический эффект липосом, содержащих 3Ό-ΜΡΕ+ΌΟ821, по сравнению только с ΌΟ821 или с липосомами, содержащими только 3Ό-ΜΡΕ.
Что касается клеточного ответа, то ранжирование было следующим:
(ΜΡΕ/Ο821 в липосомах)>(липосомы, содержащие только 3^-ΜΡ^=только О0821=обычная вакцина=ΡΒ8).
РУЗ. Краткое изложение результатов и выводы.
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые НЕтитры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентными композициями (сплит- или субъединичными) с адъювантом - только ΩΟ821 или ΜΡΕ/Ο821 в липосомах, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентными обычными композициями (сплит- или субъединичными). По-видимому, липосомы, содержащие только 3Ό-ΜΡΕ, индуцируют более высокий гуморальный ответ, когда они приготовлены с трехвалентной субъединичной композицией, а не с трехвалентной сплит-композицией.
Какой бы ни была композиция, аналогичные СЭ4+ Т-клеточные ответы были получены для трехвалентной сплит-вакцины (Р1иапх) и трехвалентной субъединичной (Адпрра1) вакцины.
Трехвалентные композиции (сплит- или субъединичные) с адъювантом ΜΡΕ/Ο821 в липосомах индуцировали более высокие СО4+ Т-клеточные ответы по сравнению с трехвалентными композициями (сплит- или субъединичными), простыми или с адъювантами - липосомами, содержащими только 3Ό-ΜΡΕ, или только 0821 в липосомах (ΌΟ821).
Пример У. Доклинические сравнительные исследования вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа с адъювантом 3Ό-ΜΡΕ/Ο821 в липосомной композиции (3Ό-ΜΡΕ в двух разных концентрациях).
У.1. Мыши.
У.1.1. План эксперимента и задача.
Для этого эксперимента использовали С57ВЕ6 мышей, примированных гетерологичными штаммами. Задача состояла в анализе гуморального (НЕтитры) и СΜI (Ю8, окрашивание внутриклеточных цитокинов) иммунных ответов, индуцированных имеющейся в продаже от С1ахо8тЕЕК1те трехвалентной сплит-вакциной (Р1иапх™), в безадъювантной форме и с адъювантом - липосомами, содержащими 3Ό-ΜΡΕ и ΌΟ821 в двух разных концентрациях.
У.1.2. Обработка/группа.
Самок С57ВЕ6 мышей в возрасте 8 недель получали от Наг1ап Нога!, Нидерланды. Мышей примировали интраназально на 0-е сутки гетеросубтипическими штаммами (цельными инактивированными А/Веушд/262/95, Н3Ш Α/Ρаηата/2007/99, В/8Напдбопд/7/97). На 28-е сутки мышам вводили посредством внутримышечной инъекции трехвалентную сплит-вакцину (Λ/№\ν Са1ебоша, А/Ууотшд, В/Лапдки), обычную или с адъювантом - иммуностимуляторами в двух разных концентрациях в липосомных композициях (см. группы в табл. 8).
- 42 014353
Таблица 8
Группа Антиген(ы) + дозировка Композиция + дозировка Другие обработки
1 Трехвалентная сплит ΡΙιι 1,5 мкг/штамм/50 мкл Простая Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально
2 Трехвалентная сплит Р!и 1,5 мкг/штамм/50 мкл Липосомы, содержащие 50 мкг 3ΕΙ-ΜΡΙ- на 0,5 мл дозы Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкп, интраназально
3 Трехвалентиая сплит Р1и 1,5 мкг/штамм/50 мкп 00821, 50 мкг на 0,5 мл дозы Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкп, интраназально
4 Трехвалентная сплит Пи 1,5 мкг/штамм/50 мкл МРЬ и <2821 по 25 мкг на 0,5 мл дозы Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально
5 Трехвалентная сплит Е1и 1,5 мкг/штамм/50 мкл МРЬ и 0821 по 50 мкг на 0,5 мл дозы Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкп, интраназально
6 РВ8 Отсутствует Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально
Композиции приготавливали. как в примере IV.
У.1.3. Результаты.
Гуморальные ответы по Ш-титрам - фиг. 24.
Активность в отношении ингибирования гемагглютинации против 3 вакцинных штаммов детектировали в образцах сыворотки от 9 животных на группу на 21-е сутки после иммунизации.
По сравнению с мышами. иммунизированными РВ8. увеличение в Ш-титрах наблюдали после иммунизации всеми Иц-вакцинами-кандидатами. протестированными на всех трех штаммах.
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые Ш-титры наблюдали у мышей. иммунизированных трехвалентной сплит-вакциной с адъювантом МРЬ и 0821 в любой концентрации. по сравнению с мышами. иммунизированными трехвалентной обычной сплит-Р1и-вакциной (максимальное значение р составляет 0.03).
Никакого статистически значимого различия между двумя группами липосомных адъювантов не наблюдали.
Клеточно-опосредованный иммунный ответ (4С8 на 7-е сутки после иммунизации) - фиг. 25
РВМС от 9 мышей/группа собирали на 7-е сутки после иммунизации и тестировали в трех пулах по 3 мыши/группа. Что касается специфических к цельному Р1и-вирусу СЭ4+ Т-клеток. экспрессирующих ^-2. Ш№-у или оба цитокина. то. как можно видеть из фиг. 25. наиболее высокие ШЛ-у -специфические СЭ4+ Т-клеточные ответы получали после иммунизации трехвалентной адъювантной сплит-вакциной с иммуностимуляторами в самой высокой концентрации. Однако ША- и ^-2+^^-/ Т-клеточные ответы для обеих концентраций иммуностимуляторов были аналогичны.
Пример VI. Клиническое испытание вакцины. содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа с адъювантом МРЬ/0821 в липосомной композиции (3О-МРЬ в двух разных концентрациях). на пожилом населении в возрасте старше 65 лет
УГ1. План исследования и задачи.
Фаза I/II открытого рандомизированного исследования с целью демонстрации не менее эффективного клеточно-опосредованного иммунного ответа противогриппозных вакцин-кандидатов от С1ахо8тйЬК1те Вю1одюа1к. содержащих различные адъюванты. вводимых пожилому населению (в возрасте 65 лет и старше). по сравнению с Р1иапх™ (известной в Бельгии как α-Κίχ™). вводимой взрослым людям (18-40 лет).
Оценивали четыре параллельные группы:
взрослых людей (в возрасте 18-40 лет) в одной контрольной группе. получающих одну дозу Р1иапх™ (группа Р1иапх);
200 пожилых субъектов (в возрасте 65 лет и старше). рандомизированных на три группы в соотношении 3:3:2:
одну группу из 75 субъектов. получающих противогриппозную вакцину с адъювантом А801В.
- 43 014353 одну группу из 75 субъектов, получающих противогриппозную вакцину с адъювантом А801Е, Р1и-группу сравнения из 50 субъектов, получающих одну дозу Р1иапх™.
Первостепенная задача.
Первостепенная задача заключается в том, чтобы продемонстрировать не меньшую эффективность через 21-е сутки после вакцинации противогриппозных адъювантных вакцин, вводимых пожилым субъектам (в возрасте 65 лет и старше), по сравнению с Р1иапх™, вводимой взрослым людям (в возрасте 18-40 лет), в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-лимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два разных цитокина (СО40Ь, 1Ь-2, ΊΝΤ-α, ΙΡΝ-γ).
Второстепенные задачи.
Второстепенные задачи:
1) оценить безопасность и реактогенность вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами-кандидатами в течение 21-х суток после внутримышечного введения вакцины пожилым субъектам (в возрасте 65 лет и старше). Для сравнения используют Р1иапх™;
2) оценить гуморальный иммунный ответ (антигемагглютининовый титр) через 21, 90 и 180 суток после вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами-кандидатами. Для сравнения используют Р1иапх™.
Третьестепенная задача.
Третьестепенная задача заключается в оценке клеточно-опосредованного иммунного ответа (продуцирование ΙΡΝ-γ, ΙΕ-2, СО40Б и ТКТ-а и ответ В-клеток памяти) через 21, 90 и 180 суток после вакцинации адъювантными противогриппозными вакцинами. Для сравнения используют Р1иапх™.
УЕ2. Вакцинная композиция и введение.
Использованы два разных адъюванта:
1) А801В - адъювант на основе липосом, содержащих 50 мкг МРЬ и 0821;
2) А801Е - разведенная в два раза композиция А801В.
Контроль: полная доза Р1иапх™ путем в/м введения.
Все вакцины предназначены для внутримышечного введения. Штаммы, используемые в пяти вакцинах, представляют собой штаммы, которые рекомендованы ВОЗ для северного полушария на сезон 2005-2006 гг., т.е. А/\е\\ Са1ебоша/20/99 (Н1М), А/\е\\ Уогк/7/2004 (№N2) и В/Лапдки/10/2003.
Три инактивированных расщепленных вирионных антигена (одновалентные формы), используемых при приготовлении адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата, являются в точности теми же, что и активные ингредиенты, используемые при приготовлении имеющейся в продаже Р1иапх™/а-К1х™, противогриппозной вакцины на основе инактивированного расщепленного вириона от С8К Вю. Они получены из вирусов, растущих на куриных эмбрионах. Штаммы вируса гриппа являются рекомендованными штаммами на сезон 2005-2006 гг., которые используются при приготовлении имеющейся в продаже Р1иапх™/а-К1х™ 2005-2006 гг.
Штаммы, используемые в трех вакцинах, представляют собой штаммы, которые рекомендованы ВОЗ для северного полушария на сезон 2005-2006 гг., т.е. А/№\г Са1ебоша/20/99 (ΉΙΝΙ) ГУИ-116, А/№\г Уогк/55/2004 (№N2) КУМС Χ-157, В/Лапдки/10/2003.
Подобно Р1иапх™/а-К1х™ адъювантная вакцина содержит 15 мкг гемагглютинина (НА) каждого штамма вируса гриппа на дозу.
УЕ2.1. Описание партий А801В-адъювантной вакцины.
А801В-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 2-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных трехвалентных инактивированных расщепленных вирионных антигенов, представленных в стеклянном флаконе, и из стеклянного флакона, содержащего адъювант А801В. В момент инъекции содержимое флакона для адъюванта извлекают и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца, использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 1 мл. Одна доза восстановленной А801Вадъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
А801В-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой вакцину, не содержащую консервант.
УЕ2.2. Состав А801В-адъювантной клинической партии.
Одна доза восстановленной А801В-адъювантной противогриппозной вакцины соответствует 1 мл. Ее состав приведен в табл. 9. Она содержит по 15 мкг НА каждого штамма вируса гриппа, как и в зарегистрированной вакцине Р1иапх™/а-К1х®.
- 44 014353
Таблица 9
Состав (компоненты вируса гриппа и адъюванта) восстановленной А801В-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата
Компонент Количество на дозу Аналитическая ссылка
АКТИВНЫЕ ИНГРЕДИЕНТЫ
Инактивированные расщепленные вирионы: - А/Ием/ Са1едоп1а/20/99 (Η1Ν1) ΐνη-116; - Α/Νβνν Уогк/55/2004 (Η3Ν2) ΝΥΜΟ Х-157; - В/Лапдзи/10/2003 15 мкг НА 15 мкг НА 15 мкг НА Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158
АДЪЮВАНТ А301В
- Липосомы; • диолеилфосфатидилхолин (ϋΟΡΟ; • холестерин; • МРЬ 1000 мкг 250 мкг 50 мкг Θ8ΚΒίο 3217 Евр. фармакопея 0993 С8К Βίο 2972
-0821 50 мкг Θ8Κ Βίο 3034
У1.2.3. Способ приготовления партии А801В-адъювантной вакцины.
Приготовление А801В-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий: приготовление партии трехвалентной конечной композиции (2-кратной концентрированной) без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов;
приготовление адъюванта А801В;
разведение А801В-адъювантной сплит-вирусной вакцины экстемпорально.
Приготовление партии трехвалентной конечной композиции без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов.
Объемы трех одновалентных партий берут на основании содержания НА, измеренного в каждой одновалентной партии перед приготовлением композиции, и целевого объема, равного 1320 мл. Концентрированный, забуференый фосфатом физиологический раствор (РО4, Nа/К2) (80 мкл/доза) и предварительно приготовленную смесь Твина 80, Тритона Х-100 и α-токоферилгидросукцината разводят в воде для инъекций. Затем три концентрированные моноформы (А/№\у Са1ебоша/20/99 1УК-116,
А/№\\' Уогк/55/2004 КУМС Х-157, В/Лапдки/10/2003) последовательно разводят в полученном растворе, представляющем собой забуференный фосфатом физиологический раствор/Твин 80-Тритон Х-100-а-токоферилгидросукцинат (рН 7,8, 81 мМ №1СТ 1,56 мМ КС1, 4,79 мМ №2НРО4, 0,87 мМ КН2РО4, 7,2 мМ КаН2РО4, 72,8 мМ К2НРО4, 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона Х-100 и 100 мкг/мл α-токоферилгидросукцината), для получения конечной концентрации по 30 мкг НА из штаммов А (Н1М и №N2) в 1 мл трехвалентной конечной формы (15 мкг НА/штамм А/500 мкл трехвалентной конечной формы) и 35 мкг НА из штамма В (17,5 мкг НА/штамм В/500 мкл трехвалентной конечной формы). Между добавлениями каждой одновалентной формы смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре. После добавления последней одновалентной формы и 15-30 мин перемешивания рН контролируют и подводят до 7,65±0,25 с помощью НС1 или №1ОН.
Трехвалентную конечную форму антигенов помещают в стерильных условиях в 3 мл стерильные стеклянные флаконы типа Ι (Европейская фармакопея). Каждый флакон имеет объем 600 мкл (500+100 мкл с учетом переполнения).
Приготовление партии адъюванта А801В и заполнение ею контейнера для адъюванта.
Адъювант А801В готовят путем смешивания двух компонентов: 0821 и липосом, содержащих МРЬ. Приготовление каждого из этих компонентов суммировано ниже. 0821 представляет собой тритерпеновый гликозид, получаемый из коры дерева Ош11а)а каропапа и выпускаемый Ацш1а Vο^сДеκДе^, МА, И8А (в настоящее время АпДДдешск).
0821 поступает в С8К Вю1одюа1к в виде лиофилизованного порошка. Приготовление 0821 на С8К Вю включает суспендирование порошка 0821 в воде для инъекций в концентрации приблизительно 5 мг/мл, подведение рН до рН 6,0±0,2 и стерилизацию фильтрованием. Жидкую партию 0821 хранят при -20°С в полиэтиленовых контейнерах.
МРЬ представляет собой 3-О-деацил-4'-монофосфориллипид А, полученный последовательным кислотным и основным гидролизами липополисахарида из штамма Ке595 8а1топе11а ттпекоДа. Он производится С8К Вю1одюа1к, НатПДоп, МопДапа. Нерасфасованная форма МРЬ поставляется в виде лиофилизованной соли триэтиламина (ТЕА).
В процессе приготовления липосом, содержащих МРЬ, ООРС (диолеилфосфатидилхолин), холестерин и МРЬ растворяют в этаноле. После выпаривания растворителя под вакуумом образуется липидная пленка. Добавляют забуференный фосфатом физиологический раствор (9 мМ №2НРО4, 41 мМ КН2РО4, 100 мМ №1С1) при рН 6,1 и смесь подвергают предварительной гомогенизации, затем гомогенизации вы
- 45 014353 сокого давления при 15000 фунт-сила/кв.дюйм (103 МПа) (± 20 циклов). В результате этого получаются липосомы, которые подвергают стерилизации фильтрованием через мембрану 0,22 мкм на стерильном (класс 100) участке. Стерильный продукт затем распределяют по стерильным стеклянным контейнерам и хранят в холодной комнате (от 2 до 8°С).
Партию стерильного препарата смешивают с партией стерильного раствора 0821. После 30 мин перемешивания эту смесь добавляют к смеси воды для инъекций и 500 мМ фосфата с 1 М №С1, рН 6,1, когда разводят в 10 раз. Количество 500 мМ фосфата с 1 М №С1, рН 6,1 при разведении в 10 раз рассчитывают таким образом, чтобы достичь изотоничности в конечном объеме. Контролируют рН. Затем адъювант подвергают стерилизации фильтрованием (0,22 мкм) и распределяют по флаконам в стерильных условиях. Флаконы хранят при температуре от 2 до 8°С. Разбавитель А801В представляет собой опалесцирующую бесцветную жидкость без инородных частиц, содержащуюся в стерильном стеклянном флаконе типа 1. Целевое наполнение для каждого флакона составляет 0,7 мл, чтобы удовлетворять данной спецификации (>0,5 мл).
Разведение А801В-адъювантной вирусной сплит-вакцины экстемпорально.
В момент инъекции содержимое флакона, содержащего адъювант, извлекают и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца, иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 1 мл. Одна доза восстановленной А801В-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
νΙ.2.4. Описание партий А801Е-адъювантной вакцины.
А801Е-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 3-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных трехвалентных инактивированных расщепленных вирионных антигенов, представленных в стеклянном флаконе, из стеклянного флакона, содержащего адъювант А801В, и из стеклянного флакона, содержащего разбавитель (раствор хлорида натрия для инъекций) для двукратного разведения А801В.
Для приготовления адъюванта А801Е содержимое флакона с разбавителем извлекают с помощью шприца и вводят во флакон, содержащий адъювант А801В, затем перемешивают. В момент инъекции 600 мкл адъюванта А801Е извлекают с помощью шприца из флакона с А801Е и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца и использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции. Одна доза восстановленной А801Е-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
А801Е-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой вакцину, не содержащую консервант.
νΙ.2.5. Состав А801Е-адъювантной клинической партии.
Одна доза восстановленной А801Е-адъювантной противогриппозной вакцины соответствует 1 мл. Ее состав приведен в табл. 10. Она содержит по 15 мкг НА каждого штамма вируса гриппа, как и в зарегистрированной вакцине Е1иапх™/а-К1х®.
Таблица 10
Состав (компоненты вируса гриппа и адъюванта) восстановленной А801Е-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата
Компонент Количество на дозу Аналитическая ссылка
АКТИВНЫЕ ИНГРЕДИЕНТЫ
Инактивированные расщепленные вирионы: - Α/Νβνν Са1ебоп1а/20/99 (Η1Ν1) ΐνΚ-116; - Α/Νβνν Уогк/55/2004 (Η3Ν2) ΝΥΜΟΧ-157; - В/Лапцзи/10/2003 15 мкг НА 15 мкг НА 15 мкг НА Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158
АДЪЮВАНТ А501В
- Липосомы: • диолеилфосфатидилхолин (ООРС); » холестерин; • МРЬ 500 мкг 125 мкг 25 мкг 68К Βίο 3217 Евр. фармакопея 0993 С8К Βίο 2972
-0321 25 мкг Θ8Κ Βίο 3034
νΙ.2.6. Способ приготовления патрии А801Е-адъювантной вакцины.
Приготовление А801В-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий: приготовление партии трехвалентной конечной композиции (2-кратной концентрированной) без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов;
приготовление адъюванта А801В;
- 46 014353 приготовление адъюванта А801Е с последующим разведением А801-Е-адъювантной вирусной сплит-вакцины экстемпорально.
Приготовление партии трехвалентной конечной композиции без адъюванта и заполнение ею контейнера для антигенов - дана ссылка на раздел У.2.3 для А801В-адъювантной противогриппозной вакцины.
Приготовление партии адъюванта А801В и заполнение ею контейнера для адъюванта - дана ссылка на раздел У.2.3 для А801В-адъювантной противогриппозной вакцины.
Разведение А801 Е-адъювантной вирусной сплит-вакцины экстемпорально - для приготовления адъюванта А801Е содержимое флакона с разбавителем извлекают с помощью шприца и вводят во флакон, содержащий адъювант А801В, затем перемешивают. В момент инъекции 600 мкл адъюванта А801Е извлекают с помощью шприца из флакона с А801Е и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца и использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции. Одна доза восстановленной А801Е-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
Четыре запланированных посещения для одного субъекта: на 0-, 21-, 90- и 180-е сутки с взятием образца крови в каждое посещение для оценки иммуногенности.
Режим вакцинации: одна инъекция противогриппозной вакцины на 0-е сутки.
УЕ2.7. Иммунологические анализы.
Анализ ингибирования гемагглютинации.
Иммунный ответ определяли путем измерения ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ) антител, используя способ, описанный Центром ВОЗ по совместному изучению гриппа (\ΗΟ Со11аЬогайид С’еЩге Гог тПнеи/а), Центрами по контролю заболеваемости, Атланта, США (1991). Измерение титров антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки с помощью стандартизированного и комплексно утвержденного микрометода с использованием 4 единиц ингибирования гемагглютинации (4 ΗΙυ) соответствующих антигенов и 0,5%-ной суспензии куриных эритроцитов. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли тепловой обработкой и обработкой разрушающим рецепторы ферментом. Полученные образцы сыворотки оценивали по уровням ΗΙ-антител. Начиная с исходного разведения 1:10, готовили серии разведений (в 2 раза) до конечного разведения включительно, составляющего 1:20480. За конечную точку титрования принимали наибольшее разведение, при котором наблюдали полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух повторах.
Проточная цитометрия цитокинов (СЕС), используемая для оценки частоты встречаемости цитокин(ы)-позитивных СЭ4 или СЭ8 Т-лимфоцитов.
Антиген-специфические СО4 и СЭ8 Т-клетки периферической крови могут быть повторно стимулированы 1и νίΙΐΌ к продуцированию СП40Ь, ΙΕ-2, ΤΝΕ-α и ΙΕΝ-γ, если их инкубировать с их соответствующим антигеном. В результате количество антигенспецифических СЭ4 и СЭ8 Т-клеток можно подсчитать с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также продуцирования внутриклеточных цитокинов. В настоящем исследовании в качестве антигенов для повторной стимуляции специфических к вирусу гриппа Т-клеток будут использованы антигены вакцинного вируса гриппа. Результаты будут выражены в виде частоты встречаемости цитокин(ы)-позитивных СЭ4 или СЭ8Т-клеток в СЭ4 или СЭ8 Т-клеточной субпопуляции.
ΕΕΙ8ΡΟΤ (фермент-опосредованный иммуноспот), используемый для оценки частоты встречаемости В-клеток памяти.
ΕΕΙδΡΟΤ-технология В-клеток позволяет осуществить количественное определение В-клеток памяти, специфических к данному антигену. В-клетки памяти могут быть индуцированы для дифференцировки в плазматические клетки 1и νίΙΐΌ после культивирования с СрС в течение 5 суток. Следовательно, образованные 1и νίΙΐΌ антигенспецифические плазматические клетки могут быть подсчитаны с использованием ΕΕΙδΡΟΤ-анализа В-клеток. Кратко, образованные 1и νίΙΐΌ плазматические клетки инкубируют в культуральных планшетах, сенсибилизированных антигеном. Антигенспецифические плазматические клетки будут образовывать пятна антитело/антиген, которые могут быть детектированы с использованием традиционной иммуноферментной методики. В настоящем исследовании вакцинные штаммы вируса гриппа или антитела против человеческого иммуноглобулина используются для сенсибилизации культуральных планшетов с целью подсчета клеток плазмы, секретирующих антитела против вируса гриппа или ΙβΟ, соответственно. Результаты выражают в виде частоты встречаемости антигенспецифических плазматических клеток на миллион ^С-продуцирующих плазматических клеток.
Исследовательская характеристика РВМС.
Может быть осуществлена экспрессия отобранных поверхностных/активационных маркеров (т.е. СЭ4, СЭ8, С^45КΟ, СЭ45 КА, СЭ28, СЭ27 или некоторых ΚΙΚ (ингибирующий рецептор киллерных клеток)).
- 47 014353
Функция индуцированных вакциной Т-лимфоцитов может быть определена путем анализа хомингмаркеров (йотшд тагкегб) (т.е. ССК7, СХСК5), цитокинов (Т-хелперных 1 или Т-хелперных 2 цитокинов) или путем анализа экспрессии факторов, ассоциированных с регуляторными функциями, таких как Еохр3 (ГогкЬеаб Ьох р3), СТЬА-4 (цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4) или ТСЕв (трансформирующий фактор роста β). В частности, СО8+СЭ28-популяция или популяции других регуляторных Т-клеток могут быть проанализированы в отношении гуморальных, В- и Т-клеточных ответов на вакцинный антиген.
У1.3. Результаты по иммуногенности.
У1.3.1. Конечные точки и результаты для СМ1.
Для того чтобы охарактеризовать СМ1 ответ после вакцинации адъювантными противогриппозными вакцинами, СЭ4 и СЭ8 Т-лимфоциты повторно стимулировали ш νίΐΐΌ, используя антигены трех вакцинных штаммов (используемые по отдельности или в виде пула). Специфические к вирусу гриппа ί.Ό4/ί.Ό8 Т-лимфоциты подсчитывали с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения продуцирования внутриклеточных цитокинов (1Ь-2, ΙΕΝ-γ, Т№-а и СО40Ь).
Оценка первичной конечной точки.
На 21-е сутки: СМ1 ответ у всех субъектов в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-лимфоцитов на 106 в тестах на продукцию по меньшей мере двух разных цитокинов (1Ь-2, ΙΕΝ-γ, Т№-а и (Ό40Ε).
Для оценки СМ1 ответа частоту встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 анализируют следующим образом.
При применении подхода по определению не меньшей эффективности, не меньшая эффективность по меньшей мере одной противогриппозной адъювантной вакцины-кандидата (вводимой пожилым людям в возрасте >65 лет - группа, обозначенная как Е1и е16ег1у или Е1и ЕБЭ) по сравнению с Е1иапх™ (вводимой взрослым людям в возрасте 18-40 лет - группа, обозначенная как Е1и Уоипд или Е1и УИС) достигалась, когда нижний предел (ИЬ) двустороннего 98,75% доверительного интервала средних геометрических (СМ) соотношений (между группой Е1иапх™ (18-40 лет) и группой противогриппозной адъювантной вакцины-кандидата (>65 лет) в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-клеток, продуцирующих по меньшей мере два цитокина на 21-е сутки) оказывался ниже 2,0.
тгт I С51ниагЯ’Офххые кЛ» про/нивоярипноуная адъювантная
98,75% ДИ для СМ-отношений через 21 сутки после вакцинации подсчитывали с использованием модели анализа ковариантности (ΑNСРУΑ) с логарифмически (по основанию 10) преобразованными частотами встречаемости. Модель ΑNСОУΑ включала вакцинированную группу в качестве фиксируемого эффекта (Е1иаг1х™ (18-40 лет) против противогриппозной адъювантной вакцины-кандидата (>65 лет)), а частоту встречаемости перед вакцинацией - в качестве параметра уравнения регрессии. СМ-отношения и их 98,75% ДИ получают в результате экспоненциального преобразования соответствующего группового сопоставления в рамках данной модели. 98,75% ДИ для скорректированного СМ (среднего геометрического) получают в результате экспоненциального преобразования 98,75% ДИ для среднего значения по группе, полученного методом наименьших квадратов в рамках упомянутой выше модели ΑNСОУΑ.
Результаты - инференциальный анализ (табл. 11).
Скорректированные СМ и СМ-отношения (со своими 98,75% ДИ) специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-лимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два цитокина (1Ь-2, ΙΕΝ-γ, ΊΝΕ-ο. и СО40Б) на 21-е сутки после повторной стимуляции ш У11го объединенными антигенами II, представлены в табл. 11. Для каждой адъювантной противогриппозной вакцины верхний предел двустороннего 98,75% ДИ для СМ-отношения оказывается значительно ниже клинического предела 2,0. Это демонстрирует не меньшую эффективность обеих адъювантных противогриппозных вакцин, вводимых пожилым субъектам, по сравнению с вакциной Е1иапх™, вводимой взрослым людям в возрасте 18-40 лет, в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 после вакцинации.
- 48 014353
Таблица 11 Скорректированное ΟΜ-отношение специфических к вирусу гриппа ί'.Ό4 Т-клеток, продуцирующих по меньшей мере два цитокина после повторной стимуляции объединенными вакцинными антигенами, 21-е сутки (АТР группа по иммуногенности)
СМ-отношение (Пи ΥΝΟ / А501В)
Ни ΥΝΘ А501В ДИ 98,8%
N СМ N СМ Значение иь
74 2844,8 71 2725,6 1,04 0,79 1,38
СМ-отношение (Ни ΥΝΟ / А501Е}
Ни ΥΝΟ А501Е ДИ 98,8%
N СМ N СМ Значение IX υι.
74 2879,6 74 2697,0 1,07 0,79 1,44
Скорректированное СΜ=среднее геометрическое для антитела, скорректированное относительно фонового титра;
Ν = количество субъектов с доступными результатами как до, так и после вакцинации;
ДИ 98,8% = доверительный интервал, равный 98,8% для скорректированного ΟΜ-отношения (модель ΑNСОVΑ: корректировка относительно фона);
ЬЬ = нижний предел;
ИЬ = верхний предел; источник данных табл. ША приложения.
Результаты - описательный анализ (фиг. 6).
Были получены следующие основные результаты:
1) перед вакцинацией СΜI ответ выше у молодых взрослых людей, чем у пожилых людей;
2) после вакцинации наблюдали усиливающий эффект противогриппозной вакцины на СΜI ответ у молодых взрослых людей (18-40 лет),
СΜI ответ у пожилых людей, получавших адъювантную противогриппозную вакцину, сопоставим с СΜI ответом у молодых взрослых людей.
Различие между состояниями до и после вакцинации в ответах ί'.Ό4 Т-лимфоцитов для всех исследованных цитокинов (^-2, СО40Ь, ΤΝΕ-α и ΞΕΝ-γ) было значительно более высоким при использовании адъювантных вакцин по сравнению с Е1иапх™ для всех тестов.
Анализ третьестепенной задачи.
С целью оценки третичной конечной точки частоту встречаемости специфических к вирусу гриппа СО4/СО8 Т-лимфоцитов и В-клеток памяти измеряли на 0-, 21-, 90- и 180-е сутки.
Частоту встречаемости специфических к вирусу гриппа цитокин-позитивных СЭ4/СЭ8 Т-лимфоцитов для каждого антигена суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинированной группы на 0- и 21-е сутки.
Для сравнения обнаруженного различия между двумя группами (противогриппозная адъювантная вакцина относительно Е1иапх™) использовали непараметрический критерий (критерий Уилкоксона (Айсохоп)), а статистическое значение р рассчитывают для каждого антигена в каждом отличном тесте.
Данные описательной статистики индивидуального различия между ответами на 21-е сутки/0-е сутки (после/до вакцинации) рассчитывают для каждой вакцинированной группы и каждого антигена в каждом отличном тесте.
Для сравнения индивидуального различия (после/до вакцинации) используют непараметрический критерий (критерий Уилкоксона), а статистическое значение р будет рассчитано для каждого антигена в каждом отличном тесте.
Значения р согласно критерию Уилкоксона, используемому для сравнения различия в частоте встречаемости специфических к вирусу гриппа ί'.Ό4 Т-лимфоцитов, представлены в табл. 12.
Результаты - оценка третичной конечной точки (табл. 12).
Основные выводы:
перед вакцинацией ΟΜ частота встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-клеток была аналогичной во всех группах пожилых субъектов, но самой большой была у взрослых людей в возрасте 18-40 лет;
у пожилых субъектов после вакцинации (21-е сутки) частота встречаемости специфических к вирусу гриппа ί'.Ό4 Т-лимфоцитов была значительно выше после вакцинации адъювантными вакцинами по сравнению с Е1иапх™;
после вакцинации частота встречаемости специфических к вирусу гриппа ί'.Ό4 Т-лимфоцитов оставалась более низкой у пожилых субъектов, вакцинированных А801В- или А801Е-адъювантными вакцинами, чем у взрослых людей в возрасте 18-40 лет, вакцинированных Е1иапх™;
ΟΜ частота встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ8 Т-клеток до вакцинации и после вакцинации по существу была аналогичной во всех группах.
- 49 014353
Таблица 12
Инференциальная статистика: значения р согласно критериям Краскела-Уоллиса для СЭ4 Т-клеток в каждую временную точку (АТР группа по иммуногенности)
Описание теста Значение р
А501В относит. Пи ΥΝΟ А801Е относит. Пи ΥΝ6
0-е сутки 21-е сутки 0-е сутки 21-е сутки
ВСЕ ПО ДВА <0,0001 0,0070 <0,0001 0,0025
СВ401. <0,0001 0,0056 <0,0001 0,0015
ΙΝΕγ <0,0001 0,0009 <0,0001 0,0006
11.2 <0,0001 0,0029 <0,0001 0,0021
ΤΝΕα <0,0001 0,0295 <0,0001 0,0378
А501В относит. Ни ЕЬО А801Е относит. Пи ΕίΌ
0-е сутки 21-е сутки 0-е сутки 21-е сутки
ВСЕ ПО ДВА 0,6165 0,0004 0,8744 0,0018
С040Й 0,7560 0,0005 0,9504 0,0021
ΙΝΡγ 0,9936 0,0008 0,9835 0,0029
11.2 0,6702 0,0011 0,7855 0,0023
ΤΝΡα 0,5450 0,0022 0,6688 0,0040
Результаты - оценка конечных точек в отношении гуморального иммунного ответа.
Наблюдаемые переменные.
На 0-, 21-, 90- и 180-е сутки: титры ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ) сывороточных антител, тестируемые по отдельности против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (аши-ШМ, анти-ЖЮ и анти-В антитела).
Отсекаемую величину для ΗΙ антитела против всех вакцинных антигенов определяли в лаборатории перед анализом (и она равна 1:10). Серонегативным субъектом является субъект, титр антител которого ниже отсекаемой величины. Серопозитивным субъектом является субъект, титр антител которого выше величины отсекаемой величины или равен ей. Титр антител ниже отсекаемой величины в данном анализе представлен произвольной выбранной величиной, равной половине отсекаемой величины.
На основании титров ΗΙ-антител рассчитывают следующие параметры:
средние геометрические титры (СМТ) ΗΙ антител на 0- и 21-е сутки, рассчитанные путем взятия антилогарифма от среднего для логарифмических преобразований титров;
факторы сероконверсии (8Е) на 21-е сутки, определенные как кратное увеличение сывороточных СМТ ΗΙ на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками;
уровни сероконверсии (8С) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных либо с ΗΙ-титром перед вакцинацией <1:10 и с титром после вакцинации >1:40 либо с титром перед вакцинацией >1:10 и минимум 4-кратным увеличением титра после вакцинации;
уровни серопротекции (8РК) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных с сывороточным ΗΙ-титром >1:40.
95% ДИ для СМ получают в пределах каждой группы по отдельности. Сначала получают 95% ДИ для среднего значения логарифмически преобразованного титра в предположении, что логарифмически преобразованные титры характеризуются нормальным распределением с неизвестной переменной. Затем получают 95% ДИ для СМ в результате экспоненциального преобразования 95% ДИ для среднего значения логарифмически преобразованного титра.
Отсутствующий серологический результат для измерения конкретного антитела не заменяют. Следовательно, субъект без серологического результата для данной временной точки не вносит вклад в анализ испытания в эту временную точку.
Результаты по гуморальному иммунному ответу (фиг. 7 и табл. 13).
СМТ ΗΙ-антител до вакцинации для всех 3 вакцинных штаммов находились в одном и том же диапазоне в 4 подвергаемых обработке группах. После вакцинации имеется очевидное воздействие 2 адъювантов, которые увеличивают гуморальный ответ у пожилых людей по сравнению со стандартной Е1иапх в той же популяции (фиг. 7 показана на линейной шкале, однако то же самое воздействие с очевидностью будет наблюдаться на логарифмической шкале).
6МТ:
значительно выше в отношении Η1Ν1 для А801Е;
значительно выше в отношении Η3Ν2 для обоих адъювантов;
никакого значительного различия не наблюдали в отношении СМТ после вакцинации между двумя группами субъектов, получавших адъювантные вакцины.
Через 21 сутки после вакцинации субъекты Ииапх (18-40 лет) имели более высокий ΗΙ-ответ для штаммов №\ν Са1ебоша и В/Лапдки.
Как показано в табл. 13, адъювантные противогриппозные вакцины превышали требования Европейских ведомств в отношении ежегодной регистрации вирионных сплит-противогриппозных вакцин [Ко1е йог Сшбапсе оп Иагтошхаиоп ой Кецшгетеп!к йог ИПпеп/а Уасстек йог !1е 1ттипо1одюа1
- 50 014353 аккекктеп! о£ аппиа1 к1га1п сйапдек (СРМР/В^Р/214/96)] для субъектов в возрасте старше 60 лет.
После вакцинации имелось статистическое различие в уровнях серопротекции Ш-антител между группой Ииапх (>65 лет) и Иц/А801В и Иц/А801Е для штамма А/НШ1/№\\' Са1ебоша.
Для каждого вакцинного штамма уровни серопротекции для 2 противогриппозных адъювантных вакцинных групп лежат в одном и том же диапазоне, что и для группы Ииапх (18-40 лет).
Для каждого вакцинного штамма уровни сероконверсии для 2 противогриппозных адъювантных вакцинных групп лежат в одном и том же диапазоне, что и для группы Ииапх (18-40 лет), за исключением штамма №\ν Са1ебоша.
Таблица 13
Уровни серопротекции, уровни сероконверсии и факторы конверсии на 21-е сутки (АТР группа по иммуногенности)
Штаммы Г руппа N Уровень серопротекции (Н1-титра40) % Уровень сероконверсии (В 4-кратное увеличение) [ДИ 95%] % Фактор конверсии [ДИ 95%] %
Стандарт ЕС (>60 лет) >50% >30% >2,0
Стандарт ЕС (<60 лет) >70% >40% >2,5
Α/Νβνν Сайота (Η1Ν1) Ни Упд 75 100 [95,20-100] 77,3 [66,2-86,2] 35,1 [21,9-56,4]
Ни Егс4ег1у 49 71,4 [56,74-83,42] 30,6 [18,3-45,4] 3,7 [2,4-5,7]
НиА801В 75 97,3 [90,70-99,68] 48,0 [36,5-59,81 4,5 [3,3-6,1]
НиА801Е 75 93,3 [85,12-97,80] 52,0 [40,2-63,7] 5,0 [3,6-6,9]
Α/Νβνν Уогк (Η3Ν2) Ни Упд 75 93,3 [85,12-97,80] 76,0 [64,7-85,1] 9,2 [7,1-11,8]
Ни ЕгбеНу 49 81,6 [67,98-91,24] 69,4 [54,6-81,7] 8,2 [5,7-11,8]
НиА801В 75 96,0 [88,75-99,17] 85,3 [75,3-92,4] 13,1 [10,0-17,1]
НиА801Е 75 93,3 [85,12-97,80] 80,0 [69,2-88,4] 14,5 [10,4-20,2]
В/Лапдзи (В) Ни Упд 75 100 [95,20-1001 81,3 [70,7-89,5] 13,9[10,1-19,1)
Ни Егс!ег1у 49 93,9 [83,13-98,72] 44,9 [30,7-59,8] 4,313,0-6,1]
НиА801В 75 100 [95,20-100] 65,3 [53,5-76,0] 5,2 [4,2-6,5]
НиА801Е 75 97,3 [90,70-99,68] 70,7 [59,0-80,6] 6,7 [5,1-8,9]
^общее количество субъектов;
%=процент субъектов с титром на 21-е сутки в пределах конкретного диапазона; ДИ=доверительный интервал.
У1.3.2. Выводы по иммуногенности.
Частота встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 перед вакцинацией была значительно ниже у пожилых взрослых по сравнению со взрослыми людьми в возрасте 18-40 лет. После вакцинации Ииапх™ послевакцинационная частота встречаемости (21-е сутки) оставалась ниже у пожилых взрослых людей по сравнению с молодыми людьми. В противоположность этому, не меньшая эффективность в терминах частоты встречаемости в отношении послевакцинационной частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 после вакцинации адъювантными вакцинами пожилых субъектов была продемонстрирована по сравнению с вакцинацией Ииапх™ взрослых людей в возрасте 18-40 лет.
Что касается гуморального иммунного ответа в терминах Ш-антительного ответа, то все противогриппозные вакцины удовлетворяли требованиям Европейских ведомств в отношении ежегодной регистрации инактивированных противогриппозных вакцин |№1е £ог Сшбапсе оп Наттошкайоп о£ Кецшгетеп!к £ог Iηί1иепζа Уасстек £ог 1йе 1ттипо1од1са1 аккекктеп! о£ аппиа1 к1гат сйапдек (СРМР/В^Р/214/96)]. У пожилых людей адъювантные вакцины опосредовали, по меньшей мере, тенденцию к более высокому гуморальному иммунному ответу на гемагглютинин вируса гриппа по сравнению с Ииапх™. Значительное различие между гуморальным иммунным ответом против каждого вакцинного штамма, опосредованным у пожилых субъектов адъювантными вакцинами по сравнению с Ииапх™, суммировано в табл. 14. По сравнению со взрослыми людьми в возрасте 18-40 лет, вакцинированными Ииапх™, пожилые субъекты, вакцинированные адъювантными вакцинами, продемонстрировали тенденцию к более высоким послевакцинационным СМТ и фактору сероконверсии на 21-е сутки против штамма Λ/№\ν Уогк.
Таблица 14
Штаммы вируса гриппа, при использовании которых наблюдали значительно более высокий гуморальный иммунный ответ (на основании не перекрывания 95% ДИ) у пожилых субъектов, вакцинированных разными адъювантными вакцинами, по сравнению с Ииапх в одной и той же популяции
Ров1 уасс СМТ Фактор сероконверсии Уровень серопротекции Уровень сероконверсии
НиА801В Α/Νβνν Уогк Α/Νβνν Са1е4оп!а
НиА801Е Α/Νβνν Са1е<1оп1а Α/Νβνν Уогк Α/Νβνν Са1е6оп1а
Рок1-уасс ОМТ= средний геометрический титр после вакцинации.
- 51 014353
У1.4. Выводы по реактогенности.
У1.4.1. Регистрация неблагоприятных событий (АЕ).
Регистрировали вызывающие беспокойства симптомы (см. табл. 15), имеющие место в течение 7 суток периода контрольного наблюдения (день вакцинации и 6 последующих суток). Кроме того, регистрировали непредусмотренные симптомы, имеющие место в течение 21 суток периода контрольного наблюдения (день вакцинации и 20+3 последующих суток). Интенсивность следующих далее АЕ оценивали, как описано в табл. 16
Таблица 15
Вызывающие беспокойства местные/общие неблагоприятные события
Вызывающие беспокойства местные АЕ Вызывающие беспокойства общие АЕ
Боль в месте инъекции Покраснение в месте инъекции Припухлость в месте инъекции Гематома Усталость Лихорадка Головная боль Мышечная боль Дрожь Суставная боль в руке с инъекцией Суставная боль в других местах
Внимание: температуру регистрировали по вечерам. При необходимости дополнительных измерений температуры в другое время суток регистрировали самое высокое значение температуры.
Таблица 16
Баллы по шкале интенсивности для вызывающих беспокойства симптомов у взрослых
Неблагоприятное событие Оценка интенсивности Параметр
Боль в месте инъекции 0 Отсутствует
1 при касании
2 при движении конечностью
3 препятствует обычной деятельности
Покраснение в месте инъекции Регистрируют самый большой размер на поверхности в мм
Припухлость в месте инъекции Регистрируют самый большой размер на поверхности в мм
Гематома в месте инъекции Регистрируют самый большой размер на поверхности в мм
Лихорадка* Регистрируют температуру в °С/°Е
Головная боль 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на обычную деятельность
3 препятствует обычной деятельности
Усталость 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на обычную деятельность
3 препятствует обычной деятельности
Суставная боль в месте инъекции и других местах 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на обычную деятельность
3 препятствует обычной деятельности
Мышечная боль 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на обычную деятельность
3 препятствует обычной деятельности
Дрожь 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на обычную деятельность
3 препятствует обычной деятельности
* Лихорадку определяют, если температура под мышкой больше или равна 37,5°С (99,5°Б).
Максимальную интенсивность местного покраснения/набухания в месте инъекции оценивают следующим образом:
означает 0 мм;
означает от >0 до <20 мм;
означает от >20 до <50 мм;
означает >50 мм.
Максимальную интенсивность лихорадки оценивают следующим образом:
- 52 014353 означает от >37,5 до <38,0°С;
означает от >38,0 до <39,0°С;
означает >39,0°С.
Исследователь осуществляет оценку интенсивности для всех других АЕ, т.е. непредусмотренных симптомов, включая 8АЕ (тяжелые АЕ), зафиксированных в ходе исследования. Оценка основана на клиническом опыте исследователя. Интенсивность каждого зафиксированного АЕ оценивают по одной из следующих категорий:
(слабое) соответствует АЕ, которое легко переносится субъектом, приводя к минимальному дискомфорту и не влияя на каждодневную деятельность;
(умеренное) соответствует АЕ, которое является достаточно дискомфортным в отношении влияния на обычную каждодневную деятельность;
(тяжелое) соответствует АЕ, которое препятствует обычной каждодневной деятельности (у взрослых/подростков такое АЕ может, например, создавать препятствие для присутствия на работе/в школе и вынуждать вводить корректирующую терапию).
УЕ4.2. Регистрация неблагоприятных событий (АЕ).
Обнаружено, что реактогенность, наблюдаемая у пожилых субъектов при использовании адъювантных вакцин, в отношении как местных, так и общих симптомов, оказалась более высокой, чем при использовании Р1иапх™. Не только возникновение, но и интенсивность симптомов увеличивались после вакцинации адъювантными вакцинами (фиг. 8). Более высокая тенденция к симптомам с оценкой 3 была показана в группе субъектов, получавших адъювантную вакцину с иммуностимуляторами (ΜΡΕ, 0821) в самой высокой концентрации по сравнению с группой субъектов, получавших адъювантную вакцину, в которой иммуностимуляторы присутствуют в более низкой концентрации. Однако во всех случаях симптомы быстро исчезали.
Пример УН. Доклиническая оценка адъювантных №У-вакцин на мышах.
В этом исследовании использовали двухвалентную антигенную композицию из папилломавируса человека (ΉΡΥ'), в которой комбинированы вирусоподобные частицы (ΥΕΡ), образованные из Б1 №У 16 и Б1 №У 18, в качестве антигена. Задача данного исследования заключалась в сравнении эффективности этого антигенного препарата после приготовления его композиции с А801В и разведенным 1/5 А801В, оцениваемым против существующего в настоящее время адъюванта, обнаруженного в вакцине против цервикального рака от С8К, А804 (ΜΡΕ на квасцах).
УП.1. Вакцинация.
Мышей (п=12 на группу) инъецировали на 0- и 28-е сутки вакцинными композициями, содержащими Б1 №У16/18 (по 2 или по 0,5 мкг каждого), взятый из способа Н1-5 80/80Б, и приготовленными с А804 (приготовленная композиция 50 мкг ΜΡΕ с квасцами) или А801В (50 мкг 0821 - 50 мкг ΜΡΕ в 0,5 мл) в 1/10 и 1/50 дозе для человека. Поскольку исследование проводили на мышах, 1/10 дозы для человека может считаться равной композиции А801В для человека, т.е. равной 50 мкг 0821 и 50 мкг ΜΡΕ в 0,5 мл, а 1/50 может считаться разведением 1/5 композиции А801В для человека, т.е. равной 10 мкг 0821 и 10 мкг ΜΡΕ в 0,5 мл. Образцы крови брали на 14- и 45-е сутки после введения дозы II (рой II) с целью анализа на суммарные специфические к анти-Е1 типу антитела в индивидуальных образцах сыворотки. Окрашивание внутриклеточных цитокинов измеряли на 7- и 14-е сутки рой II на РВМС, а на 45-е сутки рой II - с использованием клеток селезенки. Частоту встречаемости V^Ρ-специфических В-клеток памяти измеряли на 45-е сутки рой II с использованием клеток селезенки.
УП.2. ЕБКА анти-ЭТУ 16/18 Б1.
Количественное определение антител против Б1 из НΡУ-16 и №У-18 проводили посредством ЕБ^Л (твердофазный иммуноферментный анализ), используя Б1 из №У-16 и №У-18 для сенсибилизации. Антигены разводили до конечной концентрации 0,5 мкг/мл в ΡΒ8 и оставляли адсорбироваться в течение ночи при 4°С в лунках 96-луночных титрационных микропланшетов ^ах^о^ Iттиηо-р1аΐе, Νιπι^ Эептагк). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С с ΡΒ8, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) (насыщающий буфер). Образцы сыворотки, разведенные в буфере, содержащем ΡΒ8 + 0,1% Твина 20 + 1% В 8 А, добавляли в сенсибилизированные с помощью Б1 №У планшеты и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза смесью ΡΒ8 + 0,1% Твина 20, в каждую лунку добавляли биотинконъюгированные антимышиные Ц (Оако), разведенные 1/1000 в насыщающем буфере, и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. После стадии промывки добавляли конъюгат стрептавидинпероксидаза хрена (Оако, ИК), разведенный 1/3000 в насыщающем буфере, еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали, как указано выше, и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с раствором 0,04% о-фенилендиамина (81дта), 0,03% Н2О2 в 0,1%-ном Твине 20, 0,05 М цитратном буфере рН 4,5. Реакцию останавливали добавлением 2н. Н28О4 и планшеты считывали при 492/620 нм. ЕБКА-титры рассчитывали на основании ссылки с использованием 8ойΜаxΡ^о (используя четырехпараметрическое уравнение) и выражали в ЕЙ (единицы активности фермента)/мл.
УН.3. Окрашивание внутриклеточных цитокинов (Ю8).
- 53 014353
Внутриклеточное окрашивание цитокинов Т-клеток выполняли на РВЯ на 7- и 14-е сутки ροδί ΙΙ и на клетках селезенки на 45-е сутки после второй иммунизации. РВМС (1 пул/группа) или клетки селезенки (4 пула от 3 органов на группу) отбирали у мышей. Антигенную стимуляцию ίη νίΐτο клеток селезенки выполняли в конечной концентрации 5х106 клеток/мл (микропланшет с 96 лунками) с использованием УЬР 16 или 18 (5 мкг/мл) + СЭ496 СЭ28 антител (1 мкг/мл) и затем инкубировали 3 ч при 37°С. После стадии повторной стимуляции антигеном клетки инкубировали в течение ночи в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования секреции цитокинов. Окрашивание клеток выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл РВ8 с 1% РС8, содержащего 2% Рс-блокирующего реагента (1/50; 2.462). После 10 мин инкубации при 4°С добавляли 50 мкл смеси анти-СО4-АРС (1/50) и анти-СЭ8 регСр (1/50) и инкубировали 30 мин при 4°С. После промывки в РВ8 с 1% РС8 клетки подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл СуТоПхСу1орегт (набор от ВО) и инкубировали 20 мин при 4°С. Затем клетки промывали, используя Регт \Уа511 (набор от ВО), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси анти-ΙΡΝ-γ АРС (1/50)+анти-[Р-2 РГГС (1/50), разведенных в Регт ХУаЧт После 2 ч инкубации при 4°С клетки промывали Регт \Уа511 и ресуспендировали в РВ8 с 1% РС8+1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием РАС8. Живые клетки сортировали (Р8С/88С) и сбор данных осуществляли приблизительно на 20000 событий (лимфоцитов). Проценты ΙΡΝ-γ+ или ΙΒ-2+ рассчитывали на отсортированных популяциях СЭ4+ и СЭ8+.
νΙΙ.4. В-клеточная память.
Через 45 суток после второй иммунизации мышей умерщвляли; клетки селезенки отделяли с использованием градиента Рутрйоргер (Себаг1апе). Затем В-клетки ресуспендировали в среде ^ΜΙ 1640 (61Ьсо), содержащей добавки (1 мМ пируват натрия, не основные аминокислоты МЕМ (минимальной поддерживающей среды), Реп/81гер (пенициллин/стрептомицин), глутамин и β-2-меркаптоэтанол), 5% фетальной телячьей сыворотки, 50 единиц/мл гЫЬ-2 (рекомбинантный человеческий ΙΒ-2) (еВюкаепсе) и 3 мкг/мл Ср6. Клетки культивировали в течение 5 суток в конечной концентрации 106 клеток/мл в 5 мл, распределенных на 6 плоскодонных лунок. После стадии активации этанолом нитроцеллюлозные планшеты (Μи11^8с^ееη-IΡ; М1Шроге) сенсибилизировали 10 мкг/мл νΓ-Р или антимышиными Ι§ козы (6АМ; 8щта). разведенными 1/200 в РВ8. После стадии насыщения с использованием полной среды в планшеты, сенсибилизированные ^Р, добавляли по 100 мкл 2х106 клеток/мл, а в 6АМ-планшеты добавляли по 100 мкл 106 и 5х105 клеток/мл. После инкубации в течение 2 ч при 37°С планшеты хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали 4 раза РВ8 с 0,1% Твина 20, на планшеты наносили антимышиные биотинилированные (Вю1) Ι§, разведенные 1/200 в РВ8 с 1% В8А и 5% РС8 (буфер для разведения), и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После стадии промывки добавляли ΕχΙπινίάιπ ИЯР (81дта), разведенный 1/550 в буфере для разведения, еще на 1 ч при 37°С. Планшеты промывали, как указано выше, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с раствором АЕС (3-амино-9-этилкарбазол) (8щта). Реакцию останавливали путем осторожного ополаскивания планшетов под водопроводной водой. После сушки планшеты считывали с использованием К8400.
νΙΙ.5. Статистический анализ.
Средние значения для композиций сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ΑNΟVΑ 1). Анализ выполняли с логарифмически (по основанию 10) преобразованными данными с целью получения нормального распределения. Когда детектировали значительное различие между средними значениями процесса (значение р<0,05), выполняли парные сравнения среди средних значений с уровнем значимости 0,05 (критерий множественных сравнений Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (8шбеЩ-№\\'тап-Кеи15).
- 54 014353
УН.6. Результаты.
Мышей иммунизировали. как в УП.1. выше. Использовали следующие группы.
Группа Антиген Адъювант Разведение адъюванта
1 11 НРУ 16-18, 2 мкг А304 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МРЬ на 0,5 мл НО)
2 Μ НРУ 16-18, 0,5 мкг А804 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг МРЬ на 0,5 мл НО)
3 Ы НРУ 16-18, 2 мкг А804 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МРЬ на 0,5 мл НО)
4 1.1 НРУ 16-18, 0,5 мкг А804 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг МР1 на 0,5 мл НО)
5 1.1 НРУ 16-18, 2 мкг А801В 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МР1. на 0,5 мл НО)
6 И НРУ 16-18, 0,5 мкг А801В 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг МР1 на 0,5 мл НО)
7 и НРУ 16-18, 2 мкг А801В 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг ΜΡΣ на 0,5 мл Ηϋ)
8 Ы ΗΡν 16-18, 0,5 мкг А801В 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг ΜΡί на 0,5 мл НО)
УП.6.1. Гуморальные ответы.
Никакого значительного изменения в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз антигенов с обоими разбавлениями адъюванта как для титров антител против Ь1 НРУ-16. так и для титров антител против Ь1 НРУ-18 (фиг. 9).
Никакого значительного изменения в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз каждого адъюванта. какая бы ни была доза антигена. для титров антител против Ь1 НРУ-16. При изучении титров антител против Ь1 НРУ-18 наблюдали слабое увеличение титра для А801В (1/10 ΗΌ) по сравнению с А801В (1/50 ΗΌ). как измерено на 14-е сутки рок! II (2.5-кратное изменение дозы. значение р=0.0035). однако это изменение наблюдали только для 2 мкг антигена. а не для 0.5 мкг антигена (значение р=0.0867). Что касается 45-х суток рок! II. то никакого значительного изменения в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз каждого адъюванта. какая бы ни была доза антигена.
УН.6.2. Клеточные ответы.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Никакого влияния антигена на изменение в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз антигенов. какая бы ни была доза адъюванта для НРУ18-Ы. Похожие частоты встречаемости УЪР16-специфических СЭ4+ Т-клеток получали при использовании двух тестируемых доз антигенов с разными дозами адъювантов (фиг. 10).
Слабый эффект от дозировки (2.6-кратный. значение р=0.0009 для НРУ18-Ы; 2-кратный. значение р=0.0187 для НРУ16-Ы) наблюдали для А801В (1/10 ΗΌ) по сравнению с А801В (1/50 ΗΌ). однако это изменение наблюдали только для 2 мкг антигена. а не для 0.5 мкг антигена.
Специфические В-клетки памяти.
Никакого влияния антигена на изменение в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз антигенов. какая бы ни была доза адъюванта. для Ь1 из НРУ 16 или 18 (фиг. 11).
Никакого влияния адъюванта на изменение в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз адъювантов. какая бы ни была доза антигена. для Ь1 из НРУ 17 или 18.
Как можно видеть из приведенных выше результатов. в результате разведения 1/5 А801В получают композицию. которая обладает такой же эффективностью в иммуногенных композициях. что и сам А801В.
Пример VIII. Доклиническая оценка адъювантных вакцин 8.рпеитошае на мышах.
Пневмококковая вакцина. использованная в этом исследовании. представляла собой 11-валентную адъювантную пневмококковую конъюгатную вакцину (11 РСУ/А8). состоящую из смеси 11 пневмококковых полисахаридных конъюгатов с адъювантом либо А801В. либо А801Е. Конъюгаты содержат очищенные полисахариды из серотипов 1. 3. 4. 5. 6В. 7Ε. 9У. 14. 18С. 19Ε и 23Ε 8.рпеитошае. каждый из которых по отдельности конъюгирован с белком-носителем. либо дифтерийным анатоксином (ΌΤ). либо столбнячным анатоксином (ТТ). либо белком Ό (РЭ) из Н.тПиепхае. Вакцины представлены в виде высушенного сублимационной сушкой порошка. чтобы затем быть восстановленными с использованием одного из жидких адъювантов. 11РСУ/А8 приготавливают следующим образом.
- 55 014353
Для каждого полисахарида имеются конкретные условия активации и связывания. Они приведены в табл. 17. Отсортированный (по размерам частиц) полисахарид (за исключением Р8 5, 6В и 23Р) растворяли в 2 М №1С1 или в воде для инъекций (νΡΙ). Для всех серотипов была проведена оценка оптимальной концентрации полисахарида. Все серотипы, за исключением серотипа 18С, конъюгировали непосредственно с белком-носителем, как подробно представлено ниже.
К раствору полисахарида (Р8) добавляли СПАР (соотношение СПАР/Р8 0,75 мг/мг Р8) из концентрированного раствора, 100 мг/мл, в ацетонитриле или растворе ацетонитрил/вода (50%/50%). Через 1,5 мин добавляли 0,2М-0,3М №1ОН для получения конкретного рН для активации (рНа). Активацию полисахарида проводили при этом рН в течение 3 мин при 25°С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок Ό или ПТ) (количество зависит от начального соотношения Р8/белокноситель) и реакцию сочетания проводили при конкретном рН (рНс) в течение включительно до 2 ч (в зависимости от серотипа) при регулировании рН. Затем для погашения непрореагировавших цианатных сложноэфирных групп к смеси добавляли 2 М раствор глицина. рН подводили до рН гашения (рНч 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем в течение ночи при 2-8°С при непрерывном медленном перемешивании.
Подготовка 18С.
18С связывали с белком-носителем через линкер - дигидразид адипиновой кислоты (АЛН). Перед образованием конъюгата полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации.
Получение производных столбнячного анатоксина с использованием ЕЛАС.
Для получения производных столбнячного анатоксина очищенный ТТ разбавляли до 25 мг/мл в 0,2 М №1С1 и добавляли спейсер АЛН для достижения конечной концентрации, равной 0,2 М. После завершения растворения спейсера рН подводили до 6,2. Затем добавляли ЕЛАС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) для достижения конечной концентрации 0,02 М и смесь перемешивали в течение 1 ч при регулировании рН. Реакцию конденсации останавливали путем увеличения рН включительно до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С. Производные ТТ затем подвергали диафильтрации (мембрана с СО (си1-оГГ; начало отсчета) 10 кДа) с целью удаления оставшихся АЛН и реагента ЕЛАС.
Окончательно, нерасфасованную форму ТТАН подвергали стерильной фильтрации после стадии сочетания и хранили при -70°С.
Химическое сочетание ТТАН с Р8 18С.
Подробности параметров конъюгирования можно найти в табл. 1.
г подвергнутого микрофлюидизации Р8 разводили в определенной концентрации в воде и подводили до 2 М №1С1 путем добавления порошка №С1. Для достижения соответствующего соотношения СЛАР/Р8 добавляли раствор СЛАР (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси 50/50 об./об. ацетонитрил/νΡΊ).
рН повышали включительно до рН активации 9,0 путем добавления 0,3 М №1ОН и поддерживали при этом рН до добавления ТТАН.
Через 3 мин добавляли производные ТТЛН (20 мг/мл в 0,2 М №С1) для достижения соотношения ТТан/Р8, равного 2; производили регулировку рН до рН сочетания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч при регулировании рН.
Для гашения к смеси Р8/ТТан/СОАР добавляли 2 М раствор глицина.
рН подводили до рН гашения (рН 9,0).
Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем оставляли стоять в течение ночи при 28°С при непрерывном медленном перемешивании.
Очистка конъюгатов.
Конъюгаты очищали гель-фильтрацией, используя колонку для гель-фильтрации с 8еркасгу1 500НИ, уравновешенную 0,15 М №1С1 (8500НИ для 18С), для удаления небольших молекул (включая ЛМАР (4(^№диметиламино)пиридин или диметиламинопиридин) и неконъюгированных Р8 и белка. Вследствие разных молекулярных размеров реакционных компонентов конъюгаты Р8-РЛ, Р8-ТТ или Р8-ЛТ элюируются первыми, затем свободный Р8, после чего свободный РЛ или свободный ИТ и в конце ЛМАР и другие соли (№С1, глицин). Фракции, содержащие конъюгаты, детектировали по УФ280нм. Фракции объединяли в соответствии с их Кб, подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм) и хранили при 2-8°С. Определяли соотношения Р8/белок в препаратах конъюгатов.
- 56 014353
Таблица 17
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Рδ δ.рηеитоη^ае-белок Ό/ΤΤ/ΌΤ
Серотип 1 микрофлюид. 3 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 6В 7Е микрофлюид.
Конц. Р5 (мг/мл) 2,5 3,0 2,5 7,1 5,0 5,0
Растворение Р8 ννπ 2 М ЫаС1 ννπ ννπ 2 М ИаС! 2 М №С1
Конц. Ρϋ (мг/мл) 10,0 5,0 10,0 5,0 5,0 10,0
Исх. соотн. РЗ/Ρϋ (масс./масс.) 1,5/1 1/1 1,5/1 1/1 1,1/1 1,2/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,50 0,75 0,50 0,79 0,83 0,75
рНа=рНе=рНА 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,5
Серотип βν микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С микрофлюид. 19Р микрофлюид. 23Р
Конц. РЗ (мг/мл) 5,0 5,0 4,5 9,0 2,38
Растворение Ρδ 2 М №С1 2 М №С1 2 М ЫаС1 2 М №С! 2 М №С1
Конц, белканосителя (мг/мл) 10,0 10,0 20,0 (ТТ) 20,0 (ОТ) 5,0
Исх. соотн. белокноситель/РЗ (масс ./масс.) 1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8) 0,50 0,75 0,75 1,5 0,79
рНа=рНс“рНч 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Затем 11 конъюгатов смешивали друг с другом и перед иммунизацией конечный антигенный препарат смешивали с соответствующим адъювантом.
Группы из 40 самок старых мышей Ва1Ь/с в возрасте 4 недель иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 0,1 мкг 11-валентных Рδ конъюгатов, приготовленных либо с Αδ01В, либо с Αδ01Ε. В образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки, определяли дозу антител против Рδ 1дС с помощью ЕЬКА.
Как можно видеть из фиг. 12, наблюдали сопоставимые ответы для композиции с разведенным Αδ01Ε по сравнению с композицией с Αδ01В, за исключением Рδ 14, когда наблюдали более высокий ответ при использовании Αδ01В, и Рδ 19Р, когда наблюдали более высокий ответ при использовании Αδ01Ε.
- 57 014353
Пример IX. Доклиническая оценка адъювантных и безадъювантных цитомегаловирусных иммуногенных композиций.
ΙΧ.1. Морские свинки.
ΙΧ.1.1. Е11за анти-дВ.
Количественное определение анти-дВ антител выполняли посредством ЕЫ8Л с использованием дВ в качестве сенсибилизирующего антигена. Антиген разводили в конечной концентрации 4 мкг/мл в РВ8 и по 100 мкл инкубировали в течение ночи при 4°С в 96-луночных титрационных микропланшетах. Затем планшеты насыщали в течение 1 ч при 37°С с использованием по 200 мкл РВ8, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Добавляли двукратные серийные разведения сыворотки (по 100 мкл/лунка) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза РВ8 с 0,1% Твина 20, в каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгированных с пероксидазой хрена антител против 1дО морских свинок (Пако, ИК) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза РВ8 с 0,1% Твина 20 и 1 раз водой. Затем их инкубировали в течение 20 мин при 22°С после добавления по 100 мкл раствора о-фенилендиамина (81дта) в 0,1 М цитратном буфере рН 4,2. Эту реакцию останавливали добавлением по 100 мкл 2н. Н28О4 и считывали на 490/620 нм. ЕЫ8Л-титры определяли интерполяцией значений ОЭ от ссылочного образца с использованием 8ойМахРго. Титры выражали в Еи/мл.
Статистические анализы осуществляли для данных ЕЫ8Л на 14-е сутки роз! 2, используя υΝΙ8ΤΑΤ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
1) логарифмическое преобразование данных;
2) критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп;
3) критерий Кокрена с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
4) дисперсионный анализ для выбранных данных (односторонний);
5) Н8П-критерий Тьюки для множественных сравнений.
ΙΧ.1.2. Анализ нейтрализации.
Перед проведением анализа МВС5-клетки (10000 клеток/200 мкл среды МЕМ) распределяли по 96луночным микропланшетам и инкубировали в течение 3 суток при 37°С с СО2. Приготавливали двукратные разведения образцов инактивированной (30 мин при 56°С) сыворотки и инкубировали со 100 мкл раствора вируса (800 1Ри (единицы иммунопреципитации)/мл) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации инокулировали по 100 мкл смеси образцов сыворотки с вирусом в 96-луночные микропланшеты с монослоем МВС5. Планшеты центрифугировали при 2000 об./мин в течение 1 ч при 35°С. После инкубации в течение ночи при 37°С планшеты фиксировали 80%-ным раствором ацетона (20 мин при -20°С). Раствор ацетона удаляли и детектировали СМУ-позитивные клетки, используя специфические моноклональные антитела против немедленно раннего антигена в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали 3 раза РВ8, в каждую лунку добавляли биотин-конъюгированные антимышиные 1д и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После стадии промывки добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза и инкубировали в течение 10 мин с раствором истинно голубого (Тгие-Ь1ие). Путем исследования под микроскопом регистрировали сигналы специфической окраски. Титры нейтрализующих антител выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали 50%-ное уменьшение СМУ-позитивных клеток по сравнению с вирусным контролем (СМУ с клетками без сыворотки).
ΙΧ.1.3. Протоколы иммунизации.
Иммунизировали 4 группы. Каждая группа состояла из 8 самок морских свинок Наг!1еу Сг1:(ка) в возрасте 5-8 недель за исключением контрольной группы (группа 4), состоящей только из 4 субъектов. Субъектов иммунизировали в/м на 0- и 28-е сутки. Образцы сыворотки собирали через 28 суток после первой иммунизации и через 14 суток после второй иммунизации. ЕЫ8А осуществляли, как описано выше, на образцах сыворотки, взятых через 28 суток после первой иммунизации (28 роз! I) и через 14 суток после второй иммунизации (14 роз! II). Анализы нейтрализации осуществляли, как описано выше, для 14 роз! II. Рассматривались приведенные ниже группы.
Группа Антиген Адъювант
1 дВ №С1
2 дв А301В
3 дв А801Е
4 №С! №С!
Антиген приготавливали следующим образом. Вакцинный антиген экспрессируют в клетках китайского хомячка (СНО) в виде дВ** - укороченных химерных конструкций, содержащих пептидные последовательности от гликопротеина βϋ вируса простого герпеса 2 (Н8У2) на его Ν- и С-конце. дВ** укоро
- 58 014353 чен по своему С-концевому домену, содержащему мембраноякорную последовательность, и поэтому секретируется в культуральный супернатант.
Для первых трех групп по 15 мкг дВ**, приготовленного в 500 мкл либо РВ8, либо А801В или А801Е (полученных как в примере ΙΙ.2, выше), вводили внутримышечной инъекцией. Группе 4 вводили внутримышечно только РВ8.
ΙΧ.1.4. Результаты.
Как можно видеть на фиг. 13, значительно более высокие ЕЫ8А-титры анти-дВ наблюдали для двух адъювантных групп по сравнению с дВ без адъюванта (в 8 и 5,5 раз выше для дВ/А801В и дВ/А801Е соответственно). Титры антител для введения роЧ ΙΙ были совсем немного выше (в 1,5 раз) в группе дВ/А801В по сравнению с группой дВ/А801Е.
Множественное сравнение: Тьюки-ИБО.
Группа Кол-во случаев Среднее Без адъванта А801Е А301В
Без адъванта 8 4,7917 **
А301Е 8 5,5293 **
А301В 8 5,6942 **
Без адъюванта <А801Е=А801В.
Что касается титров нейтрализующих антител (фиг. 14), то никаких специфических нейтрализующих антител не наблюдали в группе дВ без адъюванта; в обеих адъювантных группах детектировали специфические нейтрализующие антитела;
в обеих адъювантных группах наблюдали похожие уровни нейтрализующих антител.
ΙΧ.2. Мыши.
ΙΧ.2.1. ЕЫ8А-титры анти-дВ.
Количественное определение анти-дВ антител осуществляли посредством ЕЫ8А с использованием дВ в качестве сенсибилизирующего антигена. Антиген разводили в конечной концентрации 1 мкг/мл в РВ8 и по 100 мкл инкубировали в течение ночи при 4°С в 96-луночных титрационных микропланшетах. Затем планшеты насыщали в течение 1 ч при 37°С с использованием по 200 мкл РВ8, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Добавляли двукратные серийные разведения сыворотки (по 100 мкл/лунка) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза РВ8 с 0,1% Твина 20, в каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза РВ8 с 0,1% Твина 20 и 1 раз водой. Затем их инкубировали в течение 10 мин при 22°С с 100 мкл 75%-ного тетраметилбензидина в 0,1 М цитратном буфере рН 5,8. Эту реакцию останавливали добавлением по 100 мкл 0,4н. Η28Ο4 и считывали на 450/620 нм. ЕЫ8А-титры определяли интерполяцией значений ΟΌ от ссылочного образца с использованием 8ойМахРго. Титры выражали в ЕИ/мл.
Статистические анализы осуществляли для данных Е11§а на 14-е сутки роЧ 2, используя ИМБТАТ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
1) логарифмическое преобразование данных;
2) критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп;
3) критерий Кокрена с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
4) дисперсионный анализ для выбранных данных (односторонний);
5) ЖО-критерий Тьюки для множественных сравнений.
ΙΧ.2.2. Анализ нейтрализации.
Перед проведением анализа МКС5-клетки (10000 клеток/200 мкл среды МЕМ) распределяли по 96-луночным микропланшетам и инкубировали в течение 3 суток при 37°С с 5% СО2. Приготавливали двукратные разведения (60 мкл) образцов инактивированной (30 мин при 56°С) сыворотки и инкубировали с 60 мкл раствора вируса (800 ГРИ/мл) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации инокулировали по 100 мкл смеси образцов сыворотки с вирусом в 96-луночные микропланшеты с монослоем МРС5. Планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 1 ч при 35°С. После инкубации в течение ночи при 37°С планшеты фиксировали 80%-ным раствором ацетона (20 мин при -20°С). Раствор ацетона удаляли и детектировали СΜV-позитивные клетки, используя специфические моноклональные антитела против немедленно раннего Ι (ГЕ-Ι) антигена в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали 3 раза РВ8, в каждую лунку добавляли биотин-конъюгированные антимышиные Ιβ и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После стадии промывки добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза и инкубировали в течение 10 мин с раствором истинно голубого. Путем исследования под микроскопом регистрировали сигналы специфической окраски. Титры нейтрализующих антител выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали 50%-ное уменьшение СΜV-позитивных клеток по сравнению с вирусным контролем (СΜV с
- 59 014353 клетками без сыворотки).
ΙΧ.2.3. Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Внутриклеточную детекцию Т-клеточных цитокинов осуществляли на РВЬ на 7- и 21-е сутки после второй иммунизации. Отбирали РВЬ у мышей и объединяли (1 пул на группу). Антигенную стимуляцию 1п уйго лимфоцитов (конечная концентрация 107 клеток/мл) выполняли либо с использованием пула пептида, охватывающего СМУ последовательность, либо белка дВ. Смесь РВЬ/антиген инкубировали 2 ч при 37°С. Затем клетки инкубировали в течение ночи в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования секреции цитокинов. Окрашивание клеток выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл РВ8 с 1% ЕС8, содержащего 2% Ес-блокирующего реагента. После 10 мин инкубации при 4°С добавляли 50 мкл смеси анти-СЭ4-РЕ и анти-СЭ8 регСр и инкубировали 30 мин при 4°С. После стадии промывки в РВ8 с 1% ЕС8 клеточные мембраны подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл СуЮПх-СуЮрегт (набор ВескЮп Оккткоп) и инкубировали 20 мин при 4°С. Затем клетки промывали, используя Регт \акй (набор от ВО), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси анти-ГЕ^гамма АРС+анти-1Ь-2 Е1ТС, разведенных в Регт\а511. После 2 ч инкубации при 4°С клетки ресуспендировали в РВ8 с 1% ЕС8+1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием ЕАС8. Живые клетки сортировали и сбор данных осуществляли приблизительно на ±20000 событий (лимфоцитов). Проценты ΙΕΝ-γ+ или 1Ь-2+ рассчитывали на отсортированных популяциях СЭ4+ и СЭ8+.
ΙΧ.2.4. Протоколы иммунизации.
Иммунизировали 4 группы. Каждая группа состояла из 12 самок С57ВЕ6 мышей в возрасте 4-10 недель.
Группа Антиген Адъювант
1 дв РВ8
2 дВ А801В
3 дВ А801Е
4 №С1 №С!
Антиген приготавливали следующим образом. Вакцинный антиген экспрессируют в клетках китайского хомячка (СНО) в виде дВ** - укороченных химерных конструкций, содержащих пептидные последовательности от гликопротеина дО вируса простого герпеса 2 (Ы8У2) на его Ν- и С-конце. дВ** укорочен по своему С-концевому домену, содержащему мембраноякорную последовательность, и поэтому секретируется в культуральный супернатант.
Каждую группу дВ** в концентрации 1,5 мкг/доза приготавливали в 625 мкл РВ8 либо адъюванта А801В или А801Е (полученных как в примере ΙΙ.2, выше, с концентрацией 100 мкл иммуностимуляторов в 1 мл или 50 мкл иммуностимуляторов в 1 мл соответственно). Внутримышечной инъекцией вводили 50 мкл (т.е. 1/10 дозы для человека в 0,5 мл). Одной контрольной группе мышей вводили инъекцией физиологический раствор. Инъекции выполняли на 0- и 28-е сутки. Образцы сыворотки отбирали на 14-е сутки после вторых инъекций для ЕЫ8А и анализов нейтрализации. Собирали РВЬ на 7- и 21-е сутки после вторых инъекций для Ιί.'8.
ΙΧ.2.5. Результаты.
ЕЬША-титры анти-дВ (фиг. 15).
В безадъювантной группе дВ наблюдали уровень анти-дВ антител от очень слабого до недетектируемого. Однако в обеих адъювантных группах, А801В и А801Е соответственно, наблюдали высокий антительный ответ (в 65 и 66 раз выше). Между группами А801В и А801Е статистической значимости не было.
Множественное сравнение: Тьюки-480
Группа Кол-во случаев Среднее Без адъванта А801Е А801В
Без адъванта 12 2,1132 АА
А301Е 12 3,9317 А*
А801В 12 3,9375 *+
Без адъюванта <А801Е=А801В.
Титры СМУ-нейтрализующих антител (фиг. 16).
Значительно более высокие анти-дВ нейтрализующие титры наблюдали для двух адъювантных групп по сравнению с группой дВ без адъюванта. Никакого значительного различия в титрах нейтрализующих антител не наблюдали между композициями с А801В и А801Е.
Клеточно-опосредованный иммунитет.
Вследствие очень низкого уровня ответа, наблюдаемого после повторной стимуляции образцов через 7 суток после второй инъекции (7 рок! ΙΙ), невозможно выявить никакого различия между группами и невозможно установить никакого убедительного ответа по стимуляции СЭ4 и СЭ8 (фиг. 17). Такие отве
- 60 014353 ты от низких до недетектируемых, вероятно, имели место из-за технической стороны (1есЬтса1 1ккие) в процессе приготовлений образцов. Тем не менее, можно было заметить ответы через 21 сутки после второй инъекции. Данные для СР4 (фиг. 18) показывают отсутствие различия после повторной стимуляции с использованием дВ (5 мкг/мл) или пептидов (2 мкг/мл или 4 мкг/мл). Похожий цитокиновый профиль показан для А801Е и А801В. Никакого убедительного ответа для стимуляции С'Р8 установить невозможно (фиг. 19).
Эти эксперименты показывают, что адъювант, имеющий низкие уровни иммуностимуляторов, является также иммунологически эффективным для другой антигенной композиции и в двух разных организмах, как и адъювант, имеющий более высокие уровни.
X. Доклиническая оценка адъювантной вакцины на основе КТ8,8.
Х.1. Приготовление.
Антигенная композиция КТ8,8 продуцируется в 8ассйаготусек сегеуЩае и состоит из двух белков, НТ8 и 8, которые являются внутриклеточными и самопроизвольно собираются в смешанные полимерные организованные в виде частиц структуры, для каждой из которых установлено, что она содержит в среднем 100 полипептидов. КТ8 представляет собой гибридную полипептидную цепь (51 кДа) из 424 аминокислот, состоящую из 189 аминокислот, происходящих из спорозоитного поверхностного антигена малярийного паразита штамма ΝΕ53 Р.ГаШрагит (С8Р антиген, аминокислоты 207-395), слитого с аминоконцевым участком белка 8 вируса гепатита В. 8 представляет собой полипептид с молекулярной массой 24 кДа (длиной 226 аминокислот), соответствующий поверхностному антигену вируса гепатипа В. Лиофилизованная гранула антигена содержит приблизительно 50 мкг (когда предполагается приготовление композиции в 0,5 мл с А801В) или 25 мкг (когда предполагается приготовление композиции в 0,5 мл с А801Е) антигена.
А801В и А801Е приготавливали путем смешивания различных компонентов (РВ8, липосом, МРЬ и 0821) в резервуаре и перемешивания в стерильных условиях. Затем продукт подвергали стерильной фильтрации перед внесением во флаконы или шприцы. Жидкий адъювант хранили при температуре от 2 до 8°С перед его использованием для повторного растворения лиофилизованной гранулы антигена.
Х.2. Эксперименты на мышах.
Проводили два эксперимента на мышах с целью сравнения специфических к КТ8,8 иммунных ответов, индуцированных под действием КТ8,8/А801В по сравнению с КТ8,8, приготовленным с А801Е. В каждом эксперименте С57ВЕ6 мышей (10 мышей/группа) иммунизировали внутримышечно 3 раза с промежутком в две недели с использованием 10, 5 или 2,5 мкг КТ8,8, приготовленного с адъювантами А801В или А801Е. В качестве контроля иммунизировали две группы либо только А801В, либо только А801Е. Для каждой мыши оценивали специфические к НВк и С8 антительные ответы по ЕЫ8А через 15 суток после третьей иммунизации. Средние геометрические титры антител и их доверительные интервалы 95% рассчитывали для всех мышей, получающих одну и ту же обработку в обоих экспериментах. Статистические анализы для оценки влияния адъюванта и влияний доз антигена выполняли на объединенных данных обоих экспериментов. СР4- и СР 8-специфические Т-клеточные ответы измеряли посредством проточной цитометрии через 7 суток после второй и третьей иммунизации на пулах клеток крови от 5 мышей на группу. Таким образом, для каждой группы в каждом эксперименте были получены два значения.
Гуморальный иммунный ответ.
Как показано на фиг. 20 и 21, оба адъюванта А801В и А801Е индуцируют сильные сравнимые антительные ответы против С8Р и НВк.
Трехсторонним АNΟVА для анти-С8Р СМТ продемонстрировано, что не было никаких значительных различий между А801В и А801Е для доз 5 или 2,5 мкг КТ8,8.
Для дозы 10 мкг было обнаружено, что адъювант А801В индуцирует более высокие анти-С8 титры, чем А801Е, а СМТ-отношение группа А801В/группа А801Е составляло 1,93 (ДИ 95%: 1,33-2,79; р=0,001).
Специфический клеточно-опосредованный иммунный ответ.
На фиг. 22 и 23 показаны уровни СР4 и СР8 Т-клеток, специфических к С8Р и НВк, которые экспрессируют Ш-2 и/или ΙΕΝ-γ.
СР4-ответ, специфический к С8Р, имеет тенденцию к более высоким значениям при использовании А801В по сравнению с А801Е после трех иммунизации, в то время как СР8 Т-клеточный ответ при использовании А801Е равен или превышает таковой для А801В.
СР4-ответ, специфический к НВк, имеет тенденцию к более высоким значениям при использовании А801В по сравнению с А801Е после трех иммунизаций, за исключением более низкой дозы КТ8,8, когда для двух адъювантов уровни СР4 Т-клеток сопоставимы. НВк-специфические СР8 Т-клеточные ответы, индуцированные КТ8,8, приготовленным с А801Е, равны или превышают ответы, индуцированные КТ8,8, приготовленным с А801В.
Полагают, что эти различия находятся в пределах ожидаемой вариабельности анализов в клеточной иммунологии.
Доклиническая оценка вакцины КТ8,8/А801Е на мышах показала приемлемый профиль безопасно
- 61 014353 сти, аналогичный таковому у КТ8,8/А801В.
XI. Клиническая оценка КТ8,8/А801Е.
Композиции приготавливают, как в примере X. В качестве эксципиента в лиофилизованной грануле антигена используют сахарозу. Как и в примере X, для повторного растворения лиофилизованного антигена используют жидкий адъювант. А801Е приготавливали, как описано в примере II.2, и хранили при температуре от 2 до 8°С, пока не потребуется повторное растворение.
Фазу II рандомизированного двойного слепого исследования безопасности и иммуногенности КТ8,8 с адъювантом А801Е в настоящее время проводят на детях в возрасте от 18 месяцев до 4 лет, проживающих в Габоне. Режимом вакцинации является 0-, 1-, 2-месячный режим вакцинации. Поставлены следующие задачи для КТ8,8/А801Е при введении в виде 3 доз внутримышечно в режиме 0, 1, 2 месяцев детям в возрасте от 18 месяцев до 4 лет, проживающим в эндемической для малярии области:
первоначальная оценить безопасность в течение 1 месяца после 3-го введения (роз! 3), продемонстрировать не меньшую эффективность вакцины на основе КТ8,8 с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде по анти-С8 антительному ответу через 1 месяц после 3-го введения;
вторичная оценить реактогенность в течение 1 месяца после 3-го введения, продемонстрировать не меньшую эффективность вакцины на основе КТ8,8 с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде по анти-НВз антительному ответу через 1 месяц после 3-го введения, дать описание серопротекции против гепатита В через 1 месяц включительно после 3-го введения, дать описание анти-СЭ-ответу через один месяц включительно после 3-го введения;
третичная безопасность в срок от 1 месяца после 3-го введения до 12 месяцев после 3-го введения, гуморальный иммунный ответ на антиген С8 через 12 месяцев после 3-го введения, гуморальный иммунный ответ на антиген НВз через 12 месяцев после 3-го введения; исследовательская оценить Т-клеточно-опосредованный иммунный ответ на антиген С8 через 12 месяцев включительно после 3-го введения, оценить иммунный ответ В-клеток памяти на антиген С8 через 12 месяцев включительно после 3-го введения, дать описание анти-СЭ-ответа через 1 месяц включительно после 3-го введения в соответствии с задокументированным при скрининге положением по ΗВV-иммунизации.
Было зарегистрировано 180 субъектов, 90 получали вакцину с зарегистрированным ранее патентованным адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде (в приведенных ниже таблицах обозначено как контроль), а 90 получали вакцину с адъювантом А801Е. Проводили скриниг здоровых мальчиков и девочек в возрасте от 18 месяцев до 4 лет. Вакцины вводили в/м способом в левую дельтовидную мышцу.
Возникновение и природа симптомов (вызывающих беспокойства и непредусмотренных), имеющих место в течение 7-суточного (сутки 0-6) послевакцинационного периода после каждого введения и в целом (общая когорта вакцинированных)
Любой симптом Общие симптомы Местные симптомы
ДИ 95% ДИ 95% ДИ 95%
Гр. N п % и. ш. N п % ЬЬ иь N η % 1.1. иь
Доза 1 Гр. 1 90 40 44,4 34,0 55,3 90 23 25,6 16,9 35,8 90 20 22,2 14,1 32,2
Гр. 2 90 47 52,2 41,4 62,9 90 26 28,9 19,8 39,4 90 32 35,6 25,7 46.3
Доза 2 Гр. 1 88 50 56,8 45,8 67,3 88 36 40,9 30,5 51,9 88 35 39,8 29,5 50,8
Гр. 2 87 53 60,9 49,9 71,2 87 39 44,8 34,1 55,9 87 34 39,1 28,8 50,1
ДозаЗ Гр.1 83 78 94,0 88,5 98,0 83 34 41,0 30,3 52,3 83 76 91,6 83,4 96,5
Гр. 2 85 82 96,5 90,0 99,3 85 50 58,8 47,6 69,4 85 79 92,9 85,3 97,4
Общее кол-во/ доза Гр.1 261 168 64,4 58,2 70,2 261 93 35,6 29,8 41,8 261 131 50,2 44,0 56,4
Гр . 2 262 182 69,5 63,5 75,0 262 115 43,9 37,8 50,1 262 145 55,3 49,1 61,5
Общее кол-ва/ субъект Гр.1 90 87 96,7 90,6 99,3 90 60 68,7 55,9 76,3 90 83 92,2 84,6 96,8
Гр. 2 90 85 94,4 87,5 98,3 90 70 77,8 67,8 85,9 90 84 93,3 86,1 97,5
Гр. 1 = КТ8,8/А801Е;
Гр. 2 = контроль;
ЬЬ = нижний предел;
ИЬ = верхний предел.
Для каждой дозы и параметра общее кол-во/субъект:
Ν = количество субъектов по меньшей мере с одной введенной дозой;
п/% = количество/процент субъектов, проявляющих, по меньшей мере, симптом одного типа после введения любой исследуемой вакцины.
Для параметра общее кол-во/доза:
- 62 014353
N = количество введенных доз;
п/% = количество/процент доз, проявляющих, по меньшей мере, симптом одного типа после введения любой исследуемой вакцины;
ДИ 95% = доверительный интервал строго 95%.
Эти данные демонстрируют, что при использовании вакцины на основе КТ8,8 с адъювантом А801Е получали приемлемые результаты по реактогенности в педиатрической популяции по сравнению с контрольной композицией.
Серологические ответы измеряли путем оценки антительных ответов на НВк и на С8Р-повторы (анти-К32ЬК). Образцы сыворотки для определения антител отбирали при скрининге на 60- и на 90-е сутки (при второй вакцинации и третьей вакцинации). Уровни антител против С8 измеряли в соответствии со стандартной методологией ЕЫ8А, используя планшет с адсорбированным на нем антигеном К32БК и стандартное антитело сравнения в качестве контроля, согласно 8ОР (стандартным рабочим процедурам), принятым в лаборатории. Результаты представлены в ЕИ/мл.
Антитело к поверхностному антигену вируса гепатита В измеряли, используя имеющийся в продаже набор для иммуноанализа ЕЫ8А (тест-набор АИ8АВ Е1А от АЬЬоДД) или эквивалентный ему в соответствии с инструкциями для данного анализа. Результаты представлены в т1и/мл.
Уровни серопозитивности и СМС для анти-С8 антител (общая группа вакцинированных)
> = 0,5 тШ/мл СМС
ДИ 95% ДИ 95%
Антитело Гр. График N η % ЬЬ иь зн-ие ЬЬ иь Μϊη Мах
Анти- Гр. 1 СКРИНИНГ 89 0 0,0 0,0 4,1 0,3 0,3 0,3 <0,5 <0,5
С8 ΡΙΙ(ϋ60) 78 78 100 95,4 100 81,9 64,9 103,2 4,6 568,6
ΡΙΙΙ(ϋ90) 75 75 100 95,2 100 215,6 178,8 259,9 14,3 1922,3
Гр. 2 СКРИНИНГ 90 1 1,1 0,0 6,0 0,3 0,2 0,3 <0,5 0,5
РП(ОбО) 78 78 100 95,4 100 56,9 45,7 70,9 3,6 2380,9
ΡΙΙΚΟ90) 80 80 100 95,5 100 164,8 134,1 202,6 6,3 2093,6
Гр. 1 = КТ8,8/А801Е;
Гр. 2 = контроль;
СМС = средняя геометрическая концентрация антител, рассчитанная для всех субъектов;
Р11 (Ό60) = после второй вакцинации (60-е сутки);
Р111 (Ό90) = после третьей вакцинации (90-е сутки);
N = количество субъектов с доступными результатами;
п/% = количество/процент субъектов с концентрацией в конкретном диапазоне;
ДИ 95% = доверительный интервал строго 95%;
ЬЬ=нижний предел;
ИЬ=верхний предел;
М1К/МАХ=минимум/максимум.
Уровни серопозитивности и СМС для анти-НВк антител (общая группа вакцинированных)
>= 10 т!Ы/мл ОМС
ДИ 95% ДИ 95%
Антитело Гр. График N η % ЬЬ иь зн-ие ЬЬ иь М1л Мах
АнтиНВ5 гр. 1 СКРИНИНГ 89 43 48,3 37,6 59,2 40,8 23,3 71,4 <10,0 46421,6
ΡΙΙ (660) 78 77 98,7 93,1 100 8936,4 4684,2 17048,7 <10,0 1615367
ΡΙΙΙ (ϋ90) 75 75 100 95,2 100 24527,7 15316,5 39278,5 21,1 169436
Гр. 2 СКРИНИНГ 90 37 41,1 30,8 52,0 20,0 12,8 31,0 <10,0 30796,4
ΡΙΙ (060) 78 77 98,7 93,1 100 3640,0 1963,1 6749,3 <10,0 1508114
ΡΙΙΙ 80 80 100 95,5 100 19485,0 13511,3 28099,9 178,6 1103974
Гр. 1 = КТ8,8/А801Е;
Гр. 2 = контроль;
СМС = средняя геометрическая концентрация антител, рассчитанная для всех субъектов; Р11 (Ό60) = после второй вакцинации (60-е сутки);
Р111 (Ό90) = после третьей вакцинации (90-е сутки);
N = количество субъектов с доступными результатами;
п/% = количество/процент субъектов с концентрацией в конкретном диапазоне;
ДИ 95% = доверительный интервал строго 95%;
ЬЬ=нижний предел;
ИЬ=верхний предел;
МШ/МАХ=минимум/максимум.
- 63 014353
Эти данные демонстрируют, что при использовании вакцинной композиции на основе КТ8,8 с адъювантом А801Е получали приемлемые гуморальные иммунные ответы в педиатрической популяции по сравнению с зарегистрированным контролем.
Пример ΧΙΙ. Доклиническая оценка вируса ветряной оспы с А801В по сравнению с А801Е.
В состав вакцины-кандидата входит укороченный оболочечный белок, дЕ, У2У, продуцируемый в клетках СНО.
Для этого исследования С57ВЕ6 мышей (и=48) примировали (вакциной) Уап1пх (~4 1од рГи (бляшкообразующая единица)/доза) в количестве одной дозы для человека (ΗΌ), вводимой подкожно. Через 5 недель после примирования Уап1пх мышей подразделяли на 5 групп по 12 мышей и вводили внутримышечной инъекцией (в район большеберцовой кости) на 0- и 28-е сутки по 5 мкг только дЕ, по 5 мкг дЕ+А801Е* (1/10 ΗΌ) или по 5 мкг дЕ+А801В (1/10 ΗΌ). Контрольной группе мышей (только примированные) вводили инъекцией физиологический раствор (0,9%-ный №1С1). Иммунные ответы оценивали через 14 и/или 30 суток после второй вакцинации. Оценивали уровни общих дЕ-специфических антител и частоту встречаемости цитокин-продуцирующих (ΙΕ-2/ΙΕΝ-γ) СЭ4 и СЭ8 Т-клеток.
дЕ-специфические антительные ответы.
Проводили ЕЬЕЗА для детекции и количественного определения дЕ-специфических антител в образцах сыворотки мышей, используя белок дЕ в качестве сенсибилизирующего антигена. ЕЫ8А-титры определяли в виде обратной величины разведения сыворотки, которое дает величину поглощения (оптической плотности), равную 50% от максимальной величины поглощения. ЕЫ8А-титры рассчитывали, используя регрессионный анализ.
Данные демонстрируют, что дЕ/А801Е и дЕ/А801В индуцируют похожие уровни дЕ-специфических антител (значения р>0,05). Обе композиции индуцировали значительно более высокие ответы по сравнению только с одним антигеном дЕ (в 10-13 раз, значения р<0,05) как через 14, так и через 30 суток рок! ΙΙ (фиг. 26).
Группа Через 14 суток роз! II ДИ 95% Через 30 суток роз! II ДИ 95%
емт (Еи/мл) IX Ш. 6МТ (ЕО/мл) ЬЬ (Л.
дЕ 12067 5960 24433 3832 911 16115
дЕ/А801Е 125934 95504 166059 50439 38071 66825
дЕ/А801В 131728 88112 196934 47589 36158 62635
Уап1пх 34 11 105 33 10 102
цЕ-специФические СЭ4 и СО8-ответы.
Продуцирование цитокинов оценивали по СЭ4 и СЭ8 Т-клеткам, используя методику окрашивания внутриклеточных цитокинов. Выделяли клетки селезенки из каждой группы, состоящей из 12 мышей, через 30 суток рок! ΙΙ и объединяли в 4 группы по 3 селезенки. Клетки селезенки (1х 106) инкубировали в течение 2 ч в присутствии пептидов дЕ (63 пептида), охватывающих весь белок дЕ (пептиды по 20 аминокислот/перекрывание 10 аминокислот), и затем инкубировали в течение ночи в присутствии брефелдина. После этого клетки окрашивали флуоресцентными тАЬ (моноклональными антителами), специфическими к СО4/СЭ8 клеточной поверхности, и затем подвергали пермеабилизации в отношении внутриклеточных цитокинов ΙΕ-2 и ΙΕΝ-γ.
Как показано на фиг. 26, несмотря на то, что похожие цитокиновые профили (ΙΕ-2/ΙΕΝ-γ) были индуцированы при использовании композиций как дЕ/А801В, так и дЕ/А801Е, композиция с А801В индуцировала более высокую величину как СЭ4, так и СЭ8 цитокин-продуцирующих клеток (в 2 раза, р>0,05 для СЭ4; в 3,6 раза, р>0,05 для СЭ8). Вследствие неожиданно высокой вариабельности Т-клеточных ответов возможности для детекции значительного различия между дозами адъюванта были очень ограничены (<50%). Важно, что обе композиции дЕ, приготовленные с А801В или А801Е, индуцировали количество цитокин-продуцирующих СЭ4 Т-клеток значительно большее по величине (в 13,3 раза, р<0,05) по сравнению с одним только дЕ. Более высокие уровни СЭ8-клеток также индуцировались под действием дЕ, приготовленного с А801В или А801Е, (в 3,8 раза, р>0,05) по сравнению с одним только антигеном дЕ.
Пример ΧΙΙΙ. Доклиническая оценка А801В по сравнению с А801Е на модели гриппа у хорьков.
Материалы и методы.
Самок хорьков (Мик!е1а ри!огшк Гиго) в возрасте 4-6 месяцев получали от МКАУ Соики1!аису №1111144111^ υΚ). Хорьков примировали на 0-е сутки гетеросубтипическим штаммом Η1Ν1 А/81оск1ю1т/24/90 (4 1од ТСГО50/мл) в количестве 250 мкл, введенных интраназально. На 21-е сутки хорькам посредством внутримышечной инъекции вводили полную человеческую дозу (1000 мкл вакцинная доза, 15 мкг НА на штамм А; 17,5 мкг штамма В) комбинации Η1Ν1 А/№\\' Са1едоша С/20/99 (15 мкг/мл), Η3Ν2 А/\уот1ид/3/2003 (15 мкг/мл) и В/Лаидки/10/2003 (17,5 мкг/мл). Затем осуществляли контрольное заражение хорьков на 42-е сутки через интраназальный путь с использованием 250 мкл гетеросубтипического штамма \У11.А/УУ/55/04 (4,51 1од ТСГО50/мл).
- 64 014353
На 21-е сутки проводили вакцинации либо простой трехвалентной композицией (простая в приведенных ниже таблицах), либо трехвалентными композициями с адъювантом Αδ01В (Αδ01В в приведенных ниже таблицах) или Αδ01Е ('Άδ01Ε в приведенных ниже таблицах). Композиции приготавливали, как приведено выше в примере 3.
Мониторинг температуры тела.
Индивидуальные температуры регистрировали в течение периода контрольного заражения и оценивали с использованием телеметрических имплантатов, с помощью которых регистрировали температуру каждого индивидуального животного каждые 15 мин до и после контрольного заражения. Все имплантаты проверили и обновили и перед размещением во внутрибрюшинной полости провели новое калибрование с использованием ΌδΙ (ΌηΙη δс^еηсеб 1Щегпа1юпа1). На время этих измерений всех животных индивидуально размещали в отдельных клетках. Температуры регистрировали каждые 15 мин в течение 6 суток до примирования и включительно до 4-х суток после примирования, а также в течение 3 суток перед контрольным заражением и включительно до 7 суток после контрольного заражения.
Тест на ингибирование гемагглютинации (Н1).
Методика тестирования.
Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (Н1). Принцип Н1-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Образцы сыворотки первоначально обрабатывали 25%-ным раствором нейраминидазы (КОЕ) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации, используя отверстия для прочтения. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли для Н1-титров, используя иХКТАТ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения в группах;
критерий Кокрена с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
односторонний дисперсионный анализ, выполненный на группах;
№О-критерий Тьюки для множественных сравнений.
Титрование вирусов в назальных смывах.
Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры δр^η X (Соб(аг) для удаления любого бактериального загрязнения. По 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных смывов переносили в титрационные микропланшеты, содержащие по 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл клеток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 6-7 суток. Через 6-7 суток инкубации культуральную среду осторожно удаляют, добавляют по 100 мкл 1/20 ^δΤ-1-содержащей среды и инкубируют в течение еще 18 ч. Интенсивность желтого формазанового красителя, образующегося в результате восстановления ^VδΤ-1 жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству находящихся в лунке жизнеспособных клеток по окончании анализа титрования вирусов и определяется количественно путем измерения поглощения в каждой лунке на соответствующей длине волны (450 нм). Начало отсчета определяют как среднее значение ОО для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ОО (0,3 ОО соответствует ±3 δΐ^еν ОО для неинфицированных контрольных клеток). Положительный балл определяют, когда ОО находится ниже начала отсчета и, наоборот, отрицательный балл определяют, когда ОО находится выше начала отсчета. Титры вирусного шеддинга определяли согласно Кееб апб МиепсЕ и выражали в виде 1од ТСГО50/мл.
Анализ пролиферации лимфоцитов.
РВМС собирали центрифугированием в градиенте плотности (20 мин при 2500 об/мин и 4°С) с использованием раствора Еюо11 ЬутрНо1у1е-Матта1 (Себаг1апе). РВМС ресуспендировали в 5 мл культуральной среды (КРМ1/А66 при 4°С) с 10% нормализованной сыворотки хорьков. В состав добавок входили 100 мМ пируват натрия, не основные аминокислоты МЕМ, пенициллин/стрептамицин, глутамин и разбавленный в 1000 раз (1000х) концентрированный в2-меркаптоэтанол.
Свежевыделенные РВМС немедленно использовали для анализов пролиферации ш νίΙΐΌ. Клетки размещали в 96-луночных планшетах с плоским дном для тканевых культур (2х105 клеток/лунка) и культивировали с разными концентрациями антигена (от 0,1 до 1 мкг НА цельного инактивированного вируса) в течение 44-96 ч и затем импульсно метили, используя 0,5 мкКи [3Н]тимидина. Включение радиоак
- 65 014353 тивной метки подтверждали через 4-16 ч с помощью β-эмиссионной спектроскопии.
Результаты.
Вирусная нагрузка в назальных смывах после контрольного заражения.
Назальные смывы собирали за 2 суток до примирования (примирование - в 0-е сутки), через 1, 2 и 7 суток после примирования, а также за 4 суток до контрольного заражения (контрольное заражение - в 42-е сутки) и в течение 7 суток после контрольного заражения.
Г руппа -2 0 +1 +2 +7 39 42 43 44 45 47 49
Простая 0,82 1,84 5,35 1,85 0.8 1,82 5,77 4,44 1,97 0,9
А501Е 0,82 2,11 5,83 1,65 0,8 1,62 4,93 4,15 2,4 0,85
А801В 0,81 2,26 5,38 1,91 0,82 1,74 2,25 1,89 1,350 0,9
Результаты см. на фиг. 27.
Выделение вирусов после примирования.
Пик выделения вирусов наблюдали у всех хорьков через 2 суток после примирования.
Через 7 суток после примирования во всех группах наблюдали только остаточную вирусную нагрузку.
Выделение вирусов после контрольного заражения.
Пик выделения вирусов наблюдали через 24 ч после контрольного заражения.
Титрование вирусов через 3 суток после контрольного заражения продемонстрировало высокие титры вирусов (отсутствие защиты) у хорьков, иммунизированных трехвалентной обычной композицией. Незначительное уменьшение выделения вирусов наблюдали у хорьков, иммунизированных трехвалентной сплит-А801Е композицией, по сравнению с наблюдаемым при использовании трехвалентной сплит-композицией с адъювантом А801В.
Температурный мониторинг.
Температуру тела регистрировали, начиная с 6 суток до примирования (примирование - в 0-е сутки) и включительно до 4 суток после примирования, а также от 3 суток до контрольного заражения и включительно до 7 суток после контрольного заражения (контрольное заражение - в 42-е сутки). Измерения выполняли каждые 15 мин и среднее значение рассчитывали в середине дня для каждой группы. Результаты показаны на фиг. 28.
После примирования.
Мониторинг температуры тела до, в процессе и после примирования продемонстрировал увеличе ние температуры во всех группах.
После контрольного заражения.
Интерпретация мониторинга температуры тела вызывает затруднение. Легкое увеличение температуры тела наблюдали после контрольного заражения у хорьков, иммунизированных трехвалентной простой сплит- и трехвалентной сплит-А801Е композицией, но не трехвалентной сплит-А801В. Приведенная ниже оценка была получена для хорьков с увеличением температуры тела более чем на 0,4°С.
Увеличение температуры после контрольного заражения.
Трехвалентная простая 5/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,7, +0,8)
Т рехвалентная АЗ01В 0/8
Трехвалентная А301Е 6/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,5, +0,9, +1,6)
Результаты этого считывания менее понятны по сравнению с другими считываниями, используе мыми для хорьков.
Тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ).
Образцы сыворотки собирали за 4 суток до примирования, через 17 суток после примирования, через 21 сутки после иммунизации и через 13 суток после контрольного заражения. Результаты показаны на фиг. 29 и 30. Для всех трех вакцинных штаммов статистически значимо более высокие ΗΙ-титры наблюдали у хорьков, иммунизированных трехвалентной сплит-композицией с адъювантом А801В или А801Е по сравнению с трехвалентной простой Сплит-композицией. Никакого различия не наблюдали между двумя адъювантными группами. По сравнению с другими группами статистически значимые более высокие перекрестно-реактивные ΗΙ-титры в отношении Λ/Nеν Уогк Η3Ν2 (штамм для контрольного заражения) наблюдали после иммунизации хорьков трехвалентными сплит-композициями с адъювантом А§01В.

Claims (28)

1. Иммуногенная композиция в объеме, подходящем для дозы для человека, содержащая антиген или антигенный препарат в комбинации с адъювантом, содержащим иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа шойпа и представленную в форме липосомы, и липополисахарид, где указанная сапониновая фракция и указанный липополисахарид представлены в указанной дозе для человека на уровне ниже 30 мкг.
2. Иммуногенная композиция по п.1, где указанная адъювантная композиция дополнительно содержит стерин, причем соотношение сапонин:стерин составляет 1:1 -1:100 мас./мас.
3. Иммуногенная композиция по любому из пп.1, 2, где указанная иммунологически активная сапониновая фракция представляет собой 0821.
4. Иммуногенная композиция по любому из пп.2, 3, где указанный стерин представляет собой холестерин.
5. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-4, где указанный липополисахарид представляет собой производное липида А.
6. Иммуногенная композиция по п.5, где указанное производное липида А представляет собой 3Ό-ΜΡΕ (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А).
7. Иммуногенная композиция по п.5 или 6, где соотношение Ο82Ε3Ό-ΜΡΕ равно 1:1.
8. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-7, где указанный липополисахарид присутствует в количестве 1-30 мкг.
9. Иммуногенная композиция по п.8, где указанный липополисахарид присутствует в количестве 25 мкг.
10. Иммуногенная композиция по п.8, где указанный липополисахарид присутствует в количестве 1-15 мкг.
11. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-10, где указанный сапонин присутствует в количестве 1-25 мкг.
12. Иммуногенная композиция по п.11, где указанный сапонин присутствует в количестве 25 мкг.
13. Иммуногенная композиция по п.11, где указанный сапонин присутствует в количестве 1-10 мкг.
14. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-13, где указанный дозовый объем, подходящий для применения человеку, равен 0,5-1,5 мл.
15. Адъювантная композиция в объеме, подходящем для применения в дозе иммуногенной композиции для человека, содержащая 1-30 мкг липополисахарида и 1-30 мкг иммунологически активной сапониновой фракции, представленной в форме липосомы.
16. Адъювантная композиция по п.15, где указанный липополисахарид представляет собой производное липида А.
17. Адъювантная композиция по п.16, где указанное производное липида А представляет собой 3Ό-ΜΡΕ.
18. Адъювантная композиция по любому из пп.15-17, где указанная иммунологически активная сапониновая фракция представляет собой 0821.
19. Адъювантная композиция по любому из пп.15-18, где указанный объем, подходящий для дозы для человека, равен 250 мкл.
20. Адъювантная композиция по любому из пп.15-18, где указанный объем, подходящий для дозы для человека, равен 360 мкл.
21. Адъювантная композиция по любому из пп.15-18, где указанный липополисахарид присутствует в количестве 25 мкг.
22. Адъювантная композиция по любому из пп.15-18, где указанный липополисахарид присутствует в количестве 10 мкг.
23. Адъювантная композиция по любому из пп.15-18, где указанный липополисахарид присутствует в количестве 5 мкг.
24. Адъювантная композиция по любому из сапонин присутствует в количестве 25 мкг.
25. Адъювантная композиция по любому из сапонин присутствует в количестве 10 мкг.
26. Адъювантная композиция по любому из сапонин присутствует в количестве 5 мкг.
27. Иммуногенная композиция по любому из парат получен из вируса ветряной оспы (У2У).
28. Иммуногенная композиция по любому из парат получен из Ρ1а5тоά^ит Ра1арагит.
EA200801307A 2005-12-13 2006-12-12 Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант EA014353B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0525321.6A GB0525321D0 (en) 2005-12-13 2005-12-13 Novel compositions
GB0609902A GB0609902D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Novel composition
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
PCT/GB2006/004634 WO2007068907A2 (en) 2005-12-13 2006-12-12 Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801307A1 EA200801307A1 (ru) 2008-12-30
EA014353B1 true EA014353B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=37876836

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001189A EA018860B1 (ru) 2005-12-13 2006-12-12 Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант
EA200801307A EA014353B1 (ru) 2005-12-13 2006-12-12 Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001189A EA018860B1 (ru) 2005-12-13 2006-12-12 Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20080279926A1 (ru)
EP (6) EP2364720B1 (ru)
JP (2) JP5461015B2 (ru)
KR (1) KR101363879B1 (ru)
CN (3) CN103861100A (ru)
AR (1) AR058543A1 (ru)
AT (1) ATE542543T1 (ru)
AU (1) AU2006325377B2 (ru)
BR (1) BRPI0619795B8 (ru)
CA (1) CA2633008C (ru)
CR (2) CR10101A (ru)
CY (3) CY1112589T1 (ru)
DK (3) DK1959992T3 (ru)
EA (2) EA018860B1 (ru)
ES (6) ES2479165T3 (ru)
HK (2) HK1118477A1 (ru)
HR (3) HRP20120136T1 (ru)
IL (2) IL191703A (ru)
MA (1) MA30023B1 (ru)
MY (1) MY145943A (ru)
NO (1) NO20082472L (ru)
NZ (2) NZ596870A (ru)
PE (1) PE20071098A1 (ru)
PL (3) PL2364724T3 (ru)
PT (3) PT2364724E (ru)
SG (2) SG170127A1 (ru)
SI (3) SI2364724T1 (ru)
TW (1) TWI457133B (ru)
WO (1) WO2007068907A2 (ru)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3017827T (lt) 2005-12-22 2019-01-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pneumokokinė polisacharidinė konjuguota vakcina
EA017441B1 (ru) 2006-06-15 2012-12-28 Новартис Аг Вакцинация против гриппа по схеме многократного введения с использованием безадъювантной дозы
KR20100045445A (ko) 2007-06-26 2010-05-03 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
EP2034022A1 (en) 2007-09-10 2009-03-11 Universite Libre De Bruxelles Leukotriene B4 binding soluble lipocalin receptor from ixodes ricinus
EP2045263A1 (en) 2007-10-02 2009-04-08 Universite Libre De Bruxelles Identification and molecular characterisation of salivary metalloproteases expressed in the tick salivary glands
EP4206231A1 (en) * 2007-12-24 2023-07-05 ID Biomedical Corporation of Quebec Recombinant rsv antigens
WO2010094663A1 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant
GB0910046D0 (en) * 2009-06-10 2009-07-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compositions
WO2010147268A1 (ko) * 2009-06-19 2010-12-23 아이진 주식회사 자궁경부암 백신
MX2012000036A (es) 2009-06-24 2012-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna.
WO2010149745A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Recombinant rsv antigens
HRP20220756T1 (hr) 2009-07-15 2022-09-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteinski pripravci rsv f i postupci za izradu istih
AU2010335970B2 (en) * 2009-12-22 2016-11-03 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic compositions
CN101791401B (zh) * 2009-12-31 2012-04-18 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法
KR20120129927A (ko) 2010-01-27 2012-11-28 글락소 그룹 리미티드 변형된 투베르쿨로시스 항원
GB201101331D0 (en) * 2011-01-26 2011-03-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions and uses
JP2017071615A (ja) * 2010-10-27 2017-04-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 神経障害を治療するための免疫原性組成物及び方法
BR112013029514A2 (pt) * 2011-05-17 2019-09-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica, vacina, e, método de tratar ou impedir uma doença
GB201116248D0 (en) * 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
EP2763698B1 (en) * 2011-10-06 2020-12-02 ImmunoVaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
GB201213364D0 (en) * 2012-07-27 2012-09-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
WO2014027302A1 (en) * 2012-08-16 2014-02-20 Pfizer Inc. Glycoconjugation processes and compositions
EP3513806B1 (en) 2012-12-05 2023-01-25 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic composition
KR20160040290A (ko) * 2013-08-05 2016-04-12 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 조합 면역원성 조성물
AU2014330337A1 (en) 2013-10-03 2016-03-17 Nitto Denko Corporation Mucosal vaccine composition
EP3053593A4 (en) * 2013-10-03 2017-07-05 Nitto Denko Corporation Nasal mucosal vaccine composition
TW201601752A (zh) * 2013-10-03 2016-01-16 Nitto Denko Corp 黏膜疫苗組合物
CN105530953A (zh) * 2013-10-03 2016-04-27 日东电工株式会社 注射疫苗组合物
GB201318862D0 (en) * 2013-10-25 2013-12-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Calcium fluoride compositions
JP6608422B2 (ja) * 2014-03-25 2019-11-20 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ，アズ リプリゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ジ アーミー モノホスホリルリピッドａ（ｍｐｌａ）含有リポソーム組成物およびサポニンを含む非毒性アジュバント製剤
GB201405921D0 (en) 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
WO2016096968A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccination
EP3242883A4 (en) 2015-01-06 2018-10-17 ImmunoVaccine Technologies Inc. Lipid a mimics, methods of preparation, and uses thereof
MY187472A (en) * 2015-09-10 2021-09-23 Inventprise Llc Multivalent vlp conjugates
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6900385B2 (ja) 2015-11-06 2021-07-07 アジュバンス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド トリテルペンサポニン類似物
GB201522068D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
WO2017109698A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic formulation
CN105770887A (zh) * 2016-03-04 2016-07-20 邓招红 一种用于hbv疫苗的佐剂及其制备方法
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
CA3045952A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel process
KR102650073B1 (ko) 2017-01-31 2024-03-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
WO2018201022A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Compositions and methods for vaccine delivery
CN111315406A (zh) * 2017-09-08 2020-06-19 传染病研究所 包括皂苷的脂质体调配物及其使用方法
CA3075822A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Adjuvance Technologies, Inc. Triterpene saponin analogues
JP2021504429A (ja) 2017-12-01 2021-02-15 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サポニン抽出
CA3083078A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Saponin purification
WO2019175147A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against intra-abdominal infections
TWI820099B (zh) * 2018-03-28 2023-11-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 新穎皂素佐劑及其評估方法
US11389519B2 (en) * 2018-06-11 2022-07-19 Inventprise, Llc Virus-like particle conjugates
EP3849521A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle vaccine adjuvant and methods of use thereof
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2020154595A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
EA202192390A1 (ru) 2019-03-18 2021-12-03 Янссен Фармасьютикалз, Инк. Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения
AU2020240075A1 (en) 2019-03-18 2021-10-14 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
AU2020318680A1 (en) 2019-07-21 2022-02-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
AU2020358862A1 (en) 2019-10-02 2022-04-14 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Staphylococcus peptides and methods of use
TW202128216A (zh) * 2019-12-13 2021-08-01 大陸商遠大賽威信生命科學（南京）有限公司 免疫刺激組合物及其用途
US20230045642A1 (en) 2019-12-19 2023-02-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa S. aureus antigens and compositions thereof
EP4090363B1 (en) 2020-01-16 2024-09-04 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutant, compositions therewith and use thereof
US11638754B2 (en) * 2020-02-14 2023-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc HPV vaccine
WO2021195024A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Adjuvance Technologies, Inc. Adjuvant compounds, salt forms, and formulations
EP4146378A1 (en) * 2020-05-05 2023-03-15 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Microfluidic mixing device and methods of use
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide
WO2022056195A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 The Rochester General Hospital Haemophilus infuluenzae vaccine and methods of use
WO2022058945A1 (en) 2020-09-17 2022-03-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Multivalent vaccine compositions and uses thereof
CA3199937A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Sanofi Pasteur Liposomes containing tlr4 agonist, preparation and uses thereof
GB2600468A (en) 2020-10-30 2022-05-04 Excivion Ltd Adjuvant composition
EP4277921A1 (en) 2021-01-12 2023-11-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutants, compositions therewith and use thereof
EP4032547A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Hsv1 fce derived fragements for the treatment of hsv
WO2022208430A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Production of e. coli o18 bioconjugates
WO2023020994A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
JP2024532127A (ja) * 2021-08-19 2024-09-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 熱安定性脂質ナノ粒子およびその使用方法
CN116199727A (zh) * 2021-12-01 2023-06-02 上海安奕康生物科技有限公司 一种mpl三乙胺盐、其制备工艺及应用
WO2023114570A1 (en) 2021-12-19 2023-06-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for long-lasting germinal center responses to a priming immunization
CN118695869A (zh) 2022-02-14 2024-09-24 佐治亚大学研究基金会股份有限公司 泛-肺病毒疫苗组合物及其使用方法
WO2023175454A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Pfizer Inc. Methods for producing an adjuvant
CN116162173B (zh) * 2022-10-28 2024-06-04 安徽农业大学 一种GnRH6-CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
US20240299524A1 (en) 2023-03-02 2024-09-12 Sanofi Compositions for use in treatment of chlamydia

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994000153A1 (en) * 1992-06-25 1994-01-06 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine composition containing adjuvants
WO1996033739A1 (en) * 1995-04-25 1996-10-31 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol
WO1998015287A1 (en) * 1996-10-05 1998-04-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
WO2002032454A1 (en) * 2000-10-18 2002-04-25 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant composition comprising an immunostimulatory oligonucleotide and a tocol
WO2003028760A2 (en) * 2001-10-01 2003-04-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
US20030219453A1 (en) * 1998-03-19 2003-11-27 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Vaccines
WO2005117958A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
WO2006123155A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine composition comprising b-subunit of e. coli heat toxin and an atigen and an adjuvant

Family Cites Families (183)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US666843A (en) * 1900-07-02 1901-01-29 Eastman Kodak Co Spirit-level.
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
DE2921961C2 (de) 1979-05-30 1986-02-06 Santrade Ltd., Luzern/Lucerne Bohreinheit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
US6222020B1 (en) 1987-01-07 2001-04-24 Imperial Cancer Research Technology Limited Antigens derived from the core protein of the human mammary epithelial mucin
CA1339204C (en) 1987-01-07 1997-08-05 Joyce Taylor-Papadimitriou Mucin core polypeptide, antibodies and probes
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
JP2851288B2 (ja) 1987-06-05 1999-01-27 アメリカ合衆国 癌診断および管理における自己分泌運動性因子
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
DE3734306A1 (de) 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US4963484A (en) 1988-01-29 1990-10-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Genetically engineered polypeptides with determinants of the human DF3 breast carcinoma-associated antigen
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
AU626961B2 (en) 1988-12-16 1992-08-13 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
GB8913737D0 (en) 1989-06-15 1989-08-02 Univ Birmingham A novel anti-allergy treatment
DE69031556T2 (de) 1989-07-25 1998-05-14 Smithkline Beecham Biologicals S.A., Rixensart Antigene sowie Verfahren zu deren Herstellung
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
WO1992014488A1 (en) 1991-02-15 1992-09-03 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
GB9113809D0 (en) 1991-06-26 1991-08-14 Cancer Res Campaign Tech Papillomavirus l2 protein
US7476389B1 (en) 1991-07-19 2009-01-13 The University Of Queensland Papillomavirus vaccines
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
DE69228698T2 (de) 1991-11-16 1999-09-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A., Rixensart HYBRIDES PROTEIN ZWISCHEN CS AUS PLASMODIUM UND HBsAG
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JPH06510799A (ja) 1992-06-25 1994-12-01 シティ・オブ・ホープ サイトメガロウイルスのポリペプチドによる細胞溶解性ｔ−リンパ球の誘導
DE122007000095I1 (de) 1992-06-25 2008-03-27 Papillomavirus vakzine
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
DE122007000014I1 (de) 1993-03-09 2007-05-24 Univ Rochester Herstellung von menschlichem Papillomavirus Hüllprotein und virus-ähnlichen Teilchen
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
SG48309A1 (en) 1993-03-23 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
DE69431624T2 (de) 1993-05-18 2003-07-10 The Ohio State University Research Foundation, Columbus Impfstoff gegen mittelohrentzündung
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
BE1007535A3 (nl) 1993-09-24 1995-07-25 Innovative Sputtering Tech Gelaagde metaalstructuur.
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
GB9409962D0 (en) 1994-05-18 1994-07-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
EP1728800A1 (de) 1994-10-07 2006-12-06 Loyola University Of Chicago Papillomavirusähnliche Partikel, Fusionsproteine sowie Verfahren zu deren Herstellung
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
WO1996026277A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
IL117459A (en) 1995-03-22 2005-11-20 Merck & Co Inc Dna encoding human papillomavirus type 18
US20010053365A1 (en) * 1995-04-25 2001-12-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5688267A (en) * 1995-05-01 1997-11-18 Ep Technologies, Inc. Systems and methods for sensing multiple temperature conditions during tissue ablation
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5668267A (en) 1995-05-31 1997-09-16 Washington University Polynucleotides encoding mammaglobin, a mammary-specific breast cancer protein
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
TR199701537T1 (xx) 1995-06-07 1998-03-21 Biochem Vaccines Inc. HSP70 ailesinin streptokokal �s� �ok protein �yeleri.
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5997881A (en) 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
JP2000511411A (ja) 1996-05-01 2000-09-05 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 抗―肺炎球菌ワクチン用のコリン結合タンパク質
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
US6420135B1 (en) 1996-10-31 2002-07-16 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
JP2002503087A (ja) 1996-11-12 2002-01-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ストレプトコッカス・ニューモニアのｃ３結合タンパク質
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
WO1998033923A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT msbB or htrB GENES
WO1998037418A2 (en) 1997-02-25 1998-08-27 Corixa Corporation Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
JP3036686B2 (ja) 1997-02-27 2000-04-24 政夫 高橋 冠状動脈のバイパス手術に用いる血管吻合部の止血保持装置
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
TR199902437T2 (xx) * 1997-04-01 2000-01-21 Corixa Corporation Monofosforil lipid A'ya ait sulu im�nolojik adjuvant terkipleri.
ZA982968B (en) 1997-04-09 1998-10-27 Corixa Corp Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
WO1998050567A1 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
CA2292838A1 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9712347D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU740956B2 (en) 1997-07-21 2001-11-15 Baxter Healthcare Sa Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
US5928215A (en) * 1997-08-14 1999-07-27 Becton, Dickinson And Acompany Syringe filling and delivery device
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
DE69815692T2 (de) * 1997-09-05 2004-04-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Öl in wasser emulsionen mit saponinen
EP1700911B1 (en) 1997-09-05 2016-04-06 Medimmune, Inc. In vitro method for disassembly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (VLPs)
KR20010024299A (ko) 1997-09-24 2001-03-26 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3 분해단백질분해효소
EP1017815A1 (en) 1997-09-26 2000-07-12 Corixa Corporation Murine model for human carcinoma
JP2002507387A (ja) 1997-12-24 2002-03-12 コリクサ コーポレイション 乳癌の免疫療法および診断のための化合物ならびにそれらの使用のための方法
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
BR9907691B1 (pt) 1998-02-05 2011-05-31 derivado de antìgeno e antìgeno da famìlia mage associado a tumor, seqüência de ácido nucléico, codificando os mesmos, seus usos na preparação de vacina, processo para produção de vacina e vacina.
US20020039584A1 (en) 1998-02-20 2002-04-04 Medigene Ag Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
CN1163602C (zh) 1998-04-07 2004-08-25 科里克萨公司 结核杆菌抗原融合蛋白及其应用
CN1200731C (zh) 1998-04-07 2005-05-11 免疫医疗公司 用作疫苗的肺炎球菌胆碱结合蛋白衍生物
KR100638503B1 (ko) 1998-04-07 2006-10-26 세인트 쥬드 칠드런즈 리써치 호스피탈 Ｎ-말단 콜린 결합 단백질 ａ 절두물의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 이로부터 유도된 백신 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1073734B1 (en) 1998-04-15 2009-09-23 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Tumor associated nucleic acids and uses therefor
EP1073450A4 (en) 1998-04-23 2003-04-23 Uab Research Foundation PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C (PSPC), EPITOPIC REGIONS, SELECTION OF CORRESPONDING STRES AND USES
GB9809683D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810285D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
CZ296086B6 (cs) 1998-06-03 2006-01-11 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Izolovaný polypeptid a polynukleotid, zpusob výroby, bunka a vakcína
GB9812163D0 (en) 1998-06-05 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812440D0 (en) 1998-06-09 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
KR20070112860A (ko) 1998-07-14 2007-11-27 코릭사 코포레이션 전립선 종양 단백질의 분리된 면역원성 부위 및 이를사용하여 전립선암을 진단하는 방법
GB9820002D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
MXPA01003073A (es) 1998-09-24 2002-04-24 Univ Minnesota Polipeptido que degrada la proteina c3 complementaria humana a partir de streptococcus pneumoniae.
AU1819400A (en) 1998-11-17 2000-06-05 Schlumberger Technology Corporation Transmitting information over a communication link
WO2000029434A2 (en) 1998-11-19 2000-05-25 St. Jude Children's Research Hospital PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS, CbpG AND CbpD, DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES THEREOF
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
CN1201004C (zh) 1999-01-29 2005-05-11 考丽克萨有限公司 HER－2/neu融合蛋白
GB9904559D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
WO2000052165A2 (en) 1999-03-04 2000-09-08 Corixa Corporation Compositions and methods for breast cancer therapy and diagnosis
HU228499B1 (en) * 1999-03-19 2013-03-28 Smithkline Beecham Biolog Streptococcus vaccine
US6245568B1 (en) 1999-03-26 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles
PT1187629E (pt) 1999-04-19 2005-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicao adjuvante que compreende saponina e um oligonucleotido imunoestimulador
DE60045721D1 (de) 1999-06-10 2011-04-21 Medimmune Inc Streptococcus pneumoniae Proteine und Impfstoffe
FR2796291B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-21 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille munie d'un systeme de declenchement piezo-electrique
FR2796290B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-14 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille fonctionnant avec un generateur d'onde de choc a travers une paroi
FR2796289B1 (fr) 1999-07-16 2001-08-10 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec injecteur a elements superposes
GB9917977D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918038D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918208D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918302D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US6139179A (en) 1999-09-03 2000-10-31 Davis-Standard Corporation Extruder screw having multi-channeled barrier section
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921147D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
FR2800619B1 (fr) 1999-11-05 2002-02-08 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec un moyen de poussee temporairement retenu
FR2802102B1 (fr) 1999-12-08 2002-07-12 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un tube d'ejection a section constante
FR2802103B1 (fr) 1999-12-08 2003-10-03 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec entrainement du principe actif par effet tube a choc
FR2802820B1 (fr) 1999-12-27 2002-10-18 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par effet tube a choc, avec maintien prealable du principe actif sur le cote
FR2804329B1 (fr) 2000-02-02 2002-12-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un opercule contenant le principe actif
FR2804869B1 (fr) 2000-02-11 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille pour l'injection d'un liquide contenu dans une ampoule pre-remplie
FR2805749B1 (fr) 2000-03-01 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille a deux niveaux de vitesse d'injection
FR2807946B1 (fr) 2000-04-19 2002-06-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec un chargement pyrotechnique bicomposition
FR2809626B1 (fr) 2000-05-30 2003-03-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille avec membrane d'isolation d'un ejecteur multiconduit
NZ553554A (en) 2000-06-20 2008-11-28 Id Biomedical Corp Streptococcus antigens
FR2810554B1 (fr) 2000-06-22 2003-05-16 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un reservoir modulable
FR2812202B1 (fr) 2000-07-28 2002-09-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par mise en compression du reservoir contenant le principe actif liquide
GB0019375D0 (en) 2000-08-07 2000-09-27 Int Centre Genetic Eng & Bio Method of polypeptide renaturation
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
FR2815544B1 (fr) 2000-10-23 2003-02-14 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille securisee a architecture compacte
AR032575A1 (es) * 2001-02-23 2003-11-12 Smithkline Beecham Biolog Uso de una preparacion antigenica de gripe para la fabricacion de una vacuna intradermica de la gripe y estuche farmaceutico que comprende dicha vacuna
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
TWI228420B (en) 2001-05-30 2005-03-01 Smithkline Beecham Pharma Gmbh Novel vaccine composition
WO2003094836A2 (en) * 2001-10-12 2003-11-20 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US7262024B2 (en) 2001-12-20 2007-08-28 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US7026465B2 (en) 2002-02-15 2006-04-11 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
CA2494508A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
GB0504436D0 (en) * 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EA201001322A1 (ru) 2005-03-31 2011-02-28 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцины против хламидиоза
EA013326B1 (ru) 2005-04-26 2010-04-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
ATE543832T1 (de) 2005-04-29 2012-02-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Verfahren zur vorbeugung oder behandlung einer m.-tuberculosis-infektion

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994000153A1 (en) * 1992-06-25 1994-01-06 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine composition containing adjuvants
WO1996033739A1 (en) * 1995-04-25 1996-10-31 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol
WO1998015287A1 (en) * 1996-10-05 1998-04-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
US20030219453A1 (en) * 1998-03-19 2003-11-27 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Vaccines
WO2002032454A1 (en) * 2000-10-18 2002-04-25 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant composition comprising an immunostimulatory oligonucleotide and a tocol
WO2003028760A2 (en) * 2001-10-01 2003-04-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
WO2005117958A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
WO2006123155A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine composition comprising b-subunit of e. coli heat toxin and an atigen and an adjuvant

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEREZIN V.E. ET AL.: "Controlled organization of multimolecular complexes of enveloped virus glycoproteins: Study of immunogenicity", VACCINE 1988, UNITED KINGDOM, vol. 6, no. 5, 1988, pages 450-456, XP002435079, ISSN: 0264-410X, the whole document *
DELIYANNIS GEORGIA ET AL.: "Immunopotentiation of humoral and cellular responses to inactivated influenza vaccines by two different adjuvants with potential for human use", VACCINE, vol. 16, no. 20, December 1998 (1998-12), pages 2058-2068, XP004138457, ISSN: 0264-410X, the whole document *
MISCHLER R. ET AL.: "Inflexal (R)V a trivalent virosome subunit influenza vaccine: Production", VACCINE 20 DEC 2002, UNITED KINGDOM, vol. 20, no. SUPPL. 5, 20 December 2002 (2002-12-20), pages B17-B23, XP002435078, ISSN: 0264-410X, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0619795B8 (pt) 2021-05-25
SI2364724T1 (sl) 2013-12-31
CR10101A (es) 2008-09-22
JP5461015B2 (ja) 2014-04-02
EA018860B1 (ru) 2013-11-29
EP2364721B1 (en) 2013-11-20
DK2364724T3 (da) 2013-11-11
HK1118477A1 (en) 2009-02-13
PE20071098A1 (es) 2007-11-07
EP2364723B1 (en) 2014-01-15
PT2364720E (pt) 2014-06-24
ATE542543T1 (de) 2012-02-15
SG170127A1 (en) 2011-04-29
SI1959992T1 (sl) 2012-04-30
EP2364724B1 (en) 2013-09-18
PL2364720T3 (pl) 2014-09-30
IL229521A0 (en) 2013-12-31
IL191703A (en) 2013-12-31
ES2444623T3 (es) 2014-02-26
EP2364721A1 (en) 2011-09-14
PT2364724E (pt) 2013-12-09
BRPI0619795A2 (pt) 2011-10-18
PL1959992T3 (pl) 2012-06-29
US20110206758A1 (en) 2011-08-25
CN103405764A (zh) 2013-11-27
CA2633008C (en) 2019-04-30
ES2445170T3 (es) 2014-02-28
NZ568825A (en) 2012-01-12
US10039823B2 (en) 2018-08-07
CY1114864T1 (el) 2016-12-14
DK1959992T3 (da) 2012-04-23
SG10201405533TA (en) 2014-11-27
ES2378471T3 (es) 2012-04-12
AR058543A1 (es) 2008-02-13
EP2364722B1 (en) 2013-11-13
CR10118A (ru) 2008-08-21
KR20080079312A (ko) 2008-08-29
NO20082472L (no) 2008-09-10
HRP20140484T1 (hr) 2014-07-04
CN103861100A (zh) 2014-06-18
JP2009519309A (ja) 2009-05-14
EA201001189A1 (ru) 2011-02-28
PL2364724T3 (pl) 2014-02-28
PT1959992E (pt) 2012-03-06
CY1112589T1 (el) 2016-02-10
MA30023B1 (fr) 2008-12-01
US10143745B2 (en) 2018-12-04
EP2364720B1 (en) 2014-05-07
ES2451573T3 (es) 2014-03-27
HRP20120136T1 (hr) 2012-03-31
IL191703A0 (en) 2008-12-29
TWI457133B (zh) 2014-10-21
ES2479165T3 (es) 2014-07-23
CY1115308T1 (el) 2017-01-04
HK1157219A1 (en) 2012-06-29
NZ596870A (en) 2013-06-28
WO2007068907A3 (en) 2007-08-09
CN102631670A (zh) 2012-08-15
WO2007068907A2 (en) 2007-06-21
EP2364722A1 (en) 2011-09-14
US20080279926A1 (en) 2008-11-13
MY145943A (en) 2012-05-31
HRP20131057T1 (hr) 2013-12-06
TW200730189A (en) 2007-08-16
EP1959992B1 (en) 2012-01-25
US20170065715A1 (en) 2017-03-09
CA2633008A1 (en) 2007-06-21
AU2006325377B2 (en) 2012-02-02
JP2013056927A (ja) 2013-03-28
KR101363879B1 (ko) 2014-02-21
ES2436645T3 (es) 2014-01-03
SI2364720T1 (sl) 2014-07-31
EP2364723A1 (en) 2011-09-14
EP1959992A2 (en) 2008-08-27
EA200801307A1 (ru) 2008-12-30
AU2006325377A1 (en) 2007-06-21
BRPI0619795B1 (pt) 2019-09-10
DK2364720T3 (da) 2014-06-10
EP2364720A1 (en) 2011-09-14
EP2364724A1 (en) 2011-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014353B1 (ru) Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант
KR101916787B1 (ko) Ｃｄ4 ｔ－세포 및/또는 개선된 ｂ－메모리 세포 반응을 유도하는 인플루엔자 바이러스 및 수중유 에멀젼 애주번트의 용도
EA015817B1 (ru) Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии &#34;масло в воде&#34;
JP2008001725A (ja) 新規組成物
JP2021505648A (ja) ジカワクチン及び免疫原性組成物、ならびにその使用方法
JP2002532435A (ja) Ｒｓｖサブユニット成分およびインフルエンザウイルス調製物を含む多価免疫原性組成物
JP5918870B2 (ja) インフルエンザに対する改善されたワクチン接種
UA98612C2 (ru) Иммуногенная композиция, пригодная для человека, включающая антиген или антигенный препарат в комбинации с адъювантом, содержащим qs21 в форме липосомы и 3d-mpl
WO2004052395A1 (en) L2-peptide of the human papillomavirus associated with virus-like particles
BRPI0609519A2 (pt) composição, uso de uma composição, método de vacinação, uso de um antìgeno, e, método para a preparação de uma composição imunogênica

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM