CZ20004510A3 - Izolovaný polypeptid - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polynukleotidů (dále označovaných jako „polynukleotid (polynukleotídy) BASB027“), jimi kódovaných polypeptidů (dále označovaných jako „BASB027“ nebo „polypeptid (polypeptidy) BASB027)“, rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se vynález týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů, včetně vakcín proti bakteriálním infekcím. V dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro detekci infekce určitými patogeny.

Dosavadní stav techniky

Moraxella catarrhalis (nazývaná také Branhamella catarrhalis) je gramnegativní bakterie, která se často izoluje z horního respiračního traktu člověka. Je odpovědná za několik patologických stavů, z nichž hlavní je zánět středního ucha u kojenců a dětí, a pneumonie u strších osob. Je také odpovědná za sinusitidu, nosokomiální infekce a méně často za invazivní onemocnění.

Zánět středního ucha je důležitým onemocněním dětského věku jak počtem případů, tak i možnými následky. Každoročně se zaznamenává ve Spojených státech více než 3,5 miliónu případů a odhaduje se, že 80 % dětí prodělalo před dosažením věku tří let alespoň jeden zánět středního ucha (Klein, J. O. (1994) Clin. Inf. Dis. 19: 823). Pokud se ponechá bez léčení, nebo pokud přejde do chronického stavu, může toto onemocnění vést ke ztrátám sluchu, které mohou být dočasné (v případě akumulace kapaliny ve středním uchu), nebo trvalé (v případě poškození sluchového nervu). U kojenců mohou tyto úbytky sluchu odpovídat za opoždění učení řeči.

• ·

Ze středního ucha dětí se zánětem středního ucha se primárně izolují tři druhy bakterií: Streptococcus pneumoniae, netypovatelný Haemophilus influenzae (NTHi) a M. catarrhalis. Jsou přítomny v 60 až 90 % případů. Přehled nedávných studií ukazuje, že S. pneumoniae a

NTHi představují obě přibližně 30 %, a M. catarrhalis přibližně 15 % případů zánětu středního ucha (Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Ze středního ucha je možno izolovat také další bakterie (H. influenzae, typ B, S. pyogenes atd.), ale s mnohem nižší četností (2 % případů nebo méně).

io Epidemiologické údaje ukazují, že pro patogeny nalézané ve středním uchu je pro vývoj zánětu ucha absolutně nezbytným požadavkem osídlení horního respiračního traktu; pro vyvinutí onemocnění je však také nezbytné splnění dalších požadavků (Dickinson, D. P. a další (1988) J. Infect. Dis. 158: 205; Faden, H. L. a další (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Ty jsou důležité pro spuštění migrace bakterií do středního ucha Eustachovými trubicemi a následnou iniciaci zánětlivého procesu. Tyto faktory jsou dosud neznámé. Uvádělo se, že neschopnost kontrolovat osídlení respiračního traktu může například způsobit přechodná anomálie imunitního systému po virové infekci (Faden, H. L. a další (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Alternativní vysvětlení je to, že významnější kolonizaci u některých dětí umožní vystavení faktorům vnějšího prostředí a děti se tak stanou vnímavé na vyvinutí zánětu středního ucha z důvodů prodloužené přítomnosti patogenů středního ucha (Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).

Imunitní odpověď na M. catarrhalis je špatně charakterizována. Analýza kmenů izolovaných postupně z nosohltanu dětí ve věku 0 až 2 roky ukazuje, že často dochází k získávání a eliminaci nových kmenů. To naznačuje, že u dětí kolonizovaných touto bakterií dochází k vyvinutí účinné imunitní odpovědi (Faden, H. L. a další (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

• · • ·

U většiny testovaných dospělých byly identifikovány baktericidní protilátky (Chapman, A. J. a další (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). U kmenů M. catarrhalis se vyskytují rozdíly ve schopnosti odolávat baktericidní aktivitě séra; obecně jsou izoláty z jednotlivců postižených nemocí rezistentnější než izoláty, které se jednoduše kolonizují (Hol, C. a další (1993) Lancet 341: 1281, Jordán, K. L. a další (1990) Am. J. Med. 88 (díl 5A): 28S). Rezistence na sérum by proto mohla být považována za faktor virulence bakterií. V sérech dětí, které se zotavily ze zánětu středního ucha, byla pozorována opsonizační io aktivita.

Antigeny, které jsou cílem těchto různých imunitních odpovědí u lidí, nebyly dosud identifikovány, s výjimkou OMP B1, což je protein s molekulovou hmotností 84 kDa (84 000), jehož exprexe je řízena železem, a který je rozpoznáván séry pacientů s pneumonií (Sethi, S.

a další (1995) Infect. Immun. 63: 1516), a UspA1 a UspA2 (Chen D. a další (1999), Infect. Immun. 67: 1310).

Několik dalších membránových proteinů přítomných na povrchu M. catarrhalis bylo charakterizováno použitím biochemických metod nebo jejich potenciální úlohou při indukci ochranné imunitní odpovědi (přehled viz Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). U modelu pneumonie na myši podporuje přítomnost protilátek proti některým z nich (UspA, CopB) rychlejší odstraňování plicní infekce. Další polypeptid (OMP CD) je u kmenů M. catarrhalis vysoce konzervovaný a vykazuje homologie s porinem Pseudomonas aeruginosa, u kterého bylo ukázáno, že je účinný proti této bakterii ve zvířecích modelech.

Četnost infekcí Moraxella catarrhalis v posledních několika desetiletích dramaticky vzrostla. To bylo připisováno vzniku kmenů s vícečetnou rezistencí na antibiotika a stoupající populaci lidí s oslabeným imunitním systémem. Není již neobvyklé izolovat kmeny

Moraxella catarrhalis, které mají rezistenci na některá nebo všechna standardní antibiotika. Tento jev vytvořil nezbytnou potřebu a

požadavky lékařů na nové protimikrobiální látky, vakciny, metody screeningu léčiv a diagnostické testy pro tento organismu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se táká BASB027, zvláště polypeptidů

BASB027 a polynukleotidů BASB027, rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se předkládaný vynález týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů, včetně mj. prevence a léčení mikrobiálních onemocnění. V dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro detekci onemocnění spojených s mikrobiálními infekcemi, a stavů spojených s těmito infekcemi, jako jsou testy pro detekci exprese nebo aktivity polynukleotidů nebo polypeptidů BASB027.

Různé změny a modifikace v rámci podstaty a rozsahu popisovaného vynálezu budou na základě následujícího popisu a dalších částí přihlášky odborníkům z oboru zřejmé.

Podrobný popis vynálezu

Vynález se týká polypeptidů a polynukleotidů BASB027, které budou podrobněji popisovány dále. Vynález se týká zvláště polypeptidů a polynukleotidů BASB027 Moraxella catarrhalis, který je homologií aminokyselinové sekvence příbuzný vnějšímu membránovému proteinu OMP85 Neisseria meningitidis. Vynález se zvláště týká BASB027 s nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3, popřípadě SEQ ID No. 2 nebo 4. Rozumí se, že sekvence uvedené ve výpisu sekvencí dále jako „DNA“ představují příklad jednoho provedení vynálezu, protože odborníkovi v oboru bude zřejmé, že tyto sekvence mohou být použity v polynukleotidech obecně, včetně ribopolynukleotidů.

• · • · • · · • · · · ·

Polypeptidy

V jednom provedení vynálezu se poskytují polypeptidy Moraxella catarrhalis označované dále jako „BASB027“ a „polypeptidy

BASB027“, stejně jako jejich biologicky, diagnosticky, preventivně, klinicky nebo terapeuticky použité varianty, a farmaceutické prostředky s jejich obsahem.

Předkládaný vynález dále poskytuje:

(a) izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespo“m 85% identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitu, se sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4;

(b) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynukleotidovou sekvenci, která má alespoň 85% is identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitu se SEQ ID No. 1 nebo 3 v celé délce SEQ ID No. 1, popřípadě 3; nebo (c) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má alespoň 85% identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4.

Polypeptidy BASB027 poskytované v SEQ ID No. 2 nebo 4 jsou polypeptidy BASB027 z Moraxella catarrhalis kmen Mc2931 (ATCC

43617).

Předkládaný vynález také poskytuje imunogenní fragment polypeptidu BASB027, tj. sousedící část polypeptidu BASB027, která má stejnou nebo v podstatě stejnou imunogenní aktivitu jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo

4; to znamená, že fragment (v případě potřeby navázaný na nosič) je • * • · schopný vyvolat imunitní odpověď, která rozpozná polypeptid BASB027. Takový imunogenní fragment může například obsahovat polypeptid BASB027 postrádající N-koncovou úvodní sekvenci, a/nebo transmembránovou doménu a/nebo C-koncovou zakotvovací doménu.

Ve výhodném provedení zahrnuje imunogenní fragment BASB027 podle předkládaného vynálezu v podstatě celou extracelulární doménu polypeptidů, který má alespoň 85% identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu se sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 po celé délce SEQ ID io No. 2.

Fragment je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako část, ale ne celek jakékoli aminokyselinové sekvence jakéhokoli polypeptidů podle vynálezu. Jako je tomu u polypeptidů BASB027, fragmenty mohou být „volné“ nebo obsažené uvnitř většího polypeptid, ze kterého tvoří část nebo oblast, nejvýhodněji jako jediná spojiná oblast v jediném větším polypeptidů.

Výhodné fragmenty zahrnují například zkrácené polypeptidy obsahující část aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo její varianty, jako jsou spojité řady zbytků, které obsahují amino20 a/nebo karboxykoncovou aminokyselinovou sekvenci. Výhodné jsou také degradační formy polypeptidů podle vynálezu produkované hostitelskou buňkou nebo v hostitelské buňce. Dále jsou výhodné fragmenty charakterizované strukturními nebo funkčními vlastnostmi, jako jsou fragmenty obsahující alfa-helix a oblasti vytvářející alfa-helix, beta-list a oblasti vytvářející beta-list, othyb a oblasti vytvářející ohyb, svinutí a oblasti vytvářející svinutí, hydrofilní oblasti, hydrofobní oblasti, alfa-amfipatické oblasti, beta-amfipatické oblasti, flexibilní oblasti, oblasti vytvářející povrch, oblasti vazby na substrát a oblasti s vysokým antigenním indexem.

Další výhodné fragmenty zahrnují izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci obsahující alespoň 15, 20, 30, ft ft

40, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin vytvořenou zkrácením nebo deleci z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4.

Fragmenty polypeptidů podle vynálezu mohou být použity pro výrobu odpovídajících polypeptidů s úplnou délkou peptidovou syntézou; proto mohou být tyto fragmenty použity jako meziprodukty pro výrobu polypeptidů podle vynálezu s úplnou délkou.

io Zvláště výhodné jsou varianty, ve kterých několik, 5 až 10, 1 až

5, 1 až 3, 1 až 2 nebo 1 aminokyselina jsou substituovány, deletovány nebo adovány v jakékoli kombinaci.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle vynálezu mohou být ve formě „zralého“ (maturního) proteinu nebo mohou být částí většího proteinu jako je prekurzor nebo fúzní protein. Často je výhodné zahrnout další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční nebo úvodní sekvence, prosekvence, sekvence napomáhající čištění jako jsou vícečetné histidinové zbytky, nebo další sekvence zlepšující stabilitu v průběhu výroby rekombinantním způsobem. Navíc

2o je také možno uvážit přidání exogenního polypeptidu nebo lipidové části nebo polynukleotidových sekvencí pro zvýšení imunogenní schopnosti hotové molekuly.

V jednom provedení se předkládaný vynález týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgG 1, jestliže fúze probíhá v oblasti závěsu. Ve zvláštním provedení může být část Fc jednoduše odstraněna zahrnutím štěpící sekvence, která může být odštěpena faktorem krevní srážlivosti Xa.

• · ·· : ; · · · · . ·;

♦ · · · · · · · · * • ··· 4 9 4 4444 4 4 4 4 * 4 4 4 4 4 4 4 _ g .............

Navíc se předkládaný vynález týká způsobu výroby těchto fúzních proteinů metodami genetického inženýrství a jejich použití pro screening léčiv, diagnózu a terapii. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů je možno nalézt v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/29458 a WO 94/22914.

Proteiny mohou být chemicky konjugovány nebo exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny umožňující produkci zvýšených koncentrací v expresním systému v porovnání s nefúzovaným proteinem. Fúzní partner může napomáhat při poskytování Thelperových epitopů (imunologický fúzní partner), s výhodou Thelperových epitopů rozpoznávaných člověkem, nebo napomáhat při expresi proteinu (látka zesilující expresi) s vyššími výtěžky než u nativního rekombinantního proteinu. Fúzní partner bude s výhodou jak imunologický fúzní partner, tak i partner zesilující expresi.

Mezi fúzní partnery patří protein D z Haemophillus influenzae a nestrukturní protein viru chřipky, NS1 (hemaglutinin). Dalším fúzním partnerem je protein známý jako LytA. S výhodou se používá Ckoncové části molekuly. Protein LytA je odvozen ze Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu, amidázu LytA (kódovanou genem lytA {Gene, 43 (1986), str. 265 - 272}), autolyzin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanové kostře. C-koncová doména proteinu LytA je odpovědná za afinitu k cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využívána pro vývoj plasmidů E. coli exprimujících C-LytA použitelných pro expresi fúzních proteinů. Purifikace hybridních proteinů obsahujících fragment C-LytA na svém aminovém konci již byla popsána {Biotechnology: 10, (1992), str. 795 - 798}. Je možné používat opakující se část molekuly LytA, která se nalézá na C-konci počínaje zbytkem 178, například zbytky 188 až 305.

Předkládaný vynález také zahrnuje varianty výše uvedených

polypeptidu, tj. polypeptidy, které se od referenčních polypeptidu liší substitucemi konzervativních aminokyselin, přičemž zbytek je substituován jiným zbytkem s podobnými vlastnostmi. Takové typické substituce probíhají mezi Ala, Val, Leu a Ile; mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi bazickými zbytky Lys a Arg; nebo aromatickými zbytky Phe a Tyr.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem. Mezi tyto polypeptidy patří izolované v přírodě se vyskytující polypeptidy, rekombinantním způsobem vyráběné polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy vyrobené kombinací těchto metod. Způsoby výroby takových polypeptidů jsou v oboru dobře známy.

Nejvýhodnější je, jestliže je polypeptid podle vynálezu odvozen z Moraxella catarrhalis, ačkoli může být s výhodou získán i z jiných organismů stejného taxonomického rodu. Polypeptid podle vynálezu může být také získán například z organismů stejné taxonomické třídy nebo řádu.

Polynukleotidy

2o Předmětem vynálezu je poskytnutí polynukleotidů, které kódují polypeptidy BASB027, zvláště polynukleotidů kódujících polypeptidy označované zde jako BASB027.

Zvláště výhodné provedení vynálezu představuje polynukleotidy zahrnující oblast kódující polypeptidy BASB027 obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3, které zahrnují gen v úplné délce nebo jeho variantu.

Polynukleotidy BASB027 poskytované v SEQ ID No. 1 nebo 3 jsou polynukleotidy BASB027 z Moraxella catarrhalis kmen Mc2931 (ATCC 43617).

Jako další provedení vynálezu se poskytují izolované molekuly • 9 nukleových kyselin kódující a/nebo exprimující polypeptidy a polynukleotidy BASB027, zvláště polypeptidy a polynukleotidy BASB027 Moraxella catarrhalis, včetně například nezpracovaných (neprocesovaných) RNA, ribozymových RNA, mRNA, cDNA, genomových DNA, B- a Z-DNA. Mezi další provedení vynálezu patří biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné polynukleotidy a polypeptidy a jejich varianty a prostředky s jejich obsahem.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká izolovaných polynukleotidů, včetně alespoň jednoho genu s úplnou délkou, které kódují polypeptid BASB027 s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 a polynukleotidy, které jsou s nimi úzce příbuzné, včetně jejich variant.

V dalším výhodném provedení vynálezu je poskytován polypeptid BASB027 z Moraxella catarrhalis, obsahující nebo složený z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo jeho varianta.

Použitím zde poskytovaných informací, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3, může být získán polynukleotid podle vynálezu kódující polypeptid BASB027, použitím standardních metod klonování a screeningu, jako jsou metody klonování a sekvenování fragmentů chromozomální DNA z bakterií s použitím buněk Moraxella catarrhalis Catlin jako výchozího materiálu, s následným získáním klonu s úplnou délkou. Například pro získání polynukleotidové sekvence podle vynálezu, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3, se typicky testuje knihovna klonů chromozomální DNA Moraxella catarrhalis Catlin v E. coli nebo některém jiném vhodném hostiteli pomocí radioaktivně značeného oligonukleotidu, s výhodou 17-meru nebo delšího, odvozeného z částečné sekvence. Klony nesoucí DNA identickou s DNA sondy, mohou být potom rozlišeny použitím stringentních podmínek hybridizace. Sekvenováním jednotlivých klonů takto identifikovaných hybridizací se sekvenačními primery navrženými pro originální polypeptidovou nebo polynukleotidovou sekvenci je potom možné prodlužovat polynukleotidovou sekvenci v obou směrech pro určení sekvence genu v úplné délce. Běžně se toto sekvenování provádí například použitím denaturované dvojřetězcové DNA připravené z plasmidového klonu. Vhodné způsoby se popisují v Maniatis, T., Fritsch, E. F. a Sambrook a další, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. vyd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (viz Screening io By Hybridization 1.90 a Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Může být také provedeno přímé sekvenování genomické DNA pro získání sekvence genu v úplné délce. Pro ilustraci vynálezu, každý polynukleotid uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3 byl objeven v knihovně DNA odvozené z Moraxella catarrhalis.

Navíc obsahuje každá sekvence DNA uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3 otevřený čtecí rámec kódující protein, který má přibližně stejný počet aminokyselinových zbytků, jako je uvedený v SEQ ID No. 2 nebo 4, s dedukovanou molekulovou hmotností, která může být vypočtena použitím hodnot molekulové hmotnosti aminokyselinových zbytků dobře známých odborníkům v oboru.

Polynukleotid SEQ ID No. 1, mezi startovacím kodonem na nukleotidu č. 1 a stopkodonem, který začíná na nukleotidu č. 2440 SEQ ID No. 1, kóduje polypeptid SEQ ID No. 2.

Polynukleotid SEQ ID No. 3, mezi startovacím kodonem 25 na nukleotidu č. 1 a stopkodonem, který začíná na nukleotidu č. 2440

SEQ ID No. 3, kóduje polypeptid SEQ ID No. 4.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález izolovaný polynukleotid, který obsahuje nebo který se skládá z:

(a) polynukleotidové sekvence, která má alespoň 85% identitu, 30 s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitu se SEQ ID No. 1 • 0 nebo 3 po celé délce SEQ ID No. 1, popřípadě 3; nebo (b) polynukleotidové sekvence kódující polypeptid, který má alespoň 85% identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, ještě výhodněji s výhodou alespoň 97 až 99% nebo 100% přesnou identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4, po celé délce SEQ ID No. 2, popřípadě 4.

Polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu, včetně homologů a orthologů z druhů jiných než Moraxella catarrhalis, může být získán způsobem zahrnujícím kroky screeningu vhodné io knihovny za stringentních podmínek hybridizace (například použitím teploty v rozmezí 45 až 65 °C a koncentrace SDS od 0,1 do 1 %) se značenou nebo detekovatelnou sondou, která se skládá nebo která obsahuje sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3 nebo její fragment; a izolace genu s úplnou délkou a/nebo genomických klonů obsahujících uvedenou polynukleotidovou sekvenci.

Vynález poskytuje polynukleotidovou sekvenci, která je identická po celé její délce s kódující sekvenci (otevřený čtecí rámec) v SEQ ID No. 1 nebo 3. Vynález také poskytuje kódující sekvenci zralého polypeptidu nebo jeho fragmentu samotného stejně jako kódující sekvence pro zralý polypeptid nebo fragment ve čtecím rámci s další kódující sekvencí, jako je sekvence kódující úvodní nebo sekreční sekvenci, pre- nebo pro- nebo prepro-proteinovou sekvenci. Polynukleotid podle vynálezu může také obsahovat alespoň jednu nekódující sekvenci, včetně například bez omezení alespoň jedné nekódující sekvence 5’ a 3’, jako jsou přepisované ale nepřekládané sekvence, terminační signály (jako jsou rho-dependentní a rhoindependentní terminační signály), ribosomová vazebná místa, Kozákovy sekvence, sekvence stabilizující mRNA, introny a polyadenylační signály. Polynukleotidová sekvence může také obsahovat další kódující sekvenci, která kóduje další aminokyseliny. Může být například kódována sekvence markéru, která umožňuje • · ····

·· • · • · čištění fúzovaného polypeptidu. V některých provedeních vynálezu je markerovou sekvencí hexa-histidinový peptid, jak se poskytuje ve vektoru pQE (Qiagen, lne.) a který je popsán v Gentz a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 86: 821 - 824 (1989), nebo HA peptidový tag (Wilson a další, Cell 37: 767 (1984), kde obě tyto sekvence mohou být použitelné při čištění polypeptidové sekvence, která je s nimi fúzována. Polynukleotidy podle vynálezu také bez omezení zahrnují polynukleotidy obsahující strukturní gen a jeho přirozeně asociované sekvence, které řídí expresi genu.

io Nukleotidová sekvence kódující BASB027 polypeptid SEQ ID

No. 2 nebo 4 může být identická s polypeptidovou kódující sekvencí obsaženou v nukleotidech 1 až 2439 SEQ ID No. 1, popřípadě 3. Alternativně může jít o sekvenci, která je výsledkem redundance (degenerace) genetického kódu, která také kóduje polypeptid SEQ ID

No. 2 nebo 4.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid“, jak se zde používá, zahrnuje polynukleotidy, které obsahují sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, zvláště bakteriální polypeptid a lépe polypeptid Moraxella catarrhalis BASB027 s aminokyselinovou sekvencí

2o uvedenou v SEQ ID No. 2 nebo 4. Tento termín také zahrnuje polynukleotidy, které obsahují jedinou spojitou oblast nebo nespojité oblasti kódující polypeptid (například polynukleotidy přerušené integrovaným fágem, integrovanou inzerční sekvencí, integrovanou vektorovu sekvencí, integrovanou transpozonovou sekvencí, nebo v důsledku editace RNA nebo reorganizace genomické DNA) spolu s dalšími oblastmi, které mohou také obsahovat kódující a/nebo nekódující sekvence.

Vynález se dále týká variant zde popisovaných polynukleotidů, které kódují varianky polypeptidu s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4. Fragmenty polynukleotidů podle vynálezu mohou být použity například pro syntézu polynukleotidů

-14*• 9 • 99

9 999 9 9

podle vynálezu s úplnou délkou.

Další zvláště výhodná provedení představují polynukleotidy kódující varianty BASB027, které mají aminokyselinovou sekvenci polypeptidu BASB027 SEQ ID No. 2 nebo 4, ve kterých je několik, málo, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádná aminokyselina substituováno, modifikováno, deletováno a/nebo adováno, a to v jakékoli kombinaci. Zvláště výhodné mezi těmito záměnami jsou mlčící (silent) substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti a aktivity polypeptidu BASB027.

io Další výhodné provedení vynálezu jsou polynukleotidy, které mají alespoň 85% identitu po celé jejich délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB027, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 2 nebo 4, a polynukleotidy, které jsou s těmito polynukleotidy komplementární. Alternativně jsou nejvýhodnější polynukleotidy, které obsahují oblast alespoň z 90 % identickou po celé své délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB027 a polynukleotidy s nimi komplementární. V tomto smyslu jsou zvláště výhodné polynukleotidy s alespoň 95% identitou po celé své délce. Navíc jsou mezi molekulami s identitou alespoň 95 % vysoce výhodné polynukleotidy s alespoň 97% identitou, a mezi těmito polynukleotidy jsou zvláště výhodné polynukleotidy s identitou alespoň 98 % a alespoň 99 %, přičemž ještě výhodnější jsou polynukleotidy s identitou alespoň 99 %.

Výhodná provedení představují polynukleotidy kódující polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako zralý polypeptid kódovaný DNA SEQ ID No. 1 nebo

3.

Podle některých výhodných provedení předkládaného vynálezu se poskytují polynukleotidy, které hybridizují, zvláště za stringentních podmínek, s polynukleotidovými sekvencemi BASB027, jako jsou polynukleotidy SEQ ID No. 1 nebo 3.

·· · • · · • ···· • · σ·Vynález se dále týká polynukleotidů, které hybridizují s poskytovanými polynukleotidovými sekvencemi. V tomto smyslu se vynález týká zvláště polynukleotidů, které hybridizují s popisovanými polynuklelotidy za stringentních podmínek. Jak se zde používá, termíny „stringentní podmínky“ a „stringentní podmínky hybridizace“ znamenají, že k hybridizaci dojde pouze v tom případě, kdy mezi sekvencemi existuje alespoň 95%, a s výhodou alespoň 97% identita. Specifickým příkladem stringentních podmínek hybridizace je inkubace přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím: 50% formamid, 5 x SSC io (150mM NaCl, 15mM citrát trisodný), 50mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10% sulfát dextranu, 20 pg/ml denaturované, působením střihu rozbité DNA lososího spermatu, s následným promytím hybridizačního nosiče v 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Hybridizace a podmínky praní jsou dobře známy a příklady se uvádějí v knize Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), zvláště kapitola 11. Pro polynukleotidové sekvence poskytované vynálezem může být také použita hybridizace v roztoku.

Předkládaný vynález také poskytuje polynukleotid, který se skládá nebo který obsahuje polynukleotidovou sekvenci získanou screeningem vhodné knihovny obsahující kompletní gen pro polynukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No. 1 nebo 3 za stringentních podmínek hybridizace se sondou, která má sekvenci uvedené polynukleotidové sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3 nebo jejího fragmentu; a izolací uvedené polynukleotidové sekvence. Fragmenty použitelné pro získání takového polynukleotidů zahrnují například sondy a primery, které budou úplně popsány na jiných místech.

Jak bude diskutováno dále vzhledem k polynukleotidovým analýzám podle vynálezu, polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity jako hybridizační sonda pro RNA, cDNA a genomickou DNA pro izolaci cDNA s úplnou délkou a genomických klonů kódujících BASB027 a pro izolaci cDNA a genomických klonů jiných genů, které • · mají vysokou identitu, zvláště vysokou sekvenční identitu, s genem BASB027. Tyto sondy budou obecně obsahovat alespoň 15 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Tyto sondy budou s výhodou obsahovat alespoň 30 nukleotidových zbytků nebo párů bází a mohou obsahovat alespoň 50 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Zvláště výhodné sondy budou obsahovat alespoň 20 nukleotidových zbytků nebo párů bází a budou obsahovat méně než 30 nukleotidových zbytků nebo párů bází.

Kódující oblast genu BASB027 může být izolována použitím io screeningu pomocí sekvence DNA poskytované v v SEQ ID No. 1 nebo 3 pro syntézu oligonukleotidové sondy. Značený oligonukleotid se sekvencí komplementární k sekvenci genu podle vynálezu se potom použije pro screening knihovny cDNA, genomické DNA nebo mRNA pro určení, které z členů knihovny se sondou hybridizují.

Existuje několik dostupných a odborníkům v oboru dobře známých metod pro získání DNA s úplnou délkou nebo pro prodloučení krátkých DNA, například metod založených na způsobu nazvaném Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) (viz například Frohman, a další, PNAS USA 85: 8998 - 9002, 1988). V poslední době vyvinuté modifikace tohoto způsobu, jejichž příklad je technologie Marathon™ (Clontech Laboratories lne.), mají výrazně zjednodušené hledání delších cDNA. Při technologii Marathon™ byly připraveny cDNA z mRNA extrahované ze zvolené tkáně a „adaptorové“ sekvence navázané na oba konce. Potom se provede amplifikace nukleové kyseliny (PCR) pro amplifikaci „chybějícího“ 5’-konce DNA s použitím kombinace oligonukleotidových primerů specifických pro gen a adaptor. Reakce PCR se potom opakuje s použitím „nested“ primerů, tj. primerů navržených tak, aby teplotně hybridizovaly s amplifikovaným produktem, typicky primer specifický pro adaptor, který teplotně hybridizuje dále ve směru 3’ v adaptorové sekvenci a primer specifický pro gen, který teplotně hybridizuje dále ve směru 5’ ve zvolené genové sekvenci. Produkty této reakce mohou být potom ··

- 17 ·· * · • · ·· ··· 0 · • ·

analyzovány sekvenováním DNA a DNA s úplnou délkou může být zkonstruována buď spojením produktu přímo s existující DNA za získání úplné sekvence nebo provedením oddělené PCR s úplnou délkou, využívající nové informace o sekvenci pro návrh 5’primeru.

Polynukleotídy a polypeptidy podle vynálezu mohou být použity například jako reakční činidla a materiály pro výzkum léčení a diagnózy onemocnění, zvláště onemocnění člověka, jak bude diskutováno dále v souvislosti s testy polynukleotidů.

Polynukleotídy podle vynálezu, které jsou oligonukleotidy io odvozené ze sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3, mohou být použity při popisovaném způsobu, ale s výhodou pro PCR, pro určeni, zda jsou nebo nejsou zde identifikované polynukleotídy v úplnosti nebo zčásti transkribovány v bakterii v infikované tkáni. Uvádí se, že tyto sekvence budou také použitelné při diagnóze stadia infekce a typu infekce, kterou patogen vyvolal.

Vynález také poskytuje polynukleotídy kódující polypeptid, který je zralý protein plus další aminokoncové nebo karboxykoncové aminokyseliny, nebo aminokyseliny uvnitř zralého polypeptidu (například jestliže má zralý protein více než jeden polypeptidový řetězec). Tyto sekvence mohou mít úlohu při zpracování (procesingu) proteinu z prekurzoru do zralé formy, mohou umožnit transport proteinu, mohou prodlužovat nebo zkracovat poločas proteinu nebo mohou umožňovat manipulaci s proteinem pro testování nebo výrobu. Jak je tomu obecně in vivo dodatečné aminokyseliny mohou být odděleny od zralého proteinu buněčnými enzymy.

Pro každý z polynukleotidů podle vynálezu se poskytuje polynukleotid, který je k němu komplementární. Je výhodné, jestliže jsou tyto komplementární polynukleotídy zcela komplementární s každým nukleotidem, se kterým jsou komplementární.

Prekurzorový protein, který má zralou formu polypeptidu fúzovanou s jednou nebo více prosekvencemi, může být inaktivní ·: · · · ·· . . .:

:*· ···· • ····. ·····.· , • · · · ·

- 18*-*..........

formou polypeptidů. Jestliže se prosekvence odstraní, tyto inaktivní prekurzory se obecně aktivují. Některé nebo všechny z těchto prosekvencí mohou být před aktivací odstraněny. Tyto prekurzory se obecně nazývají proproteiny.

Navíc ke standardním značkám A, G, C, T/U pro nukleotidy může být pro popis některých polynukleotidů podle vynálezu použit také termín „N“. „N“ znamená, že v takto označené poloze v sekvenci DNA nebo RNA může být přítomen jakýkoli ze čtyř DNA nebo RNA nukleotidů, a kromě toho je výhodné, jestliže N není nukleová kyselina, která v kombinaci se sousedícími nukleotidovými polohami, čtenými ve správném čtecím rámci, má za následek vytvoření kodonu předčasné terminace v tomto čtecím rámci.

V souhrnu, polynukleotid podle vynálezu může kódovat zralý protein, zralý protein plus úvodní sekvenci, který může být označen jako preprotein), prekurzor zralého proteinu obsahující jednu nebo více prosekvencí, které nejsou úvodními sekvencemi preproteinu nebo preproproteinu, který je prekurzor proproteinu, obsahující úrovní sekvenci a jednu nebo více prosekvencí, které se obecně odstraňují v průběhu kroků zpracování (procesingu), které poskytnou aktivní a zralé formy polypeptidů.

Podle jednoho provedení vynálezu se poskytuje použití polynukleotidu podle vynálezu pro terapeutické nebo profylaktické účely, zvláště genetickou imunizaci.

Použití polynukleotidu podle vynálezu při genetické imunizaci 25 bude s výhodou používat vhodný způsob dodávání, jako je přímá injekce plasmidové DNA do svalů (Wolff a další, Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe a další, Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), dodání DNA v komplexu se specifickými proteinovými nosiči (Wu a další, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), koprecipitace DNA s fosforečnanem vápenatým (Benvenisty & Reshef. PNAS USA (1986) 83: 9551), zapouzdení DNA do různých forem liposomú (Kaneda a • · další, Science (1989) 243: 375), bombardování částicemi (Tang a další, Nátuře (1992) 356: 152, Eisenbraun a další, DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) a infekce in vivo s použitím klonovaných retrovirových vektorů (Seeger a další, PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vektory, hostitelské buňky, expresní systémy

Předkládaný vynález se také týká vektorů, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk, které jsou vyrobeny metodami genetického inženýrství io s vektory podle vynálezu a avýroby polypeptidu podle vynálezu rekombinačními technikami. Pro výrobu těchto proteinů s použitím RNA odvozených z konstruktů DNA podle vynálezu mohou být také použity bezbuněčné translační systémy.

Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného vynálezu 15 mohou být připraveny způsoby dobře známými odborníkům v oboru z hostitelských buněk získaných metodami genetického inženýrství obsahujících expresní systémy. V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká expresních systémů, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle předkládaného vynálezu, hostitelských buněk, které jsou získány metodami genetického inženýrství s těmito expresními systémy, a produkce polypeptidů podle vynálezu rekombinantními technikami.

Pro rekombinantní produkci polypeptidů podle vynálezu mohou být hostitelské buňky upraveny metodami genového inženýrství tak, aby obsahovaly expresní systémy nebo jejich části nebo polynukleotidy podle vynálezu. Zavedení polynukleotidu do hostitelské buňky může být uskutečněno způsoby popsanými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako je Davis a další, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) a Sambrook, a další, ao MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), jako

* ·

je transfekce s použitím fosforečnanu vápenatého, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem, transvekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovými lipidy, elektroporace, transdukce, vnášení škrabáním, balistické vnášení a infekce.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako jsou buňky streptokoků, stafylokoků, enterokoků, E. coli, streptomycet, kyanobakterií, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis a Moraxella catarrhalis·, houbové buňky, jako jsou buňky kvasinek, Kluveromyces, Saccharomyces a basidiomycet, Candida albicans a

Aspergillus·, hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 a buňky Bowesova melanomů; a rostlinné buňky jako jsou buňky gymnospermu nebo angiospermu.

Pro výrobu polypeptidů podle vynálezu může být použita celá řada expresních systémů. Mezi tyto vektory patří mj. vektory odvozené z chromozomů, episomů a virů, například vektory odvozené z bakteriálních plasmidů, z bakteriofágů, z transposonů, z kvasinkových episomů, z inzerčních elementů, z kvasinkových chromozomálních elementů, z virů jako jsou bakuloviry, papovaviry, jako SV40, viry vakcinie, adenoviry, viry drůbežích neštovic, viry pseudorabies, pikornaviry, retroviry a alfaviry a vektory odvozené z jejich kombinací jako jsou vektory odvozené z plasmidových a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fágmidy. Konstrukty expresního systému mohou obsahovat řídící oblasti, které regulují a podporují expresi. Obecně může být pro expresi v tomto smyslu použit jakýkoli systém nebo vektor vhodný pro udržování, propagaci nebo expresi polynukleotidů a/nebo pro expresi polypeptidu u hostitele. Vhodná sekvence DNA může být do expresního systému vložena jakýmkoli z řady dobře známých a rutinních způsobů, jako jsou například postupy uváděné v Sambrook a další, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (výše).

• · • · ··· · · · é · · í • ··· · · · ···· · · z ·

- 2Ϊ - ’* *”* ’ *··* ·’·

V rekombinantních expresních systémech u eukaryot mohou být do exprimovaného polypeptidů zahrnuty vhodné sekreční signály pro sekreci překládaného proteinu do lumen endoplasmatického retikula, do periplasmatického prostoru nebo do extracelulárního prostředí.

Tyto signály mohou být vzhledem k polypeptidů endogenní nebo může jít o heterologní signály.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány a čištěny z rekombinantních buněčných kultur pomocí dobře známých metod včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakce kyselinou, aniontové nebo kationtové iontoměničové chromatografie, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie s využitím hydrofobních interakcí, afinitní chromatografie, chromatografie na hydroxylapatitu a lektinové chromatografie. Nejvýhodněji se pro purifikaci používá afinitní chromatografie s využitím kovových iontů (IMAC). Dobře známé techniky pro skládání prostorové struktury (refolding) proteinů mohou být použity pro regeneraci aktivní konformace, jestliže se polypeptid v průběhu intracelulární syntézy, izolace a/nebo purifikace denaturuje.

Expresní systém může být také rekombinantní živý mikroorganismus, jako je virus nebo bakterie. Příslušný gen může být vložen do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Inokulace a infekce tímto živým vektorem in vivo povede k expresi in vivo antigenu a indukci imunitních odpovědí. Viry a bakterie používané pro tyto účely jsou například: viry planých neštovic (např. vakcinie, drůbeží neštovice, kanáři neštovice (canary pox); alfaviry (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus Venezuelian Echin Encephalitis), adenoviry, viry asociované s adenoviry, pikornaviry (poliovirus, rhinovirus), herpesviry (virus varicella zoster atd.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Tyto viry nebo bakterie mohou být virulentní nebo různými způsoby oslabené pro získání živých vakcín. Tyto živé vakcíny rovněž tvoří část vynálezu.

• ·

·· · · · · · • · · · · · ft • ··· · · ftft··· · • · · · · . 22 -.....

Diagnostické, prognostické, sérotypové a mutační testy

Předkládaný vynález se týká také použití polynukleotidů a polypeptidů BASB027 podle vynálezu jako diagnostických činidel.

Detekce polynukleotidů a/nebo polypeptidů BASB027 u eukaryot, zvláště u savců a zvláště u Člověka poskytne diagnostickou metodu pro diagnózu onemocnění, fáze onemocnění nebo odpovědi infekčního organismu na léky. Eukaryotické organismy, zvláště savci a zejména lidé, zvláště infikovaní nebo s podezřením na infekci organismem obsahujícím gen nebo protein BASB027, mohou být detekovány na úrovni nukleových kyselin nebo aminokyselin řadou dobře známých způsobů stejně jako způsoby poskytovanými v předkládaném vynálezu.

Polypeptidy a polynukleotidy pro prognózu, diagnózu nebo jiné analýzy mohou být získány z tělesných materiálů domněle infikovaných a/nebo infikovaných jednotlivců. Polynukleotidy z jakéhokoli z těchto zdrojů, zvláště DNA nebo RNA, mohou být použity přímo pro detekci nebo mohou být enzymaticky amplifikovány použitím PCR nebo jiné techniky amplifikace před analýzou. RNA, zejména mRNA, cDNA a genomická DNA mohou být při těchto testech použity také. S použitím amplifikace, charakterizace druhu a kmene infekčního nebo residentního organismu přítomného u jednotlivce může být prováděna analýza genotypu zvoleného polynukleotidu organismu. Delece a inzerce mohou být detekovány změnou velikosti amplifikovaného produktu v porovnání s genotypem referenční sekvence vybrané z příbuzného organismu, s výhodou různého druhu stejného rodu nebo různého kmenu stejného druhu. Bodové mutace mohou být identifikovány hybridizací amplifikované DNA se značenými polynukleotidovými sekvencemi BASB027. Dokonale nebo výrazně souhlasící sekvence mohou být odlišeny od nedostatečně souhlasících nebo výrazněji nesouhlasících duplexů štěpením DNázou nebo • 9

RNázou v případě DNA, popřípadě RNA, nebo detekcí rozdílů v teplotách tání nebo s využitím kinetiky renaturace. Rozdíly v polynukleotidové sekvenci mohou být také detekovány změnami v elektroforetické pohyblivosti polynukleotidových fragmentů v gelech v porovnání s referenční sekvencí. To může být provedeno bez denaturačních činidel. Rozdíly mezi polynukleotidy mohou být také detekovány přímým sekvenováním DNA nebo RNA, viz například Myers a další, Science, 230: 1242 (1985).

Změny sekvence ve specifických místech mohou být také io odhaleny testy s nukleázovou ochranou, jako je test s RNázovou ochranou, V1 a S1, nebo metodou chemického štěpení, viz například

Cotton a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85: 4397 - 4401 (1985).

V dalším provedení může být zkonstruována řada oligonukleotidových sond obsahujících nukleotidovou sekvenci

BASB027 nebo její fragmenty pro provedení účinného screeningu například na genetické mutace, sérotyp, taxonomickou klasifikaci nebo identifikaci. Metody s použitím souboru (array) sond jsou dobře známé a jsou obecně použitelné a mohou být použity pro řešení řady otázek v souvislosti s molekulární genetikou včetně genové exprese, genetické vazby a genetické variability (viz například Chee a další, Science, 274: 610 (1996)).

V dalším provedení se předkládaný vynález týká diagnostického kitu, který obsahuje:

(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s výhodou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3, nebo její fragment;

(b) nukleotidovou sekvenci komplementární se sekvencí podle (a);

(c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, s výhodou polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo jeho fragment; nebo (d) protilátku proti polypeptidu podle předkládaného vynálezu • · · · • · · · · · ·

- 2’4·- ·· • · • · ·· · s výhodou proti polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4.

Bude zřejmé, že v jakémkoli takovém kitu mohou podstatnou složku tvořit látky z odstavců (a), (b), (c) nebo (d). Takový kit bude použitelný mj. při diagnóze onemocnění nebo vnímavosti k onemocnění.

Předkládaný vynález se tako týká použití polynukleotidů podle předkládaného vynálezu jako diagnostických reagencií. Detekce mutované formy polynukleotidu podle vynálezu, s výhodou SEQ ID No. 1 nebo 3, která je spojena s onemocněním nebo patogenním vlivem, io bude poskytovat diagnostický nástroj, který může přispět k diagnóze nebo definici onemocnění, prognózy nebo průběhu onemocnění, určení stadia onemocnění nebo vnímavosti k onemocnění, které vede ke snížení exprese, zvýšení exprese nebo změně exprese polynukleotidu. Organismy, zvláště infekční organismy nesoucí mutace takového polynukleotidu mohou být detekovány na polynukleotidové úrovni řadou způsobů, jako například způsoby popisované v přihlášce na jiných místech.

Buňky z organismu nesoucí mutace nebo polymorfismy (alelické variace) v polynukleotidu a/nebo polypeptidu podle vynálezu mohou být také detekovány na polynukleotidové a/nebo polypeptidové úrovni řadou technik pro zjištění například jejich sérotypu. Pro detekci mutací v RNA je například možno použít RT-PCR. Zvláště výhodné je používat RT-PCR ve spojení s automatickými detekčními systémy, jako je například GeneScan. RNA, cDNA nebo genomická DNA mohou být podobně použity ke stejnému účelu PCR. Pro identifikaci a analýzu mutací mohou být například použity primery PCR komplementární s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB027.

Předkládaný vynález dále poskytuje primery, které mají odstraněny 1, 2, 3 nebo 4 nukleotidy z 5’ a/nebo 3’konce. Tyto primery mohou být mimo jiné použity pro amplifikaci DNA a/nebo RNA BASB027 izolované ze vzorku pocházejícího z jednotlivce, jako ·· • · například tělesného materiálu. Primery mohou být použity pro amplifikaci polynukleotidu izolovaného z infikovaného jedince, takže polynukleotid může být potom zpracován různými způsoby pro objasnění polynukleotidové sekvence. Tímto způsobem je možno detekovat mutace v polynukleotidové sekvenci a použít je pro diagnózu a/nebo prognózu infekce nebo jejího stadia nebo průběhu nebo pro určení sérotypu a/nebo klasifikaci infekčního činitele.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro diagnózu onemocnění, zvláště bakteriálních infekcí, výhodněji infekcí způsobených Moraxella catarrhalis, který zahrnuje určení zvýšené úrovně exprese polynukleotidu se sekvencí SEQ ID No. 1 nebo 3 u vzorku z jednotlivce, jako je tělesný materiál. Zvýšená nebo snížená exprese polynukleotidu BASB027 může být měřena jakýmkoli způsobem známým v oboru pro kvantifikaci polynukleotidů, jako je například amplifikace, PCR, RT-PCR, RNázová ochrana, northernový přenos, spektrometrie a další způsoby hybridizace.

Diagnostický test podle předkládaného vynálezu pro detekci nadměrné exprese polypeptidu BASB027 ve srovnání s normálními vzorky kontrolní tkáně může být navíc použit například pro detekci přítomnosti infekce. Způsoby použitelné pro zjištění hladin polypeptidu BASB027 ve vzorku pocházejícím z hostitele, jako například tělesného materiálu, jsou odborníkům v oboru dobře známé. Mezi tyto testovací metody patří radioimunologické analýzy, testy s kompetitivní vazbou, analýzy pomocí westernového přenosu, sendvičové testy s použitím protilátek, detekce protilátek a testy ELISA.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity jako složky souborů (arrays) polynukleotidů, s výhodou souborů nebo mříží s vysokou hustotou. Tyto soubory s vysokou hustotou jsou použitelné zvláště pro diagnostické a prognostické účely. Soubor teček, vždy s obsahem rozdílného genu, a dále s obsahem polynukleotidu nebo polynukleotidů podle vynálezu, může být použit pro sondování, • * ·

- 2tJnapříklad s použitím hybridizace nebo amplifikace nukleových kyselin, pomocí sond získaných nebo odvozených z tělesného vzorku, pro zjištění přítomnosti konkrétní polynukleotidové sekvence nebo příbuzné sekvence u jedince. Taková přítomnost může ukazovat na přítomnost patogenu, zvláště Moraxella catarrhalis, a může být použitelná pro diagnózu a/nebo prognózu onemocnění nebo průběhu onemocnění. Mříž obsahující řadu variant polynukleotidové sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3 je výhodná. Výhodná je také mříž obsahující větší počet variant polynukleotidové sekvence kódující polypeptidovou io sekvenci SEQ ID No. 2 nebo 4.

Protilátky

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu, nebo jejich varianty nebo buňky exprimující tyto polypeptidy a polynukleotidy mohou být použity jako imunogeny pro produkci protilátek imunospecifických pro tyto polypeptidy, popřípadě polynukleotidy.

V určitých výhodných provedeních předkládaného vynálezu se poskytují protilátky proti polypeptidům nebo polynukleotidům BASB027.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu mohou být získávány podáváním polypeptidů a/nebo polynukleotidů podle vynálezu, nebo fragmentů nesoucích epitopy polynukleotidů nebo polypeptidů podle vynálezu, a analogů jedné nebo z obou těchto látek, nebo buněk exprimujících jednu nebo obě tyto látky, nebo zvířat, s výhodou různých od člověka, použitím rutinních protokolů. Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použit jakýkoli v oboru známý způsob, který poskytuje protilátky produkované kontinuálními kulturami buněčných linií. Mezi příklady patří různé způsoby, jako se popisují například v Kohier, G. a Milstein, C., Nátuře

256: 495 - 497 (1975); Kozbor a další, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole a další, str. 77 - 96 v MONOCLONAL ANTIBODIES AND • 0 ··· 0 · • · * 0 0 000 0 « 0

CANCER THERAPY, Alan R. Liss, lne. (1985).

Techniky pro výrobu jednořetězcových protilátek (US patent No. 4,946,778) mohou být upraveny pro výrobu jednořetězcových protilátek proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle předkládaného vynálezu. Pro expresi humanizovaných protilátek imunospecifických proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu mohou být použity také transgenní myši nebo jiné organismy nebo živočichové, jako jsou jiní savci.

Pro volbu genů protilátek s vazebnými aktivitami k polypeptidu io podle vynálezu buď ze souboru v-genů nebo lymfocytů amplifikovaných PCR z lidí, u kterých byly sereeningem zjištěny protilátky anti-BASB027 nebo z neupravených knihoven, může být použita technologie typu phage display (McCafferty, a další, (1990), Nátuře 348, 552 - 554; Marks, a další, (1992) Biotechnology 10, 779 15 783). Afinita těchto protilátek může být také zlepšena například míšením řetězců (Clackson, a další (1991) Nátuře 352: 628).

Výše popsané protilátky mohou být použity pro izolaci nebo identifikaci klonů exprimujících polypeptidy nebo polynukleotídy podle vynálezu pro vyčištění polypeptidů nebo polynukleotidů například afinitní chromatografií.

Pro léčení infekcí, zvláště bakteriálních infekcí, mohou být tedy mj. použity protilátky proti polypeptidu BASB027 nebo polynukleotidů BASB027.

Mezi varianty polypeptidů patří antigenně, epitopově nebo 25 imunologicky ekvivalentní varianty z příslušného provedení předkládaného vynálezu.

Protilátky nebo jejich varianty se s výhodou modifikují, aby bylo dosaženo jejich nižší imunogenicity u jednotlivce. Například jestliže tímto jednotlivcem je člověk, protilátka může být nejvýhodněji „humanizována“, přičemž oblast nebo oblasti protilátky odvozené *

9 9 • 999 9

- 28’- ·· z hybridomu se transplantují do lidské monoklonální protilátky, například jak se popisuje v Jones a další (1986), Nátuře 321, 522 525 nebo Tempest a další (1991), Biotechnology 9, 266 - 273.

Látky s antagonistickým a aqonistickym účinkem - testy a molekuly

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu mohou být také použity pro testování vazby substrátů a ligandů s malými molekulami, například buněk, bezbuněčných preparátů, chemických knihoven a směsí přírodních produktů. Tyto substráty a ligandy mohou být io přirozené substráty a ligandy, nebo mohou napodobovat jejich strukturu nebo funkci, viz např. Coligan a další, Current Protocols in

Immunology 1 (2): kapitola 5 (1991).

Metody screeningu mohou jednoduše měřit vazbu sloučeniny, která má již určité předpoklady, na polypeptid nebo polynukleotid, nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid nebo polynukleotid, nebo fúzní protein polypeptidu pomocí značky, která je přímo nebo nepřímo spojena se sloučeninou, která má určité předpoklady, alternativně může metoda screeningu zahrnovat kompetitivní interakce se značeným kompetitorem. Tyto metody screeningu mohou dále testovat, zda poskytuje vybraná sloučenina výsledky z hlediska signálu vytvořeného aktivací nebo inhibici polypeptidu nebo polynukleotidu s použitím detekčních systémů vhodných pro buňky obsahující polypeptid nebo polynukleotid. Inhibitory aktivace se obecně testují v přítomnosti známého agonisty, přičemž se pozoruje vliv přítomnosti vybrané sloučeniny na aktivaci pomocí látky s agonistickými účinky. Při metodách screeningu na látky s inverzně agonistickými nebo inhibičními účinky mohou být použity konstitutivně aktivní polypeptidy a/nebo konstitutivně exprimované polypeptidy a polynukleotidy v nepřítomnosti látky s agonistickými nebo inhibičními účinky testováním, zda přítomnost vybrané sloučeniny vede k inhibici nebo aktivaci polypeptidu nebo

9

9

9 • 999

29*- ♦·’ polynukleotidů, jak by měla v konkrétním případě nastat. Metody screeningu mohou dále jednoduše zahrnovat kroky míšení vybrané testované sloučeniny („kandidát“) s roztokem obsahujícím polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu za vytvoření směsi, měření aktivity polypeptidů a/nebo polynukleotidů BASB027 ve směsi a porovnání aktivity polypeptidů a/nebo polynukleotidů BASB027 ve směsi se standardem. Pro vysoce výkonné testy pro identifikaci antagonistů polypeptidů podle předkládaného vynálezu, stejně jako fylogeneticky a/nebo funkčně příbužných polypeptidů mohou být také io použity fúzní proteiny, jako například látky připravené z části Fc a polypeptidů BASB027, jak bylo popsáno výše (viz D. Bennett a další, J. Mol. Recognition, 8: 52 - 58 (1995); a K. Johanson a další, J. Biol.

Chem., 270 (16): 9459 - 9471 (1995)).

Polynukleotidy, polypeptidy a protilátky, které se vážou na a/nebo interagují s polypeptidem podle předkládaného vynálezu, mohou být také použity pro konfiguraci metod screeningu pro detekci vlivu přidaných sloučenin na produkci mRNA a/nebo polypeptidů v buňkách. Například je možno zkonstruovat test ELISA pro měření hladin sekrenovaného polypeptidů nebo polypeptidů asociovaného s buňkou s použitím monoklonálních a polyklonálních protilátek standardními metodami známými v oboru. Tato metoda může být použita pro odhalení látek, které mohou inhibovat nebo zesilovat produkci polypeptidů (nazývané také látky s antagonistickými, popřípadě agonistickými účinky) z vhodně manipulovaných buněk nebo tkání.

Vynález také poskytuje způsob screeningu sloučenin pro identifikaci, které z nich zesilují (agonistické látky) nebo blokují (antagonistické látky) působení polypeptidů nebo polynukleotidů BASB027, zvláště těch sloučenin, které jsou bakteriostatické a/nebo

3o baktericidní. Při metodě screeningu je možno používat techniky s vysokým výkonem. Například pro screeníng na látky s agonistickým nebo antagonistickým účinkem se syntetická reakční směs, buněčný • ·

30·- *· kompartment, jako je membrána, buněčný obal nebo buněčná stěna, nebo preparát jakéhokoli z těchto prvků obsahující polypeptid BASB027 a značený substrát nebo ligand takového polypeptidů inkubují v nepřítomnosti nebo přítomnosti testované molekuly, kterou může být agonista nebo antagonista BASB027. Schopnost testované molekuly agonizovat nebo antagonizovat polypeptid BASB027 se odráží ve snížené vazbě značeného ligandu nebo snížené tvorbě produktu z tohoto substrátu. Molekuly, které se pouze vážou, tj. bez indukce efektů polypeptidu BASB027, jsou nejpravděpodobněji dobrými antagonisty. Molekuly, které se dobře vážou a v jednotlivých případech mohou zvyšovat míru tvorby produktu ze substrátu, zvyšovat přenos signálu nebo zvyšovat aktivitu chemického kanálu, jsou agonisté. Detekce rychlosti nebo míry, vždy podle konkrétního případu, tvorby produktu ze substrátu, přenosu signálu nebo aktivity chemického kanálu může být zvýšena použitím reporterového systému. Reportérové systémy, které mohou být v tomto ohledu použitelné, zahrnují bez omezení kolorimetrické metody, přeměnu značeného substrátu na produkt, reporterový gen odpovědný za změny v aktivity polynukleotidů nebo polypeptidu BASB027, a v oboru známé vazebné testy.

Dalším příkladem testu na agonisty BASB027 je kompetitivní test, který kombinuje BASB027 a látku s potenciálními agonistickými účinky s molekulami, které se vážou na BASB027, rekombinantními vazebnými molekulami na BASB027, přirozenými substráty nebo ligandy, nebo látkami napodobujícími ligandy, za vhodných podmínek pro test využívající kompetitivní inhibice. BASB027 může být označen, například radioaktivně nebo sloučeninou zjistitelnou kolorimetricky, takže počet molekul BASB027 navážených na vazebnou molekulu nebo přeměněných na produkt může být přesně určen a tím může být zjištěna účinnost potenciálního antagonisty.

Mezi látky s potenciálními antagonistickými účinky patří mj. malé organické molekuly, peptidy, polypeptidy a protilátky, které se vážou na polynukleotid a/nebo polypeptid podle vynálezu, a tím inhibují nebo ruší jeho aktivitu nebo expresi. Potenciálními antagonisty mohou také být malé organické molekuly, peptid, polypeptid, jako je úzce příbuzný protein nebo protilátka, které se vážou na stejná místa na vazebné molekule, aniž by indukovaly účinky BASB027, čímž se dosáhne zabránění účinku nebo exprese polypeptidů a/nebo polynukleotidů BASB027 vyloučením polypeptidů a/nebo polynukleotidů BASB027 z vazby.

Mezi potenciální antagonisty patří malé molekuly, které se vážou na vazebné místo polypeptidu a obsadí je, čímž zabrání vazbě buněčných vazebných molekul, takže se zamezí normální biologické aktivitě. Mezi příklady malých molekul patří bez omezení malé organické molekuly, peptidy nebo molekuly podobné peptidům. Mezi další potenciální antagonisty patří molekuly antisense (viz Okano, J.

Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS

ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boča Raton, FL (1988), kde se tyto molekuly popisují. Mezi výhodné potenciální antagonisty patří sloučeniny, které jsou s BASB027 příbuzné, a jeho varianty.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgG 1, kde fúze probíhá v oblasti závěsu. Ve zvláštním provedení může být část Fc jednoduše odstraněna zavedením štěpící sekvence, která může být odštěpena faktorem srážení krve Xa. Předkládaný vynález se dále týká způsobů výroby těchto fúzních proteinů metodami genetického inženýrství a jejich použití pro screening léčiv, diagnózu a terapii. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie

- 32 »· » · » · ·· • · · • ···« ♦ · · • · · · • · · • · · • · · • · 44 4 fúzních proteinů je možno nalézt v mezinárodních patentových přihláškách No. WO 94/29458 a WO 94/22914.

Každá z poskytovaných sekvencí může být použita pro objevování a vývoj antibakteriálních sloučenin. Kódovaný protein může být po expresi použit jako cíl pro screening protibakteriálních léčiv. Navíc mohou být polynukleotidové sekvence kódující aminokoncové oblasti kódovaného proteinu nebo Shine-Delgarnovu sekvenci nebo jiné sekvence umožňující translaci odpovídající mRNA použity pro konstrukci sekvencí antisense pro řízení exprese vybraných kódujících io sekvencí.

Předkládaný vynález také poskytuje použití polypeptidu, polynukleotidu, agonisty nebo antagonisty podle vynálezu pro interferenci s počáteční fyzickou interakcí mezi patogenem nebo patogeny a eukaryotickým, s výhodou savčím hostitelem odpovědným za následnou nemoc. Molekuly podle vynálezu mohou být použity zvláště při prevenci adheze bakterií, zvláště grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií na proteiny eukaryotické, s výhodou savčí extracelulární matrice nebo do organismu zasahujících útvarů nebo proteinů extracelulární matrice v poraněních; pro blokování adheze bakterií mezi proteiny eukaryotické, s výhodou savčí extracelulární matrice a bakteriálními proteiny BASB027, které zprostředkují poškození tkáně; a/nebo pro blokování normálního postupu patogeneze iniciované jinak než implantací zařízení zasahujících dovnitř organismu nebo jinými chirurgickými postupy.

Podle dalšího provedení vynálezu se poskytují látky s antagonistickým a agonistickým účinkem na BASB027, s výhodou agonistické a antagonistické látky s bakteriostatickým nebo baktericidním účinkem.

Látky s antagonistickým a agonistickým účinkem podle vynálezu mohou být použity například pro prevenci, inhibici a/nebo léčení onemocnění.

·· · ··© • · • · © • ··© • · ·♦ · • · ·» • ♦ · © · · © • ♦ « ·· ©··

V dalším provedení se předkládaný vynález týká mimotopů polypeptidu podle vynálezu. Mimotop znamená peptidovou sekvenci dostatečně podobnou přirozenému peptidu (sekvencí nebo strukturou), který je schopen rozpoznání protilátkami, které rozpoznávají přirozený peptid; nebo je schopen vyvolat tvorbu protilátek, které rozpoznávají přirozený peptid při navázání na vhodný nosič.

Peptidové mimotopy mohou být navrženy pro konkrétní účel adicí, delecí nebo substitucí zvolených aminokyselin. Peptidy mohou tedy být modifikovány pro účely usnadnění konjugace s proteinovým nosičem. U některých metod chemické konjugace může být například žádoucí přidat koncový cystein. U peptidů konjugovaných s proteinovým nosičem může být vhodné přidat hydrofobní zakončení na části vzdálené od konjugovaného zakončení peptidu, takže volný nekonjugovaný konec peptidu zůstává asociován s povrchem nosného proteinu. Tak dochází k prezentaci peptidu v konformaci, která nejblíže napodobuje konformaci peptidu tak jak se nalézá u úplné nativní molekuly. Peptidy mohou být například měněny tak, aby obsahovaly Nkoncový cystein a C-koncové hydrofobní amidované zakončení. Alternativně je možno provést adici nebo substituci D-stereoisomerní formy jedné nebo více aminokyselin pro vytvoření výhodného derivátu, například se zvýšenou stabilitou peptidu.

Peptidové mimotopy mohou být alternativně identifikovány použitím protilátek, které jsou samy o sobě schopny vazby na polypeptidy podle předkládaného vynálezu, použitím technik jako je technologie typu phage display (EP 0 552 267 B1). Tato technika poskytuje velký počet peptidových sekvencí, které napodobují strukturu nativních peptidů, a jsou proto schopny vazby na anti-nativní peptidové protilátky, ale nemusí mít nezbytně významnou sekvenční homologii s nativním polypeptidem.

··· © © ·· ·· · • · © • · · * • · ···· · • · · ·· ·

Vakcíny

Další provedení vynálezu se týká způsobu indukce imunologické odpovědi u jednotlivce, zvláště savce, s výhodou u lidí, který zahrnuje inokulaci jednotlivce polynukleotidem a/nebo polypeptidem BASB027, nebo jeho fragmentem nebo variantou, které postačují pro produkci protilátky a/nebo pro vyvolání imunitní odpovědi T-buněk pro ochranu uvedeného jednotlivce před infekcí, zvláště bakteriální infekcí a zejména infekcí Moraxella catharrhalis. Poskytují se také metody, při kterých tato imunologická odpověď zpomaluje replikaci bakterií. Ještě další provedení vynálezu se týká způsobu indukce imunitní odpovědi u jednotlivce, který zahrnuje dodání nukleové kyseliny jako vektoru, sekvence nebo ribozymu do jednotlivce pro přímou expresi polynukleotidu a/nebo polypeptidu BASB027, nebo jeho fragmentu nebo varianty pro expresi polynukleotidu a/nebo polypeptidu

BASB027, nebo jeho fragmentu nebo varianty in vivo s cílem indukovat imunitní odpověď, jako je produkce protilátky a/nebo imunitní odpověď T-buněk, včetně například T-buněk produkujících cytokiny nebo cytotoxických T-buněk, pro ochranu uvedeného jednotlivce, s výhodou člověka, před onemocněním, ať již je toto onemocnění v jednotlivci vyvinuto nebo ne. Jedním příkladem podávání genu je jeho urychlení do požadovaných buněk ve formě povlaku na částicích nebo jiným způsobem. Takový vektor nukleové kyseliny může obsahovat DNA, RNA, ribozym, modifikovanou nukleovou kyselinu, hybrid DNA/RNA, komplex DNA-protein nebo komplex RNA-protein.

V dalším provedení se vynález týká imunologického prostředku, shopného při zavedení do jednotlivce, s výhodou člověka, u něj schopen indukovat imunitní odpověď, který u tohoto jednotlivce indukuje imunitní odpověď na polynukleotid BASB027 a/nebo jím kódovaný polypeptid, přičemž prostředek obsahuje rekombinantní polynukleotid BASB027 a/nebo jím kódovaný polypeptid a/nebo obsahuje DNA a/nebo RNA kódující a exprimující antigen uvedeného

- 35 φφ • φ φ ·

Φ·· φ φ φ φφ

Φ φ φ φφφ • φφφφ φ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ

φ φ

φφφ polynukleotidu BASB027, polypeptidů kódovaného tímto polynukleotidem nebo jiného polypeptidů podle vynálezu. Imunitní odpověď může být použita terapeuticky nebo preventivně a může být ve formě protilátkové imunity a/nebo buněčné imunity, jako je buněčná imunita způsobená T-buňkami CTL nebo CD4+.

Polypeptid BASB027 nebo jeho fragment může být fúzován s pomocným proteinem nebo chemickou skupinou, které mohou nebo nemusí samy o sobě produkovat protilátky, ale které jsou schopny stabilizovat první protein a vytvořit fúzovaný nebo modifikovaný protein, který bude mít antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti, a s výhodou ochranné vlastnosti. Takový fúzní rekombinantní protein s výhodou dále obsahuje antigenní pomocný protein (koprotein) jako je lipoprotein D z Haemophilus influenzae, glutathion-S-transferáza (GST) nebo betagalaktosidáza, nebo jakýkoli jiný relativně velký pomocný protein, který protein solubilizuje a umožní jeho produkci a purifikaci. Navíc může pomocný protein působit jako adjuvans ve smyslu poskytnutí generalizované stimulace imunitního systému organismu, který přijme protein. Pomocný protein může být navázán jak na aminový, tak i na karboxylový konec prvního proteinu.

Vynález poskytuje prostředky, zvláště vakcíny, a způsoby zahrnující polypepticy a/nebo polynukleotidy podle vynálezu a imunostimulační DNA sekvence, jako se popisují v Sáto, Y. a další, Science 273: 352 (1996).

Vynález také poskytuje způsoby použití popisovaného 25 polynukleotidu nebo jeho určitých fragmentů, o kterých se ukázalo, že kódují nevariabilní oblasti proteinů buněčného povrchu bakterií, v konstruktech polynukleotidů použitých při těchto experimentech s genetickou imunizací ve zvířecích modelech infekce Moraxella catarrhalis. Tyto experimenty budou zvláště použitelné pro identifikaci

3o epitopů proteinů schopných vyvolat preventivní nebo terapeutickou imunitní odpověď. Předpokládá se, že tento přístup umožní následnou • · · · · · · · ··· ··· ···· ·· _a • ··· a · a ···· a a · a • · · a a a a a ····· ·· · ·· a a a

- 36 přípravu určitých cenných monoklonálních protilátek odvozených z požadovaného orgánu živočicha, který úspěšně odolává odstranění infekce, pro vývoj preventivních prostředků nebo léčení bakteriální infekce, zvláště infekce Moraxella catarrhalis u savců, zvláště lidí.

Předkládaný vynález také zahrnuje vakcínu obsahující imunogenní rekombinantní polypeptid a/nebo polynukleotid podle vynálezu spolu s vhodným nosičem, jako je farmaceuticky přijatelný nosič. Protože polypeptidy a polynukleotidy se mohou v žaludku rozkládat, podávají se s výhodou parenterálně, včetně subkutánního, intramuskulárního, intravenózního nebo intradermálního podávání. Mezi formulace vhodné pro parenterální podávání patří vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické sloučeniny a roztoky, které poskytují roztoky isotonické s tělesnými tekutinami, s výhodou krví jednotlivce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující nebo zahušťující látky. Tyto formulace mohou být přítomny v zásobnících obsahujících jednotkovou dávku nebo více dávek, například v uzavřených ampulích a zkumavkách, a mohou být skladovány v lyofilizovaném stavu, přičemž bezprostředně před použitím je nutný pouze přídavek sterilního kapalného nosiče.

Vakcína podle vynálezu může také obsahovat adjuvantní systémy pro zesílení imunogenicity prostředku. Adjuvantní systém s výhodou přednostně zesiluje odpověď typu TH1.

Imunitní odpověď může být široce rozdělena do dvou extrémních 25 kategorií, a to humorální nebo buňkami zprostředkovaných imunitních odpovědí (tradičně charakterizovaných mechanismy ochrany působením protilátek, popřípadě buněčných efektorů). Tyto kategorie odpovědí byly označeny jako odpovědi typu TH1 (odpověď zprostředkovaná buňkami) a imunitní odpovědi typu TH2 (humorální odpověď).

Extrémní imunitní odpovědi typu TH1 mohou být • · ··· ···· ·· φ * ··· · · · ···· · · · · • ···· · · · • ·· · · ·· · ·· ···

- 37 charakterizovány tvorbou pro antigen specifických, haplotypově omezených cytotoxických T lymfocytů a odpovědí vyvolaných přirozenými buňkami - zabíječi. U myší jsou odpovědi typu TH1 často charakterizovány tvorbou protilátek subtypu lgG2a, zatímco u lidí odpovídají typu protilátek lgG1. Imunitní odpovědi typu TH2 jsou charakterizovány tvorbou širokého rozmezí imunoglobulinových isotypů, včetně u myší lgG1, IgA a IgM.

Je pravděpodobné, že hnací silou stojící za vytvářením těchto dvou typů imunitních odpovědí jsou cytokiny. Vysoké hladiny cytokinů typu TH1 spíše upřednostňují indukci imunitních odpovědí na daný antigen zprostředkovaných buňkami, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu TH2 mají sklon preferovat indukci humorálních imunitních odpovědí na antigen.

Rozlišování imunitních odpovědí typu TH1 a TH2 není absolutní.

Ve skutečnosti bude jednotlivec podporovat imunitní odpověď, která se popisuje jako převážně TH1 nebo převážně TH2. Pohodlné je však často uvažovat o rodinách cytokinů z hlediska skupin popisovaných v myších klonech T-buněk CD4+ ve Mosmannem a Coffmanem (Mosmann, T. R. a Coffman, R. L. (1989) TH1 a TH2: different patterns of lymphokin secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145 - 173). Tradičně se odpovědi typu TH1 spojují s produkcí cytokinů INF-γ a IL-2 Tlymfocyty. Další cytokiny, které jsou často asociovány s indukcí imunitních odpovědí typu TH1, nejsou produkovány T-buňkami (jako je

IL-12). Naopak odpovědi typu TH2 jsou spojovány se sekrecí IL-4, IL5, IL-6 a IL-13.

Je známo, že některé adjuvantní látky vakcín jsou zvláště vhodné pro stimulaci cytokinových odpovědí buď typu TH1 nebo TH2. Tradičně jsou nejlepšími indikátory vyvážení imunitní odpovědi

TH1 : TH2 po vakcinaci nebo infekci přímá měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 T lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem a/nebo • · měření poměru antigenně specifických odpovědí protilátek lgG1 : lgG2a.

Adjuvans typu TH1 je tedy látka, která preferenčně stimuluje izolované populace T-buněk k produkci vysokých hladin cytokinů typu

TH1 při restimulaci antigenem in vitro, a podporuje vývoj jak CD8+ cytotoxických T iymfocytů, tak i antigenně specifických odpovědí imunoglobulinů spojených s isotypem typu TH1.

Adjuvans, která jsou schopná přednostně stimulovat buněčnou odpověď TH1, se popisují v mezinárodní patentové přihlášce No. WO

94/00153 a WO 95/17209.

Jedním takovým adjuvans je 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Ten je znám z patentu GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci, který se dodává firmou Ribi Immunochem.,

Montana. Výhodnou formou 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A je forma popisovaná v evropském patentu 0 689 454 B1 (SmithKIine Beecham Biologicals SA).

S výhodou jsou částice 3-D-MPL dostatečně malé, aby je bylo možno sterilně filtrovat membránou 0,22 pm (evropský patent No.

0 689 454).

3D-MPL bude přítomen v množství 10 pg až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg na dávku, zatímco antigen bude typicky přítomen v množství v rozmezí 2 až 50 pg na dávku.

Další výhodné adjuvans zahrnuje QS21, netoxickou frakci 25 odvozenou z kůry Quillaja Saponaria Molina vyčištěnou HPLC. Tato látka může být popřípadě smísena s 3-De-O-acylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL), popřípadě spolu s nosičem.

Způsob výroby QS21 se popisuje v US patentu No. 5,057,540.

Nereaktogenní adjuvantní formulace obsahující QS21 byly již popsány dříve (WO 96/33739). Tyto formulace obsahující QS21 • ·· φφ · ·· · • · · · ··· φφφφ • •φφφ φ φ φφφ • ··· · · φ φφφφ φφφ φ • - · φφφ φφφ „ ··· ·· ·· · φφ φφφ

- 39 a cholesterol byly ukázány jako úspěšná adjuvans stimulující TH1 při formulaci spolu s antigenem.

Další adjuvans, která jsou preferenčními stimulátory buněčné odpovědi TH1, zahrnují imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované sekvence CpG, které se popisují ve WO 96/02555.

Kombinace různých adjuvans stimulujících TH1 jako jsou výše uvedené látky, mohou být jako adjuvans preferenčně stimulující buněčnou odpověď TH1 použity také. Například QS21 může být formulován spolu s 3D-MPL. Poměr QS21 : 3D-MPL bude typicky io řádově 1 : 10 až 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí pro dosažení optimálního synergického účinku je 2,5 : 1 až 1 : 1 3D-MPL : QS21.

S výhodou je ve vakcíně podle předkládaného vynálezu přítomen také nosič. Nosič může být emulze typu olej ve vodě nebo is sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze typu olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Ve zvláště výhodném provedení se antigeny ve vakcíně podle vynálezu kombinují v takové emulzi s QS21 a 3D-MPL. Emulze typu olej ve vodě může navíc obsahovat Spán 85 a/nebo lecithin a/nebo trikaprylin.

Pro podávání člověku budou QS21 a 3D-MPL typicky ve vakcíně přítomny v množství od 1 pg do 200 pg, jako 10 až 100 pg, s výhodou 10 pg až 50 pg na dávku.

Emulze typu olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % 25 skvalenu, od 2 do 10 % alfa-tokoferolu a od 0,3 do 3 % Tweenu 80. Poměr skvalen : alfa-tokoferol je s výhodou roven nebo menší než 1, protože tak se získají stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v množství 1 %. V některých případech může být vhodné, jestliže vakcíny podle předkládaného vynálezu budou navíc obsahovat stabilizátor.

• · · · »

Netoxické emulze typu olej ve vodě s výhodou obsahují netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80, ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.

Zvláště silná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol ve formě emulze typu voda v oleji byla popsána ve WO 95/17210.

Předkládaný vynález také poskytuje polyvalentní vakcínu obsahující vakcínu podle vynálezu v kombinaci s dalšími antigeny, io zvláště antigeny použitelné pro léčení rakoviny, autoimunitních onemocnění a příbuzných stavů. Taková polyvalentní vakcína může obsahovat adjuvans indukující TH1, jak bylo popsáno výše.

I když byl vynález popsán ve vztahu k určitým polypeptidům a polynukleotidům BASB027, je zřejmé, že zahrnuje i fragmenty v přírodě se vyskytujících polypeptidů a polynukleotidů a podobné polypeptidy a polynukleotidy obsahující adice, delece nebo substituce, které podstatným způsobem neovlivňují imunogenní vlastnosti rekombinantních polypeptidů nebo polynukleotidů.

Farmaceutické prostředky, kity a podávání

V dalším provedení vynálezu se poskytují prostředky obsahující polynukleotid BASB027 a/nebo polypeptid BASB027 pro podávání do buňky nebo do vícebuněčného organismu.

Vynález se tako týká prostředků obsahujících polynukleotidy 25 a/nebo polypeptidy diskutované výše nebo jejich agonisty nebo antagonisty. Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu mohou být používány v kombinaci s nesterilním nebo sterilním nosičem nebo nosiči pro použití v buňkách, tkáních nebo organismech, jako například farmaceutickým nosičem vhodným pro podávání jednotlivci.

Tyto prostředky obsahují například aditivní látky nebo terapeuticky

• ·

účinná množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku. Tyto nosiče mohou také bez omezení obsahovat fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Formulace by měla být vhodná pro zamýšlený způsob podávání. Vynález se dále týká diagnostických a farmaceutických baleni a kitů obsahujících jeden nebo více zásobníků naplněných jednou nebo více složkami výše uvedených prostředků podle vynálezu.

Polypeptidy, polynukleotidy a další sloučeniny podle vynálezu w mohou být používány samostatně nebo spolu s jinými látkami, jako jsou například terapeuticky účinné sloučeniny.

Farmaceutické prostředky mohou být podávány účinným a vhodným způsobem včetně mj. místního, orálního, análního, vaginálního, intravenózního, intraperitoneálního, intramuskulárního, subkutánního, intranazáiního nebo intradermálního podávání.

Při léčení nebo jako prevence může být účinná látka podávána jednotlivci ve formě injikovatelného prostředku, například jako sterilní vodná disperze, s výhodou isotonická.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález 20 farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu, jako je rozpustná forma polypeptidu a/nebo polynukleotidu podle předkládaného vynálezu, peptid nebo sloučenina s malou molekulou fungující jako agonista nebo antagonista, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou. Mezi takové nosiče patří bez omezení fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextróza, voda, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických balení a kitů obsahujících jeden nebo více zásobníků naplněných jednou nebo více složkami výše uvedených prostředků podle vynálezu.

• · ···· ··· 0 · ·· • •0 0 · 0 0 · · ·

000 0 0 00000·· » « • ···· · · · ··· ·· 00 0 ·· ···

-42 Polypeptidy, polynukleotidy a další sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány samostatně nebo spolu s jinými sloučeninami, jako jsou například sloučeniny s léčebnými účinky. Prostředek bude upraven podle způsobu podávání, například formou systémového nebo orálního podávání. Mezi výhodné formy systémového podávání patří injekce, typicky intravenózní injekce. Mohou být použity také další varianty injekcí, jako jsou injekce subkutánní, intramuskulární nebo intraperitoneální. Mezi alternativní prostředky pro systémové podávání patří transmukosální a io transdermální podávání s použitím látek napomáhajících penetraci, jako jsou soli žlučových kyselin nebo fusidové kyseliny nebo jiné detergenty. Navíc mohou být polypeptid nebo další sloučeniny podle vynálezu formulovány v enterosolventní nebo zapouzdřené formulaci, čímž je umožněno i orální podávání. Podávání těchto sloučenin může být také prováděno místně a/nebo lokalizované ve formě mastí, past, gelů, roztoků, prášků apod.

Pro podávání savcům a zvláště lidem se předpokládá, že denní dávka účinné sloučeniny bude od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, typicky přibližně 1 mg/kg. V každém případě určí skutečně použitou dávku ošetřující lékař, přičemž nejvhodnější dávka pro jednotlivce se bude lišit podle věku, hmotnosti a odpovědi konkrétního jednotlivce. Výše uvedené dávky jsou příklady v průměrných případech. Mohou samozřejmě nastat jednotlivé případy, kdy jsou oprávněny vyšší nebo nižší meze dávkování, přičemž i tato rozmezí patří do rozsahu předkládaného vynálezu.

Rozmezí požadovaných dávek závisí na volbě peptidu, cestě podávání, povaze formulace, povaze stavu pacienta a úsudku ošetřujícího lékaře. Vhodné dávky jsou však v rozmezí 0,1 až 100 pg/kg hmotnosti pacienta.

Vakcinační prostředek je vhodně ve formě injekce. Pro zvýšení imunitní odpovědi mohou být použita vhodná adjuvans. Vhodná • · ···· · φ φ · φ φ φ ··· φφφφ φφ ·

Φ ΦΦΦ9Φ ΦΦΦΦΦφφ φ « • ΦΦΦφ φφφ •••Φ* ΦΦ Φ ΦΦ φφφ

-43 jednotková dávka pro vakcinaci je 0,5 až 5 pg/kg antigenu, přičemž taková dávka se s výhodou podává 1 až 3 x a v intervalu 1 až 3 týdnů. V uvedeném rozmezí dávek nebudou u sloučenin podle vynálezu pozorovány žádné nepříznivé toxikologické účinky, které by vylučovaly jejich podávání jednotlivcům.

Očekává se však, že se budou vyskytovat široké variace v potřebném dávkování z hlediska druhu sloučenin, které budou k dispozici, a různým účinostem při různých způsobech podávání. Například u orálního podávání by se dalo očekávat, že bude vyžadovat io vyšší dávky než při podávání intravenózní injekcí. Variace v těchto dávkách je možno nastavit pomocí standardních empirických způsobů optimalizace, které jsou v oboru dobře známy.

Databáze sekvencí, sekvence v hmotném prostředí a algoritmy

Polynukleotidové a polypeptidové sekvence tvoří cenný zdroj informací, pomocí kterého lze určit dvojrozměrné a trojrozměrné struktury a identifikovat další sekvence s podobnou homologií. Tyto přístupy se nejčastěji uskutečňují uchováváním sekvence na počítačově čitelném médiu a potom použitím uchovaných dat v některém známém programu pro vytváření struktur makromolekul nebo pro prohledávání databáze sekvencí pomocí známých nástrojů hledání, jako je programový balík GCG.

Vynález také poskytuje způsoby analýzy charakteristických sekvencí nebo řetězců, zvláště genetických sekvencí nebo kódovaných proteinových sekvencí. Výhodné způsoby analýzy sekvencí například zahrnují metody analýzy homologie sekvencí, jako je analýza identity a podobnosti, analýza struktury DNA, RNA a proteinů, uspořádání sekvencí, kladistická analýza, analýza sekvenčních motivů, určení otevřeného čtecího rámce, vyvolávání bází nukleových kyselin, analýza využití kodonu, sestřih bází nukleových kyselin a analýza vrcholů sekvenčního chromatogramu.

• · • · · · 9 «9 · · · · **9 ·«·· » « « • ··· ·· 9 ···· * · « « • 9 9 9 9 ··· . ··· »· ·· · ·· ··«

- 44 Pro provádění identifikace homologie se poskytují metody založené na počítačích. Metoda zahrnuje kroky poskytnutí první nukleotidové sekvence obsahující sekvenci polynukleotidu podle vynálezu na počítačově čitelném médiu; a porovnání uvedené první polynukleotidové sekvence s alespoň jednou polynukleotidovou nebo polypeptidovou sekvencí pro identifikaci homologie.

Počítačová metoda se také poskytuje pro provádění identifikace homologie, kde tato metoda zahrnuje kroky: poskytnutí první polypeptidové sekvence obsahující sekvenci polypeptidu podle io vynálezu v počítačově čitelné formě; a porovnání uvedené první polypeptidové sekvence s alespoň jednou druhou polynukleotidovou nebo polypeptidovou sekvencí pro identifikaci homologie.

Všechny publikace a odkazy včetně bez omezení patentů a patentových přihlášek citovaných v této specifikaci jsou zařazeny ve svém celku odkazem, stejně jako by to bylo uvedeno v místě každého odkazu. Odkazem je také ve svém celku zařazena jakákoli patentová přihláška, ze které předkládaná přihláška nárokuje prioritu, způsobem popsaným výše pro publikace a odkazy.

Definice „Identita“, tak jak je známo v oboru, je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi, podle konkrétního příkladu, určená porovnáním sekvencí. V oboru znamená termín „identita“ také stupeň příbuznosti sekvencí mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi, podle konkrétního případu, tak jak byla zjištěna porovnáním mezi řetězci těchto sekvencí. „Identita“ může být snadno vypočtena známými metodami, včetně bez omezení metod popsaných v (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford

University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and

Genome Projects, Smith, D. W., ed, Academie Press, New York, 1993;

-45 ♦ *0 • 00 0

Computer Analysis of Sequence Data, část I, Griffin, A. M., a Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Hein, G., Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. a Devereux, J., ed., M. Stockton Press,

New York, 1991; a Cariilo, H., a Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Metody pro stanovení identity jsou navrženy tak, aby poskytly co nejvyšší souhlas mezi testovanými sekvencemi. Navíc jsou metody pro zjištění identity zakódovány do veřejně dostupných počítačových programů. Mezi počítačové programy obsahujícími io metody pro zjištění identity mezi dvěma sekvencemi patří bez omezení program GAP v balíku programů GCG (Devereux, J., a další, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S. F. a další, J. Molec. Biol. 215: 403 - 410 (1990), a FASTA (Pearson a Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444 - 2448 (1988). Třída programů BLAST je veřejně dostupná u NCBI i z jiných zdrojů (BLAST Manual, Altschul, S., a další, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., a další, J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Pro určení identity může být také použit dobře známý Smith Watermanův algoritmus. Mezi parametry pro porovnávání polypeptidových sekvencí patří následující:

Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 (1970)

Porovnávací matrice: BLOSSUM62 od Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10915 - 10919 (1992)

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 8

Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 2

Program využívající těchto parametrů je veřejně dostupný jako program „gap“ u firmy Genetics Computer Group, Madison Wl. Výše uvedené parametry jsou parametry nastavené jako výchozí pro porovnávání peptidů (spolu s žádnými trastnými body za koncové mezery).

• · • ftft · • ft · • ftft • · · · • · · · · • · · • ft ft

Parametry pro porovnávání polynukleotidů jsou následující:

Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970) Srovnávací matrice: souhlas = +10, nesouhlas = 0 Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 50

Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 3

Program je dostupný jako program gap u firmy Genetics Computer Group, Madison Wl. Uvedené parametry jsou nastavené jako výchozí pro porovnávání nukleových kyselin.

Výhodný význam pro „identitu“ polynukleotidů a polypeptidů, io podle konkrétního případu, se uvádí v odstavcích (1) a (2) níže.

(1) Provedení polynukleotidů dále zahrnují izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci s alespoň 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 nebo 100% identitou vzhledem k referenční sekvenci SEQ ID No. 1, přičemž uvedená polynukleotidová sekvence může být s referenční sekvencí SEQ ID No. 1 identická nebo může obsahovat při porovnání s referenční sekvencí až do určitého celočíselného počtu nukleotidových změn, přičemž tyto změny jsou zvoleny ze skupiny alespoň jedné delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce nukleotidů, a kde uvedené změny se mohou

2o vyskytovat v 5’ nebo 3’koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo v kterémkoli místě mezi těmito koncovými polohami, rozprostřeny buď individuálně mezi nukleotidy v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více souvislých skupinách v rámci referenční sekvence, a kde uvedený počet nukleotidových změn je určen vynásobením celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1, nebo:

n_n < x_n - (x_n · y), kde n_n je počet nukleotidových změn, x_n je celkový počet nukleotidů v SEQ ID No. 1, yje 0,50 pro 50 %, 0,60 pro 60 %, 0,70 pro

-47 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 %, 0,97 pro 97% nebo 1,00 pro 100 %, a · je symbol pro operátor násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek pro x_n a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_n.

Změny polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID No. 2 mohou v této kódující sekvenci vytvořit mutace typu nonsense, missense nebo frameshift a tím změnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po těchto změnách.

Například polynukleotidové sekvence podle předkládaného io vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 1, tj. může být s ní 100% identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn nukleových kyselin ve srovnání s referenční sekvencí, takže procento identity je nižší než 100% identita. Tyto změny jsou zvoleny ze skupiny alespoň jedné delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce nukleové kyseliny, přičemž tyto změny se mohou vyskytnout v 5’ nebo 3’koncových polohách referenční polynukleotidové sekvence nebo v kterémkoli místě mezi těmito koncovými polohami, rozptýleny buď jednotlivě mezi nukleovými kyselinami v referenční sekvenci nebo ve formě jedné nebo více spojitých skupin v rámci referenční sekvence. Počet změn nukleových kyselin pro dané procento identity se určí vynásobením celkového počtu nukleových kyselin v SEQ ID No. 1 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu nukleových kyselin v SEQ ID No. 1, nebo:

n_n < Xn - (X_n · y), kde n_n je počet změn nukleových kyselin, x_n je celkový počet nukleových kyselin v SEQ ID No. 1, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., · je symbol pro operátor násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_n a y je zaokrouhlen směrem dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x_n.

(2) Provedení polypeptidů dále zahrnují izolovaný polypeptid • · • 44 44

4 · · · • · · 4 4 4 · 44 4 • 444 44 4 4444 444 4 • · 4 4 4 444

.. ·♦· ·♦ ·· 4 44 444

- 48 obsahující polypeptid s alespoň 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 nebo 100% identitou s referenční polypeptidovou sekvencí SEQ ID No. 2, kde uvedená polypeptidová sekvence může být s referenční sekvencí SEQ ID No. 2 identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí, kde uvedené změny jsou zvoleny ze skupin alespoň jedné delece, substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerce aminokyselin, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v amino- nebo karboxykoncových polohách referenční io polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci nebo ve formě jedné nebo více souvislých skupin v rámci referenční sekvence, a kde uvedený počet aminokyselinových změn se určí vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2, nebo:

n_a< x_a- (x_a · y), kde n_a je počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No. 2, y je 0,50 pro 50 %, 0,60 pro 60 %, 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 %, 0,97 pro 97 % nebo 1,00 pro 100 %, a · je symbol pro operátor násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

Například polypeptidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 2, tj. může být 100% identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu aminokyselinových změn ve srovnání s referenční sekvencí, takže procento identity je nižší než 100% identita. Tyto změny se volí ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci, substituci, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerci ©· · • · ·

- 49 ©· ©· • · • © ·©· · · • · ♦ · ·· © · · © • ···· · · aminokyselin, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v aminonebo karboxykoncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozptýleně buď jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více souvislých skupinách v rámci referenční sekvence. Počet aminokyselinových změn pro dané procento identity se stanoví vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu aminokyselin io v SEQ ID No. 2, nebo:

n_a< Xa- (X_a · y), kde n_a počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No. 2, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., a · je symbol pro operátor násobení, a kde neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

Výraz „jednotlivec“ nebo „jednotlivci“, jestliže se zde používá v souvislosti s organismem, znamená vícebuněčný eukaryotický organismus včetně bez omezení metazoálního organismu a savce,

2o ovcí, skotu, opice, primáta a člověka.

„Izolovaný“ znamená změněný „rukou člověka“ proti přirozenému stavu, tj. jestliže se vyskytuje v přírodě, byl změněn nebo odstraněn z původního prostředí, nebo byly provedeny obě činnosti současně. Například polynukleotid nebo polypeptid přírodně přítomný v živém organismu není „izolovaný“, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený z koexistujících materiálů přirozeného stavu je „izolovaný“, tak jak se zde tento termín používá. Navíc je polynukleotid nebo polypeptid, který je zavedený do organismu transformací, genetickou manipulací nebo jakoukoli jinou rekombinantní metodou „izolovaný“ i v případě, kdy je stále ještě přítomen v uvedeném organismu, přičemž organismus může být v živém nebo neživém stavu.

• 9

• ·· ·· 9

9 ♦ 9 · · · • · 9 9 9 9 · • 999 99 9 ·99· · • 9 · « ·

- 50 -........

„Polynukleotid“ (polynukleotidy) se obecně týkají jakéhokoli polyribonukleotidu nebo polydeoxyribonukleotidu, které mohou být ve formě nemodifikované RNA nebo DNA nebo modifikované RNA nebo DNA včetně jednořetězcových a dvoj řetězcových oblastí.

Termín „varianta“ označuje polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si podstatné vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu se od jiného, referenčního polynukleotidu odlišuje nukleotidovou sekvencí. Změny v nukleotidové sekvenci varianty mohou nebo nemusí ovlivňovat io aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím, delecím, fúzím a zkrácením v polypeptidu kódovaném referenční sekvencí, jak bude diskutováno dále. Typická varianta polypeptidu se liší od jiného, referenčního polypeptidu v aminokyselinové sekvenci.

Obecně jsou rozdíly omezeny tak, že sekvence referenčního polypeptidu a varianty jsou celkově úzce podobné a v mnoha oblastech identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci o jednu nebo více substitucí, adicí, delecí v jakékoli kombinaci. Substituovaný nebo vložený aminokyselinový zbytek může nebo nemusí být kódovaný genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidu se může vyskytovat v přírodě, jak je tomu u alelické varianty, nebo může jít o variantu, o které není známo, že by se vyskytovala v přírodě. Varianty polynukleotidů a polypeptidů, které se nevyskytují v přírodě, mohou být vyrobeny technikami mutageneze nebo přímou syntézou.

„Onemocnění“ znamená jakékoli onemocnění, které je způsobeno nebo které souvisí s infekcí bakterií, včetně například zánětu středního ucha u kojenců a dětí, pneumonie u starších lidí, sinusitidy, nosokomiálních infekcí a invazivních onemocnění, chronického zánětu středního ucha se ztrátou sluchu, akumulace kapaliny ve středním uchu, poškození sluchového nervu, opožděného učení řeči, infekce horního respiračního traktu a zánětu středního

- 51 Příklady provedení vynálezu

Dále uváděné příklady byly prováděny s použitím standardních technik, které jsou známé a rutinní pro odborníky v oboru, kromě případu, kdy se postupy popisují podrobně. Příklady jsou ilustrativní a nemají omezovat vynález.

ucha.

Příklad 1

Sekvenování DNA genu BASB027 z Moraxella catarrhalis kmene

ATCC 43617 pro zjištění a potvrzení sekvence

Gen BASB027 se SEQ ID No. 1 byl poprvé objeven v databázi Incyte PathoSeq obsahující nedokončené sekvence genomické DNA Moraxella catarrhalis kmene ATCC 43617 (označovaného také jako kmen Mc2931). Překlad polynukleotidové sekvence BASB027 ukázaný v SEQ ID No. 2, měl významnou podobnost (32% identita v 817 překrývajících se aminokyselinách) s proteinem vnější membrány Neisseria meningitidis OMP85.

Sekvence genu BASB027 byla dále potvrzena experimentálně. K tomuto účelu byla genomická DNA extrahována z 10¹° buněk M. catarrhalis (kmen ATCC 43617) s použitím kitu pro extrakci genomické DNA QIAGEN (Qiagen Gmbh), a 1 pg tohoto materiálu byl zesílen polymerázovou řetězovou reakcí s použitím primerů E515515 (5’-ACTATA-GGG-CAC-GCG-TG-3’) [SEQ ID No. 5] a E515528: (5’-CCTGCG-TTT-GTT-TGA-TTG-AG-3’) [SEQ ID No. 6], Tento produkt PCR byl vyčištěn na zařízení Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) a bylo provedeno sekvenování DNA s použitím sekvenačního kitu Big Dye Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer) a šekvenátoru DNA ABI 377/PRISM. Sekvenování DNA bylo provedeno na obou řetězcích

- 52 • ·0 • 0 0 0

0 0

00« 0 0

0 00

0

0 0 • 00·· 0 s dvojnásobnou redundancí a sekvence s úplnou délkou byla sestavena použitím programu SeqMan ze softwarového balíku DNASTAR Lasergen. Získaná sekvence DNA a odvozená polypeptidové sekvence jsou ukázány jako SEQ ID No. 3, popřípadě SEQ ID No. 4. SEQ ID No. 3 od SEQ ID No. 1. odlišují čtyři rozdíly v nukleotidech. Použitím programu MEGALIGN ze softwarového balíku DNASTAR Lasergen bylo provedeno porovnání polynukleotidových sekvencí SEQ ID No. 1 a 3, které je znázorněno na obr. 2; míra identity byla vypočtena jako 99,8 %.

Použitím stejného programu bylo provedeno porovnání polypeptidových sekvencí SEQ ID No. 2 a 4, které je ukázáno na obr. 3; míra identity byla vypočtena jako 99,8 %.

Příklad 2

Analýza variability genu BASB027 mezi různými kmeny Moraxella catarrhalis

2A: Analýza délky restrikčního fragmentu (RFLP)

Genomická DNA byla extrahována z 16 kmenů M. catarrhalis (uvedených v tabulce 1), jak bylo popsáno níže. M. catarrhalis byla rozetřena na agarových plotnách BHI pro získání jednotlivých kolonií a byla ponechána růst přes noc při 37 °C. Tři nebo čtyři jednotlivé kolonie byly odpíchnuty a použity pro zaočkování —1,5 ml BHI (Brainheart infusion) jako očkovací půdy, která byla ponechána růst přes noc ve třepaném inkubátoru při -300 ot/min při 37 °C. Očkovací kulturou byla zaočkována 500ml Erlenmeyerova baňka obsahující -150 ml půdy BHI a byla ponechána růst -12 až 16 hod při 37 °C ve třepaném inkubátoru při -175 ot/min, pro získání biomasy pro izolaci DNA. Buňky byly odděleny centrifugací v rotoru Sorvall GSA při -2000 x g 15 min při teplotě laboratoře. Supernatant byl oddělen a usazené buňky byly suspendovány v -5,0 ml sterilní vody. Byl přidán stejný

- 53 ··· ·· ·· · • · α · • · · · · ··· 9 9 · ···© « • · · 9 ·· ·· 9 ··

·· objem lyzačního pufru (200mM NaCI, 20mM EDTA, 40mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,5 % (hmotn./objem) SDS, 0,5 % (obj./obj.) 2-merkaptoethanol a 250 pg/ml proteinázy K) a buňky byly suspendovány mírným mícháním a roztíráním. Buněčná suspenze byla potom inkubována přibližně 12 hod při 50 °C pro lyži bakterií a uvolnění chromozomální DNA. Proteinový materiál byl vysrážen přídavkem 5,0 ml nasyceného NaCI (~6,0 M, ve sterilní vodě) a centrifugován při ~5 500 x g v Sorvall SS34 při teplotě laboratoře. Chromosomální DNA byla z vyčeřeného supernatantu vysrážena přidáním dvou objemů 100% ethanolu. Vysrážená DNA byla oddělena a promyta mírným třepáním v malém objemu 70% ethanolu. Vyčištěná chromozomální DNA byla suspendována ve sterilní vodě a ponechána rozpouštět přes noc při 4 °C za mírného kývání. Koncentrace rozpuštěné DNA byla určena spektrofotometricky při 260 nm s použitím extinkčního koeficientu 1,0 jednotky OD ~50 pg/ml.

Tento materiál byl amplifikován PCR použitím oligonukleotidů MC-D15-BamF(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG GGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C-3’) [SEQ ID No. 7] a MC-D15-SalRC (AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G-3') [SEQ ID No. 8]. Odpovídající zesílené geny BASB027 byly potom nezávisle hydrolyzovány použitím restrikčních enzymů (Aci\, HindlW, Maelll, /V/alll, Rsal, Sau3AI) a restrikční produkty byly děleny elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu s použitím standardních postupů molekulární biologie popsaných v publikaci „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, druhé vydání, ed.: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989“. Fotografie získaných elektroforetických gelů jsou ukázány na obr. 1. Pro každý kmen byly hodnoceny a kombinovány obrazy RFLP odpovídající šesti restrikčním enzymům. Byly definovány skupiny kmenů sdílející identickou kombinaci obrazů RFLP. Použitím této metody byly kmeny testované při této studii zařazeny do čtyř genomických skupin (skupina 1: Mc2906, Mc2908, Mc2912, Mc2926; skupina 2: Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2911, Mc2913, Mc2960, Mc2975; skupina 3: Mc2910, Mc2912, Mc2956, Mc2969; skupina 4: Mc2931). Tyto údaje podporují tvrzení, že populace Moraxella catarrhalis použitá při této studii vykazuje v rámci genu BASB027 omezenou diversitu nukleotidové sekvence.

Tabulka 1

Vlastnosti kmenů Moraxella catarrhalis použitých při této studii

Kmen	Izolován v	z
Mc2904	USA	Tympanocentézy
Mc2905	USA	Tympanocentézy
Mc2906	USA	Tympanocentézy
Mc2907	US	Tympanocentézy
Mc2908	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
MC2909	USA	Tympanocentézy
Mc2910	USA	Tympanocentézy
Mc2911	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
Mc2912	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
MC2913	USA	Tympanocentézy akutního zánětu středního ucha
Mc2926	USA	Tympanocentézy
Mc2931/ATCC 43617	USA	Transtracheální aspirát
Mc2956	Finsko	Středoušní kapalina
Mc2960	Finsko	Středoušní kapalina
Mc2969	Norsko	Nasopharynx (pharyngitis-rhinitis)
MC2975	Norsko	Nasopharynx (rhinitis)

• · · · • ···· · · ··· · ·

- 55 Příklad 3

Konstrukce plasmidů pro expresi rekombinantního BASB027

A: Klonováni BASB027

Restrikční místa Sa/nHI a Sall byla vložena do dopředných (forward) (SEQ ID No. 7) a reverzních komplementárních (SEQ ID No. 8) amplifikačních primerů, což umožnilo směrové klonování produktu PCR -2500 bp do komerčně dostupného expresního plasmidů E. coli pQE30 (QiaGen, rezistentní na ampicilin) tak, že zralý protein BASB027 mohl být exprimován ve formě fúzního proteinu obsahujícího na N-konci specifickou sekvenci (tag) pro afinitní chromatografií (His)6. Produkt PCR BASB027 byl vyčištěn od amplifikační reakční směsi použitím kolon na bázi silikagelu (silica gel-based spin columns) QiaGen) podle instrukcí výrobce. Pro výrobu požadovaných konců SamHI a Sa/I nutných pro klonování byl produkt PCR postupně úplně štěpen restrikčními enzymy SamHI a Sa/I, jak je doporučeno výrobcem (Life Technologies). Po prvním restrikčním štěpení byl produkt vyčištěn na koloně jako výše pro odstranění solí a eluován ve sterilní vodě před štěpením druhým enzymem. Rozštěpený fragment DNA byl opět čištěn na výše uvedené silikagelové koloně před ligací s plasmidem pQE30.

B: Vytvoření expresního vektoru

Pro přípravu expresního plasmidů pQE30 pro ligaci byl plasmid podobně úplně štěpen oběma enzymy SamHI a Sa/I a potom vystaven působení fosfatázy z telecího žaludku (CIP, -0,02 U/pmol 5’konce, Life Technologies) podle doporučení výrobce pro zabránění samovolné ligaci. Pro naprogramování ligační reakce byl použit přibližně pětinásobný molární nadbytek rozštěpeného fragmentu vzhledem k připravenému vektoru. Byla provedena standardní ligační • · ··· ·· ., : · · ·

- 56 - .......

reakce v objemu -20 μΙ (-16 °C, -16 hod), použitím metod známých v oboru s využitím T4 DNA ligázy (-2,0 jednotky/reakci, Life Technologies). Alikvot ligační směsi (-5 μΙ) byl použit pro transformaci elektrokompetentních buněk M15 (pREP4) v oboru známými metodami. Po -2 až 3 hod nárůstu při 37 °C v -1,0 ml půdy LB byly transformované buňky vysety na agarové plotny LB s obsahem kanamycinu (50 pg/ml) a ampicilinu (100 pg/ml). Obě antibiotika byla přidána do selekčního média pro zajištění, aby všechny transformované buňky nesly jak plasmid pREP4 (KnR), který nese gen laclq nezbytný pro represi exprese proteinů na pQE30 indukovatelných IPTG, tak i plasmid pQE30-BASB027 (ApR). Plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C -16 hod. Jednotlivé KnR/ApR kolonie byly odpíchnuty sterilními párátky a použity pro „zaočkování“ čerstvých ploten LB KnR/ApR a -1,0 ml kultivační půdy LB KnR/ApR. Jak plotny, tak tekuté kultury byly inkubovány přes noc při 37 °C buď ve standardním inkubátoru (plotny) nebo na vodní třepačce.

Byla provedena analýza PCR na základě celých buněk pro ověření, že transformanty obsahují inzert DNA BASB027. K tomu účelu bylo ~1,0 ml přes noc kultivované kultury LB Kn/Ap převedeno do 1,5 ml polypropylenové zkumavky a buňky byly odděleny centrifugací v mikrocentrifuze Beckmann (-3 min, teplota laboratoře, -12 000 x g). Zcentrifugované buňky byly suspendovány v -200 μΙ sterilní vody a -10 μΙ alikvot byl použit pro programování reakce PCR s konečným objemem -50 μΙ s obsahem jak dopředných, tak i reverzních amplifikačních primerů BASB027. Konečné koncentrace reakčních složek PCR byly v podstatě stejné jako koncentrace uvedené v příkladu 2, s tím rozdílem, že bylo použito -5,0 jednotek Taq polymerázy. Počáteční krok denaturace při 95 °C byl prodloužen na 3 min pro zajištění teplotního rozpadu bakteriálních buněk a uvolnění plasmidové DNA. Pro amplifikaci fragmentu PCR BASB027 z lyžovaných transformovaných vzorků byl použit přístroj ABI thermal cycler Model 9700 a třístupňový profil teplotní amplifikace s 32 cykly,

9

- 57 tj. 95 °C, 45 s; 55 až 58 °C, 45 s, 72 °C, 1 min. Po teplotní amplifikaci byl analyzován alikvot reakční směsi o objemu -20 μΙ elektroforézou na agarózovém gelu (0,8% agaróza v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE). Fragmenty DNA byly zviditelněny po elektroforéze a barvení ethidiumbromidem ozářením UV. Paralelně s testovanými vzorky byla provedena elektroforéza standardu molekulové hmotnosti DNA (řada po 1 kb, Life Technologies), který byl použit pro odhadnutí velikosti produktů PCR. Transformanty, které poskytly očekávaný produkt PCR o délce přibližně 2500 bp byly identifikovány jako kmeny obsahující io expresní konstrukt BASB027. Kmeny obsahující expresní plasmidy byly potom analyzovány na indukovatelnou expresi rekombinantního

BASB027.

C: Analýza exprese PCR - pozitivních transformantů

Pro každý PCR - pozitivní transformant identifikovaný výše bylo zaočkováno —5,0 ml půdy LB s obsahem kanamycinu (50 pg/ml) a ampicilinu (100 pg/ml) buňkami z plotny a půda byla ponechána růst přes noc při 37 °C za třepání (-250 ot/min). Alikvot očkovací kultury pěstované přes noc (-1,0 ml) byl zaočkován do 125 ml Erlenmeyerovy baňky obsahující -25 ml půdy LB Kn/Ap a baňka byla ponechána růst při 37 °C za třepání (-250 ot/min) až do dosažení turbidity kultury OD 600 -0,5, tj. do střední logaritmické fáze (obvykle přibližně 1,5 až 2,0 hod). V této době byla přibližně polovina kultury (-12,5 ml) převedena do druhé 125 ml baňky a byla indukována exprese rekombinantního proteinu BASB027 přídavkem IPTG (1,0M zásobní roztok připravený ve sterilní vodě, Sigma) na konečnou koncentraci 1,0mM. Inkubace jak IPTG - indukované, tak i neindukované kultury pokračovala další přibližně 4 hodiny při 37 °C za třepání. Po indukční periodě byly odebírány z indukované i neindukované kultury vzorky (-1,0 ml) a buňky byly oddělovány centrifugací v mikrocentrifuze při teplotě místnosti -3 min. Jednotlivé usazené buňky byly suspendovány

v ~50 μΙ sterilní vody, potom smíseny se stejným objemem vzorkového pufru 2 x Laemelli pro SDS-PAGE s obsahem 2-merkaptoethanolu a vloženy do vroucí vody na ~3 min pro denaturaci proteinů. Stejné objemy (~15 μΙ) obou surových buněčných lyzátů z IPTG indukovaných a neindukovaných buněk byly naneseny na dvojitý 12% Tris/glycinový polyakrylamidový gel (tloušťka 1 mm, Mini-gels, Novex). Indukované a neindukované vzorky lyzátů byly vystaveny elektroforéze spolu s předbarvenými markéry molekulové hmotnosti (SeeBlue, Novex) za běžných podmínek s použitím standardního elektroforetického pufru SDS/Tris/glycin (BioRad). Po elektroforéze byl jeden gel obarven barvivém coomassie brilliant blue R250 (BioRad) a potom odbarven pro zviditelnění nových proteinů BASB027 indukovatelných IPTG. Druhý gel byl elektricky přenesen na membránu PVDF (velikost pórů 0,45 pm, Novex) během ~2 hod při 4 °C použitím přístroje BioRad Mini-Protean II blotting apparatus a Towbinova methanolového (20 %) přenosového pufru. Blokování membrány a inkubace s protilátkou byly prováděny v oboru známými způsoby. Pro potvrzení exprese a identity rekombinantního proteinu BASB027 byla použita monoklonální protilátka anti-RGS (His)3, potom druhá králičí antimyší protilátka konjugovaná s HRP (QiaGen). Zviditelnění obrazu reakce s protilátkou anti-His bylo dosaženo buď nerozpustným substrátem ABT nebo materiálem Hyperfilm s chemiluminiscenčním systémem Amersham ECL.

D: Potvrzení sekvence

Pro další ověření, že rekombinantní protein BASB027 indukovaný IPTG je exprimován ve správném otevřeném čtecím rámci a nikoli jako nesprávná molekula pocházející z artefaktu klonování (tj. posunem čtecího rámce), byla určena sekvence DNA klonovaného inzertu. Sekvence DNA genu BASB027 M. catarrhalis byla získána z jednoho řetězce použitím metody sekvenování s asymetrickým cyklem

PCR (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Sekvenační reakce byly programovány s neštěpeným expresním plasmidem DNA (~0,5 pg/rxn) jako templátem a vhodnými sekvenačními primery specifickými pro vektor pQE30 a ORF (~3,5 pmol/rxn). Navíc k templátu a sekvenačnímu primeru obsahovala každá sekvenační reakce (~20 pl) čtyři různé dNTP (tj. A, G, C a T) a čtyři odpovídající ddNTP (tj. ddA, ddG, ddC a ddT) terminátorové nukleotidy; přičemž každý terminátor byl konjugován s jednám ze čtyř fluorescenčních barviv Joe, Tam, Rox nebo Fam. Jednořetězcové produkty prodlužování sekvence byly v náhodných polohách podél templátu zakončovány přídavkem terminátorů ddNTP značených barvivý. Produkty terminace značené fluorescenčními barvivý byly čištěny pomocí mikrocentrifugačních kolon pro size-exclusion chromatografii (Princeton Genetics), usušeny ve vakuu, suspendovány v pufru Template Resuspension Buffer (Perkin-Elmer) pro kapilární elektroforézu nebo v deionizovaném formamidu pro PAGE, denaturovaném při 95 °C ~5 min, a analyzovány kapilární elektroforézou s vysokým rozlišením (ABI 310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) nebo PAGE s vysokým rozlišením (ABI 377 Automated DNA Sequenator) podle doporučení výrobce. Údaje o sekvenci DNA poskytnuté jednotlivými reakcemi byly shromážděny a byly analyzovány relativní intenzity fluorescenčních vrcholů automaticky na počítači PowerMAC s použitím softwaru ABI Sekvence Analysis Software (Perkin-Elmer). Jednotlivé automaticky analyzované sekvence DNA byly manuálně editovány na přesnost před srovnáním s konvenční jednořetězcovou sekvencí s použitím softwaru AutoAssembler software (Perkin-Elmer). Sekvenování určilo, že expresní plasmid obsahuje správnou sekvenci ve správném otevřeném čtecím rámci.

φ · • · • Φ a

-60 Příklad 4

Produkce rekombinantního BASB027

Bakteriální kmen

Pro výrobu buněčné biomasy pro čištění rekombinantního 5 proteinu byl použit rekombinantní expresní kmen E. coli M15 (pREP4) obsahující plasmid (pQE30) kódující BASB027 z M. catarrhalis. Expresní kmen byl kultivován na agarových plotnách LB obsahujících 50 pg/ml kanamycinu („Kn“) a 100 pg/ml ampicilinu („Ap“) pro zajištění zachování obou plasmidů pREP4 laclq kontrolního plasmidu a pQE30io BASB027 expresního konstruktu. Pro uchovávání za mrazu při -80 °C byl kmen namnožen v půdě LB obsahující stejnou koncentraci antibiotik a potom smíchán se stejným objemem půdy LB s obsahem % (hmotn./obj.) glycerolu.

Média

Fermentační médium použité pro produkci rekombinantního proteinu se skládalo z 2 x půdy YT (Difco) s obsahem 50 pg/ml Kn a 100 pg/ml Ap. Do média pro fermentor bylo přidáváno odpěňovadlo v koncentraci 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Pro indukci exprese rekombinantního proteinu BASB027 byl do fermentoru přidáván IPTG (isopropyl β-D-thiogalaktopyranosid) (konečná koncentrace 1 mM).

Fermentace

500ml Erlenmeyerova očkovací baňka obsahující 50 ml 25 pracovního objemu byla zaočkována 0,3 ml rychle roztavené zmražené kultury nebo několika koloniemi ze selektivní kultury na agarových plotnách, a baňka byla inkubována přibližně 12 hod při 37 ± 1 °C na třepačce při 150 ot/min (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Očkovací kultura byla potom použita pro inokulaci fermentoru • · s pracovním objemem 5 I obsahujícím půdu 2 x YT a obě antibiotika Kn a Ap. Fermentor (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) byl provozován při 37 ± 1 °C, přísunu vzduchu 0,2 až 0,4 VVM, a otáčkách míchadel Rushton 250 ot/min. pH nebylo ani v baňce, ani ve fermentoru regulováno. V průběhu fermentace dosáhlo pH ve fermentoru hodnoty 6,5 až 7,3. Při dosažení střední logaritmické fáze růstu (~0,7 jednotek OD 600) byl do fermentoru přidán IPTG (1,0 M zásobní roztok připravený ve sterilní vodě). Buňky byly indukovány po dobu 2 až 4 hod a potom centrifugovány buď na centrifuze 28RS io Heraeus (Sepatech) nebo centrifuze RC5C superspeed centrifuge (Sorvall Instruments). Pasta buněk byla skladována až do zpracování při -20 °C.

Čištění

Chemikálie a materiály

Imidazol, guanidinhydrochlorid, Tris (hydroxymethyl) a EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) v čistotě pro biotechnologii nebo lepší byly získány od firmy Ameresco Chemical, Solon, Ohio. Triton X100 (t-oktylfenoxypolyethoxyethanol), dihydrogenfosforečnan sodný

2o a močovina byly v reagenční nebo lepší čistotě a byly získány od firmy Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Ledová kyselina octová a kyselina chlorovodíková byly získány od firmy Mallincrodt Baker Inc, Phillipsburg, New Jersey. Methanol byl získán od firmy Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey. Pefabloc®SC (4-(225 -aminoethyl)benzensulfonylfluorid), tablety Complete protease inhibitor cocktail a PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid) byly získány od firmy Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Bestatin, pepstatin A a E-64 proteázové inhibitory byly získány od firmy Calbiochem, LaJolla, Kalifornie. Pufr Dulbecco's Phosphate Buffered

Salině (1 x PBS) byl získán od firmy Quality Biological, Inc, Gaithersburg, Maryland. Pufr Dulbecco's Phosphate Buffered Salině • * © ·· J * ·©· ©··· • ··· · · ·····©· · © • · · · · © © © **· ·* ·· · .9 ..©

- 62 (10 x PBS) byl získán od firmy BioWhittaker, Walkersville, Maryland. Protilátka Penta-His, prostá BSA byla získána od firmy QiaGen, Valencia, Kalifornie. Imunoglobulin AffiniPure Goat Anti-mouse IgG konjugovaný s peroxidázou byl získán od Jackson Immuno Research,

West Grove, Penn. Roztok AEC byl získán od firmy Zymed, South San Francisco, Kalifornie. Všechny další chemikálie byly v reagenční nebo lepší čistotě.

Pryskyřice Ni-NTA Superflow byla získána od firmy QiaGen lne., Valencia, Kalifornie. Připravené polyakrylamidové gely Tris-Glycine 4 io až 20 % a 10 až 20 %, všechny elektroforetické pufry a roztoky, standardy SeeBlue Pre-Stained Standards, MultiMark Multi-Colored Standards a přenosové membrány PVDF byly získány od firmy Novex, San Diego, Kalifornie. Kity SDS-PAGE Silver Stain byly získány od firmy Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japonsko.

Barvicí roztok Coomassie Stain Solution byl získán od firmy Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornie. Filtry pro injekční stříkačky Acrodisc®PF 0,2 m byly získány od firmy Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Jednorázové filtry na injekční stříkačky GD/X 25 mm byly získány u firmy Whatman lne., Clifton, New Jersey. Dialyzační trubice 8 000 MWCO byly získány od firmy BioDesign lne. Od New York, Carmal New York. Reagencie BCA Protein Assay Reagents a dialyzační trubice Snake Skin 3 500 MWCO byly získány od firmy Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Protokol extrakce

Buněčná pasta byla rozmražena při teplotě laboratoře během 30 až 60 min. 5 až 6 g materiálu bylo odváženo do 50 ml jednorázové centrifugační zkumavky. Bylo přidáno 5 ml/g guanidinhydrochloridového pufru (Gu-HCI) (6M guanidinhydrochlorid,

100mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10mM Tris a 0,05% Triton X100, pH 8,0). Buněčná pasta byla resuspendována pomocí ··· «·

- 63 homogenizátoru PRO300D proscientific homogenizer při nastavení výkonu na 3/4 po dobu jedné minuty. Extrakční směs byla potom umístěna do teploty laboratoře za mírného míchání na 60 až 90 min. Po 60 až 90 minutách byla extrakční směs centrifugována při 15 800 x g 15 min (centrifuga Sorvall RC5C, 11 500 ot/min). Supernatant (S1) byl dekantován a uchován pro další čištění. Usazený materiál (P1) byl uchován pro analýzu.

Vazba BASB027 na pryskyřici Nickel-NTA Resin ίο K S1 se přidají 3 až 4 ml pryskyřice Ni-NTA resin. Směs se uloží při teplotě laboratoře za mírného míchání na 1 hod. Po jedné hodině se vnese S1/NÍ-NTA do kolony XK16 Pharmacia. Kolona se potom promyje 1M Gu-HCI pufrem (1M guanidinhydrochlorid, 100mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10mM Tris a 0,05% Triton X-100, pH is 8,0). Potom následuje promytí fosfátovým pufrem (100mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10mM Tris a 0,05% Triton X-100, pH 6,3). Protein se potom z kolony eluuje 250mM imidazolovým pufrem (250mM imidazol, 100mM dihydrogenfosforečnan sodný, 10mM Tris a

0,05% Triton X-100, pH 5,9).

Konečná formulace

BASB027 byl formulován dialýzou přes noc proti třikrát vyměněnému pufru 0,1% Triton X-100 a 1 x PBS, pH 7,4, pro odstranění zbytkového Gu-HCI a imidazolu. Vyčištěný protein byl charakterizován a použit pro výrobu protilátek jak bude popsáno dále.

Biochemické charakterizace

SDS-PAGE a analýza westernovým přenosem

Rekombinantní vyčištěný protein byl dělen na 4 až 20% • 0 0

0 0

0000 • · 0 00 polyakrylamidových gelech a elektroforeticky přenášen na membrány PVDF při napětí 100 V 1 hod jak bylo popsáno výše (Thebain, a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350 - 4354). Membrány PVDF byly potom ošetřeny 25 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem

Dulbecco s obsahem 5% odtučněného sušeného mléka. Všechny následující inkubace byly prováděny s použitím tohoto pufru.

Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml preimunního séra v ředění 1 : 500 nebo králičího imunního anti-His séra po dobu 1 hod při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom dvakrát promyty io promývacím pufrem (20mM Tris, pH 7,5, 150mM chlorid sodný a 0,05% Tween 20). Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml, ředění 1 : 5000, kozího protikráličího IgG značeného peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 30 min při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom čtyřikrát promyty promývacím pufrem a byly vyvolávány 3-amino-9-ethylkarbazolem a peroxomočovinou dodanými firmou Zymed (San Francisco, CA), vždy po 10 min.

Výsledky SDS-PAGE (obr. 4) ukazují protein s molekulovou hmotností přibližně 95 kDa (95 000), který je reaktivní vůči protilátce anti-RGS (His) při analýze westernovým přenosem (obr. 5) na SDSPAGE.

Sekvenování proteinu

Sekvenování aminokoncové aminokyseliny vyčištěného proteinu 25 bylo prováděno pro potvrzení produkce správného rekombinantního proteinu pomocí dobře definovaných chemických protokolů na sekvenátoru Hewlett-Packard model G1000A spolu s LC model 1090 a na sekvenátoru Hewlett-Packard model 241 spolu s LC model 1100.

• · · • · · · ·

Příklad 5

Produkce antiséra proti rekombinantnímu BASB027

Polyvalentní antiséra proti proteinu BASB027 byla vytvářena vakcinací dvou králíků čištěným rekombinantním proteinem BASB027.

Každému zvířeti se podají celkem tři imunizace intramuskulárně (i.m.) v dávce přibližně 20 pg proteinu BASB027 v injekci (začíná se kompletním Freundovým adjuvans a pokračuje se nekompletním Freundovým adjuvans) v intervalech přibližně 21 dnů. Zvířatům byly odebrány před první imunizací vzorky krve („před pokusem“) a vzorky io krve byly také odebírány ve dnech 35 a 57.

Titry proteinu antí-BASB027 byly měřeny metodou ELISA s použitím čištěného rekombinantního proteinu BASB027 (0,5 pg/jamka). Titr se definuje jako nejvyšší ředění rovné nebo větší než 0,1, přičemž výpočet se provádí podle následující rovnice:

průměrná OD dvou testovaných vzorků antiséra minus průměrná OD dvou testovaných vzorků pufru.

Antiséra byla používána jako první protilátka pro identifikaci proteinu metodou westernového přenosu, jak bylo popsáno v příkladu 4 výše. Analýza westernovým přenosem ukazuje přítomnost protilátky anti-BASB027 v séru imunizovaných zvířat (obr. 6).

Příklad 6

Imunologická charakterizace

Analýza westernovým přenosem

Několik kmenů M. catarrhalis bylo pěstováno na deskách s čokoládovým agarem po dobu 48 hod při 35 °C v 5% CO₂. Několik kolonií bylo použito pro inokulaci 25 ml Muller Hintonovy půdy v 250 ml baňce. Kultury byly pěstovány přes noc a sklizeny centrifugací. Buňky potom byly solubilizovány suspendováním 30 pg buněk ve 150 pg vzorkového pufru pro PAGE (360mM Tris pH 8,8, s obsahem 4% ·· dodecylsulfátu sodného a 20% glycerolu), a suspenze byla inkubována při 100 °C 5 min. Dolubilizované buňky byly děleny na 4 až 20% polyakrylamidových gelech a separované proteiny byly elektroforeticky přenášeny na membrány PVDF při 100 V 1 hod jak bylo popsáno výše (Thebain a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350 - 4354). Membrány PVDF byly potom inkubovány s 25 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem Dulbecco obsahujícího 5% odtučněné sušené mléko. Všechny následující inkubace byly prováděny s použitím tohoto pufru.

io Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml preimunního séra nebo králičího imunního séra v ředění 1 : 500 1 hod při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom dvakrát promyty promývacím pufrem (20mM Tris, pH 7,5, s obsahem 150mM chloridu sodného a 0,05% Tween 20). Membrány PVDF byly inkubovány s 25 ml, ředění

1 : 5000, kozího protikráličího IgG značeného peroxidázou (Jackson

ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 30 min při teplotě laboratoře. Membrány PVDF byly potom čtyřikrát promyty promývacím pufrem a byly vyvíjeny 3-amino-9-ethylkarbazolem a peroxomočovinou dodanými firmou Zymed (San Francisco, CA) vždy 10 min.

Protein s molekulovou hmotností přibližně 95 kDa (95 000) odpovídající očekávané molekulové hmotnosti BASB027, který je reaktivní s antisérem, se detekuje u všech kmenů Moraxella (obr. 7).

Baktericidní aktivita

Cytotoxická aktivita protilátek anti-BASB027 zprostředkovaná komplementem byla vyšetřována pro zjištění vakcinačního účinku polypeptidu BASB027. Antisérum bylo připraveno jak bylo popsáno výše. Aktivity preimunního séra a antiséra anti-BASB027 při zprostředkování usmrcování M. catarrhalis komplementem byly testovány testem „Sérum Bactericidai Test“ popsaným Zollingerem a dalšími (Immune Responses to Neisseria meningitis, v Manual of ·· · • ·· • ·

Clinical Laboratory Immunology, 3. vyd., str. 347 - 349), s tím rozdílem, že v tomto případě byly použity kmeny nebo kultivary M. catarrhalis namísto buněk Neisseria meningitis.

Baktericidní titr králičího antiséra (50% usmrcení homologního 5 kmene) byl <1 : 8 (preimunní) a >1 : 128 (imunní).

Příklad 7

Přítomnost protilátky proti BASB027 v séru člověka rekonvalescenta

Analýza purifikovaného rekombinantního BASB027 westernovým io přenosem byla prováděna jak bylo popsáno v příkladech 4 a 6 výše, s tím rozdílem, že jako preparát první protilátky byla použita shromážděná séra dětí infikovaných M. catarrhalis. Výsledky ukazují, že antiséra z přirozeně infikovaných jedinců reagují s purifikovaným rekombinantním proteinem.

Příklad 8

Produkce peptidů BASB027, antisér a jejich reaktivita

Dva krátké peptidy specifické pro BASB027 se sekvencemi CYAKPLNKKQNDQTDT (SEQ ID No. 9) a YLTARRGQQTTLGEVVC (SEQ ID No. 10) byly vyrobeny v laboratoři použitím obecně dobře známých metod. Tyto peptidy navázané na KLH byly použity pro výrobu protilátek u dvanáct týdnů starých samic králíků typu „Specific Pathogen Free New-Zealand“. Králíci dostali čtyři injekce v intervalech přibližně 3 týdnů s dávkou 200 pg komplexu peptid-KLH v kompletním (1. injekce) nebo nekompletním (2., 3. a 4. injekce) Freundově adjuvans. Zvířatům byly před první imunizací a jeden měsíc po čtvrté injekcí odebrány vzorky krve.

Střední titry protilátek proti peptidům byly měřeny metodou ELISA s použitím volných peptidů. Střední (mid-points) titry proti peptidům jeden měsíc po čtvrté imunizaci byly vyšší než 15 000. Analýzy purifikovaného rekombinantního BASB027 westernovým přenosem s použitím protilátek proti peptidu jako první protilátky byly připraveny podle popisu v příkladech 4 a 6. Výsledky jsou uvedeny v obr 8.

Uložené materiály io Kmen Moraxella catarrhalis Catlin byl uložen ve sbírce American

Type Culture Collection (zde „ATCC“) 21. června 1997 a označen depozitním číslem 43617. Uložený vzorek byl popsán jako Branhamella catarrhalis (Frosch a Kolle) a jde o lyofilizovanou knihovnu inzertů o velikosti 1,5 - 2,9 kb zkonstruovanou z izolátu M.

catarrhalis získaného z transtracheálního aspirátu horníka v uhelných dolech s chronickou bronchitidou. Uložený materiál je popsán v Antimicrob. Agents Chemother, 21: 506 - 508 (1982).

Kmen Moraxella catarrhalis uložený ve sbírce se zde označuje jako „uložený kmen“ nebo jako „DNA uloženého kmene“. Uložený kmen obsahuje gen BASB027 s úplnou délkou.

Vektor pMC-D15 složený z DNA Moraxella catarrhalis vložené v pQE30 byl uložen ve sbírce American Type Culture Collection (ATCC) 12. února 1999 a byl označen depozitním číslem 207105.

Sekvence polynukleotidů obsažená v uloženém kmenu/klonu 25 stejně jako aminokyselinová sekvence jakéhokoli jím kódovaného polypeptidu slouží pro účely kontroly v případě jakéhokoli konfliktu týkajícího se jakéhokoli popisu uvedených sekvencí.

Uložení kmenů ve sbírce bylo provedeno v souladu s Budapešťskou úmluvou o mezinárodním uznávání uložených mikroorganismů pro účely udělování patentů. Uložené kmeny budou • ·· *» · ···· ·»· >··· ··· ·«·< ·· « • ··· · · · ···· · · · · • ···« ··· ··· »« ·· · «· ··· neodvolatelně a bez omezení nebo podmínek uvolněny veřejnosti po vydání patentu. Uložené kmeny se poskytují pouze pro pohodlí odborníkům v oboru a neznamenají, že pro uskutečnění vynálezu je uložení nezbytné.

Zastupuje:

<110> SmithKline Beecham Biciogicals <12C> Novel Compoends výpis sekve^í:..: .

............... ........-··........... · • ·

<130> BM45324 <160> 10 <170 > FastSSQ fcr Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 2442 <212> DNA <213> Bacteria <400> 1 acgcgcaact catatíttaa aggtttccag gccagtgcaa tgacaatggc tgtcacgatg 60 gcaatgtcaa cccatgcaca agcggcggac tttatggcaa acgacactac caccacagga 120 ctacagcgag tgaccatcga aagctcacaa agcgcgctgc cgtttcgctt gggtcaagcg 180 gtgagcgaaa accagttggc tgacggcgtc aaagcacttc acgcaacagg caaccttcca 240 gacgcgcaag CcCatcacca agaaaggcgc atcatctacc aggcaaccga aaggccgcca 300 accgctgaga tcaatcccga gggcaaccgc ccaatcccaa aagaaggtct acaagaaggg 360 ccaaaaaacg ccggcctagc cgtgggccaa ccactaaaac aagccacagc acagacgacc 420 gaaaccgagc ttaccaatca atatatatca caaggctatt ataataccga aattaccgtc 480 aaacagacga tgcttgacgg taatcgtgtc aagcctgata cgacctccgc cgaaggcaaa 540 cctgcacggg tggttgatat taatatcacc ggcaatcagc attttagcga tgcagacttg 600 actgacgcgc tcgcgattaa ggacaacaaa accaacccac cgtctaaagc tgaccgctac 660 actcaagaaa agccggcgac cagtctagag aatttgcgtg ccaaatatct caacgcaggg 720 tccgcgcgtc tcgagaccaa agacgctaag cctaacatca acgaagataa aaaccgtacc 780 ttcgccgaga tcccaccgca cgaaggcgag caataccgct ccggacagac acagtccctg 840 ggcaacccaa cccatactca agcagaaccc gaggcaccgc ccaaactcaa agcagaagaa 900 gggcccccac aagccatgct tgagcaaaca acaaacaata CcagCaccaa acccggcgac 960 gacagctatt accatgctca aacccgtccc gtaacacgca ttaatgatga aagccgcacg 1020 gccgacgcga aatattatat tgaccccgta caccctgtct acgtacgccg tatcaacttc 1080 acaggtaact ttaagaccca agatgaagta ccccgccgtg agacgcgaca actcgaaggt 1140 gcgttggcat ccaaccaaaa aacccagctg tctcgtgcac gcctgatgcg gactgggctt 1200 tttaaacacg ttaccgtcga tactcgtcca gtacccaact cacctgatca ggttgatgca 1260 aaccttgtgg ttgaagaaca accttcagga tcatcaacca tcgcagcagg ctacúctcaa 1320 agcggcggcg taacttctca attcgacgcc tctcaaaata actttatggg tacaggtaag 1380 cacgccaatg ccccgttttc tcgccccgag acccgcgagg tgtatagttt gggtatgacc 1440 aacccacact ttaccgcaaa cggcgcctcg caaagcctga gtggctacca tcgtaaaacc 1500 aagcatgata acaagaacat tagtaattat gcactcgacc cctatggtgg ctcattaagc 1560 tatggacatc caattgatga aaatcaacgc ataagctttg gtctgaacgc tgacaacacc 1620 aagccccacg gcggtcgtct catgggcact agtaatgtca agcagccgat ggcagacggt 1680 ggcaaaattc aagtggataa taatggcatt cctgatctta agcatgatca cacaacctac 1740 aatgccattt tggggtggaa ttactcaaac ctagatcgcc ctgtattccc aacccaaggc . 1800 acgagtcatt ctgtagattt gacggttggc tttggtgata aaactcatca aaaagcggct 1860 catcaaggca atatctatcg cccattcatc aaaaaatcag tcttgcgtgg atacgccaag 1920 ccaggccacg gcaacaattt accattttac gaaaatttct atgcaggcgg ctatggttcg 1980 gcccgcggcc acgaccaacc ccccccgggc ccacgctcac aagcctattt gacagctcgc 2040 cgcggtcaac aaaccacact aggagaggcc gtcggtggca atgctttggc aactttcggc 2100 agcgagccga ctccacctcc gccacccaaa ggcgaccgga cagaccaggt gcgcccagtg 2160 acacccattg agggcggcca ggttcccgac acaacaggta cggacaaaca aaccattgac 2220 ctaacccaac ttaaagaccc acaagcaaca gctgaacaaa acgcaaaagc agccaaccgc 2280 ccgccactaa cccaagataa acagccgcgc tatagtgctg gcgttggtgc aacttggtac 2340 acgcccattg gtccztcat cagaccgaca cggcacagt gccaagccac.

• · « agcgtcttcc catcagctac ccagaccggc «· · · · · · « · · · · · · I * · · · · · ·· • · · · Φ ······· · :qae:afiáď»£ acaaaacera:

f · ·· · ·· ” i aa <210> 2 <211> 813 <212> PRT <213> Bacteria <400> 2

Met

Arg

Asn

Ser

Tyr

Phe

Lys

Gly

Phe

Gin

Val

Ser

A-ia

Met

Thr

Met

n

5

10

15

A_a

Val

Met

Met

Val

Met

Ser

Thr

His

Ala

Gin

Ala

Ala

Asp

Phe

Met

20

25

30

A - a

nS Γ.

Asp

Ile

Thr

Ile

Thr

Gly

Leu

Gin

Arg

Val

TA»·

Ile

Glu

Ser

35

40

45

LěU

'j - Γ.

Ser

Val

Leu

Pro

Phe

Arg

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Ser

Glu

Asn

50

55

6 0

U * Γ.

Leu

Ar a

Asp

Gly

Val

Lys

Ala

Leu

Tyr

Ala

Thr

Gly

Asn

Phe

Ser

6 5

70

75

80

A.S?

Val

G*n

Val

Tyr

His

Gin

Glu

Gly

Arg

Ile

Ile

Tyr

Gin

Val

Thr

85

90

95

o i U

Arg

Pro

Leu

Ile

Ala

Glu

Ile

Asn

Phe

Glu

Gly

Asn

Arg

Leu

Ile

100

105

11C

Pro

Lys

Glu

Gly

Leu

Gin

Glu

Gly

Leu

Lys

Asn

Ala

Gly

Leu

Ala

Val

115

120

125

Gly

Gin

Pro

Leu

Lys

Gin

Ala

Thr

Val

Gin

Met

Ile

Glu

Thr

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Asn

Gin

Tyr

Ile

Ser

Gin

Gly

Tyr

Tyr

Asn

Thr

Glu

Ile

Thr

Val

145

150

155

160

Lys

Gin

Thr

Met

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Val

Lys

Leu

Asp

Met

Thr

Phe

165

170

175

Ala

Glu

Gly

Lys

Pro

Ala

Arg

Val

Val

Asp

Ile

Asn

Ile

Ile

Gly

Asn

180

185

190

Gin

His

Phe

Ser

Asp

Ala

Asp

Leu

Ile

Asp

Val

Leu

Ala

Ile

Lys

Asp

195

200

205

Asn

Lys

Ile

Asn

Pro

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Arg

Tyr

Thr

Gin

Glu

Lys

210

215

220

Leu

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Ala

Lys

Tyr

Leu

Asn

Ala

Gly

225

230

235

240

Phe

Val

Arg

Phe

Glu

Ile

Lys

Asp

Ala

Lys

Leu

Asn

Ile

Asn

Glu

Asp

245

250

255

Lys

Asn

Arg

Ile

Phe

Val

Glu

Ile

Ser

Leu

His

Glu

Gly

Glu

Gin

Tyr

260

265

270

Arg

Phe

Gly

Gin

Thr

Gin

Phe

Leu

Gly

Asn

Leu

Thr

Tyr

Thr

Gin

Ala

275

280

285

Glu

Leu

Glu

Ala

Leu

Leu

Lys

Phe

Lys

Ala

Glu

Glu

Gly

Phe

Ser

Gin

290

295

300

Ala

Met

Leu

Glu

Gin

Thr

Thr

Asn

Asn

Ile

Ser

Thr

Lys

Phe

Gly

Asp

305

310

315

320

Asp

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ala

Gin

Ile

Arg

Pro

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

325

330

335

Glu

Ser

Arg

Thr

Val

Asp

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Asp

Pro

Val

His

Pro

340

345

350

Val

Tyr

Val

Arg

Arg

Ile

Asn

Phe

Thr

Gly

Asn

Phe

Lys

Thr

Gin

Asp

355

360

365

Glu

Val

Leu

Arg

Arg

Glu

Met

Arg

Gin

Leu

Glu

Gly

Al a

Leu

Ala

Ser

370

375

380

Asn

Gin

Lys

Ile

Gin

Leu

Ser

Arg

Ala

Arg

Leu

Met

Arg

Thr

Gly

Phe

• • · •

·· • · •

1 • •

ΒΦ · • · • · *

• · • · • ·

3Θ5

3 9 C

3 5*

• · · •

' · · •

• · 1 •

B · · · •

4 co;

Phe

Lys

His

Val

Thr

Vál

Asp

Thr

Arg

Pro

vsr

Pro

Asr.

’*er

*

Asp

4 0 5

410

415

Gin

Val

Asp

Val

Asn

Pris

Vál

Val

Glu

Glu

Gin

Pro

Ser

Giy

Ser

Ser

420

425

-í 5 ?

Thr

Ile

Ala

Ala

Gly

T v **

Ser

Gin

Ser

Gly

Giy

Val

Thr

Phe

Gin

435

440

445

Asp

Val

Ser

Gin

Asn

Asr.

Phe

Met

Gly

Thr

Gly

Lys

His

Val

Asn

Ala

450

455

460

Ser

Phe

Ser

Arg

Ser

Glu

Thr

Arg

Glu

Val

Tyr

Ser

Leu

Giy

Met

Thr

465

470

475

480

Asn

Pro

Tyr

Phe

Thr

Val

Asn

Gly

Val

Ser

Gin

Ser

Leu

Ser

Giy

Tyr

485

490

495

Tyr

Arg

Lys

Thr

Lys

Tyr

Asp

Asn

Lys

Asn

Ile

Ser

Asn

Tvr

Val

Leu

500

505

5 Iv

Asp

Ser

Tyr

Gly

Gly

Ser

Leu

Ser

Tyr

Gly

Tyr

Pro

Ile

Asp

Glu

Asn

515

520

525

Gin

Arg

Ile

Ser

Phe

Gly

Leu

Asn

Ala

Asp

Asn

Thr

Lys

Leu

His

Gly

530

535

540

Gly

Arg

Phe

Met

Gly

Ile

Ser

Asn

Val

Lys

Gin

Leu

Met

Ala

Asp

Gly

545

550

555

560

Gly

Lys

Ile

Gin

Val

A.sp

Asn

Asn

Gly

Ile

Pro

Asp

Phe

Lys

His

Asp

565

570

575

Tyr

Thr

Thr

Tyr

Asn

Ala

Ile

Leu

Gly

Trp

Asn

Tyr

Ser

Ser

Leu

Asp

58C

585

590

Arg

Pro

Val

Phe

Pro

Thr

Gin

Gly

Met

Ser

His

Ser

Val

Asp

Leu

Thr

595

600

605

Val

Gly

Phe

Gly

Asp

Lys

Thr

His

Gin

Lys

Val

Val

Tyr

Gin

Giy

Asn

610

615

620

Ile

Tyr

Arg

Pro

Phe

Ile

Lys

Lys

Ser

Val

Leu

Arg

Gly

Tyr

Ala

Lys

625

630

635

640

Leu

Gly

Tyr

Gly

Asn

Asn

Leu

Pro

Phe

Tyr

Glu

Asn

Phe

Tyr

Ala

Gly

645

650

655

Gly

Tyr

Gly

Ser

Val

Arg

Gly

Tyr

Asp

Gin

Ser

Ser

Leu

Giy

Pro

Arg

660

665

670

Ser

Gin

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ala

Arg

Arg

Gly

Gin

Gin

Thr

Thr

Leu

Gly

675

680

685

Glu

Val

Val

Gly

Gly

Asn

Ala

Leu

Ala

Thr

Phe

Gly

Ser

Glu

Leu

Ile

690

695

700

Leu

Pro

Leu

Pro

Phe

Lys

Gly

Asp

Trp

Ile

Asp

Gin

Val

Arg

Pro

Val

705

710

715

720

Ile

Phe

Ile

Glu

Gly

Gly

Gin

Val

Phe

Asp

Thr

Thr

Gly

Met

Asp

Lys

725

730

735

Gin

Thr

Ile

Asp

Leu

Thr

Gin

Phe

Lys

Asp

Pro

Gin

Ala

Thr

Ala

Glu

740

745

750

Gin

Asn

Ala

Lys

Ala

Ala

Asn

Arg

Pro

Leu

Leu

Thr

Gin

As?

Lys

Gin

755

760

765

Leu

Arg

Tyr

Ser

Ala

Gly

Val

Gly

Ala

Thr

Trp

Tyr

Thr

Ρ2ΓΟ

Ile

Gly

770

775

780

Pro

Leu

Ser

Ile

Ser

Tyr

Ala

Lys

Pro

Leu

Asn

Lys

Lys

Gin

Asn

Asp

785

790

795

800

Gin

Thr

Asp

Thr

Val

Gin

Phe

Gin

Ile

Gly

Ser

Val

Phe

805

810

<210> 3 <211> 2442 <212> DNA <213> Bacteria • 9 acgcgcaaz ς gcaacgccaa ccacagcgag gcgagcaaag gacgtgcaag atcgctgaga ctaaaaaacg gaaaccgagc aaacagacga cccgcacggg accgacgcgc acccaagaaa cccgcgcgcc tccgccgaga ggcaactcaa gggctcccac gacggccacc gccgatgtgg acaggtaact gcgtcggcat ctcaaacatg aacttcgtgg agcggtggtg cacgtcaacg aacccatact aagtatgata tatggacatc aagctccatg ggcaaaac.cc aatgccattc acgagtcatc taccaaggca ttaggctatg gttcgtggct cgtggtcaac agcgagccga atacccaccg ccaacccaac ccgctaccaa acgcccaccg cagaccgaca <210 <211 <212 <213 cacattttaa cccacgcaca cgaccactga cacagCtggc cccatcacca ctaaccctga ccggctcagc ccaccaacca cgctcgatgg cggccgatac ccgcgattaa agccggcgac ccgagattaa ccccaccgca cccatactca aagccatgct accatgctca aacaccatac tcaagaccca ccaatcaaaa ccaccgttga ttgaagaaca caacccttca cttcgcttcc ccaccgtaaa acaagaacac caategaega gcggccgctt aagcggataa cggggcggaa ccgcagattc atacctatcg gcaataactt acgaccaacc aaaccacact ccctaccctt agggcggtca ttaaagaccc cccaagacaa gtcctttatc cggcacagtt • 4 . 813 PRT

- Bacteria aggttcccag agcggcggac aagctcacaa tgatggcgtc agaagggcgc gggcaaccgc tgtgggtcaa atatatatca taatcgtgcc taatatcat* ggataataaa cagtccagag agatgctaag tgaaggtgag agcagaacct cgagcaaaca aatccgtcct tgaccctgta agacgaagca aatccagccg tactcgtcca accttcagga atctgacgtc tcgctccgag tggcgccccg cagtaaccat aaatcaacgc tatgggcatt

Caatggcatt ttactcaagt gacggctggt cccaettatc accattccac ctctttgggt aggagaggcc gccatttaaa ggttcctgat acaagcaaca acagtcgcgt tactagccac ccagattggt gccagcgcaa tctacggcsa agcgtgccgc aaagcaccc c atcacctatc ccaactccaa ccaccaaaac caaggccacc aagcctgaca ggcaatcagc accaatccac aactcgcgcg ctcaacacca caatatcgct gaggcaccgc acaaacaata gtaacacgca caccctgccc ctccgtcgcg ccccgtgcac gcacccaacc ccatcaacca tetcaaaata acccgtgagg caaagcttga gtacttgatt ataagctttg agtaatgtca cctgatttta ctagatcgcc tttggtgata aaaaaatcag gaaaatttct ccacgctcac gttagtggta ggtgatcgga acaacaggta gctgaacaaa tacagcgccg gccaagccat agtgccttcc • · 9

9 9 9 · 9

99

9 9 9 • 9 9 9 ··· « · 9

9 9

tgacaatggc	tgtcatgatg
atgacatcgc	catcacagga	• “V -
cgcttcgctt	gggccaagcg	1 5 3
acgcaacagg	caacccctca	ώ n
aggcaaccga	aaggccgcca	3 C 3
aagaaggtct	acaagaaggg	3 o 3
aagccacagt	acagacgacc	*t« >
acaacaccga	aaccaccgcc	4 3?
cgacctttgc	cgaaggcaaa	54 2
atttcagcga	cgcagacccg	602
tgtctaaagc	cgaccgctac	6 6 2
ctaaatatct	caacgcaggg
atgaagataa	aaaccgcacc	75 2
tcggacagac	acagcctccg	84 2
tcaaattcaa	agcagaagaa	902
ccagtaccaa	atctggtgac	56 2
ttaatgatga	aagtcgtacg	1022
atgtacgccg	tatcaattcc	1082
agatgcgaca	acctgaaggt	1142
gcttgatgcg	gaccgggtcc	1202
cacccgatca	ggttgacgca	1252
tcgcagcagg	ctaccctcaa	13 2 2
actttatggg	tacaggtaag	1362
tgtatagttc	gggtatgacc	1440
gcggctacta	tcgtaaaacc	1500
cttaeggtgg	ctcatcaagc	156C
gtctgaatgc	tgacaatacc	1620
agcagctgat	ggcagatggc	1680
agcatgatta	cacaacctac	1740
ctgtatttcc	aacccaaggc	1800
aaactcatca	aaaagtggtt	1860
tcttgcgtgg	atacgccaag	1920
atgcaggcgg	ctatggetcg	1980
aagcctattt	gacagcccgt	2040
atgctttggc	aactttcggc	2100
tagatcaggc	gcgtccagcg	2160
tggataaaca	aaccattgat	2220
atgcaaaagc	agccaaccgc	2280
gcgttggtgc	aacctggtat	2340
cgaataaaaa	acaaaatgat	2400
aa		2442

<4Q0> 4

Met

Arg

Asn

Ser

Tyr

Phe

Lys

Gly

Phe

Gin

Val

Ser

Ala

Mec

Thr

Met

5

10

15

Ala

Val

Me;

Mec

Val

Mec

Ser

Thr

His

Ala

Gin

Ala

Ala

Asp

Phe

Met

20

25

30

Ala

Asn

Asp

11 á

Ala

lle

Thr

Gly

Leu

Gin'

Arg

Val

Thr

lle

Glu

Ser

35

40

45

Leu

Gin

Ser

Val

Leu

Pro

Phe

Arg

Leu

Gly

Gin

Val

Val

Ser

Glu

Ala

50

55

60

• φφ ·· · • φφφ φφφ · · • ΦΦ φφφφ · ·

31 π ο 5

Leu

Ala

Asp

Gly

Val 7C

Lys

Ala

Leu

Tyr

Ala Tnř! 75*· ·’

:ďť5 «

- · · · Aen 1 ·

S*ní •

-•Jf

λ 3 Ο

Val

Gin

Val

Tyr

Kis

Gin

Glu

Glv

Arg

lle lle

Tyr

'<7 - Π

t · _ 1 rf a —

rr'r ,,

85

90

9 Ξ

- u

Arg

Pro

Leu

lle

Ala

Glu

lle

Asn

Phe

Glu G.y

Asn

Ar?

Leu

7 ' A

100

105

110

Pro

Lys

Glu

Gly

Leu

Gin

Glu

Giy

Leu

Lys

Asn Ala

Giy

Leu

Ai a

Val

115

120

125

Gly

Gin

Pro

Leu

Lys

Glr.

Ala

Thr

Val

Gin

Met lle

Glu

Thr

G i u

Leu

130

135

140

Thr

Asn

Gin

Tyr

lle

Ser

Gin

Gly

Tyr

Tyr

Asn Thr

Glu

Xie

Thr

Val

145

150

155

160

Lys

Gin

Thr

Mec

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Val

Lys Leu

Asp

Met

Thr

Phe

165

170

175

Ai a

Glu

Gly

Lys

Pro

Ala

Arg

Val

Val

Asp

lle Asn

lle

lle

Gly

Asn

180

185

190

Gin

His

Phe

Ser

Asp

Ala

Asp

Leu

lle

Asp

Val Leu

Ala

lle

Lys

Asp

195

200

205

Asn

Lys

lle

Asn

Pro

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Arg Tyr

Thr

Gin

Glu

Lys

210

215

220

Leu

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Ala

Lys Tyr

Leu

Asn

Ala

Gly

-i n £

230

235

240

?he

Val

Arg

Phe

Glu

lle

Lys

Asp

Ala

Lys

Leu Asn

lle

Asn

Glu

Asp

245

250

255

Lys

Asn

Arg

lle

Phe

Val

Glu

lle

Ser

Leu

His Glu

Gly

Glu

Gin

Tyr

260

265

270

Arg

Phe

Gly

Gin

Thr

Gin

Phe

Leu

Gly

Asn

Leu Thr

Tyr

Thr

Gin

Ala

275

280

285

Glu

Leu

Glu

Ala

Leu

Leu

Lys

Phe

Lys

Ala

Glu Glu

Gly

Phe

Ser

Gin

290

295

300

Ala

Met

Leu

Glu

Gin

Thr

Thr

Asn

Asn

lle

Ser Thr

Lys

Phe

Giy

Asp

305

310

315

320

Asp

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ala

Gin

lle

Arg

Pro

Val Thr

Arg

lle

Asn

Asp

325

330

335

Glu

Ser

Arg

Thr

Val

Asp

Val

Glu

Tyr

Tyr

lle Asp

Pro

Val

His

Pro

340

•345

350

Val

Tyr

Val

Arg

Arg

lle

Asn

Phe

Thr

Gly

Asn Phe

Lys

Thr

Gin

Asp

355

360

365

Glu

Val

Leu

Arg

Arg

Glu

Met

Arg

Gin

Leu

Glu Gly

Ala

Leu

Ala

Ser

370

375

380

Asn

Gin

Lys

lle

Gin

Leu

Ser

Arg

Ala

Arg

Leu Met

Arg

Thr

Gly

Phe

385

390

395

400

Phe

Lys

His

Val

Thr

Val

Asp

Thr

Arg

Pro

Val Pro

Asn

Ser

Pro

Asp

405

410

415

Gin

Val

Asp

Val

Asn

Phe

Val

Val

Glu

Glu

Gin Pro

Ser

Gly

Ser

Ser

420

425

430

Thr

lle

Ala

Ala

Gly

Tyr

Ser

Gin

Ser

Gly

Gly Val

Thr

Phe

Gin

Phe

435

440

445

Asp

Val

Ser

Gin

Asn

Asn

Phe

Met

Gly

Thr

Gly Lys

His

Val

Asn

Ala

450

455

460

Ser

Phe

Ser

Arg

Ser

Glu

Thr

Arg

Glu

Val

Tyr Ser

Leu

Gly

Met

Thr

465

470

475

480

Asn

Pro

Tyr

Phe

Thr

Val

Asn

Gly

Val

Ser

Gin Ser

Leu

Ser

Gly

Tyr

485

490.

495

Tyr

Arg

Lys

Thr

Lys

Tyr

Asp

Asn

Lys

Asn

lle Ser

Asn

Tyr

Val

Leu

500

505

510

Asp

Ser

Tyr

Gly

Gly

Ser

Leu

Ser

Tyr

Gly

Tyr Pro

lle

Asp

Glu

Asn

515

52 0

525

• ·

Gin

Arg 530

Ile

Ser

Phe

Gly

Leu 535

Asn

Ala

Asp

• • · As· • ·«

·« • · • · Thřj '540

• • L»/s 1

• 9 · • 9 9 9 9

• · • 9 • , · Cl\* • ·· • ·

I «

•

Gly

Arg

Phe

Met

Gly

Ile

Ser

Asn

Val

Lys

Gin

Leu

Met

Ala

Asp

Gly

545

550

555

560

Gly

Lys

Ile

Gin

Val

Asp

Asn

Asn

Gly

Ile

Pro

Asp

Phe

Lys

Hxs

Asp

565

57C

575

Tyr

Thr

Thr

Tyr

Asn

Ala

Ile

Leu

Gly

Trp

Asn

TV2T

Ser

Ser

Leu

Asp

580

585

590

Arg

Pro

Val

Phe

Pro

Thr

Gin

Gly

Met

Ser

His

Ser

Val

Asp

Leu

Thr

595

600

605

Val

Gly

Phe

Gly

Asp

Lys

Thr

His

Gin

Lys

Val

Val

Tyr

Gin

Gly

Asn

610

615

620

Ile

Tyr

Arg

Fro

Phe

Ile

Lys

Lvs

Ser

Val

Leu

Arg

Gly

Tyr

Ala

Lys

625

630

635

640

Leu

Gly

Tyr

Gly

Asn

Asn

Leu

Pro

Phe

Tyr

Glu

Asn

Phe

Tyr

Ala

Gly

645

650

655

Gly

Tyr

Gly

Ser

Val

Arg

Gly

Tyr

Asp

Gin

Ser

Ser

Leu

Gly

Pro

Arg

660

665

670

Ser

Gin

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ala

Arg

Arg

Gly

Gin

Gin

Tnr

Thr

Leu

Gly

675

680

685

Glu

Val

Val

Gly

Gly

Asn

Ala

Leu

Ala

Thr

Phe

Gly

Ser

Glu

Leu

Ile

690

695

700

Leu

Pro

Leu

Pro

Phe

Lys

Gly

Asp

Trp

Ile

Asp

Gin

Val

Arg

Pro

Val

705

710

715

720

Ile

Phe

Iie

Glu

Gly

Gly

Gin

Val

Phe

Asp

Thr

Thr

Gly

Met

Asp

Lys

725

730

735

Gin

Thr

Ile

Asp

Leu

Thr

Gin

Phe

Lys

Asp

Pro

Gin

Ala

Thr

Ala

Glu

740

745

750

Gin

Asn

Ala

Lys

Ala

Ala

Asn

Arg

Pro

Leu

Leu

Thr

Gin

Asp

Lys

Gin

755

760

765

Leu

Arg

Tyr

Ser

Ala

Gly

Val

Gly

Ala

Thr

Trp

Tyr

Thr

Pro

Ile

Gly

770

775

780

Pro

Leu

Ser

Ile

Ser

Tyr

Ala

Lys

Pro

Leu

Asn

Lys

Lys

Gin

Asn

Asp

785

790

795

800

Gin

Thr

Asp

Thr

Val

Gin

Phe

Gin

Ile

Gly

Ser

Val

Phe

805

810

<210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Arcificial Sequence <220>

<223 > Primer <400> 5 actatagggc acgcgtg <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Arcificial Sequence <220>

<223> Primer <400> 6 cccgcgtttg cttgactgag »· ·· · 1 • · · · · • · · · · · *«· · · ···«· * · <210> 7 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequencs <220>

<223 > Oligonucleotide <400> 7 aagagcccaa ttacgcagaa gggatccaca ggactacagc gagtgaccat tgaaagctta

<210>	8
<211>	67
<212>	DNA
<213>	Artificial Sequence
<220>
<223>	Oligcnucleotide
<400>	8

aaggccccaa ccacgcagag ggtcgactca ccaaaagaca ccaccaatct ggaactgtac 60 cgcatcg 67

	<210> <211> <212> <213>	9 16 PRT Artificial Sequence
	<220>
	<223>	Oligopeptide
	<400>	9
Cys	Tyr Ala	Lys Pro Leu Asn Lys
1		5
	<210>	10
	<211>	17
	<212 >	PRT
	<213>	Artificial Sequence
	<220>
	<223>	Oligopeptide
	<400>	10
Tyr	Leu Thr	Ala Arg Arg Gly Gin
1		5
Cys

·· · ♦ · informace ο sekvenci ::.:

♦ · · · ·

Polynukleotidové a polypeptidové sekvence’BASB027

SEQ ID No. 1

Polynukleotidové sekvence BASB027 Moraxella catarrhalis kmene ATCC43617

ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATG

GTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGA

CTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG

GTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCA

GATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTA

ATCGCTGAGATTAATTTTGAGGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGG

CTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATC

GAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTC

AAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAA

CCTGCACGGGTGGTTGATATTAATATCATTGGCAATCAGCATTTTAGCGATGCAGATTTG

ATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTAT

ACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGG

TTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGCTAAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATC

TTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTG

GGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAA

GGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAATATCAGTACCAAATTTGGTGAC

GATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACGCATTAATGATGAAAGTCGTACG

GTTGATGTGGAATATTATATTGACCCTGTACACCCTGTCTATGTACGCCGTATTAATTTT

ACAGGTAACTTTAAGACCCAAGATGAAGTACTCCGTCGTGAGATGCGACAACTTGAAGGT

GCGTTGGCATCTAATCAAAAAATCCAGCTGTCTCGTGCACGCTTGATGCGGACTGGGTTT

TTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTGATCAGGTTGATGTA

AATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAACCATCGCAGCAGGCTACTCTCAA

AGTGGTGGTGTAACTTTTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTATGGGTACAGGTAAG

CACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACC

AACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACC

AAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGGCTCATT.AAGC

TATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTCTGAATGCTGACAATACC

AAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGT

GGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTAC

AATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGC

ATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTT

TATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAAG

TTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCG

GTTCGTGGCTATGATCAATCCTCTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGT

CGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGC

AGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTG

ATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGAT

TTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGC

CCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTAT

Α'ΑΛΛΠΛ - k?-*“· 9 · • 9

ACGCCCATTGGTCCTTTATG7AT7AGCTATGGGAAfC»ČÁ*rTC3Á^T;AAAAA5

CAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTfcTftSWUt J **!* ’ í

SEQ ID No. 2

Polypeptidové sekvence BASB027 Moraxella catarrhalis odvozená z polynukleotidové sekvence SEQ ID No. 1

MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITITGLQRVTIESLQSVLPFRLGQV VSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNRLIPKEGLQEG LKNAGLAVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTMLDGNRVKLDMTFAEGK PAR V*7D INI IGNQHFSDADLIDVLAIKDNKINPLSKADRYTQEKLVTSLENLRAKYLNAG FVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEALLXFKAEE GFSQAMLEQTTNNISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINF TGNFKTQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDV NFWEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKHVNASFSRSETREVYSLGMT N ? Y F7VNG VSQS LSGYYRKTKYDNKNISNYVLDS YGGSLS YGYPIDENQRIS FGLNADNT KLHGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHDYTTYNAILGWNYSSLDRPVFPTQG MSHSVDL7VGFGDKTHQKWYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGS VRGYDQSSLGPRSQAYLTARRGQQTTLGEWGGNALATFGSELILPLPFKGDWIDQVRPV IFIEGGQVFDTTGMDKQTIDLTQFKD PQATAEQNAKAANRPLLTQDKQLRYS AGVGATWY TPIGPLSIS YAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVF

SEQ ID No. 3

Polynukleotidové sekvence BASB027 Moraxella catarrhalis kmene ATCC43617

ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATG

GTAATGŤCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGA

CTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG

GTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCA

GATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTA

ATCGCTGAGATTAATTTTGAGGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGG

CTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATC

GAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTC

AAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAA

CCTGCACGGGTGGTTGATATTAATATCATTGGCAATCAGCATTTTAGCGATGCAGATTTG

ATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTAT

ACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGG

TTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGCTAAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATC

TTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTG

GGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAA

GGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAřJrÁTXÍAeŤAfí^-AlírTfecríGAC

GATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACt?ZATTAAIK3ÁTC#AAAtíTt:GTACG

GTTGATGTGGAATATTATATTGACCCTGTACACCCTGTCTATGYACGCCGTATTAATTTT acaggtaactttaagacccaagatgaagtactccgtcgtgagatgcgacaagttgaaggt

GCGTTGGCATGTAATCAAAAAATCCAGCTGTCTCGTGCACGCTTGATGCGGACTGGGTTT

TTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTG-ATGAGGTTGATGTA

AATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAA.CCATCGCAGCAGGCTACTCTCAA

AGTGGTGGTGTAACTTTTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTATGGGTACAGGTAAG

CACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACC

AACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACC

AAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGGCTCATTAAGC

TATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTC7GAATGCTGACAATACC

AAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGT

GGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTAC

AATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGC

ATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTT

TATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAAG

TTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCG

GTTCGTGGCTATGATCAATCCTGTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGT

CGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGC

AGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTGATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGAT

TTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGC

CCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTAT

ACGCCCATTGGTCCTTTATCTATTAGCTATGCCAAGCCATTGAATAAAAAACAAAATGAT

CAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTCTTTTAA

SEQ ID No. 4

Polypeptidová sekvence BASB027 Moraxella catarrhalis odvozená z polynukleotidové sekvence SEQ ID No. 3

MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITXTGLQRVTIESLQSVLPFRLGQV VSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNRLIPKEGLQEG LKNAGLAVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTMLDGNRVKLDMTFAEGK parwdinxignqhfsdadlidvlaikdnkinplskadrytqeklvtslenlrakylnag FVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEALLKFKAEE GFSQAMLEQTTNNISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINF TGNFKTQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDV NFWEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKHVNASFSRSETREVYSLGMT NP YFTVNGVSQSLSGYYRKTKYDNKNI SNYVLDS YGGSLS YGYPIDENQRIS FGLNADNT KLHGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHD YTTYNAILGWNYS SLDRP VFPTQG MSHSVDLTVGFGDKTHQKWYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGS VRGYDQSSLGPRSQAYLTARRGQQTTLGEWGGNALATFGSELILPLPFKGDWIDQVRPV I FI EGGQVFDTTGMDKQTIDLTQFKDPQATAEQNAKAANRPLLTQDKQLRYSAGVGATWY • · ····

TPIGPLSISYAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVF

SEQ ID NO:5

ACT ATA GGG CAC GCG TG

SEQ ID NO:6

CCT GCG TTT GTT TGA TTG AG

SEQ ID NO:7

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C

SEQ ID NO:8

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G

SEQ ID NO:9

CYAKPLNKKQNDQTDT SEQ ID NO:10

YLTARRGQQTTLGEWC

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci,

5 která má alespoň 85% identitu s aminokyselinovou sekvencí zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 4, v celé délce SEQ ID No. 2, popřípadě SEQ ID No. 4.

2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, ve kterém má io aminokyselinová sekvence alespoň 95% identitu s aminokyselinovou sekvencí zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 4 v celé délce SEQ ID No. 2, popřípadě SEQ ID No. 4.

15

3. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 4.

• 4 · · · 4 4

- 74 25. Použití prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství polynukleotidů podle některého z nároků 7 až 14 při výrobě léku pro použití při vyvolání imunitní odpovědi u živočicha.

4. Izolovaný polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze skupiny SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.

5. Imunogenní fragment polypeptidu podle některého z nároků 1 až 4, kde tento imunogenní fragment je schopen, popřípadě navázaný na nosič, vyvolat imunitní odpověď, která rozpozná polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.

6. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 5, kde tento polypeptid je částí většího fúzního proteinu.

• ···· ··· ··· ·· · · · ·· · * ®

-71

7. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle některého z nároků 1 až 6.

8. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci

5 kódující polypeptid, který má alespoň 85% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 v celé délce SEQ ID No. 2, popřípadě SEQ ID No. 4; nebo nukleotidová sekvence s tímto izolovaným polynukleotidem komplementární.

io

9. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid SEQ ID No, 2 nebo 4 v celé kódující oblasti; nebo nukleotidová sekvence s tímto izolovaným polynukleotidem komplementární.

10. Izolovaný polynukleotid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu se sekvencí SEQ ID No. 1 nebo 3 po celé délce SEQ ID No. 1, popřípadě SEQ ID No. 3; nebo nukleotidová sekvence s tímto izolovaným

20 polynukleotidem komplementární.

11. Izolovaný polynukleotid podle některého z nároků 7 až 10, který má alespoň 95% identitu se SEQ ID No. 1 nebo 3.

25

12. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.

13. Izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotid SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 3.

• · · · · • · · · · · ·

-•?r

14. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, získatelný screeningem vhodné knihovny za stringentních podmínek

5 hybridizace se značenou sondou, která má sekvenci SEQ ID

No. 1 nebo SEQ ID No. 3, nebo jejich fragmentu.

15. Expresní vektor nebo živý organismus obsahující izolovaný rekombinantní polynukleotid podle některého z nároků 7 až 14.

16. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 15, která exprimuje izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu s aminokyselinovou sekvencí zvolenou ze skupiny SEQ ID No.

15 2 a SEQ ID No. 4, nebo membrána hostitelské buňky obsahující exprimovaný polypeptid.

17. Způsob výroby polypeptidu podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci

20 hostitelské buňky podle nároku 16 za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu a izolaci polypeptidu z kultivačního média.

18. Způsob exprese polynukleotidu podle některého z nároků 7 až

25 14, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci hostitelské buňky expresním vektorem obsahujícím alespoň jeden z uvedených polynukleotidů a kultivaci hostitelské buňky za podmínek dostatečných pro expresi kteréhokoli z uvedených polynukleotidů.

ι· ···· ·· · ·· • ···· · 9 · • · 9 9 9 9 9 9 • · · 9 9 ···· 9 9 ·

- 73

19. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polypeptidů podle některého z nároků 1 až 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.

20. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polynukleotidů podle některého z nároků 7 až 14 a farmaceuticky účinný nosič.

io

21. Vakcína podle některého z nároků 19 nebo 20, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden další antigen Moraxella catarrhalis.

22. Protilátka imunospecifická pro polypeptid nebo imunologický fragment podle některého z nároků 1 až 6.

23. Způsob diagnózy infekce Moraxella catarrhalis, vyznačující se tím, že zahrnuje identifikaci polypeptidů podle některého z nároků 1 až 6 nebo protilátky, která je pro uvedený polypeptid imunospecifická, přítomných v biologickém vzorku z živočicha s podezřením na takovou infekci.

24. Použití prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství polypeptidů podle některého z nároků 1 až 6 při výrobě léku pro použití při vyvolání imunitní odpovědi u živočicha.

5 26. Farmaceutický prostředek použitelný pro léčení lidí s infekcí

Moraxella catarrhalis, vyznačující se tím, ž e obsahuje alespoň jednu protilátku proti polypeptidu podle některého z nároků 1 až 6 a vhodný farmaceutický nosič.