CZ296086B6 - Izolovaný polypeptid a polynukleotid, zpusob výroby, bunka a vakcína - Google Patents

Abstract

Polypeptidy BASB027 a polynukleotidy kódující polypeptidy BASB027 a zpusoby výroby techto polypeptidu rekombinantními technikami a zpusoby exprese polynukleotidu. Poskytují se také imunogenní fragmenty a fúzní proteiny s obsahem uvedených polypeptidu, expresní vektory, mikroorganismy a bunky obsahující uvedené polynukleotidy, vakcíny, protilátky afarmaceutické prostredky, jakoz i diagnostická, profylaktická a terapeutická pouzití.

Description

Izolovaný polypeptid a polynukleotid, způsob výroby, buňka a vakcína

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polynukleotidů (dále označovaných jako polynukleotid (polynukleotidy) BASB027), jimi kódovaných polypeptidů (dále označovaných jako BASB027 nebo polypeptid (polypeptidy) BASB027), rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se vynález týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů, včetně 10 vakcín proti bakteriálním infekcím. V dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro detekci infekce určitými patogeny.

Dosavadní stav techniky

Moraxella catarrhalis (nazývaná také Branhamella catarrhalis) je gramnegativní bakterie, která se často izoluje z horního respiračního traktu člověka. Je odpovědná za několik patologických stavů, z nichž hlavní je zánět středního ucha u kojenců a dětí, a pneumonie u širších osob. Je také odpovědná za sinusitidu, nosokomiální infekce a méně často za invazivní onemocnění.

Zánět středního ucha je důležitým onemocněním dětského věku jak počtem případů, tak i možnými následky. Každoročně se zaznamenává ve Spojených státech více než 3,5 miliónu případů a odhaduje se, že 80 % dětí prodělalo před dosažením věku tří let alespoň jeden zánět středního ucha (Klein, J. O. (1994) Clin. Inf. Dis. 19: 823). Pokud se ponechá bez léčení, nebo 25 pokud přejde do chronického stavu, může toto onemocnění vést ke ztrátám sluchu, které mohou být dočasné (v případě akumulace kapaliny ve středním uchu), nebo trvalé (v případě poškození sluchového nervu). U kojenců mohou tyto úbytky sluchu odpovídat za opoždění učení řeči.

Ze středního ucha dětí se zánětem středního ucha se primárně izolují tři druhy bakterií: 30 Streptococcus pneumoniae, netypovatelný Haemophilus influenzae (NTHi) a M. catarrhalis. Jsou přítomny v 60 až 90 % případů. Přehled nedávných studií ukazuje, že S. pneumoniae a NTHi představují obě přibližně 30 %, a M. catarrhalis přibližně 15 % případů zánětu středního ucha (Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Že středního ucha je možno izolovat také další bakterie (H. influenzae, typ B, S. pyogenes atd.), ale s mnohem nižší četností (2 % případů nebo 35 méně).

Epidemiologické údaje ukazují, že pro patogeny nalézané ve středním uchu je pro vývoj zánětu ucha absolutně nezbytným požadavkem osídlení horního respiračního traktu; pro vyvinutí onemocnění je však také nezbytné splnění dalších požadavků (Dickinson, D. P. a další (1988) 40 J. Infect. Dis. 158: 205; Faden, H. L. a další (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Ty jsou důležité pro spuštění migrace bakterií do středního ucha Eustachovými trubicemi a následnou iniciaci zánětlivého procesu. Tyto faktory jsou dosud neznámé. Uvádělo se, že neschopnost kontrolovat osídlení respiračního traktu může například způsobit přechodná anomálie imunitního systému po virové infekci (Faden, H. L. a další (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Alternativní 45 vysvětlení je to, že významnější kolonizaci u někteiých dětí umožní vystavení faktorům vnějšího prostředí a děti se tak stanou vnímavé na vyvinutí zánětu středního ucha z důvodů prodloužené přítomnosti patogenů středního ucha (Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).

Imunitní odpověď na M. catarrhalis je špatně charakterizována. Analýza kmenů izolovaných 50 postupně z nosohltanu dětí ve věku 0 až 2 roky ukazuje, že často dochází k získávání a eliminaci nových kmenů. To naznačuje, že u dětí kolonizovaných touto bakterií dochází k vyvinutí účinné imunitní odpovědi (Faden, H. L. a další (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

U většiny testovaných dospělých byly identifikovány baktericidní protilátky (Chapman, A. J. 55 a další (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). U kmenů M. catarrhalis se vyskytují rozdíly ve schopnosti

-1 CZ 296086 B6 odolávat baktericidní aktivitě séra; obecně jsou izoláty z jednotlivců postižených nemocí rezistentnější než izoláty, které se jednoduše kolonizují (Hol, C. a další (1993) Lancet 341: 1 281, Jordán, K. L. a další (1990) Am. J. Med. 88 (díl 5A): 28S). Rezistence na sérum by proto mohla být považována za faktor virulence bakterií. V sérech dětí, které se zotavily ze zánětu středního 5 ucha, byla pozorována opsonizační aktivita.

Antigeny, které jsou cílem těchto různých imunitních odpovědí u lidí, nebyly dosud identifikovány, s výjimkou OMP Bl, což je protein s molekulovou hmotností 84 kDa (84 000), jehož exprexe je řízena železem, a který je rozpoznáván séry pacientů s pneumonií (Sethi, S. a další ío (1995) Infect. Immun. 63: 1516), a UspAl a UspA2 (Chen D. a další (1999), Infect. Immun. 67: 1310).

Několik dalších membránových proteinů přítomných na povrchu M. catarrhalis bylo charakterizováno použitím biochemických metod nebo jejich potenciální úlohou při indukci ochranné imu15 nitní odpovědi (přehled viz Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60:267). U modelu pneumonie na myši podporuje přítomnost protilátek proti některým z nich (UspA, CopB) rychlejší odstraňování píleni infekce. Další polypeptid (OMP CD) je u kmenů M. catarrhalis vysoce konzervovaný a vykazuje homologie s porinem Pseudomonas aeruginosa, u kterého bylo ukázáno, že je účinný proti této bakterii ve zvířecích modelech.

Četnost infekcí Moraxella catarrhalis v posledních několika desetiletích dramaticky vzrostla. To bylo připisováno vzniku kmenů s vícečetnou rezistencí na antibiotika a stoupající populaci lidí s oslabeným imunitním systémem. Není již neobvyklé izolovat kmeny Moraxella catarrhalis, které mají rezistenci na některá nebo všechna standardní antibiotika. Tento jev vytvořil nezbyt25 nou potřebu a požadavky lékařů na nové protimikrobiální látky, vakcíny, metody screeningu léčiv a diagnostické testy pro tento organismu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká BASB027, zvláště polypeptidů BASB027 a polynukleotidů BASB027, rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se předkládaný vynález týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů, včetně mj. prevence a léčení mikrobiálních onemocnění. V dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro 35 detekci onemocnění spojených s mikrobiálními infekcemi, a stavů spojených s těmito infekcemi, jako jsou testy pro detekci exprese nebo aktivity polynukleotidů nebo polypeptidů BASB027.

Různé změny a modifikace v rámci podstaty a rozsahu popisovaného vynálezu budou na základě následujícího popisu a dalších částí přihlášky odborníkům z oboru zřejmé.

Podrobný popis vynálezu

Vynález se týká polypeptidů a polynukleotidů BASB027, které budou podrobněji popisovány 45 dále. Vynález se týká zvláště polypeptidů a polynukleotidů BASB027 Moraxella catarrhalis, který je homologií aminokyselinové sekvence příbuzný vnějšímu membránovému proteinu OMP85 Neisseria meningitidis. Vynález se zvláště týká BASB027 s nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3, popřípadě SEQ ID No. 2 nebo 4. Rozumí se, že sekvence uvedené ve výpisu sekvencí dále jako DNA představují příklad jed50 noho provedení vynálezu, protože odborníkovi v oboru bude zřejmé, že tyto sekvence mohou být použity v polynukleotidech obecně, včetně ribopolynukleotidů.

-2CZ 296086 B6

Polypeptidy

V jednom provedení vynálezu se poskytuji polypeptidy Moraxella catarrhalis označované dále jako BASB027 a polypeptidy BASB027, stejně jako jejich biologicky, diagnosticky, preventivně, klinicky nebo terapeuticky použité varianty, a farmaceutické prostředky s jejich obsahem.

Předkládaný vynález dále poskytuje:

(a) izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85 % identitu, s výhodou alespoň 90 % identitu, výhodněji alespoň 95 % identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99 % nebo přesnou identitu, se sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4;

(b) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynukleotidovou sekvenci, která má alespoň 85 % identitu, s výhodou alespoň 90 % identitu, výhodněji alespoň 95 % identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99 % nebo přesnou identitu se SEQ ID No. 1 nebo 3 v celé délce SEQ ID No. 1, popřípadě 3; nebo (c) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má alespoň 85 % identitu, s výhodou alespoň 90 % identitu, výhodněji alespoň 95 % identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99 % nebo přesnou identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4.

Polypeptidy BASB027 poskytované v SEQ ID No. 2 nebo 4 jsou polypeptidy BASB027 z Moraxella catarrhalis kmen Mc2931 (ATCC 43617).

Předkládaný vynález také poskytuje imunogenní fragment polypeptidů BASB027 o délce alespoň 15 za sebou následujících aminokyselin, tj. sousedící část polypeptidů BASB027, která má stejnou nebo v podstatě stejnou imunogenní aktivitu jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo 4; to znamená, že fragment (v případě potřeby navázaný na nosič) je schopný vyvolat imunitní odpověď, která rozpozná polypeptid BASB027. Takový imunogenní fragment může například obsahovat polypeptid BASB027 postrádající N-koncovou úvodní sekvenci, a/nebo transmembránovou doménu a/nebo C-koncovou zakotvovací doménu. Ve výhodném provedení zahrnuje imunogenní fragment BASB027 podle předkládaného vynálezu v podstatě celou extracelulámí doménu polypeptidů, který má alespoň 85 % identitu, s výhodou alespoň 90 % identitu, výhodněji alespoň 95 % identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99 % identitu se sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 po celé délce SEQ ID No. 2.

Fragment je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako část, ale ne celek jakékoli aminokyselinové sekvence jakéhokoli polypeptidů podle vynálezu. Jako je tomu u polypeptidů BASB027, fragmenty mohou být volné nebo obsažené uvnitř většího polypeptid, ze kterého tvoří část nebo oblast, nejvýhodněji jako jediná spojitá oblast v jediném větším polypeptidů.

Výhodné fragmenty zahrnují například zkrácené polypeptidy obsahující část aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo její varianty, jako jsou spojité řady zbytků, které obsahují amino- a/nebo karboxykoncovou aminokyselinovou sekvenci. Výhodné jsou také degradační formy polypeptidů podle vynálezu produkované hostitelskou buňkou nebo v hostitelské buňce. Dále jsou výhodné fragmenty charakterizované strukturními nebo funkčními vlastnostmi, jako jsou fragmenty obsahující alfa-helix a oblasti vytvářející alfa-helix, beta-list a oblasti vytvářející beta-list, ohyb a oblasti vytvářející ohyb, svinutí a oblasti vytvářející svinutí, hydrofilní oblasti, hydrofobní oblasti, alfa-amfípatické oblasti, beta-amfipatické oblasti, flexibilní oblasti, oblasti vytvářející povrch, oblasti vazby na substrát a oblasti s vysokým antigenním indexem.

Další výhodné fragmenty zahrnuji izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci obsahující alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin z aminokyselinové sek

-3CZ 296086 B6 vence SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin vytvořenou zkrácením nebo delecí z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4.

Fragmenty polypeptidu podle vynálezu mohou být použity pro výrobu odpovídajících polypeptidů s úplnou délkou peptidovou syntézou; proto mohou být tyto fragmenty použity jako meziprodukty pro výrobu polypeptidů podle vynálezu s úplnou délkou.

Zvláště výhodné jsou varianty, ve kterých několik, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 1 až 2 nebo 1 aminokyselina jsou substituovány, deletovány nebo adovány v jakékoli kombinaci.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle vynálezu mohou být ve formě zralého (maturního) proteinu nebo mohou být částí většího proteinu jako je prekurzor nebo fúzní protein. Často je výhodné zahrnout další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční nebo úvodní sekvence, prosekvence, sekvence napomáhající čištění jako jsou vícečetné histidinové zbytky, nebo další sekvence zlepšující stabilitu v průběhu výroby rekombinantním způsobem. Navíc je také možno uvážit přidání exogenního polypeptidů nebo lipidové části nebo polynukleotidových sekvencí pro zvýšení imunogenní schopnosti hotové molekuly.

V jednom provedení se předkládaný vynález týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgG 1, jestliže fúze probíhá v oblasti závěsu. Ve zvláštním provedení může být část Fc jednoduše odstraněna zahrnutím štěpící sekvence, která může být odštěpena faktorem krevní srážlivosti Xa.

Navíc se předkládaný vynález týká způsobu výroby těchto fúzních proteinů metodami genetického inženýrství a jejich použití pro screening léčiv, diagnózu a terapii. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů je možno nalézt v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/29 458 a WO 94/22 914.

Proteiny mohou být chemicky konjugovány nebo exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny umožňující produkci zvýšených koncentrací v expresním systému v porovnání s nefuzovaným proteinem. Fúzní partner může napomáhat při poskytování T-helperových epitopů (imunologický fúzní partner), s výhodou T-helperových epitopů rozpoznávaných člověkem, nebo napomáhat při expresi proteinu (látka zesilující expresi) s vyššími výtěžky než u nativního rekombinantního proteinu. Fúzní partner bude s výhodou jak imunologický fuzní partner, tak i partner zesilující expresi.

Mezi fúzní partnery patří protein D z Haemophillus influenzae a nestruktumí protein viru chřipky, NS1 (hemaglutinin). Dalším fúzním partnerem je protein známý jako LytA. S výhodou se používá C- koncové části molekuly. Protein LytA je odvozen ze Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu, amidázu LytA (kódovanou genem lytA {Gene, 43 (1986), str. 265-272}), autolyzin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanové kostře. C-koncová doména proteinu LytA je odpovědná za afinitu k cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využívána pro vývoj plazmidů E. coli exprimujících C-LytA použitelných pro expresi fúzních proteinů. Purifikace hybridních proteinů obsahujících fragment C-LytA na svém aminovém konci již byla popsána {Biotechnology: 10, (1992), str. 795-798}. Je možné používat opakující se část molekuly LytA, která se nalézá na C-konci počínaje zbytkem 178, například zbytky 188 až 305.

Předkládaný vynález také zahrnuje varianty výše uvedených polypeptidů, tj.polypeptidy, které se od referenčních polypeptidů liší substitucemi konzervativních aminokyselin, přičemž zbytek je substituován jiným zbytkem s podobnými vlastnostmi. Takové typické substituce probíhají mezi

-4CZ 296086 B6

Ala, Val, Leu a Ile; mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi bazickými zbytky Lys a Arg; nebo aromatickými zbytky Phe a Tyr.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem. Mezi tyto polypeptidy patří izolované v přírodě se vyskytující polypeptidy, rekombinantním způsobem vyráběné polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy vyrobené kombinací těchto metod. Způsoby výroby takových polypeptidů jsou v oboru dobře známy.

Nejvýhodnější je, jestliže je polypeptid podle vynálezu odvozen z Moraxella catarrhalis, ačkoli může být s výhodou získán i z jiných organismů stejného taxonomického rodu. Polypeptid podle vynálezu může být také získán například z organismů stejné taxonomické třídy nebo řádu.

Polynukleotidy

Předmětem vynálezu je poskytnutí polynukleotidů, které kódují polypeptidy BASB027, zvláště polynukleotidů kódujících polypeptidy označované zde jako BASB027.

Zvláště výhodné provedení vynálezu představuje polynukleotidy zahrnující oblast kódující polypeptidy BASB027 obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3, které zahrnují gen v úplné délce nebo jeho variantu.

Polynukleotidy BASB027 poskytované v SEQ ID No. 1 nebo 3 jsou polynukleotidy BASB027 z Moraxella catarrhalis kmen Mc2931(ATCC 43617).

Jako další provedení vynálezu se poskytují izolované molekuly nukleových kyselin kódující a/nebo exprimující polypeptidy a polynukleotidy BASB027, zvláště polypeptidy a polynukleotidy BASB027 Moraxella catarrhalis, včetně například nezpracovaných (neprocesovaných) RNA, ribozymových RNA, mRNA, cDNA, genomových DNA, B- a Z-DNA. Mezi další provedení vynálezu patří biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné polynukleotidy a polypeptidy a jejich varianty a prostředky s jejich obsahem.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká izolovaných polynukleotidů, včetně alespoň jednoho genu s úplnou délkou, které kódují polypeptid BASB027 s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 a polynukleotidy, které jsou s nimi úzce příbuzné, včetně jejich variant.

V dalším výhodném provedení vynálezu je poskytován polypeptid BASB027 z Moraxella catarrhalis, obsahující nebo složený z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo jeho varianta.

Použitím zde poskytovaných informací, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3, může být získán polynukleotid podle vynálezu kódující polypeptid BASB027, použitím standardních metod klonování a screeningu, jako jsou metody klonování a sekvenování fragmentů chromozomální DNA z bakterií s použitím buněk Moraxella catarrhalis Catlin jako výchozího materiálu, s následným získáním klonu s úplnou délkou. Například pro získání polynukleotidová sekvence podle vynálezu, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3, se typicky testuje knihovna klonů chromozomální DNA Moraxella catarrhalis Catlin v E. coli nebo některém jiném vhodném hostiteli pomocí radioaktivně značeného oligonukleotidů, s výhodou 17-meru nebo delšího, odvozeného z částečné sekvence. Klony nesoucí DNA identickou s DNA sondy, mohou být potom rozlišeny použitím stringentních podmínek hybridizace. Sekvenováním jednotlivých klonů takto identifikovaných hybridizací se sekvenačními primeiy navrženými pro originální polypeptidovou nebo polynukleotidovou sekvenci je potom možné prodlužovat polynukleotidovou sekvenci v obou směrech pro určení sekvence genu v úplné délce. Běžně se toto sekvenování provádí například použitím denaturované dvojřetězcové DNA připravené z plazmidového klonu. Vhodné způsoby se popisují v Maniatis, T.,

-5CZ 296086 B6

Fritsch. E. F. a Sambrook a další, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. vyd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (viz Screening By Hybridization 1.90 a Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Může být také provedeno přímé sekvenování genomické DNA pro získání sekvence genu v úplné délce. Pro 5 ilustraci vynálezu, každý polynukleotid uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3 byl objeven v knihovně DNA odvozené z Moraxella catarrhalis.

Navíc obsahuje každá sekvence DNA uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3 otevřený čtecí rámec kódující protein, který má přibližně stejný počet aminokyselinových zbytků, jako je uvedený ío v SEQ ID No. 2 nebo 4, s dedukovanou molekulovou hmotností, která může být vypočtena použitím hodnot molekulové hmotnosti aminokyselinových zbytků dobře známých odborníkům v oboru.

Polynukleotid SEQ ID No. 1, mezi startovacím kodonem na nukleotidu č. 1 a stopkodonem, který 15 začíná na nukleotidu č. 2440 SEQ ID No. 1, kóduje polypeptid SEQ ID No. 2.

Polynukleotid SEQ ID No. 3, mezi startovacím kodonem na nukleotidu č. 1 astopkodonem, který začíná na nukleotidu č. 2440 SEQ ID No. 3, kóduje polypeptid SEQ ID No. 4.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález izolovaný polynukleotid, který obsahuje nebo který se skládá z:

(a) polynukleotidové sekvence, která má alespoň 85 % identitu, stí s výhodou alespoň 90 % identitu, výhodněji alespoň 95 % identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99 % nebo přesnou identitu se SEQ ID No. 1 nebo 3 po celé délce SEQ ID No. 1, popřípadě 3; nebo (b) polynukleotidové sekvence kódující polypeptid, který má alespoň 85 % identitu, s výhodou alespoň 90 % identitu, výhodněji alespoň 95 % identitu, ještě výhodněji s výhodou alespoň 97 až 99 % nebo 100 % přesnou identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4, po celé délce SEQ ID No. 2, popřípadě 4.

Polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu, včetně homologů a orthologů z druhů jiných než Moraxella catarrhalis, může být získán způsobem zahrnujícím kroky screeningu vhodné knihovny za stringentních podmínek hybridizace (například použitím teploty 35 v rozmezí 45 až 65 °C a koncentrace SDS od 0,1 do 1 %) se značenou nebo detekovatelnou sondou, která se skládá nebo která obsahuje sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3 nebo její fragment; a izolace genu s úplnou délkou a/nebo genomických klonů obsahujících uvedenou polynukleotidovou sekvenci.

Vynález poskytuje polynukleotidovou sekvenci, která je identická po celé její délce s kódující sekvenci (otevřený čtecí rámec) v SEQ ID No. 1 nebo 3. Vynález také poskytuje kódující sekvenci zralého polypeptidů nebo jeho fragmentu samotného stejně jako kódující sekvence pro zralý polypeptid nebo fragment ve čtecím rámci s další kódující sekvencí, jako je sekvence kódující úvodní nebo sekreční sekvenci, pre- nebo pro- nebo prepro-proteinovou sekvenci.

Polynukleotid podle vynálezu může také obsahovat alespoň jednu nekódující sekvenci, včetně například bez omezení alespoň jedné nekódující sekvence 5' a 3', jako jsou přepisované ale nepřekládané sekvence, terminační signály (jako jsou rho-dependentní a rho-independentní terminační signály), ribosomová vazebná místa, Kozákovy sekvence, sekvence stabilizující mRNA, introny a polyadenylační signály. Polynukleotidová sekvence může také obsahovat další kódující 50 sekvenci, která kóduje další aminokyseliny. Může být například kódována sekvence markem, která umožňuje čištění fúzovaného polypeptidů. V někteiých provedeních vynálezu je markerovou sekvencí hexa-histidinový peptid, jak se poskytuje ve vektoru pQE (Qiagen, lne.) a který je popsán v Gentz a další, Proč. Nati. Acad. Sci.. USA 86: 821-824 (1989), nebo HA peptidový tag (Wilson a další, Cell 37: 767 (1984), kde obě tyto sekvence mohou být použitelné při čištění polypeptidové sekvence, která je s nimi fúzována. Polynukleotidy podle vynálezu také bez ome

-6CZ 296080 B6 zení zahrnují polynukleotidy obsahující strukturní gen a jeho přirozeně asociované sekvence, které řídí expresi genu.

Nukleotidová sekvence kódující BASB027 polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4 může být identická s polypeptidovou kódující sekvencí obsaženou v nukleotidech 1 až 2439 SEQ ID No. 1, popřípadě 3. Alternativně může jít o sekvenci, která je výsledkem redundance (degenerace) genetického kódu, která také kóduje polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4.

Termín pólynukleotid kódující polypeptid, jak se zde používá, zahrnuje polynukleotidy, které obsahují sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, zvláště bakteriální polypeptid a lépe polypeptid Moraxella catarrhalis BASB027 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 2 nebo 4. Tento termín také zahrnuje polynukleotidy, které obsahují jedinou spojitou oblast nebo nespojité oblasti kódující polypeptid (například polynukleotidy přerušené integrovaným fágem, integrovanou inzerční sekvencí, integrovanou vektorovou sekvencí, integrovanou transpozonovou sekvencí, nebo v důsledku editace RNA nebo reorganizace genomické DNA) spolu s dalšími oblastmi, které mohou také obsahovat kódující a/nebo nekódující sekvence.

Vynález se dále týká variant zde popisovaných polynukleotidů, které kódují varianky polypeptidu s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4. Fragmenty polynukleotidů podle vynálezu mohou být použity například pro syntézu polynukleotidů podle vynálezu s úplnou délkou.

Další zvláště výhodná provedení představují polynukleotidy kódující varianty BASB027, které mají aminokyselinovou sekvenci polypeptidů BASB027 SEQ ID No. 2 nebo 4, ve kterých je několik, málo, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádná aminokyselina substituováno, modifikováno, deletováno a/nebo adováno, a to v jakékoli kombinaci. Zvláště výhodné mezi těmito záměnami jsou mlčící (silent) substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti a aktivity polypeptidů BASB027.

Další výhodné provedení vynálezu jsou polynukleotidy, které mají alespoň 85 % identitu po celé jejich délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB027, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 2 nebo 4, a polynukleotidy, které jsou s těmito polynukleotidy komplementární. Alternativně jsou nejvýhodnější polynukleotidy, které obsahují oblast alespoň z 90 % identickou po celé své délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB027 a polynukleotidy s nimi komplementární. V tomto smyslu jsou zvláště výhodné polynukleotidy s alespoň 95 % identitou po celé své délce. Navíc jsou mezi molekulami s identitou alespoň 95 % vysoce výhodné polynukleotidy s alespoň 97 % identitou, a mezi těmito polynukleotidy jsou zvláště výhodné polynukleotidy s identitou alespoň 98 % a alespoň 99 %, přičemž ještě výhodnější jsou polynukleotidy s identitou alespoň 99 %.

Výhodná provedení představují polynukleotidy kódující polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako zralý polypeptid kódovaný DNA SEQ ID No. 1 nebo 3.

Podle některých výhodných provedení předkládaného vynálezu se poskytují polynukleotidy, které hybridizují, zvláště za stringentních podmínek, s polynukleotidovými sekvencemi BASB027, jako jsou polynukleotidy SEQ ID No. 1 nebo 3.

Vynález se dále týká polynukleotidů, které hybridizují s poskytovanými polynukleotidovými sekvencemi. V tomto smyslu se vynález týká zvláště polynukleotidů, které hybridizují s popisovanými polynuklelotidy za stringentních podmínek. Jak se zde používá, termíny stringentní podmínky a stringentní podmínky hybridizace znamenají, že k hybridizaci dojde pouze v tom případě, kdy mezi sekvencemi existuje alespoň 95 %, a s výhodou alespoň 97 % identita. Specifickým příkladem stringentních podmínek hybridizace je inkubace přes noc při 42 °C v

-7CZ 296086 B6 roztoku obsahujícím: 50 % formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrát trisodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10 % sulfát dextranu, 20 pg/ml denaturované, působením střihu rozbité DNA lososího spermatu, s následným promytím hybridizačního nosiče v 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Hybridizace a podmínky praní jsou dobře známy a příklady se uvádějí v knize Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.. (1989), zvláště kapitola 11. Pro polynukleotidové sekvence poskytované vynálezem může být také použita hybridizace v roztoku.

Polynukleotid podle vynálezu se může skládat nebo může obsahovat polynukleotidovou sekvenci získanou screeningem vhodné knihovny obsahující kompletní gen pro polynukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No. 1 nebo 3 za stringentních podmínek hybridizace se sondou, která má sekvenci uvedené polynukleotidové sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3 nebo jejího fragmentu; a izolací uvedené polynukleotidové sekvence. Fragmenty použitelné pro získání takového polynukleotidů zahrnují například sondy a příměry, které budou úplně popsány na jiných místech.

Jak bude diskutováno dále vzhledem k polynukleotidovým analýzám podle vynálezu, polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity jako hybridizaČní sonda pro RNA, cDNA a genomickou DNA pro izolaci cDNA s úplnou délkou a genomických klonů kódujících BASB027 a pro izolaci cDNA a genomických klonů jiných genů, které mají vysokou identitu, zvláště vysokou sekvenční identitu, s genem BASB027. Tyto sondy budou obecně obsahovat alespoň 15 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Tyto sondy budou s výhodou obsahovat alespoň 30 nukleotidových zbytků nebo párů bází a mohou obsahovat alespoň 50 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Zvláště výhodné sondy budou obsahovat alespoň 20 nukleotidových zbytků nebo párů bází a budou obsahovat méně než 30 nukleotidových zbytků nebo párů bází.

Kódující oblast genu BASB027 může být izolována použitím screeningu pomocí sekvence DNA poskytované v SEQ ID No. 1 nebo 3 pro syntézu oligonukleotidové sondy. Značený oligonukleotid se sekvencí komplementární k sekvenci genu podle vynálezu se potom použije pro screening knihovny cDNA, genomické DNA nebo mRNA pro určení, které z členů knihovny se sondou hybridizují.

Existuje několik dostupných a odborníkům v oboru dobře známých metod pro získání DNA s úplnou délkou nebo pro prodloučení krátkých DNA, například metod založených na způsobu nazvaném Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) (viz například Frohman, a další, PNAS USA 85: 8 998 - 9 002, 1988). V poslední době vyvinuté modifikace tohoto způsobu, jejichž příklad je technologie Marathon™ (Clontech Laboratories lne.), mají výrazně zjednodušené hledání delších cDNA. Při technologii Marathon™ byly připraveny cDNA z mRNA extrahované ze zvolené tkáně a adaptorové sekvence navázané na oba konce. Potom se provede amplifikace nukleové kyseliny (PCR) pro amplifikaci chybějícího 5'-konce DNA s použitím kombinace oligonukleotidových primem specifických pro gen a adaptor. Reakce PCR se potom opakuje s použitím nested příměrů, tj. primem navržených tak, aby teplotně hybridizovaly s amplifikovaným produktem, typicky přiměř specifický pro adaptor, který teplotně hybridizuje dále ve směru 3' v adaptorové sekvenci a přiměř specifický pro gen, který teplotně hybridizuje dále ve směru 5' ve zvolené genové sekvenci. Produkty této reakce mohou být potom analyzovány sekvenováním DNA a DNA s úplnou délkou může být zkonstruována buď spojením produktu přímo s existující DNA za získání úplné sekvence, nebo provedením oddělené PCR s úplnou délkou, využívající nové informace o sekvencí pro návrh 5'primerů.

Polynukleotidy a polypeptidy podle vynálezu mohou být použity například jako reakční činidla a materiály pro výzkum léčení a diagnózy onemocnění, zvláště onemocnění člověka, jak bude diskutováno dále v souvislosti s testy polynukleotidů.

Polynukleotidy podle vynálezu, které jsou oligonukleotidy odvozené ze sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3, mohou být použity při popisovaném způsobu, ale s výhodou pro PCR, pro určení, zda jsou nebo nejsou zde identifikované polynukleotidy v úplnosti nebo zčásti transkribovány

-8CZ 296086 B6 v bakterii v infikované tkáni. Uvádí se, že tyto sekvence budou také použitelné při diagnóze stadia infekce a typu infekce, kterou patogen vyvolal.

Vynález také poskytuje polynukleotidy kódující polypeptid, který je zralý protein plus další aminokoncové nebo karboxykoncové aminokyseliny, nebo aminokyseliny uvnitř zralého polypeptidů (například jestliže má zralý protein více než jeden polypeptidový řetězec). Tyto sekvence mohou mít úlohu při zpracování (procesingu) proteinu z prekurzoru do zralé formy, mohou umožnit transport proteinu, mohou prodlužovat nebo zkracovat poločas proteinu nebo mohou umožňovat manipulaci s proteinem pro testování nebo výrobu. Jak je tomu obecně in vivo dodatečné aminokyseliny mohou být odděleny od zralého proteinu buněčnými enzymy.

Pro každý z polynukleotidů podle vynálezu se poskytuje polynukleotid, který je k němu komplementární. Je výhodné, jestliže jsou tyto komplementární polynukleotidy zcela komplementární s každým nukleotidem, se kterým jsou komplementární.

Prekurzorový protein, který má zralou formu polypeptidů fúzovanou s jednou nebo více prosekvencemi, může být inaktivní formou polypeptidů. Jestliže se prosekvence odstraní, tyto inaktivní prekurzory se obecně aktivují. Některé nebo všechny z těchto prosekvencí mohou být před aktivací odstraněny. Tyto prekurzory se obecně nazývají proproteiny.

Navíc ke standardním značkám A, G, C, T/U pro nukleotidy může být pro popis některých polynukleotidů podle vynálezu použit také termín N. N znamená, že v takto označené poloze v sekvenci DNA nebo RNA může být přítomen jakýkoli ze čtyř DNA nebo RNA nukleotidů, a kromě toho je výhodné, jestliže N není nukleová kyselina, která v kombinaci se sousedícími nukleotidovými polohami, čtenými ve správném čtecím rámci, má za následek vytvoření kodonu předčasné terminace v tomto čtecím rámci.

V souhrnu, polynukleotid podle vynálezu může kódovat zralý protein, zralý protein plus úvodní sekvenci, který může být označen jako preprotein), prekurzor zralého proteinu obsahující jednu nebo více prosekvencí, které nejsou úvodními sekvencemi preproteinu nebo preproproteinu, který je prekurzor proproteinu, obsahující úrovní sekvenci a jednu nebo více prosekvencí, které se obecně odstraňují v průběhu kroků zpracování (procesingu), které poskytnou aktivní a zralé formy polypeptidů.

Polynukleotidů podle vynálezu se může používat pro terapeutické nebo profylaktické účely, zvláště genetickou imunizaci.

Použití polynukleotidů podle vynálezu při genetické imunizaci bude s výhodou používat vhodný způsob dodávání, jako je přímá injekce plazmidové DNA do svalů (Wolff a další, Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe a další, Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), dodání DNA v komplexu se specifickými proteinovými nosiči (Wu a další, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), koprecipitace DNA s fosforečnanem vápenatým (Benvenisty &Reshef. PNAS USA (1986) V 83: 9551), zapouzdení DNA do různých forem liposomů (Kaneda a další. Science (1989) 243: 375), bombardování částicemi (Tang a další, Nátuře (1992) 356: 152, Eisenbraun a další, DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) a infekce in vivo s použitím klonovaných retrovirových vektorů (Seeger a další, PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vektory, hostitelské buňky, expresní systémy

Předkládaný vynález se také týká vektorů, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk, které jsou vyrobeny metodami genetického inženýrství s vektory podle vynálezu a výroby polypeptidů podle vynálezu rekombinačními technikami. Pro výrobu těchto proteinů s použitím RNA odvozených z konstruktů DNA podle vynálezu mohou být také použity bezbuněčné translační systémy.

-9CZ 296086 B6

Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsoby dobře známými odborníkům v oboru z hostitelských buněk získaných metodami genetického inženýrství obsahujících expresní systémy. V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká expresních systémů, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle předkládaného 5 vynálezu, hostitelských buněk, které jsou získány metodami genetického inženýrství s těmito expresními systémy, a produkce polypeptidů podle vynálezu rekombinantními technikami.

Pro rekombinantní produkci polypeptidů podle vynálezu mohou být hostitelské buňky upraveny metodami genového inženýrství tak, aby obsahovaly expresní systémy nebo jejich části nebo 10 polynukleotidy podle vynálezu. Zavedení polynukleotidů do hostitelské buňky může být uskutečněno způsoby popsanými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako je Davis a další, Basic Methods in Molecular Biology, (1986) a Sambrook, a další, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), jako je transfekce s použitím fosforečnanu vápenatého, transfekce zprostředkovaná 15 DEAE-dextranem, transvekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovými lipidy, elektroporace, transdukce, vnášení škrabáním, balistické vnášení a infekce.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako jsou buňky streptokoků, stafylokoků, enterokoků, E. coli, streptomycet, kyanobakterií, Bacillus subtilis, Neisseria 20 meningitidis a Moraxella catarrhalis; houbové buňky, jako jsou buňky kvasinek, Kluveromyces, Saccharoinyces a basidiomycet, Candida albicans a Aspergillus; hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, Cl 27,3T3, BHK, 293, CV-1 a buňky Bowesova melanomu; a rostlinné buňky jako jsou buňky gymnospermu nebo angiospermu.

Pro výrobu polypeptidů podle vynálezu může být použita celá řada expresních systémů. Mezi tyto vektory patří mj. vektory odvozené z chromozomů, episomů a virů, například vektory odvozené z bakteriálních plazmidů, z bakteriofágů, z transposonů, z kvasinkových episomů, z inzerčních elementů, z kvasinkových chromozomálních elementů, z virů jako jsou bakuloviry, 30 papovaviry, jako SV40, viry vakcinie, adenoviry, viry drůbežích neštovic, viry pseudorabies, pikomaviry, retroviry a alfaviry a vektory odvozené z jejich kombinací jako jsou vektory odvozené z plazmidových a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fágmidy. Konstrukty expresního systému mohou obsahovat řídící oblasti, které regulují a podporují expresi. Obecně může být pro expresi v tomto smyslu použit jakýkoli systém nebo vektor vhodný 35 pro udržování, propagaci nebo expresi polynukleotidů a/nebo pro expresi polypeptidů u hostitele.

Vhodná sekvence DNA může být do expresního systému vložena jakýmkoli z řady dobře známých a rutinních způsobů, jako jsou například postupy uváděné v Sambrook a další, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (výše).

V rekombinantních expresních systémech u eukaryot mohou být do exprimovaného polypeptidů zahrnuty vhodné sekreční signály pro sekreci překládaného proteinu do lumen endoplasmatického retikula, do periplasmatického prostoru nebo do extracelulámího prostředí. Tyto signály mohou být vzhledem k polypeptidů endogenní nebo může jít o heterologní signály.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány a čištěny z rekombinantních buněčných kultur pomocí dobře známých metod včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakce kyselinou, aniontové nebo kationtové iontoměničové chromatografie, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie s využitím hydrofobních interakcí, afínitní chromatografie, chromatografie na hydroxylapatitu a lektinové chromatografie. Nejvýhodněji se pro purifíkaci 50 používá afínitní chromatografie s využitím kovových iontů (IMAC). Dobře známé techniky pro skládání prostorové struktury (refolding) proteinů mohou být použity pro regeneraci aktivní konformace, jestliže se polypeptid v průběhu intracelulámí syntézy, izolace a/nebo purifíkace denaturuje.

-10CZ 296086 B6

Expresní systém může být také rekombinantní živý mikroorganismus, jako je virus nebo bakterie. Příslušný gen může být vložen do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Inokulace a infekce tímto živým vektorem in vivo povede k expresi in vivo antigenu a indukci imunitních odpovědí. Viry a bakterie používané pro tyto účely jsou například: viry planých neštovic (např. vakcinie, drůbeží neštovice, kanáři neštovice (canary pox); alfaviry (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus Venezuelian Echin Encephalitis), adenoviry, viry asociované s adenoviry, pikomaviry (poliovirus, rhinovirus), herpesviry (virus varicella zoster atd.), Listena, Salmonella, Shigella, BCG. Tyto viry nebo bakterie mohou být stí virulentní nebo různými způsoby oslabené pro získání živých vakcín. Tyto živé vakcíny rovněž tvoří část vynálezu.

Diagnostické, prognostické, sérotypové a mutační testy

Předkládaný vynález se týká také použití polynukleotidů a polypeptidu BASB027 podle vynálezu jako diagnostických činidel. Detekce polynukleotidů a/nebo polypeptidu BASB027 u eukaryot, zvláště u savců a zvláště u člověka poskytne diagnostickou metodu pro diagnózu onemocnění, fáze onemocnění nebo odpovědi infekčního organismu na léky. Eukaryotické organismy, zvláště savci a zejména lidé, zvláště infikovaní nebo s podezřením na infekci organismem obsahujícím gen nebo protein BASB027, mohou být detekovány na úrovni nukleových kyselin nebo aminokyselin řadou dobře známých způsobů stejně jako způsoby poskytovanými v předkládaném vynálezu.

Polypeptidy a polynukleotidy pro prognózu, diagnózu nebo jiné analýzy mohou být získány z tělesných materiálů domněle infikovaných a/nebo infikovaných jednotlivců. Polynukleotidy z jakéhokoli z těchto zdrojů, zvláště DNA nebo RNA, mohou být použity přímo pro detekci nebo mohou být enzymaticky amplifikovány použitím PCR nebo jiné techniky amplifikace před analýzou. RNA, zejména mRNA, cDNA a genomická DNA mohou být při těchto testech použity také. S použitím amplifikace, charakterizace druhu a kmene infekčního nebo residentního organismu přítomného u jednotlivce může být prováděna analýza genotypu zvoleného polynukleotidů organismu. Delece a inzerce mohou být detekovány změnou velikosti amplifikovaného produktu v porovnání s genotypem referenční sekvence vybrané z příbuzného organismu, s výhodou různého druhu stejného rodu nebo různého kmenu stejného druhu. Bodové mutace mohou být identifikovány hybridizací amplifikované DNA se značenými polynukleotidovými sekvencemi BASB027. Dokonale nebo výrazně souhlasící sekvence mohou být odlišeny od nedostatečně souhlasících nebo výrazněji nesouhlasících duplexů štěpením DNázou nebo RNázou v případě DNA. popřípadě RNA. nebo detekcí rozdílů v teplotách tání nebo s využitím kinetiky renaturace. Rozdíly v polynukleotidové sekvenci mohou být také detekovány změnami v elektroforetické pohyblivosti polynukleotidových fragmentů v gelech v porovnání s referenční sekvencí. To může být provedeno bez denaturačních činidel. Rozdíly mezi polynukleotidy mohou být také detekovány přímým sekvenováním DNA nebo RNA, viz například Myers a další, Science, 230: 1242 (1985).

Změny sekvence ve specifických místech mohou být také odhaleny testy s nukleázovou ochranou, jako je test s RNázovou ochranou, VI a Sl, nebo metodou chemického štěpení, viz například Cotton a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85: 4 397 - 4 401 (1985).

V dalším provedení může být zkonstruována řada oligonukleotidových sond obsahujících nukleotidovou sekvenci BASB027 nebo její fragmenty pro provedení účinného screeningu například na genetické mutace, sérotyp, taxonomickou klasifikaci nebo identifikaci. Metody s použitím souboru (array) sond jsou dobře známé a jsou obecně použitelné a mohou být použity pro řešení řady otázek v souvislosti s molekulární genetikou včetně genové exprese, genetické vazby a genetické variability (viz například Chee a další, Science, 274: 610 (1996)).

Diagnostického kitu může například obsahovat:

-11 CZ 296086 B6 (a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s výhodou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3, nebo její fragment;

(b) nukleotidovou sekvenci komplementární se sekvencí podle (a);

(c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, s výhodou polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo jeho fragment; nebo (d) protilátku proti polypeptidů podle předkládaného vynálezu, s výhodou proti polypeptidů ío SEQ ID No. 2 nebo 4.

Bude zřejmé, že v jakémkoli takovém kitu mohou podstatnou složku tvořit látky z odstavců (a), (b), (c) nebo (d). Takový kit bude použitelný mj. při diagnóze onemocnění nebo vnímavosti k onemocnění.

Polynukleotidů podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako diagnostické reagencie. Detekce mutované formy polynukleotidů podle vynálezu, s výhodou SEQ ID No. 1 nebo 3, která je spojena s onemocněním nebo patogenním vlivem, bude poskytovat diagnostický nástroj, který může přispět k diagnóze nebo definici onemocnění, prognózy nebo průběhu onemocnění, 20 určení stadia onemocnění nebo vnímavosti k onemocnění, které vede ke snížení exprese, zvýšení exprese nebo změně exprese polynukleotidů. Organismy, zvláště infekční organismy nesoucí mutace takového polynukleotidů mohou být detekovány na polynukleotidové úrovni řadou způsobů, jako například způsoby popisované v přihlášce na jiných místech.

Buňky z organismu nesoucí mutace nebo polymorfismy (alelické variace) v polynukleotidů a/nebo polypeptidů podle vynálezu mohou být také detekovány na polynukleotidové a/nebo polypeptidové úrovni řadou technik pro zjištění například jejich sérotypu. Pro detekci mutací v RNA je například možno použít RT-PCR. Zvláště výhodné je používat RT-PCR ve spojení s automatickými detekčními systémy, jako je například GeneScan. RNA, cDNA nebo genomická 30 DNA mohou být podobně použity ke stejnému účelu PCR. Pro identifikaci a analýzu mutací mohou být například použity příměry PCR komplementární s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB027.

Předkládaný vynález dále poskytuje příměry, které mají odstraněny 1, 2, 3 nebo 4 nukleotidy 35 z 5' a/nebo 3'konce. Tyto příměry ač mohou být mimo jiné použity pro amplifikaci DNA a/nebo

RNA BASB027 izolované ze vzorku pocházejícího z jednotlivce, jako například tělesného materiálu. Příměry mohou být použity pro amplifikaci polynukleotidů izolovaného z infikovaného jedince, takže polynukleotid může být potom zpracován různými způsoby pro objasnění polynukleotidové sekvence. Tímto způsobem je možno V detekovat mutace v polynukleotidové 40 sekvenci a použít je pro diagnózu a/nebo prognózu infekce nebo jejího stadia nebo průběhu nebo pro určení sérotypu a/nebo klasifikaci infekčního činitele.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob diagnózy onemocnění, zvláště bakteriálních infekcí, výhodněji infekcí způsobených Moraxella catarrhalis, který zahrnuje určení zvýšené úrovně 45 exprese polynukleotidů se sekvencí SEQ ID No. 1 nebo 3 u vzorku z jednotlivce, jako je tělesný materiál. Zvýšená nebo snížená exprese polynukleotidů BASB027 může být měřena jakýmkoli způsobem známým v oboru pro kvantifikaci polynukleotidů, jako je například amplifíkace, PCR, RT-PCR, RNázová ochrana, northemový přenos, spektrometrie a další způsoby hybridizace.

Diagnostický test podle předkládaného vynálezu pro detekci nadměrné exprese polypeptidů BASB027 ve srovnání s normálními vzorky kontrolní tkáně může být navíc použit například pro detekci přítomnosti infekce. Způsoby použitelné pro zjištění hladin polypeptidů BASB027 ve vzorku pocházejícím z hostitele, jako například tělesného materiálu, jsou odborníkům v oboru dobře známé. Mezi tyto testovací metody patří radioimunologické analýzy, testy s kompetitivní

-12CZ 296086 B6 vazbou, analýzy pomocí westernového přenosu, sendvičové testy s použitím protilátek, detekce protilátek a testy ELISA.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity jako složky souborů (arrays) polynukleotidů, s výhodou souborů nebo mříží s vysokou hustotou. Tyto soubory s vysokou hustotou jsou použitelné zvláště pro diagnostické a prognostické účely. Soubor teček, vždy s obsahem rozdílného genu, a dále s obsahem polynukleotidů nebo polynukleotidů podle vynálezu, může být použit pro sondování, například s použitím hybridizace nebo amplifikace nukleových kyselin, pomocí sond získaných nebo odvozených z tělesného vzorku, pro zjištění přítomnosti konkrétní polynukleotidové sekvence nebo příbuzné sekvence u jedince. Taková přítomnost může ukazovat na přítomnost patogenu, zvláště Moraxella catarrhalis, a může být použitelná pro diagnózu a/nebo prognózu onemocnění nebo průběhu onemocnění. Mříž obsahující řadu variant polynukleotidové sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3 je výhodná. Výhodná je také mříž obsahující větší počet variant polynukleotidové sekvence kódující polypeptidovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo 4.

Protilátky

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu, nebo jejich varianty nebo buňky exprimující tyto polypeptidy a polynukleotidy mohou být použity jako imunogeny pro produkci protilátek imunospecifíckých pro tyto polypeptidy, popřípadě polynukleotidý.

V určitých výhodných provedeních předkládaného vynálezu se poskytují protilátky proti polypeptidům nebo polynukleotidům BASB027.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu mohou být získávány podáváním polypeptidu a/nebo polynukleotidů podle vynálezu, nebo fragmentů nesoucích epitopy polynukleotidů nebo polypeptidu podle vynálezu, a analogů jedné nebo z obou těchto látek, nebo buněk exprimujících jednu nebo obě tyto látky, nebo zvířat, s výhodou různých od člověka, použitím rutinních protokolů. Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použit jakýkoli v oboru známý způsob, který poskytuje protilátky produkované kontinuálními kulturami buněčných linií. Mezi příklady patří různé způsoby, jako se popisují například v Kohler, G. a Milstein, C., Nátuře 256: 495 - 497 (1975); Kozbor a další, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole a další, str. 77 - 96 v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne. (1985).

Techniky pro výrobu jednořetězcových protilátek patent US 4 946 778 mohou být upraveny pro výrobu jednořetězcových protilátek proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle předkládaného vynálezu. Pro expresi humanizovaných protilátek imunospecifických proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu mohou být použity také transgenní myši nebo jiné organismy nebo živočichové, jako jsou jiní savci.

Pro volbu genů protilátek s vazebnými aktivitami k polypeptidu podle vynálezu buď ze souboru v-genů, nebo lymfocytů amplifíkovaných PCR z lidí, u kterých byly screeningem zjištěny protilátky anti-BASB027 nebo z neupravených knihoven, může být použita technologie typu phage display (McCafferty, a další, (1990), Nátuře 348, 552-554; Marks, a další. (1992) Biotechnology 10, 779-783). Afinita těchto protilátek může být také zlepšena například míšením řetězců (Clackson, a další (1991) Nátuře 352: 628).

Výše popsané protilátky mohou být použity pro izolaci nebo identifikaci klonů exprimujících polypeptidy nebo polynukleotidy podle vynálezu pro vyčištění polypeptidu nebo polynukleotidů například afínitní chromatografíí.

Pro léčení infekcí, zvláště bakteriálních infekcí, mohou být tedy mj. použity protilátky proti polypeptidu BASB027 nebo polynukleotidů BASB027.

-13CZ 296086 B6

Mezi varianty polypeptidu patří antigenně, epitopově nebo imunologicky ekvivalentní varianty z příslušného provedení předkládaného vynálezu.

Protilátky nebo jejich varianty se s výhodou modifikují, aby bylo dosaženo jejich nižší imuno5 genicity u jednotlivce. Například jestliže tímto jednotlivcem je člověk, protilátka může být nejvýhodněji humanizována, přičemž oblast nebo oblasti protilátky odvozené z hybridomu se transplantují do lidské monoklonální protilátky, například jak se popisuje v Jones a další (1986), Nátuře 321, 522-525 nebo Tempest a další (1991), Biotechnology 9, 266-273.

ío Látky s antaqonistickvm a aqonistickým účinkem- testy a molekuly

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu mohou být také použity pro testování vazby substrátů a ligandů s malými molekulami, například buněk, bezbuněčných preparátů, chemických knihoven a směsí přírodních produktů. Tyto substráty a ligandy mohou být přirozené substráty 15 a ligandy, nebo mohou napodobovat jejich strukturu nebo funkci, viz např. Coligan a další, Current Protocois in Immunology 1 (2): kapitola 5 (1991).

Metody screeningu mohou jednoduše měřit vazbu sloučeniny, která má již určité předpoklady, na polypeptid nebo polynukleotid, nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid nebo poly20 nukleotid, nebo fúzní protein polypeptidu pomocí značky, která je přímo nebo nepřímo spojena se sloučeninou, která má určité předpoklady, alternativně může metoda screeningu zahrnovat kompetitivní interakce se značeným kompetitorem. Tyto metody screeningu mohou dále testovat, zda poskytuje vybraná sloučenina výsledky z hlediska signálu vytvořeného aktivací nebo inhibici polypeptidu nebo polynukleotidů s použitím detekčních systémů vhodných pro buňky obsahující 25 polypeptid nebo polynukleotid. Inhibitory aktivace se obecně testují v přítomnosti známého agonisty, přičemž se pozoruje vliv přítomnosti vybrané sloučeniny na aktivaci pomocí látky s agonistickými účinky. Při metodách screeningu na látky s inverzně agonistickými nebo inhibičními účinky mohou být použity konstitutivně aktivní polypeptidy a/nebo konstitutivně exprimované polypeptidy a polynukleotidy v nepřítomnosti látky s agonistickými nebo inhibičními 30 účinky testováním, zda přítomnost vybrané sloučeniny vede k inhibici nebo aktivaci polypeptidu nebo polynukleotidů, jak by měla v konkrétním případě nastat. Metody screeningu mohou dále jednoduše zahrnovat kroky míšení vybrané testované sloučeniny (kandidát) s roztokem obsahujícím polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu za vytvoření směsi, měření aktivity polypeptidu a/nebo polynukleotidů BASB027 ve směsi a porovnání aktivity polypeptidu 35 a/nebo polynukleotidů BASB027 ve směsi se standardem. Pro vysoce výkonné testy pro identifikaci antagonistů polypeptidu podle předkládaného vynálezu, stejně jako fylogeneticky a/nebo funkčně příbuzných polypeptidu mohou být také použity fúzní proteiny, jako například látky připravené z části Fc a polypeptidu BASB027, jak bylo popsáno výše (viz D. Bennett a další, J. Mol. Recognition, 8: 52-58 (1995); a K. Johanson a další, J. Biol. Chem., 270 (16): 9459 - 9471 40 (1995)).

Polynukleotidy, polypeptidy a protilátky, které se vážou na a/nebo interagují s polypeptidem podle předkládaného vynálezu, mohou být také použity pro konfiguraci metod screeningu pro detekci vlivu přidaných sloučenin na produkci mRNA a/nebo polypeptidu v buňkách. Například 45 je možno zkonstruovat test ELISA pro měření hladin sekrenovaného polypeptidu nebo polypeptidu asociovaného s buňkou s použitím monoklonálních a polyklonálních protilátek standardními metodami známými v oboru. Tato metoda může být použita pro odhalení látek, které mohou inhibovat nebo zesilovat produkci polypeptidu (nazývané také látky s antagonistickými, popřípadě agonistickými účinky) z vhodně manipulovaných buněk nebo tkání.

Podle vynálezu se také může provádět screening sloučenin pro identifikaci, které z nich zesilují (agonistické látky) nebo blokují (antagonistické látky) působení polypeptidu nebo polynukleotidů BASB027, zvláště těch sloučenin, které jsou bakteriostatické a/nebo baktericidní. Při metodě screeningu je možno používat techniky s vysokým výkonem. Například pro screening na látky 55 s agonistickým nebo antagonistickým účinkem se syntetická reakční směs, buněčný kompart

- 14CZ 296086 B6 ment, jako je membrána, buněčný obal nebo buněčná stěna, nebo preparát jakéhokoli z těchto prvků obsahující polypeptid BASB027 a značený substrát nebo ligand takového polypeptidu inkubují v nepřítomnosti nebo přítomnosti testované molekuly, kterou může být agonista nebo antagonista BASB027. Schopnost testované molekuly agonizovat nebo antagonizovat polypeptid BASB027 se odráží ve snížené vazbě značeného ligandu nebo snížené tvorbě produktu z tohoto substrátu. Molekuly, které se pouze vážou, tj. bez indukce efektů polypeptidu BASB027, jsou nej pravděpodobněji dobrými antagonisty. Molekuly, které se dobře vážou a v jednotlivých případech mohou zvyšovat míru tvorby produktu ze substrátu, zvyšovat přenos signálu nebo zvyšovat aktivitu chemického kanálu, jsou agonisté. Detekce rychlosti nebo míry, vždy podle konkrétního případu, tvorby produktu ze substrátu, přenosu signálu nebo aktivity chemického kanálu může být zvýšena použitím reporterového systému. Reportérové systémy, které mohou být v tomto ohledu použitelné, zahrnují bez omezení kolorimetrické metody, přeměnu značeného substrátu na produkt, reportérovy gen odpovědný za změny v aktivity polynukleotidů nebo polypeptidu BASB027, a v oboru aer známé vazebné testy.

Dalším příkladem testu na agonisty BASB027 je kompetitivní test, který kombinuje BASB027 a látku s potenciálními agonistickými účinky s molekulami, které se vážou na BASB027, rekombinantními vazebnými molekulami na BASB027, přirozenými substráty nebo ligandy, nebo látkami napodobujícími ligandy, za vhodných podmínek pro test využívající kompetitivní inhibice. BASB027 může být označen, například radioaktivně nebo sloučeninou zjistitelnou kolorimetricky, takže počet molekul BASB027 navážených na vazebnou molekulu nebo přeměněných na produkt může být přesně určen a tím může být zjištěna účinnost potenciálního antagonisty.

Mezi látky s potenciálními antagonistickými účinky patří mj. malé organické molekuly, peptidy, polypeptidy a protilátky, které se vážou na polynukleotid a/nebo polypeptid podle vynálezu, a tím inhibují nebo ruší jeho aktivitu nebo expresi. Potenciálními antagonisty mohou také být malé organické molekuly, peptid, polypeptid, jako je úzce příbuzný protein nebo protilátka, které se vážou na stejná místa na vazebné molekule, aniž by indukovaly účinky BASB027, čímž se dosáhne zabránění účinku nebo exprese polypeptidu a/nebo polynukleotidů BASB027 vyloučením polypeptidu a/nebo polynukleotidů BASB027 z vazby.

Mezi potenciální antagonisty patří malé molekuly, které se vážou na vazebné místo polypeptidu a obsadí je, čímž zabrání vazbě buněčných vazebných molekul, takže se zamezí normální biologické aktivitě. Mezi příklady malých molekul patří bez omezení malé organické molekuly, peptidy nebo molekuly podobné peptidům. Mezi další potenciální antagonisty patří molekuly antisense (viz Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boča Raton, FL (1988), kde se tyto molekuly popisují. Mezi výhodné potenciální antagonisty patří sloučeniny, které jsou s BASB027 příbuzné, a jeho varianty.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgG 1, kde fúze probíhá v oblasti závěsu. Ve zvláštním provedení může být část Fc jednoduše odstraněna zavedením štěpící sekvence, která může být odštěpena faktorem srážení krve Xa. Předkládaný vynález se dále týká způsobů výroby těchto fuzních proteinů metodami genetického inženýrství a jejich použití pro screening léčiv, diagnózu a terapii. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů je možno nalézt v mezinárodních patentových přihláškách. WO 94/29 458 a WO 94/22 914.

Každá z poskytovaných sekvencí může být použita pro objevování a vývoj antibakteriálních sloučenin. Kódovaný protein může být po expresi použit jako cíl pro screening protibakteriálních léčiv. Navíc mohou být polynukleotidové sekvence kódující aminokoncové oblasti kódovaného

-15CZ 296086 B6 proteinu nebo Shine-Delgamovu sekvenci nebo jiné sekvence umožňující translaci odpovídající mRNA použity pro konstrukci sekvencí antisenze pro řízení exprese vybraných kódujících sekvencí.

Předkládaný vynález také poskytuje použití polypeptidu, polynukleotidů, agonisty nebo antagonisty podle vynálezu pro interferenci s počáteční fyzickou interakcí mezi patogenem nebo patogeny a eukaryotickým, s výhodou savčím hostitelem odpovědným za následnou nemoc. Molekuly podle vynálezu mohou být použity zvláště při prevenci adheze bakterií, zvláště grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií na proteiny eukaryotické, s výhodou savčí extracelulámí matrice nebo do organismu zasahujících útvarů nebo proteinů extracelulámí matrice v poraněních; pro blokování adheze bakterií mezi proteiny eukaryotické, s výhodou savčí extracelulámí matrice a bakteriálními proteiny BASB027, které zprostředkují poškození tkáně; a/nebo pro blokování normálního postupu patogeneze iniciované jinak než implantací zařízení zasahujících dovnitř organismu nebo jinými chirurgickými postupy.

Podle dalšího provedení vynálezu se poskytují látky s antagonistickým a agonistickým účinkem na BASB027, s výhodou agonistické a antagonistické látky s bakteriostatickým nebo baktericidním účinkem.

Látky s antagonistickým a agonistickým účinkem podle vynálezu mohou být použity například pro prevenci, inhibici a/nebo léčení onemocnění.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká mimotopů polypeptidu podle vynálezu. Mimotop znamená peptidovou sekvenci dostatečně podobnou přirozenému peptidu (sekvencí nebo strukturou), který je schopen rozpoznání protilátkami, které rozpoznávají přirozený peptid; nebo je schopen vyvolat tvorbu protilátek, které rozpoznávají přirozený peptid při navázání na vhodný nosič.

Peptidové mimotopy mohou být navrženy pro konkrétní účel adicí, delecí nebo substitucí zvolených aminokyselin. Peptidy mohou tedy být modifikovány pro účely usnadnění konjugace s proteinovým nosičem. U některých metod chemické konjugace může být například žádoucí přidat koncový cystein. U peptidu konjugovaných s proteinovým nosičem může být vhodné přidat hydrofobní zakončení na části vzdálené od konjugovaného zakončení peptidu, takže volný nekonjugovaný konec peptidu zůstává asociován s povrchem nosného proteinu. Tak dochází k prezentaci peptidu v konformaci, která nejblíže napodobuje konformaci peptidu tak jak se nalézá u úplné nativní molekuly. Peptidy mohou být například měněny tak, aby obsahovaly N- koncový cystein a C-koncové hydrofobní amidované zakončení. Alternativně je možno provést adici nebo substituci D-stereoizomemí formy jedné nebo více aminokyselin pro vytvoření výhodného derivátu, například se zvýšenou stabilitou peptidu.

Peptidové mimotopy mohou být alternativně identifikovány použitím protilátek, které jsou samy o sobě schopny vazby na polypeptidy podle předkládaného vynálezu, použitím technik jako je technologie typu phage display (EP 0 552 267 Bl). Tato technika poskytuje velký počet peptidových sekvencí, které napodobují strukturu nativních peptidu, a jsou proto schopny vazby na antinativní peptidové protilátky, ale nemusí mít nezbytně významnou sekvenční homologii s nativním polypeptidem.

Vakcíny

Vynález může být využit pro indukci imunologické odpovědi u jednotlivce, zvláště savce, s výhodou u lidí, způsobem, který zahrnuje inokulaci jednotlivce polynukleotidem a/nebo polypeptidem BASB027, nebo jeho fragmentem nebo variantou, které postačují pro produkci protilátky a/nebo pro vyvolání imunitní odpovědi T-buněk pro ochranu uvedeného jednotlivce před infekcí, zvláště bakteriální infekcí a zejména infekcí Moraxella catharrhalis. Poskytují se také metody, při kterých tato imunologická odpověď zpomaluje replikaci bakterií. Ještě další

-16CZ 296086 B6 využití vynálezu se týká způsobu indukce imunitní odpovědi u jednotlivce, který zahrnuje dodání nukleové kyseliny jako vektoru, sekvence nebo ribozymu do jednotlivce pro přímou expresi polynukleotidů a/nebo polypeptidu BASB027, nebo jeho fragmentu nebo varianty pro expresi polynukleotidů a/nebo polypeptidu BASB027, nebo jeho fragmentu nebo varianty in vivo s cílem indukovat imunitní odpověď, jako je produkce protilátky a/nebo imunitní odpověď T-buněk, včetně například T-buněk produkujících cytokiny nebo cytotoxických T-buněk, pro ochranu uvedeného jednotlivce, s výhodou člověka, před onemocněním, ať již je toto onemocnění v jednotlivci vyvinuto nebo ne. Jedním příkladem podávání genu je jeho urychlení do požadovaných buněk ve formě povlaku na částicích nebo jiným způsobem. Takový vektor nukleové kyseliny může obsahovat DNA, RNA, ribozym, modifikovanou nukleovou kyselinu, hybrid DNA/RNA, komplex DNA-protein nebo komplex RNA-protein.

V dalším provedení se vynález týká imunologického prostředku, schopného při zavedení do jednotlivce, s výhodou člověka, u něj schopen indukovat imunitní odpověď, kteiý u tohoto jednotlivce indukuje imunitní odpověď na polynukleotid BASB027 a/nebo jím že kódovaný polypeptid, přičemž prostředek obsahuje rekombinantní polynukleotid BASB027 a/nebo jím kódovaný polypeptid a/nebo obsahuje DNA a/nebo RNA kódující a exprimující antigen uvedeného polynukleotidu BASB027, polypeptidu kódovaného tímto polynukleotidem nebo jiného polypeptidu podle vynálezu. Imunitní odpověď může být použita terapeuticky nebo preventivně a může být ve formě protilátkové imunity a/nebo buněčné imunity, jako je buněčná imunita způsobená Tbuňkami CTL nebo CD4+.

Polypeptid BASB027 nebo jeho fragment může být fúzován s pomocným proteinem nebo chemickou skupinou, které mohou nebo nemusí samy o sobě produkovat protilátky, ale které jsou schopny stabilizovat první protein a vytvořit fúzovaný nebo modifikovaný protein, který bude mít antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti, a s výhodou ochranné vlastnosti. Takový fúzní rekombinantní protein s výhodou dále obsahuje antigenní pomocný protein (koprotein) jako je lipoprotein D z Haemophilus influenzae, glutathion-S-transferáza (GST) nebo betagalaktosidáza, nebo jakýkoli jiný relativně velký pomocný protein, který protein solubilizuje a umožní jeho produkci a purifikaci. Navíc může pomocný protein působit jako adjuvans ve smyslu poskytnutí generalizované stimulace imunitního systému organismu, který přijme protein. Pomocný protein může být navázán jak na aminový, tak i na karboxylový konec prvního proteinu.

Vynález poskytuje prostředky, zvláště vakcíny, a způsoby zahrnující polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle vynálezu a imunostimulační DNA sekvence, jako se popisují v Sáto, Y. a další, Science 273:352(1996).

Vynález také poskytuje způsoby použití popisovaného polynukleotidů nebo jeho určitých fragmentů, o kterých se ukázalo, že kódují nevariabilní oblasti proteinů buněčného povrchu bakterií, v konstruktech polynukleotidů použitých při těchto experimentech s genetickou imunizací ve zvířecích modelech infekce Moraxella catarrhalis. Tyto experimenty budou zvláště použitelné pro identifikaci epitopů proteinů schopných vyvolat preventivní nebo terapeutickou imunitní odpověď. Předpokládá se, že tento přístup umožní následnou přípravu určitých cenných monoklonálních protilátek odvozených z požadovaného orgánu živočicha, který úspěšně odolává odstranění infekce, pro vývoj preventivních prostředků nebo léčení bakteriální infekce, zvláště infekce Moraxella catarrhalis u savců, zvláště lidí.

Předkládaný vynález také zahrnuje vakcínu obsahující imunogenní rekombinantní polypeptid a/nebo polynukleotid podle vynálezu spolu s vhodným nosičem, jako je farmaceuticky přijatelný nosič. Protože polypeptidy a polynukleotidy se mohou v žaludku rozkládat, podávají se s výhodou parenterálně, včetně subkutánního, intramuskulámího, intravenózního nebo intradermálního podávání. Mezi formulace vhodné pro parenterální podávání patří vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické sloučeniny a roztoky, které poskytují roztoky izotonické s tělesnými tekutinami, s výhodou krví jednotlivce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující nebo zahušťující látky.

- 17CZ 296086 B6 sa

Tyto formulace mohou být přítomny v zásobnících obsahujících jednotkovou dávku nebo více dávek, například v uzavřených ampulích a zkumavkách, a mohou být skladovány v lyofilizovaném stavu, přičemž bezprostředně před použitím je nutný pouze přídavek sterilního kapalného nosiče.

Vakcína podle vynálezu může také obsahovat adjuvantní systémy pro zesílení imunogenicity prostředku. Adjuvantní systém s výhodou přednostně zesiluje odpověď typu TH1.

Imunitní odpověď může být široce rozdělena do dvou extrémních kategorií, a to humorální nebo buňkami zprostředkovaných imunitních odpovědí (tradičně charakterizovaných mechanismy ochrany působením protilátek, popřípadě buněčných efektorů). Tyto kategorie odpovědí byly označeny jako odpovědi typu TH1 (odpověď zprostředkovaná buňkami) a imunitní odpovědi typu TH2 (humorální odpověď).

Extrémní imunitní odpovědi typu TH1 mohou být charakterizovány tvorbou pro antigen specifických, haplotypově omezených cytotoxických T lymfocytů a odpovědí vyvolaných přirozenými buňkami - zabíječi. U myší jsou odpovědi typu ΊΉ1 často charakterizovány tvorbou protilátek subtypu lgG2a, zatímco u lidí odpovídají typu protilátek lgGl. Imunitní odpovědi typu ΤΉ2 jsou charakterizovány tvorbou širokého rozmezí imunoglobulinových izotypů, včetně umyší lgGl, 20 IgA a IgM.

Je pravděpodobné, že hnací silou stojící za vytvářením těchto dvou typů imunitních odpovědí jsou cytokiny. Vysoké hladiny cytokinů typu TH1 spíše upřednostňují indukci imunitních odpovědí na daný antigen zprostředkovaných buňkami, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu TH2 25 mají sklon preferovat indukci humorálních imunitních odpovědí na antigen.

Rozlišování imunitních odpovědí typu ΊΉ1 a ΊΉ2 není absolutní. Ve skutečnosti bude jednotlivec podporovat imunitní odpověď, která se popisuje jako převážně ΊΉ1 nebo převážně TH2. Pohodlné je však často uvažovat o rodinách cytokinů z hlediska skupin popisovaných v myších 30 klonech T-buněk CD4+ ve Mosmannem a Coffmanem (Mosmann, T. R. a Coffman, R.L. (1989) ΊΉ1 a TH2: different pattems of lymphokin secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradičně se odpovědi typu TH1 spojují s produkcí cytokinů INF-γ a IL-2 T-lymfocyty. Další cytokiny, které jsou často asociovány s indukcí imunitních odpovědí typu TH1, nejsou produkovány T-buňkami (jako je 11^12). Naopak odpo35 vědi typu TH2 jsou spojovány se sekrecí IL-4, IL-5, IL-6 a IL-13.

Je známo, že některé adjuvantní látky vakcín jsou zvláště vhodné pro stimulaci cytokinových odpovědí buď typu TH1 nebo TH2. Tradičně jsou nejlepšími indikátory vyvážení imunitní odpovědi asi TH1 : TH2 po vakcinaci nebo infekci přímá měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 T 40 lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem a/nebo měření poměru antigenně specifických odpovědí protilátek lgGl : IgG2a.

Adjuvans typu TH1 je tedy látka, která preferenčně stimuluje izolované populace T-buněk k produkci vysokých hladin cytokinů typu TH1 při restimulaci antigenem in vitro, a podporuje 45 vývoj jak CD8+ cytotoxických T lymfocytů, tak i antigenně specifických odpovědí imunoglobulinů spojených s izotypem typu TH1.

Adjuvans, která jsou schopná přednostně stimulovat buněčnou odpověď TH1, se popisují v mezinárodní patentové přihlášce No. WO 94/00 153 a WO 95/17 209.

Jedním takovým adjuvans je 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Ten je znám z patentu GB 2 220 211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci, který se dodává firmou Ribi Immunochem., Montana. Výhodnou formou 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A je forma popisovaná v evrops55 kém patentu 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

-18CZ 290U80 tíó

S výhodou jsou částice 3-D-MPL dostatečně malé, aby je bylo možno sterilně filtrovat membránou 0,22 μπι (evropský patent 0 689 454).

3D-MPL bude přítomen v množství 10 pg až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg na dávku, zatímco antigen bude typicky přítomen v množství v rozmezí 2 až 50 pg na dávku.

Další výhodné adjuvans zahrnuje QS21, netoxickou frakci odvozenou z kůry Quillaja Saponaria Molina vyčištěnou HPLC. Tato látka může být popřípadě smíšena s 3-De-O-acylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL), popřípadě spolu s nosičem.

Způsob výroby QS21 se popisuje v patentu US 5 057 540.

Nereaktogenní adjuvantní formulace obsahující QS21 byly již popsány dříve (WO 96/33 739). Tyto formulace obsahující QS21 a cholesterol byly ukázány jako úspěšná adjuvans stimulující TH1 při formulaci spolu s antigenem.

Další adjuvans, která jsou preferenčními stimulátory buněčné odpovědi TH1, zahrnují imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované sekvence CpG, které se popisují ve WO 96/02 555.

Kombinace různých adjuvans stimulujících TH1 jako jsou výše uvedené látky, mohou být jako adjuvans preferenčně stimulující buněčnou odpověď TH1 použity také. Například QS21 může být formulován spolu s 3D-MPL. Poměr QS21 : 3D-MPL bude typicky řádově 1 : 10 až 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí pro dosažení optimálního synergického účinkuje 2,5 : 1 až 1 : 1 3D-MPL : QS21.

S výhodou je ve vakcíně podle předkládaného vynálezu přítomen také nosič. Nosič může být emulze typu olej ve vodě nebo sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze typu olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Ve zvláště výhodném provedení se antigeny ve vakcíně podle vynálezu kombinují v takové emulzi s QS21 a 3D-MPL. Emulze typu olej ve vodě může navíc obsahovat Spán 85 a/nebo lecithin a/nebo trikaprylin.

Pro podávání člověku budou QS21 a 3D-MPL typicky ve vakcíně přítomny v množství od 1 μg do 200 pg, jako 10 až 100 pg, s výhodou 10 pg až 50 pg na dávku.

Emulze typu olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10% skvalenu, od 2 do 10% alfa-tokoferolu a od 0,3 do 3 % Tweenu 80. Poměr skvalen : alfa-tokoferol je s výhodou roven nebo menší než 1, protože tak se získají stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v množství 1 %. V některých případech může být vhodné, jestliže vakcíny podle předkládaného vynálezu budou navíc obsahovat stabilizátor.

Netoxické emulze typu olej ve vodě s výhodou obsahují netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80, ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufřem.

Zvláště silná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol ve formě emulze typu voda v oleji byla popsána ve WO 95/17 210.

Předkládaný vynález také poskytuje polyvalentní vakcínu obsahující vakcínu podle vynálezu v kombinaci s dalšími antigeny, zvláště antigeny použitelné pro léčení rakoviny, autoimunitních onemocnění a příbuzných stavů. Taková polyvalentní vakcína může obsahovat adjuvans indukující TH1, jak bylo popsáno výše.

-19CZ 296086 B6

I když byl vynález popsán ve vztahu k určitým polypeptidům a polynukleotidům BASB027, je zřejmé, že zahrnuje i fragmenty v přírodě se vyskytujících polypeptidů a polynukleotidů a podobné polypeptidy a polynukleotidy obsahující adice, delece nebo substituce, které podstat5 ným způsobem neovlivňují imunogenní vlastnosti rekombinantních polypeptidů nebo polynukleotidů.

Farmaceutické prostředky, kity a podávání ίο V dalším provedení vynálezu se poskytují prostředky obsahující polynukleotid BASB027 a/nebo polypeptid BASB027 pro podávání do buňky nebo do vícebuněčného organismu.

Vynález se také týká prostředků obsahujících polynukleotidy a/nebo polypeptidy diskutované výše nebo jejich agonisty nebo antagonisty. Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu mohou 15 být používány v kombinaci s nesterilním nebo sterilním nosičem nebo nosiči pro použití v buňkách, tkáních nebo organismech, jako například farmaceutickým nosičem vhodným pro podávání jednotlivci. Tyto prostředky obsahují například aditivní látky nebo terapeuticky účinná množství polypeptidů a/nebo polynukleotidů podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku. Tyto nosiče mohou také bez omezení obsahovat fyziologický roztok, pufrovaný 20 fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Formulace by měla být vhodná pro zamýšlený způsob podávání. Vynález se dále týká diagnostických a farmaceutických balení a kitů obsahujících jeden nebo více zásobníků naplněných jednou nebo více složkami výše uvedených prostředků podle vynálezu.

Polypeptidy, polynukleotidy a další sloučeniny podle vynálezu mohou být používány samostatně nebo spolu s jinými látkami, jako jsou například terapeuticky účinné sloučeniny.

Farmaceutické prostředky mohou být podávány účinným a vhodným způsobem včetně mj. místního, orálního, análního, vaginálního, intravenózního, intraperitoneálního, intramusku30 lámího, subkutánního, intranazálního nebo intradermálního podávání.

Při léčeni nebo jako prevence může být účinná látka podávána jednotlivci ve formě injikovatelného prostředku, například jako sterilní vodná disperze, s výhodou izotonická.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidů a/nebo polynukleotidů, jako je rozpustná forma polypeptidů a/nebo polynukleotidů podle předkládaného vynálezu, peptid nebo sloučenina s malou molekulou fungující jako agonista nebo antagonista, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou. Mezi takové nosiče patří bez omezení fyziologický roztok, pufrovaný fyziolo40 gický roztok, dextróza, voda, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických balení a kitů obsahujících jeden nebo více zásobníků naplněných jednou nebo více složkami výše uvedených prostředků podle vynálezu.

Polypeptidy, polynukleotidy a další sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podá45 vány samostatně nebo spolu s jinými sloučeninami, jako jsou například sloučeniny s léčebnými účinky. Prostředek bude upraven podle způsobu podávání, například formou systémového nebo orálního podávání. Mezi výhodné formy systémového podávání patří injekce, typicky intravenózní injekce. Mohou být použity také další varianty injekcí, jako jsou injekce subkutánní, intramuskulámí nebo intraperitoneální. Mezi alternativní prostředky pro systémové podávání 50 patří transmukosální a transdermální podávání s použitím látek napomáhajících penetraci, jako jsou soli žlučových kyselin nebo fusidové kyseliny nebo jiné detergenty. Navíc mohou být polypeptid nebo další sloučeniny podle vynálezu formulovány v enterosolventní nebo zapouzdřené formulaci, čímž je umožněno i orální podávání. Podávání těchto sloučenin může být také prováděno místně a/nebo lokalizované ve formě mastí, past, gelů, roztoků, prášků apod.

-20CZ 296086 B6

Pro podávání savcům a zvláště lidem se předpokládá, že denní dávka účinné sloučeniny bude od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, typicky přibližně 1 mg/kg. V každém případě určí skutečně použitou dávku ošetřující lékař, přičemž nejvhodnější dávka pro jednotlivce se bude lišit podle věku, hmotnosti a odpovědi konkrétního jednotlivce. Výše uvedené dávky jsou příklady v průměrných případech. Mohou samozřejmě nastat jednotlivé případy, kdy jsou oprávněny vyšší nebo nižší meze dávkování, přičemž i tato rozmezí patří do rozsahu předkládaného vynálezu.

Rozmezí požadovaných dávek závisí na volbě peptidu, cestě podávání, povaze formulace, povaze stavu pacienta a úsudku ošetřujícího lékaře. Vhodné dávky jsou však v rozmezí 0,1 až 100 pg/kg hmotnosti pacienta.

Vakcinační prostředek je vhodně ve formě injekce. Pro zvýšení imunitní odpovědi mohou být použita vhodná adjuvans. Vhodná jednotková dávka pro vakcinaci je 0,5 až 5 pg/kg antigenu, přičemž taková dávka se s výhodou podává 1 až 3 x a v intervalu 1 až 3 týdnů. V uvedeném rozmezí dávek nebudou u sloučenin podle vynálezu pozorovány žádné nepříznivé toxikologické účinky, které by vylučovaly jejich podávání jednotlivcům.

Očekává se však, že se budou vyskytovat široké variace v potřebném dávkování z hlediska druhu sloučenin, které budou k dispozici, a různým účinnostem při různých způsobech podávání. Například u orálního podávání by se dalo očekávat, že bude vyžadovat vyšší dávky než při podávání intravenózní injekcí. Variace v těchto dávkách je možno nastavit pomocí standardních empirických způsobů optimalizace, které jsou v oboru dobře známy.

Databáze sekvencí, sekvence v hmotném prostředí a algoritmy

Polynukleotidové a polypeptidové sekvence tvoří cenný zdroj informací, pomocí kterého lze určit dvojrozměrné a trojrozměrné struktury a identifikovat další sekvence s podobnou homologií. Tyto přístupy se nejčastěji uskutečňují uchováváním sekvence na počítačově čitelném médiu a potom použitím uchovaných dat v některém známém programu pro vytváření struktur makromolekul nebo pro prohledávání databáze sekvencí pomocí známých nástrojů hledání, jako je programový balík GCG.

Vynález také může být využit pro analýzu charakteristických sekvencí nebo řetězců, zvláště genetických sekvencí nebo kódovaných proteinových sekvencí. Výhodné způsoby analýzy sekvencí například zahrnují metody analýzy homologie sekvencí, jako je analýza identity a podobnosti, analýza struktury DNA, RNA a proteinů, uspořádání sekvencí, kladistická analýza, analýza sekvenčních motivů, určení otevřeného čtecího rámce, vyvolávání bází nukleových kyselin, analýza využití kodonu, sestřih bází nukleových kyselin a analýza vrcholů sekvenčního chromatogramu.

Pro provádění identifikace homologie se poskytují metody založené na počítačích. Metoda zahrnuje kroky poskytnutí první nukleotidové sekvence obsahující sekvenci polynukleotidů podle vynálezu na počítačově čitelném médiu; a porovnání uvedené první polynukleotidové sekvence s alespoň jednou polynukleotidovou nebo polypeptidovou sekvencí pro identifikaci homologie.

Počítačová metoda se také poskytuje pro provádění identifikace homologie, kde tato metoda zahrnuje kroky: poskytnutí první polypeptidové sekvence obsahující sekvenci polypeptidů podle vynálezu v počítačově čitelné formě; a porovnání uvedené první polypeptidové sekvence s alespoň jednou druhou polynukleotidovou nebo polypeptidovou sekvencí pro identifikaci homologie.

Všechny publikace a odkazy včetně bez omezení patentů a patentových přihlášek citovaných v této specifikaci jsou zařazeny ve svém celku odkazem, stejně jako by to bylo uvedeno v místě každého odkazu. Odkazem je také ve svém celku zařazena jakákoli patentová přihláška, ze které předkládaná přihláška nárokuje prioritu, způsobem popsaným výše pro publikace a odkazy.

-21 CZ 296086 B6

Definice

Identita, tak, jak je známo v oboru, je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi, podle konkrétního příkladu, určená porovnáním sekvencí. V oboru znamená termín identita také stupeň příbuznosti sekvencí mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi, podle konkrétního případu, tak, jak byla zjištěna porovnáním mezi řetězci těchto sekvencí. Identita může být snadno vypočtena známými metodami, včetně bez omezení metod popsaných v (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York. 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed, Academie Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, část 1, Griffin, A. M., a Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Hein, G., Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. a Devereux, J., ed., M. Stockton Press, New York, 1991; a Carillo, H., a Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1 073 (1988). Metody pro stanovení identity jsou navrženy tak, aby poskytly co nejvyšší souhlas mezi testovanými sekvencemi. Navíc jsou metody pro zjištění identity zakódovány do veřejně dostupných počítačových programů. Mezi počítačové programy obsahujícími metody pro zjištění identity mezi dvěma sekvencemi patří bez omezení program GAP v balíku programů GCG (Devereux, J., a další, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S. F. a další, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), a FASTA (Pearson a Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 : 2 444-2 448 (1988). Třída programů BLAST je veřejně dostupná u NCBI i z jiných zdrojů (BLAST Manual, Altschul, S., a další, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., a další, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Pro určení identity může být také použit dobře známý Smith Watermanův algoritmus. Mezi parametry pro porovnávání polypeptidových sekvencí patří následující:

Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

Porovnávací matrice: BLOSSUM62 od Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10 915-10 919 (1992)

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 8

Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 2

Program využívající těchto parametrů je veřejně dostupný jako program gap u firmy Genetics Computer Group, Madison WI. Výše uvedené parametry jsou parametry nastavené jako výchozí pro porovnávání peptidů (spolu s žádnými trastnými body za koncové mezery)

Parametry pro porovnávání polynukleotidů jsou následující:

Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Srovnávací matrice: souhlas = +10, nesouhlas = 0

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 50

Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 3

Program je dostupný jako program gap u firmy Genetics Computer Group, Madison WI. Uvedené parametry jsou nastavené jako výchozí pro porovnávání nukleových kyselin.

Výhodný význam pro identitu polynukleotidů a polypeptidů, podle konkrétního případu, se uvádí v odstavcích (1) a (2) níže.

-22CZ 296086 B6 (1) Provedení polynukleotidů dále zahrnují izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci s alespoň 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 nebo 100 % identitou vzhledem k referenční sekvenci SEQ ID No. 1, přičemž uvedená polynukleotidová sekvence může být s referenční sekvencí SEQ ID No. 1 identická nebo může obsahovat při porovnání s referenční sekvencí až do určitého celočíselného počtu nukleotidových změn, přičemž tyto změny jsou zvoleny ze skupiny alespoň jedné delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce nukleotidů, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v 5' nebo 3'koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo v kterémkoli místě mezi těmito koncovými polohami, rozprostřeny buď individuálně mezi nukleotidy v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více souvislých skupinách v rámci referenční sekvence, a kde uvedený počet nukleotidových změn je určen vynásobením celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1, nebo:

n_n < x_n - (x_n · y) kde n_n je počet nukleotidových změn, x_n je celkový počet nukleotidů v SEQ ID No. 1, y je 0,50 pro 50 %, 0,60 pro 60 %, 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 %, 0,97 pro 97 % nebo 1,00 pro 100 %, a · je symbol pro operátor násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek pro x_n a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x„. Změny polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID No. 2 mohou v této kódující sekvenci vytvořit mutace typu nonsense, missense nebo frameshift a tím změnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po těchto změnách.

Například polynukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 1, tj. může být s ní 100 % identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn nukleových kyselin ve srovnání s referenční sekvencí, takže procento identity je nižší než 100 % identita. Tyto změny jsou zvoleny ze skupiny alespoň jedné delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce nukleové kyseliny, přičemž tyto změny se mohou vyskytnout v 5' nebo 3'koncových polohách referenční polynukleotidové sekvence nebo v kterémkoli místě mezi těmito koncovými polohami, rozptýleny buď jednotlivě mezi nukleovými kyselinami v referenční sekvenci, nebo ve formě jedné nebo více spojitých skupin v rámci referenční sekvence. Počet změn nukleových kyselin pro dané procento identity se určí vynásobením celkového počtu nukleových kyselin v SEQ ID No. 1 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu nukleových kyselin v SEQ ID No. 1, nebo:

n„ < x_n - (x_n · y), kde n_n je počet změn nukleových kyselin, x_n je celkový počet nukleových kyselin v SEQ ID No. 1, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., · je symbol pro operátor násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_n a y je zaokrouhlen směrem dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x„.

(2) Provedení polypeptidů dále zahrnují izolovaný polypeptid obsahující polypeptid s alespoň 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 nebo 100 % identitou s referenční polypeptidovou sekvencí SEQ ID No. 2, kde uvedená polypeptidová sekvence může být s referenční sekvencí SEQ ID No. 2 identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí, kde uvedené změny jsou zvoleny ze skupin alespoň jedné delece, substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerce aminokyselin, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v amino- nebo karboxykoncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci nebo ve formě jedné nebo více souvislých skupin v rámci referenční sekvence, a kde uvedený počet aminokyselinových změn se určí vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2 celým číslem definujícím pro

-23CZ 296086 B6 cento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2, nebo:

n_a < x_a - (x_a y), kde n_a je počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No. 2, y je 0,50 pro 50 %, 0,60 pro 60 %, 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 %, 0,97 pro 97 % nebo 1,00 pro 100 %, a · je symbol pro operátor násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

Například polypeptidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 2, tj. může být 100 % identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu aminokyselinových změn ve srovnání s referenční sekvencí, takže procento identity je nižší než 100% identita. Tyto změny se volí ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci, substituci, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerci aminokyselin, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v amino- nebo karboxykoncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozptýleně buď jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více souvislých skupinách v rámci referenční sekvence. Počet aminokyselinových změn pro dané procento identity se stanoví vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2, nebo:

n_a < Xa - (x_a · y), kde n_a počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No. 2, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., a · je symbol pro operátor násobení, a kde neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

Výraz jednotlivec nebo jednotlivci, jestliže se zde používá v souvislosti s organismem, znamená vícebuněčný eukaiyotický organismus včetně bez omezení metazoálního organismu a savce, ovcí, skotu, opice, primáta a člověka.

Izolovaný znamená změněný rukou člověka proti přirozenému stavu, tj. jestliže se vyskytuje v přírodě, byl změněn nebo odstraněn z původního prostředí, nebo byly provedeny obě činnosti současně. Například polynukleotid nebo polypeptid přírodně přítomný v živém organismu není izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený z koexistujících materiálů přirozeného stavu je izolovaný, tak jak se zde tento termín používá. Navíc je polynukleotid nebo polypeptid, který je zavedený do organismu transformací, genetickou manipulací nebo jakoukoli jinou rekombinantní metodou izolovaný i v případě, kdy je stále ještě přítomen v uvedeném organismu, přičemž organismus může být v živém nebo neživém stavu.

Polynukleotid (polynukleotidy) se obecně týkají jakéhokoli polyribonukleotidu nebo polydeoxyribonukleotidu, které mohou být ve formě nemodifikované RNA nebo DNA nebo modifikované RNA nebo DNA včetně jednořetězcových a dvojřetězcových oblastí.

Termín varianta označuje polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidů nebo polypeptidů, ale zachovává si podstatné vlastnosti. Typická varianta polynukleotidů se od jiného, referenčního polynukleotidů odlišuje nukleotidovou sekvencí. Změny v nukleotidové sekvenci varianty mohou nebo nemusí ovlivňovat aminokyselinovou sekvenci polypeptidů kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím, delecím, fúzím a zkrácením v polypeptidů kódovaném referenční sekvencí, jak bude diskutováno dále. Typická varianta polypeptidů se liší od jiného, referenčního polypeptidů v

-24CZ 296086 B6 aminokyselinové sekvenci. Obecně jsou rozdíly omezeny tak, že sekvence referenčního polypeptidu a varianty jsou celkově úzce podobné a v mnoha oblastech identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci o jednu nebo více substitucí, adicí, delecí v jakékoli kombinaci. Substituovaný nebo vložený aminokyselinový zbytek může 5 nebo nemusí být kódovaný genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidu se může vyskytovat v přírodě, jak je tomu u alelické varianty, nebo může jít o variantu, o které není známo, že by se vyskytovala v přírodě. Varianty polynukleotidů a polypeptidů, které se nevyskytují v přírodě, mohou být vyrobeny technikami mutageneze nebo přímou syntézou.

Onemocnění znamená jakékoli onemocnění, které je způsobeno nebo které souvisí s infekcí bakterií, včetně například zánětu středního ucha u kojenců a dětí, pneumonie u starších lidí, sinusitidy, nosokomiálních infekcí a invazivních onemocnění, chronického zánětu středního ucha se ztrátou sluchu, akumulace kapaliny ve středním uchu, poškození sluchového nervu, opožděného učení řeči, infekce horního respiračního traktu a zánětu středního ucha.

Příklady provedení vynálezu

Dále uváděné příklady byly prováděny s použitím standardních technik, které jsou známé 20 a rutinní pro odborníky v oboru, kromě případu, kdy se postupy popisují podrobně. Příklady jsou ilustrativní a nemají omezovat vynález.

Příklad 1

Sekvenování DNA genu BASB027 z Moraxella catarrhalis kmene ATCC 43617 pro zjištění a potvrzení sekvence

Gen BASB027 se SEQ ID No. 1 byl poprvé objeven v databázi Incyte PathoSeq obsahující nedo30 končené sekvence genomické DNA Moraxella catarrhalis kmene ATCC 43617 (označovaného také jako kmen Mc2931). Překlad polynukleotidové sekvence BASB027 ukázaný v SEQ ID No. 2, měl významnou podobnost (32% identita v 817 překrývajících se aminokyselinách) s proteinem vnější membrány Neisseria meningitidis OMP85.

Sekvence genu BASB027 byla dále potvrzena experimentálně. K tomuto účelu byla genomická DNA extrahována z 1 O¹⁰ buněk M. catarrhalis (kmen ATCC 43617) s použitím kitu pro extrakci genomické DNA QIAGEN (Qiagen Gmbh), a 1 pg tohoto materiálu byl zesílen polymerázovou řetězovou reakcí s použitím příměrů E515515 (5'-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TG-3') [SEQ ID No. 5] a E515528: (ó^CTAjCG-TTT-GTT-TGA-TTG-AG-S') [SEQ ID No. 6].

Tento produkt PCR byl vyčištěn na zařízení Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) a bylo provedeno sekvenování DNA s použitím sekvenačního kitu Big Dye Cyde Sequencing kit (Perkin-Elmer) a sekvenátoru DNA ABI 377/PRISM. Sekvenování DNA bylo provedeno na obou řetězcích s dvojnásobnou redundancí a sekvence s úplnou délkou byla sestavena použitím programu SeqMan ze softwarového balíku DNASTAR Lasergen. Získaná sekvence DNA a odvozená 45 polypeptidová sekvence jsou ukázány jako SEQ ID No. 3, popřípadě SEQ ID No. 4. SEQ ID No. 3 od SEQ ID No. 1. odlišují čtyři rozdíly v nukleotidech. Použitím programu MEGALIGN ze softwarového balíku DNASTAR Lasergen bylo provedeno porovnání polynukleotidových sekvencí SEQ ID No. 1 a 3, které je znázorněno na obr. 2; míra identity byla vypočtena jako 99,8 %.

Použitím stejného programu bylo provedeno porovnání polypeptidových sekvencí SEQ ID No. 2 a 4, které je ukázáno na obr. 3; míra identity byla vypočtena jako 99,8 %.

-25CZ 296086 B6

Příklad 2

Analýza variability genu BASB027 mezi různými kmeny Moraxella catarrhalis

2A: Analýza délky restrikčního fragmentu (RFLP)

Genomická DNA byla extrahována z 16 kmenů M. catarrhalis (uvedených v tabulce 1), jak bylo popsáno níže. M. catarrhalis byla rozetřena na agarových plotnách BHI pro získání jednotlivých kolonií a byla ponechána růst přes noc při 37 °C. Tři nebo čtyři jednotlivé kolonie byly odpíchnuty a použity pro zaočkování ~ 1,5 ml BHI (Brain-heart infusion) jako očkovací půdy, která byla ponechána růst přes noc ve třepaném inkubátoru při ~300 ot/min při 37 °C. Očkovací kulturou byla zaočkována 500 ml Erienmeyerova baňka obsahující —150 ml půdy BHI a byla ponechána růst ~12 až 16 h při 37 °C ve třepaném inkubátoru při ~175 ot/min, pro získání biomasy pro izolaci DNA. Buňky byly odděleny centrifugací v rotoru Servali GSA při -2000 x g 15 min při teplotě laboratoře. Supematant byl oddělen a usazené buňky byly suspendovány v -5,0 ml sterilní vody. Byl přidán stejný objem lyzačního pufru (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM TrisHC1, pH 8,0, 0,5 % (hmotn./objem) SDS, 0,5 % (obj./obj.) 2-merkaptoethanol a 250 pg/ml proteinázy K) a buňky byly suspendovány mírným mícháním a roztíráním. Buněčná suspenze byla potom inkubována přibližně 12 h při 50 °C pro lyži bakterií a uvolnění chromozomální DNA. Proteinový materiál byl vysrážen přídavkem 5,0 ml nasyceného NaCl (~6,0 M, ve sterilní vodě) a centrifugován při -5 500 x g v Servali SS34 při teplotě laboratoře. Chromosomální DNA byla z vyčeřeného supematantu vysrážena přidáním dvou objemů 100% ethanolu. Vysrážena DNA byla oddělena a promyta mírným třepáním v malém objemu 70 % ethanolu. Vyčištěná chromozomální DNA byla suspendována ve sterilní vodě a ponechána rozpouštět přes noc při 4 °C za mírného kývání. Koncentrace rozpuštěné DNA byla určena spektrofotometricky při 260 nm s použitím extinkčního koeficientu 1,0 jednotky OD-50 pg/ml.

Tento materiál byl amplifíkován PCR použitím oligonukleotidů MC-D15-BamF(5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACA GGA ČTA CAG GGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C-3’) [SEQ ID No. 7] a MC-D15-SalRC (AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G-3’) [SEQ ID No. 8]. Odpovídající zesílené geny BASB027 byly potom nezávisle hydrolyzovány použitím restrikčních enzymů (Acil, HindlII, MaelII, NlalII, Rsal, Sau3AI) a restrikční produkty byly děleny elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu s použitím standardních postupů molekulární biologie popsaných v publikaci Molecular Cloning, a Laboratory Manual, druhé vydání, ed.: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989”. Fotografie získaných elektroforetických gelů jsou ukázány na obr. 1. Pro každý kmen byly hodnoceny a kombinovány obrazy RFLP odpovídající šesti restrikčním enzymům. Byly definovány skupiny kmenů sdílející identickou kombinaci obrazů RFLP. Použitím této metody byly kmeny testované při této studii zařazeny do čtyř genomických skupin (skupina 1: Mc2906, Mc2908, Mc2912, Mc2926; skupina 2: Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2911, Mc2913, Mc2960, Mc2975; skupina 3: Mc2910, Mc2912, Mc2956, Mc2969; skupina 4: Mc2931). Tyto údaje podporují tvrzení, že populace Moraxella catarrhalis použitá při této studii vykazuje v rámci genu BASB027 omezenou diversitu nukleotidové sekvence.

-26CZ 296086 B6

Tabulka 1

Vlastnosti kmenů Moraxella catarrhalis použitých při této studii

Kmen	Izolován v	z
Mc2904	USA	Tympanocentézy
Mc2905	USA	Tympanocentézy
Mc2906	USA	Tympanocentézy
Mc2907	US	Tympanocentézy
Mc2908	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
Mc2909	USA	Tympanocentézy
MC2910	USA	Tympanocentézy
Mc2911	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
Mc2912	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
Mc2913	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
MC2926	USA	Tympanocentézy
Mc2931/ATCC 43617	USA	Transtracheální aspirát
Mc2956	Finsko	Středoušní kapalina
MC2960	Finsko	Středoušnl kapalina
Mc2969	Norsko	Nasopharynx (pharyngitis-rhinltís)
Mc2975 --	Norsko	Nasopharynx (rhinitis)

Příklad 3

Konstrukce plazmidu pro expresi rekombinantního BASB027

A: Klonování BASB027

Restrikční místa BamHI a Sa/1 byla vložena do dopředných (forward) (SEQ ID No. 7) a reverzních komplementárních (SEQ ID No. 8) amplifíkačních primerů, což umožnilo směrové klonování produktu PCR -2500 bp do komerčně dostupného expresního plazmidu E. coli pQE30 15 (QiaGen, rezistentní na ampicilin) tak, že zralý protein BASB027 mohl být exprimován ve formě fúzního proteinu obsahujícího na N-konci specifickou sekvenci (tag) pro afmitní chromatografii

-27CZ 296086 B6 (His)6. Produkt PCR. BASB027 byl vyčištěn od amplifikační reakční směsi použitím kolon na bázi silikagelu (silica gel-based spin columns) QiaGen) podle instrukcí výrobce. Pro výrobu požadovaných konců BamHI a Sa/1 nutných pro klonování byl produkt PCR postupně úplně štěpen restrikčními enzymy BamHI a Sa/1, jak je doporučeno výrobcem (Life Technologies). Po prvním restrikčním štěpení byl produkt vyčištěn na koloně jako výše pro odstranění solí a eluován ve sterilní vodě před štěpením druhým enzymem. Rozštěpený fragment DNA byl opět čištěn na výše uvedené silikagelové koloně před ligací s plazmidem pQE30.

B: Vytvoření expresního vektoru

Pro přípravu expresního plazmidu pQE30 pro ligaci byl plazmid podobně úplně štěpen oběma enzymy BamHI a Sa/1 a potom vystaven působení fosfatázy z telecího žaludku (CIP, -0,02 U/pmol 5'konce, Life Technologies) podle doporučení výrobce pro zabránění samovolné ligaci. Pro naprogramování ligační reakce byl použit přibližně pětinásobný molámí nadbytek rozštěpeného fragmentu vzhledem k připravenému vektoru. Byla provedena standardní ligační reakce v objemu ~20 μΐ (~16 °C, -16 h), použitím metod známých v oboru s využitím T4 DNA ligázy (~2,0 jednotky/reakci, Life Technologies). Alikvot ligační směsi (~5 μΐ) byl použit pro transformaci elektrokompetentních buněk Ml 5 (pREP4) v oboru známými metodami. Po ~2 až 3 hod nárůstu při 37 °C v ~l,0 ml půdy LB byly transformované buňky vysety na agarové plotny LB s obsahem kanamycinu (50 pg/ml) a ampicilinu (100 pg/ml). Obě antibiotika byla přidána do selekčního média pro zajištění, aby všechny transformované buňky nesly jak plazmid pREP4 (KnR), který nese gen Iaclq nezbytný pro represi exprese proteinů na pQE30 indukovatelných IPTG, tak i plazmid pQE30-BASB027 (ApR). Plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C ~16 h. Jednotlivé KnR/ApR kolonie byly odpíchnuty sterilními párátky a použity pro zaočkování čerstvých ploten LB KnR/ApR a ~ 1,0 ml kultivační půdy LB KnR/ApR. Jak plotny, tak tekuté kultury byly inkubovány přes noc při 37 °C buď ve standardním inkubátoru (plotny), nebo na vodní třepačce.

Byla provedena analýza PCR na základě celých buněk pro ověření, že transformanty obsahují inzert DNA BASB027. K tomu účelu bylo ~l,0 ml přes noc kultivované kultury LB Kn/Ap převedeno do 1,5 ml polypropylenové zkumavky a buňky byly odděleny centrifugací v mikrocentrifuze Beckmann (~3 min, teplota laboratoře, ~12 000 x g). Zcentrifúgované buňky byly suspendovány v ~200 μΐ sterilní vody a ~10 μΐ alikvot byl použit pro programování reakce PCR s konečným objemem ~50 μΐ s obsahem jak dopředných, tak i reverzních amplifikačních příměrů BASB027. Konečné koncentrace reakčních složek PCR byly v podstatě stejné jako koncentrace uvedené v příkladu 2, s tím rozdílem, že bylo použito ~5,0 jednotek Taq polymerázy. Počáteční krok denaturace při 95 °C byl prodloužen na 3 min pro zajištění teplotního rozpadu bakteriálních buněk a uvolnění plazmidové DNA. Pro amplifikaci fragmentu PCR BASB027 z lyžovaných transformovaných vzorků byl použit přístroj AB1 thermal cycler Model 9700 a třístupňový profil teplotní amplifíkace s 32 cykly, tj. 95 °C, 45 s; 55 až 58 °C, 45 s, 72 °C, 1 min. Po teplotní amplifikaci byl analyzován alikvot reakční směsi o objemu -20 μΐ elektroforézou na agarózovém gelu (0,8 % agaróza v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE). Fragmenty DNA byly zviditelněny po elektroforéze a barvení ethidiumbromidem ozářením UV. Paralelně s testovanými vzorky byla provedena elektroforéza standardu molekulové hmotnosti DNA (řada po 1 kb, Life Technologies), kteiý byl použit pro odhadnutí velikosti produktů PCR. Transformanty, které poskytly očekávaný produkt PCR o délce přibližně 2 500 bp byly identifikovány jako kmeny obsahující expresní konstrukt BASB027. Kmeny obsahující expresní plazmidy byly potom analyzovány na indukovatelnou expresi rekombinantního BASB027.

C: Analýza exprese PCR - pozitivních transformantů

Pro každý PCR - pozitivní transformant identifikovaný výše bylo zaočkováno ~5,0 ml půdy LB s obsahem kanamycinu (50 pg/ml) a ampicilinu (100 pg/ml) buňkami z plotny a půda byla ponechána růst přes noc při 37 °C za třepáni (~250 ot/min). Alikvot očkovací kultury pěstované přes

-28CZ 29(>υ»(> B6 noc (—1,0 ml) byl zaočkován do 125 ml Erienmeyerovy baňky obsahující ~25 ml půdy LB Kn/Ap a baňka byla ponechána růst při 37 °C za třepáni (-250 ot/min) až do dosažení turbidity kultury OD 600 -0,5, tj. do střední logaritmické fáze (obvykle přibližně 1,5 až 2,0 h. V této době byla přibližně polovina kultury (-12,5 ml) převedena do druhé 125 ml baňky a byla indukována exprese rekombinantního proteinu BASB027 přídavkem IPTG (1,0 M zásobní roztok připravený ve sterilní vodě, Sigma) na konečnou koncentraci 1,0 mM. Inkubace jak IPTG - indukované, tak i neindukované kultury pokračovala další přibližně 4 hodiny při 37 °C za třepání. Po indukční periodě byly odebírány z indukované i neindukované kultury vzorky (-1,0 ml) a buňky byly oddělovány centrifugací v mikrocentrifuze při teplotě místnosti -3 min. Jednotlivé usazené buňky byly suspendovány v -50 μΐ sterilní vody, potom smíšeny se stejným objemem vzorkového pufru 2 x Laemelli pro SDS-PAGE s obsahem 2-merkaptoethanolu a vloženy do vroucí vody na -3 min pro denaturaci proteinů. Stejné objemy (-15 μΐ) obou surových buněčných lyzátů z IPTG - indukovaných a neindukovaných buněk byly naneseny na dvojitý 12 % Tris/glycinový polyakrylamidový gel (tloušťka 1 mm, Mini-gels, Novex). Indukované a neindukované vzorky lyzátů byly vystaveny elektroforéze spolu s předbarvenými markéry molekulové hmotnosti (SeeBlue, Novex) za běžných podmínek s použitím standardního elektroforetického pufru SDS/Tris/glycin (BioRad). Po elektroforéze byl jeden gel obarven barvivém coomassie brilliant blue R250 (BioRad) a potom odbarven pro zviditelnění nových proteinů BASB027 indukovatelných IPTG. Druhý gel byl elektricky přenesen na membránu PVDF (velikost pórů 0,45 pm, Novex) během -2 h při 4 °C použitím přístroje BioRad Mini-Protean Π blotting apparatus a Towbinova methanolového (20 %) přenosového pufru. Blokování membrány a inkubace s protilátkou byly prováděny v oboru známými způsoby. Pro potvrzení exprese a identity rekombinantního proteinu BASB027 byla použita monoklonální protilátka anti-RGS (His)3, potom druhá králičí antimyší protilátka konjugovaná s HRP (QiaGen). Zviditelnění obrazu reakce s protilátkou anti-His bylo dosaženo buď nerozpustným substrátem ABT, nebo materiálem Hyperfilm s chemiluminiscenčním systémem Amersham ECL.

D: Potvrzení sekvence

Pro další ověření, že rekombinantní protein BASB027 indukovaný IPTG je exprimován ve správném otevřeném čtecím rámci a nikoli jako nesprávná molekula pocházející z artefaktu klonování (tj. posunem čtecího rámce), byla určena sekvence DNA klonovaného inzertu. Sekvence DNA genu BASB027 M. catarrhalis byla získána z jednoho řetězce použitím metody sekvenování s asymetrickým cyklem PCR (ABI Prism Dye-Terminator Cyde Sequencing, PerkinElmer). Sekvenační reakce byly programovány s neštěpeným expresním plazmidem DNA (-0,5 pg/rxn) jako templátem a vhodnými sekvenačními příměry specifickými pro vektor pQE30 a ORF v (-3,5 pmol/rxn). Navíc k templátu a sekvenačnímu primerů obsahovala každá sekvenační reakce (-20 μΐ) čtyři různé dNTP (tj. A, G, C a T) a čtyři odpovídající ddNTP (tj. ddA, ddG, ddC a ddT) terminátorové nukleotidy; přičemž každý terminátor byl konjugován sjednám ze čtyř fluorescenčních barviv Joe, Tam, Rox nebo Fam. Jednořetězcové produkty prodlužování sekvence byly v náhodných polohách podél templátu zakončovány přídavkem terminátorů ddNTP značených barvivý. Produkty terminace značené fluorescenčními barvivý byly čištěny pomocí mikrocentrifugačních kolon pro size-exciusion chromatografii (Princeton Genetics), usušeny ve vakuu, suspendovány v pufru Template Resuspension Buffer (Perkin-Elmer) pro kapilární elektroforézu nebo v deionizovaném formamidu pro PAGE, denaturovaném při 95 °C -5 min, a analyzovány kapilární elektroforézou s vysokým rozlišením (ABI 310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) nebo PAGE s vysokým rozlišením (ABI 377 Automated DNA Sequenator) podle doporučení výrobce. Údaje o sekvenci DNA poskytnuté jednotlivými reakcemi byly shromážděny a byly analyzovány relativní intenzity fluorescenčních vrcholů automaticky na počítači PowerMAC s použitím softwaru ABI Sekvence Analysis Software (Perkin-Elmer). Jednotlivé automaticky analyzované sekvence DNA byly manuálně editovány na přesnost před srovnáním s konvenční jednořetězcovou sekvencí s použitím softwaru AutoAssembler software (Perkin-Elmer). Sekvenování určilo, že expresní plazmid obsahuje správnou sekvenci ve správném otevřeném čtecím rámci.

-29CZ 296086 B6

Příklad 4

Produkce rekombinantního BASB027

Bakteriální kmen

Pro výrobu buněčné biomasy pro čištění rekombinantního proteinu byl použit rekombinantní expresní kmen E. coli Ml5 (pREP4) obsahující plazmid (pQE30) kódující BASB027 z M. catarrhalis. Expresní kmen byl kultivován na agarových plotnách LB obsahujících 50 pg/ml kanamycinu (Kn) a 100 pg/ml ampicilinu (Ap) pro zajištění zachování obou plazmidů pREP4 laclq kontrolního plazmidu a pQE30- BASB027 expresního konstruktu. Pro uchovávání za mrazu při -80 °C v byl kmen namnožen v půdě LB obsahující stejnou koncentraci antibiotik a potom smíchán se stejným objemem půdy LB s obsahem 30% (hmotn./obj.) glycerolu.

Média

Fermentační médium použité pro produkci rekombinantního proteinu se skládalo z 2 x půdy YT (Difco) s obsahem 50 pg/ml Kn a 100 pg/ml Ap. Do média pro fermentor bylo přidáváno odpěňovadlo v koncentraci 0,25 ml/1 (Antifoam 204, Sigma). Pro indukci exprese rekombinantního proteinu BASB027 byl do fermentora přidáván IPTG (izopropyl β-D-thiogalaktopyranosid) (konečná koncentrace 1 mM).

Fermentace

500 ml Erienmeyerova očkovací baňka obsahující 50 ml pracovního objemu byla zaočkována 0,3 ml rychle roztavené zmražené kultury nebo několika koloniemi ze selektivní kultury na agarových plotnách, a baňka byla inkubována přibližně 12 h při 37 ± 1 °C na třepačce při 150 ot/min (Innova 2100. New Brunswick Scientific). Očkovací kultura byla potom použita pro inokulaci fermentoru s pracovním objemem 5 1 obsahujícím půdu 2 x YT a obě antibiotika Kn a Ap. Fermentor (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) byl provozován při 37 ± 1 °C, přísunu vzduchu 0,2 až 0,4 WM, a otáčkách míchadel Rushton 250 ot/min. pH nebylo ani v baňce, ani ve fermentoru regulováno. V průběhu fermentace dosáhlo pH ve fermentoru hodnoty 6,5 až 7,3. Při dosažení střední logaritmické fáze růstu (~0,7 jednotek OD 600) byl do fermentoru přidán IPTG (1,0 M zásobní roztok připravený ve sterilní vodě). Buňky byly indukovány po dobu 2 až 4 h a potom centrifugovány buď na centrifuze 28RS Heraeus (Sepatech), nebo centrifuze RC5C superspeed centrifuge (Sorvall Instruments). Pasta buněk byla skladována až do zpracování při -20 °C.

Čištění

Chemikálie a materiály

Imidazol, guanidinhydrochlorid, Tris (hydroxymethyl) a EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) v čistotě pro biotechnologii nebo lepší byly získány od firmy AmerescoChemical, Solon, Ohio. Triton X-100 (t-oktylfenoxypolyethoxyethanol), dihydrogenfosforečnan sodný a močovina byly v reagenční nebo lepší čistotě a byly získány od firmy Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Ledová kyselina octová a kyselina chlorovodíková byly získány od firmy Mallincrodt Baker lne, Phillipsburg, New Jersey. Methanol byl získán od firmy Fisher Scientific, Fairiawn, New Jersey. PefablocSSC (4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluorid), tablety Complete protease inhibitor cocktail a PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid) byly získány od firmy Roche Diagnostice Corporation, Indianapolis, Indiana. Bestatin, pepstatin A a E-64 proteázové inhibitory byly získány od firmy Calbiochem, LaJolla, Kalifornie. Pufř Dulbecco's Phosphate Buffered Salině (1 x PBS) byl získán od firmy Quality Biological, lne, Gaithersburg, Maryland. Pufr Dulbecco's Phosphate Buffered Salině (1 x PBS) byl získán od firmy BioWhittaker, Walkersville, Maryland. Protilátka Penta-His, prostá BSA byla získána od firmy QiaGen, Valencia, Kalifornie. Imunoglobulin AffiniPure Goat Anti-mouse IgG konjugovaný s peroxidázou byl

-30CZ 296086 B6 získán od Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. Roztok AEC byl získán od firmy Zymed, South San Francisco, Kalifornie. Všechny další chemikálie byly v reagenční nebo lepší čistotě.

Pryskyřice Ni-NTA Superfiow byla získána od firmy QiaGen Inc., Valencia, Kalifornie. Připravené polyakrylamidové gely Tris-Glycine 4 až 20% a 10 až 20%, všechny elektroforetické pufry a roztoky, standardy SeeBlue Pre-Stained Standarde, MultiMark Multi-Colored Standards a přenosové membrány PVDF byly získány od firmy Novex, San Diego, Kalifornie. Kity SDSPAGE Silver Stain byly získány od firmy Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japonsko. Barvicí roztok Coomassie Stain Solution byl získán od firmy Βίο-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornie. Filtry pro injekční stříkačky Acrodisc®PF 0,2 m byly získány od firmy Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Jednorázové filtry na injekční stříkačky GD/X 25 mm byly získány u firmy Whatman Inc., Clifton, New Jersey. Dialyzační trubice 8000 MWCO byly získány od firmy BioDesign Inc. Od New York, Carmal New York. Reagencie BCA Protein Assay Reagents a dialyzační trubice Snake Skin 3500 MWCO byly získány od firmy Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Protokol extrakce

Buněčná pasta byla rozmražena při teplotě laboratoře během 30 až 60 min. 5 až 6 g materiálu bylo odváženo do 50 ml jednorázové centrifugační zkumavky. Bylo přidáno 5 ml/g guanidinhydrochloridového pufru (Gu-HCI) (6 M guanidinhydrochlorid, 100 mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). Buněčná pasta byla resuspendována pomocí homogenizátoru PR0300D proscientific homogenizer při nastavení výkonu na 3/4 po dobu jedné minuty. Extrakční směs byla potom umístěna do teploty laboratoře za mírného míchání na 60 až 90 min. Po 60 až 90 minutách byla extrakční směs centrifugována při 15 800 x g 15 min (centrifuga Servali RC5C, 11 500 ot/min). Supematant (Sl) byl dekantován a uchován pro další čištění. Usazený materiál (Pl) byl uchován pro analýzu.

Vazba BASB027 na pryskyřici Nickel-NTA Resin

K Sl se přidají 3 až 4 ml pryskyřice Ni-NTA resin. Směs se uloží při teplotě laboratoře za mírného míchání na 1 h. Po jedné hodině se vnese Sl/Ni-NTA do kolony XK16 Pharmacia. Kolona se potom promyje 1M Gu-HCI pufrem (1M guanidinhydrochlorid, 100 mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). Potom následuje promytí fosfátovým pufrem (100 mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X-100, pH 6.3). Protein se potom z kolony eluuje 250 mM imidazolovým pufrem (250 mM imidazol. 100 mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X-100, pH 5,9).

Konečná formulace

BASB027 byl formulován dialýzou přes noc proti třikrát vyměněnému pufru 0,1 % Triton X-100 a 1 x PBS, pH 7,4, pro odstranění zbytkového Gu-HCI a imidazolu. Vyčištěný protein byl charakterizován a použit pro výrobu protilátek jak bude popsáno dále.

Biochemické charakterizace

SDS-PAGE a analýza westernovým přenosem

Rekombinantní vyčištěný protein byl dělen na 4 až 20 % polyakrylamidových gelech a elektroforeticky přenášen na membrány PVDF při napětí 100 V 1 h jak bylo popsáno výše (Thebain, a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4 350-4 354). Membrány PVDF byly potom ošetřeny 25 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem Dulbecco s obsahem 5 % odtučněného sušeného mléka. Všechny následující inkubace byly prováděny s použitím tohoto pufru.

-31 CZ 296086 B6

Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml preimunního séra v ředění 1 : 500 nebo králičího imunního anti-His séra po dobu 1 h při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom dvakrát promyty promývacím pufrem (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM chlorid sodný a 0,05 % Tween 20). Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml, ředění 1 : 5000, kozího protikrálicího IgG značeného peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 30 min při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom čtyřikrát promyty promývacím pufrem a byly vyvolávány 3-amino-9-ethylkarbazolem a peroxomočovinou dodanými firmou Zymed (San Francisco, CA), vždy po 10 min.

Výsledky SDS-PAGE (obr. 4) ukazují protein s molekulovou hmotností přibližně 95 kDa (95 000), který je reaktivní vůči protilátce anti-RGS (His) při analýze westernovým přenosem (obr. 5) na SDS-PAGE.

Sekvenování proteinu

Sekvenování aminokoncové aminokyseliny vyčištěného proteinu bylo prováděno pro potvrzení produkce správného rekombinantního proteinu pomocí dobře definovaných chemických protokolů na sekvenátoru Hewlett-Packard model G1000A spolu s LC model 1 090 a na sekvenátoru Hewlett-Packard model 241 spolu s LC model 1100.

Příklad 5

Produkce antiséra proti rekombinantnímu BASB027

Polyvalentní antiséra proti proteinu BASB027 byla vytvářena vakcinací dvou králíků čištěným rekombinantním proteinem BASB027. Každému zvířeti se podají celkem tři imunizace intramuskulámě (i.m.) v dávce přibližně 20 pg proteinu BASB027 v injekci (začíná se kompletním Freundovým adjuvans a pokračuje se nekompletním Freundovým adjuvans) v intervalech přibližně 21 dnů. Zvířatům byly odebrány před první imunizací vzorky krve (před pokusem) a vzorky krve byly také odebírány ve dnech 35 a 57.

Titry proteinu anti-BASB027 byly měřeny metodou ELISA s použitím čištěného rekombinantního proteinu BASB027 (0,5 pg/jamka). Titr se definuje jako nejvyšší ředění rovné nebo větší než 0,1, přičemž výpočet se provádí podle následující rovnice: té průměrná OD dvou testovaných vzorků antiséra minus průměrná OD dvou testovaných vzorků pufru.

Antiséra byla používána jako první protilátka pro identifikaci proteinu metodou westernového přenosu, jak bylo popsáno v příkladu 4 výše. Analýza westernovým přenosem ukazuje přítomnost protilátky W anti-BASB027 v séru imunizovaných zvířat (obr. 6).

Příklad 6

Imunologická charakterizace

Analýza westernovým přenosem

Několik kmenů M. catarrhalis bylo pěstováno na deskách s čokoládovým agarem po dobu 48 h při 35 °C v 5 % C0₂. Několik kolonií bylo použito pro inokulaci 25 ml Muller Hintonovy půdy v 250 ml baňce. Kultury byly pěstovány přes noc a sklizeny centrifugací. Buňky potom byly solubilizovány suspendováním 30 pg buněk ve 150 pg vzorkového pufru pro PAGE (360 mM Tris pH 8,8, s obsahem 4 % dodecylsulfátu sodného a 20 % glycerolu), a suspenze byla inkubována při 100 °C 5 min. Dolubilizované buňky byly děleny na 4 až 20% polyakrylamidových gelech a separované proteiny byly elektroforeticky přenášeny na membrány PVDF při 100 V 1 h

-32CZ 296086 B6 jak bylo popsáno výše (Thebain a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4 350-4 354). Membrány PVDF byly potom inkubovány s 25 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem Dulbecco obsahujícího 5 % odtučněné sušené mléko. Všechny následující inkubace byly prováděny s použitím tohoto pufru.

Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml preimunního séra nebo králičího imunního séra v ředění 1 : 500 1 h při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom dvakrát promyty promývacím pufrem (20 mM Tris, pH 7,5, s obsahem 150 mM chloridu sodného a 0,05% Tween 20). Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml, ředění 1 : 5000, kozího protikráličího IgG značeného peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 30 min při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom čtyřikrát promyty promývacím pufrem a byly vyvíjeny 3-amino-9-ethylkarbazolem a peroxomočovinou dodanými firmou Zymed (San Francisco, CA) vždy 10 min.

Protein s molekulovou hmotností přibližně 95 kDa (95 000) odpovídající očekávané molekulové hmotnosti BASB027, který je reaktivní s antisérem, se detekuje u všech kmenů Moraxella (obr. 7).

Baktericidní aktivita

Cytotoxická aktivita protilátek anti-BASB027 zprostředkovaná komplementem byla vyšetřována pro zjištění vakcinačního účinku polypeptidu BASB027. Antisérum bylo připraveno jak bylo popsáno výše. Aktivity preimunního séra a antiséra anti-BASB027 při zprostředkování usmrcování M. catarrhalis komplementem byly testovány testem Sérum Bactericidal Test popsaným Zollingerem a dalšími (Immune Responses to Neisseria meningitis, v Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3. vyd., str. 347-349), s tím rozdílem, že v tomto případě byly použity kmeny nebo kultivary M. catarrhalis namísto buněk Neisseria meningitis.

Baktericidní titr králičího antiséra (50 % usmrcení homologního kmene) byl <1 : 8 (preimunní) a >1 : 128 (imunní).

Příklad 7

Přítomnost protilátky proti BASB027 v séru člověka rekonvalescenta

Analýza purifikovaného rekombinantního BASB027 westernovým přenosem byla prováděna jak bylo popsáno v příkladech 4 a 6 výše, s tím rozdílem, že jako preparát první protilátky byla použita shromážděná séra dětí infikovaných M. catarrhalis. Výsledky ukazují, že antiséra z přirozeně infikovaných jedinců reagují s purifikovaným rekombinantním proteinem.

Příklad 8

Produkce peptidů BASB027, antisér a jejich reaktivita

Dva krátké peptidy specifické pro BASB027 se sekvencemi CYAKPLNKKQNDQTDT (SEQ ID No. 9) a YLTARRGQQTTLGEVVC (SEQ ID No. 10) byly vyrobeny v laboratoři použitím obecně dobře známých metod. Tyto peptidy navázané na KLH byly použity pro výrobu protilátek u dvanáct týdnů starých samic králíků typu Specific Pathogen Free New-Zealand. Králíci dostali čtyři injekce v intervalech přibližně 3 týdnů s dávkou 200 pg komplexu peptidKLH v kompletním (1. injekce) nebo nekompletním (2., 3. a 4. injekce) Freundově adjuvans. Zvířatům byly před první imunizací a jeden měsíc po čtvrté injekcí odebrány vzorky krve.

-33 CZ 296086 B6

Střední titry protilátek proti peptidům byly měřeny metodou ELISA s použitím volných peptidů. Střední (mid-points) titry proti peptidům jeden měsíc po čtvrté imunizaci byly vyšší než 15 000.Analýzy puntíkovaného rekombinantního BASB027 westernovým přenosem s použitím protilátek proti peptidů jako první protilátky byly připraveny podle popisu v příkladech 4 a 6. Výsledky jsou uvedeny v obr 8.

Uložené materiály

Kmen Moraxella catarrhalis Catlin byl uložen ve sbírce Američan Type Culture Collection (zde ATCC) 21. června 1997 a označen depozitním číslem 43 617. Uložený vzorek byl popsán jako Branhamella catarrhalis (Frosch a Kolle) a jde o lyofilizovanou knihovnu inzertů o velikosti 1,5 až 2,9 kb zkonstruovanou z izolátu M. catarrhalis získaného z transtracheálního aspirátu horníka v uhelných dolech s chronickou bronchitidou. Uložený materiál je popsán v Antimicrob. Agents Chemother, 21: 506-508 (1982).

Kmen Moraxella catarrhalis uložený ve sbírce se zde označuje jako uložený kmen nebo jako DNA uloženého kmene. Uložený kmen obsahuje gen BASB027 s úplnou délkou.

Vektor pMC-D15 složený z DNA Moraxella catarrhalis vložené v pQE30 byl uložen ve sbírce Američan Type Culture Collection (ATCC) 12. února 1999 a byl označen depozitním číslem 207 105.

Sekvence polynukleotidů obsažená v uloženém kmenu/klonu stejně jako aminokyselinová sekvence jakéhokoli jím kódovaného polypeptidu slouží pro účely kontroly v případě jakéhokoli konfliktu týkajícího se jakéhokoli popisu uvedených sekvencí.

Uložení kmenů ve sbírce bylo provedeno v souladu s Budapešťskou úmluvou o mezinárodním uznávání uložených mikroorganismů pro účely udělování patentů. Uložené kmeny budou neodvolatelně a bez omezení nebo podmínek uvolněny veřejnosti po vydání patentu. Uložené kmeny se poskytují pouze pro pohodlí odborníkům v oboru a neznamenají, že pro uskutečnění vynálezu je uložení nezbytné.

Claims (24)

1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci,která má alespoň 85 % identitu s aminokyselinovou sekvencí zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 4, v celé jejich délce.

2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, ve kterém má aminokyselinová sekvence alespoň 95 % identitu s aminokyselinovou sekvencí zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 4 v celé jejich délce.

3. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 4.

4. Izolovaný polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.

5 takovou infekci.

5. Imunogenní fragment polypeptidu podle některého z nároků 1 až 4, kde tento imunogenní fragment má alespoň 15 za sebou následujících aminokyselin a je schopen, popřípadě navázaný

-34CZ 296086 B6 na nosič, vyvolat imunitní odpověď, která rozpozná polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.

6. Fúzní protein obsahující polypeptid podle některého z nároků 1 až 5.

7. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle některého z nároků 1 až 6.

8. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má alespoň 85 % identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 v celé jejich délce; nebo nukleotidová sekvence s tímto izolovaným polynukleotidem komplementární.

9. Izolovaný polynukleotid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 85 % identitu se sekvencí SEQ ID No. 1 nebo 3 po celé jejich délce; nebo nukleotidová sekvence s tímto izolovaným polynukleotidem komplementární.

10. Izolovaný polynukleotid podle některého z nároků 7 až 9, který má alespoň 95 % identitu se SEQ ID No. 1 nebo 3.

11. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4; nebo imunogenní fragment podle nároku 5.

12. Izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotid SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 3.

13. Expresní vektor obsahující izolovaný rekombinantní polynukleotid podle některého z nároků 7 až 12.

14. Živý rekombinantní mikroorganismus obsahující expresní vektor podle nároku 13.

15. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 13, nebo membrána hostitelské buňky obsahující exprimovaný polypeptid.

16. Způsob výroby polypeptidu podle některého z nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 16 za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu a izolaci polypeptidu z kultivačního média.

17. Způsob exprese polynukleotidu podle některého z nároků 7až 12, vyznačující se t í m, že zahrnuje transformaci hostitelské buňky expresním vektorem obsahujícím alespoň jeden z uvedených polynukleotidů a kultivaci hostitelské buňky za podmínek dostatečných pro expresi kteréhokoli z uvedených polynukleotidů.

18. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polypeptidu podle některého z nároků 1 až 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.

19. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polynukleotidu podle některého z nároků 7 až 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.

20. Vakcína podle některého z nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden další antigen Moraxella catarrhalis.

21. Protilátka imunospecifická pro polypeptid nebo imunologický fragment podle některého z nároků 1 až 6.

-35CZ 296086 B6

22. Způsob diagnózy infekce Moraxella catarrhalis, vyznačující se tím, že zahrnuje identifikaci polypeptidů podle některého z nároků 1 až 6 nebo protilátky, která je pro uvedený polypeptid imunospecifická, přítomných v biologickém vzorku z živočicha s podezřením na

23. Použití polypeptidů podle některého z nároků 1 až 6 při výrobě léčiva pro použití při vyvolání imunitní odpovědi u živočicha.

ío

24. Farmaceutický prostředek použitelný pro léčení lidí s infekcí Moraxella catarrhalis, vyznačující se tí m , že obsahuje alespoň jednu protilátku proti polypeptidů podle nároku 21 a vhodný farmaceutický nosič.