BRPI0619795B1 - composição imunogênica, composição adjuvante, e, uso de uma composição imunogênica e um adjuvante - Google Patents

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Abstract

composição imunogênica, composição adjuvante, e, uso de um antígeno ou sua preparação antigênica e um adjuvante. a presente invenção fornece uma dose humana de uma composição imunogênica compreendendo um antígeno ou preparação antigênica, em combinação com um adjuvante, adjuvante este compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de quiliaja saponaria molina, apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, em que dita fração de saponina e dito lipopolissacarídeo estão ambos presentes em dita dose humana em um nível abaixo de 30 <109>g. a presente invenção fornece ainda uma composição adjuvante em um volume adequado para dose humana, compreendendo entre 1 e 30 <109>g de um lipopolissacarídeo e entre 1 e 30 <109>g de uma fração de saponina imunologicamente ativa, apresentada na forma de um lipossoma.

Description

“COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO ADJUVANTE, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E UM ADJUVANTE” CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a composições de vacina aperfeiçoadas, métodos para produzi-las e seu uso em medicina. Em particular, a invenção refere-se composições de vacina auxiliadas, em que o adjuvante é uma formulação lipossomal, compreendendo uma saponina e um lipossacarídeo. A presente invenção refere-se ainda a formulações de vacina de influenza e regimes de vacinação para imunizar contra doença influenza. ANTECEDENTES DA TÉCNICA
Novas composições o vacinas, com uma imunogenicidade aperfeiçoada, são sempre necessárias. Como uma estratégia, os adjuvantes têm sido usados para tentar aperfeiçoar a resposta imune suscitada para qualquer dado antígeno.
Os lipossacarídeos (LPS) são a principal molécula de superfície da folhinha externa da membrana externa de bactérias gramnegativas. Os LPS impedem a destruição das bactérias por complementos do soro e células fagocíticas e estão envolvidos na aderência para colonização. Os LPS são um grupo de moléculas complexas estruturalmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Daltons de tamanho e consistem de três regiões covalentemente ligadas:
(i) uma cadeia de polissacarídeos O-específica (antígeno-O) na região externa (ii) uma região central de oligossacarídeo de núcleo (iii) lipídeo A - a região mais interna que serve como a âncora hidrofóbica, compreende unidades dissacarídeas de glicosamina, que contêm ácidos graxos de cadeia longa.
As atividades biológicas dos LPS, tais como toxicidade letal,
Petição 870190032432, de 04/04/2019, pág. 6/120 .15 pirogenicidade e adjuvanticidade, têm sido mostradas ser relacionadas com o componente lipídeo A. Ao contrário, a imunogenicidade é associada com o componente polissacarídeo específico-0 (antígeno-O). Tanto o LPS como o lipídeo A têm sido há muito conhecidos por seus fortes efeitos adjuvantes, porém a elevada toxicidade destas moléculas tem impedido seu uso em formulações de vacina. Esforços significativos foram, portanto, feitos para reduzir a toxicidade dos LPS ou lipídeo A, enquanto mantendo-se sua adjuvanticidade.
O mutante Salmonella minesota R595 foi isolado em 1966 de uma cultura da cepa precursora (lisa) (Luderitz et al. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sei. 133: 349-374). As colônias selecionadas foram selecionadas por sua susceptibilidade à lise por um painel de fagos e somente essas colônias que exibiram uma estreita faixa de sensibilidade (susceptíveis a um ou dos fagos somente) foram selecionadas para mais estudo. Este esforço resultou no isolamento de uma cepa mutante profundamente rugoso que é defeituosa na biossíntese dos LPS e referida como S. minnesota R595.
Em comparação com outros LPS, aqueles produzidos pelo mutante S. minnesota R595 têm uma estrutura relativamente simples.
(i) eles não contêm região específica-O - uma característica que é responsável pela mudança do fenótipo liso tipo selvagem para o fenótipo rugoso mutante e resultam em perda de virulência (ii) a região de núcleo é muito curta - esta característica aumenta a susceptibilidade da cepa a uma variedade de produtos químicos (iii) o componente de lipídeo A é altamente acilado com até 7 ácidos graxos.
O 4’-monofosforil lipídeo A (MPL), que pode ser obtido pela hidrólise ácida do LPS extraído de uma cepa mutante de rugosidade intensa de bactérias gram-negativas, retém as propriedades adjuvantes dos LPS, enquanto demonstrando uma toxicidade que é reduzida por um fator de mais do que 1000 (conforme medido por dose letal em ovos embrionários de pinto) (Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl: S512-S516). Os LPS são tipicamente refluxados em soluções de ácido mineral de moderada concentração (p. ex., 0,1 M HC1) por um período de aproximadamente 30 minutos. Este processo resulta em desfosforilação na posição 1 e a descarboidração na posição 6’, produzindo MPL.
O monofosforil lipídeo A 3-O-acilado (3D-MPL), que pode ser obtido por hidrólise alcalina suave de MPL, tem uma toxicidade mais reduzida, enquanto novamente mantendo a adjuvanticidade; vide US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals). A hidrólise alcalina é tipicamente realizada em solvente orgânico, tal como uma mistura de clorofórmio/metanol, por saturação com uma solução aquosa de base fraca, tal como carbonato de sódio 0,5 M em pH 10,5.
Mais informação sobre a preparação de 3D-MPL é disponível, por exemplo, na US 4.912.094 e WO 02/078637 (Corixa Corporation).
As saponinas Quillaja são uma mistura de glicosídeos de triterpeno extraídos da casca da árvore Quillaja saponaria. As saponinas brutas foram extensamente empregadas como adjuvantes veterinários. Quil-A é um extrato aquoso parcialmente purificado do material da saponina Quillaja. QS21 é uma fração de Quil A não tóxica, purificada por HPLC e o método de sua produção é descrito (como QA21) na Patente U.S. No. 5.057.540.
Como exemplo, as vacinas de influenza e vacinas contra papiloma vírus humano (HPV) foram desenvolvidas com adjuvantes.
Os vírus influenza são um dos vírus mais ubíquos presentes no mundo, afetando tanto humanos como gado. A influenza resulta em uma carga econômica, morbidez e mesmo mortalidade, que são significativos.
O vírus influenza é um vírus envelopado em RNA, com um tamanho de partícula de cerca de 125 nm de diâmetro. Ele consiste basicamente de um nucleocapsídeo interno ou núcleo de ácido ribonucleico
(RNA) associado com nucleoproteína, circundado por um invólucro viral com uma estrutura de bicamada de lipídeo e glicoproteínas externas. A camada interna do invólucro viral é composta predominantemente de proteínas de matriz e a camada mais externa principalmente de material lipídico derivado de hospedeiro. O vírus influenza compreende dois antígenos de superfície, glicoproteínas neuraminidase (NA) e hemaglutinina (HA), que aparecem como picos, com o comprimento de 10 a 12 nm, na superfície das partículas. São estas proteínas de superfície, particularmente a hemaglutinina, que determinam a especificidade antigênica dos subtipos da influenza.
Estes antígenos de superfície progressivamente, às vezes respectivamente, sofrem algumas mudanças, resultando em variações antigênicas do influenza. Estas mudanças antigênicas, chamadas ‘desvios” e “transferências” são imprevisíveis e podem ter um impacto dramático de um ponto de vista imunológico, visto que elas eventualmente resultam na emergência de novas cepas de influenza, que possibilitam ao vírus escapar do sistema imune, desafiando as bem conhecidas, quase anuais, epidemias.
As cepas do vírus influenza, a serem incorporadas dentro da vacina de influenza cada estação, são determinadas pela World Health Organisation, em colaboração com as autoridades nacionais da saúde e fabricantes e vacinas.
O HA é o mais importante antígeno na definição da especificidade sorológica das diferentes cepas da influenza. Esta proteína de 75-80 kD contém numerosos determinantes antigênicos, diversos dos quais estão em regiões que sofrem mudanças de seqüência em diferentes cepas (determinantes específicos de cepa) e outras em regiões que são comuns a muitas moléculas de HA (comuns a determinantes).
O vírus influenza provoca epidemias quase todo inverno, com taxas de infecção para vírus tipo A ou B tão elevadas quanto 40%, durante um período de seis semanas. A infecção por influenza resulta em vários estados tf &
doentios, de uma infecção sub-clínica através de infecção respiratória superior suave a uma pneumonia viral severa. As epidemias de influenza causa aumentos na incidência de pneumonia e doença respiratória inferior, como testemunhado pelas aumentadas taxas de hospitalização ou mortalidade. A severidade da doença é principalmente determinada pela idade do hospedeiro, seu status imune e o sítio de infecção.
Pessoas idosas, com 65 anos ou mais, são especialmente vulneráveis, sendo responsáveis por 80 - 90% de todas as mortes relacionadas com a influenza em países desenvolvidos. Os indivíduos com doenças crônicas subjacentes são também muito prováveis de experimentar tais complicações. Infantes jovens também podem sofrer doença severa. Estes grupos em particular, portanto, precisa ser protegido. Além destes grupos‘sob-risco’, as autoridades de saúde estão também recomendando vacinar adultos saudáveis que estão em contato com pessoas idosas.
A vacinação representa um papel crítico no controle de epidemias de influenza anuais. As vacinas de influenza atualmente disponíveis são vacinas inativadas ou de influenza atenuado. As vacinas da influenza inativadas são compostas de três possíveis formas de preparação de antígeno: vírus integral inativado, subvirions em que partículas de vírus purificadas são rompidas com detergentes ou outros reagentes, para solubilizar o invólucro lipídico (chamada vacina “dividida”) ou HA e NA purificada (vacina subunitária). Estas vacinas inativadas são dadas intramuscularmente (i.m.) ou intranasalmene (i.n.).
As vacinas da influenza, de todas as espécies, são usualmente vacinas trivalentes. Elas geralmente contêm antígenos derivados de duas cepas do vírus influenza A e uma cepa de influenza B. Uma dose injetável de 0,5 ml, padrão, na maioria dos casos contém 15 pg de componente de antígeno da hemaglutinina de cada cepa, conforme medido por imunodifusão radial única (SRD) (J. M. Wood et al.: An improved single radial immunodifíusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., Intemational collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Influenza vaccines currently available are considered safe in all age groups (De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 30943101). Entretanto, há pouca evidência de que as atuais vacinas da influenza funcionam em crianças pequenas abaixo de dois anos de idade. Além disso, taxas informadas de eficácia de vacina para prevenção de doença de influenza confirmada típica são de 23 - 72% para o idoso, que são significativamente mais baixas do que taxas de eficácia de 60 - 90%, informadas para adultos mais jovens (Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoe., 21, 166 - 1665; Gross, 1995, Ann Intem. Med. 123, 523 - 527). A eficácia de uma vacina de influenza tem sido mostrada correlacionar-se com títulos de soro de anticorpos de inibição da hemaglutinação (HI) para a cepa viral e diversos estudos descobriram que adultos mais idosos exibem mais baixos títulos de HI após imunização de influenza do que adultos mais jovens (Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427 - 439).
Novas vacinas com uma melhorada imunogenicidade são, portanto, ainda necessárias. A formulação do antígeno da vacina com potentes adjuvantes é uma abordagem possível para aumentar as respostas imunes a antígenos subvirions.
Uma vacina de influenza subunitária, auxiliada com o adjuvante MF59, na forma de uma emulsão de óleo em água, é comercialmente disponível e tem demonstrado sua capacidade de induzir um título de anticorpo mais elevado do que aquele obtido com a vacina subunitária não-auxiliada (De Donato et al., 1999, Vaccine, 17, 3094 - 3101). Entretanto, em uma publicação posterior, a mesma vacina não demonstrou seu
000
perfil aperfeiçoado, em comparação com uma vacina dividida sem adjuvante (Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23,283 - 289).
Como informação, durante períodos inter-pandêmicos, circulam os vírus influenza que são relacionados com aqueles da epidemia precedente. Os vírus espalham-se entre as pessoas com variáveis níveis de imunidade de infecções mas cedo na vida. Tal circulação, durante um período de usualmente 2-3 anos, promove a seleção de novas cepas que mudaram bastante para causar uma epidemia novamente entre a população geral; este processo é denominado ‘desvio antigênico”. As “variantes de desvio” podem ter diferentes impactos em diferentes comunidades, regiões, países ou continentes em qualquer ano, embora durante diversos anos seu impacto global é com freqüência similar. Em outras palavras, uma pandemia de influenza ocorre quando um novo vírus influenza aparece, contra o qual a população humana não tem imunidade. Epidemias de influenza típicas provocam aumentos da incidência de pneumonia e doença respiratória inferior, como testemunhado pelas taxas aumentadas de hospitalização ou mortalidade. O idoso ou aqueles com doenças crônicas subjacentes são mais prováveis a experimentar tais complicações, porém infantes jovens também podem sofrer severa doença.
Em intervalos imprevisíveis, novos vírus da influenza emergem com um antígeno de superfície chave, a hemaglutinina, de um subtipo totalmente deferente das cepas circulando na estação antes. Aqui, os antígenos resultantes podem variar de 20% a 50% da correspondente proteína de cepas que estavam anteriormente circulando em humanos. Isto pode resultar em vírus escapando da ‘imunidade da multidão’ e estabelecendo pandemias. Este fenômeno é chamado ‘desvio antigênico’. Imagina-se que pelo menos no passado as pandemias ocorreram quando um vírus influenza de uma diferente espécie, tal como um vírus influenza aviário ou porcino, atravessou a barreira da espécie. Se tais vírus têm o potencial de espalharem
se de pessoa para pessoa, eles podem espalhar-se mundialmente dentro de alguns meses a um ano, resultando em uma pandemia. Por exemplo, em 1957 (pandemia de influenza asiática), vírus do subtipo H2N2 substituíram os vírus H1N1, que tinham circulado na população humana desde pelo menos 1918, quando o vírus foi primeiro isolado. Os H2 HA e N2 NA sofreram desvio antigênico entre 1957 e 1968, até o HA ser substituído em 1968 (pandemia de influenza Hong-Kong) pela emergência do subtipo de influenza H3N2, após o que ο N2 NA continuou a desviar-se juntamente com ο H3 HA (Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106*383 - 395).
As características de uma cepa de vírus influenza que dão-lhe o potencial para causar um surto pandêmico são: ela contém uma nova hemaglutinina, em comparação com a hemaglutinina nas cepas atualmente circulando, que pode ou não ser acompanhada por uma mudança do subtipo da neuraminidase; é capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana; e é patogênica para humanos. Uma nova hemaglutinina pode ser uma que não tem sido evidente na população humana por um período de tempo prolongado, provavelmente numerosas décadas, tais como H2. Ou pode ser uma hemaglutinina que não esteve circulando na população humana antes, por exemplo, H5, H9, H7 ou H6, que são encontradas em pássaros. Num ou noutro caso, a maior parte, ou pelo menos uma grande proporção da, ou mesmo a inteira população não encontrou anteriormente o antígeno e é imunologicamente não afetada para ela.
Os papilomavírus são vírus tumorais de pequeno DNA, que são altamente específicos da espécie. Até agora, acima de 100 genótipos de papilomavírus humanos (HPV) individuais foram descritos. Os HPVs são genericamente específicos para a pele (p. ex., HPV-1 e 2) ou superfícies mucosas (p. ex., HPV-6 e 11) e usualmente causam tumores benignos (verrugas), que persistem por diversos meses ou anos. Tais tumores benignos podem ser penosos para os indivíduos envolvidos, porém tendem a não ser ameaçadores da vida, com algumas exceções.
Alguns HPVs são também associados com cânceres. A mais forte associação positiva entre um HPV e o câncer humano é aquela que existe entre o HPV-16 e HPV-18 e o carcinoma cervical. O câncer cervical é a mais comum malignidade nos países em desenvolvimento, com cerca de 500.000 novos casos ocorrendo no mundo a cada ano. É agora tecnicamente exeqüível combater ativamente as infecções por HPV-16 primárias e mesmo cânceres contendo HPV-16 estabelecidos, empregando-se vacinas. Para uma recapitulação sobre as perspectivas para vacinação profilática e terapêutica contra HPV-16, vide Cason J. Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293 - 306 e HageneseeM.E., InfectionsinMedicine 1997 14(7) 555-556, 559-564.
Embora pequenas variações realmente ocorram, todos os genomas de HPV descritos têm pelo menos oito genes antigos, Ela E8, e dois genes recentes, LI e L2. Além disso, uma região reguladora a montante abriga as seqüências reguladoras que parecem controlar os eventos mais transcricionais do genoma HPV.
As vacinas baseadas em HPV LI são descritas nos WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 e WO 94/05792. Uma tal vacina pode compreender o antígeno LI como um monômero, um capsômero ou uma partícula semelhante a vírus. Métodos para a preparação de VLPs são bem conhecidos na arte e incluem abordagens de desmontagem-remontagem de VLP, para fornecer homogeneidade aumentada, por exemplo, como descrito em WO 9913056 e US 6245568. Tais partículas podem adicionalmente compreender proteínas L2. As vacinas baseadas em L2 são descritas, por exemplo, em WO 93/00436. Outras abordagens de vacina HPV são baseadas nas proteínas antigas, tais como E7 ou proteínas de fusão, tais como L2-E7.
Há ainda necessidade de vacinas aperfeiçoadas, especialmente no caso de influenza e em pandemias de influenza particulares e para a população idosa, ou no caso de vacinas HPV.
Adjuvantes contendo combinações de lipopolissacarídeo e saponinas Quillaja foram descritos anteriormente, por exemplo, em EP 0671948. Esta patente demonstrou uma forte sinergia quando um lipopolissacarídeo (3D-MPL) foi combinado com uma saponina Quillaja (QS21). Foi agora constatado que boas propriedades adjuvantes podem ser conseguidas com combinações de lipopolissacarídeo e saponina quillaja como imunoestimulantes em uma composição adjuvante, mesmo quando imunoestimulantes estão presentes em baixas quantidades em uma dose humana.
RELATÓRIO DA INVENÇÃO
Em um primeiro aspecto da presente invenção, é provida uma composição imunogênica compreendendo um antígeno ou preparação antigênica dele, em combinação com uma composição adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo.
Em um segundo aspecto da presente invenção, é provida uma composição imunogênica compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, em combinação com um adjuvante de saponina, apresentado na forma de um lipossoma. Em uma forma de realização específica deste aspecto, a composição imunogênica compreende ainda um derivado de Lipídeo A, tal como 3D-MPL.
Adequadamente, o adjuvante da saponina na forma de um lipossoma de acordo com a presente invenção compreende uma fração ativa da saponina derivada da casca da Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, e um esterol, tal como colesterol, em uma relação de saponina: esterol de 1: 1 a 1: 100 p/p,
Em particular, dita composição imunogênica compreende um antígeno com um epítopo de célula CD4 T. Altemativamente, dita composição imunogênica compreende um antígeno com um epítopo de célula B.
A invenção também refere-se ao uso de um viscosidade intrínseca ou preparação antigênica dele, e um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina, apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção e/ou doença de vírus influenza.
A invenção também refere-se ao uso de um antígeno ou antígenos do vírus papiloma humano ou preparação antigênica dele, e um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina, apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção e/ou doença por papiloma vírus humano.
A invenção também refere-se ao uso de um antígeno ou antígenos de Citomegalovírus ou sua preparação antigênica, e um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção e/ou doença por citomegalovírus.
A invenção também refere-se ao uso de um antígeno ou antígenos de Streptococcus pneumoanie ou sua preparação antigênica, e um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo definido na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção e/ou doença por Streptococcus pneumonaie.
A invenção também refere-se ao uso de um antígeno de
Plasmodium falciparum ou sua preparação antigênica, e um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção por Plasmodium falciparum e/ou doença malárica.
A invenção também refere-se ao uso de um antígeno ou antígenos do vírus Varicella Zoster ou sua preparação antigênica, e um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção e/ou doença pelo vírus Varicella Zoster.
Em outro aspecto é provido o uso de (a) um antígeno ou sua preparação antigênica e (b) um adjuvante como aqui antes definido, na manufatura de uma composição imunogênica para induzir, em um humano, pelo menos um ou pelo menos dois ou todos os seguintes: (i) uma resposta imune de célula CD4 T aperfeiçoada contra dito antígeno ou sua preparação antigênica, (ii) uma aperfeiçoada resposta imune humoral contra dito antígeno ou sua preparação antigênica, (iii) uma melhorada resposta de célula Bmemória contra dito antígeno ou sua preparação antigênica.
Em particular, dito antígeno é um vírus influenza, HPV, citomegalovírus (CMV), vírus Varicella zoster (VZV), antígeno de Streptococcus pneumoniae ou da malária ou sua preparação antigênica, e dito humano é um indivíduo ou população imuno-comprometida, tal como um adulto de alto risco, um adulto idoso ou um infante. Em uma forma de realização específica, é provido o uso de uma sua preparação antigênica e um adjuvante como aqui antes definido, na preparação de uma composição imunogênica para vacinação de humano, em particular um adulto idoso humano, contra o patógeno de que o antígeno da composição imunogênica é derivado. Especificamente, dito antígeno é um vírus influenza, vírus papiloma humano, citomegalovírus, vírus Varicella zoster, Streptococcus pneumoniae, Plasmodium parasite, antígeno ou antígenos ou sua preparação antigênica.
É também provido um método de vacinação compreendendo a distribuição de um antígeno ou composição antigênica, em particular um vírus influenza ou HPV, citomegalovírus, vírus Varicella zoster, Streptococcus pneumoniae, Plasmodium parasite ou sua preparação antigênica e um adjuvante, como aqui acima definido, a um indivíduo ou população em necessidade dele.
Em uma forma de realização específica, a composição imunogênica é capaz de induzir uma melhorada resposta imune de célula CD4 T contra dito antígeno ou preparação antigênica dele e em particular é ainda capaz de induzir uma resposta imune humoral ou uma resposta de célula de memória-B melhorada, ou ambas, em comparação com aquela obtida com o antígeno ou composição antigênica não-auxiliado. Especificamente, dita resposta de célula CD4 T envolve a indução de uma resposta de célula auxiliar CD4 T de reação cruzada. Especificamente, dita resposta imune humoral envolve a indução de uma resposta imune humoral de reação cruzada.
Em uma outra forma de realização, é fornecido um método ou uso, como aqui acima definido, para proteção contra infecção ou doença causada por um patógeno que é uma variante do patógeno de que o antígeno da composição imunogênica é derivado. Em outra forma de realização, é provido um método ou uso como aqui antes definido, para proteção contra infecções ou doença causada por um patógeno que compreende um antígeno que é uma variante daquele antígeno da composição imunogênica. Em uma forma de realização específica, é provido o uso de um antígeno, em particular um influenza ou HPV, ou sua preparação antigênica, na manufatura de uma composição imunogênica para revacinação de humanos anteriormente vacinados com uma composição imunogênica compreendendo um antígeno, em particular um influenza ou HPV ou sua preparação antigênica, em combinação com um adjuvante como aqui descrito.
Em uma forma de realização específica, a composição usada para a revacinação pode adicionalmente conter um adjuvante. Em outra forma de realização específica, a composição imunogênica para revacinação contém um antígeno que compartilha epítopos de célula CD4 T comuns com um antígeno ou composição antigênica usado para uma vacinação anterior. Especificamente, a composição imunogênica para revacinação contém um vírus influenza ou sua preparação antigênica, que compartilha epítopos de célula CD4 T comuns com o vírus influenza ou sua preparação antigênica viral usada para a primeira vacinação.
Em um aspecto, a revacinação é feita em indivíduos que foram vacinados na estação anterior contra influenza. Tipicamente, a revacinação é feita pelo menos 6 meses após a primeira vacinação, preferivelmente 8 a 14 meses após, mais preferivelmente em tomo de 10 a 12 meses após. Em outro aspecto, a revacinação é feita em indivíduos que foram vacinados com uma composição compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, em que pelo menos uma cepa é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico.
Em um outro aspecto da presente invenção, é provido o uso de um vírus influenza ou sua preparação antigênica de uma primeira cepa de influenza na manufatura de uma composição imunogênica como aqui definida, para proteção contra infecções de influenza causadas por uma cepa de influenza variante.
A invenção também refere-se a um método de vacinação compreendendo a distribuição de um vírus influenza ou sua preparação antigênica e um adjuvante como aqui antes definido.
Em outro aspecto, é provido um método de vacinação de um indivíduo ou população humano imuno-comprometido, tal como adultos ou idosos de alto risco, compreendendo administrar uma composição imunogênica compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, em combinação com um adjuvante como aqui definido.
Em ainda outra forma de realização, a invenção fornece um método para revacinar humanos anteriormente vacinados com uma composição imunogênica de influenza, compreendendo um antígeno de influenza ou sua preparação antigênica de pelo menos uma cepa do vírus influenza, em combinação com um adjuvante como aqui definido, dito método compreendendo administrar a dito humano uma composição imunogênica compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, auxiliado ou não-auxiliado.
A invenção também refere-se a um método para a preparação de uma composição imunogênica, compreendendo combinar um adjuvante de saponina na forma de um lipossoma com um vírus influenza ou sua preparação antigênica e, opcionalmente, com 3D-MPL.
Outros aspectos e vantagens da presente invenção são descritos ainda na seguinte descrição detalhada de suas formas de realização preferidas.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 é uma representação diagramática da preparação MPL.
A Figura 2 é uma resposta humoral contra várias cepas de influenza em seguida à imunização de doninhas com formulações experimentais: Teste de Inibição de Hemaglutinação (GMT ± IC95), antes e após iniciação heteróloga (H1N1 A/Stockholm/24/90), após imunização (H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 e B/Shangdong/7/97) e após-desafio heteróloga (H3N2 A/Wyoming/3/2003).
Figura 3 - Estudo de doninha: titulação viral em lavagens nasais após-desafio (Dia 42).
Figura 4 - Estudo de camundongos: Resposta humoral contra as três cepas de vacina de influenza em seguida à imunização de camundongos com formulações experimentais: Teste de Inibição d Hemaglutinação (GMT +/- IC95) 21 dias após imunização (H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Wyoming/3/2003 e B/Jiangsu/ 10/2003).
Figura 5 - Estudo de camundongos: Resposta imune mediada por célula: respostas de célula CD4+ T específicas de influenza no Dia 7 pósimunização.
Figura 6 - Estudo de camundongos: CMI para CD4 - Cepa reunida (tudo duplo) - Dia 0 e Dia 21
Figura 7 - GMTS nos dias 0 e 21 para anticorpos HI
Figura 8 - Incidência de sintomas locais e gerais em humanos (Total e grau 3 relacionados) informados durante o período de acompanhamento de 7 dias em seguida à imunização, com formulações de vírus influenza com formulações de vírus influenza com adjuvante, comparando adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes.
Figura 9 - Resposta humorais a HPV 16 e 18 LI em camundongos, em seguida à imunização com formulações HPV com adjuvante, comparando adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes.
Figura 10 - Resposta imune mediada por célula em camundongos: Tingimento de Citocina Intracelular - VLP16 e células 18 CD4+ t em seguida a imunização com formulações HPV com adjuvante, comparando adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes.
Figura 11: Produção de células de Memória B Específicas, em seguida à imunização com formulações HPV com adjuvante, comparando
adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes
Figura 12: Comparação pré-clinica de vacinas S. pneumoniae com adjuvante em camundongos, comparando adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes.
Figura 13: Títulos ELISA anti-gB de porquinho da índia, em seguida a imunização com vacina Gb com adjuvante, comparando adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes.
Figura 14: Títulos de neutralização Anti CMV de porquinhos da índia, em seguida à imunização com vacina Gb com adjuvante, comparando adjuvantes tendo duas diferentes concentrações de imunoestimulantes.
Figura 15: Títulos ELISA Anti-gB de camundongos, em seguida a imunização com vacina gB com adjuvante.
Figura 16: Títulos neutralizantes anti CMV de camundongos, em seguida a imunização com vacina gB com adjuvante.
Figura 17: Estudo de camundongos: Imunidade Mediada pro Célula-Células CD4+ e CD8+ específicas CMV em seguia a reestimulação com um pool de peptídeos gB (7 dias pós segunda imunização)
Figura 18: Estudo de camundongos. Imunidade Mediada por Célula - Células CD4+ específicas CMV, em seguida a reestimulação com duas diferentes dosagens de um pool de peptídeos gB (21 dias pós segunda imunização).
Figura 19: Estudo de camundongos. Imunidade Mediada por Célula - células CD8+ específicos CMV, em seguida a reestimulação com duas diferentes dosagens de um pool de peptídeos gB (21 dias pós segunda imunização).
Figura 20: Títulos de anticorpo de média geométrica (GMT) contra proteína de Circunsporozóite CSP, em seguida a imunização com vacina RTS,S com adjuvante de camundongos; comparando adjuvantes tendo imunoestimulantes em duas diferentes concentrações.
Figura 21. Títulos de anticorpo de média geométrica (GMT) congra antígeno de superfície da Hepatite B (HBs) em seguida a imunização com vacina RTS,S com adjuvante em camundongos; comparando adjuvantes com imunoestimulantes em duas diferentes concentrações.
Figura 22. Expressão ex vivo de IL-2 e/ou IFN gama por células CD4 e CD8 T específicas-CSP, em seguida a imunização com uma composição imunogênica RTS,S com adjuvante, comparando adjuvantes com imunoestimulantes em duas diferentes concentrações.
Figura 23. Expressão in vivo de IL-2 e/ou IFN gama por células CD4 e CD8 T específicas HBs, em seguida a imunização com uma composição imunogênica RTS,S com adjuvante, adjuvantes com imunoestimulantes em duas diferentes concentrações.
Figura 24. Respostas humorais em camundongos em seguida a imunização com vacina de influenza dividida trivalente com adjuvante (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), imunoestimulantes em duas diferentes concentrações.
Figura 25: Resposta imune mediada por célula em camundongos em seguida a imunização com vacina influenza trivalente com adjuvante (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), imunoestimulantes em duas diferentes concentrações.
Figura 26: Resultados pré-clínicos em camundongos, comparando vacinas VZV gE com adjuvante AS01B ou AS01E.
Figura 27: Títulos de lavagem nasal viral, em seguida a iniciação e desafio com antígenos de vírus influenza - imunização com A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou auxiliada com composições de adjuvantes compreendendo imunoestimulantes em duas diferentes concentrações, em doninhas.
Figura 28: Monitoração de temperatura corporal em doninhas,
em seguida iniciação e desafio com antígenos influenza. Imunização com A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou auxiliado com composições com adjuvante compreendendo imunoestimulantes em duas diferentes concentrações
Figura 29: Títulos anti HI para as cepas A da formulação de vacina trivalente, em seguida a imunização e desafio com preparações de antígeno de influenza. Imunização com A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou auxiliado com composições com adjuvante compreendendo imunoestimulantes em duas diferentes concentrações,
Figura 30: Títulos anti HI para B/Jiangsu e a cepa de desvio usada para desafio, em seguida a imunização e desafio com preparações de antígeno de influenza. Imunização com A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou auxiliado com composições com adjuvante compreendendo imunoestimulantes em duas diferentes concentrações, DESCRIÇÃO DETALHADA
Os presentes inventores descobriram que uma composição com adjuvante, que compreende uma saponina apresentada na forma de um lipossoma, e um lipopolissacarídeo, em que cada imunoestimulante está presente em um nível a ou abaixo de 30 pg por dose humana, pode melhorar as respostas imunes a uma preparação antigênica, enquanto ao mesmo tempo tendo mais baixa reatogenicidade do que algumas das formulações da arte anterior, em que os imunoestimulantes estavam presentes em níveis mais levados por dose humana.
Os presentes inventores descobriram ainda que uma formulação de influenza, compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, junto com um adjuvante compreendendo uma saponina apresentada na forma de um lipossoma e, opcionalmente, adicionalmente com um derivado de lipídeo A, tal como 3D-MPL, foi capaz de melhorar a resposta imune da célula CD4 T contra dito antígeno ou composição
antigênica, em comparação com aquela obtida com o vírus sem adjuvante ou sua preparação antigênica. As formulações com adjuvante de saponina apresentadas na forma de um lipossoma são vantajosamente usadas para induzir respostas de célula CD4-6 anti-influenza, capazes de detecção de epítopos de influenza apresentados pelas moléculas MHC classe II. O presente requerente constatou que é eficaz alvejar o sistema imune mediado por célula, a fim de aumentar a responsividade contra cepas de influenza homólogas e de desvio (na vacinação e infecção).
É uma forma de realização específica da presente invenção que as composições para uso na presente invenção podem ser capazes de prover, em humanos, melhor soro-proteção contra influenza em seguida à revacinação, como avaliado pelo número de indivíduos humanos satisfazendo o correlativo de proteção de influenza. Além disso, é outra forma de realização específica que a composição para uso na presente invenção seja também capaz de induzir uma resposta de memória de célula B mais elevada, em seguida à primeira vacinação de um indivíduo humano e uma mais elevada resposta humoral em seguida à revacinação, em comparação com a composição sem adjuvante.
As composições de influenza com adjuvante de acordo com a presente invenção têm diversas vantagens:
1) uma imunogenicidade melhorada: elas permitem restaurar resposta imune fraca na pessoa idosa (acima de 50 anos de idade, tipicamente acima de 65 anos de idade) a níveis vistos em pessoas jovens (respostas anticorpo e/ou de célula T);
2) Um melhorado perfil de proteção cruzada: aumentada proteção cruzada contra cepas de influenza variantes (desviadas);
3) Elas também permitem que uma reduzida dosagem antigênica seja usada para uma resposta similar, assim assegurando uma aumentada capacidade no caso de emergência (pandemias por exemplo).
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Em outro aspecto da invenção, os inventores descobriram que a composição adjuvante, como definida aqui, demonstra resultados de imunogenicidade para tanto produção de anticorpo como freqüência pósvacinação de CD4 específica de influenza, que são equivalentes a ou às vezes maiores do que aqueles gerados com vacina sem adjuvante. Este efeito é, em particular, de valor na população idosa e pode ser conseguido com um adjuvante como aqui definido, contendo uma dose mais baixa de imunoestimulantes. Além disso, os sintomas de reatogenicidade mostraram uma tendência a serem mais elevados no grupo que recebeu a vacina com a mais elevada concentração de imunoestimulantes como adjuvante, em comparação com o grupo que recebeu a vacina com adjuvante, em que os imunoestimulantes estão em uma concentração menor.
Estes achados podem ser aplicados a outras formas dos mesmos antígenos e a outros antígenos.
Adjuvante saponina
A composição adjuvante da invenção compreende um adjuvante de saponina, apresentado na forma de um lipossoma.
Uma saponina particularmente adequada para uso na presente invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore da América do Sul Qillaja Saponaria Molina e foi primeiro descrita por Dalsgaard et al. em 1974 (Saponin adjuvants, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254) como tendo atividade de adjuvante. Fragmentos purificados de Quil A foram isolados por HPLC, que retém atividade adjuvante sem a toxicidade associada com Quil A (EP 0 362 278), por exemplo, QS7 e QS21 (também conhecidos como QA7 e QA21). QS-21 é uma saponina natural, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina, que induz células CD8+ citotóxicas T (CTLs), células Thl e uma resposta anticorpo predominante IgG2a e é uma saponina preferida no contexto da presente invenção.
Em uma forma adequada da presente invenção, o adjuvante de saponina dentro da composição imunogênica é um derivado da saponaria molina quil A, preferivelmente uma fração imunologicamente ativa de Quil A, tal como QS-17 ou QS-21, adequadamente QS-21. Em uma forma de realização, as composições da invenção contêm a fração de saponina imunologicamente ativa em forma substancialmente pura. Preferivelmente, as composições da invenção contêm QS21 em forma substancialmente pura, isto é, a QS21 é pelo menos 90% pura, por exemplo, pelo menos 95% pura ou pelo menos 98% pura.
Em uma forma de realização específica, QS21 é provida em sua composição menos reatogênica, onde é extinta com um esterol exógeno, tal como colesterol, por exemplo. Existem diversas formas particulares de composições menos reatogênicas, em que QS21 é extinta com um colesterol exógeno. Em uma forma de realização específica, a saponina / esterol é na forma de uma estrutura de lipossoma (WO 96/33739, Exemplo 1). Nesta forma de realização, os lipossomas adequadamente contêm um lipídeo neutro, por exemplo, fosfatidilcolina, que é adequadamente não-cristalino em temperatura ambiente, por exemplo, fosfatidilcolina da gema do ovo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) ou dilauril fosfatidilcolina. Os lipossomas podem também conter um lipídeo carregado, que aumenta a estabilidade da estrutura do lipossoma-QS21 para lipossomas compostos de lipídeos saturados. Nestes casos, a quantidade de lipídeo carregado é adequadamente de 1 - 20 % p/p, preferivelmente 5 - 10%. A relação de esterol para fosfolipídeo é de 1 - 50% (mol/mol), adequadamente 20 - 25%.
Esteróis adequados incluem β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol e colesterol. Em uma forma de realização particular, a composição adjuvante compreende colesterol como esterol. Estes esteróis são bem conhecidos na arte, por exemplo, colesterol é descrito no Meck Index 11a. Ed., pág. 341, como um esterol naturalmente ocorrente, encontrado em gordura animal.
As composições adjuvantes da invenção, compreendendo QS21 e esterol, colesterol em particular, apresentam uma diminuída reatogenicidade, quando comparadas a composições em que o esterol está ausente, enquanto o efeito adjuvante é mantido. Estudos de reatogenicidade podem ser avaliados de acordo com os métodos descritos no WO 96/33739. O esterol de acordo com a presente invenção significa um esterol exógeno, isto é, um esterol que não é endógeno ao organismo de que a preparação antigênica é tirada, porém é adicionado à preparação antígena ou subseqüentemente no momento da formulação. Tipicamente, o esterol pode ser adicionado durante subseqüente formulação da preparação antigênica com o adjuvante de saponina, utilizando-se, por exemplo, a saponina em sua forma extinta com o esterol. Adequadamente, o esterol exógeno é associado com o adjuvante de saponina, como descrito no WO 96/33739.
Onde a fração de saponina ativa for QS21, a relação de QS21: esterol tipicamente será da ordem de 1: 100 a 1: 1 (p/p), adequadamente entre 1: 10 a 1: 1 (p/p) e, preferivelmente, 1: 5 a 1: 1 (p/p). Adequadamente, esterol em excesso está presente, a relação de QS21: esterol sendo de pelo menos 1: 2 (p/p). Em uma forma de realização, a relação de QS21: esterol é de 1: 5 (p/p). O esterol é adequadamente colesterol.
Outras saponinas úteis são derivadas das plantas Aeculus hippocastanum ou Gyophilla struthium. Outras saponinas que foram descritas na literatura incluem Escina, que foi descrita no Merck index (12a. ed., entrada 3737) como uma mistura de saponinas ocorrendo na semente da árvore castanha da índia, Lat: Aesculus hippocastanum. Seu isolamento é descrito por cromatografia e purificação (Fiedler, Arzneimittel-Forsch 4, 213 (1953)), e por resinas de troca iônica (Erbring e al., US 3.238.190). As frações da resina foram purificadas e mostraram ser biologicamente ativa (Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug; 44(8): 1454-1464)). A
-r sapoalbina de Gypsophilla Struthium (R. Vochten et al., 1968, J. Pharm. Belg., 42, 213-226) foi também descrita em relação à produção de ISCOM, por exemplo.
Um aspecto chave da presente invenção é o fato de que a saponina imunologicamente ativa, que é preferivelmente QS21, pode ser usada em quantidades menores do que tinham sido anteriormente imaginadas úteis, adequadamente abaixo de 30 pg, por exemplo, entre 1 e 30 pg, por dose humana da composição imunogênica.
A invenção, portanto, fornece uma dose humana de uma composição imunogênica compreendendo saponina imunologicamente ativa, preferivelmente QS21, em um nível de 30 pg ou menos, por exemplo, entre 1 e 30 pg.
Em uma forma de realização, uma composição imunogênica, em um volume que é adequado para a dose humana da composição imunogênica compreendendo QS21 em um nível em tomo de 25 pg, por exemplo, entre 20-30 pg, adequadamente entre 21-29 pg ou entre 22 e 28 pg ou entre 23 e 27 pg ou entre 24 e 26 pg, ou 25 pg. Em outra forma de realização, a dose humana da composição imunogênica compreende QS21 em um nível em tomo de 10 ug, por exemplo entre 5 e 15 ug, adequadamente entre 6 e 14 ug, por exemplo entre 7 e 13 ug ou entre 8 e 12 ug ou entre 9 e 11 ug, ou 10 pg.
Em uma outra forma de realização, a dose humana da composição imunogênica compreende QS21 em um nível em tomo de 5 ug, por exemplo entre 1 e 9 ug, ou entre 2 e 8 ug ou adequadamente entre 3 e 7 ug ou 4 e 6 ug, ou 5 ug.
Uma quantidade adequada de QS21 é por exemplo qualquer um de 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ug (p/v) por dose humana da composição imunogênica.
Pela expressão “dose humana” pretendemos significar uma dose que é em um volume adequado para uso humano. Geralmente este é entre 0,3 e 1,5 ml. Em uma forma de realização, uma dose humana é 0,5 ml. Em uma outra forma de realização, uma dose humana é mais elevada do que 0.5 ml, por exemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Em uma outra forma de realização, uma dose humana é entre 1 ml e 1,5 ml. A invenção é caracterizada pelo fato de que cada dose humana contém 30 pg ou menos, por exemplo, entre 1 e 30 pg de QS21. A invenção fornece ainda uma composição adjuvante compreendendo 30 pg ou menos, por exemplo, entre 1 e 30 pg de QS21. Tipicamente, ta composição adjuvante será em um volume adequado de dose humana. Onde o adjuvante for em uma forma líquida a ser combinada com uma forma líquida de uma composição antigênica, a composição adjuvante será em um volume adequado de dose humana, que é aproximadamente metade do volume final pretendido da dose humana, por exemplo, um volume de 360 pl para uma dose humana pretendida de 0,7 ml ou um volume de 250 pl para uma dose humana pretendida de 0,5 ml. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição antigênica, para fornecer a dose humana final da vacina. O volume final de tal dose, naturalmente, variará dependendo do volume inicial da composição adjuvante e do volume da composição antigênica adicionados à composição adjuvante. Em uma forma de realização alternativa, o adjuvante líquido é usado para reconstituir uma composição antigênica liofílizada. Nesta forma de realização, o volume adequado de dose humana da composição adjuvante é aproximadamente igual ao volume final da dose humana. A composição adjuvante líquida é adicionada ao frasco contendo a composição antigênica liofílizada. A dose humana final pode variar entre 0,5 e 1,5 ml. Em uma forma de realização particular, a dose humana é de 0,5 ml, nesta forma de realização a composição de vacina da invenção compreenderá um nível de QS21 a ou abaixo de 30 pg, por exemplo, entre 1 e 30 pg, por dose humana de 0,5 ml, além disso, nesta forma de realização, uma composição adjuvante da invenção compreenderá um nível de QS21 a ou abaixo de 30 pg, por exemplo, entre 1 e 30 pg, por 250 pl de composição adjuvante, ou por 500 pl de composição adjuvante dependente de se a composição adjuvante é destinada a ser combinada com um líquido ou composição antigênica liofilizada, respectivamente.
Especificamente, quando combinada com um antígeno de influenza, uma quantidade de QS21 pode ser usada, por exemplo, em uma quantidade de 1 to 100 ug (p/v) por dose de composição, preferivelmente em uma quantidade de 10 to 50 ug (p/v) por dose de composição. Uma quantidade adequada de QS21 é por exemplo qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 ug (p/v) por dose de composição. Mais preferivelmente, a quantidade de QS21 varia de 25 a 75 ug (p/v) por dose de composição. Usualmente uma dose de composição variará de cerca de 0,5 ml a cerca de 1 ml. Uma dose de vacina típica é 0,5 ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml ou 1 ml. Em uma forma de realização preferida, uma concentração final de 50 ug of QS21 é contida por ml de composição de vacina, ou 25 ug per 0,5 ml de dose de vacina. Em outras formas de realização preferidas, uma concentração final de 35,7 ug ou
71,4 ug of QS21 é contida por ml de composição de vacina. Especificamente, um volume de dose de vacina de 0,5 ml contém 25 ug ou 50 ug of QS21 por dose. A dose de QS21 é adequadamente capaz de aumentar uma resposta imune a um antígeno em um humano. Em particular, uma quantidade de QS21 adequada é aquela que melhora o potencial imunológico da composição, em comparação com a composição sem adjuvante ou em comparação com a composição com adjuvante com outra quantidade de QS21, enquanto sendo aceitável por um perfil de reatogenicidade.
Adjuvante 3D-MPL
A composição compreende ainda um adjuvante adicional, que é um lipopolissacarídeo, adequadamente um derivado não-tóxico de lipídeo A, particularmente monofosforil lipídeo A ou, mais particularmente, monofosforil lipídeo A 3-desacilado (3D - MPL).
3D-MPL é vendido sob o nome MPL pela GlaxoSmithKline Biologicals N.A. e é referido por todo o documento como MPL ou 3D-MPL. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e 4.912.094. 3D-MPL promove principalmente as respostas de células CD4+ T com um fenótipo IFN-g (Thl). 3D-MPL pode ser produzido de acordo com os métodos descritos em GB 2 220 211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente, nas composições da presente invenção pequena partícula de 3D-MPL é usada. A pequena partícula de 3D-MPL tem um tamanho de modo que possa ser filtrada-estéril através de um filtro de 0,22 pm. Tais preparações são descritas no WO 94/21292.
Um aspecto chave da presente invenção é o fato de que o lipopolissacarídeo, que é preferivelmente 3D-MPL, pode ser usado em quantidades menores do que tinham sido anteriormente imaginadas úteis, adequadamente em um nível de 30 pg ou menos, por exemplo, entre 1 e 30 pg, por dose humana da composição imunogênica.
A invenção, portanto, fornece uma dose humana de uma composição imunogênica compreendendo lipopolissacarídeo, preferivelmente 3D-MPL, em um nível de 30 pg ou menor, por exemplo, entre 1 e 30 pg.
Em uma forma de realização, a dose humana da composição imunogênica compreende 3D-MPL em um nível em tomo de 25 pg, por exemplo, entre 20-30 pg, adequadamente entre 21 - 29 pg ou entre 22 e 28 pg ou entre 23 e 27 pg ou entre 24 e 26 ug, ou 25 ug.
Em outra forma de realização, a dose humana da composição imunogênica compreende 3D-MPL em um nível em tomo de 10 ug, por
Ul r exemplo entre 5 e 15 ug, adequadamente entre 6 e 14 ug, por exemplo entre 7 e 13 ug ou entre 8 e 12 ug ou entre 9 e 11 ug, ou 10 ug. Em uma outra forma de realização, a dose humana da composição imunogênica compreende 3DMPL em um nível em tomo de 5 ug, por exemplo entre 1 e 9 ug, ou entre 2 e 8 ug ou adequadamente entre 3 e 7 ug ou 4 e 6 ug, ou 5 ug.
Uma quantidade adequada de 3D-MPL é por exemplo qualquer uma de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ug (p/v) por dose humana da composição imunogênica.
Em uma forma de realização, o volume da dose humana é 0,5 ml. Em uma outra forma de realização, a composição imunogênica é em um volume adequado para uma dose humana, volume este sendo mais elevado do que 0,5 ml, por exemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Em uma outra forma de realização, a dose humana é entre 1 ml e 1,5 ml. A invenção é caracterizada pelo fato de cada dose humana conter 30 pg ou menos, por exemplo entre 1 e 30 ug de 3D-MPL.
A invenção fornece ainda uma composição adjuvante compreendendo 30 pg ou menos, por exemplo, entre 1 e 30 pg, de 3D-MPL. Tipicamente, tal composição adjuvante será em um volume adequado de dose humana. Onde o adjuvante for em uma forma líquida a ser combinada com uma forma líquida de uma composição antigênica, a composição adjuvante será em um volume adequado de dose humana, que é de aproximadamente metade do volume final pretendido da dose humana, por exemplo, um volume de 360 pl para uma dose humana pretendida de 0,7 ml ou um volume de 250 pl para uma dose humana pretendida de 0,5 m. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição antigênica para prover a dose humana final da composição imunogênica. O volume final de tal dose, naturalmente, variará dependendo do volume inicial da composição adjuvante e do volume da composição antigênica adicionadas à composição adjuvante.
Em uma forma de realização alternativa, a composição adjuvante líquida é usada para reconstituir uma composição antigênica liofilizada. Nesta forma de realização, o volume adequado de dose humana da composição adjuvante é aproximadamente igual ao volume final da dose humana. A composição adjuvante líquida é adicionada ao frasco contendo a composição antigênica liofilizada. A dose final humana pode variar entre 0,5 e 1,5 ml. Em uma forma de realização particular, a dose humana é de 0,5 ml, nesta forma de realização a composição de vacina da invenção compreenderá um nível de 3D-MPL a ou abaixo de 30 pg, por exemplo, entre 1 e 30 pg, por dose humana de 0,5 ml, além disso, nesta forma de realização, uma composição adjuvante da invenção compreenderá um nível de 3D-MPL a ou abaixo de 30 pg, por exemplo, entre 1 e 30 pg, por 250 pl de composição adjuvante ou por 500 pl de composição adjuvante dependente de se a composição adjuvante é destinada a ser combinada com uma composição antigênica líquida ou liofilizada respectivamente.
Quando a composição imunogênica contiver um vírus influenza ou sua preparação antigênica, a composição adjuvante que compreende uma saponina na forma de um lipossoma, opcionalmente contém adicionalmente um derivado de lipídeo A, particularmente monofosforil lipídeo A ou mais particularmente 3D-MPL. Nesta forma de realização, 3DMPL pode ser usado, por exemplo, em uma quantidade de 1 a 100 pg (p/v) por dose de composição, preferivelmente em uma quantidade de 10 a 50 pg (p/v) por dose de composição. Uma quantidade adequada de 3D-MPL é, por exemplo, qualquer uma de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 pg (p/v) por dose de composição. Mais preferivelmente, a quantidade de 3D-MPL varia de 25 a 75 pg (p/v) por dose de composição. Usualmente uma dose de composição variará de cerca de 0,5 ml a cerca de 1 ml. Uma dose de vacina típica é 0,5 ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml ou 1 ml. Em uma forma de realização, uma concentração final de 50 pg de 3D-MPL é contida por ml de composição de vacina, ou 25 pg per 0,5 ml de dose de vacina. Em outra forma de realização, uma concentração final de 35,7 pg ou 71,4 pg de 3D-MPL é contida por ml de composição de vacina. Especificamente, um volume de dose de vacina de 0,5 ml contém 25 pg ou 50 pg of 3D- MPL por dose.
A dose de 3D-MPL é adequadamente capaz de aumentar uma resposta imune a um antígeno em um humano. Em particular, uma quantidade de 3D-MPL é aquela que melhora o potencial imunológico da composição, em comparação com a composição sem adjuvante, ou em comparação com a composição com adjuvante com outra quantidade de MPL, enquanto sendo aceitável por um perfil de reatogenicidade.
Composições adequadas da invenção são aquelas em que os lipossomas são inicialmente preparados sem MPL (como descrito em WO 96/3339) e MPL é então adicionado, adequadamente como partículas pequenas de abaixo de 100 nm ou partículas que são susceptíveis a filtragem estéril através de uma membrana de 0,22 pm. O MPL não é, portanto, contido dentro da membrana de vesícula (conhecida como MPL externo). As composições em que o MPL é contido dentro da membrana vesicular (conhecida como MPL interno) também formam um aspecto da invenção. O antígeno pode ser contido dentro da membrana vesicular ou contido fora da membrana vesicular. Antígenos solúveis adequados são do lado de fora e os antígenos hidrofóbicos ou lipidados são contidos dentro ou fora da membrana.
Em uma forma de realização, a composição adjuvante da invenção compreende tanto um üpopolissacarídeo como saponina imunologicamente ativa. Em uma forma de realização específica da invenção, o üpopolissacarídeo é 3D-MPL e a saponina imunologicamente ativa é QS21. Em uma outra forma de realização da invenção, a composição adjuvante consiste essencialmente de um üpopolissacarídeo e saponina imunologicamente ativa em uma formulação lipossomal. Adequadamente, em uma forma desta forma de realização, a composição adjuvante consiste essencialmente de 3D-MPL e QS21, com opcionalmente estéril que é preferivelmente colesterol.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composição adjuvante compreende um lipopolissacarídeo e formulação lipossomal e saponina imunologicamente ativa, em combinação com um ou mais de outros imunoestimulantes ou adjuvantes. Adequadamente, em uma forma desta forma de realização, o lipopolissacarídeo é 3D-MPL e a saponina imunologicamente ativa é QS21.
Em uma forma de realização específica, QS21 e 3D-MPL estão presentes na mesma concentração final por dose humana da composição imunogênica. Em um aspecto desta forma de realização, uma dose humana de composição imunogênica compreende um nível final de 25 pg de 3D-MPL e 25 pg de QS21. Em uma outra forma de realização, uma dose humana de composição imunogênica compreende um nível final de 20 pg cada de MPL e QS21. Em uma outra forma de realização específica é provida uma composição adjuvante tendo um volume de 250 pl e compreendendo um nível de 25 pg de 3D-MPL e 25 pg de QS21, ou 10 pg cada de MPL e QS21.
Antígenos que podem ser usados com as composições adjuvantes da presente invenção incluem antígenos virais, parasíticos, bacterianos ou associados com tumor, por exemplo:
Um vírus influenza ou preparação antigênica dele para uso de acordo com a presente invenção, que pode ser um vírus influenza dividido ou sua preparação antigênica de vírus dividido. Em uma forma de realização alternativa, a preparação de influenza pode conter outro tipo de antígeno de influenza inativado, tal como um vírus integral inativado ou HA e NA purificados (vacina subunitária) ou um virossoma de influenza. Em ainda uma outra forma de realização, o vírus influenza pode ser uma preparação de influenza atenuado vivo.
Um vírus influenza dividido ou sua pressão atmosférica de vírus dividido, para uso de acordo com a presente invenção, é adequadamente uma preparação de vírus inativado, em que as partículas virais são rompidas com detergentes ou outros reagentes, para solubilizar o envoltório lipídico. Vírus dividido ou suas preparações antigênicas de vírus dividido são adequadamente preparadas por fragmentação do vírus influenza integral, infeccioso ou inativado, com concentrações solubilizantes de solventes orgânicos ou detergentes e subseqüente remoção de todo ou da maior parte do agente solubilizante e algum ou a maior parte do material lipídico viral. Por sua preparação antigênica de vírus dividido pretendemos significar uma preparação de vírus dividido, que pode ter sofrido algum grau de purificação, em comparação com o vírus dividido, enquanto retendo a maior parte das propriedades antigênicas dos componentes do vírus dividido. Por exemplo, quando produzido em ovos, o vírus dividido pode ser esgotado das proteínas contendo ovo ou, quando produzidos em cultura de célula, o vírus dividido pode ser exaurido dos contaminantes da célula hospedeira. Uma preparação antigênica do vírus dividido pode compreender componentes antigênicos de vírus dividido de mais do que uma cepa viral. As vacinas contendo vírus dividido (chamadas “vacina dividida de influenza”) ou preparação antigênicas de vírus dividido, geralmente contêm proteína e nucleoproteína de matriz residual e às vezes lipídeo, bem como as proteínas de invólucro de membrana. Tais vacinas de vírus dividido usualmente conterão a maior parte das ou todas as proteínas estruturais virais, embora não necessariamente nas mesmas proporções como ocorrem no vírus integral.
Altemativamente, o vírus influenza pode ser na forma de uma vacina de vírus integral. Isto pode provar-se ser uma vantagem em relação a uma vacina de vírus dividido para uma situação de pandemia, visto que evita a incerteza de se uma vacina de vírus dividido pode ser produzida com sucesso para uma nova cepa de vírus influenza. Para algumas cepas, os detergentes convencionais usados para produzir o vírus dividido pode avariar o vírus e tomá-lo inútil. Embora haja sempre a possibilidade de utilizarem-se diferentes detergentes e/ou desenvolver um diferente processo para produzir uma vacina dividida, isto levaria tempo, que pode não ser disponível em uma situação de pandemia. Além do maior grau de certeza com uma abordagem de vírus integral, há também uma maior capacidade de produção de vacina do que para vírus dividido, uma vez que consideráveis quantidades de antígeno são perdidas durante etapas de purificação adicionais, necessárias para preparar uma vacina dividida adequada.
Em outra forma de realização, a preparação do vírus influenza é na forma de uma vacina de influenza subunitária. As vacinas de influenza sub-unitárias geralmente contêm as duas maiores proteínas do envoltório, HA e Na, e podem ter um vantagem adicional em relação às inteiras vacinas de virion, visto que elas são geralmente menos reatogênicas, particularmente em vacinados jovens. As vacinas subunitárias podem ser produzidas recombinantemente ou purificadas de partículas virais rompidas.
Em outra forma de realização, a preparação do vírus influenza é na forma de um virossoma. Os virossomas são vesículas esféricas, unilamelares, que retêm as glicoproteínas HA e NA no invólucro viral funcional em conformação autêntica, intercaladas dentro da membrana de bicamada de fosfolipídeos dos virossomas.
Dito vírus influenza ou sua preparação antigênica pode ser derivada do ovo ou de cultura de células.
Por exemplo, o antígeno do vírus influenza ou suas preparações antigênicas de acordo com a presente invenção podem ser derivados do método de ovo embrionado convencional, cultivando-se o vírus influenza em ovos e purificando-se o fluido alantóico colhido. Os ovos podem ser acumulados em grandes números de repente. Altemativamente, eles
podem ser derivados de qualquer um dos métodos de nova geração, empregando-se célula ou cultura de células para cultivar o vírus ou expressar antígenos de superfície do vírus influenza recombinantes. Substratos de células adequados para cultivar o vírus incluem, por exemplo, células de rins de cão, tais como MDCK ou células de um clone de MDCK, células semelhantes a MDCK, células de rins de macaco, tais como células AGMK, incluindo células Vero, linhagens de células de porco adequadas ou qualquer outro tipo de célula mamífera, adequada para a produção de vírus influenza para fins de vacina. Substratos de célula adequados também incluem células humanas, p. ex., células MRC-5. Substratos de célula adequados não são limitados a linhagens de célula; por exemplo, células primárias tais como fibroblastos de embrião de frango e linhagens de células aviárias são também incluídas.
O antígeno do vírus influenza ou sua preparação antigênica pode ser produzido por qualquer um de numerosos processos comercialmente aplicáveis, por exemplo, os processo flu dividido, descrito na patente no. DD 300 833 e DD 211 444, incorporada aqui por referência. Tradicionalmente, flu dividido foi produzido usando-se um tratamento de solvente/detergente, tal como tri-n-butil fosfato ou dietiléter, em combinação com Tween (conhecido como divisão de “Tween-éter”), e este processo é ainda usado em algumas instalações de produção. Outros agentes de divisão agora empregados incluem detergentes ou enzimas proteolíticas ou sais biliares, por exemplo, deoxicolato de sódio, como descrito na patente no. DD 155 875, incoiporadA aqui por referência. Detergentes que podem ser usados como agentes de divisão incluem detergentes catiônicos, p. ex., cetil trimetil amônio brometo (CTAB), outros detergentes iônicos, p. ex., laurilssulfato, taurodexicolato ou detergentes não-iônicos, tais como os descritos acima, incluindo Triton X-100 (por exemplo, em um processo descrito em Lina et al., 2000, Biologicals 28, 95 - 103) e Triton N-101 ou combinações de qualquer í
dois ou mais detergentes.
O processo de preparação para uma vacina dividida pode incluir numerosas diferentes etapas de filtragem e/ou outras de separação, tais como etapas de ultracentrifugação, ultrafiltragem, centrifugação zonal e cromatografia (p. ex., troca de íons), em uma variedade de combinações e, opcionalmente, uma etapa de inativação, p. ex., com calor, formaldeído ou βpropiolactona ou U.V., que podem ser realizada antes ou após divisão. O processo de divisão pode ser realizado como um processo de batelada, contínuo ou semi-contínuo. Um processo de divisão e purificação preferido para uma composição imunogênica dividida é descrito em WO 02/097072.
Preparações antigênicas de flu dividido preferidas de acordo com a presente invenção, compreendem uma quantidade residual de Tween 80 e/ou Triton X-100 restando do processo de produção, embora estes possam ser adicionados ou suas concentrações ajustadas após preparação do antígeno dividido. Preferivelmente, tanto Tween 80 como Triton X-100 estão presentes. As faixas preferidas para as concentrações finais destes tensoativos não-iônicos na dose de vacina são:
Tween 80: 0,01 a 1 %, mais preferivelmente cerca de 0,1% (v/v)
Triton X-100: 0,001 a 0,1 (% p/v), mais preferivelmente 0,005 a 0,02% (p/v).
Em uma forma de realização específica, a concentração final para Tween 80 varia de 0,025%-0,09% p/v. Em outra forma de realização específica, o antígeno é provido como uma mistura duplamente concentrada, que tem uma concentração de Tween 80 variando de 0,025 %-0,2 % (p/v) e tem que ser diluída duas vezes na formulação final com o adjuvante (ou o tampão da formulação de controle).
Em outra forma de realização específica, a concentração final para Triton X-100 varia de 0,004%-0,017% p/v. Em outra forma de realização
específica, o antígeno é provido como uma mistura duplamente concentrada, que tem uma concentração de Triton X-100 variando de 0,005%-0,034% (p/v) e tem que ser diluída duas vezes na formulação final com o adjuvante (ou o tampão da formulação de controle).
Preferivelmente, a preparação de influenza é feita na presença de baixo nível de tiomersal ou, preferivelmente, na ausência de tiomersal. Preferivelmente, a preparação de influenza resultante é estável na ausência de preservativos de organomercurial, em particular a preparação não contém tiomersal residual. Em particular a preparação do vírus influenza compreende um antígeno de hemaglutinina estabilizado na ausência de tiomersal ou em baixos níveis de tiomersal (geralmente 5 pg/ml ou menos). Especificamente, a estabilização da cepa de influenza B é realizada por um derivado de tocoferol alfa, tal como succinato de tocoferol alfa (também conhecido como succinato de vitamina E, isto é., VES). Tais preparações e métodos de prepará-los são descritos no WO 02/097072.
Uma composição preferida contém três antígenos de virion dividido inativado, preparado das cepas recomendadas por WHo da apropriada estação de influenza.
Preferivelmente, o vírus influenza ou sua preparação antigênica e o adjuvante de acordo com a presente invenção são contidos no mesmo recipiente. É referido como ‘abordagem de um frasco’. Preferivelmente, o frasco é uma seringa pré-carregada. Em uma forma de realização alternativa, o vírus influenza ou sua preparação antigênica e adjuvante de acordo com a presente invenção são contidos em recipientes ou frascos separados e misturados pouco antes ou na administração no indivíduo. É referida como ‘abordagem de dois frascos”. Como exemplo, quando a vacina é uma vacina de 2 componentes para um volume de dose total de 0,7 ml, os antígenos concentrados (por exemplo, os antígenos de virion divididos inativados trivalentes concentrados) são apresentados em um frasco (335 μΐ)
6ο (recipiente de antígeno) e uma seringa pré-enchida contém o adjuvante (360 μΐ) (recipiente de adjuvante). Na ocasião da injeção, o teor do frasco contendo os antígenos de virion divididos inativados trivalentes concentrados é removido do frasco utilizando-se a seringa contendo o adjuvante, seguido por suave mistura da seringa. Antes da injeção, a agulha usada é substituída por uma agulha intramuscular e o volume é corrigido para 530 μΐ. Neste exemplo, uma dose do candidato de vacina influenza com adjuvante reconstituída corresponde a 530 μΐ.
Em um aspecto da invenção, onde houver uma composição multivalente, então pelo menos uma cepa de influenza de dita composição imunogênica multivalente, como aqui definida, é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico. Tal cepa pode também ser referida como ‘cepa pandêmica’ no texto abaixo. Em particular, quando a vacina for uma vacina multivalente, tal como uma vacina bivalente, trivalente ou quadrivalente, pelo menos uma cepa é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico. Cepas adequadas não são limitadas a: H5N1, H9N2, H7N7 e H2N2.
Dito vírus influenza ou sua preparação antigênica é adequadamente multivalente, tal como bivalente, trivalente ou quadrivalente. Preferivelmente, o vírus influenza ou sua preparação antigênica é trivalente ou quadrivalente, tendo um antígeno de três diferentes cepas de influenza, pelo menos uma cepa sendo associada com um surto pandêmico ou tendo o potencial de ser associado com um surto pandêmico.
As características de uma cepa de vírus influenza que lhe dão o potencial para causar um surto pandêmico são: ela contém uma nova hemaglutinina, em comparação com a hemaglutinina das cepas atualmente circulando; é capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana; e é patogênica para humanos. Uma nova hemaglutinina pode ser uma que não
foi evidente na população humana por um período prolongado de tempo, provavelmente numerosas décadas, tais como H2. Ou pode ser uma hemaglutinina que não tem estado circulando na população humana antes, por exemplo, H5, H9, H7 ou H6, que são encontradas em pássaros. Num ou noutro caso, a maior parte ou pelo menos uma grande parte da ou mesmo a inteira população não encontrou anteriormente o antígeno e é imunologicamente não afetada por ela.
Certos indivíduos estão geralmente em um risco aumentado de tomarem-se infectadas por influenza em uma situação pandêmica. O idoso, o cronicamente doente e crianças pequenas são particularmente susceptíveis, porém muitas pessoas jovens e aparentemente saudáveis estão também sob risco. Para a influenza H2, a parte da população nascida após 1968 está em um aumentado risco. É importante que estes grupos sejam protegidos efetivamente tão logo que possível e de uma maneira simples.
Outro grupo de pessoas que estão em risco aumentado são viajantes. As pessoas viajam mais hoje do que antes e as regiões em que a maior parte dos novos vírus emergem, China, Ásia Sudeste, tomaram-se destinos de viagens populares nos últimos anos. Esta mudança dos padrões de viagem possibilita que novos vírus alcancem em tomo do mundo de uma questão de semanas em vez de meses ou anos.
Assim, para estes grupos de pessoas há uma necessidade particular de vacinação para proteger contra influenza em uma situação pandêmica ou uma situação pandêmica potencial. Cepas adequadas não são limitadas a: H5N1, H9N2, H7N7 e H2N2.
Opcionalmente, a composição pode conter mais do que três valências, por exemplo, três cepas não-pandêmicas mais uma cepa pandêmica. Altemativamente, a composição pode conter três cepas pandêmicas. Preferivelmente, a composição contém três cepas pandêmicas.
Também exemplos de antígenos para a composição
imunogênica da invenção são antígenos Estreptococais, tais como do Grupo A Streptococcus ou Grupo B Streptococcus, porém a maioria preferivelmente de Streptococcus pneumoniae. Pelo menos uma proteína e/ou pelo menos um antígeno de sacarídeo são preferivelmente usados. O pelo menos um antígeno de proteína de Streptococcus pneumoniae é mais preferivelmente selecionado do grupo consistindo de: pneumolisina, PspA ou suas variantes de deleção da transmembrana, PspC ou suas variantes de deleção da transmembrana, PsaA ou suas variantes de deleção da transmembrana, gliceraldeído-3fosfatodeidrogenase, CbpA ou suas variantes de deleção da transmembrana PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 e Spl33, ou seu equivalente imunologicamente funcional (por exemplo, fusões de domínios das proteínas acima, por exemplo, as proteínas de fusão pHtDE descritas em WO 01/98334 e WO 03/54007).
Certas composições são descritas no WO 00/56359 e WO 02/22167 e WO 02/22168 (incorporados aqui por referência).
O antígeno pode compreender antígenos de sacarídeo capsulares (preferivelmente conjugados com uma proteína veículo), em que os sacarídeos (muitíssimo preferivelmente polissacarídeos) são derivados de pelo menos quatro sorotipos de pneumococcus. Em uma forma de realização os quatro sorotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F. Em uma outra forma de realização, pelo menos 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo, aqueles derivados dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma outra forma de realização, pelo menos 10 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo, a composição em uma forma de realização inclui sacarídeos capsulares derivados dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma outra forma de realização, pelo menos 10 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo, a composição em uma forma de realização inclui sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1,4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (preferivelmente conjugados com uma proteína veículo). Em outra forma de realização, a composição imunogênica compreende sacarídeos capsulares derivados dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma forma de realização preferida da invenção, pelo menos 13 antígenos de sacarídeo (preferivelmente conjugados com uma proteína veículo) são incluídos, embora mais antígenos de sacarídeo, por exemplo, 23 valentes (tais como sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F) são também contemplados pela invenção.
Embora os sacarídeos acima sejam vantajosamente em seu comprimento total, a forma de polissacarídeo nativa, deve ser entendido que polissacarídeos reduzidos em tamanho podem também ser usados que são ainda imunogênicos (vide, por exemplo, EP 497524 e 497525) se necessário, quando acoplados com um veículo de proteína.
Pra a prevenção/melhoria da pneumonia da população idosa (+ 55 anos) otite média em infantes (até 18 meses) e crianças começando a andar (tipicamente 18 meses a 5 anos), é uma forma preferida da invenção combinar um sacarídeo multivalente de Streptococcus pneumonia, como aqui descrito, com uma proteína de Sreptococcus pneumoniae, preferivelmente selecionada do grupo de proteínas listado acima. Uma combinação de proteínas pneumocócicas pode também ser vantajosamente utilizada como descrito abaixo.
Proteínas Pneumocócicas
Os antígenos de Streptococcus pneumoniae são preferivelmente selecionados do grupo consistindo de: uma proteína da família tríade da poliistidina (Pht), uma proteína da família Lyt, uma proteína de ligação da colina, proteínas tendo um motivo LPXTG (em que X é qualquer aminoácido), proteínas tendo um motivo de seqüência de Sinal Tipo II de LXXC (onde X é qualquer aminoácido) e proteínas tendo um motivo de seqüência de Sinal Tipo I. Exemplos preferidos dentro destas categorias (ou motivos) são as seguintes proteínas (ou seu equivalente truncado ou t
imunologicamente funcional.):
A família Pht (Poli Histidina tríade) compreende proteínas phtA, PhtB, PhtD e PhtE. A família é caracterizada por uma seqüência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolina e diversas tríades de histidina, possivelmente envolvidas em ligação de metal ou nucleosídeo ou atividade enzimática, (3 - 5) regiões em espiral enrolada, um término-N conservado e um término C heterogêneo. Está presente em todas as cepas de pneumococos testadas. Proteínas homólogas foram também encontradas em outros Streptococci e Neisseria. Membros preferidos da família compreendem PhtA, PhtB e PhtD. Mais preferivelmente, compreende pHtA ou PhtD. É entendido, entretanto, que os termos Pht A, B, D e E referem-se a proteínas tendo seqüências descritas nas citações abaixo, bem como suas variantes naturalmente ocorrentes (e produzidas pelo homem), que têm uma seqüência de homologia que é de pelo menos 90% idêntica à das proteínas referenciadas. Preferivelmente, é pelo menos 95% idêntica e muitíssimo preferivelmente é 97% idêntica.
Com respeito às proteínas pHt, PhtA é descrito no WO 98/18930 e é também referido como Sp36. Como citado acima, é uma proteína da família tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal tipo II de LXXC.
PhtD é descrita no WO 00/37105 e é também referida como Sp036D. Como citado acima, é também uma proteína da família tríade de poliistidina e tem o motivo de sinal LXXC tipo II. A PhtB é descrita no WO 003/37105 e é também referida como Sp036B. Outro membro da família de PhtB é o Polipeptídeo de Degradação-C3, como descrito no WO 00/17370. Esta proteína também é da família tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal LXXC tipo II. Um equivalente imunologicamente funcional preferido é a proteína Sp42 descrita em WO 98/18930. Um truncado de PhtB (aproximadamente 79 kD) é descrito em WO 99/15675, que é também
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considerado um membro da família PhtX.
PhtE é descrita no WO 00/30299 e é referida como BVH-3.
SpsA é uma proteína de ligação da colina (Cbp) descrita no WO 98/39450.
A família Lyt são proteínas associadas com membrama com lise celular. O domínio de terminal-N compreende domínio(s) de ligação da colina, entretanto, a família Lyt não tem todas as características encontradas na família da proteína de ligação da colina (Cbp) citada abaixo e, assim, para a presente invenção, a família Lyt é considerada distinta da família Cbp. Ao contrário, com a família Cbp, o domínio de terminal-C contém o domínio catalítico da família da proteína Lyt. A família compreende LytA, B e C. Com respeito à família Lyt, LytA é descrita em Ronda et al., Eur J Biochem, 164: 621-624 (1987). LytB é descrita no WO 98/18930 e é também referido como Sp46. LytC é descrita também em WO 98/18930 e é também referida como Sp91. Um membro preferido daquela família é LytC.
Outra forma de realização preferida são truncados da família Lyt (particularmente LytA), em que “Lyt” é definido acima e “truncados” refere-se a proteínas sem 50% ou mais da região de ligação da colina. Preferivelmente, tais proteínas não têm a inteira região de ligação da colina.
SP 125 é um exemplo de uma proteína de superfície pneumocócica com o motivo Ancorado na Parede Celular de LPXTG (onde X é qualquer aminoácido). Qualquer proteína dentro desta classe de proteína de superfície pneumocócica com este motivo foi constatada ser útil dentro do contexto desta invenção e é, portanto, considerada uma outra proteína da invenção. A própria Spl25 é descrita no WO 98/18930 e é também conhecida como ZmpB - uma metaloproteinase do zinco.
SplOl é descrita no WO 98/06734 (onde tem a referência # y85993. É caracterizada por uma seqüência de sinal Tipo I.
Spl33 é descrita no WO 98/06734 (onde ela tem a referência #
y85992). É também caracterizada por uma seqüência de sinal Tipo I.
Spl28 e Spl30 são descritas no WO 00/76540.
As proteínas usadas na presente invenção são preferivelmente selecionadas do grupo PhtD, PhtA e PhtE, ou uma combinação de 2 ou todas 3 destas proteínas (isto é, PhtA+D, A+E, D+E ou A+D+E).
Outros antígenos de proteína pneumocócicos que podem ser incluídos são um ou mais do grupo consistindo de: pneumolisina (também referida como Ply; preferivelmente desintoxicada por tratamento químico ou mutação) [WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884], PsaA e suas variantes de deleção de transmembrana (Beny & Paton, Infect Immun 1996 Dez; 64(12): 5255-62), PspA e suas variantes de deleção de transmembrana (US 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940), PspC e suas variantes de deleção da transmembrana (WO 97/09994, WO 99/53940), um membro da família da proteína de ligação da colina (Cbp) [p. ex., CbpA e suas variantes de deleção da transmembrana (WO 97/41151; WO 99/51266)], Gliceraldeído3-fosfato-deidrogenase (Infect, Immun. 1996 64: 3544), HSP70 (WO 96/40928), PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 20714), proteína semelhante a M (pedido de patente SB no. EP 0834568) e adesina 18627 (pedido de Patente SB No. EP 0834568). A presente invenção também abrange equivalentes imunologicamente funcionais ou truncados de tais proteínas (como definido acima).
Com referência à família da Proteína de Ligação da Colina, os membros dessa família foram originalmente identificados como proteínas pneumocócicas, que poderíam ser purificadas por cromatografia de afinidade de colina. Todas as proteínas de ligação de colina são não-covalentemente ligadas a componentes de fosforilcolina de ácido teicóico de parede celular e ácido lipoteicóico associado a membrana. Estruturalmente, elas têm diversas regiões em comum através da inteira família, embora a exata natureza das proteínas (seqüência aminoácida, comprimento etc.) possa variar. Em geral, as proteínas de ligação da colina compreendem uma região de terminal N (N), regiões de repetição conservada (RI e/ou R2), uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação da colina conservada (C), composta de múltiplas repetições, que compreende aproximadamente metade da proteína. Como usada neste pedido, a expressão “Família da Proteína de Ligação da Colina (Cbp)” é selecionada do grupo consistindo de Proteínas de Ligação de Colina, como identificado no WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, e CbpG. CbpA é descrita em WO 97/09994. PbcA é descrita em WO 98/21337. Preferivelmente, as Proteínas de ligação de Colina são selecionadas do grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC.
Se uma Cbp for a proteína adicional utilizada ela pode ser um truncado Cbp, em que “Cbp” é definido acima e “truncado” refere-se a proteínas faltando 50% ou mais da região de ligação da Colina (C). Preferivelmente, tais proteínas não têm a inteira região de ligação da colina. Mais preferivelmente, tais truncados de proteína não têm (i) a região de ligação da colina e (ii) uma parte da metade de terminal-N da proteína, bem como ainda retêm pelo menos uma região repetidora (RI ou R2). Mais preferivelmente ainda, o truncado tem 2 regiões de repetição (RI e R2). Exemplos de tais formas de realização preferidas são NRlxR2, RlxR2, NRlxR2P e RlxR2P, como ilustrado em WO 99/51266 ou WO 99/51188; entretanto, outras proteínas de ligação da colina sem uma região de ligação de colina similar, são também contempladas dentro do escopo desta invenção.
As proteínas quiméricas truncadas de Cbp truncado-Lyt (ou fusões) podem também ser usadas na composição da invenção. Preferivelmente, estas podem compreender NRlxR2 (ou RlxR2 ou NRlxR2P ou RlxR2P) de Cbp e da parte de terminal-C (Cterm, i.e., sem os domínios de ligação da colina) de Lyt (e.g., LytCCterm ou Sp91 Cterm). Mais preferivelmente Cbp é selecionada do grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. Mais preferivelmente ainda, é CbpA. Preferivelmente, Lyt é
LytC (também referida como Sp91).
Um truncado de PspA ou PsaA sem o domínio de ligação da colina (C) e expresso como uma proteína de fusão com Lyt, pode também ser usado. Preferivelmente, Lyt é LytC.
Em uma composição pneumocócica é possível combinarem-se diferentes proteínas pneumocócicas da invenção. Preferivelmente, a combinação das proteínas da invenção é selecionada de 2 ou mais (3 ou 4) diferentes categorias, tais como proteínas tendo um motivo de seqüência de Sinal Tipo II de LXXC (onde X é qualquer aminoácido, p. ex., a família tríade da poliistidina (Pht)), proteínas de ligação da colina (Cbp), proteínas tendo um motivo de seqüência de Sinal Tipo I (p. ex., SplOl), proteínas tendo um motivo LPXTG (em que X é qualquer aminoácido, p. ex., Spl28, Spl30), toxinas, (p. ex., Ply) etc. Exemplos preferidos dentro destas categorias (ou motivos) são as proteínas mencionadas acima ou seus equivalentes imunologicamente funcionais. Toxina + Pht, toxina + Cbp, Pht 4- Cbp, e toxina + Pht + Cbp são combinações de categoria preferidas.
Combinações benéficas preferidas incluem mas não são limitadas a proteínas quiméricas ou de fusão PhtD + NRlxR2, PhtD + NRlxR2-Sp91Cterm, proteínas quiméricas ou de fusão PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, PhtA + NRlxR2-Sp91 Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC, RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. Preferivelmente, NRlxR2 (ou RlxR2) é de CbpA ou PspC. Mais preferivelmente é de CbpA.
Uma combinação particularmente preferida de proteínas pneumocócicas compreende Ply (ou um seu equivalente truncado ou imunologicamente funcional), opcionalmente com NRlxR2 (ou RlxR2 ou NRlxR2P ou RlxR2P). Preferivelmente, NRlxR2 (ou RlxR2 ou NRlxR2P ou RlxR2P) é de CbpA ou PspC. Mais preferivelmente é de CbpA.
O antígeno pode ser um conjugado de sacarídeo pneumocócico, compreendendo antígenos de polissacarídeo derivados de pelo menos quatro sorotipos, preferivelmente pelo menos sete sorotipos, mais preferivelmente pelo menos dez sorotipos e pelo menos um, porém preferivelmente 2, 3 ou 4 proteínas do Streptococcus pneumoniae, preferivelmente selecionadas do grupo de proteínas descrito acima. Preferivelmente, uma das proteínas é PhtD (ou um seu equivalente imunologicamente funcional) e/ou Ply (ou um seu equivalente imunologicamente funcional).
Um problema associado com a abordagem de polissacarídeo para vacinação é o fato de que os polissacarídeos por si serem imunogenes pobres. Para superar isto, os sacarídeos podem ser conjugados com os veículos de proteína, que fornecem uma ajuda de célula T espectadora. Prefere-se, portanto, que os sacarídeos utilizados na invenção sejam ligados a tal veículo de proteína. Exemplos de tais veículos que são atualmente comumente usados para a produção de imunogenes de sacarídeo incluem os toxóides Difhtheria e Tetanus (DF, DT CRM197 e TT respectivamente), Hemocianina lapa buraco de fechadura (KLH), OMPC de N. meningitidis e o derivado de proteína purificado da Tuberculina (PPD).
Um veículo preferido para as composições imunogênicas baseadas em sacarídeo pneumocócico (ou vacinas) é a proteína D de Haemophilus influenzae (EP 594610-B) ou seus fragmentos. Fragmentos adequados para uso incluem fragmentos abrangendo os epítopos auxiliares-T. Em particular, um fragmento de proteína D preferivelmente conterá o terminal-N 1/3 da proteína. Um veículo de proteína D é útil como um veículo em composições em que múltiplos antígenos de sacarídeo pneumocócico são conjugados. Um ou mais sacarídeos pneumocócicos de uma combinação podem ser vantajosamente conjugados na proteína D.
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Um outro veículo preferido para o sacarídeo pneumocócico é a própria proteína pneumocócica (como definida acima na seção “Proteínas Pneumocócicas da invenção”).
O sacarídeo pode ser ligado à proteína veículo por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S. No. 4.372.945 e por Armor et al., Patente U.S. No. 4.474.757). Preferivelmente, a conjugação de CDAP é realizada (WO 95/08348).
Preferivelmente, a relação de proteína: sacarídeo (peso: peso) dos conjugados é de 0,3: 1 a 1: 1, mais preferivelmente 0,6: 1 a 0,8: 1 e muitíssimo preferivelmente cerca de 0,7: 1.
Composições particularmente preferidas da invenção compreendem um ou mais sacarídeos pneumocócicos conjugados e uma ou mais proteínas pneumocócicas da invenção. Além disso, os sacarídeos e proteínas pneumocócicos podem ser estavelmente armazenados como componentes de massa adsorvidos em fosfato de alumínio em uma forma líquida.
Em outro aspecto da invenção, a composição de vacina pode compreender um antígeno de citomegalovírus (HCMV) humano. HCMV é um vírus de DNA humano pertencente à família dos vírus de herpes e é a principal causa de defeitos congênitos em recém-nascidos e também provoca sérias condições médicas em pacientes imunocomprometidos. A doença clínica causa uma variedade de sintomas, incluindo febre, hepatite, pneumonite e mononucleose infecciosa.
Em uma forma de realização, o antígeno HCMV é uma proteína de fusão quimérica ou um seu derivado imunogênico, compreendendo uma parte de uma glicoproteína HCMV fundida a uma parte de uma glicoproteína HSV. A glicoproteína HCMV é tipicamente gB e a glicoproteína HSV é tipicamente gD, em particular HSV tipo 2gD (gD2). A fusão é tipicamente entre um aminoácido da parte de terminal-N de uma parte da proteína gB HCMV e um aminoácido do término C de uma parte da proteína HSV gD. Os componentes tanto da proteína HCMV gB como da proteína HSV gD da proteína de fusão podem não ter um domínio de ancoragem de membrana.
A parte da proteína HCMV gB pode compreender uma forma não-clivável de HCMV gB. Adequadamente, isto é conseguido mudando-se um ou mais aminoácidos em um sítio de divagem da proteína, por exemplo, trocando-se Arg458 e Arg 459 por Glu e Thr, respectivamente. A parte da proteína HSV pode compreender a seqüência de sinal de gD2 (aminoácidos 1 a 25) e, opcionalmente, aminoácidos 26 a 52 de gD2 e/ou a seqüência de gD2 que é PEDSALLEDPED ou funcionalmente seus equivalentes, que podem ser mais curtos ou mais longos. Outras seqüências de HSV gD podem ser adicionadas à proteína de fusão, por exemplo, no término C da proteína HCMV gB.
Em uma forma de realização, a proteína de fusão compreende aminoácidos 1 a 52 da proteína HSV gD2 fundida aos resíduos 28 a 685 da proteína HCMV gB. Tal proteína de fusão é designada HCMV gB685*. Em uma outra forma de realização, a seqüência aminoácida PEDSALLEDPED, que é derivada de uma seqüência gD2 interna, pode ser incluída na extremidade de terminal C de HCMV gB685* da proteína, para produzir a proteína designada HCMV gB685**. Estas proteínas de fusão específicas são descritas mais detalhadamente em WO 95/31555.
Outro imunogene adequado para uso como uma vacina HCMV é pp65, uma proteína de matriz HCMV como descrita em WO 94/00150 (City of Hope).
Em uma outra forma de realização da presente invenção, as composições imunogênicas contêm um antígeno ou preparação antigênica derivada do Papilloma Virus Humano (HPV), considerado ser responsável por verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outras) e/ou o vírus HPV responsável pelo câncer cervical (HPV 16, HPV 18 e outros).
Em uma forma de realização, as formas de composições profiláticas ou terapêuticas de verruga genital compreendem partículas LI ou capsômeros e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antígenos selecionados das proteínas HPV El, E2, E5, E6, E7, LI e L2.
Em uma forma de realização, as formas de proteína de fusão são: L2E7, como descrito no WO 96/26277 e proteína D(l/3)-E7 descrita em GB 971953.5 (PCT/EP98/05285).
Uma composição profilática ou terapêutica de infecção ou câncer cervical HPV preferida pode compreender antígenos de HPV 16 OU
18. Por exemplo, monômeros de antígeno LI ou L2, ou antígenos de LI ou L2, apresentados juntos como uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou a proteína LI sozinha, apresentada em uma estrutura VLP ou capsômero. Tais antígenos, partículas semelhantes a vírus e capsômeros são por si conhecidos. Vide, por exemplo, WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05791 e WO 93/02184.
Proteínas antigas adicionais podem ser incluídas sozinhas ou como proteínas de fusão, tais como E7, E2 ou preferivelmente E5, por exemplo; formas de realização particularmente preferidas destas incluem uma VLP compreendendo proteínas de fusão L1E7 (WO 96/11272).
Em uma forma de realização, os antígenos de HPV 16 compreendem as proteínas antigas E6 ou E7 em fusão com um veículo de proteína D, para formar as fusões da Proteína D - E6 ou E7 de HPV 16, ou suas combinações; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96/16277).
Altemativamente, as proteínas antigas de HPV 16 ou 18 E6 e E7 podem ser apresentadas em uma única molécula, preferivelmente uma fusão de Proteína D- E6/E7. Uma tal composição pode opcionalmente conter uma ou outra ou ambas proteínas E6 e E7 de HPV 18, preferivelmente na forma de uma proteína de fusão de Proteína D - E6 ou Proteína D-E7 ou
62> Τ' proteína de fusão de Proteína D E6/E7.
A composição da presente invenção pode adicionalmente compreender antígenos de outros tipos HPV, preferivelmente de HPV 31 ou 33.
Os tipos de HPV oncogênicos incluem HPV 31, 33, 35, 39, 45,
51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. Assim, a composição da presente invenção pode compreender antígenos de um ou mais destes tipos de HPV, além de HPV 16 e/ou HPV 18.
VLPs HPV LI ou capsômeros, úteis na invenção, podem compreender ou consistir de LI de comprimento total ou um fragmento imunogênico de Ll. Onde VLP ou capsômero compreender ou consistir de um fragmento imunogênico de L1, então fragmentos imunogênicos adequados de HPV Ll incluem truncagens, deleções, substituição ou mutantes de inserção de Ll. Tais fragmentos imunogênicos são adequadamente capazes de suscitar uma resposta imune, dita resposta imune sendo capaz de reconhecer uma proteína Ll, tal como uma partícula semelhante a vírus, do tipo HPV de que a proteína Ll foi derivada.
Fragmentos de Ll imunogênicos adequados incluem proteínas Ll truncadas. Em um aspecto, a truncagem remove um sinal de localização nuclear. Em outro aspecto, a truncagem é uma truncagem de terminal C. Em um outro aspecto, a truncagem do terminal C remove menos do que 50 aminoácidos, tal como menos do que 40 aminoácidos. Onde a Ll for de HPV 16, então em outro aspecto a truncagem do terminal C remove 34 aminoácidos da Ll HPV 16. Onde a Ll for de HPV 18, então em um outro aspecto a truncagem do terminal C remove 35 aminoácidos da Ll HPV 18.
As seqüências de Ll de HPV 16 e 18 truncadas são dadas no WO 06/114312. A seqüência de HPV 16 podem também ser aquela descritas em WO 9405792 ou US6649167, por exemplo, adequadamente truncadas. Truncagens adequadas são truncadas em uma posição equivalente àquela ôli
examinada acima, como avaliado pela comparação de seqüência.
Uma seqüência de HPV 18 alternativa é descrita em WO 9629413, que pode ser adequadamente truncada. Truncagens adequadas são truncadas em um posição equivalente àquela descrita cima, como avaliado 5 pela comparação de seqüência.
Outras seqüências de HPV 16 e HPV 18 são bem conhecidas na arte e podem ser adequadas para uso na presente invenção.
Onde houver uma proteína LI de outro tipo de HPV, então as truncagens de terminal C, correspondentes àquelas feitas para HPV 16 e HPV 10 18, podem ser usadas com base nos alinhamentos de DNA ou seqüência de proteína. Truncagens adequadas de proteínas LI de HPV 31 e 45 são dadas em WO 06/114312.
í Truncagens adequadas de, por exemplo, HPV 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68 podem também ser feitas, em um aspecto 15 removendo-se as porções de terminal C equivalentes da proteína LI daquelas descritas acima, como avaliado pelo alinhamento de seqüência.
A proteína LI ou fragmento imunogênico da invenção pode opcionalmente ser na forma de uma proteína de fusão, tal como a fusão da proteína LI com L2 ou uma proteína antiga.
A proteína LI HPV é adequadamente na forma de um capsômero ou partícula semelhante a vírus (VLP). Em um aspecto, as VLPs HVP podem ser usadas na presente invenção. As VLPs de HPV e métodos para a produção de VLPs são bem conhecidos na arte. As VLPs tipicamente são construídas das proteínas estruturais LI e, opcionalmente, L2 do vírus, vide, por exemplo, WO 9420137, US5985610, W09611272, US6599508B1, US6361778B1, EP 595935. Qualquer VLP de HPV adequada pode ser usada na presente invenção, o que provê proteção cruzada, tal como uma VLP LI ou LI +L2.
Adequadamente, a VLP é uma VLP somente de LI.
6-Ó
A composição da invenção pode conter uma combinação de VLPs de LI HPV 16 e VLPs de LI HPV 18, ou uma combinação de VLPs LI HPV 16, 18, 31 e 45 ou combinações maiores e inclui VLPs LI de HPV 16 e 18 ou HPV 16, 18, 31 e 45, ou combinações maiores, em que a LI é opcionalmente truncada como aqui descrito.
Em uma forma de realização particular da invenção, um ou mais antígenos adicionais de tipos de HPV causando câncer são usados com antígenos de HPV 16 e/ou 18, os antígenos sendo selecionados dos seguintes tipos de HPV: hpv 31, 45, 33, 58 e 52. Como aqui descrito, o antígeno pode, 10 em cada caso, ser Ll, por exemplo, na forma de VLPs ou capsômeros de Ll.
Assim, antígenos de HPV para uso nas composições, métodos e usos aqui descritos podem compreender ou consistir de VLPs ou capsômeros de Ll de HPV 16, 18, 31, 45, 33, 58 e 52. Os VLPs Ll podem ser VLPs somente de Ll ou em combinação com outro antígeno, tal como L2 em VLPs Ll + L2. A proteína Ll pode adequadamente ser truncada como aqui descrito.
A formação de VLP pode ser avaliada por técnicas padrão, tais como, por exemplo, microscopia eletrônica e dispersão de luz leiser dinâmica.
A VLP pode compreender proteína Ll de comprimento total.
Em um aspecto, a proteína Ll usada para formar a VLP é uma proteína Ll truncada, como descrito acima.
As VLPs podem ser produzidas em qualquer substrato celular adequado, tal como células de levedura ou células de inseto, p. ex., em um sistema de expressão de baculovírus e as técnicas para preparação de VLPs são bem conhecidas na arte, tais como WO 9913056, US 6416945B1, US 25 6261765B1 e US6245568 e referências ali, o inteiro conteúdo dos quais são por este meio incorporados por referência. As VLPs podem ser produzidas por técnicas de desmontagem e remontagem, que podem fornecer VLPs de papilomavírus mais estáveis e homogêneas. Por exemplo, McCarthy et al. 1998 Quantitative Disassembly and Reassembly of Papillomavirus humano
6G
Type 11 Vírus like Particles in Vitro J. Virology 72(1): 33-41, descreve a desmontagem e remontagem de VLPs HPV 11 LI purificadas de células de insetos, a fim de obter-se uma preparação homogênea de VLP’s. WO 9913056 e US6245568 também descrevem processos de desmontagem / remontagem para produzir VLPs de HPV.
Em um aspecto as VLPs HPV são produzidas como descrito em WO 9913056 ou US6245568.
As composições da presente invenção podem compreender antígenos ou preparações antigênicas derivadas de parasitas que causam a
Malária, tais como Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. Por exemplo, antígenos possíveis, derivados de Plasmodium falciparum incluem proteína circunsporozoíta (proteína CS), RTS,S MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMAI e TRAP. RTS é uma proteína híbrida, compreendendo substancialmente toda a porção de terminal-C da proteína circunsporozoíta (CS) de P.falciparum ligada via quatro aminoácidos da porção preS2 do antígeno de superfície da Hepatite B ao antígeno de superfície (S) do vírus da hepatite B. Sua estrutura total é descrita no Pedido de Patente Internacional No. PCI7EP92/02591, publicado sob o Número WO 93/10152, reivindicando prioridade do pedido de patente UK No. 9124390.7. Quando expresso em
RTS de levedura, é produzida como uma partícula de lipoproteína e, quando é co-expressa com o antígeno S de HBV, ela produz uma partícula mista conhecida como RTS,S. Os antígenos TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional No. PCT/GB89/00895, publicado sob WO 90/01496. Uma forma de realização preferida da presente invenção é uma vacina de
Malária, em que a preparação antigênica compreende uma combinação dos antígenos RTS,S e TRAP. Outros antígenos de plasmódios que são igualmente candidatos a serem componentes de uma vacina da Malária de multiestágios são P. faciparum MSP1, AMAI, MSP3, EB A, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl,
Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsló, Pfs48/45, Pfs230 e seus análogos de Plasmodium spp. Uma forma de realização da presente invenção é um composição compreendendo proteína RTS, S ou CS ou um seu fragmento, tal como a parte de CS de RTS, S em combinação com um ou mais de outros 5 antígenos maláricos, que podem ser selecionados, exemplo, do grupo consistindo de MSP1, MSP3, AMAI, LSA1 ou LSA3. Possíveis antígenos de P vivax incluem proteína circunsporozoíta (proteína CS) e proteína de ligação de antígeno de Duffy e seus fragmentos, tais como PvRII (vide WO 02/12292).
Outros possíveis antígenos que podem ser usados nas composições imunogênicas da presente invenção incluem:
antígenos estreptocócicos, tais como antígenos de Estreptococos do Grupo A ou Estreptococos do Grupo B são adequadamente derivados de HIV-1 (tal como antígeno F4 ou seus fragmentos ou gag ou seus 15 fragmentos, tais como p24, tat, nef, gpl20 ou gpl60 ou fragmentos de qualquer um destes), vírus do herpes humano, tais como gD ou seus derivados ou proteína Antiga Imediata, tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ((esp. Humano) (tal como gB ou seus derivados), Rotavírus (incluindo vírus atenuados vivos), vírus Epstein Barr (tais como gp350 ou 20 seus derivados), Vírus Varicella Zoster (tal como gpl, II e IE63) ou de um vírus da hepatite, tal como vírus da hepatite B (por exemplo, antígeno de Superfície da Hepatite B ou um seu derivado), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E ou de outros patógenos virais, tais como paramixovírus: vírus Sinciciais Respiratórios (tais como proteínas F, N e G ou 25 seus derivados), vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da cachumba, vírus do papiloma humano (por exemplo, HPV6, 11, 16, 18), fíavivírus (p. ex., Vírus da Febre Amarela, Vírus da Dengue, vírus da encefalite transmitida por carrapato, Vírus da Encefalite Japonesa) ou vírus influenza (vírus integral vivo ou inativado, vírus influenza dividido, cultivado em ovos ou células
MDCK, ou virossomas da flu integrais (como descritos por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 - 920) ou suas proteínas purificadas ou recombinantes, tais como proteínas HA, NP, NA ou M, ou suas combinações), ou derivados de patógenos bacterianos, tais como Neisseria spp, including N. gonorrhea e N. meningitidis (por exemplo sacarídeos capsulares e seus conjugados, proteínas de ligação de transferrina, proteínas de ligação da lactoferrina, PilC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo proteínas M ou seus fragmentos, C5A protease, ácidos lipoteicóicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyl; Moraxella spp, incluindo M catarrhalis, 10 também conhecido como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de elevado e baixo peso molecular); Bordetella spp, including B. pertussis (por exemplo pertactina, toxina pertussis ou seus derivados, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fimbrias), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., including M. tuberculosis (por exemplo 15 ESAT6, Antígeno 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M.
paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo enterotoxic E. coli (por exemplo, fatores de colonização, toxina instável ao calor ou seus derivados), E. coli enterohemorrágico, E. coli enteropatogênico (por exemplo, toxina semelhante a 20 toxina Shiga ou seus derivados); Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo, toxina da cólera ou seus derivados); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexneiril; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo, uma proteína Yop), Y pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo, toxinas, adesinas e 25 invasinas) e C. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S.
choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo urease, catalase, toxina de vacuolização); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E.
faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo toxina do tétano e seus derivados), C. botulinum (por exemplo toxina botulínica e seu derivado), C. difficile (por exemplo toxinas de clostrídio A ou B e seus derivados); Bacillus spp., incluindo S. anthracis (por exemplo, 5 toxina botulínica e seus derivados); Corynebacterium spp., incluindo C.
diphtheriae (por exemplo toxina da difteria e seus derivados); Borrelia spp., incluindo S. burgdorferi (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, 10 DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente do Erliquiose Granulocítica Humana; Rickettsia spp, incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo MOMP, proteínas de ligação da heparina), C. pneumoniae (por exemplo MOMP, proteínas de ligação da heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema 15 spp., incluindo T. pallidum (por exemplo as proteínas da membrana externa raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou derivados de parasitas tais como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp., incluindo 20 T. cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L.
major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo
T. vaginalis; Schisostoma spp., incluindo 5. mansoni, ou derivados de levedura, tais como Candida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.
Outros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis são, por exemplo, Tb Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCCl (WO 99/51748), Mtb72F e M72. As proteínas para
M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e suas variantes, onde, pelo menos dois, preferivelmente três polipeptídeos de M. tuberculosis são r
fundidos em uma proteína maior. Fusões preferidas incluem Ral2-TbH9Ra35, Erdl4-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erdl4-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748). Uma seqüência de Ral2-Tbh9-Ra35 particular que pode ser 5 mencionada é definida pela SEQ ID No. 6 de WO 2006/117240, junto com variantes em que Ser 704 daquela seqüência é mutado para outra que não serina, p. ex., para Ala e seus derivados incorporando um terminal-N His tag de um apropriado comprimento (p. ex., SEQ ID No 2 ou 4 de WO 2006/117240).
Antígenos exemplificativos para Chlamydia sp p. ex. C trachomatisare selecionada de CT858, CT 089, CT875, MOMP, CT622, PmpD, PmpG e seus fragmentos, SWIB e fragmentos imunogênicos de qualquer um deles (tais como PmpDpd e PmpGpd) e suas combinações.
Combinações preferidas de antígenos incluem CT858, CT089 e CT875. Seqüências específicas e combinações que podem ser empregadas são descritas em WO 2006/104890. Composições bacterianas preferidas compreendem antígenos derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo PRP e seus conjugados), non typeable H. influenzae, por exemplo OMP26, adesinas de elevado peso molecular, P5, P6, proteína D e lipoproteína D, e fimbrina e peptídeos derivados de fimbrina (US
5.843.464) ou variantes de múltiplas cópias ou suas proteínas de fusão.
Os derivados do antígeno de Superfície da Hepatite B são bem conhecidos na arte e incluem, inter alia, aqueles antígenos S PreSl, PreS2 expostos, descritos nos pedidos de Patente Européia EP-A- 414 374; EP-A25 0304 578, e EP 198-474. Em um aspecto preferido a formulação de vacina da invenção compreende o antígeno HIV-1, gpl20, especialmente quando expresso em células CHO. Em uma outra forma de realização, a composição da invenção compreende gD2t como aqui antes definido.
As composições podem também conter um antígeno antir tumor e ser úteis para o tratamento imunoterapêutico de cânceres. Por exemplo, o antígeno pode ser um antígeno de rejeição de tumor, tais como aqueles para cânceres de próstata, mama, colo-retal, pulmão, pancreático, renal ou de melanoma. Antígenos exemplificativos incluem MAGE 1, 3 e 5 MAGE 4 ou outros antígenos MAGE, tais como descritos em WO 99/40188, PRAME, BAGE, Lage (também conhecido como NY Eos 1) SAGE e HAGE (WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., Intemational Journal of Clinicai & Laboratory Research (submetido 1997); Correale et al. (1997), 10 Journal of the National Cancer Institute 89, p 293. Na verdade, estes antígenos são expressos em uma larga faixa de tipos de tumor, tais como melanoma, carcinoma de pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga.
Os antígenos MAGE para uso na presente invenção podem ser expressos como uma proteína de fusão com um intensificador de expressão ou 15 um parceiro de fusão imunológico. Em particular, a proteína Mage pode ser fundida à Proteína D do Heamophilus influenzae B ou um seu derivado lipidado. Em particular, o parceiro de fusão pode compreender o primeiro 1/3 da Proteína D. Tais construções são descritas no WO 99/40188.
Outros antígenos específicos de tumor incluem mas não são limitados a gangliosídeos específicos de tumor KSA (GA733), tais como GM2 e GM3 ou seus conjugados para proteínas veículo; ou dito antígeno pode ser um hormônio do peptídeo self, tal como o hormônio de liberação do hormônio da Gonadotrofina de comprimento total (GnRH, WO 95/20600), um peptídeo curto com o comprimento de 10 aminoácidos, útil no tratamento de muitos cânceres ou em imunocastração.
Em uma forma de realização preferida, são utilizados antígenos, tais como antígeno específico da Próstata (PS A), PAP, PS CA (PNAS 95(4) 1735 -1740 1998), PSMA ou antígeno conhecido como Prostase.
Prostase é uma protease de serina específica da próstata (semelhante à tripsina), com o comprimento de 254 aminoácidos, com uma tríade catalítica de serina protease conservada H-D-S e uma seqüência de prépropeptídeo de terminal amino, indicando uma função secretóría potencial (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, ‘'Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, da Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Um sítio de glicosilação putativa foi descrito. A estrutura predita é muito similar a outras serina proteases conhecidas, mostrando que o polipeptídeo maduro dobra-se em um único domínio. A proteína madura tem o comprimento de 224 aminoácidos, com um epítopo A2 mostrado ser naturalmente processado.
A seqüência do nucleotídeo de prostase e a seqüência de polipeptídeo deduzida e homólogos são descritos em Ferguson, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) e nos Pedidos de Patente Internacionais Nos. WO 98/12302 (e também a patente concedida correspondente US 5.955.306), WO 98/20117 (e também as patentes concedidas correspondentes US 5.840.871 e US 5.786.148) (calicreína específica da próstata) e WO 00/04149 (P703P).
A presente invenção fornece composições compreendendo fusões de proteína da próstata, baseadas em proteína e fragmentos de prostase e seus homólogos (“derivados”). Tais derivados são adequados para uso em formulações de vacina terapêutica, que são adequadas para o tratamento de tumores da próstata. Tipicamente, o fragmento conterá pelo menos 20, preferivelmente 50, mais preferivelmente 100 aminoácidos contíguos, como descrito na patente e pedidos de patente referenciados.
Um outro antígeno da próstata preferido é conhecido como P501S, seqüência ID no. 113 de WO 98/37814. Fragmentos imunogênicos e suas partes compreendendo pelo menos 20, preferivelmente 50,mais r preferivelmente 100 aminoácidos contíguos, como descrito no pedido de patente acima referenciado. Vide, por exemplo, PS 108 (WO 98/50567).
Outros antígenos específicos da próstata são conhecidos pelos WO 98/37418 e WO /004149. Outro é STEAP PNAS 96 14523 14528 7 -12 1999.
Outros antígenos associados com tumor, úteis no contexto da presente invenção, incluem: Plu-1 J Biol. Chem 274 (22) 15633 -15645, 1999, HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21 61-70, Patente
U.S. 5654140) Criptin Patente U.S. 5 981 215. Adicionalmente, antígenos particularmente importantes para a terapia do câncer também compreendem tirosinase e survivina.
Peptídeos derivados de mucina, tais como Mucl, vide, por exemplo, US 5827, 666 WO 8805054, US 4.963.484. Especificamente contemplados são peptídeos derivados de Muc 1, que compreendem pelo menos uma unidade repetidora do peptídeo Muc 1, preferivelmente pelo menos duas de tais repetições em que é reconhecido pelo anticorpo SM3 (US 6 054 438). Outros peptídeos derivados de mucina incluem peptídeo de Muc
5.
O antígeno da invenção pode ser um antígeno de câncer de mama, tal como her 2/ Neu, mamaglobiria (Patente U.S. No. 5668267) ou aqueles descritos no WO/ 00 52165, WO 99/33869, WO 99/19479, WO 98/45328. Antígenos Her 2 neu são descritos, inter alia, na Patente U.S. No. 5.801.005. Preferivelmente, Her 2 neu compreende o inteiro domínio extracelular (compreendendo aproximadamente 1 - 645 aminoácidos) ou seus fragmentos e pelo menos uma porção imunogênica do ou do inteiro domínio intracelular, aproximadamente os 580 aminoácidos do terminal C. Em particular, a parte intracelular deve compreender o domínio de fosforilação ou seus fragmentos. Tais construções são descritas no WO 00/44899. Uma construção particularmente preferida é conhecida como ECD PD, uma
segunda é conhecida como ECD PD, vide WO/OO/44899. O her 2 neu, como aqui usado, pode ser derivado de rato, camundongo ou humano.
As composições podem conter antígenos associados com mecanismos de suporte de tumor (p. ex., angiogênese, invasão tumoral) por exemplo tie 2, VEGF.
É previsto que as composições da presente invenção podem utilizar antígenos derivados de Borrelia sp., por exemplo, os antígenos podem incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno ou preparações antigênicas, proteína ou peptídeos recombinantemente produzidos e proteínas de fusão quimérica. Em particular, o antígeno é OspA. O OspA pode ser uma proteína totalmente madura em uma forma lipidada em virtude da célula hospedeira (E. Coli) denominada (Lipo-OspA) ou um derivado não lapidado. Tais derivados não-lipídios incluem a proteína de fusão NSl-OspA nãolipidada, que tem os primeiros 81 aminoácidos de terminal-N da proteína nãoestrutural (NS1) do vírus influenza, e a proteína OspA completa e outra MDPOspA é uma forma não-lapidada de OspA contendo 3 aminoácidos de terminal-N adicionais.
As composições da presente invenção podem ser usadas para a profilaxia ou terapia da alergia. Tais vacinas compreenderíam antígenos específicos de alérgeno (por exemplo, Der pl) e não específicos de alérgeno (por exemplo, peptídeos derivados de IgE humano, incluindo mas não limitado ao decapeptídeos stanworth (EP 0 477 231 Bl)).
As composições da presente invenção podem também ser usadas para a profilaxia ou terapia de distúrbios crônicos que não alergia, câncer ou doenças infecciosas. Tais distúrbios crônicos são doenças tais como aterosclerose e Alzheimer.
As composições da presente invenção são particularmente adequadas para o tratamento imunoterapêutico de doenças, tais como condições crônicas e cânceres, porém também para a terapia de infecções & % persistentes. Portanto, as composições da presente invenção são particularmente adequadas para a imunoterapia de doenças infecciosas, tais como Tuberculosis (TB), AIDS e infecções do vírus da Hepatite B (HepB).
Também no contexto da AIDS, é provido um método de tratamento de um indivíduo susceptível a ou sofrendo de AIDS. O método compreendendo a administração de uma vacina da presente invenção ao indivíduo, desse modo reduzindo a quantidade de declínio de célula T CD4+ causado por subseqüente infecção por HIV, ou diminuição ou parada do declínio da célula-T CD4+ em um indivíduo já infectado com HIV.
Outros antígenos incluem sacarídeos bacterianos (preferivelmente capsulares) que não (ou além de) aqueles antígenos pneumocócicos descritos acima. Os antígenos de polissacarídeo são convenientemente armazenados em massa líquida adsorvida em fosfato de alumínio - é portanto fácil de compreender gerar composições de vacina da invenção misturando-se dita massa líquida com o adjuvante da invenção extemporaneamente. Preferivelmente, os outros sacarídeos bacterianos são selecionados de um grupo consistindo de: sacarina capsular do sorogrupo A de V meningitidis (MenA), sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY), sacarídeo capsular do sorogrupo W-135 (MenW), sacarídeo capsular do grupo I de Estreptococos Grupo B, sacarídeo capsular do grupo II de Estreptococos Grupo B, sacarídeo capsular do grupo III de Estreptococos Grupo B, sacarídeo capsular do grupo IV de Estreptococos Grupo B, sacarídeo capsular do grupo V de Estreptococos Grupo B, sacarídeo capsular do tipo 5 de Staphylococcus aureus, sacarídeo capsular do tipo 8 de Staphylococcus aureus, sacarídeo Vi de Salmonella typhi, N. meningitidis LPS, M. catarrhalis LPS, e H. influenzae LPS. Por LPS pretendemos significar lipo-polissacarídeos nativos (ou lipo-oligossacarídeo) ou lipopolissacarídeo em que a parte do lipídeo A foi desintoxicada por qualquer um de numerosos métodos conhecidos (vide, por exemplo, WO 97/18837 ou WO 98/33923), ou qualquer molécula compreendendo o O-polissacarídeo derivado de dito LPS. Por N. meningitidis LPS pretendemos significar um ou mais dos 12 imunótipos conhecidos (Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lll ouL12).
Combinações particularmente preferidas são composições compreendendo: 1) Hib conjugado, MenA conjugado e MenC conjugado; 2) Hib conjugado, MenY conjugado e MenC conjugado; 3) Hib conjugado e MenC conjugado; e 4) MenA conjugado, MenC conjugado, MenY conjugado e MenW-135 conjugado. A quantidade de PS em cada um dos conjugados acima pode ser de 5 ou 10 Dg cada um por 0,5 ml de dose humana. Preferivelmente, Hib, MenA, MenC, MenW-135 e MenY são conjugados TT.
Um problema associado com a abordagem de polissacarídeo para vacinação é o fato de que os polissacarídeos sozinhos são imunogenes fracos. Para superara isto, os sacarídeos da invenção podem ser conjugados com portadores de proteína, que fornecem auxílio de célula-T expectadora. Prefere-se, portanto, que os sacarídeos utilizados na invenção sejam ligados a um tal veículo de proteína. Exemplos de tais veículos ou portadores que são atualmente comumente usados para a produção de imunogenes de sacarideo incluem toxóides da Difteria e Tétano (DT, DT CRM197 e TT, respectivamente), Hemocianina Lapa Buraco de Fechadura, proteína D de Haemophilus influenzae (EP 594610-B), OMPC de N. meningitidis, e o derivado da proteína purificada de Tuberculina (PPD).
O sacarideo pode ser ligado à proteína veículo por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S. No. 4.372.945 e por Armor et al., Patente U.S. 4.474.757). Preferivelmente, a conjugação CDAP é realizada (WO 95/08348).
Preferivelmente, a relação de proteína: sacarideo (peso: peso) dos conjugados é de 0,3: 1 a 1: 1, mais preferivelmente de 0,6: 1 a 0,8: 1 e, muitíssimo preferivelmente, cerca de 0,7: 1.
Combinações de antígenos que fornecem proteção contra pneumococos e um diferente patógeno são incluídos na presente invenção. Muitas vacinas pediátricas são agora dadas como uma vacina de combinação, a fim de reduzir o número de injeções que uma criança tem que receber. Assim, para vacinas pediátricas, outros antígenos de outros patógenos podem ser formulados com as vacinas pneumocócicas da invenção. Por exemplo, as vacinas da invenção podem ser formuladas com (ou administradas separadamente, porém ao mesmo tempo) a bem conhecida vacina de combinação ‘trivalente”, compreendendo toxóide da Difteria (DT), toxóide do tétano (TT) e componentes pertussis [tipicamente toxóide Pertussis (PT) desintoxicados e hemaglutinina fílamentosa (FHA) com pertactina (PRN) opcional e/ou aglutinina 1+2], por exemplo, a vacina comercializada INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), que contém antígenos DT, TT, PT, FHA e PRN, ou com um componente pertussis de célula integral, por exemplo, como comercializado por SmithKlineBeecham Biologicals s.a., como Tritanrix . A vacina combinada pode também compreender outro antígeno, tal como antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg), antígenos do vírus da pólio (por exemplo, vírus da pólio trivalente inativado - IPV), proteínas externas de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenzae não tipificáveis, proteínas da membrana externa de
N. memingitidis B.
Exemplos de antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis preferidos, que podem ser incluídos na vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) são: ΘΜΡ106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA &/ou LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA &/ou TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010]; UspAl e /ou UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); ΟΜΡ85 (PCT/EPOO/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo 10 (GB 9918208.1); lipoll (GB 9918302.2); lipol8 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplAl (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); e OmpE. Exemplos de antígenos de antígenos Haemophilus influenzae não tipificáveis, que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) incluem: proteína Fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões compreendendo peptídeos dela [por exemplo, fusões de peptídeo LB1 (f); US 5843464 (OSU) ou WO 99/64067] OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA e /ou TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); proteína D (EP 594610); P2; e P5 (WO 94/26304).
Outras combinações contempladas são o sacarideo & proteína pneumocócicas da invenção, em combinação com antígenos virais, por exemplo, de influenza (atenuado, dividido ou subunitário [p. ex., neuraminidase (NA) de glicoproteínas de superfície e hemaglutinina (HA). Vide, p. ex., Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121-127], RSV (p. ex., antígenos F e G ou fusões F/G fusions, vide, p. ex., Schmidt A. C. et al, J Virol, Maio 2001, p 4594-4603), PIV3 (p. ex., proteínas HN e F, vide Schmidt et al. supra), Varicella (p. ex., glicoproteínas atenuadas I-V, etc.), e qualquer (ou todos) os componente(s) of MMR (sarampo, cachumba, rubéola).
Uma vacina de combinação pediátrica preferida, contemplada pela presente invenção para tratamento global ou prevenção de otite média, compreende: um ou mais antígeno(s) de sacarideo de Streptococcus pneumoniae (preferivelmente conjugado(s) com proteína D), uma ou mais proteínas pneumocócicas (preferivelmente aquelas descritas acima) e um ou mais antígeno(s) expostos-superfície de Moraxella catarrhalis e/ou Haemophilus influenzae não tipificáveis. A proteína D pode vantajosamente
ser usada como um veículo de proteína para os sacarídeos pneumocócicos (como mencionado acima) e por ser por si mesmo um imunogene capaz de produzir proteção mediada por célula B contra H influenzae não tipifícável (ntHi). Os antígenos de Moraxella catarrhalis ou Haemophilus influenzae 5 não-tipificáveis podem ser incluídos na vacina em uma forma sub-unitária ou podem ser adicionados como antígenos presentes na superfície de vesículas de membrana externa (blebs) produzidas das bactérias.
Propriedades imunogênicas da composição imunogênica usada para a vacinação da presente invenção
Na presente invenção, a composição imunogênica é preferivelmente capaz de induzir uma melhorada resposta imune de célula-T CD4 contra pelo menos um do(s) antígeno(s) componente(s) ou composição antigênica, em comparação com a resposta imune de célula-T CD4 obtida com a correspondente composição que não é auxiliada, isto é, não contém 15 qualquer adjuvante exógeno (aqui também referida como ‘composição simples’). Em uma forma de realização específica, onde a composição imunogênica é uma composição de influenza e onde a preparação de vacina de influenza é de diversas cepas de influenza, uma das quais sendo uma cepa pandêmica, dita resposta imune de célula-T CD4 melhorada é contra a cepa 20 de influenza pandêmica.
Por “resposta imune de célula-T CD4 melhorada” pretendemos significar que uma resposta CD4 mais elevada é obtida em um mamífero após administração da composição imunogênica auxiliada do que aquela obtida após administração da mesma composição sem adjuvante. Por exemplo, uma 25 resposta de célula-T CD4 mais elevada é obtida em um paciente humano na administração de uma composição imunogênica compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, junto com o adjuvante de acordo com a presente invenção, em comparação com a resposta induzida após administração de uma composição imunogênica compreendendo um vírus
influenza ou sua preparação antigênica, que contém adjuvante. Tal formulação será usualmente usado para induzir resposta de célula-T CD4 antiinfluenza, capaz da detecção de epítopos de influenza apresentados por moléculas MHC classe II.
Em particular, porém não exclusivamente, dita ‘resposta imune de célula-T CD4 melhorada’ é obtida em um paciente não imunologicamente imprimado, isto é, um paciente que é soronegativo para dito vírus ou antígeno influenza. Esta soronegatividade pode ser o resultado de dito paciente ter nunca enfrentado tal vírus ou antígeno (chamado paciente “não afetado”) ou, altemativamente, tendo deixado de responder a dito antígeno uma vez encontrado. Em um aspecto específico, dita resposta imune de célula-T CD4 é obtida em um indivíduo imunocomprometido, tal como um idoso, tipicamente com 65 anos de idade ou acima, ou um adulto mais jovem do que 65 anos de idade, com um alto risco de condição médica (adulto de ‘alto risco’) ou uma criança sob a idade de dois anos.
A resposta imune de célula-T CD4 melhorada pode ser avaliada medindo-se o número de células produzindo qualquer uma das seguintes citocinas:
• células produzindo pelo menos duas diferentes citocinas (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa) • células produzindo pelo menos CD40L e outra citocina (IL-2, TNFa, IFNy) • células produzindo pelo menos IL-2 e outra citocina (CD40L, TNFa, IFNy) • células produzindo pelo menos IFNy e outra citocina (IL2, TNFa, CD40L) • células produzindo pelo menos TNFa e outra citocina (IL-
2, CD40L, IFNy)
A resposta imune de célula-T CD4 será melhorada quando as células produzindo qualquer uma das citocinas acima esteja em uma quantidade maior em seguida à administração da composição com adjuvante, em comparação com a administração da composição sem-adjuvante. Tipicamente, pelo menos uma, preferivelmente duas das cinco condições mencionadas aqui acima será(ão) satisfeita(s). Em uma forma de realização particular, as células produzindo todas quatro citocinas estarão presentes em uma quantidade maior no grupo com adjuvante, em comparação com o grupo sem-adjuvante.
A resposta imune de célula-T CD4 melhorada, conferida por uma composição de influenza com adjuvante da presente invenção, pode ser idealmente obtida após uma única administração. A abordagem de única dose será extremamente importante, por exemplo, em uma situação de surto evoluindo rapidamente. Em certas circunstâncias, especialmente para a população idosa ou no caso de crianças jovens (abaixo de 9 anos de idade) que são vacinadas pela primeira vez contra influenza ou no caso de uma pandemia, pode ser benéfico administrar duas doses da mesma composição para aquela estação. A segunda dose de dita mesma composição (ainda considerada como ‘composição para primeira vacinação’) pode ser administrada durante a resposta imune primária atualmente ocorrendo e é adequadamente espaçada. Tipicamente, a segunda dose da composição é dada algumas semanas ou cerca de um mês, p. ex., 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas ou 6 semanas após a primeira dose, para ajudar a iniciar o sistema imune em indivíduos não-responsivos ou fracamente-responsivos.
Em outra forma de realização, a administração de dita composição imunogênica induz uma melhorada resposta de célula de memória-B, em pacientes administrados com a composição imunogênica com adjuvante, em comparação com a resposta de célula de memória-B induzida em indivíduos imunizados com a composição sem adjuvante. Uma resposta de célula de memória-B melhorada pretende-se significar uma aumentada
freqüência de linfócitos B de sangue periféricos, capazes de diferenciação em células de plasma secretando anticorpo no encontro de antígeno, conforme medido por estimulação de diferenciação in vitro.
Em outra forma de realização, a administração de dita composição imunogênica induz uma melhorada resposta humoral em pacientes administrados com a composição imunogênica com adjuvante, em comparação com a resposta humoral induzida em indivíduos imunizados com a composição sem adjuvante. Dita resposta imune humoral pode ser medida de acordo com qualquer um dos procedimentos detalhados no Exemplo I e especialmente nas seções 1.1 (1.1.1), 1.2 (1.2.1) e 1.3 (I.3.5.2). Quando a composição imunogênica é uma composição de influenza, especificamente dita resposta humoral é obtida contra cepas homólogas e heterólogas. Em particular, dita resposta imune humoral heteróloga significa uma resposta humoral entre cepas de influenza e é denominada resposta imune humoral de “reação cruzada”. Dita resposta imune humoral de “reação cruzada’ envolve a indução de resposta contra uma cepa influenza que é uma variante (um desvio) da cepa influenza usada para vacinação. Um exemplo de tal resposta é ilustrado no Exemplo III.3.1 e na Figura 2.
Em uma forma de realização específica, a administração de dita composição imunogênica com adjuvante induz pelo menos duas das seguintes respostas: (i) uma resposta imune de célula-T CD4 melhorada, (ii) uma resposta de célula de memória-B melhorada, (iii) uma resposta humoral melhorada, conta pelo menos um do(s) antígeno(s) componente(s) ou composição antigênica, em comparação com a resposta imune obtida com a correspondente composição que, sem adjuvante, isto é, não contém qualquer adjuvante exógeno (aqui também referido como ‘composição simples’).
Em ainda outra forma de realização específica, a vacinação com a composição para a primeira vacinação, com adjuvante, não tem impacto mensurável na resposta CD8.
É uma forma de realização específica da invenção que a composição compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica, formulada com adjuvante de saponina apresentado na forma de um lipossoma, em particular saponina QS21 em sua forma extinta com colesterol, é eficaz em promover respostas de célula T em uma população humana imunocomprometida. Em uma forma de realização, dito adjuvante compreende ainda 3D-MPL. Em particular, a administração de uma única dose da composição imunogênica para a primeira vacinação como descrito na invenção é capaz de fornecer melhor soro-proteção, como avaliado pelos correlatos de proteção para vacinas de influenza, em seguida a revacinação contra influenza em uma população idosa humana, do que a vacinação com uma vacina de influenza sem adjuvante. A formulação com adjuvante reivindicada foi também capaz de induzir uma melhorada resposta imune de célula-T CD4 contra o vírus influenza, em comparação com aquela obtida com a formulação sem adjuvante. Este achado pode ser associado com uma aumentada responsividade na vacinação ou infecção vis-à-vis exposição antigênica de influenza. Além disso, este pode também ser associado com uma responsividade cruzada, isto é, uma capacidade mais elevada de responder a cepas de influenza variantes. Esta resposta melhorada pode ser especialmente benéfica em uma população humana imuno-comprometida, tal como a população idosa (65 anos de idade e acima) e em particular a população idosa de alto risco. Isto pode resultar na redução da taxa de morbidez e mortalidade total e evitar admissões de emergência em hospital por pneumonia e outras doenças semelhantes a influenza. Isto pode também ser de benefício para a população infantil (abaixo de 5 anos, preferivelmente abaixo de 2 anos de idade). Além disso, pode permitir induzir uma resposta de célula T CD4, que é mais persistente no tempo, p. ex., ainda presente um ano após a primeira vacinação, em comparação com a resposta induzida com a formulação sem adjuvante.
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Em um aspecto específico, a resposta imune de célula-T CD4, tal como a resposta imune de célula T CD4 melhorada obtida em um indivíduo não imprimado, envolve a indução de uma resposta auxiliar CD4 T reativa. Em particular, a quantidade de células CD4 6 de reação cruzada é aumentada. Por resposta de CD4 de ‘reação-cruzada’ pretendemos significar epítopos compartilhados de alvejamento de célula-T CD4 entre cepas de influenza.
Usualmente, as vacinas de influenza disponíveis são eficazes somente contra cepas infectantes de vírus influenza, que têm hemaglutinina de similares características antigênicas. Quando o vírus influenza infectante (circulante) sofreu menores mudanças (tais como uma mutação pontual ou um acúmulo de mutações pontuais resultando em mudanças aminoácidas por exemplo) nas glicoproteínas de superfície, em particular hemaglutinina (cepa de vírus variante de desvio antigênico) a vacina pode ainda fornecer alguma proteção, embora possa somente fornecer proteção limitada, visto que as variantes recentemente criadas podem escapar à imunidade induzida por infecção ou vacinação de influenza anterior. O desvio antigênico é responsável por epidemias anuais que ocorrem durante períodos interpandêmicos (Wiley & Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365 - 394). A indução de células T CD4 de reação cruzada fornece uma vantagem adicional para a composição da invenção, pelo fato de que ela pode prover também proteção cruzada, em outras palavras, proteção contra infecções heterólogas, isto é, infecções causadas por uma cepa de influenza circulante, que é uma variante (p. ex., um desvio) da cepa de influenza contida na composição imunogênica. Isto pode ser vantajoso quando a cepa circulando é de difícil propagação em ovos ou de produzir em cultura de células, tomando o uso de uma cepa desviada uma alternativa de trabalho. Isto pode também ser vantajoso quando o indivíduo recebeu uma primeira e uma segunda vacinação diversos meses ou um ano separados e a cepa de influenza da composição imunogênica usada para uma segunda imunização é uma cepa variante de desvio da cepa usada na composição usada para a primeira vacinação.
A composição imunogênica de influenza com adjuvante, como aqui definida, tem até agora uma mais elevada capacidade de induzir células T CD4 de soro-proteção e reação cruzada em indivíduos idosos vacinados. Esta característica pode ser associada com uma mais elevada capacidade de responder a uma cepa variante da cepa presente na composição imunogênica. Isto pode provar-se ser uma importante vantagem em uma situação pandêmica. Por exemplo, uma composição imunogênica de influenza multivalente, compreendendo qualquer uma de ou diversas cepa(s) H2, H9, H7 ou H6, pode fornecer uma mais elevada capacidade de responder contra uma variante pandêmica, isto é, uma cepa de desvio de dita(s) cepa(s) pandêmica(s), na vacinação subseqüente com ou na infecção por dita cepa de desvio.
Detecção de células-T CD4 de reação cruzada em seguida a vacinação com vacina de influenza
As células T CD4 que são capazes de reconhecer cepas influenza homólogas e desviadas foram citadas no presente documento de “reação cruzada”. As composições de influenza com adjuvante, como aqui descritas, foram capazes de apresentar reatividade cruzada heterosubtípica, uma vez que há reatividade-cruzada observável contra cepas de influenza desviadas. Como dito acima, a capacidade de uma formulação de vacinapandêmica ser eficaz contra cepas pandêmicas desviadas pode provarse ser uma importante característica no caso de pandemias.
Consistentemente com as observações acima, os epítopos de célula-T CD4 compartilhados por diferentes cepas de influenza foram identificados em humanos (Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2): 211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7): 4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12): 7497-506).
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Em uma forma de realização específica, a composição com adjuvante pode oferecer o benefício adicional de prover melhor proteção contra cepas circulantes que tenham sofrido uma mudança maior (tal como recombinação genética, por exemplo, entre duas diferentes espécies) na hemaglutinina (desvio antigênico) contra a qual as vacinas atualmente disponíveis não têm eficácia.
Revacinação e composição usada para revacinação (composição de reforço)
Em uma forma de realização, a invenção provê o uso de um vírus influenza ou sua preparação antigênica na manufatura de uma composição imunogênica para revacinação de humanos anteriormente vacinados com uma composição imunogênica como aqui reivindicado.
Em um aspecto da presente invenção, é provido o uso de um vírus influenza ou sua preparação antigênica de uma primeira cepa de influenza pandêmica, na manufatura de uma composição imunogênica com adjuvante como aqui definido, para proteção contra infecções de influenza causadas por uma cepa de influenza que é uma variante de dita cepa de influenza.
Em outro aspecto, a invenção provê o uso de um cargas vírus influenza ou sua preparação antigênica, na manufatura de uma composição imunogênica de influenza para revacinação de humanos anteriormente vacinados com uma composição de influenza com adjuvante como reivindicado aqui ou com uma composição de influenza com adjuvante, compreendendo uma cepa de influenza, o adjuvante sendo como definido aqui.
Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para vacinar uma população humana ou indivíduo contra uma cepa de vírus influenza, seguido por revacinação de dito humano ou população contra uma cepa de vírus influenza variante, dito método compreendendo administrar a g<f
dito humano (i) uma primeira composição compreendendo um vírus influenza ou sua preparação antigênica de uma primeira cepa de influenza e um adjuvante como aqui definido, e (ii) uma segunda composição imunogênica compreendendo uma variante de cepa do vírus influenza de dita primeira cepa do vírus influenza. Em uma forma de realização específica, dita primeira cepa é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico. Em outra forma de realização específica, dita cepa variante é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico. Em particular, a revacinação é feita com uma composição de influenza compreendendo pelo menos uma cepa que é uma cepa pandêmica circulante. Tanto a composição de iniciação como a composição de reforço podem ser multivalentes, isto é, podem conter pelo menos duas cepas do vírus influenza. Quando a(s) composição(ões) é (são) multivalentes, pelo menos uma cepa é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico.
Tipicamente, a revacinação é feita pelo menos 6 meses após a(s) primeira(s) vacinação(ões), preferivelmente 8 a 14 meses após, mais preferivelmente em tomo de 10 a 12 meses após.
A composição imunogênica para revacinação (a composição de reforço) pode conter qualquer tipo de preparação antigênica, inativada ou viva atenuada. Ela pode conter o mesmo tipo de preparação antigênica, p. ex., um vírus influenza dividido ou sua preparação antigênica, um vírion integral ou uma vacina de HA e NA (sub-unitária) purificada, como a composição imunogênica usada para a primeira vacinação. Altemativamente, a composição de reforço pode conter outro tipo de antígeno de influenza que não aquele usado para a primeira vacinação. Preferivelmente, um vírus dividido é usado. A composição de reforço pode ser com adjuvante ou sem adjuvante. A composição de reforço sem adjuvante pode ser Fluarix /aRix®/lnflusplit® dado intramuscularmente. A formulação contém três antígenos de virion divididos inativados, preparados das cepas recomendadas WHO da apropriada estação de influenza.
A composição de reforço pode ser com adjuvante ou sem adjuvante. Em uma forma de realização específica, a composição de reforço compreende um adjuvante de saponina, que é como definido aqui.
Em uma forma de realização específica, a composição imunogênica para revacinação (também chamada aqui abaixo “composição de reforço”) contém um vírus influenza ou sua preparação antigênica, que compartilha epítopos de célula-T CD4 comuns com o vírus influenza ou sua preparação antigênica usado para a primeira vacinação. Pretende-se que um epítopo de célula T CD4 comum signifique peptídeos/seqüências/epítopos de diferentes antígenos que possam ser reconhecidos pela mesma célula CD4 (vide exemplos de epítopos descritos em: Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2): 211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7): 4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12): 7497-506).
Em uma forma de realização de acordo com a presente invenção, a composição de reforço é uma composição de influenza monovalente, compreendendo uma cepa de influenza que é associada com um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico. Em particular, dita cepa da composição de reforço é uma cepa pandêmica circulante. Cepas adequadas não são limitadas a: H5N1, H9N2, H7N7 e H2N2. Dita cepa pode ser a mesma presente ou uma daquelas presentes composição usada para a primeira vacinação. Em uma forma de realização alternativa, dita cepa pode ser uma cepa variante, isto é, uma cepa de desvio da cepa presente na composição usada para a primeira vacinação.
Em outra forma de realização específica, a composição de reforço é uma vírus influenza multivalente. Em particular, quando a composição de reforço é uma vacina multivalente, tal como uma vacina bivalente, trivalente ou quadrivalente, pelo menos uma cepa é associada com τ um surto pandêmico ou tem o potencial de ser associada com um surto pandêmico. Em uma forma de realização específica, duas ou mais cepas da composição de reforço são cepas pandêmicas. Em outra forma de realização específica, a pelo menos uma cepa pandêmica da composição de reforço é do mesmo tipo daquela presente ou uma daquelas presentes na composição usada para a primeira vacinação. Em uma forma de realização alternativa, a pelo menos uma cepa pode ser uma cepa variante, isto é, uma cepa de desvio, da pelo menos uma cepa pandêmica presente na composição usada para a primeira vacinação. Em particular, a pelo menos uma cepa da composição de reforço é uma cepa pandêmica circulante. A composição de reforço pode ser com adjuvante ou não.
Tipicamente, uma composição de reforço, onde usada, é dada na estação de influenza a seguir, p. ex., aproximadamente um ano após a primeira composição imunogênica. A composição de reforço pode também ser dada cada ano subseqüente (terceira, quarta, quinta vacinação e assim em diante). A composição de reforço pode ser a mesma composição usada para a primeira vacinação. Adequadamente, a composição de reforço contém um vírus influenza ou sua preparação antigênica, que é uma cepa variante do vírus influenza usado para a primeira vacinação. Em particular, as cepas do vírus influenza ou sua preparação antigênica são selecionadas de acordo com o material de referência distribuído pela World Halth Organisation, de modo que elas são adaptadas à cepa de influenza que está circulando no ano da revacinação.
O antígeno influenza ou composição antigênica usada na revacinação preferivelmente compreende um adjuvante, adequadamente como descrito acima. O adjuvante pode ser uma saponina apresentada na forma de um lipossoma, como aqui acima descrito, que é preferida, opcionalmente contendo um adjuvante adicional, tal como 3D-MPL.
Em um aspecto, a revacinação induz qualquer um, r
preferivelmente dois ou todos dos seguintes: (i) uma resposta CD4 melhorada contra o vírus influenza ou sua preparação antigênica ou (ii) uma resposta de memória de célula B melhorada ou (iii) uma resposta humoral melhorada, em comparação com a resposta equivalente induzida após uma primeira vacinação com o vírus influenza sem adjuvante ou sua preparação antigênica. Preferivelmente, a(s) resposta(s) imunológicas induzidas após a revacinação com o vírus influenza com adjuvante ou sua preparação antigênica como aqui definido, é (são) mais elevada(s) do que a correspondente resposta induzida após a revacinação com a composição sem adjuvante. Preferivelmente, as respostas imunológicas induzidas após revacinação com um vírus influenza sem adjuvante, preferivelmente dividido, são mais elevadas na população primeiro vacinada com a composição de influenza com adjuvante, preferivelmente dividida, do que a correspondente resposta na população primeiro vacinada com a composição de influenza sem adjuvante, preferivelmente dividida.
Em uma forma de realização específica, a revacinação dos indivíduos com uma composição de reforço compreendendo um vírus influenza e um adjuvante de saponina na forma de um lipossoma, como definido aqui acima, mostra títulos de anticorpo mais elevados do que os valores correspondentes do grupo de pessoas primeiro vacinadas com a composição sem adjuvante e reforçadas com a composição sem adjuvante. O efeito do adjuvante no aumento da resposta anticorpo à revacinação é especialmente de importância na população idosa que é sabida ter uma baixa resposta à vacinação ou infecção pelo vírus influenza. O benefício associado com a composição com adjuvante foi também marcante em termos de melhoria da resposta da célula-T CD4 em seguida à revacinação.
Especifícamente, a composição com adjuvante da invenção é capaz de induzir uma melhor responsividade cruzada contra cepa desviada (a composição de influenza da próxima estação de influenza), em comparação com a proteção conferida pela vacina de controle. Dita responsividade tem mostrado uma mais elevada persistência em comparação com aquela obtida com a formulação sem adjuvante. O efeito do adjuvante no aumento da responsividade cruzada contra cepa desviada é importante em uma situação pandêmica.
Em uma outra forma de realização a invenção refere-se a um regime de vacinação em que a primeira vacinação é feita com uma composição de influenza, preferivelmente uma composição de influenza dividida, contendo pelo menos uma cepa de influenza que podería potencialmente causar um surto pandêmico e a revacinação é feita com uma cepa circulante, uma cepa pandêmica ou uma cepa clássica.
Epítopo de CD4 em HA
Este desvio antigênico reside principalmente em regiões de epítopo das proteínas de superfície viral hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). É sabido que qualquer diferença nos epítopos de células CD4 e B, entre diferentes cepas de influenza, sendo usados pelo vírus para evadir a resposta adaptativa do sistema imune do hospedeiro, representará um papel principal na vacinação de influenza.
Os epítopos de célula-T CD4 compartilhados pelas diferentes cepas de influenza foram identificados em humano (vide, por exemplo: Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2): 211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7): 4787-90; e Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12): 7497506).
Em uma forma de realização específica, a revacinação é feita utilizando-se uma composição de reforço, que contém um vírus influenza ou sua preparação antigênica, que compartilha os epítopos de célula-T CD4 comuns com o antígeno do vírus influenza ou sua preparação antigênica usado para a primeira vacinação. A invenção assim refere-se ao uso da composição imunogênica compreendendo um vírus influenza pandêmico ou
sua preparação antigênica e uma saponina na forma de um lipossoma, em particular QS21 em sua forma desintoxicada com colesterol, opcionalmente com 3D-MPL, na manufatura de um primeiro componente de vacinação de uma vacina de multi-doses, a dose de multi-doses compreendendo ainda, como uma dose de reforço, um vírus influenza ou sua preparação antigênica, que compartilha epítopos de célula-T CD4 comuns com o antígeno do vírus influenza pandêmico ou sua preparação antigênica da dose dada na primeira vacinação.
Meios de vacinação
As composições imunogênicas da invenção podem ser administradas por qualquer via de suprimento adequada, tal como intradérmica, mucosa, p. ex., intranasal, oral, intramuscular ou subcutânea. Outras vias de suprimento são bem conhecidas na arte.
A via de suprimento intramuscular é preferivelmente para a composição imunogênica com adjuvante.
O suprimento intradérmico é outra via adequada. Qualquer dispositivo adequado pode sr usado para suprimento intradérmico, por exemplo, dispositivos de agulha curta, tais como aqueles descritos nas US 4.886.499, US5.190.521, US 5.328.483, US 5.527.288, US 4.270.537, US 5.015.235, US 5.141.496, US 5.417.662. As vacinas intradérmicas podem também ser administradas por dispositivos que limitam o comprimento de penetração efetiva de uma agulha dentro da pele, tal como aqueles descritos em WO 99/34850 e EP 1092444, incorporados aqui por referência, e seus equivalentes funcionais. Também adequados são dispositivos de injeção a jato, que suprem vacinas líquidas à derme, via um injetor de jato líquido ou via uma agulha que perfura o estrato córneo e produz um jato que alcança a derme. Os dispositivos de injeção por jato são descritos por exemplo nas US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US
92> r
5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520, 639, US 4.596.556US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Também adequados são dispositivos de suprimento de pó/partículas balísticos, que utilizam gás comprimido para acelerar a vacina em forma de pó através das camadas externas da pele até a derme. Adicionalmente, seringas convencionais podem ser usadas no método mantoux clássico de administração intradérmica.
Outra via de administração adequada é a via subcutânea. Qualquer dispositivo adequado pode ser usado para suprimento subcutâneo, por exemplo, agulha clássica. Preferivelmente, um serviço de injetor a jato livre de agulha é usado, tal como aquele publicado no WO 01/05453, WO 01/05452, WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. Mais preferivelmente, dito dispositivo é pré-carregado com a formulação de vacina líquida.
Altemativamente, a vacina é administrada intranasalmente. Tipicamente, a vacina é administrada localmente à área nasofaringeana, preferivelmente sem ser inalada para dentro dos pulmões. É desejável utilizar20 se um dispositivo de suprimento intranasal, que supra a formulação de vacina à área nasofaringeana, sem ou substancialmente sem penetrar nos pulmões.
Os dispositivos preferidos para administração intranasal das vacinas de acordo com a presente invenção são dispositivos de pulverização. Dispositivos de pulverização nasal comercialmente disponíveis adequados incluem Accuspray™ (Becton Dickinson). Os nebulizadores produzem uma pulverização muito fina, que pode ser facilmente inalada para dentro dos pulmões e, portanto, não alcança eficientemente a mucosa nasal. Os nebulizadores não são, portanto, preferidos.
Os dispositivos de pulverização para uso intranasal são
dispositivos para os quais o desempenho do dispositivo não é dependente da pressão aplicada pelo usuário. Estes dispositivos são conhecidos como dispositivos de limiar de pressão. O líquido é liberado pelo bico somente quando uma pressão limiar é aplicada. Estes dispositivos tomam mais fácil 5 obter-se uma pulverização com um regular tamanho de gotícula. Os dispositivos de limiar de pressão adequados para uso com a presente invenção são conhecidos na arte e são descritos, por exemplo, em WO 91/13281, EP 311 863 B e EP 516 636, incorporados aqui por referência. Tais dispositivos são comercialmente disponíveis pela Pfeiffer GmbH e são também descritos 10 em Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Set. 1999.
Os dispositivos intranasais produzem gotículas (medidas utilizando-se água como o líquido) na faixa de 1 a 200 μιη, preferivelmente 10 a 120 pm. Abaixo de 10 pm há um risco de inalação, sendo portanto desejável terem-se não mais do que cerca de 5% de gotículas abaixo de 10 15 pm. As gotículas acima de 120 pm não se espalham tão bem quando as gotículas menores, de modo que é desejável terem-se mais do que 5% de gotículas excedendo 120 pm.
Suprimento de bi-dose é um outro aspecto preferido de um sistema de suprimento intranasal para uso com as vacinas de acordo com a 20 presente invenção. Os dispositivos de bi-dose contêm duas sub-doses de uma única dose de vacina, uma sub-dose para administração a cada narina. Geralmente, as duas sub-doses estão presentes em uma única câmara e a construção do dispositivo permite o eficiente suprimento de uma única subdose de cada vez. Altemativamente, um dispositivo de mono-dose pode ser 25 usado para administrar as vacinas de acordo com a presente invenção.
Altemativamente, a via de vacinação epidérmica ou transdérmica é também contemplada na presente invenção.
Em um aspecto específico da presente invenção, a composição imunogênica com adjuvante para a primeira administração pode se dada intramuscularmente e a composição de reforço, com adjuvante ou não, pode ser administrada através de uma diferente via, por exemplo, intradérmica, subcutânea ou intranasal. Em outra forma de realização específica, uma composição imunogênica compreendendo especificamente um antígeno do 5 vírus influenza ou sua preparação antigênica para a primeira administração pode conter um teor de HA padrão de 15 μg por cepa de influenza e a composição de influenza de reforço pode conter uma baixa dose de HA, isto é, abaixo de 15 pg e, dependendo da via de administração, pode ser dada em um volume menor.
Populações a vacinar
A população alvo a vacinar pode ser humanos imunocomprometidos. Humanos imuno-comprometidos geralmente são bem menos capazes de responder a um antígeno, em particular a um antígeno de influenza, em comparação com adultos saudáveis.
Preferivelmente, a população alvo é uma população que não é imprimada contra influenza, sendo não afetados (tal como vis à vis com uma cepa pandêmica) ou tendo deixado de responder anteriormente a uma infecção ou vacinação de influenza. Preferivelmente, a população alvo são pessoas idosas, adequadamente com a idade de 65 anos e acima, adultos mais jovens 20 com elevado risco (isto é, entre 18 e 64 anos de idade), tais como pessoas trabalhando em instituições de saúde, ou aqueles adultos jovens com um fator de risco tal como doença cardiovascular e pulmonar, ou diabetes. Outra população alvo são todas as crianças de 6 meses de idade de acima, especialmente crianças de 6 - 23 meses de idade, que experimentam uma taxa 25 de hospitalização relacionada com a influenza relativamente elevada.
Preferivelmente, a população alvo é idosa acima de 65 anos de idade.
Regimes, dosagem e critérios de eficácia adicionais de vacinação
Adequadamente, as composições imunogênicas de acordo com a presente invenção são uma dose padrão de 0,5 ml, injetável na maioria dos casos e, quando uma composição de influenza, contém 15 pg de componente de antígeno de hemaglutinina da ou de cada cepa de influenza, conforme medido por imunodifusão radial única (SRD) (J.M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237 - 247; J. M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317 330). Adequadamente,o volume de dose de vacina será entre 0,5 ml e 1 ml, em particular um volume de dose de vacina padrão de 0,5 ml ou 0,7 ml. Para vacinas de influenza, ligeira adaptação do volume de dose será feita rotineiramente, dependendo da concentração de HA na amostra de massa original.
Adequadamente, dita composição imunogênica contém uma baixa dose de antígeno Ha - p. ex., qualquer uma de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 pg de HA por cepad e influenza.
Vantajosamente, uma dose de vacina de acordo com a presente invenção, em particular uma vacina de baixa dose, pode ser provida em um volume menor do que o das vacinas flu divididas injetadas convencionais, que são geralmente em tomo de 0,5, 0,7 ou 1 ml por dose. As doses de baixo volume de acordo com a presente invenção são preferivelmente abaixo de 500 pl ou menos por dose.
Assim, uma dose de vacina de baixo volume preferida de acordo com um aspecto da invenção, é uma dose com uma baixa dose de antígeno em um baixo volume, p. ex., cerca de 15 pg ou cerca de 7,5 mg HA ou cerca de 3,0 pg HA (por cepa) em um volume de cerca de 200 pl.
O medicamento influenza da invenção preferivelmente satisfaz certos critérios internacionais para vacinas.
Padrões são aplicados intemacionalmente para medir a eficácia das vacinas de influenza. Os critérios oficiais da União Européia para uma vacina eficaz contra influenza são dados na Tabela 1 abaixo. Teoricamente, para satisfazer as exigências da União Européia, uma vacina de influenza tem que satisfazer somente um dos critérios da tabela, para todas as cepas de
influenza incluídas na vacina. As composições da presente invenção adequadamente satisfazem pelo menos um tal critério.
Entretanto, na prática, pelo menos dois ou todos três critérios necessitarão ser satisfeitos para todas as cepas, particularmente para uma nova vacina, tal como uma nova vacina para suprimento via uma diferente via. Sob algumas circunstâncias, dois critérios podem ser suficientes. Por exemplo, pode ser aceitável que dois dos três critérios sejam satisfeitos por todas as cepas, enquanto o terceiro critério é satisfeito por algumas, mas não todas as cepas (p. ex., duas em três cepas). As exigências são diferentes pra populações adultas (18-60 anos) e populações idosas (> 60 anos).
Tabela 1
18 - 60 anos > 60 anos
Taxa de soroconversão* > 40 % > 30 %
Fator de conversão** >2,5 >2,0
Taxa de proteção*** > 70 % >60%
* A taxa de soroconversão é definida como a percentagem de vacinas que têm pelo menos um aumento de 4-vezes de títulos de inibição da hemaglutinina (HI) do soro após vacinação, para cada cepa de vacina.
** Fator de conversão é definido como as vezes de aumento dos títulos de média geométrica (GMTs) da HI do soro, para cada cepa de vacina.
*** Taxa de proteção é definida com a percentagem de vacinados com um título de HI do soro igual a ou maior do que 1:40 após vacinação (para cada cepa de vacina) e é normalmente aceita como indicando proteção.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de projetar uma vacina para doenças sabidas serem curadas ou tratadas através de uma ativação das células T CD4+, compreendendo
1) selecionar um antígeno contendo epítopos de CD4+ e
2) combinar dito antígeno com adjuvante de saponina, na forma de um lipossoma como definido aqui acima, em que dita vacina, na administração em dito mamífero, é capaz de induzir uma aumentada resposta de célula T CD4 em dito mamífero.
O ensinamento de todas as referências do presente pedido, incluindo pedidos de patente e patentes concedidas, é aqui totalmente incorporado por referência.
Para evitação de dúvida, os termos “compreendendo”, “compreendem” e “compreende” aqui são pretendidos pelos inventores serem opcionalmente substituíveis com as expressões “consistindo de”, “consistem de” e “consiste de”, respectivamente, em cada exemplo.
A invenção será ainda descrita por referência aos seguintes exemplos não-limitativos:
Exemplo I descreve métodos de leitura imunológica usados em estudos de camundongos, doninhas e humanos.
Exemplo II descreve a preparação do adjuvante lipossomal MPL/QS21
Exemplo III descreve uma avaliação pré-clínica de vacinas de 15 influenza sem adjuvante em doninhas.
Exemplo IV descreve uma avaliação pré-clínica de vacinas de influenza sem adjuvante em camundongos não-afetados e imprimados C57BI/6.
Exemplo V descreve uma comparação de uma vacina de 20 influenza com adjuvante com 3D-MPL em duas diferentes concentrações em camundongos.
Exemplo VI descreve uma comparação de vacina de influenza com adjuvante com 3D-MPL em duas diferentes concentrações em humanos idosos.
Exemplo VII descreve a avaliação pré-clínica de vacinas HPV com adjuvante em camundongos.
Exemplo VIII descreve uma avaliação pré-clínica de composições imunogênicas de citomegalovírus com adjuvante e semadjuvante.
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Exemplo IX descreve a avaliação pré-clínica de uma vacina RTS,S com adjuvante com 3D-MPL em duas diferentes concentrações.
Exemplo X descreve a avaliação clínica de uma vacina RTS,S com adjuvante com 3D-MPL em duas diferentes concentrações.
Exemplo I - Métodos de Leitura Imunológica
1.1. Métodos de camundongos
1.1.1. Teste de Inibição de Hemaglutinação
Procedimento de Teste
Títulos anticorpo anti-hemaglutinina para as três cepas de vírus influenza foram determinados utilizando-se o teste de inibição de hemaglutinação (HI). O princípio do teste HI é baseado na capacidade de anticorpos anti-influenza específicos inibirem a hemaglutinação de células sangüíneas vermelhas (RBC) de frangos pela hemaglutinina do vírus influenza (HA). Soros inativados quentes foram previamente tratados por Kaolin e RBC de frango para remover inibidores não-específicos. Após prétratamento, diluições duplas de soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada cepa de influenza. Células sangüíneas vermelhas de frango foram então adicionadas e a inibição da aglutinação foi classificada. Os títulos foram expressos como o recíproco da mais elevada diluição de soro que completamente inibiu a hemaglutinação. Como a primeira diluição de soro foi de 1: 20, um nível indetectável foi classificado como um título igual a
10.
Análise Estatística
Análise estatística foi realizada em títulos HI de pós vacinação, empregando-se UNISTAT. O protocolo aplicado para análise da variação pode ser resumidamente descrito como segue:
• Transformação log de dados • Teste Shapiro-Wilk em cada população (grupo), a fim de verificar a normalidade de distribuição dos grupos
• Teste de Cochran, a fim de verificar a homogenicidade de variação entre as diferentes populações (grupos) • Análise de dois sentidos da variação realizada nos grupos • Teste HSD Tukey para múltiplas comparações
1.1.2. Tingimento de citocina intracelular
Esta técnica permite uma quantificação de linfócitos T específicos de antígeno com base na produção da citocina: células efetoras T e/ou células T de memória-efetoras produzem IFN-γ e/ou as células T de memória central produzem IL-2. PBMCs são colhidas no dia 7 pós10 imunização.
As células linfóides são reestimuladas in vitro, na presença de inibidor de secreção (Brefeldine):
Estas células são então processadas por procedimento imunofluorescente convencional, empregando-se anticorpos fluorescentes 15 (CD4, CD8, IFN-γ e IL-2). Os resultados são expressos como uma freqüência de célula positiva de citocina dentro de células T CD4/CD8. O tingimento intracelular das citocinas das células T foi realizado em PBMC 7 dias após a segunda imunização. O sangue foi coletado de camundongos e reunido em meio heparinizado RPMI+ Add. Para sangue, RPMI + suspensões de PBL 20 Add-diluídas foram encarnados sobre um gradiente de Linfólito-Mamífero de acordo com o protocolo recomendado (centrifugar 20 min a 2500 rpm e T.A.). As células mononucleares na interface foram removidas, lavadas 2x em RPMI + Add e suspensões de PBMCs foram ajustadas a 2 x 106 células/min em RPMI 5% de soro fetal.
A estimulação de antígeno in vitro de PBMCs foi realizada em uma concentração final de 1 x 106 células/min (tubo FACS) com Flu trivalente dividido em pcontas (5 g HA/cepa) ou FI Integral (1 pgHA/cepa) e então incubada 2 h a 37 °C com a adição de anti-CD28 e anti-CD49d (1 pg/ml para ambos).
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A adição de ambos os anticorpos, aumentou a proliferação e produção de citocina pelas células T e NK ativadas e pode prover um sinal coestimulatório para indução CTL.
Além disso, PBMCs foram também estimuladas durante a 5 noite com Flu trivalente dividido (30 pg HA/cepa)- ou BMDCs de FI Integral (5 pgHA/cepa)-pulsadas (1 χ 105 células/ml), que foram preparadas pulsandose BMDCs com Flu dividido (60 pg/HA cepa) ou Flu Integral trivalente FI (10 pgHA/cepa) por 6 horas a 37 °C. Em seguida à etapa de reestimulação de antígeno, PBMC são incubadas O.N. a 37 °C, na presença de Brefeldina (1 10 pg/ml) a 37 °C para inibir a secreção de citocina.
Tingimento IFN-γ /IL-2/CD4/CD8 foi realizado como segue: suspensões de célula foram lavadas, ressuspensas em 50 pl de PBS 1% FCS contendo 2% de reagente de bloqueio Fc (1/50; 2.4G2). Após 10 min de incubação a 4 °C, 50 pl de uma mistura de anti-CD4-PE (2/50) e anti-CD8 15 perCp (3/50) foram adicionados e incubados 30 min a 40 °C. Após uma lavagem em PBS 1% FCS, as células foram permeabilizadas ressuspendendose em 200 pl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) e incubadas 20 min a 4 °C. As células foram então lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 pl de uma mistura de anti-IFN-γ APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluídos 20 em Perm Wash. Após uma incubação min 2 h máx. durante a noite a 4 °C, as células foram lavadas com Perm Wash e ressuspensas em PBS 1% FCS+ 1% paraformaldeído. A análise da amostra foi realizada por FACS. As células vivas foram desbloqueadas (FSC/SSC) e a aquisição foi realizada em -50.000 eventos (linfócitos) ou 35.000 eventos em células CD4+T. As percentagens 25 de IFN-γ + ou IL2+ foram calculadas em populações desbloqueadas CD4+ e
CD8.
1.2. Método de doninhas
I.2.I. Teste de Inibição de Hemaglutinação (ΉΙ)
Procedimento de Teste
JO1 $
Títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três cepas de vírus influenza foram determinados utilizando-se o teste de inibição de hemaglutinação (HI). O principio do teste HI é baseado na capacidade de anticorpos anti-influenza específicos inibirem a hemaglutinação de células sangüíneas vermelhas (RBC) de frango por hemaglutinina (HA) do vírus influenza. Os soros foram primeiro tratados com uma solução de 25% de neuraminidase (RDE) e foram inativados por calor para remover inibidores não-específicos. Após pré-tratamento, diluições duplas de soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada cepa de influenza. As células sangüíneas vermelhas de frango foram então adicionadas e a inibição da aglutinação foi classificada usando-se lacerações para leitura. Os títulos foram expressos como o recíproco da mais elevada diluição do soro que completamente inibia a hemaglutinação. Como a primeira diluição dos soros foi de 1:10, um nível indetectável foi classificado como um título igual a 5.
Análise Estatística
Análise estatística foi realizada em títulos HI (Dia 41, antes do desafio) usando-se UNISTAT. O protocolo aplicado para análise da variação pode ser resumidamente descrito como a seguir:
• Transformação log de dados · Teste Shapiro-wilk em cada população (grupo) a fim de verificar a normalidade de distribuição dos grupos.
• Teste Cochran a fim de verificar a homogenidade da variação entre as diferentes populações (grupos).
• Teste para interação de ANOVA de um sentido.
· Teste Tuckey-HSD para múltiplas comparações.
L2.2. Lavagens Nasais
Lavagens nasais foram realizadas pela administração de 5 ml de PBS em ambas as narinas em animais alertas. O inóculo foi coletado em uma cápsula Petri e colocado em recipientes de amostra sobre gelo seco.
Titulação viral de lavagens nasais
Todas as amostras nasais foram primeiro filtradas estéreis através de filtros Spin X (Costar) para remover qualquer contaminação bacteriana. 50 μΐ de diluições de dez vezes seriais de lavagens nasais foram 5 transferidos para placas de microtítulo contendo 50 μΐ de meio (10 poços/diluição). 100 μΐ de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) foram então adicionados a cada poço e incubadas a 35 °C por 5-7 dias. Após 6-7 dias de incubação, o meio de cultura é suavemente removido e 100 μΐ de um meio contendo 1/20 WST-1 são adicionados e incubados por mais 18 h.
A intensidade do corante formazan amarelo produzido na redução de WST-1 por células viáveis é proporcional ao número de células viáveis presentes no poço no final do ensaio de titulação viral e é quantificada medindo-se a absorvência de cada poço no apropriado comprimento de onda (450 nanômetros). O corte é definido como a média OD de células de controle 15 desinfectadas - 0,3 OD (0,3 OD corresponde a ± 3 StDev de OD de células de controle desinfetadas). Uma classificação positiva é definida quando OD é < corte e ao contrário uma classificação negativa é definida quando OD é > corte. Os títulos de espalhamento viral foram determinados por “Reed and Muench” e expressos como Log TCID50/ml.
1.3. Ensaios para avaliar a resposta imune em humanos
1.3.1 Ensaio de Inibição de Hemaglutinação
A resposta imune foi determinada medindo-se anticorpos HI usando-se o método descrito pelo WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991).
As medições de título de anticorpo foram conduzidas em amostras de soro descongeladas congeladas com um micrométodo padronizado e compreensivamente validado, usando-se 4 unidades de inibição de hemaglutinação (4 HIU) dos apropriados antígenos e uma suspensão de 5% de eritrócito de galinha. Inibidores de soro não-específicos foram
removidos por tratamento térmico e enzima destruidora de receptor.
Os soros obtidos foram avaliados quanto aos níveis de anticorpo HI. Começando com uma diluição inicial de 1:10, uma série de diluição (em um fator de 2) foi preparada até uma diluição final de 1:20480.
O ponto final da titulação foi considerado como a etapa da mais elevada diluição que mostrou inibição completa (100%) de hemaglutinação. Todos os ensaios foram realizados em duplicata.
I.3.2. Ensaio de Inibição da Neuraminidase
O ensaio foi realizado em placas de microtítulo revestidas com 10 fetuína. Uma série de diluição de 2-vezes do anti-soro foi preparada e misturada com uma quantidade padronizada de vírus influenza A H3N2, H1N1 ou influenza B. O teste foi baseado na atividade biológica da neuraminidase, que enzimaticamente liberar ácido neuramínico da fetuína. Após divagem do ácido neuramínico terminal, β-D-glactose-N-acetil15 galactosamina foi desmascarada. Aglutina de amendoim rotulada peroxidase de rábano silvestre (HRP) de Arachis Hypogaea, que se liga especificamente às estruturas da galactose, foi adicionada aos poços. A quantidade de aglutinina ligada pode ser detectada e quantificada em uma reação de substrato com tetrametilbenzidina (TMB). A mais elevada diluição anticorpo 20 que ainda inibe a atividade de neuraminidase viral em pelo menos 50% foi indicada ser o título NI.
I.3.3. Ensaio de Anticorpo neutralizante
As medições de anticorpo neutralizante foram conduzidas em amostras de soro descongeladas congeladas. A neutralização do vírus pelos 25 anticorpos contidos no soro foi determinada em um ensaio de microneutralização. Os soros foram usados sem mais tratamento no ensaio. Cada soro foi testado em tripücata. Uma quantidade padronizada de vírus foi misturada com diluições seriais de soro e incubadas para permitir a ligação dos anticorpos ao vírus. Uma suspensão celular, contendo uma quantidade definida de células MDCK, foi então adicionada à mistura do vírus e anti-soro e incubada a 33 °C. Após o período de incubação, a replicação do vírus foi visualizada por hemaglutinação de células sangüíneas vermelhas de frango. O título de neutralização de 50% de um soro foi calculado pelo método de Reed 5 e Muench.
1.3.4. Imunidade mediada por célula foi avaliada por Citometria de Fluxo de Citocina (CFC)
As células T CD4 e CD8 específicas de antígeno de sangue periférico podem ser reestimuladas in vitro para produzir IL-2, CD40L, TNF10 alfa e IFN, se incubadas com seu correspondente antígeno.
Conseqüentemente, as células T CD4 e CD8 específicas de antígeno podem ser enumeradas por citometria de fluxo, em seguida a rotulação de imunofluorescência convencional de fenótipo celular bem como produção de citocinas intracelulares. No presente estudo, o antígeno do vírus influenza, 15 bem como peptídeos derivados da proteína de influenza específica, foram usados como antígeno para reestimular as células T específicas de influenza. Os resultados foram expressos como uma freqüência de célula T CD4 ou CD8 positiva-citocina(s) dentro da subpopulação de células T CD4 ou CD8.
1.3.5. Métodos Estatísticos
1.3.5.7. Pontos finais primários • Percentagem, intensidade e relação para vacinação de sinais locais e gerais solicitados e sintomas durante um período de acompanhamento de 7 dias (isto é, dia de vacinação e 6 dias subseqüentes) após vacinação e total.
· Percentagem, intensidade e relação para vacinação de sinais locais e gerais não solicitados e sintomas durante um período de acompanhamento de 21 dias (isto é, dia de vacinação e 20 dias subseqüentes) após vacinação e total.
• Ocorrência de sérios eventos adversos durante o inteiro
estudo.
1.3.5.2. Pontos finais secundários
Para a resposta imune humoral:
Variáveis observadas’.
• Nos dias 0 e 21: inibição de hemaglutinação (HI) do soro e títulos de anticorpo NI, testados separadamente em relação a cada uma das três cepas de vírus influenza representadas na vacina (anticorpos anti-HINl, anti-H3N2 & anti-B).
• Nos dias 0 e 21: títulos de anticorpo neutralizantes, testados separadamente em relação a cada uma das três cepas de vírus influenza representadas na vacina.
Variáveis Derivadas (com intervalos de 95% de confiança)'.
• Títulos de média geométrica (GMTs) de anticorpos de HI de Soro com intervalos de 95% de confiança (95% Cl) pré e pós-vacinação • Taxas de soroconversão* com 95% Cl no dia 21 • Fatores de conversão** com 95% Cl no dia 21 • Taxas de soroproteção** com 95% Cl no dia 21 • GMTs de anticorpo NI de soro (com 95% intervalos de confiança) em todos os pontos do tempo.
• Taxa de soroconversão definida como a percentagem de vacinados que têm pelo menos aumento de 4-vezes de títulos de HI de soro no dia 21, em comparação com o dia 0, para cada cepa de vacina.
** Fator de conversão definido como as vezes de aumento dos GMTs de HI de soro no dia 21, em comparação com o dia 0, para cada cepa de vacina.
*** Taxa de proteção definida como a percentagem de vacinados com um título HI de soro =40 após vacinação (para cada cepa de vacina) que usualmente é aceita como indicando proteção.
Para a resposta imune mediada por célula (CMI)
Variável observada
Nos dias 0 e 21: freqüência de células CD4/CD8 positivascitocina por 106 em diferentes testes. Cada teste quantifica a resposta de célula T CD4/CD8 para:
· Antígeno de influenza de peptídeo (pf) (a natureza e origem precisas destes antígenos precisa ser fomecida/explicada • Antígeno de influenza dividido (sf) • Antígeno de influenza integral (wf).
Variáveis Derivadas:
· células produzindo pelo menos duas diferentes citocinas (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa) • células produzindo pelo menos CD40L e outra citocina (IL2, TNFcc, IFNy • células produzindo pelo menos IL-2 e outra citocina (CD40L, TNFa, IFNy) • células produzindo pelo menos IFNy e outra citocina (IL-2, TNFa, CD40L) • células produzindo pelo menos TNFa e outra citocina (IL-2, CD40L, IFNy)
L 3.5.3. Análise de imunogenicidade
A análise de imunogenicidade foi baseada no coorte vacinado total. Para cada grupo de tratamento, os seguintes parâmetros (com 95% de intervalos de confiança) foram calculados:
• Títulos de média geométrica (GMTs) de títulos de anticorpo 25 HI e NI nos dias 0 e 21 • Títulos de média geométrica (GMTs) de títulos de anticorpo neutralizantes nos dias 0 e 21.
• Fatores de conversão no dia 21.
• Taxas de soroconversão (SC) no dia 21, definidas como a percentagem de vacinados que têm pelo menos um aumento de 4 vezes nos títulos HI do soro no dia 21, em comparação com o dia 0.
• Taxas de proteção no dia 21, definida como a percentagem de vacinados com um título HI =1:40.
• A freqüência de linfócitos-T CD4/CD8 secretando em resposta foi resumida (estatística descritiva) para cada grupo de vacinação, em cada ponto do tempo (Dia 0, Dia 21) e para cada antígeno (influenza Peptídeo (pf), influenza dividido (sf) e influenza total (wf)).
• Estatística descritiva em diferença individual entre respostas de ponto de tempo (Pós-Pré) para cada grupo de vacinação e cada antígeno (pf, sf e wf) em cada 5 diferentes testes.
• Um teste não-paramétrico (teste Kruskall-Wallis) foi usado para comparar as diferenças locais entre os 3 grupos e o valor-p estatístico foi calculado para cada antígeno em cada 5 diferentes testes. Todos os testes de significância foram de duas caudas. Valores P menores do que ou iguais a 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.
Exemplo II - Preparação ao adjuvante lipossomal MPL/QS21
II.3 Preparação da suspensão líquida MPL
A massa líquida de MPL (como usado por todo o documento, é uma abreviação para 3D-MPL, isto é, monofosforil lipídeo A 3-Odesacilado) é preparada de pó 3D-MPL liofilizado. A massa líquida MPL é uma dispersão aquosa concentrada estável (em tomo de 1 mg/ml de matéria prima, que é pronta para uso para formulação de vacina ou adjuvante. Uma representação esquemática do processo de preparação é dada na Figura 1.
Para um máximo tamanho de batelada de 12 g, a preparação da massa líquida de MPL é realizada através de recipientes de vidro estéreis. A dispersão de MPL consiste das seguintes etapas:
suspender o pó de MPL em água para injeção
- desagregar quaisquer agregados grandes por aquecimento
(tratamento térmico) reduzir o tamanho da partícula entre 100 nm e 200 nm por microfluidização pré-filtrar a preparação em uma unidade de Pré-filtro Sartoclean, 0,8 / 0,65 gm
- filtrar estéril a preparação em temperatura ambiente (unidade Sartobran P, 0,22 μπι)
O pó de MPL é liofilizado por microfluidização, resultando em uma dispersão aquosa coloidal estável (partículas MPL de um tamanho susceptível a filtragem estéril). O pó liofilizado de MPL é disperso em água pra injeção, a fim de obter-se uma suspensão grosseira de 10 mg/ml. A suspensão então sofre um tratamento térmico sob agitação. Após esfriar à temperatura ambiente, o processo de microfluidização é iniciado a fim de diminuir o tamanho das partículas. A microfluidização é conduzida usando-se aparelho de Microfluídico Ml 10EH, circulando-se continuamente a dispersão através de uma câmara de interação de microfluidização, em uma pressão definida por uma quantidade mínima de passagens (número de ciclos: nmin). A duração da microfluidização, representando o número de ciclos, é calculada com base na taxa de fluxo e volume de dispersão medidos. Em um dado equipamento em uma dada pressão, a taxa de fluxo resultante pode variar de uma câmara de interação para outra e por todo o ciclo de vida de uma câmara de interação particular. No presente exemplo, a câmara de interação usada é do tipo F20Y Microfluidics. Como a eficiência de microfluidização é ligada à pressão de acoplamento - taxa de fluxo, o tempo de processamento pode variar de uma batelada para outra. O tempo necessário para 1 ciclo é calculado com base na taxa de fluxo. A taxa de fluxo a ser considerada é a taxa de fluxo medida com água para injeção, logo antes da introdução do MPL dentro do aparelho. Um ciclo é definido como o tempo (em minutos) necessário para o volume total de MPL passar uma vez através do aparelho. O
tempo necessário para obter-se n ciclos é calculado como segue: n x quantidade de MPL para tratar (ml) / taxa de fluxo (ml/min)
O número de ciclos é assim adaptado desta maneira. A quantidade mínima de ciclos a realizar (nmjn) é descrita para o equipamento preferido e câmaras de interação usados. A quantidade total de ciclos a realizar é determinada pelo resultado de uma medição de tamanho de partícula realizada após nmin ciclos. Um limite de tamanho de partícula (dHm) é definido com base em dados históricos. A medição é realizada por técnica de espectroscopia de correlação fotônica (PCS) e diim é expresso como um resultado unimodal (Zmédia). Sob este limite, a microfluidização pode ser parada após nmin ciclos). Acima deste limite, a microfluidização é continuada até redução de tamanho satisfatória ser obtida, por outros 50 ciclos máximos.
Se a filtragem não ocorrer imediatamente após microfluidização, o MPL disperso é armazenado a +2 a +8 °C, esperando a transferência para a área de filtragem.
Após microfluidização, a dispersão é diluída com água para injeção e filtrada estéril através de um filtro de 0,22 pm sob fluxo laminar. A concentração de MPL final é de 1 mg/ml (0,80 - 1,20 mg/ml).
II.2 Preparação de adjuvante lipossomal MPL/QS21
Este adjuvante, citado AS01, compreende 3D-MPL e QS21 em uma forma extinta com colesterol e foi produzido como descrito no WO 96/33739, incorporado aqui por referência. Em particular o adjuvante AS01 foi preparado essencialmente como no Exemplo 1.1 do WO 96/33739. O adjuvante AS01B compreende: lipossomas que, por sua vez, compreendem dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), colesterol e 3D MPL [em uma quantidade de 1000 pg DOPC, 250 pg de colesterol e 50 pg de 3D-MPL, cada valor fornecido aproximadamente por dose de vacina], QS21 [50 pg/dose], tampão de NaCl fosfato e água a um volume de 0,5 ml.
O adjuvante AS01E compreende os mesmos ingredientes que
AS01B, porém em uma concentração menor, em uma quantidade de 500 pg DOPC, 125 pg colesterol, 25 pg 3D-MPL e 25 pg QS21, tampão de NaCl fosfato e água, a um volume de 0,5 ml.
No processo de produção de lipossomas contendo MPL, o DOPC (Dioleil fosfatidilcolina), colesterol e MPL são dissolvidos em etanol. Uma película de lipídeo é formada por evaporação de solvente sob vácuo. Solução de Tampão de Fosfato (9 mM Na2HPO4, 41 mM KH2PO4, 100 mM NaCl) em pH 6,1 é adicionada e a mistura é submetida a pré-homogeneização, seguido por homogeneização de alta pressão a 15.000 psi (1055 kg/cm2) (em tomo de 15 a 20 ciclos). Isto resulta na produção de lipossomas que são filtrados estéreis através de uma membrana de 0,22 pm em uma área asséptica (classe 100). O produto estéril é então distribuído em recipientes de vidro estéreis e armazenados em um recinto frio (+ 2 a + 8 °C).
Desta maneira, os lipossomas produzidos contêm MPL na membrana (a forma de realização de “MPL em” do WO 96/33739).
QS21 é adicionado em solução aquosa à desejada concentração.
Exemplo III - Avaliação pré-clínica das vacinas influenza com adjuvante e sem adjuvante em doninhas
III.l. Análise racional e objetivos
A infecção por influenza no modelo de doninha imita rigorosamente a influenza humana, com respeito tanto à sensibilidade à infecção como à resposta clínica.
A doninha é extremamente sensível à infecção com vírus tanto influenza A como B, sem adaptação anterior de cepas virais. Portanto, ela fornece um excelente sistema modelo para estudos de proteção conferido pelas vacinas de influenza administradas.
Este estudo investigou a eficácia de várias vacinas Divididas Trivalentes, com adjuvante ou não, para reduzir os sintomas da doença (temperatura corporal) e espalhamento viral em secreções nasais de doninhas provocadas com cepas homólogas.
O objetivo deste experimento foi demonstrar a eficácia de uma vírus influenza com adjuvante, em comparação com a vacina simples (sem adjuvante).
Os pontos finais foram:
1) Ponto final primário: redução de espalhamento viral em lavagens nasais após-desafio homóloga:
2) Pontos finais secundários: Análise da resposta humoral por títulos HI
III.2 Projeto experimental
IIL2.1. Tratamento/grupo (Tabela 1)
Doninhas fêmeas (Mustelaputorius furo), com a idade de 14 20 semanas, foram obtidas de MISAY Consultancy (Hampshire, UK). As doninhas foram imprimadas no dia 0 com cepa heterosubtípica H1N1 A/Stockholm/24/49 (4 Log TCID50/ml). No dia 21, as doninhas foram injetadas intramuscularmente com uma dose humana completa (500 pg de dose de vacina, 15 pg HA/cepa) de uma combinação de H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99, H3N2 A/Panama/2007/99 e B/Shangdong/7/97. As doninhas foram então provocadas no dia 42 por via intranasal com uma cepa heterossubtípica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,5 Log TCIDso/ml).
Tabela 1
Grupo Antígeno(s)+ dosagem Formulação+ dosagem Comentários (programa/via/ desafio) In/Po Outros tratamentos
1 Tri valente Simples HD total: 15 pg HA/cepa IM; Dia 21 In Iniciação (A/Stockolm/24/90) Dia 0
2 Trivalente/ MPL-QS21 em lipossomas HD total: 15 pg HA/cepa IM; Dia 21 In Iniciação H1N1 (A/Stockolm/24/90) Dia 0
doninhas/grupo. In/Po = Indivíduo/pool
III.2.2. Preparação das formulações de vacina (Tabela 2)
100
JJ3 r Formulação 1: Formulação Simples (sem adjuvante) Dividida Trivalente
PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado), bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades levando-se em conta os detergentes presentes nas cepas), são adicionados à água para injeção. Após 5 min de agitação, 15 pg de cada cepa H1N1, H3N2 e 17,5 pg de cepa B são adicionados com 10 min de agitação entre cada adição. A formulação é agitada por 15 minutos no mínimo e armazenada a 4 °C se não administrada diretamente.
Formulação 2: Influenza Dividido Trivalente com adjuvante com MPL/QS21 em lipossomas:
PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado), bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades levando em conta os detergentes presentes nas cepas), são adicionados à água para injeção. Após 5 min de agitação, 15 pg de cada cepa H1N1, H3N2 e 17,5 pg de cepa B são adicionados com 10 min de agitação entre cada adição. A formulação é agitada por 15 minutos. Uma pré-mistura de chamado “DQS21-MPLin” é adicionada à formulação, que é então agitada pelo mínimo 15 minutos. A pré-mistura de DQS21-MPLin é uma mistura de lipossomas (feito de DOPC 40 mg/ml, colesterol 10 mg/ml, MPL 2 mg/ml) e o imunoestimulante QS21. Esta pré-mistura é incubada por um mínimo de 15 minutos antes da adição à mistura dividida trivalente. A concentração de MPL e QS21 na formulação final é de 50 pg por 500 pl. A formulação é armazenada a 4 °C, se não administrada diretamente.
Observação: Em cada formulação, PBS 10 vezes concentrado é adicionado para alcançar a isotonicidade e é 1 vez concentrado no volume final. O volume de H2O é calculado para alcançar o volume pretendido.
101
Tabela 2: Composição final das formulações 1 e 2 (Formulações preparadas com cepas divididas (para 500 μΐ))
Formulação Antígeno Tw&en 80 Trlton X- 100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1 H1N1:15pg H3N2:15pg B: 17.5pg 375pg 55yg 50pg
2 H1N1:15pg H3N2:15pg B: 17.5ug 375pg S5pg 50pg img 2S0pg 50pg 50pg
III.2.3. Leituras (Tabela 3)
Tabela 3
Leitura Ponto do Tempo Tipo Amostra Método Análise
Espalhamento viral D+l a D+7 Pós-desafio Lavagens nasais Titulação
Anticorpos Anti-HI (títulos «D Pré, Pós iniciação, Pós Imunização, Pós-desafio Soros Teste Inibição Hemaglutinação
ΙΠ.3. Resultados
Uma representação esquemática dos resultados é dada nas Figuras 1 e 2.
III.3.1. Imunidade Humoral (Figura 1)
A atividade de inibição de hemaglutinação contra as cepas de vacina H3N2 (cepa de vacina A/Pariama/2007/99 e cepa de desafio A/Wyoming/3/2003) foi detectada em soros de 6 animais por grupo no Dia 17 após iniciação heteróloga intranasal e no Dia 21 Pós-imunização e Dia 13 Pós-desafio.
Os títulos anticorpo anti-hemaglutinina para as três cepas de vírus influenza foram determinados usando-se o teste de inibição de hemaglutinação (HI), como detalhado sob o Exemplo I.2.I. As conclusões são como seguem:
> Para as duas cepas A/H3N2 e para todos os grupos, um reforço de títulos HI foi observado em todos os grupos vacinados após imunização.
> Pós-imunização com A/Panama/2007/99 foram observados títulos anti-A/Panama/2007/99 HI mais elevados, estatisticamente
102 já6 & significativos, quando a vacina Trivalente Dividida recebeu adjuvante MPL/QS21 em lipossomas, em comparação com a vacina Simples Trivalente Dividida.
> Após imunização com A/Panama/2007/99, somente a Trivalente Dividida com adjuvante MPL/QS21 em lipossomas foi capaz de significativamente aumentar os títulos HI para a cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reatividade cruzada antes do desafio com esta cepa de desvio).
> Após-desafio com A/Wyoming/3/2003, um significativo aumento de títulos HI anti-A/Wyoming/3/2003 foi observado para tanto Trivalente Dividida Simples como Trivalente Dividida com adjuvante MPL/QS21 em lipossomas.
> Para as cepas A/New Caledonia/20/99 e B/Shangdong/7/97, títulos HI mais elevados estatisticamente significativos foram observados quando a Trivalente Dividida recebeu adjuvante MPL/QS21 nos lipossomas, em comparação com a vacina Trivalente Dividida Simples.
III.3.2. Espalhamento viral (Figura 3)
Titulação viral de lavagens virais foi realizada em 6 animais por grupo, como detalhado sob os Exemplos 1.2.3. As lavagens nasais foram realizadas por administração de 5 ml de PBS em ambas as narinas de animais alertas. A inoculação foi coletada em uma cápsula Petri e colocada dentro de recipientes de amostra a -80 °C.
> Dois dias após-desafio, espalhamento viral menor estatisticamente significativo foi observado com Trivalente Dividida com adjuvante MPL/QS21 em lipossomas, em comparação com Trivalente Dividida Simples.
> No Dia 49 (7 dias pós-desafio), nenhum vírus foi detectado nas lavagens nasais.
4Í6
103
III. 3.3. Conclusão do experimento
Respostas humorais mais elevadas (títulos HI) foram observados com Trivalente Dividida com adjuvante MPL/QS21 em lipossomas, em comparação com a Trivalente Dividida Simples por todas as 4 cepas.
Após imunização com A/Panama/2007/99, somente a Trivalente Dividida com adjuvante MPL/QS21 nos lipossomas foi capaz de significativamente aumentar os títulos HI para a cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reatividade cruzada antes do desafio com esta cepa).
MPL/QS21 das formulações de lipossomas mostrou benefício aumentado em termos de eficácia protetora em doninhas (menor espalhamento viral após-desafio heteróloga). A reação cruzada observada após imunização com Trivalente Dividida MPL/QS21 nos lipossomas em relação à cepa de desvio usada para o desafio pareceu correlacionar-se com o efeito de proteção observado nestas doninhas.
Exemplo IV - Avaliação pré-clínica de vírus influenza com adjuvante e sem adjuvante em camundongos imprimados C57BI/6
IV. l. Projeto experimental e objetivo
Camundongos C57BI/6 imprimados com cepas heterólogas foram usados para este experimento.
A finalidade foi comparar as respostas imune humorais (títulos HI) e CMI (ICS, tingimento de citocina intracelular) induzidas por uma
ΤΠΆ jf vacina Trivalente Dividida (Fluarix ) comercialmente disponível da GlaxoSmithKline versus uma vacina subunitária Trivalente (vacina Agrippal™ da Chiron), bem como a resposta CMI obtidas com estas vacinas com adjuvante de Lipossomas contendo 3D-MPL apenas, DQS21 (QS21 em lipossomas, isto é, QS21 desintoxicado) apenas ou MPL/QS21 em lipossomas. No exemplo abaixo, as formulações foram preparadas partindo-se das monomassas divididas para alcançar a mesma composição da vacina
104
Fluarix e não das doses de Fluarix comercialmente disponíveis. As formulações obtidas foram chamadas “Fluarix like”.
IV. 1.1. Tratamento/Grupo
Camundongos fêmeas C57B16, com a idade de 6 - 8 semanas, foram obtidos de Harlan Horst, Países Baixos. Os camundongos foram imprimados no dia 0 com cepas heterossubtípicas (5 pg A/Beijing/262/95 H1N1 inativadas integrais HA, A/Panama/2007/9 H3N2, B/Shangdong/7/97).
No dia 28, os camundongos foram injetados intramuscularmente com 1,5 pg Trivalente Dividida HA (A/New Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003,
B/Jiangsu/10/2003) simples ou com adjuvante (vide grupos nas Tabelas 4 a 6 abaixo).
Tabela 4
Gr Antígeno / Formulação Outro tratamento
1 Trivalente Dividida* / Simples (sem adjuvante) = semelhante Fluarix DO iniciação heteróloga
2 Trivalente Dividida* / contendo lipossomas 3D-MPL D0 iniciação heteróloga
3 Trivalente Dividida* / DQS21 DO iniciação heteróloga
4 Trivalente Dividida* / MPL/QS21 em lipossomas D0 iniciação heteróloga
5 Aggripal1M (sub-unidade) DO iniciação heteróloga
6 Aggripal1M (sub-unidade) / Lipossomas contendo 3D-MPL D0 iniciação heteróloga
7 Aggripal1M (sub-unidade) / DQS21 DO iniciação heteróloga
8 AggripaliM (sub-unidade) / MPL/QS21 em lipossomas D0 iniciação heteróloga
9 PBS D0 iniciação heteróloga
* Semelhante a Fluarix. 16 camundongos/grupo
IV. 1.2. Preparação das formulações de vacina
Formulação para o grupo 1:
PB S 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado), bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades levando em consideração os detergentes presentes nas cepas) são adicionados a água para injeção. Após 5 min de agitação, 15 pg de 20 cada cepa H1N1, H3N2 e 15 pg de cepa B são adicionados com 10 min de agitação entre cada adição. A formulação é agitada pelo mínimo de 15
105 minutos e armazenada a 4 °C se não administrada diretamente.
Formulação para o grupo 2:
PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado), bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades levando em consideração os detergentes presentes nas cepas) são adicionados a água para injeção. Após 5 min de agitação, 15 pg de cada cepa H1N1, H3N2 e 15 pg de cepa B são adicionados com 10 min de agitação entre cada adição. A formulação é agitada por 15 minutos. Lipossomas concentrados contendo 3D-MPL (produzidos de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) são adicionados para alcançar uma concentração de MPL final de 50 pg por dose. A formulação é então agitada no mínimo por 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada diretamente.
Formulação para grupo 3:
PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado), bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades levando em consideração os detergentes presentes nas cepas) são adicionados a água para injeção. Após 5 min de agitação, 15 pg de cada cepa H1N1, H3N2 e 15 pg de cepa B são adicionados com 10 min de agitação entre cada adição. A formulação é agitada por 15 minutos. Uma prémistura feita de lipossomas (feitos de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml) e QS21 chamado “DQS21” é então adicionada para alcançar uma concentração de QS21 de 50 pg por dose. Esta pré-mistura é incubada pelo menos por 15 minutos antes da adição à mistura dividida trivalente. A formulação é agitada por 15 minutos no mínimo e armazenada a 4 °C se não administrada diretamente.
Formulação para o grupo 4:
PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado), bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e
106
VES (quantidades levando em consideração os detergentes presentes nas cepas) são adicionados a água para injeção. Após 5 min de agitação, 15 pg de cada cepa H1N1, H3N2 e 15 pg de cepa B são adicionados com 10 min de agitação entre cada adição. A formulação é agitada por 15 minutos. Uma mistura feita de lipossomas contendo 3D-MPL (feitos de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) e QS21 é então adicionada para alcançar concentrações de QS21 e MPL de 50 pg por dose. Esta mistura é incubada pelo menos por 15 minutos antes da adição à mistura dividida trivalente. A formulação chamada “trivalente dividida MPL/QS21 em lipossomas” é agitada por no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C se não administrada diretamente.
Observação: Nos grupos 1 a 4, PBS 10 vezes concentrado é adicionado para alcançar isotonicidade e é 1 vez concentrado no volume final. O volume de H2O é calculado para alcançar o volume pretendido. Formulação para o grupo 5:
Uma dose de Aggripal™ é misturada com igual volume de PBS mod pH 7,4. A formulação é agitada pelo mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada diretamente.
Formulação para o grupo 6:
PBS pH 7,4 e uma dose de Aggripal são misturadas. Os lipossomas contendo 3D-MPL (produzidos de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) são então adicionados sob agitação para alcançar o equivalente de 50 pg de MPL por dose. A formulação é agitada pelo mínimo de 15 minutos e armazenada a 4 °C se não administrada diretamente.
Observação: PBS é adicionado para alcançar isotonicidade no volume final. Aggripal é metade do volume da formulação.
Formulação para o grupo 7:
PBS pH 7,4 e uma dose de Aggripal™ são misturadas. Uma pré-mistura de lipossomas (produzidos de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10
107 mg/ml e QS21 chamado “DQS21” é então adicionada sob agitação para alcançar o equivalente de 50 pg de QS21. Esta pré-mistura é incubada por pelo menos 15 minutos antes da adição. A formulação é agitada pelo mínimo de 15 minutos e armazenada a 4 °C se não administrada diretamente.
Observação: PBS é adicionado para alcançar isotonicidade no volume final. Aggripal é metade do volume da formulação.
Formulação para o grupo 8:
rp* r
PBS pH 7,4 e uma dose de Aggripal são misturados. Uma pré-mistura do chamado “DQS21-MPLin” é adicionada sob agitação à formulação. A pré-mistura de DQS21-MPLin é uma mistura de lipossomas (feitos de DOPC 40 mg/ml, colesterol 10 mg/ml, MPL 2 mg/ml) e do imunoestimulante QS21. Esta pré-mistura é incubada por pelo menos 15 minutos antes da adição à mistura de Aggripal/PBS. A quantidade de MPL e QS21 na formulação é 50 pg cada. A formulação é agitada pelo mínimo de 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada diretamente.
Observação: PBS é adicionado para alcançar a isotonicidade no volume final. Aggripal é metade do volume de formulação.
Tabela 5: Composição final das formulações 1 a 4, preparadas com cepas divididas (para 1 ml)
Grupo Antígeno Tween 80 Triton X-100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1 H1N1:15yg H3N2:1Spg B: 17.5jjg 750pg 110yg 100yg **
2 Idêntico a 1 Idêntico a 1 110pg lOOyg 1mg 250yg 50pg -
3 Idêntico a 1 Idêntico a 1 1Í0pg lOOyg 1mg 250yg - SOyg
4 Idêntico a 1 11OP0 100yg 1mg 250yg 50yg 60yg
108
Tabela 6: Composição final das formulações 5 a 8, preparadas com vacina Aggripal™ (1 ml)
Grupo Antígeno DOPC Colesterol MPL QS21
5 1 dose de vacina Aggripal — — —
6 Idêntico a 5 1rng 250gg 50pg -
7 Idêntico a 5 1mg 250pg - 50pg
8 Idêntico a 5 . 1mg 250pg 50pg SOpg
IV. 1.3. Leituras (Tabela 7)
Tabela 7
Leitura Ponto Tempo Tipo Amostra In/Po Método Análise
Anticorpos Anti-HI (títulos HI) Dia 21 Pós- Imunização (Dia 49) Soros In Teste inibição hemaglutinação
CD4, CD8, IL- 2, IFN-γ (FACS) Dia 7 Pós Imunização (Dia 35) PBLs Po Tingimento Citocina Intracelular (ICS)
In = individual / Po = Pool
IV.2. Resultados
IV.2.1. Resposta humoral (títulos HI 21 dias pós imunização)
Respostas Humoraispor títulos HI-Figura 4
A atividade de inibição de hemaglutinação contra as três cepas de vacina (A/New Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) foi detectada em soros de 8 animais por grupo no Dia 21 pós-imunização.
> Comparado com camundongos imunizados com PBS, um aumento em títulos HI foi observado após imunização com todos os candidatos de vacina Flu, testados para todas três cepas (vacina Trivalente dividida ou Trivalente subunitária) > Para todas três cepas, títulos HI mais elevados estatisticamente significativos foram observados em camundongos imunizados com Trivalente dividida com adjuvante DQS21 MPL/QS21 em lipossomas, em comparação com camundongos imunizados com Flu Trivalente dividido simples ou com Lipossomas contendo 3D-MPL apenas. A classificação para a resposta humoral foi como segue: (MPL/QS21 em
109 lipossomas = DQS21 apenas) > (Lipossomas contendo 3D-MPL apenas = Simples) > PBS > Para todas as três cepas, títulos HI mais elevados, estatisticamente significativos, foram observados em camundongos imunizados com Trivalente subunitária com DQS21 apenas, Lipossomas contendo 3D-MPL apenas ou MPL/QS21 em lipossomas, em comparação com camundongos imunizados com Trivalente dividido simples. A classificação para a resposta humoral foi como segue: (MPL/QS21 em lipossomas = DQS21 apenas = Lipossomas contendo 3D-MPL apenas) > Simples > PBS.
> Trivalente Dividida e Trivalente subunitária induziram títulos HI similares, quando formulações não receberam ou receberam DQS21 apenas ou MPL/QS21 em lipossomas.
IV.2.2. Resposta imune mediada por célula (ICS no dia 7 pós imunização
Respostas de células T CD4 — Figura 5
PBMCs de 8 camundongos por grupo foram colhidas no Dia 7 Pós-imunização e testadas em 4 pools de 2 camundongos/grupo.
Em termos de células T CD4+ totais específicas de vírus integral Flu (expressando IL-2, IFN-γ e ambas as citocinas):
> Qualquer que seja a formulação, respostas de célula T CD4+ idênticas foram observadas entre as vacinas subunitárias Trivalentes divididas e Trivalente subunitárias.
> Respostas de células T CD4+ mais elevadas foram observadas para formulações Trivalentes (divididas ou subunitárias) com adjuvante MPL/QS21 em lipossomas, quando comparadas com formulações Trivalentes (divididas ou subunitárias) simples ou com adjuvante de Lipossomas contendo 3D-MPL apenas ou DQS21 apenas.
> Para a resposta celular induzida por uma formulação
110 $
Trivalente (dividida ou subunitária), há um efeito sinérgico de Lipossomas contendo 3D-MPL + DQS21, em comparação com apenas DQS21 ou Lipossomas contendo apenas 3D-MPL.
> A ordem para a resposta celular foi como segue:
MPL/QS21 em lipossomas > (Lipossomas contendo 3D-MPL apenas = DQS21 apenas = Simples = PBS).
IV. 3. Resumo dos resultados e conclusões > Para todas as três cepas, títulos HI mais elevados, estatisticamente signifícantes, foram observados em camundongos imunizados com formulações Trivalentes (divididas ou subunitárias) com adjuvante DQS21 apenas ou MPL/QS21 em lipossomas, em comparação com camundongos imunizados com formulações Trivalentes (dividas ou subunitárias) simples. Os lipossomas contendo 3D-MPL apenas pareciam induzir mais elevada resposta humoral, quando formulados com Trivalente subunitária do que Trivalente dividida.
> Qualquer que seja a formulação, respostas de célula T CD4+ similares foram obtidas para Trivalente dividida (Fluarix) e Trivalente subunitária (Agrippal).
> Formulações trivalentes (divididas ou subunitárias) com adjuvante MPL/QS21 em lipossomas induziram mais elevadas respostas de células T CD4+, em comparações com formulações Trivalentes (divididas ou subunitárias) simples ou com adjuvante de Lipossomas contendo 3D-MPL apenas ou QS21 em lipossomas (DQS21) apenas.
Exemplo V - comparação pré-clínica de uma vacina contendo uma preparação de antígeno influenza dividido, com adjuvante 3DMPL/QS21 em uma formulação lipossomal (3D-MPL em duas diferentes concentrações)
V. l - camundongos
V.l.l - projeto experimental e objetivo
111
Camundongos C57B1/6 imprimados com cepas heterólogas foram usados para este experimento. A finalidade foi analisar as respostas imunes humoral (títulos HI) e CMI (ICS, tingimento de citocina intracelular), induzidas por uma vacina Trivalente dividida comercialmente disponível í-p» r
GlaxoSmithKline (Fluarix ) em forma sem adjuvante e, quando com adjuvante, com lipossomas contendo duas diferentes concentrações de 3DMPLeQS21.
V. 1.2 - Tratamento/Grupo
Camundongos fêmeas C57B1/6, com a idade de 8 semanas, foram obtidos de Harlan Horst, Países Baixos. Os camundongos foram imprimados intranasalmente no dia 0 com cepas heterossubtípicas (A/Beijing/262/95, H3N2 A/Panama/2007/99, B/Shangdong/7/97). No dia 28, os camundongos foram injetados intramuscularmente com Trivalente Dividida (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu) simples ou com adjuvante com duas diferentes concentrações de imunoestimulantes em formulações lipossomais (vide grupos na tabela 8 abaixo).
Tabela S
Grupo Antígeno(s) + dosagem Formulação + dosagem Outros tratamentos
1 Trivalente Split Flu - 1,5 pg/cepa/50 μΐ Simples (plain) Iniciação heteróloga de DO total inativado 50 pg/20 μΐ intranasalmente
2 Trivalente Split Flu - 1,5 pg/cepa/50 μΐ Lipossomas contendo 3DMPL 50 pg por dose de 0,5 ml Iniciação heteróloga de DO total inativado 50 pg/20 pl intranasalmente
3 Trivalente Split Flu - 1,5 pg/cepa/50 μΐ DQS21 50 pg por dose de 0,5 ml Iniciação heteróloga de DO total inativado 50 pg/20 μΐ intranasalmente
4 Trivalente Split Flu - 1,5 pg/cepa/50 pl MPL e QS21 25 pg por dose de 0,5 ml Iniciação heteróloga de DO total inativado 50 pg/20 pl intranasalmente
5 Trivalente Split Flu - 1,5 pg/cepa/50 μΐ MPL e QS21 50 pg por dose de 0,5 ml Iniciação heteróloga de DO total inativado 50 pg/20 pl intranasalmente
6 PBS Nenhum Iniciação heteróloga de DO total inativado 50 pg/20 pl intranasalmente
112
As formulações foram preparadas como no exemplo IV.
V. 1.3 - Resultados
Resposta humoralpor títulos HI - Figura 24
A atividade de inibição da hemaglutinação contra as 3 cepas de vacina foi deletada em soros de 9 animais/grupo no dia 21 pós imunização.
> Em comparação com camundongos imunizados com PBS, um aumento dos títulos HI foi observado após imunização com todos os candidatos de vacina Flu testados para todas três cepas.
Para todas três cepas, títulos HI mais elevados, significativos, foram observados em camundongos Trivalente Dividida com adjuvante MPL e QS21 em estatisticamente imunizados com concentração comparada com camundongo imunizado com a Trivalente Flu Dividida Simples (p valor máx = 0,03) > Diferença não estatisticamente significativa foi observada entre os dois grupos com adjuvante lipossomal
Resposta imune mediata por célula (ICS no dia 7 pós-imunização) - Figura 25.
PBMC’s de 9 camundongos/grupo foram colhidas 7 dias pós imunização e testadas em três pools de 3 camundongos/grupos. Em termos de células T CD4+ específicas de vírus Flu, expressando IL-2, IFN-γ ou ambas as citocinas:
Como pode ser visto pela figura 25, as mais elevadas respostas específicas de células T CD4+ IFN-γ foram obtidas após imunização com trivalente dividida com adjuvante da mais elevada concentração de imunoestimulantes. Entretanto, as respostas de célula T IL2 e IL2+ IFN-γ foram similares entre as duas concentrações de imunoestimulantes.
Exemplo VI - Experimento clínico em uma população idosa com a idade acima de 65 anos, com uma vacina contendo uma preparação de antígeno influenza dividido, tendo como adjuvante MPL/QS21 em uma
113 formulação lipossomal (3D-MPL em duas diferentes concentrações)
VI.l. Projeto de estudo e objetivos
Um estudo de fase I/II aleatorizado aberto, para demonstrar a não inferioridade em termos de resposta imune mediada por celular de vacinas candidatas de influenza GlaxoSmithKline Biologicals, contendo vários adjuvantes administrados em população idosa (com a idade de 65 anos e mais velha), em comparação com Fluarix™ (conhecido como α-Rix™ na Bélgica), administrado em adultos (18-40 anos)
Quatro grupos paralelos foram designados:
· 75 adultos (com idade de 18-40 anos) em um grupo de controle recebendo uma dose de Fluarix™ (grupos Fluarix) • 200 indivíduos idosos (idade de 65 anos ou mais) aleatorizados 3:3:2 em três grupos:
um grupo com 75 indivíduos recebendo vacina influenza com adjuvante ASO 1B um grupo com 75 indivíduos recebendo vacina influenza com AS01E
Grupo Flu de referência com 50 indivíduos recebendo uma dose de Fluarix™
Objetivo Primário
O objetivo primário é demonstrar a não inferioridade 21 dias pós-vacinação das vacinas de influenza com adjuvante, administradas em _ qnit jf indivíduos idosos (idade de 65 anos e mais), em comparação com Fluarix administrado em adultos (idade de 18-40 anos) em termos de freqüência de linfócitos-T CD4 específicos de influenza, produzindo pelo menos duas diferentes citocinas (CD40L, IL-2, TNF-a, IFN-γ).
Objetivos Secundários
Os objetivos secundários são:
1) avaliar a segurança e reatogenicidade da vacinação com
114 vacinas de influenza candidatas com adjuvante durante 21 dias, em seguida à administração intramuscular da vacina em indivíduos idosos (com 65 anos ou mais). Fluarix™ é usado como referência.
2) avaliar a resposta imune humoral (título antihemaglutinina) 21, 90 e 180 dias após a vacinação com vacinas candidatas de influenza com adjuvante. Fluarix é usado como referência.
Objetivo Terciário
O objetivo terciário é avaliar a resposta imune mediada por célula (produção de IFN-γ, IL-2, CD40L e TNF-α e resposta de célula de memória-B) 21, 90 e 180 dias após vacinação com vacinas de influenza com adjuvante. Fluarix™ é usado como referência.
VL2. Composição e administração da vacina
Dois diferentes adjuvantes foram usados:
1. AS01B um adjuvante baseado em lipossoma, contendo 50 pgMPLeQS21
2. AS01E uma formulação duplamente diluída de AS01B
Controle: dose total de Fluarix™ por administração IM.
Todas as vacinas são destinadas a administração intramuscular. As cepas usadas nas cinco vacinas são as que foram recomendadas pela WHO para a estação do Hemisfério do Norte de 2005 2006, isto é, adoçante A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/New York/7/2004 (H3N2) e B/Jiangsu/10/2003.
Os três antígenos de virion divididos inativados (massas monovalentes) usadas na formulação da vacina candidata de influenza com adjuvante são exatamente os mesmos que os ingredientes ativos usados na qpX j| 'Τ'Χ jf formulação do Fluarix /a-Rix comercialmente disponível - vacina de influenza inativada de virion dividida da GSK Bio. Eles são derivados de vírus cultivados em ovo. As cepas de influenza são as recomendadas para a estação 2005/2006, como usado na formulação do Fluarix™/a-Rix™
115
2005/2006 comercial.
As cepas usadas nas três vacinas são as que foram recomendadas pela WHO para a estação do Hemisfério Norte de 2005-2006, isto é, • A/New Caledonia/20/99 (HM) IVR-116 • A/New York/7/2004 (H3N2) NYMC X-157 • B/Jiangsu/10/2003 'Τ'Ν Λ 'Τλ Λ
Como Fluarix /a-Rix , a vacina com adjuvante contém 15 pg de hemaglutinina (HA) de cada cepa de vírus influenza por dose.
VI.2.1. Descrição dos lotes de vacina com adjuvante AS01B
A vacina candidata com adjuvante AS01B é uma vacina de 2 componentes, consistindo de um antígeno de virion dividido inativado trivalente concentrado, apresentado em um frasco de vidro e de um frasco de vidro contendo o adjuvante AS01B. Na ocasião da injeção, o teor da frasco de adjuvante é retirado e injetado dentro do frasco que contém o antígeno de virion dividido inativado trivalente concentrado. Após mistura, o conteúdo é retirado para dentro da seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular. A agulha usada é substituída por uma agulha intramuscular e o volume é corrigido a 1 ml. Uma dose da vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B corresponde a 1 ml.
A vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B é uma vacina livre de preservativo.
VI.2.2. Composição do lote clínico com adjuvante AS01B
Uma dose da vacina influenza com adjuvante AS01B corresponde a 1 ml. Sua composição é dada na Tabela 8. Ela contém 15 pg HA de cada cepa do vírus influenza como na vacina Fluarix™/a-Rix® registrada.
116
Tabela 8 - Composição (componentes influenza e adjuvante) da vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B
Componente Quantidade por dose Referência analítica
Ingredientes ativos
Vírions divididos inativados -A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 -A/New York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157 -B/Jiangsu/10/2003 15pgHA 15pgHA 15 pgHA Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158
Adjuvante AS01B
- Lipossomas • dioleil fosdaatidilcolina (DOPC) •Colesterol • MPL 1000 pg 250 pg 50 pg GSK Bio 3217 Ph. Eur. 0993 GSK Bio 2972
-QS21 50 pg GSK Bio 3034
VI.2.3. Método de produção do lote de vacina com adjuvante AS01B
A manufatura da vacina influenza com adjuvante AS01B consiste de três etapas principais:
• Formulação da massa final trivalente (2 x concentrada) sem adjuvante e enchimento do recipiente de antígeno • Preparação do adjuvante AS01B • Reconstituição extemporânea da vacina de vírus dividido com adjuvante AS01B.
Formulação da massa final trivalente sem adjuvante e carga no recipiente de antígeno
Os volumes das três massas monovalentes são baseadas no teor de HA medido em cada massa monovalente antes da formulação e em um volume alvo de 1320 ml.
Solução salina tamponada com fosfato concentrada PO4 Na/K2 (80 μΐ/dose) e uma pré-mistura de Tween 80, Trion X-100 e succinato de atocoferil hidrogênio são diluídas em água para injeção. As três monomassas concentradas (A/New Caledonia/20/99 IVR-116, A/New York/7/2004 NYMC X-157, B/Jiangsu/10/2003) são então sucessivamente diluídas na solução
117
MP salina tamponada com fosfato resultante / Tween 80 - Triton X-100 - solução de succinato hidrogenado de a-tocoferila (pH 7,8, 81 mM NaCl, 1,56 mM KC1, 4,79 mM Na2HPO4, 0,87 mM KH2PO4, 7,2 mM NaH2PO4, 72,8 mM K2HPO4, 750 mg/ml Tween 80, 110 mg/ml Triton X-100 e 100 mg/ml succinato hidrogenado de α-tcoferila), a fim de ter-se uma concentração final de 30 pg de cepas HA de A (H1N1 e H3N2) por ml de massa final trivalente (15 pg HA/ cepa A / 500 pl massa final trivalente) e 35 pg HA de cepa B (17,5 pg HA/ cepa B / 500 pl massa final trivalente). Entre a adição de cada massa monovalente, a mistura é agitada por 10-30 minutos em temperatura ambiente. Após adição da última massa monovalente, a mistura é agitada por 10-30 minutos em temperatura ambiente. Após adição da última massa monovalente e 15 - 30 minutos de agitação, o pH é verificado e ajustado a 7,65 ± 0,25 com HC1 ou NaOH.
A massa final trivalente de antígenos é assepticamente colocada em frascos de vidro Tipo I (Ph. Eur.) estéreis de 3-ml. Cada frasco contém um volume de 600 pl (500 pl + 100 p carga extra).
Preparação de massa de adjuvante AS01B e enchimento no recipiente de adjuvante
O adjuvante AS01B é preparado por mistura de dois componentes: QS21 e MPL contendo lipossomas. A preparação de cada um destes componentes é resumida abaixo. QS21 é um glicosídeo triterpeno, obtido da casca de árvore de Quillaja saponiaria e é produzido por Aquila Worchester, MA, USA (agora Antigenics).
QS21 é fornecido a GSK Biologicals como um pó liofilizado. A preparação de QS21 na GSK Bio da suspensão de pó de QS21 em água para injeção, em uma concentração de aproximadamente 5 mg/ml, ajuste de pH a pH 6,0 ± 0,2 e filtragem estéril. A massa líquida de QS21 é armazenada a -20 °C em recipientes de polietileno.
MPL é o 3-O-deacil-4’-monofosforil lipídeo A, obtido por
118 hidrólises ácida e básica seqüencial do lipopolissacarídeo da cepa Re595 de Salmonella minnesota. É produzido por GSK Biologicals, Hamilton, Montana. MPL em massa é suprido como o sal liofílizado de tríetilamina (TEA).
No processo de produção de lipossomas contendo MPL, DOPC (Dioleil fosfatidilcolina), colesterol e MPL são dissolvidos em etanol. Uma película de lipídeo é formada por evaporação de solvente sob vácuo. Solução salina de Tampão de Fosfato, produzida de 9 mM Na2HPO4, 41 mM KH2PO4, 100 Mm NaCl a pH 6.1, é adicionada e a mistura é submetida a préhomogeneização, seguido por homogeneização de alta pressão a 15.000 psi
Λ (1055 kg/cm ) (± 20 ciclos). Isto resulta na produção de lipossomas, que são filtrados estéreis através de uma membrana de 0,22 pm em uma área asséptica (classe 100). O produto estéril é então distribuído em recipientes de vidro estéreis e armazenado no recinto frio (+2 a + 8 °C).
A preparação de massa estéril de lipossomas é misturada com solução de massa QS21 estéril. Após 30 min de agitação, esta mistura é adicionada a uma mistura de água para injeção e fosfato 500 mM, NaCl 1M pH 6,1, quando diluída 10 vezes. A quantidade do fosfato 500 mM, NaCl 1M pH 6.1, quando diluída 10 vezes, é calculada para alcançar isotonicidade no volume final. O pH é verificado. O adjuvante é então filtrado estéril (0,22 pm) e assepticamente distribuído dentro de frascos. Os frascos são armazenados a +2 a + 8 °C.
O diluente AS01B é um líquido incolor opalescente, livre de partículas estranhas, contidas em um frasco de vidro estéril tipo 1. A carga alvo para cada frasco é de 0,7 ml, a fim de atender à especificação (> 0,5 ml). Reconstituição extemporânea da vacina de vírus dividida com adjuvante AS01B
Na ocasião da injeção, o conteúdo do frasco contendo o adjuvante é retirado e é injetado dentro do frasco que contém os antígenos de
119 t virion divididos inativados trivalentes concentrados. Após mistura, o conteúdo é retirado para dentro da seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular e o volume é corrigido para 1 ml. Uma dose da vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B corresponde a 1 ml.
VI.2.4. Descrição dos lotes de vacina com adjuvante AS01E
A vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B é uma vacina de 3 componentes, consistindo de antígenos de virion divididos inativados trivalentes concentrados, apresentados em um frasco de vidro, um frasco de vidro contendo o adjuvante AS01B e um frasco de vidro contendo o diluente (solução de cloreto de sódio para injeção) para a diluição de duas vezes de AS01B.
Para preparar o adjuvante AS01E, o conteúdo do frasco de diluente é retirado com uma seringa e injetado dentro do frasco contendo o adjuvante AS01B, seguido por mistura. Na ocasião da injeção, 600 μΐ de adjuvante AS01E são retirados com uma seringa do frasco AS01E e injetados dentro do frasco que contém os antígenos de virion divididos inativados trivalentes concentrados. Após misturar o conteúdo é retirado para dentro da seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular. Uma dose da vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B corresponde a 1 ml.
A vacina candidata de influenza com adjuvante AS01B é uma vacina livre de preservativo.
VI.2,5. Composição do lote clínico com adjuvante AS01E
Um dose da vacina influenza com adjuvante AS01E corresponde a 1 ml. Sua composição é dada na Tabela 9. Ela contém 15 pg HA de cada cepa do vírus influenza como na vacina Fluarix™/a-Rix®.
120
Tabela 9 Composição (componentes de influenza e adjuvante) da vacina candidata de influenza com adjuvante AS01E reconstituída
Componente Quantidade por dose Referência analítica
1“ jredientes ativos
Vírions divididos inativados -A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 15 Mg HA Ph. Eur. 158
-A/New York/55/2004 (H3N2) NYMCX-157 15 Mg HA Ph. Eur. 158
-B/Jiangsu/10/2003 15 Mg HA Ph. Eur. 158
Adjuvante AS01B
- Lipossomas • dioleil fosdaatidilcolina 500 Mg GSK Bio 3217
(DOPC) •Cólesterol 125 Mg Ph. Eur. 0993
• MPL 25 Mg GSK Bio 2972
-QS21 25 gg GSK Bio 3034
VI.2.6. Método de produção do lote de vacina com adjuvante AS01E
A manufatura da vacina influenza com adjuvante AS01B consiste de três principais etapas:
• Formulação da massa final trivalente (2 x concentrada) sem adjuvante e carga no recipiente de antígeno • Preparação do adjuvante ASO 1B • Preparação do adjuvante ASO 1E, seguido por reconstituição extemporânea da vacina de vírus dividido com adjuvante AS01E
Formulação da massa final trivalente sem adjuvante e carga no recipiente de antígeno
É feita referência à seção V.2.3 para a vacina influenza com adjuvante AS01B.
Preparação de massa com adjuvante AS01B e carga no recipiente com adjuvante
É feita referência à seção V.2.3 para a vacina influenza com adjuvante AS01B.
Reconstituição extemporânea da vacina de vírus dividido com adjuvante ÁS01E
121
V
Para preparar o adjuvante AS01E, o conteúdo do frasco de diluente é retirado com uma seringa e injetado dentro do frasco contendo o adjuvante AS01B, seguido por mistura. Na ocasião da injeção, 600 μΐ de adjuvante AS01E são retirados com uma seringa do frasco AS01E e injetados dentro do frasco que contém os antígenos de virion divididos inativados trivalentes concentrados. Após mistura, o conteúdo é retirado para dentro da seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular. Uma dose da vacina de candidato de influenza com adjuvante AS01E corresponde a 1 ml.
Quatro visitas programadas por indivíduo: nos dias 0, 21, 90 e
180 com amostra de sangue coletada em cada visita para avaliar a imunogenicidade.
Programa de vacinação: uma injeção de vírus influenza no dia 0
VI.2.7 - Ensaios imunológicos Hemaglutinação - ensaio de inibição
A resposta imune é determinada medindo-se os anticorpos da inibição de hemaglutinação (HI) usando-se o método descrito pelo WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Diseases Control, Atlanta, USA (1991). As medições de título anticorpo foram conduzidas em amostras de soro descongeladas congeladas com um micrométodo padronizado e compreensivamente validado, empregando-se 4 unidades de inibição de hemaglutinação (4 HIU) dos antígenos apropriados e uma suspensão de 0,5% de eritrócito de galinha. Os inibidores de soro não-específicos foram removidos por tratamento com calor e enzima destruidora de receptor. Os soros obtidos foram avaliados quanto aos níveis de anticorpo de HI. Começando com uma diluição inicial de 1:10, uma série de diluição (em um fator de 2) foi preparada até uma diluição final de 1:20480. O ponto final da titulação foi considerado como a etapa da mais elevada diluição que mostra completa inibição (100%) de hemaglutinação. Todos os ensaios foram realizados em duplicata.
122
A Citometria de Fluxo de Citocina (CFC) usada para avaliar a freqüência da(s) citocina(s) - linfóticos T CD4 ou CD8 positivos.
As células T CD4 e CD8 específicas de antígeno de sangue periférico podem ser reestimuladas in vitro para produzir CD40L, IL-2, TNFoc e IFN-γ se incubadas com seu correspondente antígeno. Conseqüentemente, as células T CD4 e CD8 podem ser enumeradas por citometria de fluxo seguindo-se rotulação de imunofluorescência convencional de fenótipo celular, bem como produção de citocinas intracelulares. No presente estudo, os antígenos de vacina da influenza serão usados como antígenos para reestimular as células T específicas de influenza. Os resultados serão expressos como uma freqüência de célula T CD4 ou CD8 positiva de citocina(s) dentro da sub-população de célula T CD4 ou CD8.
ELISPOT usado para avaliar a freqüência da célula de memória B
A tecnologia Elispot de célula B permite a quantificação de células da memória B específicas para um dado antígeno. As células de memória B pode ser induzidas para diferenciar-se em células de plasma in vitro, em seguida ao cultivo com CpG por 5 dias. As células de plasma específicas de antígeno geradas in vitro pode, portanto, ser enumeradas usando-se o ensaio elispot de célula-B. Resumidamente, as células de plasma geradas in vitro são incubadas em placas de cultura revestidas com antígeno. As células de plasma específicas de antígeno formarão sítios de anticorpo/antígeno, que podem ser detectados por procedimento imunoenzimático convencional. No presente estudo, as cepas de vírus influenza ou imunoglobulina anti-humana são usadas para revestir placas de cultura, a fim de enumerar células de plasma anti-influenza ou de secreção IgG, respectivamente. Os resultados são expressos como uma freqüência de plasma específico de antígeno dentro de um milhão de células de plasma produtoras de IgG.
123
Caracterização Exploratória de PBMCs
A expressão dos marcadores de tensoativação selecionados (isto é, CD4, CD8, CD455O, CD45RA, CD28, CD27 ou alguns KIR) pode ser realizada. A função dos linfócitos T induzidos pela vacina podem ser consignadas pela análise dos marcadores residentes (isto é, CCR7, CXCR5), das citocinas (citocinas auxiliar 1 ou auxiliar 2) ou analisando-se a expressão dos fatores associados comas funções reguladoras, tais como Foxp3, CTLA-4 ou TGFp. Em particular, a população CD8+CD28 ou outras populações de células reguladoras podem ser analisadas em relação às respostas das células
B e T humorais ao antígeno da vacina.
VL3. Resultados da Imunogenicidade
VI.3.1. Pontos finais CMI e resultados
A fim de caracterizar a resposta CMI após vacinação com as vacinas de influenza com adjuvante, os linfócitos-T CD4 e CD8 foram reestimulados in vitro usando-se antígenos das três cepas de vacina (usadas individualmente ou em pool). Os linfócitos-T CD4/CD8 específicos de influenza foram enumerados por citometria de fluxo, em seguida a rotulação de imunofluorescência convencional de produção de citocinas intracelulares (IL-2, IFN-γ, TNF-α e CD40L).
Avaliação do ponto final primário
No dia 21: resposta CMI em todos os indivíduos, em termos de freqüência de linfócito T CD4 específico de influenza por 106 em testes produzindo pelo menos duas diferentes citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α e CD40L).
Para a avaliação da resposta CMI, a freqüência de CD4 específica de influenza é analisada como segue:
Usando-se a abordagem de não-inferioridade, a não inferioridade de pelo menos uma vacina candidata com adjuvante de influenza (administrada a idosos com a idade > 65 anos - o grupo denominado Flu
124 'Τ'Κ <
idoso ou Flu ELD) comparada com Fluarix (administrada a adultos com a idade de 18-40 anos - o grupo denominado Flu Young ou Flu YNG) foi alcançada quando o limite superior do intervalo de confiança de 98,75% de dois lados na relação da Média Geométrica (GM) (entre o grupo de Fluarix™ (18 - 40 anos) e a vacina candidata com adjuvante influenza (grupo > 65 anos) em termos de ffeqüência de células-T CD4 específicas de influenza, produzindo pelo menos duas citocinas no dia 21, foi abaixo de 2,0 T7r f CÍAÍFluarix adultos
ÜZmwa TE?--«2
Adjuvante influenza J
Os 98,75% de Cl das relações GM, 21 dias após vacinação, foram computados usando-se uma análise do modelo de covariância (ANCPVA) da transformação de logaritmo 10 das ffeqüências. O modelo ___ ψΐ f ANCOVA incluiu o grupo de vacina como efeito fixo (Fluarix (18 - 40 anos), versus a vacina candidata com adjuvante influenza (> 65 anos)) e a freqüência de pré-vacinação como um regressor. A relação GM e seus 98,75% Cl são derivados como transformação-exponencial do correspondente contraste de grupo do modelo. Os 98,75 Cl para GM ajustado é obtido por transformação exponencial dos 98,75% Cl para o grupo média de quadrados mínimos do modelo ANCOVA acima.
Resultados - Análise Inferencial (Tabela 10)
As GM e relações GM ajustadas (com seus 98,75% Cl) de linfócito T CD4 específico de influenza, produzindo pelo menos duas citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α e CD40L) no dia 21, após reestimulação in vitro com “antígenos II em pool”, são apresentadas na Tabela 10. Para cada vacina de influenza com adjuvante, o limite superior dos 98,75% Cl de dois lados da relação GM é muito abaixo do limite clínico de 2,0. Isto mostra a não-inferioridade de ambas as vacinas de influenza com adjuvante para indivíduos idosos, em comparação com a vacina Fluarix administrada em adultos com a idade entre 18 e 40 anos, em termos de frequência pósvacinação de CD4 específico de influenza.
125
Tabela 10 Relação GM ajustada de células CD4 T específicas de influenza produzindo pelo menos duas citocinas após reestimulação com antígenos de vacina em pool, Dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)
Relação GM (Flu YNG/ AS01B)
Flu YNG ASQ1B 98,8% Cl
N GM N GM Valor LL UL
74 2844,8 71 2725.6 1.M 0,79 1.38
Relação GM (Ru YNG/A801E)
Flu YNG AS01E 98.8% Cl
N GM N GM . i Valor LL UL
74 2879.8 74 2697.0 | |l.07 0.79 1,44
GM ajustada = média geométrica anticorpo ajustada para título de linha de referência; N = Número de indivíduos com resultados tanto de pré como de pós-vacinação disponíveis; 98,8% Cl = 98,8% intervalo de confiança para a relação GM ajustada (modelo Ancova; ajuste para a linha de referência); LL = limite inferior, UL = limite superior; Fonte dados = Apêndice tabela IIIA Resultados - Análise descritiva (Figura 6)
Os principais achados foram:
1) Antes da vacinação a resposta CMI é mais elevada em adultos jovens do que em idosos
2) Após vacinação:
- houve um efeito de reforço da vacina de influenza na resposta CMI em adultos jovens (18 - 40 anos).
- a resposta CMI no idoso tendo recebido a vacina de influenza com adjuvante é comparável com a resposta CMI de adultos jovens.
A diferença entre a pré e pós-vacinação das respostas de linfócitos-T CD4 para todas as citocinas investigadas (IL-2, CD40L, TNF-α e IFN-γ) foi significativamente mais elevada com as vacinas com adjuvante ηρκ jí comparadas com Fluarix para todos os testes.
Análise do objetivo terciário:
A fim de avaliar o ponto final terciário, a ffeqüência dos linfócitos T CD4/CD8 e células de memória-B específicos de influenza foi medida nos dias 0, 21, 90 e 180.
126 • A frequência dos linfócitos-T CD4/CD8 positivos-citocina específicos de influenza foi resumida (estatística descritiva) para cada grupo de vacinação nos dias 0 e 21, para cada antígeno.
• Um teste não-paramétrico (teste Wilcoxon) foi usado para comparar o local da diferença entre os dois grupos (vacina com adjuvante de 'ρκ <
influenza versus Fluarix ) e o valor-p estatístico é calculado para cada antígeno em cada teste diferente.
• Estatística descritiva em diferença individual entre respostas de dia 21/dia 0 (Pós-Pré-vacinação) é calculada para cada grupo de vacinação e cada antígeno em cada teste diferente.
• Um teste não-paramétrico (teste Wilcoxon) é usado para comparar a diferença individual Pós-/Pré-vacinação e o valor-p estatístico será calculado para cada antígeno em cada diferente teste.
Os valores-p do teste Wilcoxon usado para comparar a diferença da freqüência dos linfócitos-T CD4 específicos da influenza são apresentados na Tabela 11.
Resultados - Avaliação do ponto final terciário (Tabela 11)
As conclusões principais são:
• As freqüências GM de pré-vacinação de células T CD4
específicas de influenza foram similares em todos os grupos de indivíduos idosos, porém superiores nos adultos com a idade entre 18 e 40 anos.
• Em indivíduos idosos, a freqüência de pós-vacinação (dia 21) de linfócitos T CD4 específicos de influenza foi significativamente mais elevada após vacinação com vacinas com adjuvante do que com Fluarix .
• A freqüência pós-vacinação de linfócitos T CD4 específicos de influenza permaneceu mais baixa em indivíduos idosos vacinados com vacinas com adjuvante AS01B ou AS01E do que em adultos __ 'TNX com a idade entre 18 e 40 anos, vacinados com Fluarix .
• A freqüência GM de pré-vacinação e pós-vacinação de
127 célula T CD8 específica de influenza foi essencialmente similar em todos os grupos.
Tabela 11 Estatística inferencial: valores-p de Testes Kruskal-Wallis para células T CD4 em cada ponto do tempo (Coorte ATP para imunogenicidade)
Descrição do teste Valor P
ASOIBvs. Flu YNG ASOIEvs, Flu YNG
dia 0 dia 21 dia Õ dia 21
TODOS DUPLOS <0.0001 0.0070 <0,0001 0.0025
CD4OL <0.0001 0.0056 <0.0001 0.0015
IFNy <0.0001 0.0009 <0.0001 0.0006
IL2 <0.0001 0.0029 <0.0001 0.0021
TFNa <0.0001 0.0295 <0.0001 0.0378
ASOIBVS. F1U El .0 ASOIEvfkFlu ELD
dia 0 dia 21 dia 0 dia 21
TODOS DUPLOS 0.6165 0.0004 0.8744 0.0018
CD4OL 0.7560 0.0005 0.9504 0.0021
IFNy 0.9936 Õ.ÕÓÕ8 0.9835 0.0029
IL2 0.6702 0.0011 0.7855 0.0023
TFNa 0.5460 0.0022 0.6688 0,0040
Resultados — Avaliação dos pontos finais da resposta imune Humoral Variáveis observadas:
Nos dias 0, 21, 90 e 180: títulos de anticorpo de inibição de hemaglutinação (HI), testados separadamente em relação a cada uma das três cepas do vírus influenza, representados na vacina (anti-HINl, anti-H3N2 & anti-B-anticorpos).
O valor do corte do anticorpo HI em relação a todos os antígenos de vacina foi definido pelo laboratório antes da análise (e iguala 1:10). Um indivíduo soronegativo é um indivíduo cujo título de anticorpo está abaixo do valor de corte. Um indivíduo soropositivo é um indivíduo cujo título de anticorpo é maior do que ou igual ao valor de corte. O título de anticorpo abaixo do corte do ensaio recebe um valor arbitrário de metade do corte.
Com base nos títulos de anticorpo HI, os seguintes parâmetros são calculados:
• Títulos de média geométrica (GMTs) do anticorpo HI nos dias 0 e 21, calculados adotando-se o anti-log da média das transformações de
128 título log.
• Fatores de soroconversão (SF) no dia 21, definidos como o aumento de vezes dos GMTs HI do soro no dia 21, em comparação com o dia
0.
• Taxas de soroconversão (SC) no dia 21, definidas como a percentagem de vacinados com um título de HI de pré-vacinação < 1: 10 e um título pós-vacinação > 1:40, ou um título de pré-vacinação > 1:10 e um aumento mínimo de 4 vezes no título de pós-vacinação.
• Taxas de soroproteção (SPR) no dia 21, definidas como a percentagem de vacinados com um título HI de soro > 1:40.
O Cl de 95% para GM são obtidos dentro de cada grupo separadamente. O Cl de 95% para a média do título log-transformado é primeiro obtido admitindo-se que os títulos log-transformados são normalmente distribuídos com variação desconhecida. O Cl de 95% para a GM é então obtido por transformação exponencial do Cl de 95% para a média do título de log-transformado.
O resultado sorológico faltante para uma medição anticorpo particular não é substituído. Portanto, um indivíduo sem resultado sorológico em um dado ponto do tempo não contribui para a análise do ensaio para aquele ponto do tempo.
Resultados da resposta imune humoral (Figura 7 e Tabela 12)
Os GMTs de pré-vacinação de anticorpos HI para todas as 3 cepas de vacina estavam dentro da mesma faixa nos 4 grupos de tratamento. Após vacinação, há um claro impacto dos 2 adjuvantes que aumentam a resposta humoral em idosos, em comparação com o Fluarix padrão da mesma população (Figura 7, mostrado em uma escala linear, porém o mesmo impacto obviamente visto se mostrado em uma escala logarítmica).
Os GMTs são • significativamente mais elevados para H1N1 para AS01E
129 • significativamente mais elevados para H3N1 para ambos os adjuvantes.
• Não foi observada diferença significativa em termos de GMTs de pós vacinação entre os dois grupos de indivíduos tendo recebido as vacinas com adjuvante.
Vinte e um dias após vacinação, os indivíduos de Fluarix (18 40 anos) tinham uma resposta HI mais elevada para cepas New Caledonia e B/Jangsu.
Como mostrado na Tabela 12, as vacinas de influenza com adjuvante excederam as exigências das autoridades Européias para registro anual das vacinas de influenza de virion dividido [Note for Guidance on Harmonization of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes (CPMP/BWP/214/96)] em indivíduos com idade acima de 60 anos.
Após vacinação, houve uma diferença estatística em termos de taxas de soroproteção de anticorpos HI entre o grupo de Fluarix (> 65 anos) e • Flu/ASOIB e Flu/ASOIE para cepa A/H1N1/ New Caledonia
Para cada cepa de vacina, as taxas de soroproteção para os 2 grupos de vacina de influenza com adjuvante são na mesma faixa em comparação com o grupo Fluarix (18-40 anos).
Para cada cepa de vacina, as taxas de soroconversão para os 2 grupos de vacina de influenza com adjuvante são na mesma faixa, em comparação com o grupo de Fluarix (18-40 anos), exceto para a cepa New Caledonia.
130
Tabela 12 Taxas de soroproteção, taxas de soroconversão e fatores de conversão no dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)
Cepas Grupo N Taxa de soroproteção (Título HI 40) % ] Taxa de soroconv. aumento 4 vezes) (95% Ct) .. ..... %...................... Fator de conversão [95% cg %
Padrão EU (> 60 anos) >60% >30% >2.0
Padrão EU (> 60 anos) >70% >•40% >2.5
A/New Catecfonía (H1N1) HuYng 75 100 [95.20-100] 77.3(66,2-86.2] 35.1 '21.9-56,4]
Flu idoso 49 7L4 (56.74-a3.42) 30.6(18.345.4] 3,7(24*5.7]
FK1AS01B 75 97.3(90.70-99.68} 48.0(36.5-59^] 4.5(3.3-6.1]
FkiASOIE 75 93.3 (55.12-97,80] 52.0 [40.2-63.7] 5,0(3.6-6.91
A/New Yorit (H3N2] FXtYng 75 93.3 [85J 2-97.80] 76.0(64,7-85.1] 9.2(7.1-11.8]
Flu idoso 49 81,6167.96-91.24] 69.4(54.6-81.7] 8.2(5.7-11.81
FkiASOIB 75 98.0(88.75-99.17] 55.3(75.3^2.41 13.1 [10.0-17.1]
FluASOIE 75 93.3 [85,12*97.80] 80.0(69.2-55.4] 14.5(10,4-20.2]
B/Jiangsu (B) Flu Yng 75 100(95.20-100] 81.3170.7-89.5] 13.9[10,1-19.1]
Flu idoso 49 93,9(83.13-90.72] 44.9(30.7-59.8] 4,3(3,0-6.1]
FluASOIB 75 100(95.20*100] 65.3(53,5-76.0] 5.2(4.2-6.5)
FluASOIE 75 97.3(90.70*99.68] 70.7(59.0*50,6] 6.7(5.1-8.9]
N = número total de indivíduos; % = Percentagem de indivíduos com título no dia 21 dentro da faixa especificada; Cl = intervalo de confiança
VI.3.2. Conclusões de Imunogenicidade • A freqüência de pré-vacinação de CD4 específica de influenza foi significativamente inferior em adultos idosos, em comparação com adultos com a idade entre 18 e 40 anos. Após vacinação com Fluarix™, a freqüência de pós-vacinação (dia 21) permaneceu inferior em adultos idosos, em comparação com adultos mais jovens. Ao contrário, a não-inferioridade em termos de freqüência da freqüência pós-vacinação de CD4 específica de influenza após vacinação com vacinas com adjuvante de indivíduos idosos foi demonstrada em comparação com a vacinação com Fluarix™ em adultos com a idade entre 18 e 40 anos.
Com referência à resposta imune humoral, em termos de resposta anticorpo HI, todas as vacinas de influenza atenderam às exigências das autoridades européias para registro anual de vacinas inativadas de influenza [Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes (CPMP/BWP/214/96)]. Em adultos idosos, as vacinas com adjuvante mediaram pelo menos uma tendência para uma mais elevada
131 ___ 'Τ'Ά Λ resposta humoral à hemaglutinina de influenza do que Fluarix . Diferenças significativas entre a resposta imune humoral contra cada cepa de vacina mediada em indivíduos idosos pelas vacinas com adjuvante, em comparação com Fluarix , são resumidas na Tabela 13. Em comparação com adultos 5 com a idade entre 18 e 40 anos, vacinados com Fluarix™, indivíduos idosos vacinados com as vacinas com adjuvante mostraram uma tendência para GMTs pós-vacinação mais elevados e fator de conversão no dia 21 contra a cepa A/New York.
Tabela 13 Cepas de influenza para as quais respostas imunes humorais 10 mais elevadas (baseadas em não-sobreposição de 95% Cl) foram observadas em indivíduos idosos vacinados com diferentes vacinas com adjuvante, em comparação com Fluarix na mesma população.
GMT pós-vac. Fator Soroconversão Taxa Soroproteção Taxa de sprpconversão
FluASOlB A/New York A/New Caledonia
FluASOlB A/New Caledonia A/New York A/New Caledonia
GMT pós vac. = Título Média Geométrica na pós-vacinação.
VI.4 Conclusões de reatogenicidade
VL4.1, Registro de Eventos Adversos (AE)
Os sintomas solicitados (vide Tabela 14), ocorrendo durante um período de acompanhamento de 7 dias (dia de vacinação e 6 dias subseqüentes) foram registrados. Os sintomas não solicitados, ocorrendo durante um período de acompanhamento de 21 dias (dia de vacinação e 20+3 20 dias subseqüentes) foram também registrados. A intensidade dos AEs em seguida foi avaliada como descrito na Tabela 15.
Tabela 14 Eventos adversos Iocais/gerais solicitados
AEs locais solicitados AEs gerais solicitados
Dor no sítio de injeção Vermelhidão no sítio de injeção Intumescimento no sítio de injeção Hematoma Fadiga Febre Dor de cabeça Dor muscular Tremor Dor de junta no braço da injeção Dor de junta em outros locais
132
N.B. A temperatura foi registrada ao entardecer. Caso as medições de temperatura adicionais fossem realizadas em outros ocasiões do dia, a mais elevada temperatura era registrada.
Tabela 15 Escalas de intensidade para sintomas solicitados em adultos
Evento adverso Grau de Intensidad e Parâmetro
Dor no sítio da injeção 0 Ausente
1 no toque
2 quando membro é movido
3 evita atividade normal
Vermelhidão no sítio da injeção Registra o maior diâmetro de superfície em mm
Intumescimento no sítio da injeção Registra o maior diâmetro de superfície em mm
Hematoma no sítio da injeção Registra o maior diâmetro de superfície em mm
Febre* Registra temperatura em °C/°F
Dor de Cabeça 0 Ausente
1 é facilmente tolerado
2 interfere com a atividade normal
3 evita atividade normal
Fadiga 0 Ausente
1 é facilmente tolerada
2 interfere com atividade normal
3 evita atividade normal
3 evita atividade normal
Dor em junta no sítio da injeção e outros locais 0 Ausente
1 é facilmente tolerada
2 interfere com atividade normal
3 evita atividade normal
Dor muscular 0 ausente
1 é facilmente tolerada
2 interfere com atividade normal
3 evita atividade normal
Tremor 0 Ausente
1 é facilmente tolerado
2 interfere com atividade normal
3 evita atividade normal
133 * A febre é definida como temperatura auxiliar > 37,5 °C (99,5 °F)
A intensidade máxima da vermelhidão/intumescimento no sítio de injeção local é classificada como segue:
é 0 mm; 1 é > 0-< 20 mm; 2 é > 20-< 50 mm; 3 é > 50 mm.
A intensidade máxima da febre é classificada como segue:
é > 37,5-< 38,0 °C; 2 é > 38,0-< 39,0 °C; 3 é > 39,0
O investigador faz uma avaliação da intensidade para todos os outros AEs, isto é, sintomas não solicitados, incluindo SAEs relatados durante o estudo. A avaliação é baseada no julgamento clínico do investigador. À intensidade de cada AE registrado é atribuída uma das seguintes categorias:
(suave) = Um AE que é facilmente tolerado pelo indivíduo, causando desconforto mínimo e não interferindo com as atividades diárias;
(moderada) = Um AE que é suficientemente desconfortante para interferir com as atividades diárias normais;
(severa) = Uma AE que evita as atividades normais diárias (em adultos/ adolescentes, uma tal AE que evitaria, por exemplo, comparecimento no trabalho / escola e necessitaria a administração de terapia corretiva).
VI.4.2. Registro de Eventos Adversos (AE)
Em indivíduos idosos, a reatogenicidade observada com vacinas com adjuvante, em termos de sintomas tanto locais como gerais, foi mais elevada do que com Fluarix . Não somente a incidência, porém também a intensidade dos sintomas foram aumentadas após vacinação com vacinas coma adjuvante (Figura 8). Os sintomas de grau 3 mostraram uma tendência a serem mais elevados no grupo que recebeu a vacina com adjuvante com a mais elevada concentração de imunoestimulantes (MPL, QS21), em comparação com o grupo que recebeu a vacina com adjuvante em que os imunoestimulantes estão em uma mais baixa concentração. Em todos os casos, os sintomas, entretanto, resolveram-se rapidamente.
134
Exemplo VII: Avaliação pré-clínica de vacinas HPV com adjuvante em Camundongos
Este estudo empregou uma composição antigênica bivalente de papilomavírus humano (HPV), combinando partículas semelhantes a vírus (VLPs), formadas de LI de HPV 16 e LI de HPV 18, como o antígeno. O objetivo do estudo foi comparar a eficácia desta preparação antigênica, quando formulada com AS01B e uma diluição de 1/5 de AS01B, tendo como ponto de referência contra a atual adjuvante encontrado na vacina de câncer cervical de GKS, AS04 (MPL em alume).
VII.l - Vacinação
Camundongos (n = 12 por grupo) foram injetados a 0 e 28 dias com formulações de vacina compostas de HPV16/18 LI (2 pg ou 0,5 pg cada) derivadas do processo Hi-5 80/80L e formuladas com AS04 (50 pg MPL formulados com alume ou AS01B (50 pg QS21 - 50 pg MPL em 0,5 ml) dose Humana de 1/10 e 1/50. Como os estudos foram realizados em camundongos, 1/10 da dose humana pode ser adotada como sendo equivalente à formulação humana AS01B, isto é, 50 pg QS21 e 50 pg MPL em 0,5 ml e 1/50 pode ser adotado como sendo uma diluição de 1/5 da formulação humana AS01B, isto é, 10 pg QS21 e 10 pg MPL em 0,5 ml. Amostras de sangue foram retiradas a 14 e 45 dias pós dose II para ensaiar para anticorpos específicos tipo L-l totais em soros individuais. O fingimento das citocinas intracelulares foi medido a 7 e 14 dias pós II em PBMC e no dia 45 pós II, empregando-se células de baço. A freqüência as células de memória B específicas de VLPs foi medida no dia 45 pós II, empregando-se células de baço.
VIL2 - Elisa Antí-Hpv 16/18 LI
Quantificação de anticorpos anti-HPV-16 e HPV-18 LI foi realizada por ELISA usando-se HPV-16 e HPV-18 LI como revestimento. Os antígenos foram diluídos em uma concentração final de 0,5 pg/ml em PBS e
135 foram adsorvidos durante a noite a 4 °C nos poços de placas de microtítulo de 96 poços (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). As placas foram então incubadas pro 1 h a 37 °C com PBS contendo 1% de Albumina de Soro Bovino (tampão de sapuração). Os soros diluídos em tampão contendo PBS + 0,1% Tween 20 + 1% BSA foram adicionados nas placas revestidas com HPV Lie incubados por 1 h 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS 0,1% Tween20 e Ig anti-camundongo conjugado com biotina (Dako, UK), diluídos a 1/1000 em tampão de saturação foram adicionados a cada poço e incubados por 1 h 30 a 37 °C. Após a etapa de lavagem, estreptavidina-rábono silvestre (Dako, UK), diluídos 1/3000 em tampão de saturação foram adicionados por mais 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas como indicado acima e incubadas por 20 min em temperatura ambiente com uma solução de 0,04% de o-fenilenodiamina (Sigma) 0,03% H2O2 em 0,1% Tween20, 0,05 M tampão de citrato pH 4,5. A reação foi parada com IN H2SO4 e lida a 492/620 nm. Os títulos ELISA foram calculados de uma referência por SoftMaxPro (usando-se uma equação de quatro parâmetros) e expressos em Eu/ml.
VII.3 - Tingimento de citocinas intracelulares (ICS)
O tingimento intracelular das citocinas de células T foi realizado em PBL nos dias 7 e 14 pós II e em células de baço no dia 45 após a segunda imunização. As PBMCs (1 pool/grupo) ou células de baço (4 pools de 3 órgãos por grupo) foram coletadas de camundongos. Estimulação de antígeno in vitro de células de baço foi realizada em uma concentração final de 5 106 células / ml (microplaca com 96 poços) com VLP 16 ou 18 (5 pg/ml) + anticorpos CD49d CD28 (1 pg/ml) e então incubada 3H a 37 °C. Em seguida à etapa de reestimulação de antígeno, as células foram incubadas durante a noite na presença de Brefeldina (1 pg/ml) a 37 °C, para inibir a secreção da citocina. O tingimento das células foi realizado como segue: as suspensões de células foram lavadas, ressuspensas em 50 μΐ de PBS 1% FCS
136 contendo 2% reagente de bloqueio Fc (1/50; 2,4G2). Após 10 min de incubação a 4 °C, 50 μΐ de uma mistura de anti-CD4-APC (1/50) e anti-CD8 perCp (1/50) foram adicionados e incubados 30 min a 4 °C. Após uma lavagem em PBS 1% FCS, as células foram permeabilizadas por ressuspensão em 200 μΐ de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) e incubadas 20 min a 4 °C. As células foram então lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 μΐ de anti-IFy APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluído em PermWash. Após 2H de incubação a 4 °C, as células foram lavadas com Perm Wash e ressuspensas em PBS 1% FCS + 1% paraformaldeído. A análise da amostra foi realizada por FACS. As células vivas foram ativadas (FSC/SSC) e a aquisição foi realizada em ~ 20.000 eventos (linfócitos). As percentagens de IFy + ou IL2+ foram calculadas em populações ativadas de CD4+ e CD8+. VIL4 - Memória de célula B
Quarenta e cinco dias após a segunda imunização, os camundongos foram sacrificados, as células de baço foram separadas por um gradiente lymphoprep (Cedarlane). As células B foram então ressuspensas em meio RPMI 1640 (Gibco) contendo aditivos (piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não-essenciais MEM, Pen/Strep, Glutamina e mercaptoetanol β2), 5% de soro de bezerro fetal, 50 U/ml rhIL-2 (eBioscience) e 3 pg/ml CpG. As células foram cultivadas cinco dias em uma concentração final de 106 células/ml, em 5 ml por 6 poços de fundo plano. Após uma etapa de ativação com etanol, placas de nitrocelulose (Multiscreen-IP; Millipore) foram revestidas com 10 pg/ml de VLPs ou com Ig anti-camundongo de Cabra (GAM; Sigma) diluído 1/200 em PBS. Após uma etapa de saturação com meio completo, 100 μΐ de 2,106 células/ml foram adicionados a placas revestidas com VLPs e 100 μΐ de 106 e 5,105 células/ml foram adicionadas a placas GAM. Após um tempo de incubação de 2 h a 37 °C, as placas foram armazenadas durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS 0,1% Tween20 e Biot Ig anti-camundongo diluído 1/200 em PBS
137 &
1% BSA 5% FCS (tampão de diluição) foi distribuído em placas e incubado por 2 horas a 37 °C. Após uma etapa de lavagem, Extravidina HRP (Sigma) diluída 1/550 em tampão de diluição foi adicionada por mais 1 h a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e incubadas por 10 min em temperatura ambiente com uma solução de AEC (Sigma). A reação é parada enxaguandose as placas suavemente sob água de bica. Quando as placas são secadas, lidas com KS400.
VII.5 - Análise estatística
Os meios de formulação foram comparados utilizando-se uma análise de um sentido de variação (ANOVA 1). A análise foi conduzida em dados transformados loglO para fins de normalização. Quando uma diferença significativa entre os meios de processamento foi detectada (valor-p < 0,05), comparações em pares entre meios foram realizadas em um nível de 0,05 de significância (teste de múltiplas comparações Student-Newman-Keuls).
VII.6 — resultados
Os camundongos foram imunizados como em VIL 1 acima. Os seguintes grupos foram usados:
Grupo Antígeno Adjuvante Diluição adjuvante
1 HPV 16-18 LI 2 pg ÀS04 dose humana 1/10 (equivalente a 50μg MPL por 0,5 ml de HD)
2 HPV 16-18 LI 0,5 μg AS04 dose humana 1/50 (equivalente a 10μg MPL por 0,5 ml de HD)
3 HPV 16-18 LI 2 pg AS04 dose humana 1/10 (equivalente a 50μg MPL por 0,5 ml de HD)
4 HPV 16-18 LI 0,5 pg AS04 dose humana 1/50 (equivalente a 10μg MPL por 0,5 ml de HD)
5 HPV 16-18 LI 2 pg AS01B dose humana 1/10 (equivalente a 50μg MPL por 0,5 ml de HD)
6 HPV 16-18 LI 0,5 pg AS01B dose humana 1/50 (equivalente a 10pg MPL por 0,5 ml de HD)
7 HPV 16-18 LI 2 pg AS01B dose humana 1/10 (equivalente a 50pg MPL por 0,5 ml de HD)
8 HPV 16-18 LI 0,5 pg AS01B dose humana 1/50 (equivalente a 10pg MPL por 0,5 ml de HD)
VII.6.1 - respostas humorais
Faixa de dose não significativa foi observada para as duas doses testadas de antígenos com diluição de adjuvante para títulos de
138 anticorpo HPV 16-L1 ou títulos de anticorpo HPV 18-L1 (figura 9)
Nenhuma faixa de dose significativa foi observada para as duas doses testadas de cada adjuvante, qualquer que seja a dose de antígeno para títulos de anticorpo HPV 16-L1.
Quando olhando para títulos de anticorpo HPV 18-L1, um ligeiro aumento de título foi visto para AS01B (1/10 HD) em comparação com AS01B (1/50 HD), conforme medido no dia 14 pós II (2,5 vezes faixa de dose, valor p = 0,0035), entretanto, esta faixa foi observada somente para antígeno 2pg e não para antígeno 0,5 pg (valor p = 0,0867). No dia 45 pós II, nenhuma faixa de dose significativa foi vista para as duas doses testadas de cada adjuvante, qualquer que seja a dose de antígeno.
VII.6.2 - Respostas celulares
Tingimento de Citocina Intracelular
Nenhum efeito de faixa de dose de antígeno foi observado para as duas doses testadas de antígenos, qualquer que seja a dose de adjuvante para HPV 18-L1. Freqüências similares de células T CD4+ específicas de VLP16 foram obtidas com as duas doses de antígenos testadas com diferentes doses de adjuvantes (figura 10).
Um ligeiro efeito de dosagem (2,6 vezes, valor p = 0,0009 para HPV 18-L1, 2 vezes, valor p = 0,0187 para HPV 16-L1) foi visto para AS01B (1/10 HD) em comparação com AS01B (1/50 HD); entretanto esta faixa foi observada somente para antígeno 2 pg e não para antígeno 0,5 pg.
Células de Memória B Específicas
Não foi observado nenhum efeito de antígeno de faixa de dose para as duas doses de antígenos testadas, qualquer que seja a dose de adjuvante para HPV 16 ou 18 LI (figura 11)
Não foi observado nenhum efeito de adjuvante para as duas doses de adjuvantes testadas, qualquer que seja a dose de antígeno para HPV 17 ou 18 Ll.
139 t7
Como pode ser visto pelos resultados acima, uma diluição de 1/5 de AS01B produz uma formulação que tem eficácia equivalente em composições imunogênicas para o próprio AS01B.
Exemplo VIII: Avaliação pré-clínica de vacinas de S. pneumoniae com adjuvante em camundongos.
A vacina pneumocócica usada neste estudo foi uma vacina conjugada pneumocócica com adjuvante 11-valente (11PCV/AS), consistindo de uma mistura de 11 conjugados de polissacarídeo pneumocócicos com adjuvante AS01B ou AS01E. Os conjugados consistem de polissacarídeos purificados com sorotipos S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, cada um individualmente conjugado com uma proteína veículo, toxóide de difteria (DT), toxóide de tétano (TT) ou proteína D de H. influenza (PD). As vacinas são apresentadas como um pó seco por congelamento, a ser reconstituído com um dos adjuvantes líquidos.
11PCV/AS é produzida como segue:
As condições de ativação e acoplamento são específicas para cada polissacarídeo. Estes são fornecidos na tabela abaixo. Polissacarídeo dimensionado (exceto quanto a PS5, 6B e 23F) foi dissolvido em NaCl 2M ou em água para injeção (WFI). A concentração de polissacarídeo ótima foi avaliada para todos os sorotipos. Todos os sorotipos, exceto sorotipo 18C, foram conjugados diretamente na proteína veículo, como detalhado abaixo.
De uma solução estoque de 100 mg/ml em acetonitrila ou acetonitrila/água solução de 50%/50%, CDAP (relação de CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) foi adicionada à solução de polissacarídeo. 1,5 minuto mais tarde, 0,2M-0,3M NaOH foram adicionados para obter-se o pH de ativação específico. A ativação do polissacarídeo foi realizada neste pH durante 3 minutos a 25 °C. Proteína purificada (proteína D ou DT) (a quantidade depende da relação inicial de PS/proteína veículo) foi adicionada ao polissacarídeo ativado e a reação de acoplamento foi realizada no pH
140 específico por até 2 horas (dependendo do sorotipo) sob regulação de pH. A fim de extinguir os grupos éster de cianato não-reagidos, uma solução de glicina 2M foi então adicionada à mistura. O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0). A solução foi agitada por 30 minutos a 25 °C e então durante a noite a 2 - 8 °C com lenta agitação contínua.
Preparação de 18C:
18C foi ligado à proteína veículo via um ligador - Sorotipo de polissacarídeo de diidrazida ácida adípica (ADH) 18c foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivatização de toxóide de tétano com EDAC
Para derivatização do toxóide de tétano, TT purificado foi diluído a 25 mg/ml em NaCl 0,2M e o espaçador ADH foi adicionado a fim de alcançar uma concentração final de 0,2M. Quando a dissolução do espaçador estava completa, o pH foi ajustado a 6.2. EDAC (l-etil-3-(3dimetil-aminopropil) carbodiimida) foi então adicionado para alcançar uma concentração final de 0,02M e a mistura foi agitada por 1 hora sob regulação de pH. A reação de condensação foi parada aumentando-se o pH até 9,0 por pelo menos 30 minutos a 25 °C. TT derivatizado foi então diafiltrado (membrana CO 10 kDa), a fim de remover ADH residual e reagente EDAC.
Massa TTah foi finalmente filtrada estéril até a etapa de acoplamento e armazenada a-70 °C.
Acoplamento químico de TTAH a PS 18C
Detalhes dos parâmetros de conjugação podem ser encontrados na Tabela 1.
gramas de PS microfluidizado foram diluídos na concentração definida em água e ajustados a 2M NaCl por adição de pó de NaCl.
Solução CD AP (100 mg/ml recentemente preparada em 50/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionada para alcançar a apropriada relação
141
CDAP/PS.
O pH foi elevado até a ativação de pH 9,0 por adição de NaOH 0,3 M e foi estabilizado neste pH até adição de TTah·
Após 3 minutos, TTah derivatizado (20 mg/ml em NaCl 0,2 M) foi adicionado para alcançar uma relação TTah/PS de 2; o pH foi regulado ao pH de acoplamento 9,0. A solução foi deixada por uma hora sob regulação de pH.
Para extinção, uma solução de glicina 2 M foi adicionada à mistura PS/TTah/CDAP.
O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0).
A solução foi agitada por 30 min a 25 °C e então deixada durante a noite a 2 - 8 °C com lenta agitação contínua.
Purificação dos conjugados:
Os conjugados foram purificados por filtragem gel usando-se uma coluna de filtragem de gel Sephacryl 500HR, equilibrada com NaCl 0,15M (S500HR para 18C) para remover pequenas moléculas (incluindo DMAP) e PS e proteína não conjugados. Com base nos diferentes tamanhos moleculares dos componentes de reação, conjugados PS-PE, PS-TT ou PSDT são eluídos primeiro, seguido por PS livre, em seguida por PD livre ou DT livre e, finalmente, DMAP e outros sais (NaCl, glicina).
As frações contendo conjugados são detectadas por UV280 nm. As frações são reunidas de acordo com seu Kd, filtradas estéreis (0,22 pm) e armazenadas a + 2 - 8 °C. As relações de PS/Proteína das preparações de conjugados foram determinadas.
Condições de ativação/acoplamento/extinção específicas de conjugados PS S. pneumoniae-Proteína D/TT/DT
Sorotipo 1 gfluido 3 μίΐιιΐάο 4 pfiuido 5 6B 7F pfluido
Concent. de PS (mg/ml) 2,5 3,0 2,5 7,1 5,0 5,0
Dissolução de PS (mg/ml) WF1 NaCl 2M WF1 WF1 NaCl 2M NaC12M
Concentr. de PD (mg/ml) 10,0 5,0 10,0 5,0 5,0 10,0
142
Relação PS/PD inicial (p/p) 1,5/1 1/1 1,5/1 1/1 1,1/1 1,2/1
Cone. CDAP PS) (mg/mg 0,50 0,75 0,50 0,79 0,83 0,75
pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,5
Sorotipo 9V pfluido 14 pfluido 18C pfluido 19F pfluido 23F
Concentr. PS (mg/ml) 5,0 5,0 4,5 9,0 2,38
Dissolução de.PS NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
Cone, de proteína veículo (mg/ml) 10,0 10,0 20,0 (TT) 20,0 (DT) 5,0
Relação de proteína veículo/PS (p/p) 1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1/1
Concentr. de cdap (mg/mg PS) 0,50 0,75 0,75 1,5 0,79
pHa=pHc=pHa 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Os 11 conjugados foram então misturados entre si e a preparação antigênica final misturada com o apropriado adjuvante antes da imunização.
Grupos de 40 camundongos Balb/c fêmeas com a idade de 4 semanas foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 0,1 pg de conjugados PS 11-valente, formulados com AS01B ou AS01E. Anticorpos anti-PS IgG foram dosados por ELISA em soros coletados no dia 42.
Como pode ser visto pela figura 12, respostas comparáveis foram vistas entre a formulação de AS01E diluída, em comparação com a formulação AS01B, exceto quanto a PS 14, em que uma resposta mais elevada foi vista com AS01B, e PS 19F onde uma resposta mais elevada foi vista com AS01E.
Exemplo IX: Avaliação pré-clínica de composições imunogênicas de citomegalovírus com adjuvante e sem adjuvante.
IX.l: Porquinhos da índia.
IX.1.1 Elisa anti-gB
A quantificação de anticorpos anti-gB foi realizada por ELISA, usando-se gB como um antígeno de revestimento. O antígeno foi diluído em uma concentração final de 4 pg/ml em PBS e 400 pl foram incubados durante a noite a 4 °C e, placas de microtítulo de 96 poços. As placas foram então saturadas pro 1 hora a 37 °C com 200 pl de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino. Diluições seriais de duas vezes de soro foram
143 adicionadas (100 μΐ/poço) e incubadas por 1 hora 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS 0,1% Tween 20 e 100 μΐ de IgG antiporquinho da índia de peroxidase de rábano silvestre (Dako, UK) foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora 30 minutos a 37 °C. As placas 5 foram lavadas 4 vezes com PBS 0,1% Tween 20 e 1 vez com água. Em seguida foram incubadas por 20 min a 22 °C com 100 μΐ de uma solução de ofenilenodiamina (Signa) em tampão de citrato 0,lM pH 4,2. Esta reação foi parada com 100 μΐ de H2SO4 2N e lida a 490/620 nm. Títulos Elisa foram determinados por interpolação de valores OD de uma referência de amostra 10 por SoftMaxPro. Os títulos foram expressos em EU/ml.
Análises estatísticas foram realizadas nos dias 14 pós 2 dados Elisa usando-se UNISTAT. O protocolo aplicado para análise da variação pode ser resumidamente descrito como segue:
1) Transformação log dos dados
2) Teste Shapiro-Wilk em cada população (grupo) a fim de verificar a normalidade
3) Teste Cochran, a fim de verificar a homogeneidade de variação entre diferentes populações (grupos)
4) Análise da variação em dados selecionados (um sentido)
5) Teste Tuckey-HSD para múltipla comparação.
IX.1.2 -Ensaio de Neutralização
Antes do ensaio, células MRC5 (10000 células/200 μΐ meio MEM) foram distribuídas em microplacas com 96 poços e incubadas por 3 dias a 37 °C com CO2. Diluições de duas vezes de soros inativados (30 min a 25 56 °C) foram realizadas em incubadas com 100 μΐ de solução viral (800/ml) por 1 hora a 37 °C. Após incubação, 100 μΐ de mistura de soro/vírus foram inoculados em microplacas de 96 poços contendo monocamada MRC5. As placas foram centrifugadas a 2000 RPM por 1 hora a 35 °C. Após uma incubação noturna a 37 °C, as placas foram fixadas com uma solução de 80%
144 de acetona (20 minutos a -20 °C). A solução de acetona foi descartada e células positivas CMV foram detectadas utilizando-se um antígeno antigo anti-imediato monoclonal específico por 1 hora a 37 °C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS e Ig anti-camundongo conjugado-biotina foi adicionado a cada poço e incubadas por 1 hora a 37 °C. Após uma etapa de lavagem, estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre foi adicionada por uma adição de 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes e incubadas por 10 minutos com uma solução de True-blue. Sinais coloridos específicos foram registrados pelo exame sob microscópio. Títulos de neutralização foram expressos como o inverso da mais elevada diluição de soro fornecendo 50% de redução de células positivas CMV, em comparação com um controle de vírus (CMV mais células sem soro).
IX.1.3 - Protocolos de imunização grupos foram imunizados. Cada grupo continha 8 porquinhos da índia Hartley Cri: (ha) fêmeas com 5-8 semanas de idade, exceto quanto ao grupo de controle (grupo 4), que continha somente 4 indivíduos. Os indivíduos foram imunizados IM em 0 e 28 dias. Amostras de soro foram coletadas 28 dias após a primeira imunização e 14 dias após a segunda imunização. Elisas foram realizados como descrito acima em soro tomado a 28 pós I e 14 pós II. Ensaios de neutralização foram realizados como descrito
acima em 14 ?ós II. Os grupos foram como abaixo:
Grupo Antígeno Adjuvante
1 gB NaCl
2 GB AS01B
3 GB AS01E
4 NaCl NaCl
O antígeno foi preparado como a seguir: O antígeno da vacina é expresso em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) como gB**, uma quimera truncada contendo sequências de peptídeos de glicoproteína gD do vírus Herpes Simples 2 (HSV2) em seu término N e C. O gB** é truncado em seu domínio terminal-C, que contém a seqüência de ancoragem de membrana
145 e é, portanto, secretado no sobrenadante da cultura.
Para os primeiros três grupos 15 pg gB** preparados em 500 pl de PBS, AS01B ou AS01E (preparados como no exemplo II.2 acima), foram injetados intramuscularmente. No grupo 4, somente PBS foi 5 administrado intramuscularmente.
IX.1.4 - resultados
Como pode ser visto na figura 13, títulos ELISA anti-gB significativamente mais elevados foram observados para os dois grupos com adjuvantes, em comparação ao simples gB (8 e 5,5 vezes mais elevados para 10 gB e AS01B e gb/ASOlE, respectivamente). Os títulos de anticorpo de pós dose II foram muito ligeiramente mais elevados (1,5 vezes) no grupo gB/ASOlB em comparação ao grupo gB/ASOlE.
Comparação múltipla: Tuckey - HSD
Grupo Casos Meio Simples AS01E AS01B
Simples 8 4,7917 ** **
AS01E 8 5,5293 **
AsOlB 8 5,6942 **
Simples<AS01E = AS01B _15 Quanto aos títulos de neutralização (Figura 14):
• Anticorpos neutralizantes não específicos foram observados no grupo simples gB • Anticorpos neutralizantes específicos foram detectados em ambos os grupos com adjuvantes · Níveis similares de anticorpos neutralizantes foram observados em ambos os grupos com adjuvantes.
IX.2 - Camundongos
IX.2.1 - ELISA anti gB
A quantificação de anticorpos anti-gB foi realizada por ELISA empregando-se gB como um antígeno de revestimento. O antígeno foi diluído em uma concentração final de 1 pg/ml de PBS e 100 μΐ foram incubados durante a noite a 4 °C em placas de microtítulo de 96 poços. As placas foram
146 então saturadas por 1 hora a 37 °C com 200 μΐ de PBS contendo 1 % de albumina de soro bovino. Diluições seriais duplas de soro foram adicionadas (100 μΐ/poço) e incubadas por 1 hora e 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS 0,1 % Tween 20 e 100 μΐ de peroxidase de estreptavidina-rábano silvestre foram adicionados a cada poço por mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS 1 % Tween 20 e 1 vez com água. Em seguida elas foram incubadas por 10 min a 22 °C com 100 μΐ de 75 % de tetra-metil-benzidina em 0,1 M de tampão de citrato pH 5,8. Esta reação foi parada com 100 μΐ de H2SO4 0,4 N e lida a 450/620 nm. Títulos ELISA foram determinados por interpolação de valores OD de uma amostra de referência por SoftMaxPro. Os títulos foram expressos em EU/ml.
As análises estatísticas foram realizadas nos dados ELISA dos dias 14 pós 2, usando-se UNISTAT. O protocolo empregado para a análise de variação pode ser brevemente descrito como a seguir:
1) Transformação log dos dados
2) Teste Shapiro-Wilk em cada população (grupo) a fim de verificar a normalidade
3) Teste Cochran a fim de verificar a homogeneidade de variação entre diferentes populações (grupos)
4) Análise de variação de dados selecionados (uma direção)
5) Teste Tuckey-HSD para comparação múltipla.
IX.2.2 - Ensaio de Neutralização
Antes do ensaio, células MRC5 (10000 céIulas/200 μΐ de meio MEM) foram distribuídas em microplacas de 96 poços e incubadas por 3 dias a 37 °C com 5 % de CO2. Diluições seriais duplas (60 μΐ) de soros inativados (30 min a 56 °C) foram incubadas com 60 μΐ de solução viral (800IPU/ml) por 1 hora a 37 °C. Após incubação, 100 μΐ de mistura de soros-vírus foram inoculadas em microplacas de 96 poços contendo células MRC5. As placas foram centrifugadas a 2000RPM por 1 hora a 35 °C. Após uma incubação
147
JGO durante a noite a 37 °C, as placas foram fixadas com uma solução de 80 % acetona (20 minutos a -20 °C). A solução de acetona foi descartada e células positivas CMV foram detectadas usando-se um antígeno antigo I (IE-I) antiimediato monoclonal específico por 1 hora a 37 °C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS e biotina conjugada anti-camundongo Ig foi adicionada a cada poço e incubada por 1 hora a 37 °C. Após uma etapa de lavagem, peroxidase estreptavidina-rábano silvestre foi adicionada por mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes e incubadas por 10 minutos com uma solução de True-blue. Sinais coloridos específicos foram registrados examinando-se ao microscópio. Títulos neutralizantes foram expressos como o inverso da mais elevada diluição de soro, fornecendo 50 % de redução de células positivas CMV, em comparação com um controle de vírus (plus células CMV sem soro).
IX.2.3 - Coloração de Citocina Intracelular
A detecção intracelular de citocinas de células T foi realizada em PBLs em 7 e 21 dias após a segunda imunização. PBLs foram coletados de camundongos e reunidos (1 pool por grupo). A estimulação in vitro de antígeno de linfócitos (concentração final de 10*7 celulas/ml) foi feita com um pool de peptídeos revestindo a seqüência de CMV ou com a proteína gB. A mistura de PBLs/antígeno foi incubada 2h a 37 °C. As células foram em seguida incubadas durante a noite na presença de Brefelding (1 pg/ml) a 37 °C, para inibir a secreção de citocina.
A coloração das células foi realizada como a seguir: suspensões de células foram lavadas, ressuspensas em 50 μΐ de PBS 1& FCS contendo 2 % de reagente de bloqueio Fc. Após 10 min de incubação a 4 °C, 50 μΐ de uma mistura de anti-CD4 PE e anti-CD8 porCp foram adicionados e incubados 30 minutos a 4 °C. Após uma etapa de lavagem em PBS 1% FCS, membranas de células foram permeabilizadas por ressuspensão em 200 μΐ de Cytofíx=Cytoperm (Kit Beckton Dickison) e incubadas 20 min a 4 °C. As
148 células foram então lavadas com Perm Wash (kit BD) e ressuspensas com 50 μΐ de um anti-IFN-gama APC + anti-IL-2 FITC diluído em Perm Wash. Após 2 horas de incubação a 4 °C, células foram ressuspensas em PBS 1 % FCS + paraformaldeído. A análise de amostra foi realizada por FACS. As células vivas foram fechadas e uma aquisição foi realizada em +/- 20000 eventos. As porcentagens de IFNg+ ou IL2+ foram calculadas em populações fechadas CD4+ e CD8+.
ΓΧ.2.4 - Protocolos de imunização grupos foram imunizados. Cada grupo continha 12 camundongos C57BI/6 fêmeas de 4 - 10 semanas de idade.
Grupo Antígeno Adjuvante.
1 gB PBS
2 gB AS01B
3 gB AS01E
4 NaCl NaCl
O antígeno foi preparado como a seguir: O antígeno de vacina é expresso em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) como gB**, uma quimera truncada contendo seqüências de peptídeo de glicoproteína gD de vírus Herpes simples 2 (HSV2) em seu término N e C. O gB** é truncado em seu domínio terminal-C, que contém a seqüência de ancoragem de membrana e é, portanto, secretado no sobrenadante da cultura.
Para cada grupo, gB** em uma concentração de 1,5 pg/dose, foi preparado em 625 pl de PBS ou adjuvante AS01B ou ASO1E (preparado como no exemplo II.2 acima tendo uma concentração de 100 pl de imunoestimulantes por ml ou 50 pl de imunoestimulantes por ml, respectivamente). 50 pl (isto é, 1/10 de uma dose humana de 0,5 ml) foram injetados intramuscularmente. Um grupo de controle de camundongo foi injetado com solução salina. Injeções foram realizadas em 0 e 28 dias. Amostras de soro foram coletadas 14 dias após as segundas injeções por ELISA e Ensaios de Neutralização. PBLs foram coletados 7 dias e 21 dias pós segundas injeções por ICS.
149
IX.2.5- resultados
Títulos ELISA anti - gB (Figura 15).
Um nível muito fraco a indetectável de anticorpos anti-gB foi observado no grupo gB sem adjuvante. Entretanto, uma elevada resposta do 5 anticorpo (mais elevada 65 e 66 vezes) foi observada tanto em grupos com adjuvante AS01B como AS01E, respectivamente. Não houve importância estatística entre os grupos AS01B e AS01E.
Comparação múltipla: Tuckey - HSD
Grupo Casos Meio Simples AS01E AS01B
Simples 12 2,1132 ** **
AS01E 12 3,9317 **
AS01B 12 3,9375 **
Simples<AS01E = AS01B
Títulos neutralizantes Anti-CMV (Figura 16)
Títulos neutralizantes anti-gB significativamente mais elevados foram observados para os dois grupos com adjuvantes, em comparação ao grupo simples gB. Diferença não significante em títulos de anticorpo neutralizante foi observada entre as formulações AS01B e AS01E. á 5 Imunidade Mediada por Célula
Devido ao nível muito baixo de resposta observado após reestimulação de 7 amostras pós II, nenhuma discriminação pode ser feita entre os grupos e nenhuma resposta conclusiva para estimulação CD4 e CD8 pode ser vista (Figura 17). Estas baixas a indetectáveis respostas foram 20 provavelmente devido a um problema técnico durante as preparações de amostras. Entretanto, as respostas poderíam ser vistas 21 dias pós a segunda injeção. Os dados CD4 (Figura 18) não mostram diferença após reestimulação por gB (5 pg/ml) ou peptídeos (2 pg/ml ou 4 pg/ml). Um perfil de citocina similar é visto para AS01E e AS01B. Nenhuma resposta conclusiva pode ser 25 vista para estimulação CD8 (Figura 19).
Estes experimentos mostram que para outra composição antigênica e em dois organismos diferentes, um adjuvante tendo níveis mais
150
J63 baixos de imunoestimulantes é tão imunologicamente eficaz quanto aqueles tendo níveis mais elevados.
X: Avaliação Pré-clínica de vacina RTS, S com adjuvante X.l - Formulação
A composição antigênica RTS,S é produzida em Saccharomyces cervisiae e consiste de duas proteínas, RTS e S, que intracelularmente e expontaneamente fixam-se dentro de estruturas particuladas poliméricas mistas, que estima-se conter, em média, 100 polipeptídeos. RTS é uma cadeia de polipeptídeo híbrido 51 kDa de 424 aminoácidos, consistindo de 189aa derivados de um surfact antígeno de esporozoíto do parasita da malária P. Falciparum cepa NF53 (o antígeno CSP, a.a. 207 a 395), fundido à extremidade do terminal amino da proteína S do vírus da hepatite B. S é um polipeptídeo 24 kDa (226 aminoácidos longos) correspondendo ao surfact antígeno do vírus da hepatite B. As pelotas de antígeno liofilizadas contém aproximadamente 50 pg (quando designadas a serem formuladas em 0,5 ml com AS01B) ou 25 pg (quando designadas a serem formuladas em 0,5 ml com AS01E) de antígeno.
AS01B E AS01E foram preparados misturando-se os vários componentes (PBS, lipossomas, MPL e QS21) em um tanque, e agitando-se sob condições assépticas. O produto foi então filtrado estéril antes do enchimento em frascos ou seringas. O líquido adjuvante foi estocado em +2 °C a + 8 °C, sendo usado antes para reconstituir a pelota de antígeno liofilizada.
X.2 - Experimentos em camundongos
Dois experimentos com camundongos foram realizados objetivando-se comparar as respostas imunes específicas para RTS,S induzidas por RTS,S/AS01B, em comparação com RTS,S formulado com AS01E. Em cada experimento, camundongos C57BI/6 (10 camundongos/grupo) foram imunizados intramuscularmente três vezes, duas
151 semanas à parte, com 10, 5 ou 2,5 pg de RTS,S formulados com adjuvantes AS01B ou AS01E. Dois grupos de controles AS foram imunizados com AS01B ou AS01E sozinho. As respostas anticorpo específicas para HBs e CS foram avaliadas para cada camundongo por ELISA, 15 dias após a terceira imunização. Os títulos anticorpo de média geométrica e seus 95 % de intervalos de confiança foram calculados para todos os camundongos recebendo o mesmo tratamento em ambos os experimentos. As análises estatísticas, para avaliar o efeito do adjuvante e os efeitos das doses do antígeno, foram realizadas em dados reunidos de ambos os experimentos. As respostas de células T específicas CD4 e CD8 foram medidas por citometria de fluxo 7 dias após as segunda e terceira imunizações em pools de células sanguíneas de 5 camundongos por grupo. Assim, dois valores foram gerados para cada grupo em cada experimento.
Resposta Imune Humoral
Como mostrado nas figuras 20 e 21, os adjuvantes tanto AS01B como AS01E induzem fortes respostas anticorpo comparáveis em relação a CSP e HBs.
Uma ANOVA de três sentidos em anti-CSP GMTs mostrou que não houve diferenças significantes entre AS01B e AS01E para 5 ou 2,5 pg doses de RTS,S.
Para a dose de 10 pg, o adjuvante AS01B foi constatado induzir títulos anti-CS mais elevados do que AS01E e a ração GMT “grupo AS01B /grupo AS01E” foi 1,93 (95 % Cl: 1,33 - 2,79; p = 0,001)
Resposta imune específica mediada por célula
As figuras 22 e 23 mostram os níveis de células específicas T CD4 e CD8 para CSP e HBs que expressam IL-2 e/ou gama IFN.
A resposta CD4 específica para CSP tende a ser mais elevada com AS01B em comparação com AS01E após três imunizações, enquanto a resposta de célula T CD8 com AS01E é equivalente a, ou melhor do que, com
152
AS01B.
A resposta CD4 específica para HBs tende a ser mais elevada com AS01B em comparação com AS01E após três imunizações, exceto para a dose mais baixa de RTS,S, onde os níveis de células T CD4 são comparáveis entre os dois adjuvantes. As respostas das célula T CD8 específicas HBs induzidas por RTS,S formuladas com AS01E, são equivalentes a ou melhores do que, as respostas induzidas por RTS,S formuladas com AS01B.
Pensa-se que estas diferenças estão dentro da variabilidade esperada dos ensaios de imunologia celular.
A avaliação pré-clinica da vacina RTS,S/AS01E em camundongos revelou um perfil de segurança aceitável, semelhante a aquele de RTS,S/AS01B.
XI: Avaliação clínica de RTS, S/AS01E.
As formulaçãos são preparadas como no exemplo X acima. Sacarose é usada como um excipiente na pelota de antígeno liofilizado. Como no exemplo X, o adjuvante líquido é usado para reconstituir o antígeno liofilizado. AS01E foi preparado como descrito no exemplo II.2, e estocado em +2 a +8 °C até necessário para reconstituição.
Um estudo duplo-cego aleatorizado de fase II da segurança e imunogenicidade de RTS,S auxiliado com AS01E está atualmente em andamento em crianças com a idade de 18 meses a 4 anos vivendo em Gabon. O programa de vacinação é um programa de vacinação de 0, 1,2- meses. Os objetivos são como segue para RTS,S/AS01E quando administrado como 3 doses intramuscularmente em um programa de 0,1,2-meses para crianças com a idade de 18 meses a 4 anos vivendo em uma área endêmica de malária: Co-primário para avaliar a segurança até uma pós Dose 3 de um mês.
para demonstrar não-inferioridade para uma vacina RTS,S com adjuvante de emulsão de óleo em água, em termos de resposta anticorpo
153 anti-CS de uma pós Dose 3 de um mês.
Secundário para avaliar reatogenicidade até uma pós Dose 3 de um mês.
para demonstrar não-inferioridade para uma vacina RTS,S com adjuvante de emulsão de óleo em água, em termos de resposta anticorpo HBs de uma pós Dose 3 de um mês.
para descrever soroproteção em relação a hepatite B até uma pós Dose 3 de um mês.
para descrever a resposta anti-CS até uma pós Dose 3 de um mês.
Terciário
Segurança entre uma pós Dose 3 de um mês até uma pós Dose 3 de 12 meses.
Resposta imune humoral para antígeno CS em uma pós Dose 3 de 12 meses.
Resposta imune humoral para antígeno HBs em uma pós
Dose 3 de 12 meses.
Exploratório para avaliar a imune resposta mediada por célula-T ao antígeno CS até uma pós Dose 3 de 12 meses.
para avaliar a imune resposta de memória de célula-B para antígeno CS até uma pós dose 3 de até 12 meses.
para descrever a resposta anti-CS até uma pós Dose 3 de um mês, de acordo com o status de imunização HBV documentado na avaliação.
180 indivíduos foram inscritos, 90 receberam uma vacina com adjuvante com um adjuvante de emulsão de óleo em água patenteado previamente validado (denominado “controle” nas tabelas abaixo) e 90
154 receberam uma vacina com adjuvante de AS01E. Crianças machos e fêmeas sadias com 18 meses a 4 anos de idade foram avaliadas. As vacinas foram administradas pela via IM à esquerda do deltóide.
Incidência e natureza dos sintomas (solicitados e não solicitados) relatados durante o período pós-vacinação de 7 dias (Dias 0-6) seguintes a cada dose e total (coorte vacinado total)
Qualquer sintoma Sintomas gerais Sintomas locais
95% Cl 95% Cl 95Í fcCI
Grupo N n % LL UL N n % LL UL N n % LL UL
Dosei Gr1 90 40 44.4 34.0 55.3 90 23 25.6 16.9 35.8 90 20 22.2 14.1 32.2
Gr 2 90 47 52.2 41.4 62.9 90 26 28.9 19.8 39.4 90 32 35.6 25.7 46.3
Dose 2 Gr1 89 50 56.8 45.8 67.3 88 36 40.9 30.5 51.9 88 35 39.8 29.5 50.8
Gr 2 87 53 60.9 49.9 71.2 87 39 44.8 34.1 55.9 87 34 39.1 28.8 50.1
Dose3 Gr 1 83 78 94.0 86.5 98.0 83 34 41.0 30.3 52.3 83 76 91.6 83.4 96.5
Gr 2 85 82 , 96.5 90,0 99.3 85 50 58.8 47.6 69.4 85 79 92.9 85.3 97.4
Total/dose Gr1 261 168 64.4 58.2 70.2 261 93 35,6 29.8 41.8 261 13 1 50.2 44.0 56.4
Gr 2 262 182 69.5 63.5 75.0 262 115 43.9 37.8 50.1 262 14 5 55.3 49.1 61.5
Total/indivíduo Grl 90 87 96.7 90,6 99.3 90 60 66,7 55.9 76.3 90 83 92,2 84.6 96.8
Gr 2 90 85 94.4 87.5 98,2 90 70 77.8 67.8 85.9 90 84 93.3 86.1 97.5
Gr.l = RTS,S.AS01E
Gr.2 = controle
LL = limite inferior
UL = limite superior
Para cada dose e total/indivíduo:
N = número de indivíduos com pelo menos uma dose administrada n/% = número/percentagem de indivíduos apresentando pelo menos um tipo de sintoma, seja qual for a vacina de estudo administrada
Para total/dose:
N = número de doses administradas n/% = número/percentagem de doses seguidas de pelo menos um tipo de sintoma, seja qual for a vacina de estudo administrada % Cl = 95 % exatos de intervalo de confiança, LL = Limite inferior, UL = Limite Superior
Estes dados demonstram que uma vacina RTS,S com
155 adjuvante AS01E forneceu resultados de reatogenicidade aceitáveis em uma população pediátrica, quando em comparação com uma formulação de controle.
As respostas sorológicas foram medidas avaliando-se as repetidas respostas anticorpo ao HBs e ao CSP (anti R32LR). O soro para a determinação de anticorpo foi coletado na avaliação, no dia 60 e no dia 90 (na segunda vacinação e na terceira vacinação). Os níveis de anticorpos em relação ao CS foram medidos por metodologia padrão ELISA, usando-se placa de antígeno R32LR adsorvido com um anticorpo de referência padrão como um controle, de acordo com SOPs de laboratório. Os resultados são relatados em EU/mL.
O anticorpo para antígeno de superfície da hepatite B foi medido utilizando-se um imunoensaio ELISA comercialmente disponível (kit de teste AUSAB EIA da Abbott) ou equivalente, de acordo com as instruções do ensaio. Os resultados são relatados em mlU/mL.
Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos anti-CS (coorte vacinado total)
>=0.5 ELU/ML GMC
95Ϊ fcCI 959 ÍCI
Anticoxpo Grupo Regulação N n % LL UL valor LL UL Min Max
Anti-CS Gr 1 TRIAGEM 89 .0 0.0 0Ό 44 0.3 Õ.3 0.3 <0.5 <0.5
PII(D60) 78 78 100 95.4 100 81.9 64.9 103.2 4,6 568.6
PIII(D90) 75 75 100 95.2 100 215.6 178.8 259.9 14.3 1922.3
Gr 2 TRIAGEM 90 1 14 0.0 6.0 0.3 0.2 0.3 <0.5 0.5
Pll(D60) 78 78 100 95.4 100 56.9 45.7 70.9 3.6 2380.9
P1ll(D90) 80 80 100 95.5 100 164.8 134.1 202.6 6.3 2093.6
Gr.l = RTS,S.AS01E
Gr.2 = Controle
GMC = média geométrica de concentração de anticorpo calculada em todos os indivíduos
N = número de indivíduos com resultados disponíveis n /% = número/percentagem de indivíduos com concentração dentro da
156 faixa especificada % Cl = 95 % de intervalo de confiança; LL = Limite Inferior, UL = Limite
Superior
MIN/MAX = Mínimo/Máximo
Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos anfi-HBs (coorte vacinado total)
>310MIU/ML GMC
95* fcCI 95°/ ÍCI
Anticorpo Grupo Regulação N n % LL UL Valor LL UL Min Max
Anti-HBs Gf1 TRIAGEM 89 43 48.3 37.6 59.2 308 23.3 71.4 <10.0 46421.6
Plt(D60) 78 77 98.7 93.1 100 8936.4 4684.2 17048.7 <10.0 161536 7
PIII(D90) 75 75 100 95.2 100 24527.7 15316.5 39278.5 21.1 169430 6
Gr2 TRIAGEM 90 37 41.1 30.8 52.0 20.0 12.8 31.0 <10.0 30796.4
P«(D60) 78 77 98.7 93.1 100 3640.0 1963.1 6749.3 <10.0 150811 4
Plll(D90) 80 80 100 95.5 100 19485.0 13511.3 28099.9 178.6 110397 4
Gr.l = RTS,S.AS01E
Gr.2 = Controle
GMC = concentração anticorpo de média geométrica calculada em todos —10 os indivíduos
N — número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/percentagem de indivíduos com concentração dentro da faixa especificada % Cl = 95 % de intervalo de confiança; LL = Limite Inferior, UL =
Limite Superior
MIN/MAX = Mínimo/Máximo
Estes dados demonstram que uma formulação de vacina RTS,S com adjuvante AS01E forneceu respostas imunes humorais aceitáveis em uma população pediátrica, quando em comparação com um controle de 20 validado.
Exemplo XII: Avaliação pré-clinica de Vírus Varicella Zoster com AS01B em comparação com AS01E.
157
A vacina candidata é composta de uma proteína de envoltório VZV truncada, gE, produzida em células CHO.
Para este estudo, camundongos C57BL/6 (n=48) foram imprimados com uma dose humana (HD) de Varilrix (~4 log pfu/dose) administrada sub-cutâneamente. Cinco semanas após imprimados com Varilrix, os camundongos foram divididos em até 5 grupos de 12 camundongos e injetados intra-muscularmente (tíbias) nos dias 0 e 28 com 5 pg de gE sozinho, 5 pg gE + AS01E* (1/10 HD) ou 5 pg gE + AS01B (1/10 HD). O grupo de controle de camundongos (somente imprimados) foi injetado com solução salina (0,9 % NaCl). As imune respostas foram avaliadas em 14 e/ou 30 dias seguindo-se a segunda vacinação. Os níveis de anticorpos totais específicos gE e a freqüência de citocina produzindo (IL2/IFNÜ) células T CD4 e CD8 foram avaliados.
Respostas anticorpo específicas gE:
Um ELISA foi desenvolvido para detectar e quantificar anticorpos gE-específicos em soro de camundongos, usando-se proteína gE como o antígeno de revestimento. Os títulos ELISA foram definidos como o recíproco da diluição de soro, que produziu uma medida de absorvência (densidade óptica) igual a 50 % do valor de absorvência máximo. Os títulos ELISA foram calculados por análise de regressão.
Os dados demonstram que gE AS01E e gE AS01B induziram níveis similares de anticorpos específicos gE (pvalores > 0,05). Ambas formulações induziram respostas significativamente mais elevadas em comparação com o antígeno gE sozinho (10-13 vezes, pvalores < 0,05) tanto em 14 quanto em 30 dias pós II (Figura 26).
14 dias pós Π 95% Cl 30 dias pós Π 95% Cl
Grupo GMT (EU/ml) LL UL GMT (EU/ml) LL UL
QE 12067 5960 24433 3832 911 16115
gE/ASOIE 126934 95504 166059 50439 38071 66825
jg&ASOlB 131728 88112 196934 47589 36158 62635
Varilrix 34 11 105 33 10 102
158 $ Respostas CD4 e CD8 específicas gE
A produção de citocina foi avaliada em células T CD4 e CD8 empregando-se uma técnica de coloração de citocina intra-celular. Células de baço foram isoladas de cada grupo de 12 camundongos nos 30 dias pós II e reunidas em 4 grupos de 3 baços. Células de baço (1 χ 106) foram incubadas por 2 horas na presença de peptídeos gE (63 peptídeos) abrangendo a proteína completa gE (20 aa peptídeos/10 aa sobreposição) e então incubadas durante a noite na presença de brefeldin. Subseqüentemente as células foram coloridas com fluorescente mAb específico para superfície de célula CD4/CD8 e seguindo-se à permeabilização intracelular de citocinas IL-2 e IFNy.
Como apresentado nas figuras 26, embora perfis similares de citocina (IL2/IFNy) sejam induzidos tanto com formulações AS01B gE como AS01E gE, a formulação de AS01B induziu uma mais elevada magnitude de células produzindo tanto citocina CD4 como CD8 (2 vezes, p>0,005 para CD4, 3,6 vezes, p>0,05 para CD8). Devido a inesperada elevada variabilidade das respostas das células T, a capacidade para detectar uma significante diferença entre as doses adjuvantes foi muito limitada (<50 %). Importantemente tanto gE formulado com AS01B como com AS01E induziu células T CD4 a produzirem citocina de uma significativamente mais elevada magnitude (13,3 vezes, p< 0,05), em comparação ao gE sozinho. Os níveis mais elevados de células CD8 foram também induzidos por gE formulado com AS01B ou AS01E (3,8 vezes, p> 0,05) em comparação ao antígeno gE sozinho.
Exemplo XIII: Avaliação Pré-clínica de AS01B v AS01E em um modelo de Doninha de influenza
Materiais e métodos
Doninhas fêmeas (Mustela putorius furo) de 4 - 6 meses de idade foram obtidas da MISAY Consultancy (Hampshire, UK). As doninhas foram imprimadas no dia 0 com a cepa heterossubtípica H1N1
159 r
A/Stockholm/24/90, (4LogTCID50/ml), 250 μΐ administrada intranasalmente. No dia 21, as doninhas foram injetadas intramuscularmente com uma dose humana total (1000 μΐ dose de vacina, 15 μg HA por cepa A, 17,5 pg cepa B) de uma combinação de H1N1 A/New Caledonia C/20/99 (15 pg/ml), H3N2 A/Wyoming/3/2003 (15 pg/ml) e B/Jiangsu/10/2003 (17,5 pg/ml). As doninhas foram então provocadas no dia 42 por via intranasal com 250 μΐ de uma cepa heterossubtípica Wh.A/Ny/55/04 (4,51 Log TCID50/ml). As vacinações no dia 21 foram com a formulação trivalente simples (“simples” nas tabelas acima) ou com a formulação trivalente com adjuvante AS01B (“AS01B” nas tabelas abaixo) ou AS01E (“AS01E” nas tabelas abaixo). As formulações foram preparadas como exposto acima.
Monitoramento da temperatura corporal:
As temperaturas individuais foram monitoradas durante o período de desafio e foram avaliadas usando-se implantes de telemetria que registraram cada temperatura do animal individual a cada 15 minutos antes e após o desafio. Todos os implantes foram verificados e renovados e uma nova calibração foi realizada por DSI antes da colocação na cavidade intraperitoneal. Todos os animais foram individualmente alojados em gaiolas simples durante estas medições. As temperaturas foram registradas a cada 15 minutos e 6 dias antes da iniciação até 4 dias pós-iniciação, assim como 3 dias antes do desafio até 7 dias pós-desafio.
Teste de inibição de Hemaglutinação (HI).
Procedimento de teste
Os títulos de anticorpo de anti-hemaglutinina para as três cepas de vírus de gripe foram determinados usando-se o teste de inibição de hemaglutinação (HI). O princípio do teste HI é baseado na capacidade de anticorpos específicos da anti-gripe inibirem a hemaglutinação de células sangüíneas vermelhas de frango (RBC) por hemaglutinina do vírus influenza (HA). Os soros foram primeiro tratados com uma solução de 25 %
160 neuraminidase (RDE) e foram inativados por calor, para remover inibidores não específicos. Após pré-tratamento, diluições duplas de soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada cepa de gripe. Células sangüíneas vermelhas de frango foram então adicionadas e a inibição de aglutinação foi classificada usando-se lacerações para leitura. Os títulos foram expressos como o recíproco da mais elevada diluição de soro que inibiu completamente a hemaglutinação. Como a primeira diluição de soros foi 1:10, um nível indetectável foi classificado como um título igual a 5.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada nos títulos HI utilizando-se UNISTAT. O protocolo aplicado para análise de variação pode ser brevemente descrito como a seguir:
• Transformação log dos dados.
• Teste Shapiro-Wilk em cada população (grupo) a fim de verificar a normalidade dos grupos de distribuição.
• Teste Cochran a fim de verificar a homogenicidade de variação entre as diferentes populações (grupos) • Análise de variação de uma direção realizada em grupos.
• Teste Tuckey-HSD para múltiplas comparações Titulação viral em lavagens nasais
Todas as amostras nasais foram primeiro filtradas estéreis através de filtros Spin X (Costar), para remover qualquer contaminação bacteriana. 50 μΐ de diluições de dez vezes seriais de lavagens nasais foram transferidas para placas de microtítulo contendo 50 μΐ de meio (10 poços/diluição). 100 μΐ de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) foram então adicionados a cada poço e incubados a 35 °C por 6-7 dias. Após 6-7 dias de incubação, o meio de cultura é suavemente removido e 100 μΐ de um meio contendo 1/20 WST-1 é adicionado e incubado por outras 18 horas. A intensidade do pigmento formazan amarelo produzido sob redução de WST-1
161 % por células viáveis é proporcional ao número de células viáveis presentes no poço no final do ensaio de titulação viral e é quantificada medindo-se a absorvência de cada poço no comprimento de onda apropriado (450 nanometros). O corte é definido como a média OD de células de controle não infectadas - 0,3 OD (0,3 OD corresponde a +/- 3 Desvio padrão de OD de células de controle não infectadas). Uma classificação positiva é definida quando OD é < corte e em contraste uma classificação negativa é definida quando OD é > corte. Os títulos de espalhamento viral foram determinados por “Reed and Muench” e expressos como Log TCID5o/ml.
Ensaio de linfoproliferação.
PBMC foram coletados por centrifugação gradiente de densidade (20 min a 2500 rpm e 4 °C) em solução mamífera linfólita Ficoll Cedarlane. PBMC foram ressuspensos em 5 ml de meio de cultura (RPMI/Add a 4 °C) e 10 % de soro de doninha normal. Os aditivos foram compostos de 100 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais MEM, Penicilina/estreptamicina, glutamina e 1000 x mercaptoetanol-P2 concentrado. PBMC recentemente isolados foram imediatamente usados por ensaios de proliferação in vitro. As células foram colocadas em placas de cultura de tecido de fundo plano de 96-poços a 2 x 105 células/poço e cultivadas com diferentes concentrações de antígeno (0,1 a 1 pg HA de vírus todo inativado) por 44 a 96 h e em seguida foram rotuladas por pulsação com 0,5 pCi de [3H]thimidina. A incorporação de marcador radioativo foi estimada 4 a 16 horas depois por espectroscopia de emissão-β.
Resultados
Carga viral em lavagens nasais após-desafio.
As lavagens nasais foram coletadas 2 dias antes da iniciação (iniciação = dia 0) 1, 2, e 7 pós iniciação, assim como, 4 dias antes do desafio (desafio = dia 42) e por um período de 7 dias pós classificação.
162
Grupo -2 0 +1 +2 +7 39 42 43 44 45 47 49
Simples 0,82 1,84 5,35 1,85 0,8 1,82 5,77 4,44 1,97 0,9
AS01E 0,82 2,11 5,83 1,65 0,8 1,62 4,93 4,15 2,4 0,85
AS01B 0,81 2,26 5,38 1,91 0,82 1,74 2,25 1,89 1,350 0,9
Vide resultados na figura 27.
Espalhamento viral após iniciação
Um pico de espalhamento viral foi observado em todas as doninhas 2 dias após a iniciação.
dias pós iniciação, somente carga viral residual foi observada em todos os grupos.
Espalhamento viral após desafio
O pico de espalhamento viral foi observado 24 horas após o desafio.
A titulação viral 3 dias pós-desafio mostrou elevados títulos virais (nenhuma proteção) em doninhas imunizadas com trivalente dividida simples. A mais baixa redução do espalhamento viral foi observada em doninhas imunizadas com AS01E trivalente dividida do que foi vista com trivalente dividida com adjuvante AS01B.
Monitoramento da temperatura:
A temperatura corporal foi monitorada por 6 dias pré-iniciação (iniciação = dia 0) até 4 dias pós-iniciação, bem como de 3 dias pré-desafio até 7 dias pós-desafio (desafio = dia 42). As medições foram tomadas a cada 15 minutos e uma média calculada por meio-dia para cada grupo. Os resultados podem ser vistos na figura 28.
Pós iniciação
A temperatura monitorada antes, durante e após a iniciação mostrou um aumento na temperatura em todos os grupos. Pós-desafio
A interpretação do monitoramento da temperatura corporal é difícil. Um ligeiro aumento da temperatura corporal foi observado pós-desafio em doninhas imunizadas com trivalente dividida simples e trivalente dividida
163 com AS01E, mas não com trivalente dividida com AS01B. A classificação abaixo foi obtida por número de doninhas com um aumento da temperatura
corporal de >0,4 °C. Aumento na temperatura pós desafio
Trivalente simples: 5/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,7, +0,8)
Trivalente AS01B: 0/8
Trivalente AS01E: 6/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,5, +0,9, +1,6)
Esta leitura é menos robusta do que outras leituras utilizadas em doninhas.
Teste de Inibição de Hemaglutinação (HI)
Amostras de soro foram coletadas 4 dias antes da iniciação, 17 dias pós-iniciação, 21 dias pós-imunização e 13 dias pós-desafio. Os resultados podem ser vistos nas figuras 29 e 30. Para todas as três cepas de vacina, títulos mais elevados (HI), estatisticamente significativos, foram observados em doninhas imunizadas com trivalente dividida com adjuvante AS01B ou AS01E em comparação com trivalente dividida simples. Nenhuma diferença foi observada entre os dois grupos com adjuvantes. Em comparação com outros grupos, foram observados títulos mais elevados (HI) de reação cruzada estatisticamente significativos para A/New York H3N2 (cepa de desafio) após a imunização de doninhas com vacinas trivalentes divididas com adjuvante AS01B.

Claims (27)

1. Composição imunogênica em um volume de dose adequado para uso humano, caracterizada pelo fato de compreender um antígeno ou preparação antigênica em combinação com um adjuvante, adjuvante este compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa, derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina, apresentada na forma de um lipossoma e um lipopolissacarídeo, em que a dita fração de saponina e o dito lipopolissacarídeo estão ambos presentes na dita dose humana em um nível entre 1 pg e 30 pg.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição adjuvante compreende ainda um esterol, em que a razão saponina: esterol é 1:1 a 1:100 p/p.
3. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita fração de saponina imunologicamente ativa é QS21.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o dito esterol é colesterol.
5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo é um derivado de lipídeo A.
6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito derivado de lipídeo A é 3D-MPL.
7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a razão QS21: 3D-MPL é de 1: 1.
8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo esté presente em uma quantidade de 25 pg.
9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das
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2 / 4 reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo está presente em uma quantidade de 1 - 15 μg.
10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita saponina está presente em uma quantidade de 1 - 25 μg.
11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a dita saponina está presente em uma quantidade de 25 μg.
12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a dita saponina está presente em uma quantidade de 1 - 10 μg.
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de o dito volume de dose adequado para uso humano ser entre 0,5 e 1,5 ml.
14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que QS21 e 3D-MPL estão em um nível entre 20 e 30 μg.
15. Composição adjuvante em um volume adequado para uso em uma dose humana de uma composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender entre 1 e 30 μg de um lipopolissacarídeo e entre 1 e 30 μg de uma fração de saponina imunologicamente ativa apresentada na forma de um lipossoma.
16. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo é um derivado de lipídeo A.
17. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o dito derivado de lipídeo A é 3D-MPL.
18. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que a dita fração de
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19. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato de que o dito volume adequado para dose humana é 250 pl.
20. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato de que o dito volume adequado para dose humana é 360 pl.
21. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo está presente em uma quantidade de 25 pg.
22. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo está presente em uma quantidade de 10 pg.
23. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato de que o dito lipopolissacarídeo está presente em uma quantidade de 5 pg.
24. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizada pelo fato de que a dita saponina imunologicamente ativa está presente na quantidade de 25pg.
25. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizada pelo fato de que a dita saponina imunologicamente ativa está presente na quantidade de 10pg.
26. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizada pelo fato de que a dita saponina imunologicamente ativa está presente na quantidade de 5pg.
27. Uso de uma composição antigênica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um adjuvante, como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 26, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para o suprimento da dita composição antigênica e
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4 / 4 adjuvante a um indivíduo ou população necessitados em necessidade destes.
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