CN103405764A - 包含皂苷佐剂的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含皂苷佐剂的疫苗组合物。具体地，本发明提供了人类剂量的免疫原性组合物，包含与佐剂组合的抗原或抗原制剂，该佐剂包含以脂质体形式存在的来源于南美皂皮树的树皮的免疫活性皂苷级分和脂多糖，其中所述皂苷级分和所述脂多糖都以低于30μg的水平存在于所述人类剂量中。本发明进一步提供了人类剂量合适体积的佐剂组合物，包含1-30μg脂多糖和以脂质体形式存在的1-30μg免疫活性皂苷级分。

Description

包含皂苷佐剂的疫苗组合物
本申请是申请日为2006年12月12日的中国专利申请200680047139.5“包含皂苷佐剂的疫苗组合物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及改进的疫苗组合物、制备它们的方法，以及它们在医学中的用途。具体地，本发明涉及含佐剂的疫苗组合物，其中所述佐剂是脂质体制剂，包含皂苷和脂多糖。本发明进一步涉及流感疫苗制剂和用于进行抗流感疾病免疫的免疫方案。
背景技术
总是需要具有改进的免疫原性的新组合物或疫苗。作为一种策略，已经用佐剂尝试和改进针对任何给定抗原产生的免疫应答。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的外小叶的主要表面分子，并且只存在于所述外小叶中。LPS通过血清补体和吞噬细胞阻止细菌破坏，并且参与用于集群的粘附。LPS是一组结构上相关的复杂分子，大小是大约10,000道尔顿，并且由三个共价连接的区域组成：
(i)外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)
(ii)核心寡糖中心区
(iii)最内部的区域，其作为疏水性锚，包含携带长链脂肪酸的糖胺二糖单元。
已经证明LPS的生物活性，例如致死毒性、致热性和佐剂性，与脂质A部分相关。相反，免疫原性与O-特异性多糖成分(O-抗原)相关。长期以来，已知LPS和脂质A都具有强佐剂作用，但这些分子的高毒性排除了将它们用于疫苗制剂。因此，为了减少LPS或脂质A的毒性而保持它们的佐剂性，进行了显著努力。
1966年，从亲本(光滑)菌株的培养物分离了明尼苏达沙门氏菌突变体R595(Luderitz等，1966Ann.N.Y.Acad.ScL133：349-374)。筛选了选择的菌落对一组噬菌体的裂解的易感性，仅仅选择了展示出窄范围敏感性(仅仅对一种或两种噬菌体易感)的那些菌落进行进一步研究。该努力导致分离了深粗糙(deep rough)突变菌株，其是LPS生物合成缺陷的，并且称作明尼苏达沙门氏菌R595。
与其它LPS相比，由突变体明尼苏达沙门氏菌R595产生的那些具有相对简单的结构。
(i)它们不含O-特异性区-这是导致从野生型光滑表型转变为突变的粗造表型并且导致失去毒力的特征
(ii)核心区非常短-该特征增加菌株对多种化学物质的易感性
(iii)脂质A部分由最多7个脂肪酸进行高度酰化。
4′-单磷酰脂质A(MPL)可以通过从革兰氏阴性细菌的深粗糙突变株提取的LPS的酸水解获得，其保留LPS的佐剂特性，同时证明毒性减少超过1000的因数(由鸡胚卵中的致死剂量测量)(Johnson等，1987Rev.Infect.Dis.9Suppl：S512-S516)。LPS典型地在中等强度的无机酸溶液(如0.1M HCl)中回流大约30分钟。该过程导致在1位的去磷酸化，和在6’位的去糖化，产生MPL。
3-O-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)可以通过MPL的温和碱水解获得，其具有进一步减少的毒性，同时也保持佐剂性。参见US4,912,094(Ribi Immunochemicals)。碱水解典型地在有机溶剂，如氯仿/甲醇的混合物中通过用弱碱水溶液，如pH10.5的0.5M碳酸钠饱和而进行。
关于制备3D-MPL的进一步信息可以从例如US4,912,094和WO02/078637(Corixa Corporation)获得。
皂苷是从皂树(Quillaja saponaria)的树皮提取的三萜糖苷。粗皂苷已经广泛用作兽医佐剂。Quil-A是皂苷材料的一种部分纯化的水性提取物。QS21是Quil A的Hplc纯化的无毒级分，其制备方法(作为QA21)公开于美国专利No.5,057,540。
举例说明，已经开发了具有佐剂的流感疫苗和抗人乳头瘤病毒(HPV)的疫苗。
流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感产生重大的经济负担、发病率乃至死亡率。
流感病毒是RNA包膜病毒，颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为：内部为与核蛋白缔合的核糖核酸(RNA)核衣壳或核心，其包绕着脂质双层结构和外层糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。流感病毒包含两种表面抗原：糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，它们以10-12nm长的刺突显露在颗粒表面上。就是这些表面蛋白、尤其是血细胞凝集素，决定了流感亚型的抗原特异性。
这些表面抗原渐进地、有时快速地经历某些导致流感病毒抗原性变异的改变。这些抗原性改变称为‘漂移’和‘转换’，是不可预见的，由免疫学观点看可能具有显著的影响，因为它们最终导致出现新流感株，能使病毒逃逸免疫系统，几乎每年都引起众所周知的流行病。
每个季节加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO协同国家卫生管理局以及疫苗生产商共同确定。
HA是确定不同流感株的血清学特异性的最重要的抗原。此75-80kD的蛋白包含众多的抗原决定簇，其中几个位于在不同毒株中经历序列改变的区域中(毒株特异性决定簇)，其余的位于许多HA分子共有的区域中(决定簇所共有的)。
流感病毒几乎每年冬天都引起流行，甲型或乙型病毒的感染率在6周的时间段内高达40％。流感感染产生各种疾病状态，由亚临床感染至轻微的上呼吸道感染到严重的病毒性肺炎。典型的流感流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。疾病的严重性主要由宿主的年龄、其免疫状况和感染部位决定。
65岁和以上的老年人尤其易受攻击，占发达国家所有流感相关死亡的80-90％。患有基础性慢性疾病的个体也非常有可能经历这种并发症。幼儿也可能患严重疾病。因此，这些群体尤其需要受保护。除了这些‘风险’群体以外，卫生当局还推荐对与老年人接触的健康成人接种。
接种对控制每年的流感流行起关键作用。目前可用的流感疫苗是灭活的流感疫苗或减毒活流感疫苗。灭活的流感疫苗包括3种可能形式的抗原制剂：灭活的全病毒、纯化的病毒颗粒被去污剂或其它试剂破坏以溶解脂质包膜的亚病毒体(所谓的“分裂(split)疫苗”)或纯化的HA或NA(亚单位疫苗)。这些灭活的疫苗肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)施用。
所有种类的流感疫苗通常都是三价疫苗。一般来说，它们含有的抗原得自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株。据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：An improved single radial immunodiffusiontechnique for the assay of influenza haemaggiutinin antigen：adaptation forpotency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，International collaborativestudy ofsingle radial diffuslon and Immunoelectrophoresis techniques forthe assay of haemaggiutinin antigen of influenza virus.J.Bio1.Stand.9(1981)317-330)的检测，在大多数情况下，标准0.5ml注射剂量含有每种毒株的15μg血细胞凝集素抗原组分。
目前可用的流感疫苗被认为在所有年龄组都是安全的(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，很少有证据表明当前的流感疫苗在2岁以下的儿童中有作用。而且，预防典型的已确认流感疾病的疫苗的报告有效率对老年人为23-72％，这显著低于对较年轻成年人所报告的60-90％的有效率(Govaert，1994，J.Am.Med.Assoc，21，166-1665；Gross，1995，Ann Intern.Med.123，523-527)。业已表明，流感疫苗的有效性与针对病毒株的血凝反应抑制(HI)抗体的血清滴度相关，几个研究已发现较年长的成年人在流感免疫后表现出的HI滴度低于较年轻成年人(Murasko，2002，Experimental gerontology，37，427-439)。
因此，仍需要具有改善的免疫原性的新疫苗。疫苗抗原和有效佐剂的制剂是一种有可能增强对亚病毒体抗原的免疫应答的方法。
用水包油乳液形式的佐剂MF59作为佐剂的亚单位流感疫苗已商品化，已证明其诱导高于无佐剂亚单位疫苗所获抗体滴度的抗体滴度的能力(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，在后来的出版物中，相同疫苗没有表现出其相比无佐剂分裂疫苗改善的谱(Puig-Barbera等，2004，Vaccine23，283-289)。
作为背景，在大流行之间的时间段内，与之前流行的流感病毒相关的流感病毒传播。病毒以和生命早期感染不同的免疫水平在人之间传播。在通常2-3年的时间段内，这种传播促进对已改变得足以在一般群体中再引起流行的新毒株的选择；此过程称为‘抗原性漂移’。‘漂移变体’在任一年中在不同的社区、地区、国家或洲都具有不同影响，尽管在几年内其总体影响经常是相似的。换句话说，当出现人群对其没有免疫性的新流感病毒时，发生流感大流行。典型的流感流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。老年人或患有基础性慢性疾病的人最有可能经历此并发症，而幼儿也可能患严重疾病。
新流感病毒以不可预见的间隔出现，其具有与之前季节流行的毒株完全不同亚型的关键表面抗原，即血细胞凝集素。此时，产生的抗原可以先前在人体中循环的毒株的对应蛋白的20％至50％变化。这可导致病毒逃逸‘群体免疫’，并建立大流行。此现象叫做‘抗原性转变’。一般认为，至少在过去已发生了大流行，当时不同物种的流感病毒如禽或猪流感病毒已穿过种间屏障。如果这些病毒具有人与人之间传播的潜力，它们可在数月至一年内全球扩散，导致大流行。例如，在1957年(亚洲流感大流行)，H2N2亚型取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少从首先分离到该病毒的1918年开始就在人群中循环。H2HA和N2NA在1957年至1968年之间经历了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出现的H3N2流感病毒亚型替代，此后N2NA连同H3HA继续漂移(Nakajima等，1991，Epidemiol.Infect.106，383-395)。
给予流感病毒株引起大流行爆发潜力的流感病毒株特征是：与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素，其可伴有或不伴有神经氨酸酶亚型的改变；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟类中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的乃至整个群体以前都没有遇到抗原，在免疫学上对抗原是原初态的。
乳头瘤病毒是小DNA肿瘤病毒，是高度物种特异性的。迄今为止已描述了100多种独立的人乳头瘤病毒(HPV)基因型。一般来说，HPV对皮肤(例如HPV-1和HPV-2)或粘膜表面（例如HPV-6和HPV-11)是特异性的，通常引起持续数月或数年的良性肿瘤(疣)。这种良性肿瘤可困扰所涉及的个体，但趋向于无生命威胁，有一些例外。
一些HPV还与癌症相关。HPV和人类癌症之间最强的正相关是HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间存在的正相关。宫颈癌是发展中国家最常见的恶性肿瘤，在全世界每年发生约500,000例新病例。现在，使用疫苗主动对抗原发性HPV-16感染乃至已确诊的含HPV-16的癌症在技术上是可行的。关于抗HPV-16的预防性和治疗性接种的前景的综述，参见Cason J.，Clin.Immunother.1994；1(4)293-306和HageneseeM.E.，Infections in Medicine199714(7)555-556，559-564。
尽管确实存在微小差异，但所描述的所有HPV基因组都具有至少8个早期基因，即E1至E8和2个晚期基因，即L1和L2。另外，上游调节区具有调节序列，该调节序列似乎控制HPV基因组的大部分转录事件。
基于HPVL1的疫苗公开于WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184和WO94/05792。此疫苗可包含为单体、壳粒或病毒样颗粒的L1抗原。制备VLP的方法在本领域众所周知，包括VLP分解-再组装法，以提供增强的均一性，例如WO9913056和US6245568所述。这种颗粒可另外包含L2蛋白。基于L2的疫苗描述于例如WO93/00436。其它HPV疫苗方法基于早期蛋白，例如E7或诸如L2-E7的融合蛋白。
仍需要改进的疫苗，特别是在流感的情况下，特别是流感大流行，以及对于老年人群，或在HPV疫苗的情况下。
以前已经公开了含有脂多糖和皂苷的组合的佐剂，例如，在EP0671948中。该专利证明了当脂多糖(3D-MPL)与皂苷(QS21)组合时的强协同作用。目前已经发现在佐剂组合物中采用脂多糖和皂苷的组合作为免疫刺激剂，可以实现良好的佐剂特性，甚至当免疫刺激剂在人类剂量中以小量存在时也是如此。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了免疫原性组合物，其包含与佐剂组合物组合的抗原或其抗原性制剂，所述佐剂组合物包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树(Quillaja SaponariaMolina)的树皮并以脂质体形式存在。
在本发明的第二方面，提供了免疫原性组合物，其包含与皂苷佐剂组合的流感病毒或其抗原性制剂，所述皂苷佐剂以脂质体形式存在。在该方面的一种特定实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含脂质A衍生物，如3D-MPL。
适当地，本发明的脂质体形式的皂苷佐剂包含来源于南美皂皮树的树皮的皂苷的活性级分，如QS21和甾醇，如胆固醇，其中皂苷：甾醇的比是1∶1-1∶100w/w。
具体地，所述免疫原性组合物包含具有CD4T细胞表位的抗原。或者，所述免疫原性组合物包含具有B细胞表位的抗原。
本发明也涉及流感病毒或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防流感病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。
本发明也涉及人乳头瘤病毒抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防人乳头瘤病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。
本发明也涉及巨细胞病毒抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防巨细胞病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。
本发明也涉及肺炎链球菌抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防肺炎链球菌感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。
本发明也涉及恶性疟原虫抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防恶性疟原虫感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。
本发明也涉及水痘-带状疱疹病毒抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防水痘-带状疱疹病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。
另一方面，提供了(a)抗原或其抗原性制剂和(b)上文定义的佐剂在制备用于在人类中诱导以下至少一种或至少两种或全部效果的免疫原性组合物中的用途：(i)改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的CD4T-细胞免疫应答，(ii)改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的体液免疫应答，(iii)改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的B-记忆细胞应答。
具体地，所述抗原是流感病毒、HPV、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、肺炎链球菌或疟疾抗原或其抗原性制剂，并且所述人是免疫受损的个体或群体，例如高危成人、老年人或婴儿。在一种特定实施方案中，提供了本文定义的抗原或其抗原性制剂在制备用于人类，特别是老年人抗病原体接种的免疫原性组合物中的用途，其中免疫组合物中的抗原来源于所述病原体。特别地，所述抗原是流感病毒、人乳头瘤病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎链球菌、疟原虫寄生虫抗原或其抗原性制剂。
也提供了接种方法，包括给有需要的个体或群体送递抗原或抗原性组合物，特别是流感病毒或HPV、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎链球菌、疟原虫寄生虫或其抗原性制剂和上文定义的佐剂。
在一种特定实施方案中，与用不包含佐剂的抗原或抗原性组合物所获得的免疫应答相比，所述免疫原性组合物能够诱导改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的CD4T-细胞免疫应答，特别地，进一步能够诱导体液免疫应答或改进的B-记忆细胞应答，或这两者。特别地，所述CD4T-细胞免疫应答涉及诱导交叉反应性CD4T辅助细胞应答。特别地，所述体液免疫应答涉及诱导交叉反应性体液免疫应答。
在进一步的实施方案中，提供了上文定义的方法或用途，用于提供抗病原体导致的感染或疾病的保护作用，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原所来源的病原体的变体。在另一实施方案中，提供了上文定义的方法或用途，用于提供抗病原体导致的感染或疾病的保护作用，所述病原体包含抗原，所述抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。在一种特定实施方案中，提供了抗原，特别是流感病毒或HPV或其免疫原性制剂在制备用于以前用包含抗原的免疫原性组合物接种的人的再次接种的免疫原性组合物中的用途，所述抗原特别是流感病毒或HPV或其抗原性制剂，其与本文描述的佐剂组合。
在一种特定实施方案中，用于再次接种的组合物可以额外包含佐剂。在另一特定实施方案中，用于再次接种的免疫原性组合物包含抗原，所述抗原与用于前一次接种的抗原或抗原性组合物具有共同的CD4T-细胞表位。特别地，用于再次接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制剂，其与用于第一次接种的流感病毒或其病毒抗原性制剂具有共同的CD4T-细胞表位。
一方面，对已经在上一季进行了抗流感接种的受试者中进行再次接种。典型地，在第一次接种后至少6个月，优选在第一次接种后8-14个月，更优选在第一次接种后大约10-12个月进行再次接种。另一方面，在已经用包含流感病毒或其抗原性制剂的组合物接种的受试者中进行再次接种，其中至少一种病毒株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。
在本发明的进一步的实施方案中，提供了来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂在制备本文定义的用于提供抗流感感染的保护作用的免疫原性组合物中的用途，所述流感感染由变异的流感病毒株导致。
本发明也涉及接种方法，包括送递流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的佐剂。
另一方面，提供了对免疫受损的人类个体或群体，例如高危成人或老年人进行接种的方法，包括施用包含与本文定义的佐剂组合的流感病毒或其抗原性制剂的流感免疫原性组合物。
在另一实施方案中，本发明提供了对以前用流感免疫原性组合物接种过的人进行再次接种的方法，所述组合物包含与本文定义的佐剂组合的、来自至少一种流感病毒株的流感病毒抗原或其抗原性制剂，所述方法包括给所述人施用含有佐剂或不含佐剂的免疫原性组合物，所述组合物包含流感病毒或其抗原性制剂。
本发明也涉及用于制备免疫原性组合物的方法，包括将脂质体形式的皂苷佐剂与流感病毒或其抗原性制剂组合，任选与3D-MPL组合。
在以下优选实施方案的详述中进一步描述本发明的其它方面和优点。
附图说明
图1：MPL制备的图示。
图2：在用实验制剂免疫雪貂后抗各种流感病毒株的体液应答：异源初免(H1N1A/斯德哥尔摩/24/90)之前和之后，免疫后(H1N1A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97)以及异源攻击后(H3N2A/怀俄明/3/2003)的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。
图3：雪貂研究：攻击后(第42天)鼻洗液中的病毒滴度。
图4：小鼠研究：用实验制剂免疫小鼠后抗三种流感疫苗株的体液应答：免疫(H1N1A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/怀俄明/3/2003和B/江苏/10/2003)后21天的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。
图5：小鼠研究：细胞介导的免疫应答：免疫后第7天的流感特异性CD4+T细胞应答。
图6：小鼠研究：CD4的CMI-合并的病毒株(都加倍)-第0天和第21天。
图7：第0天和21天时HI抗体的GMTs。
图8：用含有佐剂的流感病毒制剂免疫后，在7天随访阶段期间报道的人局部和全身症状的发生率(总数和第3级相关的)，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图9：用含佐剂的HPV制剂免疫后，小鼠中对HPV16和18L1的体液应答，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图10：小鼠中的细胞介导的免疫应答：细胞内细胞因子染色-用含佐剂的HPV制剂免疫后的VLP16和18CD4+T细胞，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图11：用含佐剂的HPV制剂免疫后产生特异性B记忆细胞，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图12：小鼠中含有佐剂的肺炎链球菌疫苗的临床前比较，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图13：用含有佐剂的Gb疫苗免疫后的豚鼠抗-gB ELISA滴度，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图14：用含有佐剂的Gb疫苗免疫后的豚鼠抗CMV中和滴度，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图15：用含有佐剂的gB疫苗免疫后的小鼠抗-gB ELISA滴度。
图16：用含有佐剂的gB疫苗免疫后的小鼠抗CMV中和滴度。
图17：小鼠研究：细胞介导的免疫-用gB肽的合并物再刺激后的CMV特异性CD4+和CD8+细胞(第二次免疫后7天)。
图18：小鼠研究：细胞介导的免疫-用两种不同剂量的gB肽的合并物再刺激后的CMV特异性CD4+细胞(第二次免疫后21天)。
图19：小鼠研究：细胞介导的免疫-用两种不同剂量的gB肽的合并物再刺激后的CMV特异性CD8+细胞(第二次免疫后21天)。
图20：在小鼠中用含有佐剂的RTS，S疫苗免疫后抗子孢子蛋白CSP的几何平均抗体滴度(GMT)，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图21：在小鼠中用含有佐剂的RTS，S疫苗免疫后抗乙型肝炎表面抗原(HBs)的几何平均抗体滴度(GMT)，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图22：用含有佐剂的RTS，S免疫原性组合物免疫后，CSP特异性CD4和CD8T细胞的IL-2和/或IFNγ离体表达，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图23：用含有佐剂的RTS,S免疫原性组合物免疫后，HBs特异性CD4和CD8T细胞的IL-2和/或IFNγ离体表达，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图24：用含有佐剂的三价分裂流感疫苗(A/新喀里多尼亚，A/怀俄明，B/江苏)免疫后小鼠中的体液应答，两种不同浓度的免疫刺激剂。
图25：用含有佐剂的三价流感疫苗(A/新喀里多尼亚，A/怀俄明，B/江苏)免疫后小鼠中的细胞介导的免疫应答，两种不同浓度的免疫刺激剂。
图26：小鼠中比较以AS01B或AS01E为佐剂的VZV gE疫苗的临床前结果。
图27：用流感病毒抗原初免和攻击后的鼻洗液病毒滴度-在雪貂中用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。
图28：用流感抗原初免和攻击后在雪貂中监测体温。用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。
图29：用流感抗原制剂免疫和攻击后三价疫苗制剂中A株的抗HI滴度。用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。
图30：用流感抗原制剂免疫和攻击后用于攻击的B/江苏和漂移株的抗HI滴度，用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。
具体实施方式
本发明人发现，包含以脂质体形式存在的皂苷和脂多糖的佐剂组合物(其中每种免疫刺激剂以30μg或低于30μg/人类剂量的水平存在)可以改进对抗原性制剂的免疫应答，而同时比一些现有技术的制剂具有更低的反应原性，在所述现有技术制剂中，免疫刺激剂以每个人类剂量更高水平存在。
本发明人进一步发现，包含流感病毒或其抗原性制剂以及佐剂(包含以脂质体形式存在的皂苷)并且任选额外包含脂质A衍生物如3D-MPL的流感制剂与用不含佐剂的病毒或其抗原性制剂获得的制剂相比，能够改进抗所述抗原或抗原性组合物的CD4T-细胞免疫应答。以脂质体形式的皂苷作为佐剂的制剂有利地用于诱导能够检测II类MHC分子呈递的流感病毒表位。本申请人发现，其有效靶定细胞介导的免疫系统，以便(在接种和感染后)增加针对同源和漂移流感病毒株的反应性。
本发明的一种特定实施方案是，用于本发明的组合物在再次接种后能够在人类中提供更好的抗流感的血清保护作用，这是通过满足流感相关保护作用的人类受试者数目评估的。此外，另一特定实施方案是与不含佐剂的组合物相比，用于本发明的组合物在首次接种人类受试者后也能够诱导更高的B细胞记忆应答，并且在再次接种后能够诱导更高的体液应答。
本发明的含有佐剂的组合物具有一些优点：
1)改进的免疫原性：它们使得能够在老年人(超过50岁，典型地超过65岁)中的弱免疫应答恢复到年轻人中观察到的水平(抗体和/或T细胞应答)；
2)改进的交叉保护谱：增加的抗变异(漂移)流感病毒株的交叉保护作用；
3)它们也允许用减少的抗原剂量来得到相似的应答，从而确保在紧急情况(例如大流行)时增加的能力。
在本发明的另一方面，发明人发现，本文定义的佐剂组合物证明了抗体产生和接种后流感特异性CD4频率的免疫原性结果等于或有时大于用不含佐剂的疫苗产生的结果。这种作用在老年群体中特别有价值，并且可以用本文定义的含有较低剂量免疫刺激剂的佐剂实现。此外，反应原性症状显示以下趋势：在接受以最高浓度的免疫刺激剂为佐剂的疫苗的组中比接受以较低浓度免疫刺激剂为佐剂的疫苗的组中更高。
这些发现可以适用于其它形式的相同抗原和其它抗原。
皂苷佐剂
本发明的佐剂组合物包含以脂质体形式存在的皂苷佐剂。
特别适用于本发明的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是一种从南美洲的树木-南美皂皮树分离的皂苷制剂，并且在1974年由Dalsgaard等人首先描述(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamteVirusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP0362278)，所述片段例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)。QS-21是一种来源于南美皂皮树的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+毒性T细胞(CTLs)、Thl细胞和占优势的IgG2a抗体应答，并且是本发明的优选皂苷。
在本发明的一种合适的形式中，免疫原性组合物中的皂苷佐剂是南美皂皮树Quil A的衍生物，优选是Quil A的免疫活性级分，例如QS-17或QS-21，合适地是QS-21。在一种实施方案中，本发明的组合物含有基本纯的形式的免疫活性皂苷级分。优选地，本发明的组合物含有基本纯的形式的QS21，也就是说，QS21是至少90％纯的，例如，至少95％纯或至少98％纯。
在一种特定实施方案中，QS21是在其反应原性较低的组合物中提供的，其中用外源甾醇，例如胆固醇对其进行猝灭。存在一些特定形式的反应原性较低的组合物，其中用外源胆固醇猝灭QS21。在一种特定实施方案中，皂苷/甾醇是脂质体结构的形式(wO96/33739，实施例1)。在该实施方案中，脂质体合适地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下合适地是非晶体，所述磷脂酰胆碱例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱。脂质体也可以含有带电脂质，其增加用于饱和脂质组成的脂质体的脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电脂质的量合适地是1-20％w/w，优选5-10％。甾醇与磷脂的比例是1-50％(mol/mol)，合适地是20-25％。
合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化甾醇和胆固醇。在一种特定实施方案中，佐剂组合物包含胆固醇作为甾醇。这些甾醇是本领域已知的，例如，胆固醇在Merck Index，第11版，第341页中描述为动物脂肪中存在的天然甾醇。
本发明的包含QS21和甾醇，特别是胆固醇的佐剂组合物，与不存在甾醇的组合物相比，显示出减少的反应原性，同时保持佐剂作用。可以根据WO96/33739中公开的方法评估反应原性研究。本发明的甾醇表示外源甾醇，即，并非是抗原性制剂所来源的生物体内源的甾醇，而是加入到抗原制剂中或随后在配制时加入的。典型地，通过利用例如甾醇猝灭形式的皂苷，可以在随后用皂苷佐剂配制抗原制剂过程中加入甾醇。合适地，如WO96/33739中的描述，外源甾醇与皂苷佐剂缔合。
当活性皂苷级分是QS21时，QS21：甾醇的比例典型地将是1∶100-1∶1(w/w)的数量级，合适地是1∶10-1∶1(w/w)，优选是1∶5-1∶1(w/w)。存在合适过量的甾醇，QS21：甾醇的比例是至少1∶2(w/w)。在一种实施方案中，QS21：甾醇的比例是1∶5(w/w)。甾醇合适地是胆固醇。
其它有用的皂苷来源于植物-欧洲七叶树或Gyophilla struthium。描述于文献中的其它皂苷包括七叶素，其描述于Merck index(12版：条目3737)，其是存在于七叶树(拉丁文是Aesculus hippocastanum)的种子中的皂苷混合物。描述其分离是通过色谱和纯化(Fiedler，Arzneimittel-Forsch.4，213(1953))，以及通过离子交换树脂(Erbring等，US3,238,190)。已经纯化了七叶素的级分，并且显示是生物活性的(Yoshikawa M等，(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996Aug；44(8)：1454-1464))。已经针对例如ISCOM生产，描述了来自Gypsophilla struthium的Sapoalbin(R.Vochten等，，1968，J.Pharm.Belg.，42，213-226)。
本发明的关键方面是以下事实：免疫活性皂苷，优选QS21，可以以比以前认为有用的量更低的量使用，合适地是低于30μg，例如1-30μg/人类剂量的免疫原性组合物。
因此，本发明提供了人类剂量的免疫原性组合物，其中包含免疫活性皂苷，优选QS21，其水平是30μg或更低，例如1-30μg。
在一种实施方案中，免疫原性组合物的体积适于人类剂量，所述人类剂量的免疫组合物包含QS21，其水平是大约25μg，例如20-30μg，合适地是21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或25μg。在另一实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含QS21，其水平是大约10μg，例如5-15μg，合适地是6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或10μg。
在进一步的实施方案中，人类剂量的免疫组合物包含QS21，其水平是大约5μg，例如1-9μg，或2-8μg，或合适地是3-7μg或4-6μg，或5μg。
QS21的合适量是例如以下任一量：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，μg(w/v)/人类剂量的免疫原性组合物。
术语“人类剂量”表示具有适于人类使用的体积的剂量。通常是0.3-1.5ml。在一种实施方案中，人类剂量是0.5ml。在进一步的实施方案中，人类剂量是高于0.5ml，例如0.6，0.7，0.8，0.9或1ml。在进一步的实施方案中，人类剂量是1ml-1.5ml。本发明的特征在于每个人类剂量含有30μg或更少，例如1-30μg的QS21。
本发明进一步提供了包含30μg或更少，例如1-30μg的QS21的佐剂组合物。典型地，所述佐剂组合物将是人类剂量合适的体积。当佐剂是要与液体形式的抗原组合物进行组合的液体形式时，佐剂组合物将是人类剂量合适的体积，其大约是人类剂量的目标终体积的大约一半，例如，对于0.7ml的目标人类剂量，其是360μl体积，对于0.5ml的目标人类剂量，其是250μl体积。当与抗原组合物组合时，佐剂组合物是稀释的，以提供最终人类剂量的疫苗。所述剂量的终体积当然根据佐剂组合物的初始体积和加入佐剂组合物中的抗原组合物的体积而改变。在一种替代的实施方案中，用液体佐剂重配冻干的抗原组合物。在该实施方案中，佐剂组合物的人类剂量合适的体积大约等于人类剂量的终体积。在含有冻干的抗原组合物的管形瓶中加入液体佐剂组合物。最终的人类剂量可以是0.5-1.5ml。在一种特定实施方案中，人类剂量是0.5ml。在该实施方案中，本发明的疫苗组合物将包含QS21，其水平是30μg或低于30μg，例如1-30μtg/0.5ml人类剂量。此外，在该实施方案中，本发明的佐剂组合物将包含QS21，其水平是30μg或低于30μg，例如1-30μtg/250μl佐剂组合物或/500μl佐剂组合物，这取决于佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。
特别地，当与流感抗原组合时，可以使用的QS21的量可以是例如1-100μg(w/v)/组合物剂量，优选是10-50μg(w/v)/组合物剂量。QS21的合适的量是例如以下任一量：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50μg(w/v)/组合物剂量。更优选地，QS21的量是25-75μg(w/v)/组合物剂量。通常，组合物剂量是约0.5ml-约1ml。典型的疫苗剂量是0.5ml，0.6ml，0.7ml，0.8ml，0.9ml或1ml。在一种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为50μg的QS21，或25μg/0.5ml疫苗剂量。在另一种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为35.7μg或71.4μg的QS21。特别地，0.5ml疫苗剂量体积包含25μg或50μg的QS21/剂量。
QS21的剂量合适地能够增强人类中对抗原的免疫应答。具体地，合适的QS21的量是相对于不含佐剂的组合物或相对于以另一QS21量为佐剂的组合物，改进组合物的免疫潜能同时仍然是反应原性谱能够接受的量。
3D-MPL佐剂
组合物进一步包含额外的佐剂，其是脂多糖，合适地是脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。
3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以MPL的名称出售，并且在文件中称作MPL或3D-MPL。参见例如美国专利Nos.4,436,727；4，877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。根据GB2220211A公开的方法可以生产3D-MPL。化学上，它是具有3、4、5或6个酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。优选地，本发明的组合物中采用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒度使得它能够通过0.22μm滤器进行灭菌过滤。所述制剂描述于WO94/21292中。
本发明的关键方面是以下事实：脂多糖，优选3D-MPL，可以以比以前认为有用的量更低的量使用，合适地30μg或更低的水平，例如1-30μg/人类剂量的免疫原性组合物。
因此，本发明提供了人类剂量的免疫原性组合物，其中包含脂多糖，优选3D-MPL，其水平是30μg或更低，例如1-30μg。
在一种实施方案中，人类剂量的免疫组合物包含3D-MPL，其水平是大约25μg，例如20-30μg，合适地是21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或25μg。
在另一实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含3D-MPL，其水平是大约10μg，例如5-15μg，合适地是6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或10μg。
在进一步的实施方案中，人类剂量的免疫组合物包含3D-MPL，其水平是大约5μg，例如1-9μg，或2-8μg，或合适地是3-7μg或4-6μg，或5μg。
3D-MPL的合适量是例如以下任一量：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，μg(w/v)/人类剂量的免疫原性组合物。
在一种实施方案中，人类剂量的体积是0.5ml。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物的体积是适于人类剂量的体积，所述体积是高于0.5ml，例如0.6，0.7，0.8，0.9或1ml。在进一步的实施方案中，人类剂量是1ml-1.5ml。本发明的特征在于每个人类剂量含有30μg或更少，例如1-30μg的3D-MPL。
本发明进一步提供了包含30μg或更少，例如1-30μg的3D-MPL的佐剂组合物。典型地，所述佐剂组合物将是人类剂量合适的体积。当佐剂是要与液体形式的抗原组合物进行组合的液体形式时，佐剂组合物将是人类剂量合适的体积，其大约是人类剂量的目标终体积的大约一半，例如，对于0.7ml的目标人类剂量，其是360μl体积，对于0.5ml的目标人类剂量，其是250μl体积。当与抗原组合物组合时，佐剂组合物是稀释的，以提供最终人类剂量的疫苗。所述剂量的终体积当然根据佐剂组合物的初始体积和加入佐剂组合物中的抗原组合物的体积而改变。在一种替代的实施方案中，用液体佐剂重配冻干的抗原组合物。在该实施方案中，佐剂组合物的人类剂量合适的体积大约等于人类剂量的终体积。在含有冻干的抗原组合物的管形瓶中加入液体佐剂组合物。最终的人类剂量可以是0.5-1.5ml。在一种特定实施方案中，人类剂量是0.5ml。在该实施方案中，本发明的疫苗组合物将包含3D-MPL，其水平是30μg或低于30μg，例如1-30μg/0.5ml人类剂量。此外，在该实施方案中，本发明的佐剂组合物将包含3D-MPL，其水平是30μg或低于30μg，例如1-30μg/250μl佐剂组合物或/500μl佐剂组合物，这取决于佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。
当免疫原性组合物含有流感病毒或其抗原性制剂时，包含脂质体形式的皂苷的佐剂组合物任选额外包含脂质A衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3D-MPL。在该实施方案中，可以使用的3D-MPL的量可以是例如1-100μg(w/v)/组合物剂量，优选是10-50μg(w/v)/组合物剂量。3D-MPL的合适的量是例如以下任一量：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50μg(w/v)/组合物剂量。更优选地，3D-MPL的量是25-75μg(w/v)/组合物剂量。通常，组合物剂量是约0.5ml-约1ml。典型的疫苗剂量是0.5ml，0.6ml，0.7ml，0.8ml，0.9ml或1ml。在一种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为50μg的3D-MPL，或25μg/0.5ml疫苗剂量。在另一种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为35.7μg或71.4μg的3D-MPL。特别地，0.5ml疫苗剂量体积包含25μg或50μg的3D-MPL/剂量。
3D-MPL的剂量合适地能够增强人类中对抗原的免疫应答。具体地，合适的3D-MPL的量是相对于不含佐剂的组合物或相对于以另一MPL量为佐剂的组合物，改进组合物的免疫潜能同时仍然是反应原性谱能够接受的量。
本发明的合适组合物是这样的：其中最初在没有MPL的条件下制备脂质体(如WO96/33739中的描述)，然后加入MPL，合适地作为小于100nm的小颗粒或容易通过0.22μm膜进行灭菌过滤的颗粒。因此，MPL不包含在囊泡膜中(称作MPL在外)。MPL包含在囊泡膜内(称作MPL在内)的组合物也形成本发明的一方面。抗原可以包含在囊泡膜内或包含在囊泡膜外。合适地，可溶性抗原在外，疏水或脂化抗原包含在膜内或膜外。
在一种实施方案中，本发明的佐剂组合物包含脂多糖和免疫活性皂苷这两者。在本发明的一种特定实施方案中，脂多糖是3D-MPL，并且免疫活性皂苷是QS21。在本发明的进一步的实施方案中，佐剂组合物基本由脂多糖和脂质体制剂中的免疫活性皂苷组成。合适地，在这种实施方案的一种形式中，佐剂组合物基本由3D-MPL和QS21组成，任选含有甾醇，其优选是胆固醇。
在本发明的进一步的实施方案中，佐剂组合物在脂质体制剂中包含脂多糖和免疫活性皂苷，它们与一种或多种其它的免疫刺激剂或佐剂组合。合适地，在这种实施方案的一种形式中，脂多糖是3D-MPL，并且免疫活性皂苷是QS21。
在一种特定实施方案中，QS21和3D-MPL以相同终浓度/人类剂量的免疫组合物存在。在该实施方案的一个方面，人类剂量的免疫原性组合物包含最终水平为25μg的3D-MP和25μg的QS21。在进一步的实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含最终水平为10μg的MPL和10μg的QS21。在进一步的实施方案中，提供了体积为250μl的佐剂组合物，其中包含水平为25μg的MPL和25μg的QS21，或MPL和QS21各10μg。
可以与本发明的佐剂组合物一起使用的抗原包括病毒、寄生虫、细菌或肿瘤相关抗原，例如：
按照本发明使用的流感病毒或其抗原性制剂可为分裂流感病毒或其分裂病毒抗原性制剂。在一个替代性实施方案中，流感病毒制剂可包含另一类型的灭活流感抗原，例如灭活的全病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)，或流感病毒体。在再另一个实施方案中，流感病毒可为减毒活流感病毒制剂。
合适地，按照本发明使用的分裂流感病毒或其分裂病毒抗原性制剂为灭活病毒制剂，其中病毒颗粒用溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏。合适地，分裂病毒或其分裂病毒抗原性制剂如下制备：用溶解浓度的有机溶剂或去污剂使感染性或灭活的完整流感病毒片段化，随后去除全部或大部分溶解剂和某些或大部分病毒脂质物质。所述其分裂病毒抗原性制剂是指相比于分裂病毒可能已经受了一定程度的纯化而保留了分裂病毒组分的大部分抗原特性的分裂病毒制剂。例如，当在卵中产生时，可以从分裂病毒去除了卵污染蛋白，或者在细胞培养物中产生时，可以从分裂病毒去除了宿主细胞杂质。分裂病毒抗原性制剂可包含一种以上病毒株的分裂病毒抗原性组分。含分裂病毒的疫苗(叫做‘分裂流感疫苗’)或含分裂病毒抗原性制剂的疫苗一般包含残余的基质蛋白和核蛋白，有时包含脂质以及膜包膜蛋白。这种分裂病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒结构蛋白，但不一定和它们在全病毒中存在的比例相同。
或者，流感病毒可为全病毒疫苗形式。对于大流行情况来说，其可表现出超过分裂病毒疫苗的优势，因为其避免了有关针对新流感病毒株是否可成功地产生分裂病毒疫苗的不确定性。对于某些病毒株来说，用于生产分裂病毒的常规去污剂可损伤病毒，并使其无用。尽管经常有可能使用不同的去污剂和/或开发不同的分裂疫苗生产方法，但这会耗时，在大流行情况下可能不可用。全病毒法除了较大程度的确定性以外，还有比分裂病毒大的疫苗生产能力，因为在制备适宜的分裂疫苗必需的额外纯化步骤中有相当大量的抗原损失。
在另一个实施方案中，流感病毒制剂为纯化的亚单位流感疫苗形式。亚单位流感疫苗一般包含两种主要的包膜蛋白HA和NA，可能具有超过全病毒体疫苗的额外优势，因为它们一般无反应原性，尤其是在年轻的接种者中。亚单位疫苗可重组生产，或者可由破裂的病毒颗粒纯化。
在另一个实施方案中，流感病毒制剂为病毒体形式。病毒体是球形的单层囊泡，其保留了真实构象的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA，嵌入病毒体的磷脂双层膜中。
所述流感病毒或其抗原性制剂来源于卵或来源于细胞培养物。
例如，本发明的流感病毒抗原或其抗原性制剂可来源于常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的尿囊液。卵可在短时间内大量累积。或者，它们可来源于任一种使用细胞或细胞培养物的新生产方法，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基质包括例如狗肾细胞，例如MDCK或来自MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括Vero细胞，合适的猪细胞系，或适于生产疫苗用途的流感病毒的任意其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基质还包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如原代细胞，如鸡胚成纤维细胞，还包括禽细胞系。
流感病毒抗原或其抗原性制剂可通过众多工业用方法中的任一种生产，例如在专利号DD300833和DD211444(引入本文作为参考)中描述的分裂流感病毒法。分裂流感病毒传统上使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚与TweenTM的组合(称作“Tween-醚”分裂)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它分裂剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆盐，例如在专利号DD155875(引入本文作为参考)中描述的脱氧胆酸钠。可用作分裂剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)；其它离子去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子去污剂，如上述的一种，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals28，95-103描述的方法中)和Triton N-101；或者任何两种或多种去污剂的组合。
分裂疫苗的制备方法可包括众多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交换)步骤，以及任选的例如采用热、甲醛或β-丙醇酸内酯或紫外线的灭活步骤，其可在分裂前或后进行。分裂过程可以分批、连续或半连续过程进行。用于分裂免疫原性组合物的优选分裂和纯化方法描述于WO02/097072。
本发明的优选分裂流感疫苗抗原制剂包含生产过程剩余的残余量的Tween80和/或Triton X-100，但这些物质可在分裂抗原制备后加入或调整其浓度。优选地，Tween80和Triton X-100都存在。疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为：
Tween80：0.01-1％，更优选为约0.1％(体积/体积)
Triton X-100：0.001-0.1％(重量/体积)，更优选为0.005-0.02％(重量/体积)。
在一个特定实施方案中，Tween80的终浓度在0.045％-0.09％(重量/体积)的范围内。在另一个特定实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Tween80浓度在0.045％-0.2％(重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。
在另一个特定实施方案中，Triton X-100的终浓度在0.005％-0.017％(重量/体积)的范围内。在另一个特定实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Triton X-100浓度在0.005％-0.034％(重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。
优选地，流感病毒制剂在低水平硫柳汞存在下制备，或优选地在没有硫柳汞的情况下制备。优选地，获得的流感制剂在没有有机汞防腐剂的情况下是稳定的，具体地说，所述制剂不含残余硫柳汞。具体地说，流感病毒制剂包含在没有硫柳汞的情况下或在低水平硫柳汞(一般来说为5μg/ml或以下)的情况下稳定的血细胞凝集素抗原。具体地说，乙型流感毒株的稳定利用α生育酚衍生物如α生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯，即VES)来实施。这种制剂及其制备方法公开于WO02/097072。
优选的组合物含3种灭活的分裂病毒体抗原，它们由WHO推荐的适宜流感季的病毒株制备。
优选地，流感病毒或其抗原性制剂和本发明的佐剂包含在同一容器中。这被称为‘单管形瓶法’。优选地，所述管形瓶为预填充注射器。在一个替代实施方案中，流感病毒或其抗原性制剂和本发明的佐剂包含在分开的容器或管形瓶中，并在给予受试者之前不久或给予受试者时混合。这被称为‘双管形瓶法’。作为实例，当疫苗为0.7ml总剂量体积的2组分疫苗时，浓缩抗原(例如浓缩三价灭活分裂病毒体抗原)存在于1个管形瓶(335μl)(抗原容器)中，预填充注射器含佐剂(360μl)(佐剂容器)。在注射时，使用含佐剂的注射器将含浓缩的三价灭活分裂病毒体抗原的管形瓶中的内容物由管形瓶中取出，接着轻柔混合注射器。在注射前，使用的针头用肌内针头替换，体积调整到530μl。在该实例中，一个剂量的重配的含有佐剂的流感疫苗候选物相当于530μl。
根据本发明，在本文定义的多价免疫原性组合物中的至少一种流感病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。这种病毒株在下文还可称为‘大流行株’。具体地说，当疫苗为多价疫苗如二价或三价或四价疫苗时，至少一种病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。适宜的病毒株是但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。
所述流感病毒或其抗原性制剂合适地为多价的，例如二价或三价或四价。优选地，流感病毒或其抗原性制剂为三价的或四价的，具有得自3种不同流感株的抗原，至少一种病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。
给予流感病毒株引起大流行爆发潜力的流感病毒株特征是：与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的乃至整个群体以前都没有遇到抗原，在免疫学上对抗原是原初态的。
一般来说，在大流行环境下，某些群体被流感感染的风险增加。老年人、慢性疾病患者和小孩尤其易感，但许多年轻人和表面上健康的人也有风险。对于H2流感，1968年后出生的部分群体承受的风险增加。对这些群体重要的是尽快地和以简单的方式有效地被保护。
承受增加的风险的另一个人群是旅行者。今天，人们比以往任何时候都更常旅行，出现最多新病毒的地区中国和东南亚在近些年已成为受欢迎的旅行目的地。旅游模式的这种改变能使新病毒在约数周内而不是数月或数年内到达全球。
因此，对于这些人群来说，在大流行情况下或潜在大流行的情况下特别需要接种保护来对抗流感。适宜的病毒株是但不限于：HSNl、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。
任选地，所述组合物可包含3价以上，例如3种非大流行毒株加一种大流行毒株。或者，所述组合物可包含3种大流行毒株。优选地，所述组合物包含3种大流行毒株。
用于本发明的免疫原性组合物的抗原的另一实例是链球菌抗原，例如来自A族链球菌或B族链球菌，但最优选来自肺炎链球菌。最优选使用至少一种蛋白和/或至少一种糖抗原。至少一种肺炎链球菌蛋白抗原最优选选自：肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜缺失变体、PspC或其跨膜缺失变体、PsaA或其跨膜缺失变体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、CbpA或其跨膜缺失变体、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp133，或其免疫功能等同物(例如，上述蛋白的结构域的融合体，例如WO01/98334和WO03/54007中描述的PhtDE融合体)。
某些组合物描述于WO00/56359和WO02/22167和WO02/22168(在此引入作为参考)。
所述抗原可包含荚膜糖类抗原(优选缀合至载体蛋白)，其中所述糖类(最优选多糖)来源于至少四种肺炎球菌血清型。优选地，所述四种血清型包括6B、14、19F和23F。在进一步的实施方案中，所述组合物中包含至少7种血清型，例如来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些。在进一步的实施方案中，所述组合物中包含至少10种血清型，例如在一个实施方案中，所述组合物包含来源于血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖类(优选缀合至载体蛋白)。在另一实施方案中，免疫原性组合物包含来源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖类(优选缀合至载体蛋白)。在本发明的一种优选实施方案中，包括至少13种糖类抗原(优选缀合至载体蛋白)，但本发明还包括另外的糖类抗原，例如23价体(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。
尽管上述糖类有利地为其全长天然多糖形式，但应该理解，如果在偶联至蛋白载体时有需要，那么也可以使用大小减少但仍然具备免疫原性的多糖(参见例如EP497524和497525)。
为了预防/缓解老年(55岁以上)群体的肺炎和婴儿(最大至18个月)以及幼儿(通常是18个月到5岁)的中耳炎，本发明的优选实施方案将本文描述的多价肺炎链球菌糖类与优选选自以上列出蛋白的肺炎链球菌蛋白组合在一起。肺炎链球菌蛋白的组合还可有利地如下文所述使用。
肺炎球菌蛋白
肺炎链球菌抗原优选选自：来自多组氨酸三联体家族(Pht)的蛋白、来自Lyt家族的蛋白、胆碱结合蛋白、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸)、具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任意氨基酸)和具有I型信号序列基序的蛋白。这些种类(或基序)中的优选实例是以下蛋白(或其截短物或免疫功能等同物)：
Pht(聚组氨酸三联体)家族包含蛋白phtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征：脂化序列、由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域(可能涉及金属或核苷结合或酶活性)、(3-5)卷曲螺旋区、保守的N末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎球菌菌株中。同源蛋白还可见于其它链球菌和奈瑟氏球菌。该家族优选的成员包括PhtA、PhtB和PhtD。更优选地，其包括PhtA或PhtD。但是，要理解的是，术语PhtA、B、D和E指具有在下文引用文献中公开的序列的蛋白，以及其具有序列同源性的天然(和人工制备的)变体，所述变体与参比蛋白至少90％相同。优选地，至少95％相同，最优选97％相同。
对于Pht蛋白而言，PhtA公开于WO98/18930，还可称作Sp36。如上所述，其是一种多组氨酸三联体家族的蛋白，且具有II型信号基序LXXC。
PhtD公开于WO00/37105，也可称作Sp036D。如上所述，它也是多组氨酸三联体家族的一种蛋白，也具有II型LXXC信号基序。PhtB公开于WO00/37105，也称作Sp036B。PhtB家族的另一成员是降解C3的多肽，公开于WO00/17370。该蛋白也来自多组氨酸三联体家族，也具有II型LXXC信号基序。优选的免疫功能等同物是公开于WO98/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79kD)公开于WO99/15675，它也被认为是PhtX家族成员。
PhtE公开于WO00/30299，称作BVH-3。
SpsA是胆碱结合蛋白(Cbp)，公开于WO98/39450。
Lyt家族是膜结合蛋白，与细胞裂解有关。N末端结构域包含胆碱结合结构域，但Lyt家族不具有以下所示的见于胆碱结合蛋白家族(Cbp)的所有特征，因此，对本发明而言，Lyt家族被认为不同于Cbp家族。与Cbp家族相反，C末端结构域包含Lyt蛋白家族的催化结构域。该家族包括LytA、B和C。对于Lyt家族而言，LytA公开于Ronda等，Eur JBiochem，164：621-624(1987)。LytB公开于WO98/18930，也称作Sp46。LytC也公开于WO98/18930，也称作Sp91。该家族的优选成员是LytC。
另一个优选实施方案是Lyt家族(具体地说是LytA)截短物，其中“Lyt”如上定义，“截短物”指缺失胆碱结合区的50％或更多的蛋白。优选地，这类蛋白缺失整个胆碱结合区。
Sp125是具有细胞壁锚定基序LPXTG(其中X是任意氨基酸)的肺炎球菌表面抗原的实例。业已发现，在该类具有此基序的肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白在本发明范围内都是有用的，因此被看作是本发明的又一种蛋白。Sp125自身公开于WO98/18930，也称为ZmpB一锌金属蛋白酶。
Sp101公开于WO98/06734(其中，其具有参考号#y85993)。其特征还在于I型信号序列。
Sp133公开于WO98/06734(其中，其具有参考号#y85992)。其特征还在于I型信号序列。
Sp128和Sp130公开于WO00/765400。
本发明所使用的蛋白优选选自：PhtD、PhtA和PhtE，或者是这些蛋白中的2种或全部3种的组合(即PhtA+D、A+E、D+E或A+D+E)。
可包括的其它肺炎球菌蛋白抗原为来自以下的一种或多种：肺炎球菌溶血素(也称为Ply；优选通过化学处理或突变而去毒)[WO96/05859，WO90/06951，WO99/03884]、PsaA及其跨膜缺失变体(Berry和Paton，Infect Immun1996年12月；64(12)：5255-62)、PspA及其跨膜缺失变体(US5804193、WO92/14488、WO99/53940)、PspC及其跨膜缺失变体(WO97/09994、WO99/53940)、胆碱结合蛋白(Cbp)家族成员[例如CbpA及其跨膜缺失变体(WO97/41151；WO99/51266)]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect，Immun.199664：3544)、HSP70(WO96/40928)、PcpA(Sanchez-Beato等，FEMS Microbiol Lett1998，164：207-14)、M样蛋白(SB专利申请号EP0837130)和粘附素18627(SB专利申请号EP0834568)。本发明还包含这种蛋白的免疫功能等同物或截短物(如上定义)。
关于胆碱结合蛋白家族，该家族的成员最初被鉴定为可通过胆碱亲和层析纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合型脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。在结构上，它们有数个在整个家族中共有的区域，但这些蛋白的确切特性(氨基酸序列，长度等)可变。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)，这些区域由多个重复序列组成，占该蛋白的约一半。正如本申请中所用的，术语“胆碱结合蛋白家族(Cbp)”选自在WO97/41151中鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO97/41151。CbpD和CbpG公开于WO00/29434。PspC公开于WO97/09994。PbcA公开于WO98/21337。优选地，胆碱结合蛋白选自：CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
如果Cbp是所用的另一种蛋白，那么它可以是Cbp截短物，其中“Cbp”如上定义，“截短物”指缺失胆碱结合区(C)的50％或更多的蛋白。优选这类蛋白缺失整个胆碱结合区。更优选地，这类蛋白截短物缺失(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白的N末端一半的一部分，但仍保留至少一个重复区(R1或R2)。再更优选地，所述截短物具有2个重复区(R1和R2)。这类优选实施方案的实例是描述于WO99/51266或WO99/51188的NR1xR2、R1xR2、NR1xR2P和R1xR2P，但缺失类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白也包括在本发明的范围内。
Cbp截短物-Lyt截短物嵌合蛋白(或融合体)也可用于本发明的组合物。优选地，其包括Cbp的NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)和Lyt的C末端区(Cterm，即缺失胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更优选地，Cbp选自CbpA、PbcA、SpsA或PspC。再更优选地，其是CbpA。优选地，Lyt是LytC(也可称作Sp91)。
也可应用缺失了胆碱结合域(C)并表达为与Lyt的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。优选地，Lyt是LytC。
在一种肺炎球菌组合物中，可能组合本发明的不同肺炎球菌蛋白。优选本发明的蛋白组合选自2种或多种(3或4种)不同种类，如具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如多组氨酸三联体家族(Pht))、胆碱结合蛋白家族(Cbp)、具有I型信号序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸，例如Sp128、Sp130)、毒素(例如Ply)等等。在这些种类(或基序)中的优选实例是以上所提到的蛋白或其免疫功能等同物。毒素+Pht、毒素+Cbp、Pht+Cbp和毒素+Pht+Cbp是优选的种类组合。
优选的有益组合包括但不限于PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NR1xR2P+PspA、NR1xR2+PspA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、R1xR2+PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。优选地，NR1xR2(或R1xR2)来自CbpA或PspC。更优选它来自CbpA。
特别优选的肺炎球菌蛋白组合包括Ply(或其截短物或免疫功能等同物)+PhtD(或其截短物或免疫功能等同物)以及任选包括NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)。优选地，NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)来自CbpA或PspC。更优选它来自CbpA。
所述抗原可为含多糖抗原的肺炎球菌糖类缀合物，所述多糖抗原来自至少4种血清型，优选至少7种血清型，更优选至少10种血清型，包括至少一种但优选2、3或4种优选选自上述蛋白组的肺炎链球菌蛋白。优选所述蛋白中的一种蛋白是PhtD(或其免疫功能等同物)和/或Ply(或其免疫功能等同物)。
与多糖接种方法有关的问题是多糖本身为弱免疫原这一事实。为克服此问题，可将多糖与蛋白载体缀合，所述载体可提供旁观T细胞辅助作用。因此，优选本发明所用的糖类连接至这种蛋白载体。目前常用于产生糖类免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC以及结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。
基于肺炎球菌糖类的免疫原性组合物(或疫苗)的优选载体是来自流感嗜血杆菌的D蛋白(EP594610-B)或其片段。适合使用的片段包括含T辅助表位的片段。具体地说，D蛋白片段优选包含所述蛋白的N末端1/3。D蛋白载体可作为载体用在其中缀合了多种肺炎球菌糖类抗原的组合物中。组合中的一种或多种肺炎球菌糖类可有利地缀合到D蛋白上。
用于肺炎球菌糖类的另一种优选载体是肺炎球菌蛋白本身(如上在“本发明的肺炎球菌蛋白”章节中定义)。
所述糖类可通过任何已知方法(例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757的方法)与载体蛋白连接。优选地，可进行CDAP缀合(WO95/08348)。
优选地，所述缀合物的蛋白∶糖类(重量∶重量)比例是0.3∶1到1∶1，更优选0.6∶1到0.8∶1，最优选约0.7∶1。
本发明的特别优选的组合物包含一种或多种缀合的肺炎球菌糖类，以及本发明的一种或多种肺炎球菌蛋白。另外，肺炎球菌糖类和蛋白可作为吸附在磷酸铝上的原液组分以液体形式稳定储存。
在本发明的另一方面，疫苗组合物可以包含人巨细胞病毒(HCMV)抗原。HCMV是一种属于疱疹病毒家族的人DNA病毒，并且是新生儿先天缺陷的主要原因，并且也导致免疫受损患者的严重医学状况。临床疾病导致多种症状，包括发热、肝炎、肺炎和传染性单核细胞增多症。
在一种实施方案中，HCMV抗原是嵌合融合蛋白或其免疫原性衍生物，其包含与HSV糖蛋白的一部分融合的HCMV糖蛋白的一部分。HCMV糖蛋白典型地是gB，并且HSV糖蛋白典型地是gD，特别是HSV2型gD(gD2)。融合体典型地位于HCMV gB蛋白的一部分的N末端部分的氨基酸与HCMV gD蛋白的一部分的C末端的氨基酸之间。融合蛋白的HCMV gB蛋白和HSV gD蛋白组分都可以缺乏膜锚区。
HCMV gB蛋白的部分可以包含HCMV gB的不可切割形式。合适地，这是通过改变位于蛋白的切割位点的一个或多个氨基酸，例如通过分别将Arg458和Arg459分别交换为Glu和Thr而实现的。HSV蛋白的部分可以包含gD2的信号序列(氨基酸1-25)，并且任选包含gD2的氨基酸26-52，和/或来自gD2的序列PEDSALLEDPED或其功能等同物，其可以更短或更长。来自HSV gD的其它序列可以加入融合蛋白，例如HCMV gB蛋白的C末端。
在一种实施方案中，融合蛋白包含与HCMV gB蛋白的残基28-685融合的HSV gD2蛋白的氨基酸1-52。所述融合蛋白称作HCMVgB685*。在进一步的实施方案中，来源于内部gD2序列的氨基酸序列PEDSALLEDPED可以包括在蛋白HCMV gB685*的C末端，以产生命名为HCMV gB685**的蛋白。这些特定融合蛋白更详细描述于WO95/31555。
适于用作HCMV疫苗的另一种免疫原是pp65，它是一种描述于WO94/00150(City ofHope)的HCMV基质。
在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含来源于认为与生殖器疣有关的人乳头瘤病毒(HPV)(HPV6或HPV11以及其它HPV病毒)和/或与宫颈癌有关的HPV病毒(HPV16、HPV18以及其它HPV病毒)的抗原。
在一种实施方案中，生殖器疣预防或治疗组合物的形式包含L1颗粒或病毒壳粒和融合蛋白，该融合蛋白包含一种或多种选自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1和L2的抗原。
在一种实施方案中，融合蛋白的形式为：WO96/26277公开的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)公开的蛋白D(1/3)-E7。
优选HPV宫颈感染或宫颈癌的预防或治疗疫苗组合物可包含HPV16或18抗原。例如L1或L2抗原单体、或以病毒样颗粒(VLP)一起存在的L1或L2抗原或者以VLP或壳粒结构单独存在的L1蛋白。这类抗原、病毒样颗粒和病毒壳粒本身是已知的。参见例如wO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。
可包含其它单独或作为融合蛋白的早期蛋白，例如E7、E2或优选E5；这样特别优选的实施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。
在一种实施方案中，HPV16抗原包含与蛋白D载体融合的早期蛋白E6或E7，以形成蛋白D-HPV16的E6或E7融合体，或其组合；或者E6或E7与L2的组合(WO96/26277)。
或者，HPV16或18早期蛋白E6和E7可以以单个分子、优选蛋白D-E6/E7融合蛋白存在。这种组合物可任选包含HPV18的E6和E7之一或二者，优选为蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白形式。
本发明的组合物还可额外包含来自其它HPV类型、优选HPV31或33的抗原。
致癌HPV类型包括HPV31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。因此，除HPV16和/或PV18之外，本发明的组合物可以包含来自一种或多种所述HPV类型的抗原。
用于本发明的HPV L1VLPs或病毒壳粒可以包含全长L1或L1的免疫原性片段，或由全长L1或L1的免疫原性片段组成。当VLP或病毒壳粒包含L1的免疫原性片段或由L1的免疫原性片段组成时，HPVL1的合适免疫原性片段包括L1的截短、缺失、取代或插入突变体。合适地，所述免疫原性片段能够引起免疫应答，所述免疫应答能够识别L1蛋白，例如得到L1蛋白的HPV类型的病毒样颗粒。
合适的免疫原性L1片段包括截短的L1蛋白。一方面，截短除去了核定位信号。另一方面，截短是C末端截短。另一方面，C末端截短除去了少于50个氨基酸，如少于40个氨基酸。当L1来自HPV16时，则另一方面，C末端截短从HPV16L1除去了34个氨基酸。当L1来自HPV18时，则另一方面，C末端截短从HPV18L1除去了35个氨基酸。
合适的截短的HPV16和18L1序列公开于WO06/114312。
HPV16序列也可以为公开于W09405792或US6649167中的那些，例如，合适地被截短。合适的截短为在上述序列的等同位置截短，如通过序列比较来评价。
另一种HPV18序列在W09629413中公开，其可合适地被截短。合适的截短为在上述序列的等同位置截短，如通过序列比较来评价。
其它的HPV16和HPV18序列是本领域已知的，可适用于本发明。
当存在来自另一种HPV类型的L1蛋白时，则可以使用相应于对HPV16和HPV18进行的C末端截短的那些截短，这是基于DNA或蛋白序列比对。HPV31和45L1蛋白的合适截短公开于WO06/114312。
例如，也可以进行HPV31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68的合适的截短，在一方面，除去与上文描述的那些等同的L1蛋白C末端部分，如通过序列比对所评价的。
本发明的L1蛋白或其免疫原性片段可以任选是融合蛋白形式，例如L1蛋白与L2或早期蛋白的融合体。
HPVL1蛋白合适地是病毒壳粒或病毒样颗粒(VLP)的形式。一方面，HPV VLPs可以用于本发明。HPV VLPs和生产VLPs的方法是本领域公知的。VLPs典型地是从病毒的L1结构蛋白，任选从L2结构蛋白构建的，参见例如WO9420137，US5985610，W09611272，US6599508B1，US6361778B1，EP595935。任何合适的HPV VLP都可以用于本发明，其提供交叉保护，如L1或L1+L2VLP。
合适地，VLP是仅仅含有L1的VLP。
本发明的组合物可以含有HPV16L1VLPs和HPV18L1VLPs的组合，或来自HPV16，18，31和45的HPVL1VLPs的组合，或更大的组合，并且包括HPV16和18或HPV16，18，31和45L1VLPs，或更大的组合，其中L1按照上文的描述任选截短。
在本发明的特定实施方案中，一种或多种来自致癌HPV类型的额外抗原与HPV16和/或18抗原一起使用，所述抗原选自以下HPV类型：HPV31，45，33，58和52。如本文的描述，每种情况下抗原可以是L1，例如L1VLPs或病毒壳粒形式。因此，用于本文描述的组合物、方法和用途中的HPV抗原可以包含来自HPV16，18，31，45，33，58和52的L1VLPs或病毒壳粒或由所述VLPs或病毒壳粒组成。L1VLPs可以是仅仅含L1的VLPs，或与另一种抗原如L2在L1+L2VLPs中组合。L1蛋白可以合适地按照本文的描述截短。
可以通过标准技术，例如电子显微术和动态激光散射来评估VLP制剂。
VLP可以包含全长L1蛋白。一方面，用于形成VLP的L1蛋白是上文描述的截短的L1蛋白。
可以在任何合适的细胞基质，如酵母细胞或昆虫细胞，如在杆状病毒表达系统中制备VLPs，并且，用于制备VLPs的技术是本领域公知的，如WO9913056，US6416945B1，US6261765B1和US6245568及其中的参考文献，在此引入其完整内容作为参考。
可以通过解组装和重新组装技术来制备VLP，其可提供更稳定和/或更均质的乳头瘤病毒VLP。例如McCarthy等，1998″QuantitativeDisassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type11Virus likeParticles in Vitro″J.Virology72(1)：33-41，其中描述了从昆虫细胞纯化的重组L1HPV11VLP的解组装和重新组装以获得VLP的均质制剂。WO9913056和US6245568也描述了制备HPV VLP的解组装和重新组装方法。
一方面，本发明的HPV VLPs可如W09913056或US6245568中的描述制备。
本发明的组合物可以包含来自引起疟疾的寄生虫如恶性疟原虫或间日疟原虫的抗原或其抗原性制剂。例如，可能的来自恶性疟原虫的抗原包括子孢子蛋白(CS蛋白)、RTS，S MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1和TRAP。RTS是一种杂合蛋白，包含恶性疟原虫的子孢子(CS)蛋白的基本上所有C-末端部分，其通过乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸与乙型肝炎病毒的表面(S)抗原连接。它的完整结构在国际专利申请NO.PCT/EP92/02591中公开，所述专利申请的公开号是WO93/10152，要求英国专利申请No.9124390.7的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，当与来自HBV的S抗原共表达时，产生称为RTS，S的混合颗粒。TRAP抗原在以WO90/01496公开的国际专利申请NO.PCT/GB89/00895中公开。本发明的一种优选实施方案是疟疾疫苗，其中抗原性制剂包含RTS，S和TRAP抗原的组合。其他很可能作为多阶段疟疾疫苗的组分候选物的疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和它们在疟原虫物种中的类似物。本发明的一个实施方案是包含RTS，S或C蛋白或其片段，如RTS，S的CS部分的组合物，所述RTS，S或C蛋白或其片段与可以选自例如MSP1、MSP3、AMA1、LSA1或LSA3的一种或多种其它疟疾抗原组合。来自间日疟原虫的可能抗原包括子孢子蛋白(CS蛋白)和Duffy抗原结合蛋白及其片段，如PvRII(参见例如WO02/12292)。
可以用于本发明的免疫原性组合物的其它可能的抗原包括：
链球菌抗原，如来自A族链球菌或B族链球菌、合适地来源于以下病原体的抗原：HIV-1，(如F4抗原或其片段或gag或其片段，诸如p24、tat、nef、gp120或gp160或任何这些抗原的片段)；人类疱疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白，如来自HSV1或HSV2的ICP27；巨细胞病毒((尤其是人类)(如gB或其衍生物))；轮状病毒(包括减毒活病毒)；EB病毒(如gp350或其衍生物)；水痘-带状疱疹病毒(如gpI、II和IE63)；或来自肝炎病毒，如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或来自其它病毒病原体，如副粘病毒：呼吸道合胞体病毒(如F、N和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)、黄病毒(如黄热病毒、登革热病毒、蜱传播脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒(全活病毒或灭活病毒、在卵中或MDCK细胞中培养的分裂流感病毒或完整流感病毒体(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或其纯化蛋白或重组蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白或其组合)；或来源于细菌病原体，如奈瑟氏球菌(Neisseriaspp)，包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如荚膜糖类及其缀合物、运铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；化脓链球菌(S.pyogenes)(如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变异链球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌(Moraxella spp)，包括粘膜炎莫拉氏菌(M catarrhalis)，也称为粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵袭素)；博德特氏菌(Bordetella spp)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如百日咳外膜蛋白(pertactin)、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌(Mycobacteriumspp.)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团菌(Legionella spp)，包括侵肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp)，包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxic E.coli)(例如定居因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒素或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素或其衍生物)；弧菌(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺氏菌(Shigella spp)，包括索氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贫氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贫氏菌(S.flexnerii)；耶尔森氏菌(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲杆菌(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuna)(例如毒素、粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌(C.coli)；沙门氏菌(Salmonella spp)，包括伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；利斯特氏菌(Listeria spp)，包括单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺杆菌(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌(Staphylococcus spp)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌(Enterococcus spp)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、尿肠球菌(E.faecium)；梭菌(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤风毒素和其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B和其衍生物)；芽孢杆菌(Bacillus spp)，包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)；棒杆菌(Corynebacterium spp)，包括白喉棒杆菌(Cdiphtheriae)(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋体(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蜱疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希氏体(Ehrlichiaspp)，包括马埃里希氏体(E.equi)和人粒细胞埃里希氏体病(Ehrlichiosis)因子；立克次氏体(Rickettsia spp)，包括立氏立克次氏体(R.rickettsii)；衣原体(Chlamydia spp.)，包括砂眼衣原体(C trachomatis)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumomae)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体(Leptospira spp.)，包括问号钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体(Treponema spp.)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或来源于寄生物，如疟虫(plasmodium spp.)，包括恶性疟虫(P.falciparum)；弓形虫(Toxoplasmaspp.)，包括鼠弓形虫(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；内变形虫(Entamoeba spp.)，包括痢疾内变形虫(E.histolytica)；巴贝虫(Babesiaspp.)，包括果氏巴贝虫(B.microti)；锥虫(Trypanosoma spp.)，包括克香氏锥虫(T.cruzi)；贾第虫(Giardia spp.)，包括表吮贾第虫(G. lamblia)；利什曼虫(Leishmania spp.)，包括硕大利什曼虫(L.major)；肺囊虫(pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫(Trichomonasspp.)，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)；血吸虫(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸虫(S.mansoni)，或来源于酵母，如假丝酵母(Candida spp.)，包括白色假丝酵母(C.albicans)；隐球酵母(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球酵母(C.neoformans)。
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的其它优选特异性抗原是例如TbRa12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO99/51748)，Mtb72F和M72。结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白和其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个，优选三个多肽融合成一个更大的蛋白。优选的融合体包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO99/51748)。可以提到的特定Ra12-Tbh9-Ra35序列是WO2006/117240中定义为SEQ ID No6的序列以及其变体(其中该序列的Ser704突变为丝氨酸以外的氨基酸，如Ala)和衍生物，所述衍生物中掺入了合适长度的N末端His标记(如WO2006/117240的SEQ ID No2或4)。
衣原体如沙眼衣原体的示例性抗原选自CT858，CT089，CT875，MOMPCT622，PmpD，PmpG及其片段，SWIB和其任一免疫原性片段(如PmpDpd和PmpGpd)及其组合。抗原的优选组合包括CT858，CT089和CT875。可以采用的特定序列和组合描述于WO2006/104890。优选的细菌组合物包含源自嗜血菌(Haemophilus spp)的抗原，包括B型流感嗜血菌(例如PRP及其缀合物)、不可分型的流感嗜血菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、D蛋白和脂蛋白D，以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生的肽(US5,843,464)或多重拷贝变体或其融合蛋白。
乙型肝炎表面抗原的衍生物是本领域熟知的，且尤其包括，在欧洲专利申请EP-A-414374、EP-A-0304578和EP198-474中所列出的PreS1、PreS2S抗原。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1抗原、gp120，尤其是在CHO细胞中表达时。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含如上文所述的gD2t。
组合物还可包含抗肿瘤抗原，并用于癌症的免疫治疗性治疗。例如，所述抗原可为肿瘤排斥抗原，例如针对前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑素瘤的抗原。示例性的抗原包括MAGE1、MAGE3和MAGE4或例如公开于WO99/40188中的其它MAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(也称为NY Eos1)、SAGE和HAGE(WO99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions inImmunology8,628-636页；Van den Eynde等，International Journal ofClinical&Laboratory Research(1997年提交)；Correale等(1997)，Journalof the National Cancer Institute89，293页)。实际上，这些抗原在广泛的肿瘤类型中表达，如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。
用于本发明的MAGE抗原可与表达增强子或免疫融合配偶体一起作为融合蛋白表达。具体地说，Mage蛋白可融合至B型流感嗜血菌的D蛋白或其脂质化衍生物。具体地说，融合配偶体可包含D蛋白的前1/3。此结构公开于WO99/40188。
其它肿瘤特异性抗原包括但不限于KSA(GA733)肿瘤特异性神经节苷脂，例如GM2和GM3或其与运载蛋白的缀合物；或者所述抗原可以是自身肽激素，如全长促性腺激素释放激素(GnRH，WO95/20600)，其是10个氨基酸长的短肽，用于治疗许多癌症，或用于免疫去势。
在一个优选实施方案中，利用前列腺抗原，例如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS95(4)1735-17401998)、PSMA或称为Prostase的抗原。
Prostase是前列腺特异性丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶样)，254个氨基酸长，具有保守的丝氨酸蛋白酶催化三联体H-D-S和氨基末端前-肽原序列，显示潜在的分泌功能(P.Nelson，Lu Gan，C.Ferguson，P.Moss，R.Gelinas，L Hood&K.Wand，“Molecular cloning and characterisation ofprostase，an androgen-regulated serine protease with prostate restrictedexpression”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96,3114-3119)。已经描述了推定的糖基化位点。预测的结构非常类似于其它已知的丝氨酸蛋白酶，表明成熟多肽折叠成单个结构域。成熟蛋白为224个氨基酸长，具有一个显示被天然加工的A2表位。
Prostase核苷酸序列和推定的多肽序列和同源物公开于Ferguson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96,3114-3119)和国际专利申请号WO98/12302(以及相应的授权专利US5,955,306)、WO98/20117(以及相应的授权专利US5,840,871和US5,786,148)(前列腺特异性激肽释放酶)和WO00/04149(P703P)。本发明提供含基于Prostase蛋白及其片段和同源物(“衍生物”)的含Prostase蛋白融合体的组合物。这种衍生物适用于适合治疗前列腺肿瘤的治疗性疫苗制剂。典型地，所述片段将含如在以上引用的专利和专利申请中公开的至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸。
再优选的前列腺抗原称为P501S，即WO98/37814的序列标识号113。免疫原性片及其部分含如以上引用的专利申请中公开的至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸。参见例如PS108(WO98/50567)。
其它前列腺特异性抗原可从WO98/37418和WO/004149得知。另一个是STEAP(PNAS9614523145287-121999)。
在本发明范围中有用的其它肿瘤相关抗原包括：Plu-1(J Biol.Chem274(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等，Bioessays199，2161-70，美国专利5654140)、Criptin(美国专利5981215)。另外，与癌症治疗特别相关的抗原还包括酪氨酸酶和存活蛋白。
粘蛋白衍生的肽如Mucl参见例如US5744,144、US5827,666、WO8805054、US4,963,484。特别考虑的是Muc1衍生肽，其包含Muc1肽的至少一个重复单元，优选至少两个这种重复单元，其可被SM3抗体识别(US6054438)。其它粘蛋白衍生肽包括来自Muc5的肽。
本发明抗原可为乳癌抗原，如Her-2/Neu、乳腺珠蛋白(美国专利5668267)或在WO00/52165、WO99/33869、WO99/19479、WO98/45328中公开的抗原。Her2neu抗原特别地公开于美国专利5,801,005。优选地，Her2neu包含完整胞外结构域(包含大约氨基酸1-645)或其片段，以及大约C末端580个氨基酸的至少免疫原性部分或完整胞内结构域。具体地说，胞内部分应包含磷酸化结构域或其片段。这种构建体公开于WO00/44899。一种特别优选的构建体被称为ECD PD，第二种被称为ECD PD。参见WO00/44899。在此使用的Her-2neu可来源于大鼠、小鼠或人类。
所述组合物可包含与肿瘤支持机制(例如血管生成、肿瘤侵入)相关的抗原，例如tie2、VEGF。
可预见的是，本发明的组合物可使用来源于博氏疏螺旋体(Borreliasp.)的抗原。例如，抗原可包括核酸、病原体衍生的抗原或抗原制备物、重组生产的蛋白或肽以及嵌合融合蛋白。具体地说，所述抗原是OspA。OspA可为借助于宿主细胞(大肠杆菌)的脂质化形式的完整成熟蛋白，称为(Lipo-OspA)，或者可为非脂质化的衍生物。此非脂质化衍生物包括具有流感病毒非结构蛋白(NS1)的前81个N-末端氨基酸的非脂质化NS1-OspA融合蛋白、完整OspA蛋白以及另-个MDP-OspA，MDP-OspA是携带3个额外的N-末端氨基酸的OspA的非脂质化形式。
本发明的组合物可用于变态反应的预防或治疗。这种疫苗应包含变应原特异性抗原(例如Der p1)和变应原非特异性抗原(例如来源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP0477231B1))。
本发明的组合物还可用于变态反应、癌症或感染性疾病之外的慢性疾病的预防或治疗。这种慢性疾病是诸如动脉硬化和阿尔茨海默病的疾病。
本发明的组合物特别适合于诸如慢性病症和癌症的疾病的免疫治疗性治疗，而且适合于持续感染的治疗。因此，本发明的组合物特别适合于感染性疾病的免疫治疗，所述感染性疾病例如为结核病(TB)、AIDS和乙型肝炎(HepB)病毒感染。
另外，在AIDS背景下，提供一种治疗易感或患有AIDS的个体的方法。该方法包括给予所述个体本发明的疫苗，由此降低由随后的HIV感染引起的CD4+T细胞减少量，或者减慢或阻止已感染HIV的个体中的CD4+T-细胞减少。
除了上述肺炎球菌抗原以外(包括或不包括肺炎球菌抗原)，其它抗原包括细菌(优选荚膜)糖类。多糖抗原吸附到磷酸铝上，便利地储存于原液中-因此通过将所述原液与本发明的含油乳液即时混合直接产生本发明的疫苗组合物。优选地，所述其它细菌糖类选自：脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A荚膜糖类(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型C荚膜糖类(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型Y荚膜糖类(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型W-135荚膜糖类(MenW)、B族链球菌I组荚膜糖类、B族链球菌II组荚膜糖类、B族链球菌III组荚膜糖类、B族链球菌IV组荚膜糖类、B族链球菌V组荚膜糖类、金黄色葡萄球菌5型荚膜糖类、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖类、得自伤寒沙门氏菌的Vi糖类、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS、卡他莫拉菌LPS和流感嗜血菌LPS。所述LPS是指天然脂多糖(或脂寡糖)或其中脂质A部分已通过众多已知方法中的任一种解毒的脂多糖(参见例如WO97/18837或WO98/33923)，或任何包含来源于所述LPS的O-多糖的分子。所述脑膜炎奈瑟氏球菌LPS是指12种已知免疫型(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11或L12)中的1种或多种。
特别优选的组合是含以下组分的组合物：1)缀合的Hib、缀合的MenA和缀合的MenC；2)缀合的Hib、缀合的MenY和缀合的MenC；3)缀合的Hib和缀合的MenC；和4)缀合的MenA、缀合的MenC、缀合的MenY和缀合的MenW-135。在每种上述缀合物中的PS量可为每0.5mL人剂量各5或10μg。优选地，Hib、MenA、MenC、MenW-135和MenY是TT缀合物。
与多糖接种方法有关的问题是多糖本身为弱免疫原这一事实。为克服此问题，可将本发明的糖类与蛋白载体缀合，所述载体可提供旁观T细胞辅助作用。因此，优选本发明所用的糖类连接至这种蛋白载体。目前常用于产生糖类免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、来自流感嗜血杆菌的D蛋白(EP594610-B)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC以及结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。
所述糖类可通过任何已知方法(例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757中的方法)连接至载体蛋白。优选地，可进行CDAP缀合(WO95/08348)。
优选地，所述缀合物的蛋白∶糖类(重量∶重量)比例是0.3∶1-1∶1，更优选0.6∶1-0.8∶1，最优选约0.7∶1。
本发明包括提供抗肺炎球菌和不同病原体的保护作用的抗原组合。目前许多儿科疫苗以联合疫苗形式给子，以减少儿童必须接受的注射次数。因此，对于儿科疫苗来说，来自其它病原体的其它抗原可以与本发明的肺炎球菌疫苗一起配制。例如，本发明的疫苗可以用公知的‘三价’联合疫苗配制(或同一时间分别给予)，该联合疫苗包含白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)和百日咳成分[通常是去毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，以及任选的百日咳外膜蛋白(pertactin，PRN)和/或凝集素1+2]，例如市售疫苗INFANRIX-DTPa(SmithKlineBeecham Biologicals)，其包含DT、TT、PT、FHA和PRN抗原，或带有完整细胞百日咳组分，例如SmithKlineBeecham Biologicalss.a.销售的TritanrixTM。联合疫苗还可以包含其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)、卡他莫拉菌外膜蛋白、不可分型的流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。
可包含在联合疫苗中(特别是用于预防中耳炎)的优选卡他莫拉菌蛋白抗原的实例为：OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME等，(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[wO93/03761(德克萨斯大学)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE。可包含在联合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的不可分型的流感嗜血菌抗原的实例包括：丝束蛋白[(US5766608-俄亥俄州研究基金会)]和含来自该蛋白的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(纽约州立大学)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；D蛋白(EP594610)；P2和P5(WO94/26304)。
考虑的其它组合是本发明的肺炎链球菌糖类和蛋白与病毒抗原的组合，所述病毒抗原例如来自流感病毒(减毒的、裂解的或亚单位的)[例如表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)]。参见例如：Chaloupka I.等，Eur.Journal Clin.Microbiol.Infect.Dis.1996，15：121-127]；RSV(例如F和G抗原或F/G融合体，参见例如：Schmidt A.C.等，J Viral，2001年5月，4594-4603页)；PIV3(例如HN和F蛋白，参见Schmidt等，出处同上)；水痘病毒(例如减毒的、糖蛋白I-V等)以及MMR(麻疹、流行性腮腺炎、风疹)的任意(或全部)组分。
本发明意欲用于整体治疗或预防中耳炎的优选儿科联合疫苗包含：一种或多种肺炎链球菌糖类抗原(优选缀合至D蛋白)、一种或多种肺炎球菌蛋白(优选上述肺炎球菌蛋白)和一种或多种来自卡他莫拉菌和/或非典型流感嗜血菌的表面暴露抗原。D蛋白可有利地用作肺炎球菌糖类(如上所述)的蛋白载体，因为其自身为能够产生B细胞介导的抗非典型流感嗜血菌(ntHi)保护作用的免疫原。卡他莫拉菌或非典型流感嗜血菌抗原可包含在亚单位形式的疫苗中，或者可作为存在于由细菌制备的外膜囊泡(疱)表面上的抗原被加入。
用于本发明接种的免疫原性组合物的免疫原性特性
在本发明中，相比于用不含佐剂，即不含任何外源佐剂的对应组合物(本文也称为‘普通组合物’)获得的CD4T-细胞免疫应答，免疫原性组合物优选能够诱导抗至少一种组分抗原或抗原性组合物的改进的CD4T-细胞免疫应答。在一种特定实施方案中，当免疫原性组合物是流感组合物，并且当流感疫苗制剂是来自几种流感病毒株(其中之一是大流行株)时，所述改进的CD4T-细胞免疫应答是针对大流行流感病毒株。
所述“改进的CD4T-细胞免疫应答”是指在给予含有佐剂的免疫原性组合物之后在哺乳动物中获得的CD4应答高于在给予不含佐剂的相同组合物后获得的CD4应答。例如，与给予包含流感病毒或其抗原性制剂并且不含佐剂的免疫原性组合物之后诱导的应答相比，在给予包含流感病毒或其抗原性制剂以及佐剂的免疫原性组合物后在人类患者中获得更高的CD4T-细胞应答。这种制剂将有利地用于诱导抗流感病毒的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子呈递的流感表位。
具体地但非排它性地，所述‘改进的CD4T-细胞免疫应答’在免疫学上未初免的患者(即对所述抗原为血清阴性的患者)中获得。此血清阴性可能是从未面对这种病毒或抗原的所述患者(所谓的‘原初’患者)的结果，或者是在遭遇时不能对所述抗原应答的所述患者的结果。在一个特定方面，在免疫受损的受试者，如老年人，典型是65岁或年龄更大，或具有高危医学状况的小于65岁的成人(“高危”成人)或2岁以下幼儿中获得所述CD4T-细胞免疫应答。
改进的CD4T-细胞免疫应答可通过检测产生任何以下细胞因子的细胞数来评价：
·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞
·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞
·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞
当与给予不含佐剂的组合物相比在给予含有佐剂的组合物后产生任何以上细胞因子的细胞的量较高时，将存在改进的CD4T-细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少一种、优选两种将被实现。在一个具体实施方案中，与无佐剂组相比，含有佐剂的组中生产全部4种细胞因子的细胞将以更高量存在。
由本发明的含有佐剂的流感组合物赋予的改进的CD4T-细胞免疫应答理想地可在单次给予后获得。例如在快速发展的爆发情况下单剂方法将有极为重大的意义。在某些情况下，尤其是对于老年人群，或者对于首次进行抗流感接种的小孩(9岁以下)或在大流行的情况下，给予两剂相同的用于该季的组合物可能是有益的。第二剂所述相同组合物(仍被看作是‘用于首次接种的组合物’)可在初次免疫应答正在发展的过程中给予，并有足够的时间间隔。通常，第二剂组合物在首剂后数周或约1个月(例如首剂后2周、3周、4周、5周或6周)给予，以帮助激发无应答或低应答个体的免疫系统。
在另一实施方案中，与用不含佐剂的组合物免疫的个体中诱导的B记忆细胞应答相比，给予所述免疫原性组合物在给予含有佐剂的免疫原性组合物的患者中诱导改进的B-记忆细胞应答。改进的B-记忆细胞应答意指在遭遇抗原时能够分化为分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率增加，这通过体外分化刺激进行检测。
在另一实施方案中，与用不含佐剂的组合物免疫的个体中诱导的体液应答相比，给予所述免疫原性组合物在给予含有佐剂的免疫原性组合物的患者中诱导改进的体液应答。所述体液免疫应答可以根据实施例1，特别是I.1(I.1.1)、I.2(I.2.1)和I.3(I.3.5.2)部分详细描述的任何程序进行测量。当免疫原性组合物是流感病毒组合物时，特别地，所述体液应答是针对同源或异源病毒株获得的。具体地，所述异源体液免疫应答表示流感病毒株之间的体液应答，并且称作“交叉反应性”体液免疫应答。所述“交叉反应性”体液免疫应答涉及诱导抗一种流感病毒株的应答，所述流感病毒株是用于接种的流感病毒株的变体(漂移)。所述应答的一个实例在实施例III.3.1和图2中举例说明。
在一种特定实施方案中，给予所述含有佐剂的免疫原性组合诱导以下应答中的至少两种：与用不含佐剂，即不含任何外源佐剂的相应组合物(本文也称作“普通组合物”)相比，(i)改进的CD4T-细胞免疫应答，(ii)改进的B-记忆细胞应答，(iii)改进的针对至少一种组分抗原或抗原性组合物的体液应答。
在进一步的特定实施方案中，采用用于第一次接种的含佐剂的组合物进行接种，对CD8应答没有可测量的影响。
本发明的一个特定实施方案是用以脂质体形式存在的皂苷佐剂，特别是胆固醇猝灭形式的QS21皂苷配制包含流感病毒或其抗原性制剂的组合物，能够在免疫受损的人群中有效促进T细胞应答。在一种实施方案中，所述佐剂进一步包含3D-MPL。具体地，通过流感疫苗保护的关联性评价，与用不含佐剂的流感疫苗接种相比，给予单剂如本发明所述的用于首次接种的免疫原性组合物，在对老年人群进行抗流感接种后能够提供更好的血清保护作用。相比于用不含佐剂的制剂获得的免疫应答，要求保护的含有佐剂的制剂还能够诱导抗流感病毒的改进的CD4T-细胞免疫应答。该观察结果可能与接种或由于流感抗原暴露导致的感染时增加的应答性相关。而且，其还可能与交叉反应性相关，即对变体流感株应答的能力较高。这种改进的应答可能在免疫受损的人群如老年人群(65岁和以上)以及尤其是高危老年人群中特别有益。这可导致降低整体的发病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感类疾病的紧急入院。这还可对婴儿群体(5岁以下，优选2岁以下)有益。而且，与用不含佐剂的制剂诱导的应答相比，其允许诱导时间更持久的CD4T细胞应答，例如在首次接种后1年仍存在。
在一个特定方面，CD4T-细胞免疫应答，例如在未初免受试者中获得的改进的CD4T-细胞免疫应答，包括诱导交叉反应性CD4T辅助细胞应答。具体地说，增加交叉反应性CD4T细胞的量。所述‘交叉反应性’CD4应答指CD4T-细胞靶向流感株之间的共有表位。
通常，可用的流感疫苗通常仅有效对抗具有相似抗原性特征的血细胞凝集素的流感病毒感染株。当感染(循环)性流感病毒已经历了表面糖蛋白(具体地说是血细胞凝集素)的微小变化(例如点突变或点突变的累积，导致例如氨基酸改变)时(抗原漂移变体病毒株)，疫苗仍可提供一些保护作用，但其可能仅提供有限的保护作用，因为新产生的变体可能逃脱先前流感感染或接种诱导的免疫性。抗原漂移是两次大流行期间发生的年度流行的原因(Wiley&Skehel，1987，Ann.Rev.Biochem.56，365-394)。交叉反应性CD4T细胞的诱导为本发明组合物提供了额外的优势，因为其还可提供交叉保护作用，换句话说是抗异源感染的保护作用，所述异源感染即由为免疫原性组合物中包含的流感病毒株的变体(例如漂移变体)的循环流感病毒株引起的感染。这在循环毒株难以在卵中繁殖或难以在组织培养物中生产时可能是有利的，使漂移株用作备选工作株。这在受试者以几个月或一年间隔接受第一次和第二次接种时也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性组合物中的流感株是用于首次接种的组合物中使用的毒株的漂移变体株。
因此，本文定义的含有佐剂的流感免疫原性组合物具有更高的诱导接种的老年受试者中的血清保护和交叉反应性CD4T细胞的能力。这种特征可能与针对免疫原性组合物中存在的病毒株的变异株的更高应答能力相关。可以证实这是大流行情况下的重要优点。例如，包含H5、H2、H9、H7或H6株中的任一或几个株的多价流感免疫原性组合物在接种后或受到大流行变体，即所述大流行株的漂移株感染后，可以提供更高的针对所述漂移株的应答。
用流感疫苗接种后交叉反应性CD4T-细胞的检测
能够识别同源和漂移的流感株两者的CD4T-细胞在本文件中已命名为“交叉反应性”。如本文所述的含有佐剂的流感组合物已能够显示出异亚型的交叉反应性，因为存在可观测的抗漂移流感株的交叉反应性。如上所述，大流行疫苗制剂有效对抗漂移大流行株的能力在大流行情况下可证明是重要的特征。
与以上观测结果相一致，已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4T-细胞表位(Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995J Virol.199569(12)：7497-506)。
在一个特定实施方案中，含有佐剂的组合物可提供额外益处，该益处提供了抗循环株的更好的保护作用，所述循环株经历了血细胞凝集素的大改变(例如基因重组，例如两个不同物种之间的基因重组)(抗原转变)，目前可用疫苗对其无效。
再次接种和用于再次接种的组合物(加强组合物)
在一种实施方案中，本发明提供流感病毒或其抗原性制剂在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再次接种先前用本文要求保护的免疫原性组合物接种过的人。
在本发明的一个方面，提供了来自第一次大流行的流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂在制备本文定义的含有佐剂的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于提供抗流感病毒株导致的流感感染的保护作用，所述病毒株是所述第一次流感病毒株的变体。
另一方面，本发明提供流感病毒或其抗原性制剂在制备流感免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再次接种先前用本文要求保护的含佐剂的流感组合物或用含变异流感病毒株的含佐剂的流感组合物接种过的人，所述佐剂是本文定义的佐剂。
另一方面，本发明提供了对人群或个体进行抗一种流感病毒株的接种，然后对所述人或人群进行抗变异流感病毒株的再次接种的方法，所述方法包括给所述人施用(i)第一组合物，其包含来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的佐剂，和(ii)第二免疫原性组合物，其包含所述第一流感病毒株的流感病毒株变体。在一种特定实施方案中，所述第一病毒株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。在另一特定实施方案中，所述变异株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。具体地，再次接种是用包含作为循环大流行株的至少一种病毒株的流感组合物进行的。初免组合物和加强组合物都可以是多价的，即可以含有至少两种流感病毒株。当组合物是多价时，至少一种病毒株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。
通常，再次接种于首次接种后至少6个月进行，优选于首次接种后8-14个月进行，更优选于首次接种后约10-12个月进行。
用于再次接种的免疫原性组合物(加强组合物)可包含任意类型的抗原制剂，其是灭活的或者是减毒的活病毒。其可包含相同类型的抗原制剂，即分裂流感病毒或其分裂流感病毒抗原性制剂、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒，作为首次接种用的免疫原性组合物。或者，加强组合物可包含首次接种所使用流感抗原类型之外的另一种类型的流感病毒抗原，即分裂流感病毒或其分裂流感病毒抗原性制剂、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒。优选地，使用分裂病毒或全病毒体疫苗。加强组合物可有佐剂或无佐剂。无佐剂的加强组合物可为肌内给予的所述制剂包含3种由WHO推荐的合适流感季毒株制备的灭活分裂病毒体抗原。
加强组合物可含有佐剂或不含佐剂。在一个特定实施方案中，加强组合物包含本文定义的皂苷佐剂。
在一个特定实施方案中，用于再次接种的免疫原性组合物(下文也称为‘加强组合物’)包含流感病毒或其抗原性制剂，它们与用于首次接种的流感病毒或其抗原性制剂共有共同的CD4T-细胞表位。共同的CD4T-细胞表位意指可由相同CD4细胞识别的不同抗原的肽/序列/表位(参见例如以下文献描述的表位：Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995J Virol.199569(12)：7497-506)。
在本发明的一个实施方案中，加强组合物为一种单价流感组合物，其包含与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能的流感株。具体地，加强组合物中的所述病毒株是循环大流行株。合适的病毒株是但不限于：H5N1、H9N2、H7N7和H2N2。所述病毒株可与存在于首次接种用组合物中的病毒株相同，或与其中一种病毒株相同。在一个替代实施方案中，所述病毒株可为首次接种用组合物中存在的病毒株的变体株，即漂移株。
在另一个具体实施方案中，加强组合物为多价流感疫苗。具体地说，当加强组合物为多价疫苗如二价、三价或四价疫苗时，至少一种病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。在一个具体实施方案中，加强组合物中的两种或多种病毒株是大流行株。在另一个具体实施方案中，加强组合物中的至少一种大流行株与首次接种用组合物中存在的病毒株相同，或与其中一种病毒株相同。在一个备选实施方案中，至少一种病毒株可为首次接种用组合物中存在的至少一种大流行株的变体株，即漂移株。具体地，加强组合物中的至少一种病毒株是循环大流行株。加强组合物可以含佐剂或不含佐剂。
通常，加强组合物在使用时于下一个流感季给予，例如在第一个免疫原性组合物之后约1年给予。加强组合物还可随后每年给予(第三次、第四次、第五次接种等)。加强组合物可与用于首次接种的组合物相同。合适地，加强组合物包含流感病毒或其抗原性制剂，其为用于首次接种的流感病毒的变异株。具体地说，流感病病毒株或其抗原性制剂按照世界卫生组织发布的参考材料选择，使得它们适合于在再次接种年循环的流感株。
用于再次接种的流感抗原或抗原性组合物优选合适地包含上文描述的佐剂。所述佐剂可为如上文所述的以脂质体形式存在的皂苷，优选任选地包含额外的佐剂，如3D-MPL。
一方面，相比于用无佐剂的流感病毒或其抗原性制剂第一次接种后诱导的等同应答，再次接种诱导以下的任一种、优选两种或全部：(i)抗流感病毒或其抗原性制剂的改进的CD4应答，或(ii)改进的B细胞记忆应答或(iii)改进的体液应答。优选地，用本文定义的含有佐剂的流感病毒或其抗原性制剂再次接种后诱导的免疫应答高于用不含佐剂的组合物再次接种后诱导的对应应答。优选地，在用含有佐剂的、优选分裂的流感病毒组合物首次接种的人群中，用无佐剂的、优选分裂的流感病毒再次接种后诱导的免疫应答高于在用无佐剂的、优选分裂的流感病毒组合物首次接种的人群中的对应应答。
在一个特定实施方案中，用含流感病毒和本文定义的脂质体形式的皂苷佐剂的加强组合物再次接种受试者显示出的抗体滴度高于用不含佐剂的组合物首次接种并用不含佐剂的组合物加强的人群中的对应值。佐剂增强针对再次接种的抗体应答的效力在已知对流感病毒接种或感染具有低应答的老年人中尤其重要。就改善再次接种后的CD4T-细胞应答而言，含有佐剂的组合物相关的益处也是显著的。
具体地，相比于对照疫苗赋予的保护作用，本发明的含有佐剂的组合物能够诱导抗漂移株(下一流感季的流感株)的更好的交叉反应性。所述交叉反应性表现出的持久性比用无佐剂制剂获得的持久性高。所述佐剂增强抗漂移株的交叉反应性的作用对于大流行情况很重要。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种接种方案，其中首次接种用含至少一种流感病毒株的流感组合物、优选分裂流感组合物进行，其中所述流感病毒株可能引起大流行爆发，再次接种用为大流行株或经典株的循环病毒株进行。
HA中的CD4表位
此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表位区。已知被病毒用于逃避宿主免疫系统的适应性应答的不同流感株之间CD4和B细胞表位的任意差异都将在流感接种中起重要作用，并确实如此。
已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4T-细胞表位(参见例如：Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996J Virol.70(7)：4787-90；和Gelder CM等，1995J Viroi.199569(12)：7497-506)。
在一个具体的实施方案中，再次接种使用含流感病毒或其抗原性制剂的加强组合物进行，所述流感病毒或其抗原性制剂与用于第一次接种的流感病毒抗原或其病毒抗原性制剂共有共同的CD4T-细胞表位。因此，本发明涉及含大流行流感病毒或其抗原性制剂和脂质体形式的皂苷，特别是胆固醇去毒形式的QS21，以及任选3D-MPL的免疫原性组合物在制备多剂疫苗的首次接种组分中的用途，所述多剂疫苗还包含作为加强剂量的流感病毒或其抗原性制剂，它们与第一次接种时所给予剂量的大流行流感病毒抗原或其病毒抗原性制剂共有共同的CD4T-细胞表位。
接种方法
本发明的免疫原性组合物可通过任意合适的传递途径施用，例如皮内、粘膜如鼻内、口服、肌内或皮下。其它送递途径在本领域众所周知。
肌内送递途径对含有佐剂的免疫原性组合物是优选的。
皮内送递是另一个适宜的途径。任意合适的装置都可用于皮内传递，例如在US4,886,499、US5,190,521、US5,328,483、US5,527,288、US4,270,537、US5，015,235、US5，141,496、US5,417,662中描述的短针装置。皮内疫苗还可通过限制针头进入皮肤的有效穿透长度的装置施用，例如描述于WO99/34850和EPl092444的装置及其功能等同物，这两个文献通过引用结合到本文中。射流喷射装置也是适宜的，其经液体射流喷射器或经刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针头传递液体疫苗至真皮。射流喷射装置描述于例如US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,l63、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。喷射粉末/颗粒送递装置也是适宜的，其使用压缩气体加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规注射器可用于皮内施用的经典结核菌素皮内试验法。
另一个合适的施用途径是皮下途径。任意合适的装置都可用于皮下送递，例如经典的针。优选地，使用例如在WO01/05453、WO01/05452、WO01/05451、WO01/32243、WO01/41840、WO01/41839、WO01/47585、WO01/56637、WO01/58512、WO01/64269、WO01/78810、WO01/91835、WO01/97884、WO02/09796、WO02/34317中公开的无针射流喷射器装置。更优选地，所述装置用液体疫苗制剂预填充。
或者，疫苗鼻内施用。典型地，疫苗局部施用于鼻咽部，优选没有吸入到肺中。理想的是使用将疫苗制剂送递入鼻咽部而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内送递装置。
本发明疫苗的优选鼻内施用装置是喷雾装置。适宜的商用鼻喷雾装置包括AccusprayTM(Becton Dickinson)。雾化器产生非常细小的雾滴，其可被轻易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。
用于鼻内用途的优选喷雾装置的性能与使用者提供的压力无关。这些装置称为压力阈装置。只有在提供阈压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压力阈装置在本领域是已知的，描述于例如WO91/13281和EP311863B和EP516636，这些文献通过引用结合到本文中。这种装置可由Pfeiffer GmbH购买，还描述于Bommer，R.Pharmaceutical Technology Europe，1999年9月。
优选的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体检测)范围为1-200μm，优选10-120μm。小于10μm存在吸入风险，因此理想的是10μm以下的液滴不超过约5％。120μm以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超过约5％。
双剂量送递是用于本发明疫苗的鼻内送递系统的更优选特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔施用一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于一个容器中，装置的构造允许每次有效送递单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置施用本发明疫苗。
或者，本发明还设想了表皮或透皮接种途径。
在本发明的一个具体实施方案中，首次施用的含有佐剂的免疫原性组合物可肌内施用，含有佐剂的或不含佐剂的的加强组合物可通过不同途径施用，例如皮内、皮下或鼻内。在另一个具体实施方案中，首次施用的组合物可包含每个流感病毒株15μg的标准HA含量，加强组合物可包含低剂量的HA，即低于15μg，并根据施用途径可以较小体积施用。
接种群体
接种的目标群体可为免疫受损的人。和健康成人相比，免疫受损的人一般不能很好地对抗原、尤其是流感抗原应答。
优选地，目标群体是未进行抗流感初免的群体，他们或者是原初态的(例如相对于大流行病毒株)，或者先前不能对流感感染或接种应答。优选地，目标群体是老年人，合适地为65岁和以上，较年轻的高危成人(即18-64岁)，例如在健康机构工作的人，或者具有高危因素如心血管病和肺病或糖尿病的年轻成人。另一个目标群体是所有6个月和以上的儿童，尤其是6-23个月龄的儿童，他们经历了相对高的流感相关住院率。优选地，目标群体是65岁以上的老年人。
接种方案、给药和附加的效力标准
合适地，本发明的免疫原性组合物在大部分情况下为标准0.5ml注射剂量，根据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)检测，含各个流感株的15μg血细胞凝集素抗原组分。合适地，疫苗剂量体积在0.5ml至1ml之间，具体地说是标准0.5ml或0.7ml疫苗剂量体积。根据原液样品中的HA浓度，可常规地轻微调整剂量体积。
合适地，所述免疫原性组合物含低剂量的HA抗原-例如每流感病毒株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14μgHA中的任一个剂量。
有利地，本发明的疫苗剂量，尤其是低剂量疫苗，可以以比一般为每剂约0.5、0.7或1ml的常规注射分裂流感疫苗小的体积提供。本发明的小体积剂量优选每剂不到500μl，更优选每剂不到300μl，最优选每剂不超过约200μl或以下。
因此，按照本发明一个方面的优选小体积疫苗剂量是在小体积中具有低抗原剂量的剂量，例如在约200μl体积中有约15μg或约7.5μgHA或约3.0μg HA(每病毒株)。
本发明的流感药物优选满足疫苗的某些国际标准。
国际上应用了检测流感疫苗效力的标准。在下表1中显示了有效抗流感疫苗的欧盟官方标准。理论上，为满足欧盟要求，对疫苗中包含的所有流感株来说，流感疫苗仅需满足表中的一项标准。本发明的组合物合适地满足这些标准中的至少一项。
然而，在实践中，所有病病毒株必须满足所述标准中的至少两项或全部三项，特别是对于新型疫苗(例如经不同途径送递的新型疫苗)而言。在某些情况下，两项标准可能足够了。例如，可以接受所有病病毒株满足三项标准中的两项，而部分但不是全部病病毒株满足第三项标准(例如三种病病毒株中的两种)。对成年人群体(18-60岁)和老年人群体(大于60岁)的要求是不同的。
表1
18-60岁 ＞60岁
血清阳转率* ＞40％ ＞30％
转变因子** ＞2.5 ＞2.0
保护率*** ＞70％ ＞60％
*血清阳转率定义为接种后针对每种疫苗株的血清血细胞凝集素抑制(HI)滴度增加达至少4倍的接种者的百分率。
**转变因子定义为接种后针对每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数。
***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于或高于1∶40的接种者的百分率，通常可被看作指示保护作用。
再一方面，本发明提供一种设计用于已知要通过CD4+T细胞活化治愈或治疗的疾病的疫苗的方法，包括“
1)选择含CD4+表位的抗原，和
2)组合所述抗原和上文定义的脂质体形式的皂苷佐剂，其中所述疫苗在所述哺乳动物中施用后能够在所述哺乳动物中诱导增强的CD4T细胞应答。
本申请的所有参考文献(包括专利申请和已授予专利)的教导都完整地通过引用结合到本文中。
为避免疑惑，本发明人的意图为本文的术语“包含”、“含有”和“包括”在每种情况下都任选地可以被术语“由......组成”替代。
本发明将参考以下的非限制性实施例进一步描述：
实施例I描述了在小鼠、雪貂和人研究中使用的免疫读出方法。
实施例II描述了MPL/QS21脂质体佐剂的制备。
实施例III描述了含有佐剂的和不含佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价。
实施例IV显示了含有佐剂的和不含佐剂的流感疫苗在原初和初免的C57BI/6小鼠中的临床前评价。
实施例V描述了以两种不同浓度的3D-MPL为佐剂的流感疫苗在小鼠中的比较。
实施例VI描述了以两种不同浓度的3D-MPL为佐剂的流感疫苗在老年人中的比较。
实施例VII描述了含有佐剂的HPV疫苗在小鼠中临床前评价。
实施例VIII描述了含有佐剂的和不含佐剂的巨细胞免疫组合物的临床前评价。
实施例IX描述了以两种不同浓度的3D-MPL为佐剂的RTS，S疫苗的临床前评价。
实施例X描述了以两种不同浓度的3D-MPL为佐剂的RTS，S疫苗的临床评价。
实施例I-免疫读出方法
I.1.小鼠法
I.1.1.血凝反应抑制测试
测试程序
使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。热灭活血清预先用高岭土和鸡RBC处理，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶20，所以不可检测水平记录为等于10的滴度。
统计学分析
使用UNISTAT对接种后的HI滴度进行统计学分析。用于分析方差的方法可如下简述：
■数据的对数转换
■对各个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性
■对各组进行的双因素方差分析
■用于多重比较的Tukey HSD检验
I.1.2.胞内细胞因子染色
该技术允许根据细胞因子产量定量抗原特异性T淋巴细胞：效应子T细胞和/或生产IFN-γ的效应子-记忆T细胞和/或生产IL-2的中枢记忆性T细胞。在免疫后7天收集PBMC。
在分泌性抑制剂(Brefeldine)存在下体外再刺激淋巴样细胞。
然后使用荧光抗体(CD4、CD8、IFN-γ和IL-2)通过常规免疫荧光法处理这些细胞。结果表示为CD4/CD8T细胞中细胞因子阳样的细胞的频率。在第二次免疫后7天对PBMC进行T细胞的胞内细胞因子染色。由小鼠收集血液，并合并在肝素化培养基RPMI+添加物中。对于血液，RPMI+添加物稀释的PBL悬浮液按照推荐的方法(于室温以2500rpm离心20分钟)在Lympholyte-Mammal梯度上分层。去除界面处的单核细胞，用RPMI+添加物清洗2次，用RPMI5％胎牛血清将PBMC悬浮液调整至2×106个细胞/ml。
用μbeads上的流感三价分裂病毒(5μgHA/珠)或完整流感疫苗(1μgHA/病毒株)以1×106个细胞/ml(管式FACS)的终浓度对PBMC进行体外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(均为1μg/ml)的情况下于37℃温育2小时。
加入两种抗体后，活化的T和NK细胞的增殖和细胞因子产生增加，并且可以提供CTL诱导的共刺激信号。
此外，也用流感三价分裂疫苗(30μg HA/株)-或完整流感疫苗(5μg HA/病毒株)-脉冲的BMDCs(1x105个细胞/ml)刺激PBMCs过夜，所述脉冲的BMDCs是通过37℃下用三价分裂疫苗(60μgHA/株)或完整流感三价疫苗(10μgHA/病毒株)脉冲BMDCs6小时而制备的。抗原刺激步骤后，37℃下在布雷菲德菌素(1μg/ml)存在下温育PBMC过夜，以抑制细胞因子分泌。
IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色如下进行：清洗细胞悬浮液，重悬浮在含2％Fc封闭试剂(1/50；2.4G2)的50μl PBS1％FCS中。于4℃温育10分钟后，加入抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8perCp(3/50)的50μl混合物，于4℃温育30分钟。在PBS1％FCS中清洗后，通过重悬浮在200μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)中并于4℃温育20分钟使细胞透化。然后用Perm Wash(Kit BD)清洗细胞，并用以Perm Wash稀释的抗-IFN-γAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)的50μl混合物重悬浮。于4℃温育最少2小时最长过夜后，用Perm Wash清洗细胞并重悬浮在PBS1％FCS+1％低聚甲醛中。通过FACS进行样品分析。门控(FSC/SSC)活细胞，对CD4+T细胞上的约50,000个事件(淋巴细胞)或35,000个事件进行探测。针对CD4+和CD8+门控的群体计算IFN-γ+或IL2+的百分率。
I.2.雪貂法
I.2.1.血凝反应抑制测试(HI)
测试程序
使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热灭活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。
统计学分析
使用UNISTAT对HI滴度(41天，攻击前)进行统计学分析。用于分析方差的方法可如下简述：
■数据的对数转换
■对各个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性
■对单因素ANOVA的相互作用的检验
■用于多重比较的Tukey HSD检验
I.2.3.鼻清洗
通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于干冰上的样品容器中。
鼻清洗液的病毒滴定
所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染物。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×105个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育5-7天。在6-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。
在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲腊染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截止值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准差)。OD＜截止值时定义为阳性得分，相反，OD＞截止值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID50/ml。
I.3.评价人体中免疫应答的测定
I.3.1.血凝反应抑制测定
使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta，USA(1991)描述的方法通过检测HI抗体测定免疫应答。
使用4个血凝反应抑制单位(4HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬浮液，用标准的和综合验证过的微量法对融化的冷冻血清样品进行抗体滴度检测。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。
评价所获血清的HI抗体水平。以1∶10起始稀释度开始制备稀释系列(乘以因数2)，直至最终稀释度1∶20480。把显示完全抑制(100％)血凝反应的最高稀释度步骤视为滴定终点。所有实验都以双份进行。
I.3.2.神经氨酸酶抑制测定
在包被胎球蛋白的微量滴定板中进行测定。制备2倍连续稀释的抗血清，与标准化量的甲型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。测试基于由胎球蛋白酶解释放神经氨酸的神经氨酸酶生物活性。在切下末端神经氨酸后，β-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出来。向各孔加入来自落花生的辣根过氧化物酶(HRP)标记的花生凝集素，其特异性结合半乳糖结构。可在含四甲基联苯胺(TMB)的底物反应中检测和定量结合凝集素的量。表明仍抑制病毒神经氨酸酶活性达至少50％的最高抗体稀释度为NI滴度。
I.3.3.中和抗体测定
对融化的冷冻血清样品进行中和抗体检测。包含在血清中的抗体的病毒中和以微量中和实验来测定。血清在实验中无需进一步处理即可使用。各个血清以三重测定进行测试。将标准化量的病毒与连续稀释的血清混合并温育，以使抗体结合病毒。然后将含确定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入病毒和抗血清的混合物中，于33℃温育。在温育期后，通过鸡红细胞的凝集反应显现病毒复制。利用Reed and Muench的方法计算血清的50％中和滴度。
I.3.4.通过细胞因子流式细胞术(CFC)评价细胞介导的免疫性
如果与对应抗原温育，外周血抗原特异性CD4和CD8T细胞可在体外被再刺激，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFN。因此，抗原特异性CD4和CD8T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞术计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8T细胞的频率。
I.3.5.统计方法
I.3.5.1.主要终点
·在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中主诉的局部和全身体征和症状的百分率、强度以及同接种的关联。
·在接种后的21天随访期(即接种日和随后20天)以及整个过程中主诉的局部和全身体征和症状的百分率、强度以及同与接种的关联。
·整个研究过程中严重不良事件的发生。
I.3.5.2.次要终点
对于体液免疫应答：
观测变量：
·在0天和21天：血清血凝反应抑制(HI)和NI抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病病毒株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。
·在0天和21天：中和抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病病毒株的每一种测试。
衍生变量(具有95％置信区间)：
·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMT)
21天时具有95％CI的血清阳转率*
21天时具有95％CI的转变因子**
21天时具有95％CI的血清保护率***
·在所有时间点的血清NI抗体GMT(具有95％置信区间)
*血清阳转率定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI滴度时增加达至少4倍的接种者百分率。
**转变因子定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。
***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于40的接种者百分率，通常将该百分率看作指示保护作用。
对于细胞介导的免疫(CMI)应答
观测变量
在第0天和21天：不同测试中每106当中细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试都定量CD4/CD8T细胞针对以下物质的应答：
·肽流感(pf)抗原(这些抗原的精确性质和来源必须给出/解释)
·分裂流感(sf)抗原
·完整流感(wf)抗原
衍生变量：
·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞
·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞
·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞
I.3.5.3.免疫原性分析
免疫原性分析基于总接种群体。对于每个治疗组，计算以下参数(具有95％置信区间)：
·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
21天时的转变因子
21天时的血清阳转率(SC)，定义为相比于第0天在第21天时血清HI滴度增加达至少4倍的接种者百分率。
21天时的保护率定义为血清HI滴度＝1∶40的接种者百分率。
·在各个时间点(第0天、第21天)针对每个接种组和针对每种抗原(肽流感(pf)抗原、分裂流感(sf)抗原和完整流感(wf)抗原)总结CD4/CD8T-淋巴细胞分泌应答的频率(描述统计)。
·在各5种不同测试中对于每个接种组和每种抗原(pf、sf和wf)，在时间点(接种后-接种前)之间个体应答差异的描述统计。
·使用非参数检验(Kruskall-Wallis检验)比较3组之间的局部差异，以各5种不同测试计算每种抗原的统计学p-值。所有显著性检验都是双尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是统计学显著的。
实施例II-制备MPL/QS21脂质体佐剂
II.3MPL液体悬浮液的制备
MPL(在整个文件中使用，其是3D-MPL即3-O-脱酰基单磷酰脂质A的缩写)原液由3D-MPL冻干粉制备。MPL原液是稳定的原料浓缩(约1mg/ml)水分散体，其随时可用于疫苗或佐剂配制。制备过程的示意图在图1中给出。
对于最大批量12g，MPL原液制品储存在无菌玻璃容器中。MPL的分散由以下步骤组成：
-将MPL粉末悬浮在注射用水中
-通过加热解聚任意大的聚集物(热处理)
-通过微流化将粒度缩小至100nm至200nm
-用Sartoclean预过滤装置0.8/0.65μm预过滤制品
-于室温除菌过滤制品(Sartobran P装置，0.22μm)
MPL粉末通过微流化冻干，产生稳定的胶体水性分散体(MPL粒度小于200nm)。MPL冻干粉末分散在注射用水中，以便获得粗制的10mg/ml悬浮液。然后在搅拌下对悬浮液进行热处理。冷却至室温后，开始微流化处理，以便降低粒度。使用微流控装置M110EH，以限定压力通过微流化相互作用腔连续循环分散液达最小通过量(循环次数：nmin)进行微流化。代表循环次数的微流化持续时间基于检测的流速和分散体积计算。对于给定压力下的给定设备，获得的流速可在一个至另一个相互作用腔之间以及特定相互作用腔的整个活动周期中有所变化。在本实施例中，使用的相互作用腔是F20Y型微流控器。由于微流化效力与压力-流速对相关，所以处理时间可在一批至另一批之间变化。1次循环需要的时间基于流速计算。所认定的流速是就在将MPL导入装置前用注射用水检测的流速。1次循环被定义为MPL总体积通过装置1次所需要的时间(以分钟表示)。如下计算获得n次循环需要的时间：
n×要处理的MPL的量(ml)/流速(ml/分钟)
由此相应地修改循环次数。描述了对所用的优选设备和相互作用腔要实施的最小循环量(nmim)。根据nmin循环后进行的粒度检测结果确定要实施的总循环量。基于历史数据确定粒度限制(dlim)。检测通过光子相关光谱法(PCS)技术实现，dlim表示为单峰结果(Z均值)。在该限度之下，可在nmin循环后终止微流化。在该限度之上，继续微流化，直至获得满意的粒度减小，最多再进行50个循环。
如果在微流化后不立即开始过滤，则将分散的MPL储存在+2至+8℃，等待转移至过滤区域。
在微流化后，用注射用水稀释分散液，通过0.22μm滤器在层流下除菌过滤。最终的MPL浓度是1mg/ml(0.80-1.20mg/ml)。
II.2制备MPL/QS21脂质体佐剂
该佐剂命名为AS01，其包含胆固醇猝灭形式的3D-MPL和QS21，并且按照引入作为参考的WO96/33739中的描述制备。具体地，基本按照WO96/33739的实施例1.1的描述制备AS01佐剂。AS01B佐剂包含：脂质体，其包含二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇和3D MPL[其量为1000μg DOPC，250μg胆固醇和50μg3D-MPL,每个值都是以每疫苗剂量中大约的量给出的]，QS21[50μg/剂]，磷酸盐NaCl缓冲液和水，到0.5ml的体积。
AS01E包含与AS01B相同的成分，但浓度较低，其量是500μgDOPC，125μg胆固醇，25μg3D-MPL和25μg QS21，磷酸盐NaCl缓冲液和水，到0.5ml的体积。
在制备含有MPL的脂质体的过程中，将DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)、胆固醇和MPL溶解于乙醇。通过真空下蒸发溶剂，形成脂质膜。加入pH6.1的磷酸缓冲液(9mM Na2HPO4，41mM KH2PO4，100mMNaCl)，使混合物进行预先匀化，然后在15,000psi压力下进行高压匀化(约15-20个循环)。这导致产生脂质体，所述脂质体在无菌(100型)区域中通过0.22μm膜灭菌过滤。然后在无菌玻璃容器中分布无菌产物，并且在冷室中保存(+2-+8℃)。
以此方式，产生的脂质体在膜中含有MPL(WO96/33739的“MPL在内”实施方案)。
QS21在水溶液中添加到需要的浓度。
实施例III-含有佐剂的和不含佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价
III.1.原理和目的
就对感染的敏感性和临床应答这二者而言，雪貂模型中的流感感染酷似人流感。
在先前未适应流感病毒株的情况下，雪貂对甲型流感和乙型流感这二者的感染极为敏感。因此，其为研究由施用的流感疫苗赋予的保护作用提供了极佳的模型系统。
该研究调查了含有佐剂的或不含佐剂的各种3价分裂疫苗减轻疾病症状(体温)和用同源病毒株攻击的雪貂鼻分泌物中病毒脱落的效力。
该实验的目标是表明含有佐剂的流感疫苗相比于普通(不含佐剂的)疫苗的效力。
终点是：
1)主要终点：减少同源攻击后鼻清洗液中的病毒脱落；
2)次要终点：通过HI滴度分型体液应答
III.2.实验设计
III.2.1.治疗/组别(表1)
由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))。雪貂在第0天用异亚型病毒株H1N1A/斯德哥尔摩/24/90(4Log TCID50/ml)初免。在第21天，用全人剂量(500μg疫苗剂量，15μg HA/病毒株)的H1N1A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97的组合肌内注射雪貂。然后在第42天通过鼻内途径用异亚型病毒株H3N2A/怀俄明/3/2003(4.5Log TCID50/ml)攻击雪貂。
表1
Figure BDA0000367049300000621
6只雪貂/组。In/Po＝单个/合并物
III.2.2.疫苗制剂的制备
制剂1：三价普通(不含佐剂的)分裂制剂：
将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量计入病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。搅拌5分钟后，按顺序加入病毒株H1N1、H3N2各15μg和17.5μg乙型病毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即施用，则储存于4℃。
制剂2：以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂流感疫苗：
将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量计入病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。搅拌5分钟后，按顺序加入病毒株H1N1、H3N2各15μg和17.5μg乙型病毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟。在制剂中加入称作“DQS21-MPLin”的预混合物，然后最少搅拌15分钟。DQS21-MPLin预混合物是脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml，MPL2mg/ml制备)和免疫刺激剂QS21的混合物。将该预混合物温育最少15分钟，然后加入三价分裂混合物。最终制剂中MPL和QS21的浓度是50μg/500μl。如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
备注：在每种制剂中，加入PBS10倍浓缩液至等渗，在最终体积中为1倍浓缩液。计算H2O体积以达到目标体积。
表2：制剂1和2(用分裂株制备的制剂中的最终组成(对于500μl)
Figure BDA0000367049300000631
III.2.3.读出结果(表3)
表3
Figure BDA0000367049300000632
III.3.结果
结果的示意图示于图1和2。
III.3.1.体液免疫(图1)
在鼻内异源初免后17天和免疫后21天以及攻击后13天，检测来自每组6只动物的血清中抗H3N2疫苗株(疫苗株A/巴拿马/2007/99和攻击株A/怀俄明/3/2003)的血凝反应抑制活性。
用实施例I.2.1详述的血凝反应抑制测试(HI)确定针对三种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。结论如下：
Figure BDA0000367049300000641
对于两种A/H3N2株和所有组，免疫后在所有接种组中观察到了HI滴度的加强。
用A/巴拿马/2007/99免疫后，与三价普通分裂疫苗相比，以脂质体中的MPL/QS21为三价分裂疫苗的佐剂时，观察到了统计学显著更高的抗-A/巴拿马/2007/99HI滴度。
Figure BDA0000367049300000643
用A/巴拿马/2007/99免疫后，只有以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂疫苗能够显著增加针对异源株A/怀俄明/3/2003的HI滴度(在用该漂移株攻击前的交叉反应性)
Figure BDA0000367049300000644
用A/怀俄明3/2003攻击后，对于三价普通分裂疫苗和以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂疫苗，都观察到了抗-A/怀俄明/3/2003HI滴度的显著增加。
Figure BDA0000367049300000645
对于A/新喀里多尼亚/20/99和B/山东/7/97株，与三价普通分裂疫苗相比，以脂质体中的MPL/QS21为三价分裂疫苗的佐剂时，观察到了统计学显著更高的HI滴度。
III.3.2.病毒脱落(图3).
按照实施例I.2.3的详细描述，对每组6只动物进行鼻清洗液的病毒滴定。通过在清醒动物的两个鼻孔中施用5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于-80℃(干冰)的样品容器中。
攻击后2天，与三价普通分裂疫苗相比，用以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂疫苗观察到了统计学显著更低的病毒脱落。
Figure BDA0000367049300000647
第49天(攻击后7天)，在鼻清洗液中没有检测到病毒。
III.3.3.实验结论
对于所有4种病毒株，与三价普通分裂疫苗相比，用以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂疫苗观察到了更高的体液应答(HI滴度)。
用A/巴拿马/2007/99免疫后，只有以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂疫苗能够显著增加针对异源株A/怀俄明/3/2003的HI滴度(在用该病毒株攻击前的交叉反应性)
脂质体制剂中的MPL/QS21在雪貂中的保护效力方面显示了增加的益处(异源攻击后更低的病毒脱落)。用脂质体中的三价分裂MPL/QS21进行抗用于攻击的漂移株的免疫后观察到的交叉反应似乎与在这些雪貂中观察到的保护作用相关。
实施例IV含有佐剂的和不含佐剂的流感疫苗在C57Bl/6初免小鼠中的临床前评价
IV.1.实验设计和目的
将异源病毒株初免的C57Bl/6小鼠用于本实验。
目的是比较由GlaxoSmithKline公司的商业化三价分裂疫苗(FluarixTM)与三价亚单位疫苗(Chiron公司的疫苗AgrippalTM)诱导的体液(HI滴度)和CMI(ICS，细胞内细胞因子染色)免疫应答以及由以含有单独的3D-MPL的脂质体、单独的DQS2l(脂质体中的QS21，即去毒的QS21)或脂质体中的MPL/QS21为佐剂的这些疫苗获得的CMI应答。在下文实施例中，从分裂的单批量(monobulks)开始制备制剂，达到与Fluarix疫苗相同组成而与商购Fluarix剂量不同。获得的制剂称作“Fluarix样”。
IV.1.1.处理/组
从荷兰的Harlan Horst获得6-8周龄的雌性C57Bl/6小鼠。在第0天用异亚型病毒株对小鼠进行初免(5μg HA完整灭活H1N1A/北京/262/95，H3N2A/巴拿马/2007/99，B/山东/7/97)。第28天，给小鼠肌内注射1，5μg HA三价分裂(A/新喀里多尼亚/20/99，A/怀俄明/3/2003，B/江苏/10/2003)普通疫苗或含有佐剂的疫苗(参见下文表4-6的分组)。
表4
组 抗原/制剂 其它处理
1 三价分裂*/普通(不含佐剂的)＝Fluarix样 异源初免D0
2 三价分裂*/含3D-MPL的脂质体 异源初免D0
3 三价分裂*/DQS21 异源初免D0
4 三价分裂*/脂质体中的MPL/QS21 异源初免D0
5 AggripalTM(亚基) 异源初免D0
6 AggripalTM(亚基)/含3D-MPL的脂质体 异源初免D0
7 AggripalTM(亚基)/DQS21 异源初免D0
8 AggripalTM(亚基)/脂质体中的MPL/QS21 异源初免D0
9 PBS 异源初免D0
*Fluarix样.16只小鼠/组
IV.1.2.制备疫苗制剂
IV.1.2.制备疫苗制剂
第1组的制剂：
将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量计入病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。搅拌5分钟后，按顺序加入病毒株H1N1、H3N2各15μg和15μg乙型病毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即施用，则储存于4℃。
第2组的制剂：
将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量计入病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。搅拌5分钟后，按顺序加入病毒株H1N1、H3N2各15μg和15μg乙型病毒株，每次加入之间搅拌10分钟。将制剂搅拌15分钟。加入含有3D-MPL的浓缩脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml，3D-MPL2mg/ml制备)达到每剂50μg的最终MPL浓度。然后将该制剂搅拌最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
第3组的制剂：
将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量计入病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。搅拌5分钟后，按顺序加入病毒株H1N1、H3N2各15μg和15μg乙型病毒株，每次加入之间搅拌10分钟。将制剂搅拌15分钟。然后加入由脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml制备)和称作“DQS21”的QS21制备的预混合物，达到每剂50μg的QS21浓度。在加入三价分裂混合物之前，该预混合物至少温育了15分钟。将该制剂搅拌最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
第4组的制剂：
将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量计入病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。搅拌5分钟后，按顺序加入病毒株H1N1、H3N2各15μg和15μg乙型病毒株，每次加入之间搅拌10分钟。将制剂搅拌15分钟。然后加入由含3D-MPL的脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml，3D-MPL2mg/ml制备)和QS21制备的混合物，达到每剂50μg的QS21和MPL浓度。在加入三价分裂混合物之前，该预混合物至少温育了15分钟。将所称的“三价分裂脂质体中的MPL/QS21”制剂最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
备注：在1-4组，加入PBS10倍浓缩液达到等渗，在终体积中是1倍浓缩。计算H2O体积，达到目标体积。
第5组的制剂：
将一剂AggripalTM与等体积PBS pH7.4。将该制剂搅拌最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
第6组的制剂：
混合PBS pH7.4和一剂AggripalTM。然后在搅拌下加入含3D-MPL的脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml，3D-MPL2mg/ml制备)，达到相当于每剂50μg MPL。将该制剂搅拌最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
备注：加入PBS，在终体积达到等渗。Aggripal是制剂体积的一半。
第7组的制剂：
混合PBS pH7.4和一剂AggripalTM。然后在搅拌下加入脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml制备)和称作“DQS21”的QS21的预混合物，达到相当于50μg QS21。在加入之前，该预混合物至少温育了15分钟。将该制剂搅拌最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
备注：加入PBS，在终体积达到等渗。AggripalTM是制剂体积的一半。
第8组的制剂：
混合PBS pH7.4和一剂AggripalTM。搅拌下在制剂中加入所谓的“DQS21-MPLin”的预混合物。DQS21-MPLin预混合物是脂质体(由DOPC40mg/ml、胆固醇10mg/ml，MPL2mg/ml制备)和免疫刺激剂QS21的混合物。在加入Aggripal/PBS混合物之前，该预混合物至少温育了15分钟。MPL和QS21在制剂中的量是各50μg。将该制剂搅拌最少15分钟，如果不立即施用，则将该制剂储存于4℃。
备注：加入PBS，在终体积达到等渗。Aggripal是制剂体积的一半。
表5：用分裂病毒株制备的制剂1-4的最终组成(对于1ml)
Figure BDA0000367049300000681
表6：用AggripalTM疫苗制备的制剂5-8的最终组成(1ml)
组 抗原 DOPC 胆固醇 MPL QS21
5 1剂Aggripal疫苗 _ _ _ _
6 与第5组相同 1mg 250μg 50μg -
7 与第5组相同 1mg 250μg - 50μg
8 与第5组相同 1mg 250μg 50μg 50μg
IV.1.3.读出结果(表7)
表7
Figure BDA0000367049300000682
In＝单个/Po＝合并物
IV.2.结果
IV.2.1.体液应答(免疫后21天的HI滴度).
HI滴度表示的体液应答-图4。
免疫后21天，检测来自每组8只动物的血清中抗三种疫苗株(A/新喀里多尼亚/20/99，A/怀俄明/3/2003，B/江苏/10/2003)的血凝反应抑制活性。
Figure BDA0000367049300000691
与PBS免疫的小鼠相比，对于所有三种病毒株(三价分裂或三价亚单位疫苗)，用测试的所有流感疫苗候选物免疫后，观察到了HI滴度的增加。
Figure BDA0000367049300000692
对于三种病毒株，与三价分裂流感普通疫苗或以含有单独的3D-MPL的脂质体为佐剂的疫苗免疫的小鼠相比，用以单独的DQS21或脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价分裂疫苗免疫的小鼠中观察到了统计学显著更高的HI滴度。体液应答的排序如下：(脂质体中的MPL/QS21＝单独的DQS21)＞(含有单独的3D-MPL的脂质体＝普通)＞PBS。
Figure BDA0000367049300000693
对于三种病毒株，与用三价分裂普通疫苗免疫的小鼠相比，在用以单独的DQS21、含有单独的3D-MPL的脂质体或脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价亚单位疫苗免疫的小鼠中观察到了统计学显著更高的HI滴度。体液应答的排序如下：(脂质体中的MPL/QS21＝单独的DQ21＝含单独的3D-MPL的脂质体)＞普通＞PBS。
当制剂不含佐剂或以单独的DQ21或脂质体中的MPL/QS21为佐剂时，三价分裂和三价亚单位疫苗诱导相似的HI滴度。
IV.2.2.细胞介导的免疫应答(免疫后第7天的ICS)。
CD4T细胞应答-图5
在免疫后第7天收获来自每组8只小鼠的PBMCs，并且在每组2只小鼠的4个合并物中测试。
在流感全病毒特异性总CD4+T细胞(表达IL-2、IFN-γ和这两种细胞因子)方面：
Figure BDA0000367049300000695
无论是何种制剂，在三价分裂和三价亚单位疫苗之间观察到了相同的CD4+T细胞应答。
Figure BDA0000367049300000701
与普通或以含单独的3D-MPL的脂质体或单独的DQ21为佐剂的三价制剂(分裂或亚单位)相比，以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价制剂(分裂或亚单位)观察到了更高的CD4+T细胞应答。
Figure BDA0000367049300000702
对于三价制剂(分裂或亚单位)诱导的细胞应答，与单独的DQ21或含单独的3D-MPL的脂质体相比，含有3D-MPL+DQS21的脂质体存在协同作用。
Figure BDA0000367049300000703
细胞应答的排序如下：脂质体中的MPL/QS21＞(含单独的3D-MPL的脂质体＝单独的DQ21＝普通＝PBS)。
IV.3.结果概括和结论
对于所有三种病毒株，与用普通三价制剂(分裂或亚单位)免疫的小鼠相比，用以单独的DQ21或脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价制剂(分裂或亚单位)免疫的小鼠中观察到了统计学显著更高的HI滴度。含单独的3D-MPL的脂质体当与三价亚单位疫苗一起配制时，似乎比与三价分裂疫苗一起配制诱导更高的体液应答。
Figure BDA0000367049300000705
无论是何种制剂，对三价分裂(Fluarix)和三价亚单位疫苗(Agrippal)获得了相似的CD4+T细胞应答。
与普通或以含单独的3D-MPL的脂质体或脂质体中单独的DQ21(DQS21)为佐剂的三价制剂(分裂或亚单位)相比，以脂质体中的MPL/QS21为佐剂的三价制剂(分裂或亚单位)诱导了更高的CD4+T细胞应答。
实施例V以脂质体制剂中的3D-MPL/QS21为佐剂的含分裂流感抗原的疫苗的临床前比较(两种不同浓度的3D-MPL)
V.1小鼠
V.1.1实验设计和目的
本实验采用异源病毒株初免的C57B1/6小鼠。目的是分析不含佐剂的GlaxoSmithKline商业化三价分裂疫苗(FluarixTM)和当以含有两种不同浓度的3D-MPL和QS21的脂质体为佐剂时诱导的体液(HI滴度)和CMI(ICS，细胞内细胞因子染色)免疫应答。
V.1.2处理/组
从荷兰的Harlan Horst获得8周龄的雌性C57B1/6小鼠。在第0天用异亚型病毒株对小鼠进行鼻内初免(完整灭活A/北京/262/95，H3N2A/巴拿马/2007/99，B/山东/7/97)。第28天，给小鼠肌内注射三价分裂(A/新喀里多尼亚/20/99，A/怀俄明，B/江苏)普通疫苗或以两种不同浓度的脂质体中的免疫刺激剂为佐剂的疫苗(参见下文表8的分组)。
表8
Figure BDA0000367049300000711
按照实施例IV制备制剂。
V.1.3结果
HI滴度表示的体液应答-图24。
免疫后21天，检测来自每组9只动物的血清中抗三种疫苗株的血凝反应抑制活性。
Figure BDA0000367049300000712
与PBS免疫的小鼠相比，对于所有三种病毒株，用测试的所有流感疫苗候选物免疫后，观察到了HI滴度的增加。
Figure BDA0000367049300000713
对于所有三种病毒株，与用三价流感分裂普通疫苗免疫的小鼠相比，用以MPL和QS21为佐剂的三价分裂疫苗免疫的小鼠中观察到了统计学显著更高的HI滴度(最大p值＝0.03)。
Figure BDA0000367049300000721
个以脂质体为佐剂的组之间没有观察到统计学显著差异。
细胞介导的免疫应答(免疫后7天的ICS)-图25
在免疫后第7天收获来自每组8只小鼠的PBMCs，并且在每组3只小鼠的3个合并物中测试。在完整流感病毒特异性CD4+T细胞(表达IL-2、IFN-γ或这两种细胞因子)方面：
从图25可以看出，用以最高浓度的免疫刺激剂为佐剂的三价分裂疫苗免疫后，获得了最高的IFN-γCD4+T细胞特异性应答。但是，两种浓度的免疫刺激剂之间，IL2和IL2+IFN-γT细胞应答是相似的。
实施例VI-以脂质体制剂中的3D-MPL/QS21为佐剂的含分裂流感抗原制剂的疫苗在年龄超过65岁的老年人群中的临床试验(两种不同浓度的3D-MPL)
VI.1.研究设计和目的
开放的随机I/II期研究，证明在老年人群(年龄65岁和以上)中施用的含各种佐剂的GlaxoSmithKline Biologicals公司的流感候选疫苗在细胞介导的免疫应答方面与在成人(18-40岁)中施用的FluarixTM(在比利时称作α-RixTM)相比，效果并不差。
分为4个平行组：
●-个对照组中的75个成人(18-40岁)接受一剂FluarixTM(Fluarix组)
●200个老年受试者(年龄65岁和以上)以3∶3∶2随机分为3组：
-一组75个受试者，接受以AS01B为佐剂的流感疫苗
-一组75个受试者，接受以AS01E为佐剂的流感疫苗
-具有50个受试者的参照流感疫苗组，接受一剂FluarixTM
第一目的
第一目的是证明在接种后21天，与在成人(18-40岁)中施用的FluarixTM相比，在老年受试者(年龄65岁和以上)中施用的含佐剂的流感疫苗在产生至少两种不同细胞因子(CD40L，IL-2，TNF-α，IFN-γ)的流感特异性CD4T-淋巴细胞频率方面，效果并不差。
第二目的
第二目的是：
1)在老年受试者(年龄65岁和以上)中肌内施用疫苗后的21天期间，评价用含有佐剂的候选流感疫苗接种的安全性和反应原性。FluarixTM用作参照。
2)评价用含有佐剂的流感候选疫苗接种后21、90和180天的体液免疫应答(抗血细胞凝集素滴度)。FluarixTM用作参照。
第三目的
第三目的是评价含有佐剂的流感疫苗接种后21、90和180天的细胞介导的免疫应答(IFN-γ，IL-2，CD40L和TNF-α的产生以及记忆B-细胞应答)。FluarixTM用作参照。
VI.2.疫苗组成和施用
采用两种不同的佐剂：
1.AS01B，含有50μg MPL和QS21的基于脂质体的佐剂
2.AS01E，AS01B的两倍稀释制剂
对照：通过IM施用全剂量的FluarixTM。
所有疫苗都意欲肌内施用。用于5种疫苗中的病毒株是WHO推荐的2005-2006北半球流感季的那些，即A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)，A/纽约/7/2004(H3N2)和B/江苏/10/2003。
用于含有佐剂的流感候选疫苗制剂中的三种灭活分裂病毒体抗原(单价批量)与用于商购FluarixTM/α-RixTM-GSK Bio的分裂病毒体灭活流感疫苗制剂中使用的活性成分完全相同。它们来源于卵生长的病毒。流感病毒株是商购FluarixTM/α-RixTM2005/2006的制剂中使用的2005/2006季推荐的那些。
用于三种疫苗中的病毒株是WHO推荐的2005-2006北半球流感季的那些，即
●A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)IVR-116
●A/纽约/55/2004(H3N2)NYMC X-157
●B/江苏/10/2003
同FluarixTM/α-RixTM类似，含有佐剂的疫苗每剂含有每种流感病毒株的15μg血细胞凝集素(HA)。
VI.2.1.以AS01B为佐剂的疫苗批次的说明
以AS01B为佐剂的流感候选疫苗是一种两组分疫苗，由玻璃管形瓶中的浓缩三价灭活分裂病毒体抗原和含有AS01B佐剂的玻璃管形瓶组成。注射时，取出佐剂管形瓶的内容物，并且注射到含有浓缩三价灭活分裂病毒体抗原的管形瓶中。混合后，将内容物抽入注射器，针头用肌内针头替换。采用的针头用肌内针头替换，体积校正到1ml。一剂重配的以AS01B为佐剂的流感候选疫苗相应于1mL。
以AS01B为佐剂的流感候选疫苗是不含防腐剂的疫苗。
VI.2.2.以AS01B为佐剂的临床批次的组成
一剂重配的以AS01B为佐剂的流感候选疫苗相应于1mL。其组成如表8所示。如同注册的
Figure BDA0000367049300000742
疫苗，它含有15μg每种流感病毒株的HA。
表8-重配的以AS01B为佐剂的流感候选疫苗的组成(流感病毒和佐剂组分)
Figure BDA0000367049300000741
VI.2.3.以AS01B为佐剂的疫苗批次的生产方法
以AS01B为佐剂的流感疫苗的制备由以下三个主要步骤组成：
●配制不含佐剂的三价最终批量(2倍浓缩)并且装入抗原容器
●制备AS01B佐剂
●以AS01B为佐剂的分裂病毒疫苗的临时重配。
配制不含佐剂的三价最终批量并且装入抗原容器
三个单价批量的体积是基于在配制之前每个单价批量中测量的HA含量并且基于1320ml的目标体积。
将浓缩的磷酸缓冲液PO4Na/K2(80μl/剂)以及Tween80、TritonX-100和α-生育酚氢琥珀酸酯的预混合物稀释在注射用水中。然后将3种浓缩的单价批量(A/新喀里多尼亚/20/99IVR-116，A/纽约/55/2004NYMC X-157，B/江苏/10/2003)连续稀释入获得的磷酸缓冲盐水/Tween80-Triton X-100-α-生育酚氢琥珀酸酯溶液(pH7.8，81mM NaCl，1.56mM KCl，4.79mM Na2HPO4，0.87mM KH2PO4，7.2mM NaH2PO4，72.8mM K2HPO4，750μg/ml Tween80，110μg/ml Triton X-100和100μg/mlα-生育酚氢琥珀酸酯)中，以便具有终浓度30μg A病毒株(H1N1、H3N2)的HA/ml三价最终批量(15μg HA/A病毒株/500μl三价最终批量)和35μg B病毒株的HA(17.5μg HA/B病毒株/500μl三价最终批量)。在加入每种单价批量之间，于室温搅拌混合物10-30分钟。在加入最后一种单价批量后，搅拌15-30分钟，检查pH，并用HCl或NaOH将pH调节至7.65±0.25。
抗原的三价最终批量无菌分装入3-ml无菌I型(欧洲药典)玻璃瓶中。每瓶含600μl体积(500μl+90μl过充)。
制备AS01B佐剂批量并且装入佐剂容器
通过混合两种组分：QS21和含有MPL的脂质体，制备佐剂AS01B。这些组分的每一种组分的制备概括如下：
QS21是一种三萜烯糖苷，获自皂树的树皮，由Aquila Worchester，MA，USA(现在是Antigenics)生产。
QS21是作为冻干粉末提供给GSK Biologicals公司的。GSKBiologicals公司对QS21的制备由以下步骤组成：以大约5mg/mL的浓度将QS21粉末悬浮于注射用水中，pH调节到pH6.0±0.2，并且进行灭菌过滤。将液体批量QS21于-20℃下储存于聚乙烯容器中。
MPL是通过来自明尼苏达沙门氏菌的Re595株的脂多糖的顺序酸和碱水解获得的3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂质A。它由GSK Biologicals，Hamilton，Montana生产。批量MPL是作为三乙胺(TEA)的冻干盐提供的。
在制备含MPL的脂质体过程中，将DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)、胆固醇和MPL溶解于乙醇中。通过真空下蒸发溶剂，形成脂质膜。加入pH6.1的磷酸缓冲液(9mM Na2HPO4，41mM KH2PO4，100mM NaCl组成)，使混合物进行预先匀化，然后在15,000psi压力下进行高压匀化(+/-20个循环)。这导致产生脂质体，所述脂质体在无菌(100型)区域中通过0.22μm膜灭菌过滤。然后在无菌玻璃容器中分装无菌产物，并且在冷室中保存(+2-+8℃)。
将脂质体的无菌批量制品与无菌QS21批量溶液混合。搅拌30分钟后，将混合物加入注射用水和稀释10倍的磷酸盐500mM，NaCl1MpH6.1的混合物。计算稀释10倍时的磷酸盐500mM，NaCl1M pH6.1的量，达到在最终体积中等渗。检查pH。然后对佐剂进行灭菌过滤(0.22μm)，并且无菌分装到管形瓶中。管形瓶在+2-+8℃下保存。
AS01B稀释液是乳白色液体，不含外来颗粒，装在无菌1型玻璃管形瓶中。每个管形瓶的目标填充量是0.7ml，以满足规定(≥0.5ml)。
以AS01B为佐剂的分裂病毒疫苗的临时重配
注射时，取出含佐剂的管形瓶的内容物，并且注射到含有浓缩三价灭活分裂病毒体抗原的管形瓶中。混合后，将内容物抽入注射器，采用的针头用肌内针头替换，体积校正到1ml。一剂重配的以AS01B为佐剂的流感候选疫苗相应于1mL。
VI.2.4.以AS01E为佐剂的疫苗批次的说明
以AS01E为佐剂的流感候选疫苗是一种3组分疫苗，由玻璃管形瓶中的浓缩三价灭活分裂病毒体抗原、含有AS01B佐剂的玻璃管形瓶和含有稀释剂(注射用氯化钠溶液)的管形瓶组成，所述稀释剂用于对AS01B进行两倍稀释。
为了制备AS01E佐剂，用注射器抽出稀释剂管形瓶的内容物，注射到含有AS01B佐剂的管形瓶中，然后混合。注射时，用注射器从AS01E管形瓶抽出600μl AS01E佐剂，注射到含有浓缩三价灭活分裂病毒体抗原的管形瓶中。混合后，将内容物抽入注射器，针头用肌内针头替换。一剂重配的以AS01B为佐剂的流感候选疫苗相应于1mL。
以AS01E为佐剂的流感候选疫苗是不含防腐剂的疫苗。
VI.2.5.以AS01E为佐剂的临床批次的组成
一剂重配的以AS01E为佐剂的流感候选疫苗相应于1mL。其组成如表9所示。如同注册的
Figure BDA0000367049300000772
疫苗，它含有15μg每种流感病毒株的HA。
1.表9-重配的以AS01E为佐剂的流感候选疫苗的组成(流感病毒和佐剂组分)
Figure BDA0000367049300000771
VI.2.6.以AS01E为佐剂的疫苗批次的生产方法
以AS01B为佐剂的流感疫苗的制备由以下三个主要步骤组成：
●配制不含佐剂的三价最终批量(2倍浓缩)并且装入抗原容器
●制备AS01B佐剂
●制备以AS01E为佐剂的流感疫苗，然后是以AS01E为佐剂的分裂病毒疫苗的临时重配。
配制不含佐剂的三价最终批量并且装入抗原容器
参照V.2.3部分对以AS01B为佐剂的流感疫苗的描述。
制备AS01B佐剂批量并且装入佐剂容器
参照V.2.3部分对以AS01B为佐剂的流感疫苗的描述。
以AS01E为佐剂的分裂病毒疫苗的临时重配
为了制备AS01E佐剂，用注射器抽出稀释剂管形瓶的内容物，注射到含有AS01B佐剂的管形瓶中，然后混合。注射时，用注射器从AS01E管形瓶抽出600μl AS01E佐剂，注射到含有浓缩三价灭活分裂病毒体抗原的管形瓶中。混合后，将内容物抽入注射器，针头用肌内针头替换。一剂重配的以AS01B为佐剂的流感候选疫苗相应于1mL。
每名受试者进行4次预定随访：于0、21、90和180天的每次随访时收集血样，以评价免疫原性。
接种程序：在第0天进行1次流感疫苗注射。
VI.2.7免疫测定
血凝反应抑制测定
使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，亚特兰大，美国(1991)描述的方法通过检测血凝反应抑制(HI)抗体测定免疫应答。使用4个血凝反应抑制单位(4HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬浮液，用标准的和综合验证过的微量法对解冻的冷冻血清样品进行抗体滴度检测。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。评价所获血清的HI抗体水平。以1∶10起始稀释度开始制备连续稀释度(乘以因数2)，直至最终稀释度1∶20480。把显示完全抑制(100％)血凝反应的最高稀释度步骤视为滴定终点。所有实验都以双份进行。
通过细胞因子流式细胞术(CFC)评价细胞因子的频率-阳性CD4或CD8T淋巴细胞
如果与对应抗原温育，外周血抗原特异性CD4和CD8T细胞可在体外被再刺激，以产生CD40L、IL-2、TNF-α和IFN-γ。因此，抗原特异性CD4和CD8T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞术计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8T细胞的频率。
用ELISPOT评价记忆B-细胞的频率
B细胞Elispot技术使得能够进行特定抗原的特异性记忆B细胞的定量。用CpG培养5天后，记忆B细胞可以在体外诱导分化成浆细胞。因此，可以用B-细胞elispot测定计数体外产生的抗原特异性浆细胞。简言之，在抗原包被的培养板中温育体外产生的浆细胞。抗原特异性浆细胞将形成抗体/抗原斑点，其可以通过常规免疫-酶程序检测。在本研究中，用流感疫苗株或抗人免疫球蛋白包被培养板，以分别计数抗流感或分泌IgG的浆细胞。结果表示为一百万个产生IgG的浆细胞中的抗原特异性浆细胞的频率。
PBMCs的解释性表征
可以进行选择的表面活性剂/激活标记物(即CD4，CD8，CD45RO，CD45RA，CD28，CD27或一些KIR)的表达。通过分析细胞因子(T辅助细胞1或T辅助细胞2细胞因子)的归巢标记物(即CCR7、CXCR5)，或通过分析与诸如Foxp3、CTLA-4或TGFβ的调节功能相关的因子的表达，可以解决疫苗诱导的T淋巴细胞的功能。具体地，可以通过对疫苗抗原的体液、B和T细胞应答，分析CD8+CD28-群体或其它调节性T细胞群体。
VI.3.免疫原性结果
VI.3.1.CMI终点知结果
为了表征用含有佐剂的流感疫苗接种后的CMI应答，用来自三种疫苗株的抗原(单独或合并使用)的抗原体外再刺激CD4和CD8T-淋巴细胞。流感特异性CD4/CD8T细胞在常规免疫荧光标记胞内细胞因子(IL-2，IFN-γ，TNF-α和CD40L)生产后通过流式细胞术计数。
主要终点的评价
第21天：所有受试者中在产生至少两种不同细胞因子(IL-2，IFN-γ，TNF-α和CD40L)的测试中每106个细胞中流感特异性CD4T-淋巴细胞频率方面的CMI应答。
对于CMI应答的评价，如下分析流感特异性CD4的频率：
采用同等方法，当几何平均值(GM)比(FluarixTM(18-40岁)组和含有佐剂的流感候选疫苗(≥65岁组)之间在第21天时产生至少两种细胞因子的流感特异性CD4T-细胞的频率方面)的两侧98.75％置信区间的上限低于2.0时，与FluarixTM(施用于18-40岁的成人-称作“年轻人流感”或“Flu YNG”的组)，至少一种含有佐剂的流感候选疫苗(施用于≥65岁的老年人-称作“老年人流感”或“Flu ELD”的组)并没有表现出更差。
Figure BDA0000367049300000801
用协变量分析(ANCPVA)模型，对频率的1og10转换结果计算接种后21天的GM比的98.75％CI。ANCOVA模型包括作为固定效果的疫苗组(FluarixTM(18-40岁)组与含有佐剂的流感候选疫苗(≥65岁))和作为回归量的接种前频率。GM比及其98.75％CI来源于模型中相反的对应组的指数转换。调整的GM的98.75％CI通过以上ANCOVA模型的组最小平方法的98.75％CI的指数转换获得。
结果-推理分析(表10)
在用“合并的抗原II”体外再刺激后于第21天产生至少两种细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和CD4OL)的流感特异性CD4T-淋巴细胞的调整的GM和GM比示于表10。对于每种含佐剂的流感疫苗，GM比的双侧98.75％CI的上限远低于2.0的临床限度。这表明与施用于18-40岁的成人的FluarixTM疫苗相比，施用于老年受试者的两种含有佐剂的流感疫苗在流感特异性CD40的接种后频率方面没有表现出更差。
1.1.1.1.1.1.1.1.表10用合并的疫苗抗原再刺激后第21天产生至少两种细胞因子的流感特异性CD4的调整的GM比(免疫原性的ATP队列)
Figure BDA0000367049300000802
Figure BDA0000367049300000811
调整的GM＝根据基线滴度调整的几何平均抗体；N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目；98.8％CI＝调整的GM比的98.8％置信区间(Ancova模型：对基线调整)；LL＝上限；UL＝下限。数据来源＝附表IIIA
结果-描述性分析(图6)
主要发现是：
1)接种前CMI应答在年轻人中比在老年人中高
2)接种后：
-流感疫苗对年轻成人(18-40岁)中的CMI应答有加强作用
-在已接受含有佐剂的流感疫苗的老年人中的CMI应答与年轻成人中的CMI应答相当。
对于所有测试，与FluarixTM相比，接种前和接种后针对所研究的所有细胞因子(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)的CD4T淋巴细胞应答的差异在采用含有佐剂的疫苗时都显著较高。
分析第三目的
为了评价第三终点，在第0、21、90和180天检测流感特异性CD4/CD8T-淋巴细胞和记忆B细胞的频率。
●总结了对于每种抗原、每个接种组在第0和21天的流感特异性细胞因子阳性CD4/CD8T-淋巴细胞的频率(描述性统计)。
●非参数检验(Wilcoxon检验)用于对比两个组之间的差异定位(含有佐剂的流感疫苗与FluarixTM)，计算在各个测试中针对每种抗原的统计学p-值。
●在各个不同的测试中针对每个接种组和每种抗原进行21天/0天(接种后/接种前)应答之间的个体差异的描述性统计。
●非参数检验(Wilcoxon检验)用于对比个体差异(接种后/接种前接种)，计算每个不同检验中每种抗原的统计学p-值。
用于对比流感特异性CD4T-淋巴细胞频率差异的Wilcoxon检验的p-值示于表11。
结果-评价第三终点(表11)
主要结论是：
●流感特异性CD4的接种前GM频率在所有老年受试者组中都是相似的，但在18-40岁的成人中较优。
●与FluarixTM相比，在用含有佐剂的疫苗接种后，流感特异性CD4T淋巴细胞的接种后(第21天)频率显著较高。
●与接种FluarixTM的18-40岁成人相比，接种以AS01B或AS01E为佐剂的疫苗的老年受试者接种后的流感特异性CD4T淋巴细胞的接种后频率保持较低。
●流感特异性CD8T细胞的接种前和接种后GM频率在所有组中都基本相似。
表11推论性统计：由Kruskal-Wallis检验获得的CD4T细胞在各个时间点的p-值(免疫原性的ATP队列)
Figure BDA0000367049300000821
结果-评价体液免疫应答终点
观测变量：
在第0、21、90和180天：血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度，针对疫苗中提供的3种流感病病毒株的每一种单独测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B抗体)。
抗所有疫苗抗原的HI抗体的截止值在分析前由实验室确定(等于1∶10)。血清阴性受试者是抗体滴度低于截止值的受试者。血清阳性受试者是抗体滴度大于或等于截止值的受试者。低于测定截止值的抗体滴度以截止值一半的任意值给出。
基于HI抗体滴度，计算以下参数：
●在第0天和21天的HI抗体的几何平均滴度(GMTs)，采用对数滴度转换平均值的反对数计算。
●第21天时的血清转变因子(SF)，定义为相比于第0天在第21天时血清HI GMTs的增加倍数。
●第2l天时的血清阳转率(SC)，定义为接种前HI滴度＜1∶l0且接种后滴度≥1∶40的接种者百分率，或接种前滴度≥1∶10且接种后滴度有最少达4倍增加的接种者百分率。
●第2l天时的血清保护率(SPR)，定义为血清HI滴度≥1∶40的接种者的百分率。
分别获得每个组的GM的95％CI。首先获得对数转换滴度平均值的95％CI，假定对数转换滴度以未知方差正态分布。然后通过对数转换滴度平均值的95％CI的指数转换获得GM的95％CI。
具体抗体检测的缺失的血清学结果不被替换。因此，在给定时间点无血清学结果的受试者不影响该时间点的测定分析。
体液免疫应答结果(图7和表12)
全部3种疫苗株的HI抗体的接种前GMTs在4个治疗组中都处于相同范围内。在接种后，相比于相同群体中的标准Fluarix，增加老年人中的体液应答的2种佐剂有明显的作用(图7，以线性刻度示出，如果以对数刻度显示，明显是相同影响)。
GMTs是
·对于AS01E，针对H1N1的GMT显著较高，
·对于两种佐剂，针对H3N2的GMT显著较高。
·在接受含有佐剂的两组受试者之间，没有观察到接种后GMTs方面的显著差异。
接种后21天，Fluarix(18-40岁)的受试者对新喀里多尼亚和B/江苏株的HI应答较高。
如表12所示，在60岁以上的受试者中，含有佐剂的流感疫苗超出了欧洲官方对每年注册的分裂病毒体流感疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度病毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。
在接种后，就HI抗体的血清保护率而言，Fluarix(≥65岁)组和以下组具有统计学差异：
·对于A/新喀里多尼亚株的Flu/AS01B和Flu/AS01E
对于各个疫苗株，2种含有佐剂的流感疫苗组的血清保护率相比于Fluarix(18-40岁)组处于相同范围内。
对于各个疫苗株，2种含有佐剂的流感疫苗组的血清阳转率相比于Fluarix(18-40岁)组处于相同范围内，新喀里多尼亚株除外。
表12在第21天的血清保护率、血清阳转率和转变因子(免疫原性的ATP队列)
Figure BDA0000367049300000841
Figure BDA0000367049300000851
N＝受试者总数；％＝在21天时滴度处于特定范围内的受试者百分率；CI＝置信区间
VI.3.2.免疫原性结论
●相比于18-40岁的成人，老年人中的流感特异性CD4的接种前频率明显较差。在用FluarixTM接种后，相比于年轻人，老年人中的接种后频率(第21天)仍较差。相反，相比于在l8-40岁成人中用FluarixTM接种，在用含有佐剂的疫苗接种老年受试者后表现出的流感特异性CD4的接种后频率并不差。
●关于HI抗体滴度方面的体液免疫应答，所有流感疫苗都满足欧洲官方对每年注册的流感灭活疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度病毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。在老年人中，含有佐剂的疫苗介导至少一种趋势：针对流感血细胞凝集素的体液免疫应答比FluarixTM高。表13总结了相比于FluarixTM在老年受试者中由含有佐剂的疫苗介导的针对每种疫苗株的体液免疫应答之间的显著差异。相比于用FluarixTM接种的18-40岁成人，用含有佐剂的疫苗接种的老年受试者显示出一种趋势：在第21天时抗A/纽约株的接种后GMTs和血清转变因子较高。
表13在相同群体中，与Fluarix相比，在接种不同的含有佐剂的疫苗的老年受试者中观察到显著更高的体液免疫应答(基于非重叠的95％CI)的流感病毒株
Figure BDA0000367049300000861
接种后GMT＝接种后的几何平均滴度
VI.4反应原性结论
VI.4.1.不良事件的记录(AE）
记录在7天随访期(接种日和随后的6天)当中出现的主诉症状(参见表14)。还记录了在21天随访期(接种日和随后的20+3天)当中出现的主诉症状。如在表15中所述，评价以下AE的强度。
表14主诉的局部/全身不良事件
Figure BDA0000367049300000862
注意：体温在晚上记录。在一天中的其它时间应另外进行体温检测，记录最高体温。
表15成人中主诉症状的强度等级
Figure BDA0000367049300000871
*发热定义为腋下体温≥37.5℃(99.5°F)
局部注射部位发红/肿胀的最大强度如下记录：
0是0mm；1是＞0至≤20mm；2是＞20至≤50mm；3是＞50mm。
如下记录发热的最大强度：
1是＞37.5至≤38.0℃；2是＞38.0至≤39.0℃；3是＞39.0℃。
研究者针对所有其它AE进行强度判断，其它AE即主诉的症状，包括在研究当中报告的SAE。评价基于研究者的临床判断。记录的每种AE的强度指定为以下的一种类别：
1(轻微)＝受试者容易耐受的AE，引起最低的不适，且不干扰每天的活动；
2(中等)＝不适足以干扰每日正常活动的AE；
3(严重)＝阻碍每日正常活动的AE(在成人/青少年中，这种AE例如会阻碍上班/上学，应必须给予正确的治疗)。
VI.4.2.记录不良事件(AE)
在老年人中，就局部和全身症状这二者来说，发现采用含有佐剂的疫苗观察到的反应原性比用FluarixTM观察到的高。症状的发病率和强度在用含有佐剂的疫苗接种后都增加(图8)。3级症状表现出一种趋势：与接受以较低浓度的免疫刺激剂为佐剂的疫苗的组相比，在接受以最高浓度的免疫刺激剂(MPL，QS21)为佐剂的疫苗的组中较高。但是，在所有情况下，症状都快速消退。
实施例VII：含有佐剂的HPV疫苗在小鼠中的临床前评价
该研究采用来自人乳头瘤病毒(HPV)的二价抗原性组合物，其组合了从HPV16的L1和HPV18的L1形成的病毒样颗粒(VLPs)作为抗原。研究的目的是比较当与AS01B和AS01B的1/5稀释液一起配制时，这种抗原性制剂的效力，所述稀释液是以GSK的宫颈癌疫苗中的佐剂AS04(明矾上的MPL)为基准的。
VII.1-接种
在第0和28天，用疫苗制剂注射小鼠(n＝每组12只)，所述疫苗制剂包含来源于Hi-580/80L方法，并且用1/10和1/50人剂量的AS04(用明矾配制的50μg MPL)或AS01B(0.5ml中的50μg QS21-50μgMPL)配制的HPV16/18L1(各2μg或0.5μg)。由于实验是在小鼠中进行的，1/10人剂量可以等同于AS01B人制剂，即，0.5ml中的50μg QS21和50μg MPL，并且1/50可以认为是AS01B人制剂的1/5稀释液，即0.5ml中的10μg QS21和10μg MPL。在第II剂后14和45天采取血样，以测定个体血清中总的抗L1型特异性抗体。在第II剂后7天和14天对PBMC测量细胞因子染色，在第II剂后45天用脾细胞进行。在第II剂后45天用脾细胞测量VLPs特异性记忆B细胞的频率。
VII.2-抗-HPV16/18L1ELISA
用VLP-16和VLP-18作为包被抗原，通过ELISA完成抗VLP-16抗体和抗VLP-18抗体的定量。以0.5μg/ml的终浓度，用PBS稀释所述抗原，且在4℃使该抗原过夜吸附到96孔微量滴定板(MaxisorbImmuno-plate，Nunc，丹麦)的各孔中。然后，使所述板与包含1％牛血清白蛋白的PBS(饱和缓冲液)在37℃温育1小时。将稀释于含有PBS+0.1％Tween20+1％BSA的缓冲液中的血清加入HPV L1包被的板中，37℃下温育1小时30分钟。用PBS0.1％Tween20洗涤所述板四次，并往每个孔中添加用饱和缓冲液以1/1000稀释的生物素缀合的抗小鼠Ig(Dako，UK)，且在37℃将其温育1小时30分钟。在一个洗涤步骤之后，加入用饱和缓冲液以1/3000稀释的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶复合物(Dako，UK)，并在37℃再温育30分钟。如上所述洗涤所述板，并将其与一种溶液室温下20分钟，所述溶液为0.04％的邻苯二胺(Sigma)和0.03％H2O2溶于0.1％Tween200.05M柠檬酸缓冲液pH4.5中的溶液。用2N的H2SO4终止该反应，并在492/620nm读数。用SoftmaxPro(用一个四参数方程)，从参照来计算ELISA效价，并以EU/ml表示。
VII.3-细胞内细胞因子染色(ICS)
在第II剂后7天和14天对PBL进行T细胞的细胞内细胞因子染色，并且在第二次免疫后45天进行对脾细胞进行上述染色。从小鼠采集PBMCs(1个合并物/组)或脾细胞(每组3个器官的4个合并物)。用VLP16或18，(5μg/ml)+CD49d CD28抗体(1μg/ml)，以5×106个细胞/ml(96孔微量滴定板)的终浓度进行脾细胞的体外抗原刺激，然后37℃下温育3小时。抗原再刺激步骤后，37℃下在布雷菲德菌素(1μg/ml)存在下将细胞温育过夜，以抑制细胞因子分泌。如下进行细胞染色：洗涤细胞悬浮液，重悬于50μl含有2％Fc阻断试剂(1/50；2.4G2)的PBS1％FCS中。4℃下温育10分钟后，加入50μl抗-CD4-APC(1/50)和抗-CD8perCp(1/50)的混合物，4℃下温育30分钟。在PBS1％FCS中洗涤后，通过重悬于200μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)中使细胞透化，4℃下温育20分钟。然后用Perm Wash(Kit BD)洗涤细胞，重悬于50μl稀释于PermWash中的抗-IFγAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)。4℃下温育2小时后，用Perm Wash洗涤细胞，重悬于PBS1％FCS+1％低聚甲醛中。通过FACS进行样品分析。门控(FSC/SSC)活细胞，对约20,000个事件(淋巴细胞)进行采集。针对CD4+和CD8+门控的群体计算IFN-γ+或IL2+的百分率。
VII.4-B记忆细胞
第二次免疫后45天，处死小鼠，通过lymphoprep梯度(Cedarlane)分离脾细胞。然后将B细胞重悬于含有添加剂(丙酮酸钠1mM、MEM非必须氨基酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺和β-2巯基乙醇)、5％胎牛血清、50U/ml rhIL-2(eBioscience)和3μg/ml CpG的RPMI1640培养基(Gibco)。在每个平底6孔的5ml中以106个细胞/ml的终浓度培养细胞5天。乙醇活化步骤后，用10μg/ml VLPs或用1/200稀释于PBS中的山羊抗小鼠Ig(GAM；Sigma)包被硝酸纤维素板(Multiscreen-IP；Millipore)。用完全培养基进行饱和的步骤后，将100μ12×106个细胞/ml加入VLPs包被的板，并且将100μl106和5×105个细胞/ml加入GAM板。37℃下温育2小时的时间后，4℃下将平板保存过夜。用PBS0.1％Tween20将板洗涤4次，将1/200稀释于PBS1％BSA5％FCS(稀释缓冲液)中的抗小鼠Ig Biot分布到板上，37℃下温育2小时。洗涤步骤后，加入1/550稀释于稀释缓冲液中的Extravidin HRP(Sigma)，37℃下持续额外的1小时。按照上文洗涤平板，室温下用AEC溶液(Sigma)温育10分钟。通过用自来水轻柔冲洗平板，终止反应。当平板干燥后，用KS400读数。
VII.5-统计分析
用单因素方差分析(ANOVAl)比较配制方法。为了标准化目的，对1og10转换数据进行分析。当检测到处理平均值之间的显著差异时(p-值≤0.05)，以0.5的显著性水平进行平均值之间的逐对比较(Student-Newman-Keuls多重比较检验)。
VI1.6结果
按照上文VII.1免疫小鼠。采用以下组：
Figure BDA0000367049300000911
VII.6.体液应答
对于抗HPVl6-L1抗体滴度或抗HPVl8-L1抗体滴度，采用任一种佐剂稀释液，对于两种测试的抗原剂量，没有观察到显著剂量范围(图9)。
对于抗HPVl6-L1抗体滴度，无论抗原剂量如何，对于每种佐剂测试的两种剂量，没有观察到显著剂量范围。
当观察抗HPVl8-Ll抗体滴度时，在第二剂后14天测量，与ASOlB(1/5OHD)相比，对ASOlB(l/lOHD)观察到了滴度的略微增加(2.5倍剂量范围，p值＝0.0035)，但是仅仅对2μg抗原观察到了该范围，对0.5μg抗原没有观察到该范围(P值＝0.0867)。到第II剂后45天，无论抗原剂量如何，对于每种佐剂测试的两种剂量，没有观察到显著剂量范围。
VII.6.2细胞应答
细胞内细胞因子染色
无论HPV18-L1的佐剂剂量如何，对测试的两种抗原剂量，没有观察到抗原的剂量范围效果。用含有不同剂量佐剂的两种测试抗原剂量获得了相似频率的VLP16特异性CD4+T细胞(图10)。
与AS01B(1/50HD)相比，对AS01B(1/10HD)观察到了轻微的剂量效果(对于HPV18-L1是2.6倍，p值＝0.0009，对于HPV16-L1是2倍，P值＝0.0187)，但是仅仅对2μg抗原观察到了该范围，对0.5μg抗原没有观察到该范围。
特异性B记忆细胞
无论HPV16或18L1的佐剂的剂量如何，对两种测试的抗原剂量没有观察到抗原的剂量范围效果(图11)。
无论HPV17或18l1的佐剂的剂量如何，对两种测试的抗原剂量没有观察到抗原的剂量范围效果。
从上述结果可以看出，AS01B的1/5稀释液产生了在免疫组合物中与AS01B自身具有等同效力的制剂。
实施例VIII：含有佐剂的肺炎链球菌疫苗在小鼠中的临床前评价
用于本研究中的肺炎球菌疫苗是11价的含有佐剂的肺炎球菌缀合物疫苗(11PCV/AS)，其由以AS01B或AS01E为佐剂的11种肺炎球菌多糖缀合物的混合物组成。缀合物由肺炎链球菌血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F的纯化多糖组成，其各自缀合于载体蛋白，所述载体蛋白是白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)或流感嗜血杆菌的蛋白D(PD)。疫苗作为冻干粉末存在，将要用液体佐剂之一重配。
如下生产11PCV/AS：
活化和偶联条件对于每种多糖是特异性的。这些条件如下表所示。将一定大小的多糖(除PS5、6B和23F外)溶解于NaCl2M中或注射用水(WFI)中。对于所有血清型，评价最佳多糖浓度。将除血清型18C外的所有血清型直接与载体蛋白缀合，如下文的详细描述。
从乙腈或乙腈/水50％/50％溶液中的100mg/ml原液，将CDAP(CDAP/PS比：0.75mg/mg PS)加入多糖溶液。1.5分钟后，加入0.2M-0.3M NaOH，获得特定活化pH。25℃下在3分钟的时间中在此pH下进行多糖的活化。在活化的多糖中加入纯化的蛋白(蛋白D或DT)(其量取决于最初PS/载体蛋白比)，在pH调节下，于特定pH进行偶联反应，最多达2小时(取决于血清型)。为了猝灭未反应的氰酸酯的酯基团，随后将2M甘氨酸溶液加入混合物中。将pH调节至猝灭pH(pH9.0)。25℃下将该溶液搅拌30分钟，然后2-8℃下连续缓慢搅拌过夜。
18C的制备：
通过接头，即己二酸二酰肼(ADH)将18C连接于载体蛋白。
缀合前，对多糖血清型18C进行微流化。
用EDAC衍生破伤风类毒素
为了衍生破伤风类毒素，以25mg/ml将纯化的TT稀释于0.2MNaCl中，加入ADH间隔物，以便达到0.2M的终浓度。当间隔物完全溶解时，将pH调节到6.2。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)，达到0.02M的终浓度，pH调节下将混合物搅拌1小时。通过在25℃下将pH增加到最多9.0至少30分钟，终止缩合反应。然后，渗滤(10kDa CO膜)衍生的TT，以便除去残留的ADH和试剂。
最后对TTAH批量进行灭菌过滤，直到偶联步骤，并且在-70℃下保存。
TTAH与PS18C的化学偶联
缀合参数的细节可以见表1。
以确定的浓度将2克微流化的PS稀释于水中，通过添加NaCl粉末，调节到2M NaCl。
加入CDAP溶液(100mg/ml，在50/50v/v乙腈/WFI中新制备)，达到合适的CDAP/PS比。
通过加入0.3M NaOH，使pH升高到活化pH9.0，在此pH稳定，直到加入TTAH。
3分钟后，加入衍生的TTAH(20mg/ml，溶于0.2M NaCl)，达到TTAH/PS比为2；调节pH，达到偶联pH9.0。静止溶液1小时，直到pH调节。
为了猝灭，在混合物PS/TTAH/CDAP中加入2M甘氨酸溶液。
将pH调节到猝灭pH(pH9.0)。
25℃下将溶液搅拌30分钟，然后2-8℃下连续缓慢搅拌过夜。
缀合物的纯化：
采用0.15M NaCl平衡的Sephacryl500HR凝胶过滤柱(对于18C是S500HR)，通过凝胶过滤纯化缀合物，以除去小分子(包括DMAP)和未缀合的PS和蛋白。基于反应组分的不同分子大小，首先洗脱PS-PD、PS-TT或PS-DT，然后是游离PS，然后是游离PD或游离DT，最后是DMAP和其它盐(NaCl，甘氨酸)。
通过UV280nm检测含缀合物的级分。根据Kd合并级分，灭菌过滤(0.22μm)，在+2-8℃下保存。确定缀合物制剂中的PS/蛋白比。
PS肺炎链球菌-蛋白D/TT/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件
Figure BDA0000367049300000941
Figure BDA0000367049300000951
然后将11种缀合物混合在一起，在免疫前将最终的抗原性制剂与合适的佐剂混合。
在第0、14和28天用AS01B或AS01E配制的0.1μg11价PS缀合物肌内免疫各组的40只雌性4周龄Balb/c小鼠。通过对第42天采集的血清进行ELISA，测量抗-PS IgG抗体。
如图12所示，与除PS14(其中用AS01B观察到了更高的应答)和PS19F(其中用AS01E观察到了更高的应答)之外的AS01B制剂相比，在稀释的AS01E制剂中观察到了相似的应答。
实施例IX：含有佐剂的和不含佐剂的巨细胞病毒免疫原性组合物的临床前评价
IX.1：豚鼠
IX.1.1Elisa抗-gB
采用gB作为包被抗原，通过Elisa进行抗-gB抗体的定量。以4μg/ml的最终浓度在PBS中稀释抗原，4℃下在96孔微量滴定板中将100μl温育过夜。然后37℃下用200μl含1％牛血清白蛋白的PBS使平板饱和1小时。加入血清的两倍系列稀释液(100μl/孔)，37℃下温育1小时30分钟。用PBS0.1％Tween20洗涤平板4次，在每孔中加入100μl辣根过氧化物酶抗豚鼠IgG(Dako，UK)，37℃下温育1小时30分钟。用PBS0.1％Tween20洗涤平板4次，用水洗涤1次。然后22℃下用0.1M柠檬酸缓冲液pH4.2中的100μl邻苯二胺(Sigma)溶液温育20分钟。用100μl H2SO42N终止反应，在490/620nm下读数。通过SoftMaxPro，从参照样品内推OD值，确定Elisa滴度。滴度以EU/ml表示。
用UNISTAT对第二次免疫后14天的Elisa数据进行统计分析。用于方差分析的方案可以简要描述如下：
1)数据的对数转换
2)为了证实正态性，对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验。
3)为了证实不同群体(组)之间变量的均质性，进行Cochran检验。
4)对选定的数据进行方差分析(单因素)
5)用于多重比较的Tuckey-HSD检验。
IX.1.2中和测定
测定前，在96孔微量滴定板中分布MRC5细胞(10000个细胞/200μl MEM培养基)，37℃下用CO2温育3天。实现灭活(56℃下30分钟)血清的两倍稀释，37℃下用100μl病毒溶液(800/ml)温育1小时。温育后，将100μl血清/病毒混合物接种在含有MRC5单层的96孔微量滴定板中。35℃下在2000RPM将平板离心1小时。37℃下温育过夜后，用80％丙酮溶液固定平板(-20℃下20分钟)。弃去丙酮溶液，37℃下用特异性单克隆抗立即早期抗原检测CMV阳性细胞1小时。用PBS洗涤平板三次，在每个孔中加入生物素缀合的抗小鼠IgG，37℃下温育1小时。洗涤步骤后，37℃下加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶额外的30分钟。洗涤平板4次，用True-blue溶液温育10分钟。通过显微镜检查，记录特异性有色信号。中和滴度表示为与病毒对照(不含血清的CMV+细胞)相比，导致CMV阳性细胞减少50％的血清最高稀释度的倒数。
IX.1.3免疫方案
免疫了4组。每组含有8只5-8周龄的雌性Hartley Crl：(ha)豚鼠，但是对照组(第4组)仅仅有4个受试者。第0和28天对受试者进行肌内免疫。第一次免疫后28天和第二次免疫后14天采集血清样品。按照上文所述，对第一次免疫后28天和第二次免疫后14天的血清进行Elisa。按照上文的描述，在第二次免疫后14天进行中和测定。各组如下：
Figure BDA0000367049300000971
如下制备抗原：疫苗抗原在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达为gB**，即一种截短的嵌合体，其N和C-末端含有来自单纯疱疹病毒2(HSV2)的糖蛋白gD的肽序列的截短嵌合体。gB**在其含有膜锚定序列的C-末端结构域截短，因此分泌到培养物上清液中。
对于前三组，肌内注射在500μl PBS、AS01B或AS01E(按照上文实施例II.2制备)中制备的15μg gB**。在第4组，肌内施用单独的PBS。
IX.1.4结果
如图13所示，与gB普通疫苗相比，两个含有佐剂的组观察到了显著更高的抗gB ELISA滴度(gB/AS01B以及gb/AS01E分别高8和5.5倍)。与gB/AS01E组相比，第II剂后的抗体滴度在gB/AS01B组中非常微小地更高(1.5倍)。
多重比较：Tuckey-HSD
Figure BDA0000367049300000972
普通＜AS01E＝AS01B
在中和滴度方面(图14)：
●在gB普通组中没有观察到特异性中和抗体
●在两个含有佐剂的组中都检测到了特异性中和抗体
●在两个含有佐剂的组中观察到了相似水平的中和抗体。
IX.2小鼠
IX.2.1ELISA抗gB
采用gB作为包被抗原，通过ELISA进行抗-gB抗体的定量。以1μg/ml的最终浓度在PBS中稀释抗原，4℃下在96孔微量滴定板中将100μl温育过夜。然后37℃下用200μl含1％牛血清白蛋白的PBS使平板饱和1小时。加入血清的两倍系列稀释液(100μl/孔)，37℃下温育1小时30分钟。用PBS0.1％Tween20洗涤平板4次，在每孔中加入l00μl辣根过氧化物酶，37℃下温育额外的30分钟。用PBS0.1％Tween20洗涤平板4次，用水洗涤1次。然后22℃下用0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8中的100μl四甲基联苯胺75％温育20分钟。用100μlH2SO40.4N终止反应，在450/620nm下读数。通过SoftMaxPro，从参照样品内推OD值，确定Elisa滴度。滴度以EU/ml表示。
用UNISTAT对第二次免疫后14天的Elisa数据进行统计分析。用于方差分析的方案可以简要描述如下：
数据的对数转换
2)为了证实正态性，对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验。
3)为了证实不同群体(组)之间变量的均质性，进行Cochran检验。
4)对选定的数据进行方差分析(单因素)
5)用于多重比较的Tuckey-HSD检验。
IX.2.2中和测定
测定前，在96孔微量滴定板中分布MRC5细胞(10000个细胞/200μl MEM培养基)，37℃下用CO2温育3天。将灭活(56℃下30分钟)血清的两倍稀释液(60μl)37℃下用60μl病毒溶液(800IPU/ml)温育1小时。温育后，将100μl血清/病毒混合物接种在含有MRC5细胞的96孔微量滴定板中。35℃下在2000RPM将平板离心1小时。37℃下温育过夜后，用80％丙酮溶液固定平板(-20℃下20分钟)。弃去丙酮溶液，37℃下用特异性单克隆抗立即早期I(IE-1)抗原检测CMV阳性细胞1小时。用PBS洗涤平板三次，在每个孔中加入生物素缀合的抗小鼠IgG，37℃下温育1小时。洗涤步骤后，37℃下加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶额外的30分钟。洗涤平板4次，用True-blue溶液温育10分钟。通过显微镜检查，记录特异性有色信号。中和滴度表示为与病毒对照(不含血清的CMV+细胞)相比，导致CMV阳性细胞减少50％的血清最高稀释度的倒数。
IX.2.3细胞内细胞因子染色
在第二次免疫后7天和21天对PBLs进行T细胞的细胞内细胞因子检测。从小鼠采集PBLs(1个合并物/组)。用覆盖CMV序列的肽合并物或gB蛋白进行淋巴细胞(10×7个细胞/ml的终浓度)的体外抗原刺激。PBLs/抗原混合物在37℃下温育2小时。然后37℃下在布雷菲德菌素(1μg/ml)存在下将细胞温育过夜，以抑制细胞因子分泌。
如下进行细胞染色：洗涤细胞悬浮液，重悬于50μl含有2％Fc阻断试剂的PBS1％FCS中。4℃下温育10分钟后，加入50μl抗-CD4-PE和抗-CD8perCp的混合物，4℃下温育30分钟。在PBS1％FCS中洗涤后，通过重悬于200μl Cytofix-Cytoperm(kit Beckton Dickinson)中使细胞透化，4℃下温育20分钟。然后用Perm Wash(Kit BD)洗涤细胞，重悬于50μl稀释于PermWash中的抗-IFγAPC+抗-IL-2FITC。4℃下温育2小时后，将细胞重悬于PBS1％FCS+1％低聚甲醛中。
通过FACS进行样品分析。门控活细胞，对+/-20,000个事件进行采集。针对CD4+和CD8+门控的群体计算IFN-γ+或IL2+的百分率。
IX.2.4免疫方案
免疫了4组。每组含有12只4-10周龄的雌性C57B1/6小鼠。
如下制备抗原：疫苗抗原在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达为gB**，即一种截短的嵌合体，其N和C-末端含有来自单纯疱疹病毒2(HSV2)的糖蛋白gD的肽序列的截短嵌合体。gB**在其含有膜锚定序列的C-末端结构域截短，因此分泌到培养物上清液中。
对于每组，在625μl PBS或佐剂AS01B或AS01E(按照上文实施例II.2制备，分别具有100μl免疫刺激剂/ml或50μl免疫刺激剂/ml的浓度)中制备浓度为1.5μg/剂的gB*。肌内注射50μl(即0.5ml的人剂量的1/10)。一个对照组的小鼠注射盐水。第0和28天进行注射。第二次注射后14天采集血清样品进行ELISA和中和测定。在第二次注射后7天和2l天采集PBLs，进行ICS。
IX.2.5结果
抗-gB ELISA滴度(图15)
在不含佐剂的gB组中观察到了非常弱至不可检测水平的抗-gB抗体。但是，在两个佐剂组，即分别是AS01B和AS01E中观察到了高抗体应答(高65和66倍)。在AS01B和AS01E组之间没有显著统计学差异。
多重比较：Tuckey-HSD
Figure BDA0000367049300001002
普通＜AS01E＝AS01B
抗-CMV中和滴度(图16)
与gB普通组相比，在两个含有佐剂的组中观察到了显著更高的抗gB中和滴度。在AS01B和AS01E制剂之间没有观察到中和抗体滴度的显著差异。
细胞介导的免疫
由于在第二剂后7天样品的再刺激后观察到非常低水平的应答，组间无法分辨，对CD4和CD8刺激没有观察到确实的应答(图17)。这些低至不能检测的应答可能是由于样品制备过程中的技术问题。但是，在第二次注射后21天，可以观察到应答。gB(5μg/ml)或肽(2μg/ml或4μg/ml)再刺激后的CD4数据没有显示出差异(图18)。对AS01E和AS01B观察到了相似细胞因子谱。对于CD8刺激，没有观察到确实的应答(图19)。
这些实验显示，对于另一种抗原性组合物和在两种不同生物中，具有较低水平免疫刺激剂的佐剂与具有较高水平的免疫刺激剂的该佐剂在免疫学上同样有效。
X：含有佐剂的RTS，S疫苗的临床前评价
X.1-制剂
在啤酒糖酵母中制备抗原性组合物RTS，S，所述组合物由两种蛋白，即RTS和S组成，它们在肌内和皮下组装成混合的聚合颗粒结构，所述结构估计每个含有平均100个多肽。RTS是424个氨基酸的51KDa的杂合多肽链，所述多肽链由融合于乙型肝炎病毒S蛋白的氨基末端的、来自疟疾寄生虫-恶性疟原虫NF53株的子孢子表面抗原的189aa(CSP抗原，氨基酸207-395)组成。S是一种24KDa的多肽(长度为226个氨基酸)，相应于乙型肝炎病毒表面抗原。冻干的抗原团块含有大约50μg(当设计与AS01B配制在0.5ml中时)或25μg(当设计与AS01E配制在0.5ml中时)抗原。
通过在罐中混合各种组分(PBS、脂质体、MPL和QS21)并且在无菌条件下搅拌，制备AS01B和AS01E。然后灭菌过滤产物，装入管形瓶或注射器。使用前，液体佐剂在+2℃-+8℃下保存，用于重配冻干的抗原团块。
X.2小鼠实验
在小鼠中进行了两个实验，目标在于比较由RTS，S/AS01B诱导的对RTS，S特异的免疫应答与用AS01E配制的RTS，S诱导的免疫应答。在每个实验中，用10、5或2.5μg AS01B或AS01E佐剂配制的RTS，S对C57B1/6小鼠(10只小鼠/组)进行肌内免疫三次，每次间隔2周。作为对照，两组用单独的AS01B或AS01E免疫。第三次免疫后15天，通过ELISA评估每只小鼠的HBs和CS特异性抗体应答。在两个实验中，对所有接受相同处理的小鼠计算几何平均抗体滴度和它们的95％置信区间。对来自两个实验的合并数据进行评估佐剂效果和抗原剂量效果的统计学分析。第二次和第三次免疫后7天，通过对来自每组5只小鼠的血细胞合并物的流式细胞术，测量CD4和CD8特异性T细胞应答。因此，在每个实验中，从每组得到2个值。
体液免疫应答
如图20和21所示，AS0lB和AS01E佐剂都诱导抗CSP和HBs的相似的强抗体应答。
抗-CSP GMTs的三因素ANOVA显示，对于5或2.5μg剂量的RTS，S，AS01B和AS01E之间没有显著差异。
对于10μg剂量，发现AS01B佐剂比AS01E诱导更高的抗CS滴度，GMT定量“AS01B组/AS01E组”是1.93(95％CI：1.33-2.79；p＝0.001)。
细胞介导的特异性免疫应答
图22和23显示CSP和HBs特异性的、表达IL-2和/或IFNγ的CD4和CD8T细胞。
三次免疫后，与AS01E相比，用AS01B时CSP特异性CD4应答倾向于更高，而用AS01E时CD8T细胞应答与用AS01B时等同或更好。
三次免疫后，与AS01E相比，用AS01B时HBs特异性CD4应答倾向于更高，较低剂量RTS，S时除外，此时CD4T细胞水平在两种佐剂之间相似。用AS01E配制的RTS，S诱导的HBs特异性CD8T细胞应答等同于或好于AS01B配制的RTS，S诱导的应答。
这些差异认为是在细胞免疫应答的预期可变性范围之内。
小鼠中的RTS，S/AS01E疫苗临床前研究发现与RTS，S/AS01B相似的可接受的安全性谱。
XI：RTS，S/AS01E的临床评价
按照上述实施例X制备制剂。蔗糖用作冻干抗原团块中的赋形剂。如同实施例X，用液体佐剂重配冻干的抗原。按照实施例II.2的描述制备AS01E，并且在+2-+8℃下保存直到重配时需要。
以AS01E为佐剂的RTS，S的安全性和免疫原性的II期随机双盲研究目前正在加蓬的18个月-4岁儿童中进行。接种方案是0、1、2个月的接种方案。当给生活在疟疾流行地区的18个月-4岁儿童中以0、1、2个月方案肌内施用3次时，RTS，S/AS01E的目标如下：
第一
-评估安全性，直到第三剂后1个月。
-证明在第三剂后1个月在抗-CS抗体应答方面不比以水包油乳液为佐剂的RTS，S疫苗差。
第二
-评估反应原性，直到第三剂后1个月。
-证明在第三剂后1个月在抗-HBs抗体应答方面不比以水包油乳液为佐剂的RTS，S疫苗差。
-描述抗乙型肝炎血清保护，直到第三剂后1个月。
-描述抗CS应答，直到第三剂后1个月。
第三
-第三剂后1个月到第三剂后12个月的安全性。
-第三剂后12个月时对CS抗原的体液免疫应答。
-第三剂后12个月时对HBs抗原的体液免疫应答。
解释性
-评价对CS抗原的T-细胞介导的免疫应答，直到第三剂后12个月。
-评价对CS抗原的B-细胞记忆免疫应答，直到第三剂后12个月。
-根据筛选时记录的HBV免疫状态，描述抗CS应答，直到第三剂后1个月。
入选了180个受试者，90个给予以以前验证的水包油乳液为佐剂的疫苗(在下表中称作“对照”)，90个给予以AS01E为佐剂的疫苗。筛选年龄为18个月-4岁的健康男孩和女孩。通过肌内途径在左侧三角肌施用疫苗。
在每剂和总体之后，接种后7天阶段(第0-6天)中报道的症状(主诉和非主诉)的发生率和性质(总接种队列)
Figure BDA0000367049300001041
Gr.1＝RTS，S.AS01E
Gr.2＝对照
LL＝下限
UL＝上限
对于每个剂量和总体/受试者：
N＝施用至少1剂的受试者的数目
n/％＝存在至少一类症状的受试者的
对于总体/剂
N＝施用的剂数
n/％＝无论施用的研究疫苗是什么，施用后产生至少一类症状的剂数/百分比
95％CI＝准确95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
这些数据证明，当与对照制剂比较时，以AS01E为佐剂的RTS，S疫苗在儿科群体中产生了可接受的反应原性。
通过评估对HBs和CSP重复(抗R32LR)的抗体应答，测量血清反应。在筛选时、第60天和第90天(第二次接种和第三次接种时)，收集用于测定抗体的血清。根据实验室的SOPs，采用吸附R32LR抗原的平板，通过标准ELISA方法测量抗CS的抗体水平，用标准参照抗体作为对照。结果以EU/mL报道。
根据测定说明，用商购ELISA免疫测定(来自Abbott的AUSABEIA测试试剂盒)或等同方案测量针对乙型肝炎表面抗原的抗体。结果以EU/mL报道。
抗-CS抗体的血清阳性率和GMCs(总接种队列)
Figure BDA0000367049300001051
Gr.1＝RTS，S.AS01E
Gr.2＝对照
GMC＝对所有受试者计算的几何平均抗体浓度
N＝具有可获得的结果的受试者数目
n/％＝具有落在指定范围内的浓度的受试者数目/百分比
95％CI＝95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限
MIN/MAX＝最小/最大
抗-HBs抗体的血清阳性率和GMCs(总接种队列)
Figure BDA0000367049300001061
Gr.1＝RTS，S.AS01E
Gr.2＝对照
GMC＝对所有受试者计算的几何平均抗体浓度
N＝具有可获得的结果的受试者数目
n/％＝具有落在指定范围内的浓度的受试者数目/百分比
95％CI＝95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限
MIN/MAX＝最小/最大
这些数据证明，当与验证的对照比较时，以AS01E为佐剂的RTS，S疫苗在儿科群体中产生了可接受的体液免疫应答。
实施例XII：与AS01E相比，以AS01B为佐剂的水痘-带状疱疹病毒的临床前评价
候选疫苗包含CHO细胞中产生的截短的VZV包膜蛋白，即gE。
为此研究，用皮下施用的一个人类剂量(HD)的Varilrix(约4logpfu/剂)对C57BL/6小鼠(n＝48)进行初免。用Varilrix初免后5周，将小鼠分为5组，每组12只，在第0天和第28天肌内注射(胫骨肌)5μg单独的gE、5μg gE+AS01E*(1/10HD)或5μg gE+AS01B(1/10HD)。用盐水(0.9％NaCl)注射对照组小鼠(仅仅是初免)。在第二次接种后14和/或30天，评价免疫应答。评价gE特异性总抗体水平和产生细胞因子(IL2/IFNγ)的CD4和CD8T细胞的频率。
gE特异性抗体应答：
开发ELISA，用于检测和定量小鼠血清中的gE特异性抗体，其中采用gE蛋白作为包被蛋白。ELISA滴度定义为血清稀释度的倒数，其产生等于最大吸光值的50％的吸光度(光密度)测量值。通过回归分析计算ELISA滴度。
数据证明，gE AS01E和gE AS01B诱导相似水平的gE特异性抗体(p值＞0.05)。与单独的gE抗原相比，两种制剂在第二次接种后14和30天都诱导显著更高的应答(10-13倍，p值＞0.05)(图26)。
Figure BDA0000367049300001071
gE特异性CD4和CD8应答
用细胞内细胞因子染色技术评价了CD4和CD8T细胞的细胞因子产生。在第二次免疫后30天，从每组12只小鼠分离脾细胞，并且合并为4组，每组3个脾。在跨完整gE蛋白(20个氨基酸的肽/10个氨基酸重叠)的gE肽(63个肽)存在下将脾细胞(1x106)温育2小时，然后在布雷菲德菌素存在下温育过夜。随后，用细胞表面CD4/CD8特异性荧光mAb和随后的细胞内细胞因子IL-2和IFNγ透化对细胞染色。
如图26所示，尽管用gE AS01B和gE AS01E制剂都诱导了相似的细胞因子谱(IL2/IFNγ)，AS01B制剂诱导了更高数量级的产生CD4和CD8细胞因子的细胞(对于CD4是2倍，p＞0.05，对于CD8是3.6倍，p＞0.05)。由于T细胞应答的出乎意料高的可变性，检测佐剂剂量之间的显著差异的能力非常有限(＜50％)。重要的是，与单独的gE相比，以AS01B或AS01E为佐剂的制剂能够诱导显著更高数量级的产生CD4的T细胞(13.3倍，p＜0.05)。与单独的gE相比，通过AS01B或AS01E配制gE，也诱导了更高水平的CD8细胞(3.8倍，p＞0.05)。
实施例XIII：AS01B与AS01E在流感雪貂模型中的临床前评价
材料和方法
由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得4-6月龄的雌性雪貂(Mustela putorius furo)。雪貂在第0天用鼻内施用的250μl异亚型病毒株H1N1A/斯德哥尔摩/24/90(4Log TCID50/ml)初免。在第21天，用全人剂量(1000μl疫苗剂量，15μg HA/A病毒株，17.5μgB病毒株)的H1N1A/新喀里多尼亚/20/99(15μg/ml)、H3N2A/怀俄明/3/2003(15μg/ml)和B/江苏/10/2003(17.5μg/ml)的组合肌内注射雪貂。然后在第42天通过鼻内途径用250μl异亚型病毒株wh.A/NY/55/04(4.51LogTCID50/ml)攻击雪貂。
第21天的接种是用普通三价制剂(下表中的“普通”)或用以AS01B(下表中的“AS01B”)或AS01E(下表中的“AS01E”)为佐剂的三价制剂进行的。按照上文实施例3所述制备制剂。
体温监测
在攻击期间监测个体的体温，并且采用记录每个动物体温的遥测植入物评估的，所述记录是在攻击前和攻击后每15分钟进行一次。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地图养在单独的笼中。
从初免前6天直到初免后4天，以及攻击前3天直到攻击后7天，每15分钟记录一次体温。
血凝反应抑制测试(HI)
测试程序
使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热灭活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1：10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。
用UNISTAT对HI滴度进行统计分析。用于方差分析的方案可以简要描述如下：
●数据的对数转换。
●为了证实组分布的正态性，对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验。
●为了证实不同群体(组)之间变量的均质性，进行Cochran检验。
●对各组进行单因素方差分析。
●用于多重比较的Tuckey-HSD检验。
鼻清洗液的病毒滴定
所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染物。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×105个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育6-7天。在6-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲腊染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截止值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准差)。OD＜截止值时定义为阳性得分，相反，OD＞截止值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID50/ml。
淋巴细胞增殖测定
通过在Ficoll Cedarlane哺乳动物淋巴细胞溶液上的密度梯度离心(2500rpm下20分钟，4℃)，收集PBMC。将PBMC重悬于5ml培养基(RPMI/4℃下添加)和10％正常雪貂血清中。添加剂由100mM丙酮酸钠、非必须氨基酸MEM、青霉素/链霉素、谷氨酰胺和1000×浓缩β2-巯基乙醇组成。立即将新分离的PBMC用于体外增殖测定。以2x105个细胞/孔将细胞置于96孔平底组织培养板中，用不同浓度的抗原(完整灭活病毒的0.1-1μg HA)培养44-96小时，然后用0.5μCi的[3H]胸苷脉冲标记。4-16小时后通过β-发射光谱评估放射性标记的掺入。
结果
攻击后鼻清洗液中的病毒负荷
在初免(初免＝第0天)前2天、初免后1、2和7天，以及攻击(攻击＝第42天)前4天和攻击后7天的时间段中收集鼻清洗液。
组 -2 0 +1 +2 +7 39 42 43 44 45 47 49
普通 0.82 1.84 5.35 1.85 0.8 1.82 5.77 4.44 1.97 0.9
AS01E 0.82 2.11 5.83 1.65 0.8 1.62 4.93 4.15 2.4 0.85
AS01B 0.81 2.26 5.38 1.91 0.82 1.74 2.25 1.89 1.350 0.9
参见图27中的结果。
初免后的病毒脱落
在初免后2天，在所有雪貂中观察到了病毒脱落的峰值。
初免后7天，在所有组中仅仅观察到残留的病毒负荷。
攻击后的病毒脱落
攻击后24小时，观察到了病毒脱落的峰值。
攻击后3天的病毒滴定显示三价分裂普通疫苗免疫的雪貂中的高病毒滴度(无保护)。与用以AS01B为佐剂的三价分裂疫苗相比，用三价分裂AS01E疫苗观察到了较低的病毒脱落减少。
体温监测：
从初免(初免＝第0天)前6天到初免后4天以及从攻击(攻击＝第42天)前3天到攻击后7天监测体温。每15分钟进行一次测量，对每组在每日中间计算平均值。结果可以参见图28。
初免后
在初免之前、期间和之后监测体温，所有组中没有显示体温的增加。
攻击后
体温监测的解释是困难的。用三价分裂普通疫苗和三价分裂AS01E免疫的雪貂在攻击后观察到了体温的略微增加，而三价分裂AS01B疫苗则没有观察到增加。通过体温增加＞0.4℃的雪貂数目，获得以下评分。
攻击后的体温增加。
三价普通：5/8(+0.4，+0.4，+0.5，+0.7，+0.8)
三价AS01B0/8
三价AS01E6/8(+0.4，+0.4，+0.5，+0.5，+0.9，+1.6)
该读出结果没有雪貂中的其它读出结果强。
血凝反应抑制测试(HI)
在初免前4天、初免后17天、免疫后21天和攻击后13天采集血清样品。结果可以参见图29和30。对于所有三个疫苗株，与三价分裂普通疫苗相比，用AS01B或AS01E为佐剂的三价分裂疫苗免疫的雪貂中观察到了统计学显著更高的HI滴度。两个含有佐剂的组之间没有观察到差异。与其它组相比，用以AS01B为佐剂的三价分裂疫苗免疫雪貂后，观察到了对A/纽约H3N2(攻击株)的统计学显著更高的交叉反应性HI滴度。

Claims (91)

1.适于人类使用的剂量体积的免疫原性组合物，包含与佐剂组合的抗原或抗原性制剂，所述佐剂包含免疫活性皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在，其中所述皂苷级分和所述脂多糖都以低于30μg的水平存在于所述人类剂量中。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述佐剂组合物进一步包含甾醇，其中皂苷：甾醇的比是1∶1-1∶100w/w。
3.权利要求2的免疫原性组合物，其中皂苷：甾醇的比是1∶1-1∶10w/w。
4.权利要求2的免疫原性组合物，其中皂苷：甾醇的比是1∶1-1∶5w/w。
5.权利要求1-4的任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。
6.权利要求2-5的任一项的免疫原性组合物，其中所述甾醇是胆固醇。
7.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
9.权利要求7或8的免疫原性组合物，其中QS21：3D-MPL的比是1∶1。
10.权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物，进一步包含载体。
11.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以1-30μg的量存在。
12.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以25μg的量存在。
13.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以1-15μg的量存在。
14.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以10μg的量存在。
15.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以5μg的量存在。
16.权利要求11-15的任一项的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。
17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
18.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述皂苷以1-25μg的量存在。
19.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述皂苷以25μg的量存在。
20.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述皂苷以1-10μg的量存在。
21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述皂苷以10μg的量存在。
22.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述皂苷以5μg的量存在。
23.权利要求18-22的任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。
24.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述适于人类使用的剂量体积是0.5-1.5ml。
25.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是0.5ml。
26.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是0.7ml。
27.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是1.0ml。
28.以适用于人类剂量的免疫原性组合物的体积存在的佐剂组合物，包含1-30μg脂多糖和1-30μg以脂质体形式存在的免疫活性皂苷级分。
29.权利要求28的佐剂组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。
30.权利要求29的佐剂组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
31.权利要求28-30的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。
32.权利要求28-31的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖和所述免疫活性皂苷级分以相同量存在于佐剂组合物中。
33.权利要求28-32的任一项的佐剂组合物，其中所述适用于人类剂量的体积是250μl。
34.权利要求28-32的任一项的佐剂组合物，其中所述适用于人类剂量的体积是360μl。
35.权利要求28-34的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖以25μg的量存在。
36.权利要求28-34的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖以10μg的量存在。
37.权利要求28-34的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖以5μg的量存在。
38.权利要求28-37的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷以25μg的量存在。
39.权利要求28-37的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷以10μg的量存在。
40.权利要求28-37的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷以5μg的量存在。
41.权利要求1-27的任一项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于水痘-带状疱疹病毒(VZV)。
42.权利要求1-27的任一项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于肺炎链球菌。
43.权利要求1-27的任一项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于巨细胞病毒(CMV)。
44.权利要求1-27的任一项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于恶性疟原虫。
45.权利要求1-27的任一项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于流感病毒。
46.权利要求1-27的任一项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于人乳头瘤病毒(HPV)。
47.免疫原性组合物，包含与佐剂组合物组合的流感病毒或其抗原性制剂，所述佐剂组合物包含以脂质体形式存在的免疫活性皂苷。
48.权利要求47的免疫原性组合物，其中所述佐剂进一步包含脂质A衍生物。
49.权利要求48的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
50.(a)抗原或其抗原性制剂和(b)权利要求1-49的任一项定义的佐剂在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于诱导人类的以下至少一种或至少两种或全部应答：(i)改进的针对所述抗原或其抗原性制剂的CD4T-细胞免疫应答，(ii)改进的针对所述抗原或其抗原性制剂的体液免疫应答，(iii)改进的针对所述抗原或其抗原性制剂的B-记忆细胞应答。
51.接种方法，包括给有需要的个体或群体送递抗原或抗原性组合物，和权利要求1-49的任一项定义的佐剂。
52.权利要求50或51的用途或方法，所述用途或方法是用于老年人或免疫受损的人类个体或群体。
53.权利要求50-52的任一项的用途或方法，其中所述免疫原性组合物的施用诱导改进的CD4T细胞免疫应答和改进的B-记忆细胞应答。
54.权利要求50-53的任一项的用途或方法，其中所述CD4T-细胞免疫应答涉及诱导交叉反应性CD4T辅助细胞应答。
55.权利要求50-54的任一项的用途或方法，其中所述体液免疫应答涉及诱导交叉反应性体液免疫应答。
56.权利要求50-55的任一项的用途或方法，其中所述目标群体是超过65岁的老年人。
57.权利要求50-56的任一项的用途或方法，用于提供抗病原体引起的感染或疾病的保护作用，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原所来源的病原体的变体。
58.权利要求50-56的任一项的用途或方法，用于提供抗病原体引起的感染或疾病的保护作用，所述病原体包含抗原，所述抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。
59.权利要求57或58的任一项的用途或方法，其中再次接种后的免疫应答是以下任意一种或两种或全部：改进的针对所述抗原或抗原性制剂的CD4应答、改进的体液应答或改进的B细胞记忆应答。
60.权利要求57或58的用途或方法，其中所述保护作用是通过受感染个体或群体的体温而评估的。
61.权利要求1-60的任一项的组合物、用途或方法，其中所述免疫原性组合物包含具有CD4T细胞表位的抗原。
62.权利要求1-60的任一项的组合物、用途或方法，其中所述免疫原性组合物包含具有B细胞表位的抗原。
63.一种抗原在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再次接种以前用抗原或抗原性组合物或其片段或变体和权利要求1-49的任一项所定义的佐剂接种过的个体。
64.权利要求63的用途，其中所述用于再次接种的抗原与用于前一次接种的抗原或抗原性组合物具有共同的CD4T-细胞表位。
65.权利要求63或64的用途，其中所述用于再次接种的抗原或抗原性组合物是含有佐剂的。
66.权利要求65的用途，其中所述佐剂如权利要求1-49的任一项所定义。
67.权利要求1-27的任一项的人类剂量的免疫原性组合物，用于医药。
68.权利要求1-67的任一项的组合物、用途或方法，其中所述抗原或抗原性制剂来源于选自下组的生物：流感病毒、HPV、CMV、VZV、肺炎链球菌、恶性疟原虫、间日疟原虫、呼吸道合胞病毒(RSV)。
69.权利要求68的组合物、用途或方法，其中所述流感抗原选自：分裂流感病毒、纯化的完整流感病毒、亚基流感病毒及其抗原性制剂。
70.权利要求69的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂来自至少两种流感病毒株。
71.权利要求70的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂来自至少三种流感病毒株。
72.权利要求71的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂来自至少四种流感病毒株。
73.权利要求69-72的任一项的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒的至少一种株或其抗原性制剂与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。
74.权利要求73的组合物、用途或方法，其中所述所述流感病毒的至少两种株或其抗原性制剂与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。
75.权利要求74的组合物、用途或方法，其中所述所述流感病毒的至少三种株或其抗原性制剂与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。
76.权利要求73-75的任一项的组合物、用途或方法，其中所述至少一种、至少两种、至少三种大流行流感病毒株选自：H5N1、H9N2、H7N7和H2N2。
77.权利要求68-76的任一项的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂含有每流感病毒株1-15μg HA。
78.权利要求68-76的任一项的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂含有每流感病毒株少于15μg HA。
79.权利要求77或78的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂含有每株2.5-7.5μg HA。
80.权利要求51-53的任一项的用途或方法，其中所述用于再次接种的流感病毒或其抗原性制剂来自至少两种不同的流感病毒株。
81.权利要求80的用途或方法，其中用于再次接种的流感病毒或其抗原性制剂来自至少三种不同的流感病毒株。
82.权利要求57-59的任一项的用途或方法，其中用于再次接种的流感病毒或其抗原性制剂含有至少一种与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能的流感病毒株。
83.权利要求82的用途或方法，其中所述大流行株选自H5N1、H9N2、H7N7和H2N2。
84.权利要求57-59和80-83的任一项的用途或方法，其中第一次接种是用含有可能导致大流行爆发的流感病毒株的流感组合物进行的，再次接种是用含有循环大流行株的流感组合物进行的。
85.权利要求57-59和80-84的任一项的用途或方法，其中所述流感抗原或其抗原制剂是每剂少于15μg HA抗原。
86.权利要求68-85的任一项的用途或方法，其中所述流感抗原或其抗原性制剂来源于卵或来源于细胞培养物。
87.权利要求86的组合物、用途或方法，其中所述HPV抗原与癌症或生殖器疣相关。
88.权利要求68的组合物、用途或方法，其中所述癌症相关HPV是16型HPV和/或18型HPV。
89.权利要求88的组合物、用途或方法，其中与HPV16和/或18抗原一起使用一种或多种来自致癌HPV类型的额外抗原，所述抗原选自以下HPV类型：HPV31、45、33、58和52。
90.权利要求88或89的组合物、用途或方法，其中所述抗原是病毒样颗粒(VLPs)的形式。
91.权利要求90的组合物、用途或方法，其中所述VLPs是L1VLPs。
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