JP2002517199A - モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ０２７タンパク質およびＢＡＳＢ０２７遺伝子、抗原、抗体、ならびに使用 - Google Patents

モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ０２７タンパク質およびＢＡＳＢ０２７遺伝子、抗原、抗体、ならびに使用

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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

(57)【要約】 本発明はBASB027ポリペプチドおよびBASB027ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに組換え技術による該ポリペプチドの生産方法を提供する。さらに本発明は、診断上、予防上、および治療上の使用も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、ポリヌクレオチド(本明細書中で「BASB027ポリヌクレオチド」と呼
ぶ)、それによりコードされるポリペプチド(本明細書中で「BASB027」または「B
ASB027ポリペプチド」と呼ぶ)、組換え物質およびその生産方法に関する。別の
態様において、本発明は、細菌感染に対するワクチンを含む、前記ポリペプチド
およびポリヌクレオチドの使用方法に関する。更なる態様では、本発明は特定の
病原体の感染を検出するための診断アッセイに関する。
【０００２】発明の背景 モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis; M.catarrhalis)（カタル
球菌(Branhamella catarrhalis)とも称される）はヒト上気道から頻繁に単離さ
れるグラム陰性細菌である。この細菌は、乳児および小児における中耳炎、なら
びに高齢者における肺炎を主なものとするいくつかの病状の原因である。それは
また、副鼻腔炎、院内感染、およびまれな侵襲性疾患の原因でもある。
【０００３】 中耳炎は、症例数の点でもその可能性のある後遺症の点でも重要な小児期の疾
患である。米国においては毎年350万以上の症例が記録され、小児の80％が、３
歳になる前に少なくとも１度は耳炎を起こした経験があると推定されている（Kl
ein. JO(1994) Clin. Inf. Dis 19:823）。処置せずに放置したり慢性化したり
すると、この疾患は一過性（中耳内に体液が蓄積する場合）または永久的（聴覚
神経が損傷を受ける場合）であり得る聴覚障害を起こす可能性がある。乳児にお
いては、このような聴覚障害は言語学習遅延の原因にもなり得る。
【０００４】 中耳炎を患っている小児の中耳からは、主として３種の細菌が単離される。ス
トレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae; S.pneumoniae)、
分類不能型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)（NTHi）、およびM.カタ
ラーリスである。これらは症例の60〜90％に存在している。最近の研究の概説で
は、中耳炎の症例の内、S.ニューモニエとNTHiがどちらも約30％、M.カタラーリ
スが約15％であることが示されている（Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60
:267）。その他の細菌も中耳から単離されることがあるが（インフルエンザ菌B
型、S.ピオゲネス(S. pyogenes)等）、頻度はずっと低い（症例の２％以下）。
【０００５】 中耳にみられる病原菌についての疫学的データは、上気道でのコロニー形成が
耳炎の発症に対する絶対的必要条件であることを示す。しかしながら、疾患が引
き起こされるには、その他の事象も必要になる（Dickinson, DPら (1988) J. In
fect. Dis. 158:205、Faden, HLら (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612
）。それらは、エウスタキオ管を経た中耳への細菌の移動を誘発し、続いて炎症
性経過を開始させるために、とても重大である。それら要因は今日まで分かって
いない。ウイルス感染後の免疫系の一時的な異常が、例えば気道のコロニー形成
に対する抑制不能を引き起こす可能性が仮定されている（Faden, HLら (1994) J
. Infect. Dis. 169:1312）。別の説明は、環境因子への曝露によって、一部の
小児でより重大なコロニー形成が引き起こされるというものである。というのも
、中耳の病原菌が継続的に存在しているため、そのような小児はそれに引き続い
て中耳炎を起こしやすくなるのである（Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60
:267）。
【０００６】 M.カタラーリスに対する免疫応答は十分に特徴付けられていない。幼児の鼻咽
頭から、０〜２歳まで追跡して経時的に単離した株の分析によって、幼児がしば
しば新しい株を獲得しまた排除していることが示される。このことは、この細菌
に対する有効な免疫応答が、コロニー形成された小児によって備えられることを
示している（Faden, HLら (1994) J. Infect. Dis. 169:1312）。
【０００７】 調べた大部分の成人で、殺菌性抗体が確認されている（Chapman, AJら (1985)
J. Infect. Dis. 151:878）。M.カタラーリスの株には、血清の殺菌活性に対す
る耐性能力にばらつきが存在する。一般に、罹患個体からの単離株は、単にコロ
ニー形成した個体由来のものを上回る耐性がある（Hol, Cら (1993) Lancet 341
:1281, Jordan, KLら (1990) Am. J. Med. 88 (増補5A):28S）。従って血清耐性
は、細菌のビルレンスの１つとして考えることができる。オプソニン化活性が中
耳炎から回復しつつある小児の血清中に見出される。
【０００８】 ヒトにおけるこれらの様々な免疫応答により標的とされるその抗原は、OMP B1
、UspA1およびUspA2（Chen D.ら (1999), Infect. Immun. 67:1310）を除いては
同定されていない。このOMP B1は、発現が鉄により調節される84kDaのタンパク
質であり、肺炎を患っている患者の血清により認められる（Sethi. S.ら (1995)
infect. Immun. 63:1516）。
【０００９】 M.カタラーリスの表面上に存在するその他の２〜３の膜タンパク質が、生化学
的手法を用いて、または防御免疫の誘導における潜在的関連性に対して、特徴付
けられている（概説としては、Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267を参
照のこと）。マウス肺炎モデルにおいて、それらのうちの一部（UspA、CopB）に
対して産生された抗体の存在が、肺感染のより速い浄化に有利にはたらく。別の
ポリペプチド（OMP CD）はM.カタラーリス株間で高度に保存され、また緑膿菌(P
seudomonas aeruginosa)のポーリンとの相同性を示し、動物モデルで本細菌に対
する有効性が示されている。
【００１０】 モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)の感染頻度は過去数十年
の間に劇的に上昇している。これは、複数の抗生物質に耐性な株の出現および免
疫系が弱められた人口数の増大を原因とする。幾つかのまたは全ての標準的な抗
生物質に耐性であるモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)株が単
離されることは、もはや珍しいことではない。この現象は、新たな抗菌剤、ワク
チン、薬剤のスクリーニング法、およびこれらの生物用の診断試験に対する、今ま
でに経験したことの無い医薬の要求および需要を生み出した。
【００１１】発明の概要 本発明は、BASB027、特にBASB027ポリペプチドおよびBASB027ポリヌクレオチ
ド、組換え物質およびその生産方法に関する。別の態様において、本発明は、特
に微生物性疾患の予防および治療を含む、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドの使用方法に関する。更なる態様では、本発明は、微生物感染に関連する疾
患およびかかる感染に関連する症状を検出するための診断アッセイ、例えば、BA
SB027ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの発現または活性を検出するため
のアッセイに関する。
【００１２】 開示された発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、後述の説明
を読むことにより、また本開示内容の他の部分を読むことにより、当業者には容
易に明らかとなろう。
【００１３】発明の説明 本発明は、以下により詳細に記載するように、BASB027ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関する。特に、本発明は、モラクセラ・カタラーリス(Moraxel
la catarrhalis)のBASB027ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関し、該ポリ
ペプチドは髄膜炎菌（Neisseria meiningitidis）OMP85の外膜タンパク質とその
アミノ酸配列相同性により関連付けられる。本発明は特に、それぞれ配列番号１
または３および配列番号２または４に示す、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列を有するBASB027に関する。後述の配列表に「ＤＮＡ」として列挙した配列は
、当業者であればかかる配列を一般にリボポリヌクレオチドを含むポリヌクレオ
チドに有効に使用し得ることが理解されることから、本発明の１実施形態の例示
にすぎないことが理解されよう。
【００１４】ポリペプチド 本発明の１態様において、本明細書中で「BASB027」および「BASB027ポリペプ
チド」と呼ぶモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)のポリペプチ
ド、そして生物学上、診断上、予防上、臨床上または治療上有用なその変異体、
ならびにそれらを含む組成物が提供される。
【００１５】 さらに、本発明は、 (a) 配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性、
好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一
性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは完全に同
一であるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド、 (b) 配列番号１または３のポリヌクレオチド配列に対して、それぞれその配列
番号１または３の全長にわたって少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なく
とも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より一層好ま
しくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは完全に同一であるポリ
ヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチド、 (c) 配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性、
好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一
性、より一層好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは完全
に同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された
ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、 を提供する。
【００１６】 配列番号２または４に示すBASB027ポリペプチドは、モラクセラ・カタラーリ
ス(Moraxella catarrhalis)のMc2931株(ATCC 43617)から得たBASB027ポリペプチ
ドである。
【００１７】 また本発明は、BASB027ポリペプチドの免疫原性断片、すなわち配列番号２ま
たは４のアミノ酸配列を含むBASB027ポリペプチドと同一または実質的に同一の
免疫原活性を有する該ポリペプチドの連続した部分、を提供する。すなわち、前
記断片(必要であれば、担体に結合されている)は、BASB027ポリペプチドを認識
する免疫応答を引き出すことができる。こうした免疫原性断片には、例えば、Ｎ
末端のリーダー配列、および／または膜貫通ドメインおよび／またはＣ末端のア
ンカードメインを欠くBASB027ポリペプチドが含まれる。好ましい態様において
、本発明のBASB027の免疫原性断片は、配列番号２の全長にわたる配列番号２ま
たは４のポリペプチド配列に対して少なくとも８５％の同一性、好ましくは少な
くとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好まし
くは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドの実質的に全ての細
胞外ドメインを含む。
【００１８】 断片は、本発明の任意のポリペプチドの任意のアミノ酸配列と部分的には完全
に同一であるが全てが同一ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
BASB027ポリペプチドに関して言えば、断片は「フリースタンディング」であっ
ても、または該断片がその部分または領域を形成するより大きなポリペプチド中
に、最も好ましくは単一のより大きなポリペプチド中の単一の連続した領域とし
て含まれていてもよい。
【００１９】 好ましい断片は、例えば、配列番号２または４のアミノ酸配列またはその変異
体の部分(例えば、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端アミノ酸配列を
含む連続した一連の残基)を有するトランケーションポリペプチドを含む。宿主
細胞により、または宿主細胞内で生産される本発明のポリペプチドの分解形態も
好ましい。さらに好ましいのは、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域、β
シートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコ
イル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フ
レキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指数(high anti
genic index)領域を含む断片などの、構造的および機能的特性により特徴付けら
れる断片である。
【００２０】 さらに好ましい断片には、配列番号２または４のアミノ酸配列に由来する少な
くとも１５、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続したアミノ酸を有
するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号２または４の
アミノ酸配列から末端切断された(truncated)もしくは欠失した少なくとも１５
、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列
を含む単離されたポリペプチド、を含む。
【００２１】 本発明のポリペプチドの断片を使用して、ペプチド合成により対応する全長ポ
リペプチドを生産することができる。従って、これらの断片を中間体として使用
して、本発明の全長ポリペプチドを生産することができる。
【００２２】 特に、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ
酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が好ましい。
【００２３】 本発明のポリペプチドまたは免疫原性断片は「成熟」タンパク質の形であって
も、前駆体または融合タンパク質等のより大きいタンパク質の一部であってもよ
い。しばしば、追加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミ
ノ酸配列には、分泌またはリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のよう
な精製に役立つ配列、または組換え体生産の間の安定性を確保する付加的配列が
含有される。さらに、外来ポリペプチドまたは脂質テイル(lipid tail)またはポ
リヌクレオチド配列の追加により最終的な分子の免疫原としての可能性を高める
ことも考慮される。
【００２４】 １つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片と、各
種サブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンのＨ鎖また
はＬ鎖の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製された可溶
性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１
のＨ鎖の定常部が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特定例では
、血液凝固因子Ｘａで開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Ｆｃ部分を簡単
に除去できる。
【００２５】 さらに、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学的作製方法、ならびに
薬物スクリーニング、診断および治療におけるそれらの使用に関する。また、本
発明の更なる態様はこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに
関する。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/29458 およびWO94/22914
に見いだせる。
【００２６】 前記タンパク質を化学的に結合するかまたは組換え融合タンパク質として発現
させることにより、発現系において該タンパク質が非融合タンパク質に比べて増
大されたレベルで産生される。融合パートナーはＴへルパーエピトープ、好まし
くはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープの提供を助ける(免疫学的融合
パートナー)か、または前記タンパク質の、元の組換えタンパク質より高い産生
量での発現を助ける(発現エンハンサー)ことができる。好ましくは、前記融合パ
ートナーは免疫学的融合パートナーおよび発現エンハンサーパートナーの両方で
ある。
【００２７】 融合パートナーには、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza
e)由来のプロテインＤおよびインフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質NS
1(赤血球凝集素)が含まれる。別の融合パートナーはLytAとして知られるタンパ
ク質である。好ましくは、該分子のＣ末端部分を使用する。LytAは、N-アセチル
-L-アラニンアミダーゼであるアミダーゼLytA(lytA遺伝子によりコードされる[G
ene. 43(1986) page 265-272])、すなわちペプチドグリカン骨格内の特定の結合
を特異的に分解する自己分解酵素を合成するストレプトコッカス・ニューモニエ
(Streptococcus pneumoniae)から得られる。前記LytAタンパク質のＣ末端ドメイ
ンは、コリン、またはDEAE等の数種のコリン類似体に対する親和性に関与してい
る。この性質を融合タンパク質の発現に有用な大腸菌(E.coli)C-LytA発現プラス
ミドの開発に利用した。そのアミノ末端に前記C-LytA断片を含有するハイブリッ
ドタンパク質の精製については、Biotechnology:10. (1992) page 795-798に記
載されている。前記LytA分子のＣ末端に見出され、残基178から始まる反復部分(
例えば残基188〜305)を使用することができる。
【００２８】 また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換（ある残基が
性質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違して
いるポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Le
u および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間
；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。
【００２９】 本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で生産することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に生産されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より生産されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを生産するため
の手段は当技術分野でよく理解されている。
【００３０】 本発明のポリペプチドはモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)
由来であることが最も好ましいが、好ましくは同じ分類学上の属に含まれるその
他の生物から得ることができる。また、本発明のポリペプチドは、例えば同じ分
類学上の科または綱の生物から得ることもできる。
【００３１】ポリヌクレオチド 本発明の目的は、BASB027ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に
本明細書中でBASB027と呼ぶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
することにある。
【００３２】 本発明の特に好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１ま
たは３に示した配列を含むBASB027ポリペプチドをコードする領域を含み、これ
には全長遺伝子またはその変異体が含まれる。
【００３３】 配列番号１または３で示されるBASB027ポリヌクレオチドは、モラクセラ・カ
タラーリス(Moraxella catarrhalis)のMc2931株(ATCC 43617)に由来するBASB027
ポリヌクレオチドである。
【００３４】 本発明の更なる態様では、BASB027ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、特
にモラクセラ・カタラーリスのBASB027ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを
コードする、ならびに／または発現する単離された核酸分子が提供され、これに
は例えば、プロセシングされていないＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−およびＺ−ＤＮＡが含まれる。本発明の更なる実施
形態には、生物学上、診断上、予防上、臨床上または治療上有用なポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド、およびその変異体、ならびにそれらを含む組成物が含
まれる。
【００３５】 本発明の別の態様は、配列番号２または４の推定アミノ酸配列を有するBASB02
7ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの全長遺伝子を含む単離されたポ
リヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドと密接に関連するポリヌクレオチド
ならびにその変異体に関する。
【００３６】 本発明の別の特に好ましい実施形態としては、配列番号２もしくは４のアミノ
酸配列を含むかまたは該配列からなるモラクセラ・カタラーリス(Moraxella cat
arrhalis)由来のBASB027ポリペプチド、またはその変異体がある。
【００３７】 本明細書中で提供される情報を用いると、配列番号１または３に示すポリヌク
レオチド配列等の、BASB027ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチ
ドは、標準的なクローニング法およびスクリーニング法、例えばモラクセラ・カ
タラーリス(Moraxella catarrhalis)カトリン(Catlin)細胞を出発物質として用
いて細菌から染色体ＤＮＡ断片をクローニングおよび配列決定し、次いで全長ク
ローンを得る方法等により得ることができる。例えば、配列番号１または３に示
すポリヌクレオチド配列等の本発明のポリヌクレオチド配列を得るためには、典
型的には大腸菌またはある他の適当な宿主内のモラクセラ・カタラーリス(Morax
ella catarrhalis)カトリンの染色体ＤＮＡクローンのライブラリーを、放射性
標識したオリゴヌクレオチド、好ましくは部分配列由来の１７マー以上の長さの
ものでプローブする。その後、該プローブのＤＮＡと同一のＤＮＡを担持するク
ローンを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて識別するこ
とができる。従って、ハイブリダイゼーションにより同定された個々のクローン
を、元のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列から設計した配列決定用プラ
イマーを用いて配列決定することにより、その後ポリヌクレオチド配列を両方向
に伸長して全長遺伝子配列を決定することが可能である。そうした配列決定は、
例えばプラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて都合よく実施
する。適当な技術はManiatis,T., Fritsch,E.F.およびSambrookら、MOLECULAR C
LONING, A LABORATORY MANUAL,第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York(1989)に記載されている(特にScreening By Hyb
ridization 1.90 およびSequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates
13.70を参照されたい)。また、直接ゲノムＤＮＡ配列決定を行って全長遺伝子
配列を得ることもできる。本発明の具体例である配列番号１または３に示した各
ポリヌクレオチドは、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)由来
のＤＮＡライブラリー中に見出された。
【００３８】 さらに、配列番号１または３に示す各ＤＮＡ配列は、当業者に周知のアミノ酸
残基の分子量値を用いて算出しうる推定分子量を有する、配列番号２または４に
示すおおよその数のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを含有する。
【００３９】 配列番号１のポリヌクレオチド(配列番号１のヌクレオチド番号１の開始コド
ンとヌクレオチド番号2440で始まる終結コドンとの間)は、配列番号２のポリペ
プチドをコードする。配列番号３のポリヌクレオチド(配列番号３のヌクレオチ
ド番号１の開始コドンとヌクレオチド番号2440で始まる終結コドンとの間)は、
配列番号４のポリペプチドをコードする。
【００４０】 更なる態様において、本発明は、下記(a)または(b)のポリヌクレオチド配列を
含む、または下記(a)または(b)のポリヌクレオチド配列からなる、単離されたポ
リヌクレオチドを提供する； (a) 配列番号１または３のポリヌクレオチド配列に対して、それぞれその配列
番号１または３の全長にわたって少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なく
とも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より一層好ま
しくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは完全に同一であるポリ
ヌクレオチド配列、または (b) 配列番号２または４のアミノ酸配列に対して、それぞれその配列番号２ま
たは４の全長にわたって少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より一層好ましくは少
なくとも９７〜９９％の同一性もしくは１００％きっかりの同一性を有するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【００４１】 モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)以外の種に由来する相同
体およびオーソログ体を含む本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、配列番号１もしくは３の配列またはその断片からなるまたはそれらを含む
標識されたプローブまたは検出可能なプローブを用いて、ストリンジェントな条
件下で(例えば、４５〜６５℃の範囲の温度および0.1〜1％のSDS濃度を用いて)
適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を含む全長遺
伝子および／またはゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる方法により得
られる。
【００４２】 本発明は、配列番号１または３中のコード配列(オープンリーディングフレー
ム)に対して、その全長にわたり同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。
また、本発明により、成熟ポリペプチドもしくはその断片のコード配列単独、な
らびに別のコード配列（例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ−またはプロ−
またはプレプロ−タンパク質配列をコードする配列）をそのリーディングフレー
ム内に有する成熟ポリペプチドもしくはその断片のコード配列が提供される。ま
た、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、限定するものではないが、少なくと
も１つの5'および3'非コード配列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、終
結シグナル(例えば、rho依存性およびrho非依存性終結シグナル)、リボソーム結
合部位、Kozak配列、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、ならびにポリアデニル
化シグナル、を含む少なくとも１つの非コード領域を含有していてもよい。また
、このポリヌクレオチド配列は、追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列
を含んでいてもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配
列がコードされ得る。本発明の特定の実施形態では、マーカー配列は、ｐＱＥベ
クター(Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 86:821-824(1989)に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、また
はＨＡペプチドタグ(Wilsonら、Cell 37:767(1984))であり、いずれもそれらに
融合させたポリペプチド配列を精製する際に有用でありうる。また、本発明のポ
リヌクレオチドは、限定するものではないが、構造遺伝子および該遺伝子がその
自然状態において関連する遺伝子発現制御配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００４３】 配列番号２または４のBASB027ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は
、配列番号１または３のそれぞれのヌクレオチド番号１〜2439中に含まれるポリ
ペプチドコード配列と同一であってもよい。あるいは、遺伝子コードの重複性（
縮重）のため、やはり配列番号２または４のポリペプチドをコードする配列であ
ってもよい。
【００４４】 本明細書中で使用する用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は
、本発明のポリペプチド、特に細菌のポリペプチド、より特定的には配列番号２
または４に示すアミノ酸配列を有するモラクセラ・カタラーリスBASB027のポリ
ペプチド、をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。また、この用
語は、前記ポリペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域(例えば
、組み込まれたファージ、組み込まれた挿入配列、組み込まれたベクター配列、
組み込まれたトランスポゾン配列により、またはＲＮＡエディティングもしくは
ゲノムＤＮＡ再構成により分断されたポリヌクレオチド)を、やはりコード配列
および／または非コード配列を含有しうる追加の領域と共に含むポリヌクレオチ
ドを包含する。
【００４５】 本発明はさらに、配列番号２または４の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの変異体をコードする、本明細書中に記載されたポリヌクレオチドの変異体に
関する。本発明のポリヌクレオチドの断片を使用して、例えば、本発明の全長ポ
リヌクレオチドを合成することができる。
【００４６】 更にとりわけ好ましい実施形態としては、配列番号２または４のBASB027ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有するBASB027変異体をコードするポリヌクレオチド
であって、数個、２〜３個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、２個、１個、ま
たは０個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、修飾、欠失および／または付加
されているポリヌクレオチドがある。これらのうち特に好ましいのは、BASB027
ポリペプチドの特性および活性を変更しないサイレント置換、付加および欠失で
ある。
【００４７】 本発明の更に好ましい実施形態としては、配列番号２または４に示すアミノ酸
配列を有するBASB027ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、そ
の全長にわたり、少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならび
にかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドがある。あるいは、BASB
027ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれに対する相補的ポリ
ヌクレオチドに対して、その全長にわたり、少なくとも９０％の同一性を有する
領域を含んでなるポリヌクレオチドが、最高に好ましい。これに関して、上記同
様に、その全長にわたり、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド
が特に好ましい。更に、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドの
うち少なくとも９７％の同一性を有するものが一層好ましく、これらのうち少な
くとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有するものが特に一層好ましく
、少なくとも９９％の同一性を有するものが最も好ましいものである。
【００４８】 好ましい実施形態としては、配列番号１または３のＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持しているポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチドがある。
【００４９】 本発明の特定の好ましい実施形態に従って、特にストリンジェントな条件下で
、配列番号１または３のポリヌクレオチド等のBASB027ポリヌクレオチド配列に
ハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。
【００５０】 更に、本発明は、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は特に、ストリンジ
ェントな条件下で本明細書中に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ
リヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、用語「ストリンジェント
な条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列
間に少なくとも９５％の同一性、および好ましくは少なくとも９７％の同一性が
ある場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件の特定の具体例は、50% ホルムアミド、５×
SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.
6)、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断した
サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中４２℃で一夜インキュベートし、次いでハイブ
リダイゼーション支持体を 0.1×SSC 中約６５℃で洗浄することである。ハイブ
リダイーゼションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrookら、Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1989)中、特に第
１１章に例示されている。また、溶液ハイブリダイゼーションを、本発明により
提供されるポリヌクレオチド配列と共に使用することができる。
【００５１】 また、本発明は、配列番号１もしくは３に示すポリヌクレオチド配列またはそ
の断片の配列を有するプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で完全な前記遺伝子を含有する適当なライブラリーを配列番号１ま
たは３に示すポリヌクレオチド配列についてスクリーニングし、前記ポリヌクレ
オチド配列を単離することにより得られるポリヌクレオチド配列からなる、また
は該ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌク
レオチドを得るために有用な断片には、例えば、本明細書中の他の箇所において
十分に記載したプローブおよびプライマーが含まれる。
【００５２】 本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中の他の箇所において論
じたように、例えば、本発明のポリヌクレオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノ
ムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用して、BASB027を
コードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離したり、BASB027遺伝子
に対して高い同一性、特に高い配列同一性を有する別の遺伝子のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離することができる。このようなプローブはたいてい少なく
とも１５個のヌクレオチド残基または塩基対を含む。好ましくは、このようなプ
ローブは少なくとも３０個のヌクレオチド残基または塩基対を有し、少なくとも
５０個のヌクレオチド残基または塩基対を有していてもよい。特に好ましいプロ
ーブは少なくとも２０個のヌクレオチド残基または塩基対を有し、かつ３０個未
満のヌクレオチド残基または塩基対を有するものである。
【００５３】 BASB027遺伝子のコード領域を配列番号１または３に示すＤＮＡ配列を用いて
スクリーニングすることにより単離し、オリゴヌクレオチドプローブを合成する
ことができる。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリ
ゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリ
ーをスクリーニングし、該ライブラリーのどのメンバーに前記プローブがハイブ
リダイズするかを決定することができる。
【００５４】 完全長ＤＮＡを得るための、または短鎖ＤＮＡを伸長させるための、当業者に
周知で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、ｃＤＮＡ末端高速増幅法（ＲＡ
ＣＥ）に基づいた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002, 1
988を参照のこと）。例えばMarathonTM技術(Clontech Laboratories Inc.)によ
り例示されるような、上記技法の最近の改良により、より長いｃＤＮＡの検索が
大いに簡便化された。MarathonTM技術では、所定の組織より抽出されたｍＲＮＡ
からｃＤＮＡを作製し、各末端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝
子特異的およびアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用
いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行い、前記ＤＮＡの「欠失」5'末端を増幅する。次に
、「ネステッド(nested)」プライマー、すなわち増幅産物の内部にアニールする
ように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列のさらに3'側にアニ
ールするアダプター特異的プライマーおよび選択された遺伝子配列のさらに5'側
にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。その
後、この反応の産物をＤＮＡ塩基配列決定により解析し、この産物を既存のＤＮ
Ａに直接結合して完全な配列とするか、または5'プライマー設計用の新たな配列
情報を用いて別の全長ＰＣＲを行うことにより、全長ＤＮＡを構築することがで
きる。
【００５５】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、本明細書中でポリヌクレオ
チドアッセイについてさらに論じたように、例えば、疾患(特にヒトの疾患)用の
治療薬および診断薬を発見するための、研究試薬ならびに材料として使用するこ
とができる。
【００５６】 配列番号１または３の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発明のポリ
ヌクレオチドを本明細書中に記載した方法、好ましくはＰＣＲにおいて使用して
、本発明で同定されたポリヌクレオチドの全体または部分が感染組織中の細菌に
て転写されるか否かを確認することができる。また、病原体が到達した感染段階
および感染型を診断する際にそのような配列が有用であることは理解されよう。
【００５７】 また、本発明は、成熟タンパク質に追加のアミノもしくはカルボキシ末端アミ
ノ酸を、または(例えば、成熟形態が２以上のポリペプチド鎖を有する場合は)該
成熟タンパク質内部に追加のアミノ酸を付け加えたポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを提供する。そのような配列は、タンパク質を前駆体から成熟形
態にプロセシングする際に何らかの役割を果たし、タンパク質の輸送を可能とし
、タンパク質の半減期を延長するかまたは短縮し、あるいは特にアッセイまたは
生産のためのタンパク質の操作を容易にすることができる。in vivoの場合は一
般に、前記の追加のアミノ酸を細胞内酵素により前記成熟タンパク質から除去す
ることができる。
【００５８】 本発明の各々どのポリヌクレオチドについても、それに相補的なポリヌクレオ
チドが提供される。これらの相補的なポリヌクレオチドは、それらが相補性を示
す各ポリヌクレオチドに対して十分に相補的であることが好ましい。
【００５９】 前駆体タンパク質は、そのポリペプチドの成熟形態が１以上のプロ配列に融合
されている場合、該ポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、通常そのような不活性前駆体は活性化される。前記プロ配列のいくつ
かまたは全ては、活性化の前に除去され得る。一般に、そのような前駆体はプロ
タンパク質と呼ばれる。
【００６０】 ヌクレオチドを示す標準的な記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕに加えて、用語「Ｎ」を
本発明の特定のポリヌクレオチドを記載する際に使用することもできる。「Ｎ」
は４種のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのうちの任意のものが、ＤＮＡまたは
ＲＮＡ配列中のその示された位置にみられることを意味する。ただし、隣接する
ヌクレオチド位置と組み合わせて用いられる場合や正しいリーディングフレーム
で読まれる場合には、Ｎはそのようなリーディングフレーム内に早期終結コドン
を生じる効果を有する核酸ではないことが好ましい。
【００６１】 まとめると、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、成熟タンパク質に
リーダー配列を付け加えたもの(プレタンパク質とも呼ばれる)、プレタンパク質
のリーダー配列ではない１以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、ま
たはプレプロタンパク質(通常はポリペプチドの活性形態および成熟形態を生産
するプロセシング工程の間に除去される１以上のプロ配列、およびリーダー配列
を有する、プロタンパク質の前駆体)をコードするものであってよい。
【００６２】 本発明の態様に従うと、本発明のポリヌクレオチドの治療または予防目的での
使用、特に遺伝子的免疫感作(genetic immunization)における使用が提供される
。
【００６３】 遺伝子的免疫感作における本発明のポリヌクレオチドの使用では、好ましくは
、プラスミドＤＮＡの筋内への直接注射(Wolffら、Hum Mol Genet(1992)1:363,
Manthorpeら、Hum. Gene Ther.(1983)4:419)、特定のタンパク質担体と複合体化
させたＤＮＡの送達(Wuら、J Biol Chem.(1989)264:16985)、ＤＮＡとリン酸カ
ルシウムとの共沈殿(BenvenistyおよびReshef, PNAS USA, (1986)83:9551)、Ｄ
ＮＡの種々の形態のリポソームへの封入(Kanedaら、Science(1989)243:375)、粒
子撃ち込み(particle bombardment)(Tangら、Nature(1992)356:152, Eisenbraun
ら、DNA Cell Biol(1993)12:791)ならびにクローン化レトロウイルスベクターを
用いたin vivo感染(Seegerら、PNAS USA(1984)81:5849)等の適切な送達方法を使
用する。
【００６４】ベクター、宿主細胞、発現系 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明の該ベクターに
より遺伝子操作された宿主細胞ならびに組換え法による本発明のポリペプチドの
生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの種のタ
ンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。
【００６５】 本発明の組換えポリペプチドは、当業者に周知の手法により、発現系を含む遺
伝子操作された宿主細胞から調製することができる。従って、更なる態様におい
て、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現系、かかる発現系を用いて
遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組換え法による本発明のポリペプチドの生
産に関する。
【００６６】 本発明のポリペプチドの組換え生産のために、宿主細胞を遺伝子操作して発現
系もしくはその部分または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら, BASIC METHODS IN
MOLECULAR BIOLOGY (1986) および Sambrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORAT
ORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, N.Y. (1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載された方法、
例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介
トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェ
クション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション
、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballisticin
troduction)および感染などによって行うことができる。
【００６７】 適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、エンテロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリ
ア、枯草菌、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)およびモラクセラ・カタラーリ
ス）、真菌細胞（例：酵母であるクルベロミセス(Kluveromyces)、サッカロミセ
ス、また担子菌、カンジダ・アルビカンスCandida albicans)およびアスペルギ
ルス）、昆虫細胞（例：ショウジョウバエＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動物細
胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ127、３Ｔ３、ＢＨＫ、293、ＣＶ−１お
よびBowes メラノーマ細胞）および植物細胞(例：裸子植物または被子植物の細
胞)が挙げられる。
【００６８】 多種多様な発現系を使用して、本発明のポリぺプチドを生産することができる
。そのようなベクターとして、特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポ
ゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来、酵母染色体エレメント由来、ウ
イルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコルナウイ
ルス、レトロウイルスおよびアルファウイルス）由来のベクター、ならびにこれ
らの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラ
スミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。発現系構築物
は発現を調節するだけでなく発現を起こさせる制御領域を含んでいてもよい。一
般的に、宿主内でポリヌクレオチドを維持し、増やすかもしくは発現するのに適
した系もしくはベクター、および／またはポリペプチドを発現するのに適した系
もしくはベクターはどれもこの点に関して発現のために使用しうる。例えば、Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (前掲) に記載されるよう
な、周知で日常的に用いられる種々の技法のいずれかにより、適当なＤＮＡ配列
を発現系に挿入することができる。
【００６９】 真核細胞における組み換え発現系の場合、翻訳されたタンパク質を小胞体の内
腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグ
ナルを発現されるポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは該
ポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
【００７０】 組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、イオン金属アフィニティークロマトグラフィー(i
on metal affinity chromatography:IMAC)が精製に用いられる。ポリペプチドが
細胞内合成、単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を再生
させるための周知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元するこ
とが可能である。
【００７１】 また、前記発現系はウイルスまたは細菌等の組換え生存微生物であってもよい
。目的とする遺伝子を組換え生存ウイルスまたは細菌のゲノム内に挿入すること
ができる。この生存ベクターを用いての接種またはin vivo感染により、抗原のi
n vivo発現および免疫応答の誘導がもたらされる。この目的のために使用するウ
イルスおよび細菌としては、例えば、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウ
イルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス)、アルファウイルス(シンドビスウ
イルス、セムリキ森林ウイルス、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス)、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ピコルナウイルス(ポリオウイルス、ライノウイル
ス)、ヘルペスウイルス(水痘-帯状ヘルペスウイルス等)、リステリア、サルモネ
ラ、シゲラ、BCG、がある。これらのウイルスおよび細菌は有毒であっても、ま
たは生ワクチンを得るために種々の方法により弱毒化されていてもよい。そのよ
うな生ワクチンもまた、本発明の一部を成すものである。
【００７２】診断アッセイ、予後アッセイ、血清型判別(serotyping)アッセイおよび変異アッ
セイ また、本発明は、本発明のBASB027ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの診
断用試薬としての使用に関する。真核生物(特に哺乳動物、とりわけヒト)におけ
るBASB027ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出により、疾患、
疾患の段階または薬剤に対する感染生物の応答を診断するための診断方法が提供
される。真核生物(特に哺乳動物、とりわけヒト、特にBASB027遺伝子もしくはタ
ンパク質を含む生物に感染した、または感染した可能性のあるヒト)を、種々の
周知の技法および本明細書中で示す方法により核酸レベルまたはアミノ酸レベル
で検出することができる。
【００７３】 予後、診断または他の分析用のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、感染
したと思われる個体および／または感染した個体の生体材料から得ることができ
る。これらのいずれかの供給源に由来するポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたは
ＲＮＡを検出のために直接使用してもよいし、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法
を使って酵素的に増幅してもよい。また、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡを同様の方法で使用することもできる。増幅を用いて、個体に存
在する感染生物または常在生物の種および系統を、該生物の選択したポリヌクレ
オチドの遺伝子型の分析により特徴付けることができる。欠失および挿入は、近
縁の生物(好ましくは同じ属で異なる種の生物または同じ種で異なる系統の生物)
から選択された基準配列の遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化に
より検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識したBASB027ポリヌクレオチド
配列とハイブリダイズさせることで同定できる。完全にもしくは有意にマッチし
た配列と、不完全にもしくはより有意にミスマッチである二重鎖とは、ＤＮＡま
たはＲＮＡそれぞれについて、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼ消化により、または
融解温度もしくは再生キネティクスの差を検出することにより区別できる。また
、ポリヌクレオチド配列の差異は、基準配列と比較した場合のゲルでのポリヌク
レオチド断片の電気泳動の移動度の変化により検出できる。これは変性剤を用い
ても用いなくても実施できる。また、ポリヌクレオチドの差異は、直接ＤＮＡま
たはＲＮＡ塩基配列決定によっても検出できる（例えば、Myersら, Science 23
0:1242(1985) を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテク
ションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼ、Ｖ１およびＳ１プロテクションアッセイ
）または化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 85:4397-4401(1985)を参照のこと）。
【００７４】 別の実施形態において、BASB027ヌクレオチド配列またはその断片を含むオリ
ゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば、遺伝的突然変異、血清型
、分類学的な分類または同定の効率的なスクリーニングを実施することができる
。アレイ技法は周知であって一般に適用可能であり、これを使用して遺伝子発現
、遺伝的連鎖、および遺伝的多様性を含む分子遺伝学における疑問に取り組むこ
とができる（例えば、Cheeら, Science, 274:610 (1996)を参照のこと）。
【００７５】 かくして、別の態様において、本発明は、 (a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１または３のヌクレオ
チド配列）もしくはその断片、 (b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 (c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２または４のポリペプチド
）もしくはその断片、または (d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２または４のポリペプチド
）に対する抗体、 を含む、診断用キットに関する。
【００７６】 このようなキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)が実質的な構成成分であ
ることが理解されよう。このようなキットは疾患または疾患への罹りやすさなど
を診断するうえで有用である。
【００７７】 本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。疾
病または病原性と関連した、本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１
または３の変異型の検出は、該ポリヌクレオチドの過少発現、過剰発現または改
変した発現により生ずる疾病、疾病の進行の予後、疾病のステージの決定、また
はその疾病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断
用ツールを提供するだろう。該ポリヌクレオチドに突然変異がある生物、特に感
染症の生物を、本明細書の他に記載されているさまざまな技法によりポリヌクレ
オチドレベルで検出することができる。
【００７８】 また本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドにおいて突然変異
または多型性（対立遺伝子変異）を有する生物由来の細胞を、種々の技法によっ
てポリヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレベルで検出することができ、そ
れにより例えば血清型別にすることができる。例えば、RT−PCRを使用して、RNA
における突然変異を検出することができる。特に好ましくは、RT−PCRを、例え
ばGeneScanなどの自動検出システムと組み合わせて使用する。RNA、cDNAまたは
ゲノムDNAもまた同じ目的でPCRに使用することができる。例えば、BASB027ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的なPCRプライマーを使用して、
突然変異を同定し、解析することができる。
【００７９】 更に本発明は、5’末端および／または3’末端から取り除いた1、2、3または4
個のヌクレオチドを有するプライマーを提供する。これらのプライマーは特に、
生体材料などの個体由来のサンプルから単離したBASB027 DNAおよび／またはRNA
を増幅するのに使用しうる。該プライマーを使用して感染した個体から単離され
たポリヌクレオチドを増幅することができ、次いでそのポリヌクレオチドは、ポ
リヌクレオチド配列の解明のための種々の技法に付すことができる。このように
して、ポリヌクレオチド配列における突然変異を検出し、かつ使用して、感染症
または該感染症のステージもしくは進行を診断および／または予後判定するか、
あるいは該感染因子を血清型に分ける、および／または分類することができる。
【００８０】 本発明は更に、疾患、好ましくは細菌感染症、より好ましくはモラクセラ・カ
タラーリスにより引き起こされる感染症を診断する方法を提供する。該方法には
、生体材料などの個体由来のサンプルから、配列番号１または３の配列を有する
ポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を測定することが含まれる。BASB027ポリ
ヌクレオチドの発現の増加または低下は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定
量法、例えば増幅、PCR、RT−PCR、RNaseプロテクション、ノーザンブロッティ
ング、分光測定法、その他のハイブリダイゼーション法などの方法のいずれか1
つにより測定することができる。
【００８１】 更に、正常な対照組織サンプルと比較した場合のBASB027ポリペプチドの過剰
発現を検出するための本発明の診断アッセイを使用して、例えば感染症の有無を
検出しうる。宿主から得られたサンプル中（生体材料など）のBASB027ポリペプ
チドのレベルを測定するのに使用しうるアッセイ法は当業者によく知られている
。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエ
スタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出、ELISAアッセイな
どがある。
【００８２】 本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドアレイ、好ましくは高密度ア
レイまたはグリッドの構成成分として使用することができる。これらの高密度ア
レイは、診断用途および予後判定の用途に特に有用である。例えば、それぞれが
異なる遺伝子を含み、更に本発明のポリヌクレオチドを含むスポットの1セット
を、生体サンプルから得たまたは生体サンプルから誘導したプローブを利用して
、ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅などにより、プロービングすることに
使用することができ、それによって個体中の特定のポリヌクレオチド配列または
関連配列の存在を決定することができる。そのような配列の存在は、病原体の存
在、特にモラクセラ・カタラーリスの存在を示し得るものであり、疾患もしくは
疾患の進行を診断および／または予後判定するのに有用でありうる。配列番号１
または３のポリヌクレオチド配列のいくつかの変異体を含むグリッドが好ましい
。また、配列番号２または４のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド
配列のいくつかの変異体を含むグリッドが好ましい。
【００８３】抗体 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、もしくはそれらの変異体、ま
たはそれらを発現する細胞は、該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにそれぞ
れ免疫特異的な抗体を製造するための免疫原として使用することができる。
【００８４】 本発明の特定の好ましい実施形態において、BASB027ポリペプチドまたはポリ
ヌクオチドに対する抗体が提供される。
【００８５】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して生成された抗体は、慣
用のプロトコルを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のポリペプチド
および／もしくはポリヌクレオチド、またはそのどちらかもしくは両方のエピト
ープ含有断片、どちらかもしくは両方の類似体、あるいはどちらかもしくは両方
を発現する細胞を投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の
調製には、連続細胞系の培養物により抗体を産生させる当技術分野で公知の任意
の技法を用いることができる。例を挙げると、Kohler, G.およびMilstein, C.の
方法（Nature 256:495-497(1975))、Kozborらの方法（Immunology Today 4:72(1
983))およびColeらの方法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pg77-
96, Alan R. Liss, Inc.(1985))など種々の方法がある。
【００８６】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する一本鎖抗体を産生する
ために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）も適用することができ
る。また、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに免疫特異的なヒト化
抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の生物もしくは他
の哺乳動物などの動物を利用することができる。
【００８７】 あるいは、ファージディスプレイ法を利用して、抗BASB027の保持についてス
クリーニングしたヒト由来のリンパ球のPCR増幅したv遺伝子のレパートリー、あ
るいは天然ライブラリー（McCaffertyら、(1990)Nature 348, 552-554；Marksら
、(1992)Biotechnology 10, 779-783）のいずれかから、本発明のポリペプチド
に対し結合活性を有する抗体遺伝子を選択することができる。これらの抗体の親
和性を、例えば、チェーンシャフリング（chain shuffling：Clacksonら、(1991
)Nature 352:628）により改良することもできる。
【００８８】 前述の抗体を用いて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現す
るクローンを単離または同定したり、例えばアフィニティークロマトグラフィー
でそのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを精製することもできる。
【００８９】 従ってその中でも、BASB027ポリペプチドまたはBASB027ポリヌクレオチドに対
する抗体を使用して、感染症、特に細菌感染症を治療しうる。
【００９０】 ポリペプチド変異体には、抗原的に、エピトープ的にまたは免疫学的に本発明
の特定の態様を形作る等価変異体が含まれる。
【００９１】 好ましくは、前記抗体またはその変異体を改変し、個体におけるその免疫原性
がより低くなるようにする。例えば、該個体がヒトである場合、該抗体は「ヒト
化」されているのが最も好ましく、その際、ハイブリドーマ化された抗体の相補
性決定領域は、例えばJonesら(1986)Nature 321, 522-525、またはTempestら(19
91)Biotechnology 9, 266-273に記載のようにヒトモノクローナル抗体中に導入
される。
【００９２】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 また本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、例えば、細胞、
無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物中の、小分子基質とリガ
ンドとの結合を評価することができる。これらの基質およびリガンドは、天然基
質およびリガンドであってもよいし、または構造的もしくは機能的にミメティッ
クであってもよい。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2
):５章(1991)を参照のこと。
【００９３】 スクリーニング法では、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ま
たは該ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを担持する細胞もしくは膜、また
は該ポリペプチドの融合タンパク質、への候補化合物の結合を、該候補化合物に
直接または間接的に結合される標識を用いて簡単に測定できる。あるいは、スク
リーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。さらに、こう
したスクリーニング法では、該候補化合物が該ポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチドの活性化または抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、
該ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含有する細胞に適した検出系を用い
て試験することができる。一般的には、既知のアゴニストの存在下で活性化のイ
ンヒビターをアッセイして、アゴニストによる活性化に該候補化合物の存在が与
える影響を観察する。アゴニストまたはインヒビターの不在下で、該候補化合物
が該ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性化を抑制するか否かを調べる
ことによる反アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、場合によ
っては、構成的に活性のあるポリペプチドならびに／または構成的に発現される
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが用いられる。さらに、これらのスクリー
ニング法は、候補化合物と本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含
む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつくり、この混合物中のBASB027ポリペプチド
および／もしくはポリヌクレオチド活性を測定し、そしてこの混合物のBASB027
ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド活性をスタンダードと比較する
各ステップを単に含みうる。本発明のポリペプチド、ならびに系統学的におよび
／または機能的に関連するポリペプチドのアンタゴニストを同定するためのハイ
スループットスクリーニングアッセイでは、上記のようなFc部分とBASB027ポリ
ペプチドから作製されるような融合タンパク質も使用することができる(D. Benn
ettら, J. Mol. Recognition, 852-58 (1995) およびK. Johansonら, J. Biol.
Chem., 270(16):94599471 (1995)を参照のこと）。
【００９４】 また、本発明のポリペプチドに結合するおよび／または該ポリペプチドと相互
作用するポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を用いて、細胞内でのmRNA
および／またはポリペプチドの産生に及ぼす添加化合物の作用を検出するための
スクリーニング法を組み立てることができる。例えば、当業界で公知の標準方法
によりモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、ポリペプチドの
分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのELISAアッセイを構築するこ
とができ、これは適切に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を
抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストともいう）
の探索に用いることができる。
【００９５】 本発明はまた、BASB027ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの作用を増強
する（アゴニスト）もしくはブロックする（アンタゴニスト）化合物、特に静菌
性および／もしくは殺菌性の化合物を同定するための、該化合物のスクリーニン
グ法を提供する。該スクリーニング法は、ハイスループット技術を伴いうる。例
えば、アゴニストまたはアンタゴニストについてスクリーニングするために、BA
SB027ポリペプチドおよび該ポリペプチドの標識基質もしくはリガンドを含有す
る、合成反応混合物、細胞構成成分（膜、細胞エンベロープ、もしくは細胞壁）
またはそれらの任意の調製物を、BASB027のアゴニストもしくはアンタゴニスト
でありうる候補分子の不在下または存在下でインキュベートする。該候補分子の
、BASB027ポリペプチドを作動させるまたは拮抗阻害する能力は、標識リガンド
の結合が減少すること、または該基質からの産物の生成が減少することに反映さ
れる。むやみに結合する、すなわちBASB027ポリペプチドの作用を誘導すること
なく結合する分子は、最も有望な、有効なアンタゴニストである。十分に結合す
る分子、および場合により基質からの産物の生成速度を上昇させる分子、シグナ
ル伝達を増強する分子、または化学チャネル活性を増加させる分子は、アゴニス
トである。場合により、基質からの産物の生成、シグナル伝達、または化学チャ
ネル活性の速度もしくはレベルの検出を、レポーター系を用いて強化させること
ができる。この点において有効でありうるレポーター系には、限定するものでは
ないが、産物に変換される比色用標識基質、BASB027ポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド活性の変化に反応するレポーター遺伝子、および当技術分野で公知
の結合アッセイが含まれる。
【００９６】 BASB027アゴニストについてのアッセイの他の例は、競合阻害アッセイに適切
な条件下で、BASB027と、BASB027結合分子、組換えBASB027結合分子、天然基質
もしくはリガンド、または基質もしくはリガンドミメティックを有する潜在的な
アゴニストとを結合させる、競合アッセイである。BASB027を、放射性または比
色用化合物などで標識することができ、それにより結合分子に結合したまたは生
成物に変換されたBASB027分子数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの
有効性を評価しうる。
【００９７】 潜在的なアンタゴニストには他に、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしく
はポリペプチドに結合し、それによりその活性または発現を抑制または無効にす
る、有機小分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。潜在的なアン
タゴニストはまた、BASB027誘導性活性を誘導することなく、結合分子などの結
合分子の同じ部位に結合し、それによりBASB027ポリペプチドおよび／もしくは
ポリヌクレオチドが結合するのを排除してBASB027ポリペプチドおよび／もしく
はポリヌクレオチドの作用または発現を妨害する、有機小分子、ペプチド、非常
に近縁なタンパク質または抗体などのポリペプチドでありうる。
【００９８】 潜在的なアンタゴニストには、前記ポリペプチドの結合部位に結合しかつその
部位を占有して、それにより細胞性結合分子に結合するのを妨害することにより
正常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。小分子の例としては、限定する
ものではないが、有機小分子、ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。他の
潜在的なアゴニストには、アンチセンス分子（これらの分子についての記載は、
Okano, J. Neurochem. 56: 560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense I
nhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)を参照のこ
と）が含まれる。好ましい潜在的なアンタゴニストには、BASB027に関連した化
合物およびBASB027の変異体が含まれる。
【００９９】 更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片と、各
種サブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンのH鎖またはL鎖の定常領
域の様々な部分と、を含む遺伝子工学的に作製された可溶性融合タンパク質に関
する。免疫グロブリンとしてはヒトIgG、特にIgG1のH鎖の定常部が好ましく、そ
の場合は融合がヒンジ領域で起こる。特定の実施形態では、血液凝固Xa因子で切
断され得る切断配列を組み込むことで、Fc部分を簡単に除去できる。さらに、本
発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学的作製方法、ならびに薬物スクリー
ニング、診断および治療におけるそれらの使用に関する。また本発明の更なる態
様は、このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。融合
タンパク質技術の例は、国際特許出願 WO94/29458 およびWO94/22914に記載され
ている。
【０１００】 本明細書に示したポリヌクレオチド配列のそれぞれは、抗菌性化合物の発見お
よび開発に使用することができる。コード化タンパク質は発現の際に、抗菌薬の
スクリーニングの標的として使用されうる。それに加えて、それぞれのmRNAのコ
ード化タンパク質またはシャイン・ダルガルノもしくはその他の翻訳促進配列の
アミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド配列を使用して、アンチセンス配
列を構築し、目的のコード化配列の発現を制御することができる。
【０１０１】 また本発明は、病原体（１種または複数種）と、感染の続発症の原因となる真
核生物（好ましくは哺乳動物）宿主との間の最初の物理的相互作用を妨害するた
めの、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニ
ストの使用を提供する。特に、本発明の分子を使用して、細菌（特にグラム陽性
菌および／またはグラム陰性菌）の、留置デバイス上の真核生物（好ましくは哺
乳動物）細胞外マトリックスタンパク質または創傷内の細胞外マトリックスタン
パク質への付着を妨害すること、真核生物（好ましくは哺乳動物）の細胞外マト
リックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性BASB027タンパク質との間の細
菌性付着をブロックすること、および／または、留置デバイスの移植またはその
他の外科的手法以外により開始される感染症の病理発生の正常進行をブロックす
ること、ができる。
【０１０２】 更に本発明の他の態様により、BASB027アゴニストおよびアンタゴニスト、好
ましくは静菌性または殺菌性のアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。
【０１０３】 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを使用して、例えば、疾病を予防し
、阻害し、および／または治療しうる。
【０１０４】 更なる態様において本発明は、本発明のポリペプチドのミモトープ（mimotope
）に関する。ミモトープは、天然ペプチドと（配列的または構造的に）十分に類
似しているペプチド配列であり、該天然ペプチドを認識する抗体により認識され
得るか、あるいは適切な担体に結合した場合に該天然ペプチドを認識する抗体を
生じさせることができる。
【０１０５】 ペプチドミモトープは、特定の目的のために、選択されたアミノ酸の付加、欠
失または置換によって設計することができる。従って、該ペプチドは、タンパク
質担体への結合を容易にするために改変しても良い。例えば、いくつかの化学結
合法については、末端システインを含有させることが好ましい。更に、タンパク
質担体に結合させたペプチドについては、該ペプチドの結合末端から遠い位置に
疎水性末端を含有させて、該ペプチドの非結合末端が担体タンパク質の表面に結
合したままにすることが好ましい。それにより、インタクトな天然分子の場合に
みられるようなペプチドのコンホメーションと最も近似しているコンホメーショ
ンで該ペプチドを提示する。例えば、該ペプチドは、N末端システインおよびC末
端疎水性アミド化テールを含有するように改変しうる。あるいは、1以上のアミ
ノ酸のD立体異性体の付加または置換を行うことにより、例えば該ペプチドの安
定性を向上させる、有益な誘導体を作製しうる。
【０１０６】 あるいは、ファージディスプレイ法（EP 0 552 267 B1）などの技法を利用し
て、それ自体が本発明のポリペプチドに結合する能力のある抗体を用いてペプチ
ドミモトープを同定することができる。この方法により、天然ペプチドの構造を
模擬した多数のペプチド配列が生成され、またそれゆえ該配列は、抗天然ペプチ
ド抗体に結合する能力を有するが、該配列自体が該天然ポリペプチドと有意な配
列相同性を共有する必要はない。
【０１０７】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物、好ましくはヒトにおいて免疫学的
応答を誘導する方法に関するものであり、この方法は、抗体および／またはT細
胞免疫応答を生じさせて該個体を感染、具体的には細菌感染、最も具体的にはモ
ラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)感染から防御するのに十分なB
ASB027ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドまたはその断片もしくは変
異体を該個体に接種することを含んでなる。また、そのような免疫学的応答によ
って細菌複製を遅延させる方法も提供する。本発明のさらに別の態様は、個体に
おいて免疫学的応答を誘導する方法であって、BASB027ポリヌクレオチドおよび
／またはポリペプチド、またはその断片もしくは変異体をin vivo発現させるた
めにBASB027ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドまたはその断片もし
くは変異体の発現を指令する核酸ベクター、配列またはリボザイムを該個体に送
達することにより、免疫学的応答を誘導して(例えば、抗体および／またはT細胞
免疫応答(例えばサイトカイン産生T細胞または細胞傷害性T細胞を含む)を生じさ
せて)該個体、好ましくはヒトを疾病から防御する(この疾病がすでに該個体にお
いて確立されていようがいまいが防御する)ことを含んでなる方法に関する。遺
伝子投与は、例えば、遺伝子を粒子またはその他のものにコーティングしてそれ
を所望の細胞に高速で射入することにより行われる。そのような核酸ベクターは
、DNA、RNA、リボザイム、改変型核酸、DNA/RNAハイブリッド、DNA-タンパク質
複合体またはRNA-タンパク質複合体を含み得る。
【０１０８】 本発明のさらなる態様は、免疫学的応答を誘導する能力を有している個体、好
ましくはヒトに導入した場合に、そのような個体においてBASB027ポリヌクレオ
チドおよび／または該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対し
て免疫学的応答を誘導する免疫学的組成物に関するものであり、該組成物は、組
換えBASB027ポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチドを含むか、および／または本発明の該BASB027ポリヌクレオ
チド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、またはその他のポ
リペプチドの抗原をコードし、発現するDNAおよび／またはRNAを含む。この免疫
学的応答は、治療または予防に使用し得るものであり、抗体免疫および／または
細胞性免疫、例えばCTLもしくはCD4+T細胞から生ずる細胞性免疫のような形態を
とり得る。
【０１０９】 BASB027ポリペプチドまたはその断片は、協同タンパク質(co-protein)または
化学成分(それ自体抗体を産生してもしなくてもよいが、第1のタンパク質を安定
化させ、抗原性および／または免疫原性、好ましくは防御特性を有する融合タン
パク質または改変タンパク質を産生させ得る)と融合してもよい。したがって、
融合組換えタンパク質は、好ましくは、抗原性協同タンパク質(例えば、インフ
ルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のリポタンパク質D、グルタチオン-S-
トランスフェラーゼ(GST)もしくはβ-ガラクトシダーゼ)、またはタンパク質を
可溶化して、その産生および精製を容易にする任意のその他の比較的大きい協同
タンパク質をさらに含む。さらに、協同タンパク質は、該タンパク質を投与され
る生物の免疫系に全身性刺激(generalized stimulation)をもたらすという意味
でアジュバントとして作用し得る。協同タンパク質は、第1のタンパク質のアミ
ノ末端またはカルボキシ末端に結合され得る。
【０１１０】 本発明は、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドならびに免
疫刺激性DNA配列(例えば、Sato, Yら, Science 273:352(1996)に記載されている
ものなど)を含む組成物、特にワクチン組成物、ならびに方法を提供する。
【０１１１】 また、本発明は、細菌細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることが分
かっている既知のポリヌクレオチドまたはその特定の断片を、モラクセラ・カタ
ラーリス(Moraxella catarrhalis)に感染した動物モデルでのそのような遺伝子
による免疫感作実験に用いられるポリヌクレオチド構築物において使用する方法
も提供する。そのような実験は、予防または治療的免疫応答を生起させ得るタン
パク質エピトープを同定するのに特に有用である。この手法により、その後、哺
乳動物、特にヒトにおける細菌感染、特にモラクセラ・カタラーリス(Moraxella
catarrhalis)感染の予防剤または治療的処置の開発のために、感染しないこと
または感染を除去することに成功している動物の必須の器官に由来する特定価の
モノクローナル抗体の調製が可能になると考えられる。
【０１１２】 また本発明は、本発明の免疫原性組換えポリペプチドおよび／またはポリヌク
レオチドならびに製薬上許容される担体などの適当な担体を含むワクチン製剤も
提供する。このポリペプチドおよびポリヌクレオチドは胃の中で分解される可能
性があるので、どちらも非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内
注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝剤、静菌性化合物およびこの製剤を受容者の体液、好ましくは血液
と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤ま
たは増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１
回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供する
ことができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状
態で保管することもできる。
【０１１３】 また、本発明のワクチン製剤は該製剤の免疫原性を増強するためのアジュバン
ト系を含んでいてもよい。好ましくは、前記アジュバント系は優先的にTH1型の
応答を生じさせる。
【０１１４】 免疫応答は極端な２つのカテゴリー(体液性または細胞媒介性免疫応答[慣例で
は、それぞれ抗体による、および細胞エフェクターによる防御機構によって特徴
付けられている])に大まかに区別することができる。これらの応答カテゴリーは
、TH1型応答(細胞媒介性応答)およびTH2型免疫応答(体液性応答)と呼ばれている
。
【０１１５】 極端なTH1型免疫応答は、抗原特異的でハプロタイプ拘束性細胞傷害性Ｔリン
パ球の生成およびナチュラルキラー細胞の応答により特徴付けられる。マウスで
はTH1型応答はIgG2aサブタイプの抗体の生成により特徴付けられることが多いが
、ヒトではこれらはIgG1型抗体に相当する。TH2型免疫応答はマウスIgG1、IgAお
よびIgMを含む広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成により特徴付けられ
る。
【０１１６】 これらの２タイプの免疫応答の発生を陰で駆動している力はサイトカインであ
ると考えられる。高濃度のTH1型サイトカインは所与の抗原に対して細胞媒介性
免疫応答を好んで誘導する傾向があるが、高濃度のTH2型サイトカインは前記抗
原に対して体液性免疫応答を好んで誘導する傾向がある。
【０１１７】 TH1およびTH2型免疫応答の区別は絶対的なものではない。実際、ある人は、主
にTH1であるとか、主にTH2であると記載されるような免疫応答を支持している。
しかしながら、多くの場合、MosmannおよびCoffmanによりマウスCD4+veＴ細胞ク
ローンについて記載された内容(Mosmann,T.R.およびCoffmann,R.L. (1989) TH1
and TH2 cells:differnt patterns of lymphokine secretion lead to differen
t functional properties. Annual Review of Immnology, 7, p145-173)から、
サイトカインのファミリーを考慮するのが都合がよい。慣例上、TH1型応答はＴ
リンパ球によるINF-γおよびIL-2サイトカイン産生と関連している。TH1型免疫
応答の誘導に直接関わることの多い他のサイトカインは、IL-12等のＴ細胞によ
っては産生されない。対照的に、TH2型応答はIL-4、IL-5、IL-6およびIL-13の分
泌に関連している。
【０１１８】 特定のワクチンアジュバントがTH1またはTH2型のいずれかのサイトカイン応答
の刺激にとりわけ適していることが知られている。慣例上、ワクチン接種または
感染後の免疫応答におけるTH1：TH2平衡の最良の指標としては、抗原再刺激後の
in vitroでのＴリンパ球によるTH1もしくはTH2サイトカイン産生の直接測定、お
よび／または抗原特異的抗体応答のIgG1：IgG2a比の測定が挙げられる。
【０１１９】 従って、TH1型アジュバントは、抗原によりin vitroで再刺激された際に優先
的に単離されたＴ細胞集団を刺激して高濃度のTH1型サイトカインを産生し、CD8
+細胞傷害性Ｔリンパ球の発生およびTH1型アイソタイプに関連した抗原特異的免
疫グロブリン応答を促進するものである。
【０１２０】 TH1細胞応答を優先的に刺激し得るアジュバントは、国際特許出願番号WO94/00
153およびWO95/17209に記載されている。
【０１２１】 3De-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）はそうしたアジュバントの
１つである。これはGB2220211(Ribi)により知られている。化学的には、該アジ
ュバントは3De-O-アシル化モノホスホリルリピドAと4、5、6本のアシル化された
鎖との混合物であり、Ribi Immunochem. Montanaにより製造される。3De-O-アシ
ル化モノホスホリルリピドAの好ましい形態は、欧州特許第0 689 454 B1号(Smit
hKline Beecham Biologicals SA)に開示されている。
【０１２２】 好ましくは、3D-MPLの粒子は、0.22ミクロンの膜を通り抜けて滅菌ろ過される
のに十分な程度小さい(欧州特許第0 689 454 号)。3D-MPLは投与量あたり10μg
〜100μg、好ましくは25〜50μgの範囲で存在する。この場合、抗原は通常投与
量あたり2〜50μgの範囲で存在する。
【０１２３】 別の好ましいアジュバントは、QS21(Quillaja Saponaria Molinaの樹皮から得
た、Hplc精製した毒性の無い画分)を含む。任意でこれを3De-O-アシル化モノホ
スホリルリピドA（3D-MPL）と、場合により担体と共に混合することもできる。
【０１２４】 QS21の製造方法は米国特許第5,057,540号に開示されている。
【０１２５】 QS21を含有する反応性の無いアジュバント製剤は以前に記載されている(WO96/
33739)。QS21およびコレステロールを含むそうした製剤は、抗原と共に製剤する
場合には良好なTH1刺激性アジュバントであることが示されている。
【０１２６】 TH1細胞応答の優先的刺激物質である別のアジュバントとしては、免疫調節性
の(immunomodulatory)オリゴヌクレオチド、例えばWO96/02555に開示されている
非メチル化CpG配列が挙げられる。
【０１２７】 また、前述したもののような異なるTH1刺激アジュバントの組み合わせも、TH1
細胞応答の優先的な刺激物質であるアジュバントを提供する際に考慮される。例
えば、QS21を3D-MPLと共に製剤化することができる。通常、QS21:3D-MPL比は1:1
0〜10:1であり、好ましくは1:5〜5:1であり、多くの場合は実質的に1:1である。
最適な共働作用のために好ましい範囲は、2.5:1〜1:1の3D-MPL:QS21である。
【０１２８】 好ましくは、本発明のワクチン組成物中に担体も存在する。前記担体は水中油
型エマルジョンであっても、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム等の
アルミニウム塩であってもよい。
【０１２９】 好ましい水中油型エマルジョンは代謝可能な油、例えばスクアレン、α-トコ
フェロールおよびTween80を含む。特に好ましい態様では本発明のワクチン組成
物中の抗原をそのようなエマルジョン中でQS21および3D-MPLと組み合わせる。更
に、前記水中油型エマルジョンはスパン85および／またはレシチンおよび／また
はトリカプリリン(tricaprylin)を含んでいてもよい。
【０１３０】 通常、ヒトへの投与の場合は、QS21および3D-MPLは投与量あたり1〜200μgの
範囲内、例えば10〜100μg、好ましくは10〜50μgの範囲内でワクチン中に存在
する。通常、水中油型エマルジョンは、2〜10％のスクアレン、2〜10％のα-ト
コフェロールおよび0.3〜3％のTween80を含む。好ましくは、スクアレン：α-ト
コフェロール比は１以下であり、これによってより安定なエマルジョンが提供さ
れる。また、スパン85は１％という濃度で存在しうる。幾つかの場合、本発明の
ワクチンが更に安定化剤を含むことが有益であろう。
【０１３１】 毒性の無い水中油型エマルジョンは、好ましくは、毒性の無い油(例えばスク
アランもしくはスクアレン)、乳化剤(例えばTween80)を水性担体中に含む。前記
水性担体は、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水でありうる。
【０１３２】 水中油型エマルジョン中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に有効
なアジュバント製剤はWO95/17210に記載されている。
【０１３３】 また本発明は、本発明のワクチン製剤を他の抗原、特に癌、自己免疫疾患およ
び関連病態の治療に有用な抗原と組み合わせて含む多価ワクチン組成物を提供す
。そのような多価ワクチン組成物は前記のTH1誘導性アジュバントを含みうる。
【０１３４】 本発明は、特定のBASB027ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関して記載
されているが、本発明はその天然のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの断片
、ならびに組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドの免疫原性に実質的に影
響を及ぼさない付加、欠失または置換をもつ類似のポリペプチドおよびポリヌク
レオチドを含むものと理解されるべきである。
【０１３５】組成物、キットおよび投与 本発明のさらなる態様では、細胞または多細胞生物に投与するためのBASB027
ポリヌクレオチドおよび／またはBASB027ポリペプチドを含む組成物が提供され
る。
【０１３６】 また本発明は、本明細書で検討したポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チドまたはそのアゴニストまたはアンタゴニストを含む組成物にも関する。本発
明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、細胞、組織または生物に使用する
ために、非滅菌担体または滅菌担体(例えば個体への投与に適した製薬用担体な
ど)とともに用いてもよい。そのような組成物は、例えば、培地添加剤または治
療有効量の本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドならびに製薬
上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、限定するものでは
ないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられ得る。製剤は投与の様式に適合
させるべきである。本発明はさらに、本発明の上記組成物の1種以上の成分を充
填した容器を1以上含んでなる診断用および製剤用のパックおよびキットに関す
る。
【０１３７】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびその他の化合物は、単独で用
いてもよく、治療用化合物などのその他の化合物とともに用いてもよい。
【０１３８】 医薬組成物は、任意の有効で都合のよい様式、例えば、特に局所投与、経口投
与、肛門投与、膣内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻
腔内投与、または経皮経路での投与によって投与し得る。
【０１３９】 治療または予防において、活性剤は注射可能な組成物として、例えば無菌水性
分散液、好ましくは等張液として、個体に投与し得る。
【０１４０】 更なる態様においては、本発明は、治療に有効な量のポリペプチドおよび／ま
たはポリヌクレオチド（例えば可溶性形態の本発明のポリペプチドおよび／また
はポリヌクレオチド）、アゴニストペプチド/アンタゴニストペプチド、または
低分子化合物を、製薬上許容し得る担体または賦形剤と組み合わせて含む医薬組
成物を提供する。そのような担体には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキス
トロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれるが、
これらに限定されるものではない。本発明はさらに、前述の本発明の組成物の1
種以上の成分を充填した容器を1以上含んでなる医薬用パックおよびキットに関
するものである。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび他の化合物は
、単独で用いてもよく、または治療用化合物等の他の化合物と組み合わせて用い
てもよい。
【０１４１】 医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入（注射）、典型的には静注である。
皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の
手段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経
粘膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を
腸溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である
。これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲル、溶液、粉末などの剤形で局所に投与
しても、かつ／または局在化させてもよい。
【０１４２】 哺乳動物、特にヒトへの投与の場合、活性剤の日用量は0.01mg/kg〜10mg/kg、
典型的には約1mg/kgであると予想される。医師は、任意の状況において、個体に
最も適した実際の投与量(これは特定の個体の年齢、体重および応答により様々
である)を決定するであろう。上記の投与量は、平均的な場合の代表例である。
もちろん、より高いか低い投与量範囲にメリットがあるような場合もあり得る。
そのような場合も本発明の範囲に含まれる。
【０１４３】 必要な投与量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態の
性質、そして治療する医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の
体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。
【０１４４】 ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都合がよい。通常のアジュバン
トを用いることにより免疫応答を高めることができる。ワクチン接種に適した単
位投与量は、0.5〜5マイクログラム/kgの抗原であり、そのような投与量を１〜
３週間間隔で１〜３回投与するのが好ましい。前記の投与量範囲で本発明の化合
物を用いた場合、適当な個体への投与を不可能とするような有害な中毒作用は観
察されない。
【０１４５】 しかしながら、入手可能な化合物が多様であること、投与経路の効率が異なる
ことを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例
えば、経口投与は静注による投与よりも高い投与量を必要とすると予想されよう
。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的
経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１４６】配列データベース、有形媒体(tangible medium)における配列、およびアルゴリ
ズム ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、その2次元構造および3次元構
造を決定し、類似の相同性をもつ別の配列を同定する際の価値ある情報源を提供
する。これらの手法は、コンピュータ読み取り可能媒体中に配列を保存し、次い
で既知の巨大分子構造プログラムにおいて、またはGCGプログラムパッケージな
どの公知の検索ツールにより配列データベースを検索するためにその保存データ
を用いることで、最大限促進される。
【０１４７】 また、本発明は、文字配列または列、特に遺伝子配列またはコード化タンパク
質配列の解析方法も提供する。好ましい配列解析方法としては、例えば、同一性
および類似性解析などの配列相同性解析法、DNA、RNAおよびタンパク質構造解析
法、配列のアセンブリ方法、分岐解析法、配列モチーフ解析法、オープンリーデ
ィングフレーム決定法、核酸塩基呼出し(calling)法、コドン使用頻度解析法、
核酸塩基トリミング(trimming)法、および配列決定クロマトグラムピーク解析法
が挙げられる。
【０１４８】 相同性確認を行うためのコンピュータに基づく方法であって、コンピュータ読
み取り可能媒体中に本発明のポリヌクレオチドの配列を含む第1ポリヌクレオチ
ド配列を提供する工程、および該第1ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つの
第2のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を確認する工
程を含む上記方法を提供する。
【０１４９】 相同性確認を行うためのコンピュータに基づく方法であって、コンピュータ読
み取り可能媒体中に本発明のポリペプチドの配列を含む第1ポリペプチド配列を
提供する工程および該第1ポリペプチド配列を少なくとも１つの第2のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を確認する工程を含む上記方法
も提供される。
【０１５０】 限定するものではないが、特許および特許出願のような本明細書で引用した刊
行物および参考文献は、あたかも各刊行物または参考文献がそれぞれ本明細書に
参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に指摘されているように、その
全内容が参照により本明細書に組み込まれる。本出願が優先権を主張している任
意の特許出願も、刊行物および参考文献について上記したように、その全内容が
参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】定義 当技術分野で知られた「同一性」とは、場合によっては、ポリペプチド配列ま
たはポリヌクレオチド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の類
縁性のことである。当技術分野ではまた、「同一性」は、場合によっては、ポリ
ペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の鎖間の一致度(match)により決定さ
れた、このような配列間の配列類縁性の程度を意味する。「同一性」は公知の方
法により難なく算出することができ、こうした方法として、例えば Computation
al Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1
988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Acad
emic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,
Griffin, A.M. and Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequ
ence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987
; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton
Press, New York, 1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Appli
ed Math., 48: 1073 (1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同
一性を決定するための方法は、検討する配列間で最大級のマッチングが得られる
ように設計される。同一性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュータプロ
グラムに編集されている。２配列間の同一性を決定するためのコンピュータプロ
グラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージにおけるGAPプログラム(Devere
ux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡ
ＳＴＮ(Altschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)) ならびにＦ
ＡＳＴＡ(PearsonおよびLipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448(19
88)があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴプログラムファミリーはＮＣＢＩ
および他のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.ら,
NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-
410 (1990))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用するこ
とができる。
【０１５２】 ポリペプチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む： アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：８ ギャップ長ペナルティー：２ これらのパラメーターを用いて有効なプログラムは Genetics Computer Group
（Madison WI）から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記の
パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default paramet
er) である（末端ギャップのペナルティーは無し）。
【０１５３】 ポリヌクレオチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む： アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターを用いて有用であるプログラムは Genetics Computer G
roup(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして公に入手可能である。これら
は核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【０１５４】 ポリヌクレオチドとポリペプチドについての「同一性」の好ましい意味は、場
合によっては、下記の(1)および(2)に示される。
【０１５５】 (1) ポリヌクレオチドの実施形態は、配列番号１の基準配列に対して少なくと
も50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレオ
チド配列を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。ここで、該ポリヌク
レオチド配列は、配列番号１の基準配列と同一であるか、または該基準配列に対
して、一定の整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。そのような変
異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトラン
スバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準
ヌクレオチド配列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のど
こに存在してもよく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列
内に１以上の連続するグループとして散在する。そのようなヌクレオチド変異の
数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に、同一性％を示す整数を100で割った
値を掛け、次いでその積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことに
より、すなわち、次式： ｎｎ ≦ｘｎ −（ｘｎ・ｙ） により求めることができる。式中、ｎｎはヌクレオチド変異の数であり、ｘｎは
配列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは50％については0.50、60％につい
ては0.60、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90
％については0.90、95％については0.95、97％については0.97または100％につ
いては1.00であり、・は掛算演算子の記号であり、さらにｘｎとｙの非整数の積
は、その積をｘｎから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号２の
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列にナ
ンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、それにより、
こうした変異後に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変さ
せることができる。
【０１５６】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１の基準配列と同一で
ある、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有し得るか、または同一性％
が100％未満となるように該基準配列に対して一定の整数個までの核酸変異を含
んでいてもよい。そのような変異は少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トラン
ジションおよびトランスバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され
、こうした変異は基準ポリヌクレオチド配列の 5'もしくは 3'末端位置、または
これらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中の核酸の間に個々に
、または基準配列内に１以上の連続するグループとして散在する。所定の同一性
％についての核酸変異の数は、配列番号１の核酸の総数に、同一性％値を示す整
数を100で割った値を掛け、次いでその積を配列番号１の核酸の総数から差し引
くことにより、すなわち、次式： ｎｎ ≦ｘｎ −（ｘｎ・ｙ） により求めることができる。式中、ｎｎは核酸変異の数であり、ｘｎは配列番号
１の核酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、
85％については0.85などであり、・は掛算演算子の記号であり、さらにｘｎとｙ
の非整数の積は、その積をｘｎから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
【０１５７】 (2) ポリペプチドの実施形態は、配列番号２のポリペプチド基準配列に対して
少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリ
ペプチドを含む単離されたポリペプチドをさらに含む。ここで、該ポリペプチド
配列は、配列番号２の基準配列と同一であるか、または該基準配列に対して、一
定の整数個までのアミノ酸変異を含んでいてもよい。そのような変異は少なくと
も１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的置換を含む）または挿入
よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノまたは
カルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基
準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグルー
プとして散在する。そのようなアミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総
数に、同一性％を示す整数を100で割った値を掛け、次いでその積を配列番号２
のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎa ≦ｘa −（ｘa・ｙ） により求めることができる。式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番
号２のアミノ酸の総数であり、ｙは50％については0.50、60％については0.60、
70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％について
は0.90、95％については0.95、97％については0.97または100％については1.00
であり、・は掛算演算子の記号であり、さらにｘaとｙの非整数の積は、その積
をｘaから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
【０１５８】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号２の基準配列と同一で
ある、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有し得るか、または同一性％
が100％未満となるように該基準配列に対して一定の整数個までのアミノ酸変異
を含んでいてもよい。そのような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換
（保存的および非保存的置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、こう
した変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、または
これらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個
々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして散在する。所定の同
一性％についてのアミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、同一性
％値を示す整数を100で割った値を掛け、次いでその積を配列番号２のアミノ酸
の総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎa ≦ｘa −（ｘa・ｙ） により求めることができる。式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番
号２のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％については
0.80、85％については0.85などであり、・は掛算演算子の記号であり、さらにｘ a とｙの非整数の積は、その積をｘaから引く前に、最も近似する整数に切り下げ
る。
【０１５９】 「個体」は、本明細書で生物に関して用いられる場合、多細胞真核生物、例え
ば限定するものではないが、後生動物、哺乳動物、ヒツジ(ovid)、ウシ(bovid)
、サル(simian)、霊長類、ヒトなどを意味する。
【０１６０】 「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味し、すなわち「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば
、それはそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方で
ある。例えば、生存している生物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質か
ら分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられる
ように、「単離された」ものである。さらに、形質転換、遺伝子操作または任意
のその他の組換え法により生物に導入されるポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、該生物（生物は生きていても生きていなくてもよい）中に存在していると
しても「単離された」ものである。
【０１６１】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを指し、これは一本鎖および二本鎖の領域を含む、修飾
されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡで
あり得る。
【０１６２】 「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。
典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列
の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくても
よい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および末端切断（トランケ
ーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプチド
とアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体
の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような相違に限ら
れる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以上の置換、欠失、付
加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基
は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子変異体のように天然に存在する
ものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法ま
たは直接合成により作製することができる。
【０１６３】 「疾患」は、細菌による感染によって引き起こされるか、該感染に関連した任
意の疾病を意味する。そのような疾患としては例えば、乳児および小児における
中耳炎、高齢者における肺炎、副鼻腔炎、院内感染および侵襲性疾患、聴覚障害
、耳内の体液蓄積、聴覚神経損傷、言語学習遅発、上気道の感染および中耳の炎
症を伴う慢性中耳炎、が挙げられる。
【０１６４】実施例 下記の実施例は、特に詳細に記載した場合を除き、当業者によく知られた常用
の標準的方法により行った。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明
を限定するものではない。
【０１６５】実施例１： モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)株ATCC 43617
由来のBASB027遺伝子の発見およびDNA配列決定による確認 配列番号１のBASB027遺伝子を、モラクセラ・カタラーリス株ATCC 43617（Mc2
931株とも称される）の配列決定未終了のゲノムDNA配列を含むIncyte PathoSeq
データベースで初めて発見した。配列番号２に示した、BASB027ポリヌクレオチ
ド配列の翻訳は、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)のOMP85外膜タンパク質と
有意な類似性(817個のアミノ酸オーバーラップにおいて32％の同一性)を示した
。
【０１６６】 さらにBASB027遺伝子の配列を実験的に確認した。この目的のために、QIAGEN
ゲノムDNA抽出キット(Qiagen Gmbh)を用いてゲノムDNAをM.カタラーリス(M.cata
rrhalis)細胞(ATCC 43617株)1010細胞から抽出し、その１μgをプライマーE5155
15(5'-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TG-3')(配列番号5)およびE515528:(5'-CCT-GCG-TTT
-GTT-TGA-TTG-AG-3')(配列番号6)を用いるポリメラーゼ連鎖反応DNA増幅に供し
た。このPCR産物をBiorobot 9600(Qiagen Gmbh)装置で精製し、Big Dye Cycle S
equencingキット(Perkin-Elmer)およびABI 377/PRISM DNAシーケンサーを用いて
DNA配列決定した。DNA配列決定は両方の鎖に関して２回重複して行い、完全長配
列をDNASTAR LasergeneソフトウェアパッケージのSeqManプログラムを用いて組
み立てた。得られたDNA配列および推定ポリペプチド配列をそれぞれ配列番号３
および配列番号４として示す。４つのヌクレオチドが異なることより、配列番号
３は配列番号１と区別される。DNASTAR LasergeneソフトウェアパッケージのMEG
ALIGNプログラムを用いて、配列番号１と３のポリヌクレオチド配列のアライメ
ントを実施し、これを図２に示す。これらの配列の同一性のレベルは99.8%と計
算された。同一のプログラムを用いて、配列番号２と４のポリペプチド配列のア
ライメントを実施し、これを図3に示す。これらの配列の同一性のレベルは、99.
8％と計算された。
【０１６７】実施例２： 数種のモラクセラ・カタラーリス株間のBASB027遺伝子の多様性解
析 2A： 制限断片長解析（RFLP） ゲノムDNAは16のM.カタラーリス株（表１に示す）から以下に記載のように抽
出した。M.カタラーリスをBHI寒天プレート上の単一コロニーに対してストリー
クし、37℃で一晩培養させた。３または４個の単一コロニーを拾って、それを用
いて約1.5mlのBHI(脳-心臓浸出物)ブロス接種培養液に接種し、振とう培養機に
て37℃、約300rpmで一晩培養した。約150mlのBHIブロスを入れた500mlエーレン
マイヤーフラスコにその接種培養液を接種し、振とう培養機にて37℃、約175rpm
で12〜16時間培養して、DNA単離用の菌体量を生じさせた。細胞は、室温にて15
分間、Sorvall GSAローターで約2000×gで遠心分離することによって回収した。
上清を除き、細胞ペレットを約5.0mlの無菌水に懸濁した。等量の溶解バッファ
ー(200mM NaCl, 20mM EDTA, 40mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5%(w/v) SDS, 0.5%(v/v
) 2-メルカプトエタノール, および250μg/mlのプロテイナーゼK)を加え、穏や
かに攪拌し破砕することにより、細胞を懸濁させた。次いでその細胞懸濁液を50
℃で約12時間インキュベートして細菌を溶菌させ、染色体DNAを放出させた。飽
和NaCl（約6.0M、無菌水中）5.0mlを加え、室温にてSorvall SS34ローターで約5
,500×gで遠心分離することによって、タンパク質材料を沈殿させた。清澄化さ
れた上清から、２容量の100％エタノールを加えることによって染色体DNAを沈殿
させた。凝集したDNAを回収し、少量の70％エタノール溶液中で穏やかに攪拌し
て洗浄した。精製された染色体DNAを無菌水に懸濁し、４℃で一晩、穏やかに振
動させることにより溶解／分散させた。溶解したDNAの濃度は、分光測定により
、吸光係数を1.0 O.D.単位で約50μg/mlとして、260nmにて測定した。
【０１６８】 この物質を次にPCR増幅させた。この際、MC-D15-BamF(5'-AAG GGC CCA ATT AC
G CAG AGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C-3') （配
列番号７）オリゴヌクレオチドおよびMC-D15-SaIRC (AAG GGC CCA ATT ACG CAG
AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G-3')（
配列番号８）オリゴヌクレオチドを使用した。次いで対応するBASB027遺伝子の
アンプリコンを制限酵素（AciI、HindIII、MaeIII、NlaIII、RsaI、Sau3AI）を
用いて独立して加水分解し、制限産物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分離した。ここでは、「Molecular Cloning, a Laboratory
Manual,第２版,編者：Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Pre
ss 1989」に記載されているような、標準的な分子生物学的手法を用いた。得ら
れた電気泳動ゲルの写真を図１に示す。各株について、６つの制限酵素に対応す
るRFLPパターンを得点化し、組合せた。次いで同一のRFLPパターンの組合せを共
有する株のグループを定義した。この方法論により、本研究で調べた株は４つの
ゲノムグループに分類される（Group 1: Mc2906, Mc 2908, Mc2912, Mc2926; Gr
oup 2:Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2911, Mc2913, Mc2960, Mc2975; Group 3: M
c2910, Mc2912, Mc2956, Mc2969; Group 4: Mc2931）。これらのデータは、本研
究に用いられたモラクセラ・カタラーリス母集団がBASB027遺伝子に関していく
つかのヌクレオチド配列の多様性を示すことを裏付けるものである。
【０１６９】
【表１】 表１：本研究で使用したモラクセラ・カタラーリス株の特徴
【０１７０】実施例３： 組換えBASB027を発現するプラスミドの構築 A： BASB027のクローニング 順方向増幅プライマー（配列番号７）および逆方向相補的増幅プライマー（配
列番号８）各々の内に遺伝子工学的に作製されたBamHIおよびSalI制限部位によ
って、約2500bpのPCR産物を市販の大腸菌発現プラスミドpQE30(QiaGen、アンピ
シリン耐性)中に方向性クローニングすることができるようになり、成熟BASB027
タンパク質をそのN末端に(His)6アフィニティークロマトグラフィータグを含む
融合タンパク質として発現させることができた。BASB027のPCR産物を、メーカー
の説明書に従ってシリカゲルベースのスピンカラム(QiaGen)を使用して、増幅反
応液から精製した。クローニングに必要な必須BamHIおよびSalI末端を生成する
ために、精製したPCR産物を、メーカー(Life Technologies)が推奨する通りに制
限酵素BamHIおよびSalIを用いて連続的に完全消化した。第１の制限消化に続い
て、PCR産物を上記のようにスピンカラムを通して精製して塩を除去し、第２の
酵素消化の前に無菌水中に溶出させた。消化したDNA断片は、pQE30プラスミドと
のライゲーションの前に、再びシリカゲルベースのスピンカラムを用いて精製し
た。
【０１７１】B： 発現ベクターの生産 発現プラスミドpQE30をライゲーション用に調製するために、該プラスミドを
、BamHIおよびSalIの両方で同様に完全消化し、次いでセルフライゲーションを
防ぐためにメーカーの指示する通りウシ腸管ホスファターゼ（CIP、5’末端1pmo
l当り約0.02単位、Life Technologies）で処理した。調製ベクターに対して、消
化した断片を約５倍のモル過剰で使用して、ライゲーション反応液を設定した。
標準的な約20μlのライゲーション反応（約16℃、約16時間）は、当技術分野で
周知の方法を用いて、T4 DNAリガーゼ（約2.0単位/反応、Life Technologies）
を使用して行った。このライゲーションのアリコート（約５μl）を使用して、
当技術分野で周知の方法に従ってエレクトロコンピテントM15(pREP4)細胞を形質
転換した。約1.0mlのLBブロス中、37℃で約２〜３時間の増殖時間に続いて、形
質転換した細胞をカナマイシン(50μg/ml)およびアンピシリン(100μg/ml)を含
むLB寒天プレート上に播いた。全ての形質転換細胞が、pQE30上のタンパク質のI
PTG誘導性発現に対する発現抑制に必要とされるlacIq遺伝子を保持するpREP4プ
ラスミド(KnR)と、pQE30-BASB027プラスミド(ApR)の両方を保有することを確実
にするため、選択培地中に両方の抗生物質を含ませた。プレートを37℃で約16時
間、一晩培養した。個々のKnR/ApRコロニーを滅菌済つまようじで拾い、それを
用いて新鮮なLB KnR/ApRプレートに「パッチ」接種し、また同様に約1.0mlのLB
KnR/AnRブロス培養液に接種した。パッチプレートおよびブロス培養液を両方と
も、標準的なインキュベーター（プレートの場合）または振とうさせたウォータ
ーバス中で、37℃にて一晩培養した。
【０１７２】 全細胞に基づくPCR解析を用いて、形質転換体がBASB027 DNAインサートを含む
ことを確認した。ここで、約1.0mlのLB Kn/Apブロス一晩培養液を1.5mlポリプロ
ピレンチューブに移し、Beckmann微量遠心機中で遠心分離することにより（約３
分間、室温、約12,000×g）細胞を回収した。この細胞ペレットを約200μlの無
菌水に懸濁し、その約10μlアリコートを使用して、BASB027順方向および逆方向
増幅プライマーを含む最終容量約50μlのPCR反応液を設定した。PCR反応液の成
分の最終濃度は、Taqポリメラーゼ約5.0単位を使用したこと以外は、本質的には
実施例２で指定されたものと同じであった。初めの95℃の変性ステップを３分間
に増やして細菌細胞の熱破壊とプラスミドDNAの放出を確保した。ABI Model 970
0 サーマルサイクラーを使用し、32サイクル、３ステップの熱増幅プロファイル
（すなわち95℃, 45秒間、55〜58℃, 45秒間、72℃, １分間）によって、溶解し
た形質転換体試料由来のBASB027PCR 断片を増幅した。熱増幅に続き、該反応液
の約20μlアリコートをアガロースゲル電気泳動（Tris-アセテート-EDTA(TAE)バ
ッファー中、0.8% アガロース）により分析した。ゲル電気泳動およびエチジウ
ムブロマイド染色の後、DNA断片をUV照射により可視化した。DNA分子サイズ基準
（1kbラダー、Life Technologies）を被験試料と平行して電気泳動し、PCR産物
のサイズを見積もるのに用いた。約2500bpと予想されるPCR産物を生成する形質
転換体を、BASB027発現構築体を含有する株として同定した。次に発現プラスミ
ド含有株を組換えBASB027の誘導性発現について解析した。
【０１７３】C： PCR-陽性形質転換体の発現解析 上記で同定された各PCR-陽性形質転換体について、パッチプレートに由来する
細胞を、カナマイシン(50μg/ml)およびアンピシリン(100μg/ml)を含有する約5
.0mlのLBブロスに接種し、37℃で振とう（約250rpm）しながら一晩培養した。一
晩接種培養液（約1.0ml）のアリコートを、125mlエーレンマイヤーフラスコに入
れた約25mlのLB Kn/Apブロスに接種し、培養液の濁度がO.D.600値約0.5に達する
まで、すなわち中間対数期(mid-log phase)に達するまで（通常約1.5〜2.0時間
）、37℃で振とう（約250rpm）しながら増殖させた。この時点でその培養液のお
よそ半分（約12.5ml）を第２の125mlフラスコに移し、さらに最終濃度1.0mMにな
るようIPTG（無菌水中に調製した1.0Mストック、Sigma）を添加することにより
組換えBASB027タンパク質の発現を誘導した。IPTG誘導性培養液および非誘導性
培養液の両方を、さらに４時間、37℃で振とうしながら培養し続けた。誘導時間
後、誘導性培養液および非誘導性培養液の両方の試料（約1.0ml）を取り出し、
微量遠心機での室温にて約３分間の遠心分離によって細胞を回収した。それぞれ
の細胞ペレットを約50μlの無菌水に懸濁し、次いで2-メルカプトエタノールを
含有する等量の2×Laemelli SDS-PAGEサンプルバッファーと混合して、沸騰して
いるウォーターバス中に約３分間置いてタンパク質を変性させた。粗IPTG誘導性
細胞溶解物および粗非誘導性細胞溶解物の両方を等量ずつ（約15μl）、二重(du
plicate)12％Tris/グリシンポリアクリルアミドゲル（1mm厚 Mini-gels, Novex
）にロードした。誘導性および非誘導性溶解物サンプルを、標準SDS/Tris/グリ
シン泳動バッファー(BioRad)を使用し、慣用条件下で予め染色した分子量マーカ
ー(SeeBlue, Novex)と共に電気泳動した。電気泳動後、一方のゲルをクーマシー
ブリリアントブルーR250(BioRad)で染色することで、新規のBASB027 IPTG誘導性
タンパク質が可視化された。第２のゲルは、BioRad Mini-Protean II ブロッテ
ィング装置およびTowbinのメタノール(20％)トランスファーバッファーを使用し
て、PVDF膜（0.45ミクロン孔サイズ, Novex）上に、４℃にて約２時間かけてエ
レクトロブロットした。膜のブロッキングおよび抗体インキュベーションを、当
技術分野で周知の方法に従って実施した。モノクローナル抗RGS(His)3抗体、続
いてHRPに結合させた第２のウサギ抗マウス抗体(QiaGen)を用いて、BASB027組換
えタンパク質の発現および正体(identity)を確認した。抗His抗体の反応パター
ンを、ABT不溶性基質を用いるか、またはAmersham ECL 化学蛍光システムを用い
たHyperfilmを使用して、可視化することができた。
【０１７４】D： 配列確認 発現されているIPTG誘導性組換えBASB027タンパク質が正しいオープンリーデ
ィングフレームにあり、クローニングによる人為現象（すなわちフレームシフト
）から生じた偽の分子ではないことをさらに確認するために、クローン化された
インサートのDNA配列を決定した。M.カタラーリスのBASB027遺伝子のDNA配列は
、従来の非対称PCRサイクルシークエンス法(ABI Prism Dye-Terminator Cycle S
equencing, Perkin-Elmer)を用いて片方の鎖から得た。シークエンス反応液は、
鋳型として非消化発現プラスミドDNA（約0.5μg/rxn）、ならびに適切なpQE30ベ
クター特異的プライマーおよびORF特異的シークエンスプライマー（約3.5pmol/r
xn）を用いて設定した。鋳型とシークエンスプライマーに加えて、各シークエン
ス反応液（約20μl）には４種の異なるdNTP（すなわちA、G、C、およびT）なら
びに４種の対応するddNTP（すなわちddA、ddG、ddC、およびddT）終結因子ヌク
レオチドを含めた。各終結因子は、４種の蛍光色素Joe、Tam、Rox、およびFamの
うちの１つに結合させたものを使用した。一本鎖シークエンシング伸長産物は、
その色素標識したddNTP終結因子を取り込むことによって、鋳型に沿ったランダ
ムな部位で終結した。蛍光色素標識された終結産物を、微量遠心分離サイズ排除
クロマトグラフィーカラム(Princeton Genetics)を使用して精製し、真空下で乾
燥させ、キャピラリー電気泳動用のTemplate Resuspension Buffer(Perkin-Elme
r) またはPAGE用の脱イオン化ホルムアミドに懸濁して、95℃で約５分間変性し
、メーカーの推奨に従って高分解能キャピラリー電気泳動(ABI 310 Automated D
NA Sequenator, Perkin-Elmer)または高分解能PAGE(ABI 377 Automated DNA Seq
uenator)により分析した。個々の反応から生成されたDNA配列データを集め、相
対蛍光ピーク強度をABI Sequence Analysis Software(Perkin-Elmer)を用いてPo
werMACコンピュータ上で自動解析した。AutoAssemblerソフトウェア(Perkin-Elm
er)を用いて一本鎖コンセンサス配列「文字列(string)」に統合する前に、正確
を期して、個々に自動解析したDNA配列を手作業で編集した。配列決定により、
発現プラスミドが正しい配列を正しいオープンリーディングフレームで含むこと
を確定した。
【０１７５】実施例４： 組換えBASB027の生産 菌株 M.カタラーリス(M.catarrhalis)由来のBASB027をコードするプラスミド(pQE30
)を含有する大腸菌M15組換え体発現株(pREP4)を使用して、組換えタンパク質精
製用の細胞集団を生産した。この発現株を、50μg／mlのカナマイシン(「Kn」)お
よび100μg／mlのアンピシリン(「Ap」)を含有するLB寒天プレート上で培養し、pR
EP4 lacIq制御プラスミドとpQE30-BASB027発現構築物との両方が共に確実に保持
されるようにした。-80℃で凍結保存するために、この株を前記と同濃度の抗生
物質を含有するLBブロス中で増殖させて、その後30％(w/v)グリセロールを含有
する等量のLBブロスと混合した。
【０１７６】培地 組換えタンパク質生産のために使用した発酵培地は、50μg／mlのKnおよび100
μg／mlのApを含有する2X YTブロス(Difco)からなるものであった。消泡剤(Anti
foam204、Sigma)を発酵槽(fermentor)に対して0.25ml/Lの濃度で培地に添加した
。BASB027組換えタンパク質の発現を誘導するために、IPTG(イソプロピルβ-D-
チオガラクトピラノシド)を前記発酵槽に添加した(最終濃度1mM)。
【０１７７】発酵 50ml実施用量(working volume)を含有する500mlのエーレンマイヤー接種用フ
ラスコに、急速解凍した凍結培養物0.3mlまたは選択寒天プレート培養物から得
た数個のコロニーを接種し、150rpmで試料台を振とうしながら37±1℃にて約12
時間培養した(Innova2100、New Brunswick Scientific)。次に、この接種培養物
を用いて、2X YTブロスならびに抗生物質KnおよびApの両方を含む5L実使用量の
発酵槽に接種した。この発酵槽(Bioflo3000、New Brunswick Scientific)を、37
±1℃、0.2〜0.4 VVMの空中散布(air sparge)、Rushton攪拌翼による250rpmにて
、作動させた。フラスコ接種培養物中でも発酵槽中でも、pHは調整しなかった。
発酵中、前記発酵槽におけるpHは6.5から7.3に変化した。培養物が対数増殖中期
(O.D.600単位で約0.7)に達した時に、前記発酵槽にIPTG(滅菌水中で調製した1.0
Mストック)を添加した。細胞を、2〜4時間誘導した後、28RS Heraeus(Sepatech)
またはRC5C超高速遠心機(Sorvall Instruments)のいずれかを用いる遠心分離に
より回収した。細胞ペーストを、処理するまで-20℃で保存した。
【０１７８】精製 化学物質および材料 バイオテクノロジー等級またはそれ以上の等級のイミダゾール、塩酸グアニジ
ン、トリス(ヒドロキシメチル)、およびEDTA(エチレンジアミン四酢酸)は全てAm
eresco Chemical,Solon,Ohioから入手した。トリトンX-100(t-オクチルフェノキ
シポリエトキシ-エタノール)、リン酸ナトリウム(一塩基のもの(monobasic))、
および尿素は試薬等級またはそれ以上の等級であり、Sigma Chemical Company,S
t.Louis,Missouriから入手した。氷酢酸および塩酸はMallincrodt Baker Inc.,P
hillipsburg,New Jerseyから入手した。メタノールはFisher Scientific,Fairla
wn,New Jerseyから入手した。Pefabloc(登録商標)SC(4-(2-アミノエチル)-ベン
ゼンスルホニルフルオライド)、完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤(Co
mplete protease inhibitor cocktail tablet)、およびPMSF(フェニルメチル−
スルホニルフルオライド)はRoche Diagnostics Corporation,Indianapolis,Indi
anaから入手した。ベスタチン、ペプスタチンA、およびE-64プロテアーゼインヒ
ビターはCalbiochem,LaJolla,Californiaから入手した。ダルベッコリン酸緩衝
化生理食塩水(1×PBS)はQuality Biological,Inc.,Gaithersburg,Marylandから
入手した。ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水(10×PBS)はBio Whittaker,Walke
rsville,Marylandから入手した。BSAを含まないPenta-His抗体はQiaGen,Valenci
a,Californiaから入手した。ペルオキシダーゼ結合AffiniPureヤギ抗マウスIgG
はJackson Immuno Research,West Grove,Penn.から入手した。AEC単一溶液(AEC
single solution)はZymed,South San Francisco,Californiaから入手した。他の
全ての化学物質は試薬等級またはそれ以上の等級であった。
【０１７９】 Ni-NTA Superflow樹脂はQiaGen Inc.,Valencia,Californiaから入手した。既
製のトリス-グリシン4〜20％および10〜20％ポリアクリルアミドゲル、全ての泳
動用バッファーおよび溶液、SeeBlue Pre-Stained Standards、MultiMark Multi
-Colored StandardsならびにPVDFトランスファー膜はNovex,San Diego,Californ
iaから入手した。SDS-PAGE銀染色キットはDaiichi Pure Chemicals Company Lim
ited,Tokyo,Japanから入手した。クーマシー染色液はBio-Rad Laboratories,Her
cules,Californiaから入手した。Acrodisc(登録商標)PF 0.2μmシリンジフィル
ターはPall Gelman Sciences,Ann Arbor,Michiganから入手した。GD/X 25mm使い
捨てシリンジフィルターはWhatman Inc.,Clifton,New Jerseyから入手した。透
析チューブ8,000 MWCOはBioDesign Inc.Od New York,Carmal New Yorkから入手
した。BCAタンパク質アッセイ試薬およびSnake Skin透析チューブ3,500 MWCOはP
ierce Chemical Co.,Rockford,Illinoisから入手した。
【０１８０】抽出プロトコル 細胞ペーストを室温にて30〜60分かけて解凍し、5〜6gの材料を量りとって50m
lの使い捨て遠心チューブに入れた。これに5ml／gの塩酸グアニジン(Gu-HCl)バ
ッファー(6M 塩酸グアニジン、100mM リン酸ナトリウム(一塩基のもの)、10mM
トリスおよび0.05％のトリトンX-100、pH8.0)を加えた。細胞ペーストを、PRO30
0Dプロサイエンティフィックホモジナイザーを用いて１分間3/4パワーで再懸濁
した。次に、得られた抽出混合物を、穏やかに揺らしながら60〜90分室温にて放
置した。60〜90分後、前記抽出混合物を15,800×gで15分遠心した(Sorvall RC5C
遠心機、11,500rpm)。得られた上清(S1)をデカントし、更なる精製のためにとっ
ておいた。ペレット(P1)は解析用にとっておいた。
【０１８１】BASB027のニッケル-NTA樹脂への結合 前記S1に3〜4mlのNi-NTA樹脂を添加した。次に、これを穏やかに揺らしながら
１時間室温にて放置した。１時間後、S1/Ni-NTAをXK16ファルマシアカラムに詰
めた。次いでこのカラムを1M Gu-HClバッファー(1M 塩酸グアニジン、100mM リ
ン酸ナトリウム(一塩基のもの)、10mM トリスおよび0.05%トリトンX-100、pH8.0
)で洗浄した。これをさらにリン酸バッファー(100mM リン酸ナトリウム(一塩基
のもの)、10mM トリスおよび0.05%トリトンX-100、pH6.3)で洗浄した。その後、
250mM イミダゾールバッファー(250mM イミダゾール、100mM リン酸ナトリウム(
一塩基のもの)、10mM トリスおよび0.05%トリトンX-100、pH5.9)を用いて、前記
カラムからタンパク質を溶出させた。
【０１８２】最終生成物 0.1％トリトンX-100および1×PBS、pH7.4の３種の変更に対して一晩透析を行
い、残留するGu-HClおよびイミダゾールを除去することにより、BASB027を生成
した。この精製タンパク質を特性付けし、これを用いて以下に記載するように抗
体を製造した。
【０１８３】生化学的特徴付け SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析 組換え精製タンパク質を4〜20％ポリアクリルアミドゲル上で分解し、以前に
記載されたように(Thebaineら、1979, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)
、100Vで１時間電気泳動することによりPVDF膜に移した。次に、このPVDF膜を5
％の脱脂粉乳を含有する25mlのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水で前処理した
。その後の全てのインキュベーションは、この前処理バッファーを用いて行った
。
【０１８４】 PVDF膜を、免疫前血清またはウサギ抗His免疫血清の1:500希釈物25mlと共に室
温にて１時間インキュベートした。次に、PVDF膜を洗浄バッファー(20mM トリス
バッファー、pH7.5、150mM 塩化ナトリウムおよび0.05％Tween20を含む)で２回
洗浄した。PVDF膜をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoRese
arch Laboratories,West Grove,PA)の1:5000希釈物25mlと共に室温にて30分イン
キュベートした。次に、このPVDF膜を洗浄バッファーで４回洗浄し、Zymed(San
Francisco,CA)から供給された3-アミノ-9-エチルカルバゾールおよび過酸化尿素
を用いて各々10分間展開した。
【０１８５】 SDS-PAGEの結果(図４)は、このSDS-PAGEのウェスタンブロット(図５)により、
抗RGS(His)抗体に対して反応性である約95kDaのタンパク質を示す。
【０１８６】タンパク質の配列決定 モデル1090 LCを備えたHewlett-PackardモデルG1000Aシーケンサーおよびモデ
ル1100 LCを備えたHewlett-Packardモデル241シーケンサーに関して十分に定め
られた化学プロトコルを用いて前記精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列
を決定することにより、正しい組換えタンパク質が生産されたことを確認した。
【０１８７】実施例５： 組換えBASB027に対する抗血清の生産 ２羽のウサギに前記精製組換えBASB027タンパク質をワクチン接種することに
より、該BASB027タンパク質に対する多価抗血清を作製した。約20μg／注射のBA
SB027タンパク質をおよそ21日間隔で筋肉内注射(i.m.)(最初は完全フロイントア
ジュバントを使用し、次いで不完全フロイントアジュバントを使用する)するこ
とにより、各動物を全部で３回免疫した。最初の免疫前(「採血前(pre-bleed)」
)および35日目と57日目に動物から採血した。
【０１８８】 抗BASB027タンパク質の力価を、精製組換えBASB027タンパク質(0.5μg／ウェ
ル)を用いるELISAにより測定した。力価は、次の式： 抗血清の２つの試験サン
プルの平均OD − バッファーの２つの試験サンプルの平均OD、を用いて算出し
た場合に0.1以上となる最も高い希釈率であると定義した。
【０１８９】 抗血清を第１の抗体として使用し、上記実施例４で記載したようにして、ウェ
スタンブロット中の前記タンパク質を確認した。ウェスタンブロットにより、免
疫した動物の血清中の抗BASB027抗体の存在が示された（図６）。
【０１９０】実施例６： 免疫学的特徴付け ウェスタンブロット解析 M.カタラーリス(M.catarrhalis)の幾つかの菌株をチョコレート寒天プレート
上で5％CO2中35℃にて48時間増殖させた。数個のコロニーを使用して250mlフラ
スコ中のMuller Hintonブロス25mlに接種した。培養物を一晩増殖させて、遠心
分離により回収した。次に、150μlのPAGEサンプルバッファー(360mM トリスバ
ッファー、pH8.8、4％ドデシル硫酸ナトリウムと20％グリセロールを含有する)
中に30μgの細胞を懸濁し、この懸濁物を100℃にて５分インキュベートすること
により、該細胞を可溶化した。可溶化した細胞を4〜20％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分解し、分離されたタンパク質を、以前に記載されたように(Thebaineら
、1979, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)、100Vで１時間電気泳動するこ
とによりPVDF膜に移した。次に、このPVDF膜を5％の脱脂粉乳を含有する25mlの
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水で前処理した。その後の全てのインキュベー
ションは、この前処理バッファーを用いて行った。
【０１９１】 PVDF膜を、免疫前血清またはウサギ免疫血清の1:500希釈物25mlと共に室温に
て１時間インキュベートした。次に、PVDF膜を洗浄バッファー(20mM トリスバッ
ファー、pH7.5、150mM 塩化ナトリウムと0.05％Tween20を含む)で２回洗浄した
。PVDF膜をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Lab
oratories,West Grove,PA)の1:5000希釈物25mlと共に室温にて30分インキュベー
トした。次に、このPVDF膜を洗浄バッファーで４回洗浄し、Zymed(San Francisc
o,CA)から供給された3-アミノ-9-エチルカルバゾールおよび過酸化尿素を用いて
各々10分間展開した。
【０１９２】 抗血清に対して反応性を示す約95kDa(BSAB027の予想分子量に相当)のタンパク
質が全てのモラクセラ(Moraxella)株で検出された（図７）。
【０１９３】殺菌活性 抗BASB027抗体の補体媒介性細胞傷害性活性を試験して、BASB027ポリペプチド
のワクチンとしての潜在性を評価した。抗血清を上述のように調製した。M.カタ
ラーリス(M.catarrharis)の補体による死滅を媒介する際の、免疫前血清および
抗BASB027抗血清の活性を、Zollingerら(Immune Responses to Neisseria menin
gitis, in Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3rd ed., pg 347-349)
に記載の「血清殺菌試験（Serum Bactericidal Test）」を使用して試験した。
ただし、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）細胞のかわりにM.カタラーリス株ま
たは培養株の細胞を使用した。ウサギ抗血清の殺菌力価（相同株の50%を死滅）
は1：8未満（免疫前）および1：128より上（免疫）であった。
【０１９４】実施例７： 回復期のヒト血清におけるBASB027に対する抗体の存在 精製組換えBASB027のウェスタンブロット分析を、M.カタラーリス(M.catarrha
ris)に感染した子供から得たヒト血清のプールを第１抗体調製物として使用した
こと以外は上記実施例４および６に記載した通りに行った。結果から、自然状態
で感染した個体からの抗血清が前記精製組換え体と反応することがわかる。
【０１９５】実施例８： BASB027ペプチドの生産、抗血清およびその反応性 配列CYAKPLNKKQNDQTDT(配列番号9)およびYLTARRGQQTTLGEVVC(配列番号10)を有
する２つの短いアミノ酸BASB027特異的ペプチドを、一般によく知られた方法を
用いて実験室で生産した。KLHに結合させたこれらのペプチドを使用して、12週
齢のSPFニュージーランド雌ウサギ体内で抗体を産生させた。完全フロイントア
ジュバント中(１回目の注射)または不完全フロイントアジュバント中(２、３お
よび４回目の注射)の200μgのペプチド-KLHを、約3週間隔で４回ウサギに注射し
た。初回免疫前および４回目の免疫の１月後に動物から採血した。
【０１９６】 抗ペプチド中央力価(anti-peptide mid-point titres)を遊離ペプチドを用い
るELISAにて測定した。４回目の免疫から１月後の抗ペプチド中央力価は、15000
を上回っていた。精製組換えBASB027のウェスタンブロットは、第１抗体として
抗ペプチド抗体を用いて、実施例４および６に記載した通りに調製した。結果を
図８に示す。
【０１９７】寄託物 モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)カトリン(Catlin)株を含
む寄託物をAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)に1997年6月21日に寄
託し、寄託番号43617を得た。この寄託物は、カタル球菌(Branhamella catarrha
lis)(FroschおよびKolle)として記載され、慢性気管支炎を患っている炭坑夫の
経気管吸引液から得たM.カタラーリス分離株から構築した、凍結乾燥した1.5〜2
.9kbのインサートライブラリーである。この寄託物は、Antimicrob. Agents Che
mother. 21:506-508 (1982)に記載されている。
【０１９８】 該モラクセラ・カタラーリス株の寄託物は、本明細書では「寄託株」または「
寄託株のDNA」と称する。
【０１９９】 該寄託株は、完全長BASB027遺伝子を含む。
【０２００】 pMC-D15に挿入されたモラクセラ・カタラーリスDNAからなるベクターpMC-Hly3
の寄託物を、American Type Culture Collection（ATCC）に1999年2月12日に寄
託し、寄託受託番号207105を得た。
【０２０１】 万一本明細書の配列の記述と矛盾する場合、寄託株／クローンに含まれるポリ
ヌクレオチドの配列、ならびにそれによってコードされる任意のポリペプチドの
アミノ酸配列が優先される。
【０２０２】 寄託株の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約の条項に基いてなされたものである。この寄託株は、変更できず、特許発行
の際には無制限または無条件に一般に公開される。寄託株は、単に当業者の便宜
のために提供されるものであり、寄託が米国特許法第112条で要求されるような
実施可能要件を満たす上で必要であるということを承認するものではない。
【０２０３】
【０２０４】配列情報 BASB027ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 配列番号１ ATCC43617株に由来するモラクセラ・カタラーリスBASB027のポリヌクレオチド配
列 配列番号２ 配列番号１のポリヌクレオチド配列から推定されるモラクセラ・カタラーリスBA
SB027のポリペプチド配列 配列番号３ ATCC43617株由来のモラクセラ・カタラーリスBASB027のポリヌクレオチド配列 配列番号４ 配列番号３のポリヌクレオチド配列から推定されるモラクセラ・カタラーリスBA
SB027のポリペプチド配列 配列番号５ 配列番号６ 配列番号７ 配列番号８ 配列番号９ 配列番号１０
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 BASB027のRFLP解析において得られた電気泳動ゲルの写真。
【図２】 BASB027ポリヌクレオチド配列のアライメント。配列番号１と同一の塩基をド
ットで示す。
【図３】 BASB027ポリペプチド配列のアライメント。配列番号２と同一のアミノ酸をド
ットで示す。
【図４】 精製BASB027タンパク質についての、クーマシー染色したSDS-PAGE。
【図５】 精製BASB027タンパク質についての、tera-His抗体を用いたウェスタンブロッ
ト。
【図６】 対応する抗組換えタンパク質血清を用いた、精製BASB027タンパク質のウェス
タンブロット。パネルA：免疫前血清。パネルB：免疫血清。
【図７】 BASB027タンパク質に対してプールした血清を用いたM.カタラーリス16株の細
胞溶解物全体のウェスタンブロット（血清は1:2000に希釈）。
【図８】 対応する抗ペプチド血清を用いた、精製組換えBASB027のウェスタンブロット
（レーン２および３：非免疫血清、レーン１および４：免疫血清）。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月３１日（２０００．７．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２６】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドに対し
て誘導された少なくとも１種の抗体および適当な製薬学的担体を含む、髄膜炎菌
（Neisseria meningitidis）疾患に罹患したヒトの治療に有用な治療用組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月１日（２００１．５．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２６
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ０７Ｋ 14/21 Ｃ０７Ｋ 14/21 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 5/10 33/569 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA03 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B065 AA01X AA01Y AA57X AA87X AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 AA13 AA14 BA15 BB11 CC07 CC21 EE01 GG02 GG03 GG04 GG06 GG08 GG10 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 DA76 EA31

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミ
    ノ酸配列に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、
    単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 アミノ酸配列が配列番号２および配列番号４からなる群より
    選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項１に
    記載の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミ
    ノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 配列番号２または配列番号４のいずれかの単離されたポリペ
    プチド。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドの免疫原
    性断片であって、該免疫原性断片の免疫原活性が配列番号２または配列番号４の
    ポリペプチドのものと実質的に同一である、上記断片。
  6. 【請求項６】 配列番号２もしくは４のアミノ酸配列に対して、それぞれそ
    の配列番号２もしくは４の全長にわたって少なくとも85％の同一性を有するポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチ
    ド、またはその単離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
  7. 【請求項７】 配列番号２もしくは４のポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列に対して、そのコード領域全体にわたって少なくとも85％の同一性を有
    するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、またはその単
    離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
  8. 【請求項８】 配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列に対して、それぞ
    れその配列番号１もしくは３の全長にわたって少なくとも85％の同一性を有する
    ヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、またはその単離さ
    れたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】 同一性が配列番号１または３に対して少なくとも95％である
    、請求項６〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする
    ヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチドを含んで
    なる単離されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配
    列番号１もしくは配列番号３の配列またはその断片を有する標識プローブを用い
    て適当なライブラリーをスクリーニングすることによって得られる配列番号２ま
    たは配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単
    離されたポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 請求項６〜１２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌ
    クレオチドを含む、発現ベクターまたは組換え生存微生物。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞、または
    配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少
    なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチ
    ドを発現している該宿主細胞の細胞画分もしくは膜。
  15. 【請求項１５】 配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるア
    ミノ酸配列に対して少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる
    ポリペプチドの生産方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を該ポリペプチ
    ドを産生させるのに十分な条件下で培養し、その培養培地から該ポリペプチドを
    回収することを含んでなる、上記方法。
  16. 【請求項１６】 請求項６〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    の発現方法であって、宿主細胞を該ポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む発
    現ベクターで形質転換し、該宿主細胞を該ポリヌクレオチドのいずれか１つを発
    現させるのに十分な条件下で培養することを含む、上記発現方法。
  17. 【請求項１７】 有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチ
    ドおよび製薬上許容される担体を含むワクチン組成物。
  18. 【請求項１８】 有効量の請求項６〜１２のいずれか１項に記載のポリヌク
    レオチドおよび製薬上有効な担体を含むワクチン組成物。
  19. 【請求項１９】 少なくとも１種の他のモラクセラ・カタラーリス(Moraxel
    la catarrhalis)抗原を含む、請求項１７または１８に記載のワクチン組成物。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは
    免疫学的断片に対して免疫特異的な抗体。
  21. 【請求項２１】 モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)に感
    染した疑いのある動物由来の生物学的サンプル中に存在する、請求項１〜５のい
    ずれか１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドに対して免疫特異的な抗
    体を同定することを含む、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)
    感染の診断方法。
  22. 【請求項２２】 動物において免疫応答を生起させるのに使用する薬剤の調
    製における、免疫学的に有効な量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペ
    プチドを含む組成物の使用。
  23. 【請求項２３】 動物において免疫応答を生起させるのに使用する薬剤の調
    製における、免疫学的に有効な量の請求項６〜１２のいずれか１項に記載のポリ
    ヌクレオチドを含む組成物の使用。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドに対し
    て誘導された少なくとも１種の抗体および適当な製薬学的担体を含む、モラクセ
    ラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)感染症に罹患したヒトの治療に有用
    な治療用組成物。
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