CN101180078A - 组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及流感疫苗制剂和用于免疫对抗各种疾病的接种方案。具体地说，本发明涉及含水包油乳液佐剂和3D－MPL的疫苗制剂、其在药物中的用途，尤其是其在增强对各种抗原的免疫应答方面的用途，并涉及制备方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代谢油和乳化剂。

Description

组合物

技术领域

本发明涉及流感疫苗制剂和用于免疫对抗各种疾病的接种方案。具体地说，本发明涉及含水包油乳液佐剂和3D-MPL的疫苗制剂、其在药物中的用途，尤其是其在增强对各种抗原的免疫应答方面的用途，并涉及制备方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代谢油和乳化剂。

技术背景

始终需要具有改善的免疫原性的新组合物或疫苗。作为一种策略，佐剂已用于寻求和改善针对任意给定抗原产生的免疫应答。

作为实例，已开发了具有佐剂的流感疫苗和抗人乳头瘤病毒(HPV)的疫苗。

流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感产生重大的经济负担、发病率乃至死亡率。

流感病毒是RNA包膜病毒，颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为：内部为与核蛋白结合的核糖核酸(RNA)核衣壳或核心，外部包绕着脂质双层结构和外层糖蛋白的病毒被膜。病毒被膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。流感病毒包含两种表面抗原：糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，它们以10-12nm长的刺突显露在颗粒表面上。就是这些表面蛋白、尤其是血细胞凝集素，决定了流感亚型的抗原特异性。

这些表面抗原渐进地、有时快速地经历某些导致流感病毒抗原性变异的改变。这些抗原性改变叫做‘漂移’和‘转换’，是不可预见的，由免疫学观点看可能具有显著的影响，因为它们最终导致出现新流感株，能使病毒逃逸免疫系统，几乎每年都引起众所周知的流行病。

每个季节加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO协同国家卫生管理局以及疫苗生产商共同确定。

HA是确定不同流感株的血清学特异性的最重要抗原。此75-80kD的蛋白包含众多的抗原决定簇，其中几个位于在不同毒株中经历序列改变的区域中(毒株特异性决定簇)，其余的位于许多HA分子共有的区域中(共同决定簇)。

流感病毒几乎每年冬天都引起大流行，甲(A)型或乙(B)型病毒的感染率在6周的时间段内高达40％。流感感染产生各种病症，由亚临床感染至轻微的上呼吸道感染到严重的病毒性肺炎。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。疾病的严重性主要由宿主的年龄、其免疫状况和感染部位决定。

65岁和以上的老年人尤其易受攻击，占发达国家所有流感相关死亡的80-90％。患有基础性慢性疾病的个体也非常有可能体验到这种并发症。幼儿也可能患严重疾病。因此，这些群体尤其需要受保护。除了这些‘风险’群体以外，卫生当局还推荐对与老年人接触的健康成人接种。

接种对控制每年的流感大流行起关键作用。目前可用的流感疫苗是失活流感疫苗或减毒活流感疫苗。失活流感疫苗由3种可能形式的抗原制备物组成：失活全病毒、其中纯化的病毒颗粒被溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏的亚病毒体(所谓的“裂解疫苗”)或纯化的HA或NA(亚单位疫苗)。这些失活疫苗肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)给予。

所有种类的流感疫苗通常都是三价疫苗。一般来说，它们含有的抗原得自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株。据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：An improved single radialimmunodiffusion technique for the assay of influenza haemaggiutininantigen：adaptation for potency determination of inactivated whole virusand subunit vaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，International collaborative study of single radial diffusion andImmunoelectrophoresis techniques for the assay of haemaggiutininantigen of influenza virus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330)的检测，在大多数情况下，标准0.5ml注射剂量含有每种毒株的15μg血细胞凝集素抗原组分。

目前可用的流感疫苗被认为在所有年龄组都是安全的(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，很少有证据表明当前的流感疫苗在2岁以下的小孩中有作用。而且，预防典型已确认流感疾病的疫苗效力的报告比率对老年人为23-72％，这显著低于对较年轻成年人所报告的60-90％的有效率(Govaert，1994，J.Am.Med.Assoc，21，166-1665；Gross，1995，Ann Intern.Med.123，523-527)。业已表明，流感疫苗的有效性与针对病毒株的血凝反应抑制(HI)抗体的血清滴度相关，几个研究已发现较年长的成年人在流感免疫后表现出的HI滴度低于较年轻成年人(Murasko，2002，Experimental gerontology，37，427-439)。

因此，仍需要具有改良的免疫原性的新疫苗。疫苗抗原和有效佐剂的制剂是一种有可能增强对亚病毒体抗原的免疫应答的方法。

水包油乳液形式的用佐剂MF59佐剂化的亚单位流感疫苗已商品化，已表现出其诱导高于无佐剂亚单位疫苗所获抗体滴度的抗体滴度的能力(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，在后来的出版物中，相同疫苗没有表现出其比无佐剂裂解疫苗改善的模式(Puig-Barbera等，2004，Vaccine 23，283-289)。

乳头瘤病毒是小DNA肿瘤病毒，是高度物种特异性的。迄今为止已描述了100多种独立的人乳头瘤病毒(HPV)基因型。一般来说，HPV对皮肤(例如HPV-1和HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)是特异性的，通常引起持续数月或数年的良性肿瘤(疣)。这种良性肿瘤可困扰所涉及的个体，但趋向于无生命威胁，有一些例外。

一些HPV还与癌症相关。HPV和人类癌症之间最强的正相关是HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间存在的正相关。宫颈癌是发展中国家最常见的恶性肿瘤，在全世界每年发生约500,000例新病例。现在，使用疫苗积极对抗原发性HPV-16感染乃至已确诊的含HPV-16的癌症在技术上是可行的。关于抗HPV-16的预防性和治疗性接种的前景的综述，参见Cason J.，Clin.Immunother.1994；1(4)293-306和Hagenesee M.E.，Infections in Medicine 1997 14(7)555-556，559-564。

尽管确实存在微小差异，但所描述的所有HPV基因组都具有至少8个早期基因E1至E8和2个晚期基因L1和L2。另外，上游调节区具有调节序列，该调节序列似乎控制HPV基因组的大部分转录事件。

基于HPV L1的疫苗公开于WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184和WO94/05792。此疫苗可包含为单体、壳粒或病毒样颗粒的L1抗原。制备VLP的方法在本领域众所周知，包括VLP分解-再组装法，以提供增强的均一性，例如WO9913056和US6245568所述。这种颗粒可另外包含L2蛋白。基于L2的疫苗描述于例如WO93/00436。其它HPV疫苗方法基于早期蛋白，例如E7或诸如L2-E7的融合蛋白。

仍需要改良的流感疫苗，例如流感疫苗或HPV疫苗。

发明陈述

在本发明的第一个方面，提供一种免疫原性组合物，其包含：

(a)抗原，

(b)水包油乳液佐剂；和

(c)3D MPL，

其中所述水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂。

本发明还涉及含以下物质的组合物在生产免疫原性组合物中的用途：

(a)抗原，和

(b)水包油乳液佐剂；和

(c)3D MPL

其中所述水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂，所述免疫原性组合物用于预防感染和/或疾病。

本发明还涉及一种接种方法，该方法包括传递抗原、如本文定义的水包油乳液佐剂和3D MPL。

本发明还涉及一种制备免疫原性组合物的方法，该方法包括组合如本文定义的水包油乳液和抗原以及3D-MPL。

本发明的其它方面和优势在以下的其优选实施方案的详述中进一步描述。

附图说明

图1：依据PCS检测的SB62水包油乳液的油滴粒度分布。图1A显示了用Malvern Zetasizer 3000HS检测的SB62批号1023的粒度测量结果：A＝稀释度1/10000(Rec22至Rec24)(用Contin和适合的光学模型1.5/0.01分析)；B＝稀释度1/20000(Rec28至Rec30)(用Contin和适合的光学模型1.5/0.01分析)。图1B显示了依据强度的记录22(上部)和记录23(下部)的示意图。

图2：制备MPL原液的示意图。

图3：制备AS03+MPL佐剂的示意图。

图4：Explo Flu-001临床实验。针对裂解流感抗原的CD4T细胞应答(Q1＝第一四分位数，Q3＝第三四分位数)。

图5：Explo Flu-001临床实验。针对裂解流感抗原的CD8T细胞应答(Q1＝第一四分位数，Q3＝第三四分位数)。

图6：Explo Flu-001临床实验。在用Fluarix+AS03接种后针对裂解流感病毒抗原的交叉反应性CD4T-细胞应答。

图7：Explo Flu-001临床实验。接种后的B细胞记忆应答。

图8：Explo Flu-002临床实验。再接种后抗裂解流感抗原的CD4T细胞应答。

图9：Explo Flu-002临床实验。再接种后的抗HI滴度。

图10：雪貂研究I。温度监测(初免和攻击)。图10A是初免，图10B是攻击。

图11：雪貂研究I。病毒脱落。

图12：雪貂研究II。温度监测(初免和攻击)。图12A是初免，图12B是攻击。

图13：雪貂研究II。病毒脱落。

图14：雪貂研究II。对H3N2 A/巴拿马(疫苗株)(图14A)和H3N2A/怀俄明(攻击株)(图14B)的HI滴度。

图15：小鼠研究。使用全失活病毒作为再刺激抗原(免疫后7天)的情况下C57BI/6初免小鼠中CD4T细胞的频率。

图16：小鼠研究。使用全失活病毒作为再刺激抗原(免疫后7天)的情况下C57BI/6初免小鼠中CD8T细胞的频率。

图17：小鼠研究。使用全失活病毒作为再刺激抗原(免疫后7天)的情况下用异源毒株初免的C57BI/6小鼠中CD4T细胞(上部)和CD8T细胞(下部)的频率。

图18：人临床实验。老年人接种Fluarix、Fluarix+AS03、Fluarix+AS03+MPL后的B细胞记忆应答(接种前和接种后之间的差异)。

图19：雪貂研究III。攻击前和攻击后的温度监测。

图20：雪貂研究III。攻击前和攻击后的病毒脱落。

图21：雪貂研究III。针对H3N2 A/怀俄明(疫苗株)的HI滴度。

图22：雪貂研究III。针对H3N2 A/巴拿马(攻击株)的HI滴度。

图23：人临床实验。在接种后21天、90天和180天时的HI滴度(GMT)(持续性)。

图24：人临床实验。在接种后21天、90天和180天时的CD4应答-all double(产生至少两种细胞因子的细胞)检验-混合抗原(持续性)。

图25：人临床实验。与Fluarix相比在使用AS03+MPL的再接种临床实验中的HI滴度。

图26：人临床实验。在接种后0和21天时CD4应答的CMI-alldouble检验-混合抗原。

图27：采用两个浓度的AS03+MPL的人临床实验。在0和21天的HI滴度。

图28：采用两个浓度的AS03+MPL的人临床实验。反应原性。

发明详述

就亚单位或裂解流感抗原或用VLP形式的各种癌症相关性HPV抗原，并组合水包油乳液和3D-MPL，来表明本发明的原理。

在本发明的一个方面，本发明人已经发现，相比于用无佐剂亚单位或裂解病毒或其裂解病毒抗原性制备物获得的应答，含亚单位或裂解流感病毒或其抗原性制备物连同水包油乳液佐剂和3D-MPL的流感制剂能够在人中改善抗所述抗原或抗原性组合物的CD4T-细胞免疫应答和/或B细胞记忆应答。

所述组合物因此提供改进的流感疫苗。

要求保护的制剂可用于诱导抗流感的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子提呈的流感表位。本申请人现在已发现，该制剂有效靶向细胞介导的免疫系统，以便增加对同源和漂移的流感株的反应性(在接种和感染时)。

本发明人已发现，含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物连同如本文定义的水包油乳液佐剂和3D-MPL的流感制剂能够诱导至少一种趋势：相比于无佐剂组合物，第一次接种人受试者后的B细胞记忆应答较高。

本发明的佐剂化流感组合物具有几个优势：

1)改善的免疫原性：它们允许将老年人(50岁以上，通常65岁以上)中的弱免疫应答恢复至在年轻人中所见的水平(抗体和/或T细胞应答)；

2)改善的交叉保护模式：增加抗变异(漂移)流感株的交叉保护作用；

3)它们还允许使用减少的抗原剂量获得相似的应答，因此确保了紧急情况下(例如大流行)增加的效力。

在本发明的另一方面，本发明人已发现，如本文定义的水包油乳液佐剂+3D MPL对于抗体产生和B细胞记忆而言表现出的免疫原性结果等于(或者有时高于)用没有水包油乳化组分的佐剂产生的免疫原性结果。

这些发现可应用于其它形式的相同抗原和其它抗原。

抗原

可用于本发明的抗原包括：

链球菌抗原例如来自A组链球菌或B组链球菌，但最优选来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。最优选使用蛋白和/或糖类抗原。肺炎链球菌糖类抗原和/或至少一种肺炎链球菌蛋白抗原最优选选自：肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜缺失变体、PspC或其跨膜缺失变体、PsaA或其跨膜缺失变体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、CbpA或其跨膜缺失变体、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp133，或其免疫功能等同物。

还优选至少1(2、3、4、5、6、7、8、9或10)种肺炎链球菌糖类抗原和/或优选选自以上列出的蛋白抗原的肺炎链球菌蛋白抗原。

某些组合物描述于WO 00/56359和WO 02/22167和WO 02/22168(通过引用结合到本文中)。

所述抗原可包含荚膜糖类抗原(优选缀合至载体蛋白)，其中所述糖类(最优选多糖)来源于至少四种肺炎球菌血清型。优选地，所述四种血清型包括6B、14、19F和23F。更优选地，所述组合物中包含至少7种血清型，例如来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的血清型。再更优选地，所述组合物中包含至少11种血清型，例如在一个实施方案中，所述组合物包含来源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖类(优选缀合至载体蛋白)。在本发明的一个优选实施方案中，包括至少13种多类糖抗原(优选缀合至载体蛋白)，但本发明还包括另外的糖类抗原，例如23价体(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。

对于老年人接种(例如用于预防肺炎)而言，有利地在上述11价抗原组合物中包含血清型8和12F(最优选还包括血清型15和22)，以形成15价组合物，而对于婴儿或幼儿而言(这时主要考虑中耳炎)，有利地包含血清型6A和19A，以便形成13价组合物。

尽管上述糖类有利地为其全长天然多糖形式，但应该理解，如果在偶联至蛋白载体时有需要，那么也可以使用大小降低但仍然具备免疫原性的多糖(参见例如EP 497524和497525)。

为了预防/缓解老年(+55岁)人群的肺炎和婴儿(最大至18个月)以及幼儿(通常是18个月到5岁)的中耳炎，本发明的优选实施方案将本文描述的多价肺炎链球菌糖类与优选选自以上列出蛋白的肺炎链球菌蛋白组合在一起。肺炎链球菌蛋白的组合还可有利地如下文所述使用。

肺炎球菌蛋白

本发明的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原优选选自：来自多组氨酸三联体家族(Pht)的蛋白、来自Lyt家族的蛋白、胆碱结合蛋白、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸)、具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任意氨基酸)和具有I型信号序列基序的蛋白。这些种类(或基序)中的优选实例是以下蛋白(或其截短物或免疫功能等效物)：

Pht(多组氨酸三联体)家族包含蛋白phtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征：脂质化序列、由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域(可能涉及金属或核苷的结合或酶活性)、(3-5)卷曲螺旋区、保守的N末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎球菌菌株中。同源蛋白还可见于其它链球菌和奈瑟氏球菌属(Neisseria)。该家族优选的成员包括PhtA、PhtB和PhtD。更优选地，其包括PhtA或PhtD。但是，要理解的是，术语PhtA、B、D和E指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其具有序列同源性的天然(和人工制备的)变体，所述变体与参比蛋白至少90％相同。优选地，至少95％相同，最优选97％相同。

对于Pht蛋白而言，PhtA公开于WO 98/18930，还可称作Sp36。如上所述，其是一种多组氨酸三联体家族的蛋白，且具有II型信号基序LXXC。

PhtD公开于WO 00/37105，也可称作Sp036D。如上所述，它也是多组氨酸三联体家族的一种蛋白，也具有II型LXXC信号基序。PhtB公开于WO 00/37105，也称作Sp036B。PhtB家族的另一成员是降解C3的多肽，公开于WO 00/17370。该蛋白也来自多组氨酸三联体家族，也具有II型LXXC信号基序。优选的免疫功能等效物是公开于WO 98/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79kD)公开于WO99/15675，它也被认为是PhtX家族成员。

PhtE公开于WO 00/30299，称作BVH-3。

SpsA是胆碱结合蛋白(Cbp)，公开于WO 98/39450。

Lyt家族是膜结合蛋白，与细胞裂解有关。N末端结构域包含胆碱结合结构域，但Lyt家族不具有以下所示的见于胆碱结合蛋白家族(Cbp)的所有特征，因此，对本发明而言，Lyt家族被认为不同于Cbp家族。与Cbp家族相反，C末端结构域包含Lyt蛋白家族的催化结构域。该家族包括LytA、B和C。对于Lyt家族而言，LytA公开于Ronda等，Eur J Biochem，164：621-624(1987)。LytB公开于WO98/18930，也称作Sp46。LytC也公开于WO 98/18930，也称作Sp91。该家族的优选成员是LytC。

另一个优选实施方案是Lyt家族(具体地说是LytA)截短物，其中“Lyt”如上定义，“截短物”指缺失胆碱结合区的50％或更多的蛋白。优选地，这类蛋白缺失整个胆碱结合区。

Sp125是具有细胞壁锚定基序LPXTG(其中X是任意氨基酸)的肺炎球菌表面抗原的实例。业已发现，在该类具有此基序的肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白在本发明范围内都是有用的，因此被看作是本发明的又一种蛋白。Sp125自身公开于WO 98/18930，也称为ZmpB-锌金属蛋白酶。

Sp101公开于WO 98/06734(其中，其具有参考号#y85993)。其特征还在于I型信号序列。

Sp133公开于WO 98/06734(其中，其具有参考号#y85992)。其特征还在于I型信号序列。

Sp128和Sp130公开于WO 00/765400。

本发明所使用的蛋白优选选自：PhtD、PhtA和PhtE，或者是这些蛋白中的2种或全部3种的组合(即PhtA+D、A+E、D+E或A+D+E)。

可纳入的其它肺炎球菌蛋白抗原为来自以下的一种或多种：肺炎球菌溶血素(也称为Ply；优选通过化学处理或突变而脱毒)[WO96/05859，WO 90/06951，WO 99/03884]、PsaA及其跨膜缺失变体(Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)：5255-62)、PspA及其跨膜缺失变体(US 5804193、WO 92/14488、WO 99/53940)、PspC及其跨膜缺失变体(WO 97/09994、WO 99/53940)、胆碱结合蛋白(Cbp)家族成员[例如CbpA及其跨膜缺失变体(WO 97/41151；WO 99/51266)]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect，Immun.1996 64：3544)、HSP70(WO96/40928)、PcpA(Sanchez-Beato等，FEMS Microbiol Lett 1998，164：207-14)、M样蛋白(SB专利申请号EP 0837130)和粘附素18627(SB专利申请号EP 0834568)。本发明还包含这种蛋白的免疫功能等效物或截短物(如上定义)。

关于胆碱结合蛋白家族，该家族的成员最初被鉴定为可通过胆碱亲和层析纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合型脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。在结构上，它们有数个在整个家族中共有的区域，但这些蛋白的确切特性(氨基酸序列，长度等)可变。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)，这些区域由多个重复序列组成，占该蛋白的约一半。正如本申请中所用的，术语“胆碱结合蛋白家族(Cbp)”选自在WO 97/41151中鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO 97/41151。CbpD和CbpG公开于WO 00/29434。PspC公开于WO 97/09994。PbcA公开于WO 98/21337。优选地，胆碱结合蛋白选自：CbpA、PbcA、SpsA和PspC。

如果Cbp是所用的另一种蛋白，那么它可以是Cbp截短物，其中“Cbp”如上定义，“截短物”指缺失胆碱结合区(C)的50％或更多的蛋白。优选这类蛋白缺失整个胆碱结合区。更优选地，这类蛋白截短物缺失(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白的N末端一半的一部分，但仍保留至少一个重复区(R1或R2)。再更优选地，所述截短物具有2个重复区(R1和R2)。这类优选实施方案的实例是描述于WO 99/51266或WO 99/51188的NR1xR2、R1xR2、NR1xR2P和R1xR2P，但缺失类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白也包括在本发明的范围内。

Cbp截短物-Lyt截短物嵌合蛋白(或融合体)也可用于本发明的组合物。优选地，其包括Cbp的NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)和Lyt的C末端区(Cterm，即缺失胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更优选地，Cbp选自CbpA、PbcA、SpsA或PspC。再更优选地，其是CbpA。优选地，Lyt是LytC(也可称作Sp91)。

也可应用缺失了胆碱结合域(C)并表达为与Lyt的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。优选，Lyt是LytC。

在一种肺炎球菌组合物中，可能组合本发明的不同肺炎球菌蛋白。

优选本发明的蛋白组合选自2种或多种(3或4种)不同种类，如具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如多组氨酸三联体家族(Pht))、胆碱结合蛋白家族(Cbp)、具有I型信号序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸，例如Sp128、Sp130)、毒素(例如Ply)等等。在这些种类(或基序)中的优选实例是以上所提到的蛋白或其免疫功能等效物。毒素+Pht、毒素+Cbp、Pht+Cbp和毒素+Pht+Cbp是优选的种类组合。

优选的有益组合包括但不限于PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NR1xR2P+PspA、NR1xR2+PspA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、R1xR2+PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。优选地，NR1xR2(或R1xR2)来自CbpA或PspC。更优选它来自CbpA。

特别优选的肺炎球菌蛋白组合包括Ply(或其截短物或免疫功能等效物)+PhtD(或其截短物或免疫功能等效物)以及任选的NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)。优选地，NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)来自CbpA或PspC。更优选它来自CbpA。

所述抗原可为含多糖抗原的肺炎球菌糖类缀合物，所述多糖抗原来自至少4种血清型，优选至少7种血清型，更优选至少11种血清型，包括至少一种但优选2、3或4种优选选自上述蛋白组的肺炎链球菌蛋白。优选所述蛋白中的一种蛋白是PhtD(或其免疫功能等效物)和/或Ply(或其免疫功能等效物)。

与多糖接种方法有关的问题是多糖本身为弱免疫原这一事实。为克服此问题，可将多糖与蛋白载体缀合，所述载体可提供旁观T细胞辅助作用。因此，优选本发明所用的糖类连接至这种蛋白载体。目前常用于产生糖类免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔

血蓝蛋白(KLH)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的OMPC以及结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。

基于肺炎球菌糖类的免疫原性组合物(或疫苗)的优选载体是来自流感嗜血菌(Haemophilus influenaze)的D蛋白(EP 594610-B)或其片段。适合使用的片段包括含T辅助表位的片段。具体地说，D蛋白片段优选包含所述蛋白的N末1/3。D蛋白载体可作为载体用在其中缀合了多种肺炎球菌糖类抗原的组合物中。组合中的一种或多种肺炎球菌糖类可有利地缀合到D蛋白上。

用于肺炎球菌糖类的另一种优选载体是肺炎球菌蛋白本身(如上在“本发明的肺炎球菌蛋白”章节中定义)。

所述糖类可通过任何已知方法(例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757的方法)与载体蛋白连接。优选地，可进行CDAP缀合(WO 95/08348)。

优选地，所述缀合物的蛋白∶糖类(重量∶重量)比例是0.3∶1到1∶1，更优选0.6∶1到0.8∶1，最优选约0.7∶1。

本发明的特别优选的组合物包含一种或多种缀合的肺炎球菌糖类，以及本发明的一种或多种肺炎球菌蛋白。另外，肺炎球菌糖类和蛋白可作为吸附在磷酸铝上的原液组分以液体形式稳定储存。

适宜地，其它抗原来源于HIV-1，(如gag或其片段，诸如p24、tat、nef、gp120或gp160或任何这些片段)；人类疱疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白，如来自HSV1或HSV2的ICP27；巨细胞病毒((尤其是人类)(如gB或其衍生物))；轮状病毒(包括减毒活病毒)；EB病毒(如gp350或其衍生物)；水痘-带状疱疹病毒(如gpI、II和IE63)；或来自肝炎病毒，如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或来自其它病毒病原体，如副粘病毒：呼吸道合胞体病毒(如F、N、M和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)、黄病毒(如黄热病毒、登革病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒(全活病毒或失活病毒、在卵中或MDCK细胞中培养的裂解流感病毒或全流感病毒体(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或其纯化蛋白或重组蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白或其组合)；或来源于细菌病原体，如奈瑟氏球菌(Neisseria spp)，包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如荚膜糖类及其缀合物、运铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；化脓链球菌(S.pyogenes)(如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变异链球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌(Moraxellaspp)，包括粘膜炎莫拉氏菌(M catarrhalis)，也称为粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵袭素)；博德特氏菌(Bordetella spp)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌(Mycobacterium spp.)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Msmegmatis)；军团菌(Legionella spp)，包括侵肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp)，包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxic E.coli)(例如定居因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒素或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素或其衍生物)；弧菌(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺氏菌(Shigella spp)，包括索氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贫氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贫氏菌(S.flexnerii)；耶尔森氏菌(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲杆菌(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuna)(例如毒素、粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌(C.coli)；沙门氏菌(Salmonella spp)，包括伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；利斯特氏菌(Listeria spp)，包括单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺杆菌(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌(Staphylococcus spp)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌(Enterococcus spp)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、尿肠球菌(E.faecium)；梭菌(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤风毒素和其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B和其衍生物)；芽孢杆菌(Bacillus spp)，包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)；棒杆菌(Corynebacterium spp)，包括白喉棒杆菌(C diphtheriae)(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋体(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蜱疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希氏体(Ehrlichiaspp)，包括马埃里希氏体(E.equi)和人粒细胞埃里希氏体病(Ehrlichiosis)因子；立克次氏体(Rickettsia spp)，包括立氏立克次氏体(R.rickettsii)；衣原体(Chlamydia spp.)，包括砂眼衣原体(C trachomatis)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体(Leptospiraspp.)，包括问号钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体(Treponemaspp.)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或来源于寄生物，如疟虫(Plasmodium spp.)，包括恶性疟虫(P.falciparum)；弓形虫(Toxoplasma spp.)，包括鼠弓形虫(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；内变形虫(Entamoeba spp.)，包括痢疾内变形虫(E.histolytica)；巴贝虫(Babesia spp.)，包括果氏巴贝虫(B.microti)；锥虫(Trypanosomaspp.)，包括克香氏锥虫(T.cruzi)；贾第虫(Giardia spp.)，包括表吮贾第虫(G.lamblia)；利什曼虫(Leishmania spp.)，包括硕大利什曼虫(L.major)；肺囊虫(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫(Trichomonas spp.)，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)；血吸虫(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸虫(S.mansoni)，或来源于酵母，如假丝酵母(Candida spp.)，包括白色假丝酵母(C.albicans)；隐球酵母(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球酵母(C.neoformans)。

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的其它优选特异性抗原是例如TbRa12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白和其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个，优选三个多肽融合成一个更大的蛋白。优选的融合体包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。

衣原体的最优选抗原包括例如高分子量蛋白(HMW)(WO99/17741)、ORF3(EP 366 412)和推定的膜蛋白(Pmp)。组合物的其它衣原体抗原可选自WO 99/28475所述的组。

优选的细菌组合物包含源自嗜血菌(Haemophilus spp)的抗原，包括B型流感嗜血菌(H.influenzae)(例如PRP及其缀合物)、不定型的流感嗜血菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、D蛋白和脂蛋白D，以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生的肽(US 5,843,464)或多重拷贝变体或其融合蛋白。

乙型肝炎表面抗原的衍生物是本领域熟知的，且尤其包括，在欧洲专利申请EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP 198-474中所列出的PreS1、PreS2 S抗原。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1抗原、gp120，尤其是在CHO细胞中表达时。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含如上文所述的gD2t。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原，HPV被认为是生殖器疣的原因(HPV6或HPV11等)，且HPV病毒也是造成子宫颈癌的原因(HPV16、HPV18等)。

生殖器疣的预防性或治疗性组合物的特别优选形式包含L1颗粒或壳粒，和含有选自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1和L2的一种或多种抗原的融合蛋白。

融合蛋白的最优选形式是：如WO 96/26277中公开的L2E7，和GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中公开的D蛋白(1/3)-E7。

优选的HPV子宫颈感染或癌症的预防性或治疗性组合物可包含HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原单体或L1或L2抗原一起呈现为病毒样颗粒(VLP)，或单独的L1蛋白单独地存在于VLP或壳粒结构中。这种抗原、病毒样颗粒和壳粒自身是已知的。参见例如WO 94/00152、WO 94/20137、WO 94/05792和WO 93/02184。

可包含单独的或作为融合蛋白的其它早期蛋白，例如E7、E2或优选E5，例如，其特别优选的实施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(WO 96/11272)。

特别优选的HPV16抗原包括早期蛋白E6或E7，其与D蛋白载体融合，形成HPV16的D蛋白-E6或E7融合体，或其组合；或E6或E7与L2的组合(WO 96/26277)。

或者，HPV16或18早期蛋白E6和E7可以单分子形式存在，优选为D蛋白-E6/E7融合体。这种组合物可任选地包含HPV 18的E6和E7蛋白的任一种或两种，优选为D蛋白-E6或D蛋白-E7融合蛋白或D蛋白E6/E7融合蛋白的形式。

本发明的组合物可另外包含其它HPV毒株的抗原，优选为毒株HPV 31或33。

本发明的组合物还包含源于可导致疟疾的寄生物的抗原。例如来自恶性疟原虫(Plasmodia falciparum)的优选抗原包括环孢子蛋白(CS蛋白)、RTS，S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1和TRAP。RTS是一种杂合蛋白，含有恶性疟原虫环孢子(CS)蛋白的基本全部C-末端部分，该部分经乙型肝炎表面抗原preS2部分的四个氨基酸连接至乙型肝炎病毒表面(S)抗原。其完整结构在国际专利申请号PCT/EP92/02591中公开，在要求了UK专利申请号9124390.7优先权的编号WO 93/10152下发表。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒生产，而当其与HBV的S抗原共表达时，产生称为RTS，S的混合颗粒。TRAP抗原在国际专利申请号PCT/GB89/00895中描述，在WO 90/01496下公开。本发明的一个优选实施方案是其中抗原制备物包含RTS，S和TRAP抗原组合的疟疾疫苗。可能是多期疟疾疫苗组分的候选物的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和它们在疟原虫(Plasmodium spp.)中的类似物。本发明的一个实施方案是一种组合物，其包含RTS，S或CS蛋白或其片段，如RTS，S的CS部分，它们与一种或多种其它疟疾抗原组合，这些疟疾抗原可选自例如MPS1、MSP3、AMA1、LSA1或LSA3。

组合物还可包含抗肿瘤抗原，并用于癌症的免疫治疗性治疗。例如，所述抗原可为肿瘤排斥抗原，例如针对前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑素瘤癌的抗原。示例性的抗原包括MAGE1、MAGE3和MAGE4或例如公开于WO99/40188中的其它MAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(也称为NY Eos 1)、SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，CurrentOpinions in Immunology 8，628-636页；Van den Eynde等，InternationalJournal of Clinical & Laboratory Research(1997年提交)；Correale等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，293页)。实际上，这些抗原在广泛的肿瘤类型中表达，如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。

用于本发明的MAGE抗原可与表达增强物或免疫融合配偶体一起作为融合蛋白表达。具体地说，Mage蛋白可融合至乙型流感嗜血菌的D蛋白或其脂质化衍生物。具体地说，融合配偶体可包含D蛋白的前1/3。此结构公开于WO 99/40188。

其它肿瘤特异性抗原包括但不限于KSA(GA733)肿瘤特异性神经节苷脂，例如GM2和GM3或其与运载蛋白的缀合物；或者所述抗原可以是自身肽激素，如全长促性腺激素释放激素(GnRH，WO95/20600)，其是10个氨基酸长的短肽，用于治疗许多癌症，或用于免疫去势。

在一个优选实施方案中，利用前列腺抗原，例如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4)1735-17401998)、PSMA或称为Prostase的抗原。

Prostase是前列腺特异性丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶样)，254个氨基酸长，具有保守的丝氨酸蛋白酶催化三联体H-D-S和氨基末端前-原肽序列，显示潜在的分泌功能(P.Nelson，Lu Gan，C.Ferguson，P.Moss，R.Gelinas，L.Hood & K.Wand，“Molecular cloning andcharacterisation of prostase，an androgen-regulated serine protease withprostate restricted expression”，载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96，3114-3119)。已经描述了推定的糖基化位点。预测的结构非常类似于其它已知的丝氨酸蛋白酶，表明成熟多肽折叠成单个结构域。成熟蛋白为224个氨基酸长，具有至少一个显示被天然加工的A2表位。

Prostase核苷酸序列和推断的多肽序列和同源物公开于Ferguson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，3114-3119)和国际专利申请号WO 98/12302(以及相应的授权专利US 5,955,306)、WO 98/20117(以及相应的授权专利US 5,840,871和US5,786,148)(前列腺特异性激肽释放酶)和WO 00/04149(P703P)。本发明提供含基于Prostase蛋白及其片段和同源物(“衍生物”)的含Prostase蛋白融合体的组合物。这种衍生物适用于适合治疗前列腺肿瘤的治疗性疫苗制剂。典型地，所述片段将含如在以上引用的专利和专利申请中公开的至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸。

再优选的前列腺抗原称为P501S，WO 98/37814的序列标识号113。免疫原性片及其部分含如以上引用的专利申请中公开的至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸。参见例如PS108(WO98/50567)。

其它前列腺特异性抗原可从WO 98/37418和WO/004149得知。另一个是STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)。

在本发明范围中有用的其它肿瘤相关抗原包括：Plu-1(J Biol.Chem 274(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等，Bioessays 199，2161-70，美国专利5654140)、Criptin(美国专利5981215)。另外，与癌症治疗特别相关的抗原还包括酪氨酸酶和存活蛋白。

粘蛋白衍生的肽如Muc1参见例如US 5744,144、US 5827,666、WO 8805054、US 4,963,484。特别考虑的是Muc 1衍生肽，其包含Muc 1肽的至少一个重复单元，优选至少两个这种重复单元，其可被SM3抗体识别(US 6 054 438)。其它粘蛋白衍生肽包括来自Muc 5的肽。

本发明抗原可为乳癌抗原，如Her-2/Neu、乳腺珠蛋白(美国专利5668267)或在WO00/52165、WO99/33869、WO99/19479、WO98/45328中公开的抗原。Her 2 neu抗原特别地公开于美国专利5,801,005。优选地，Her 2 neu包含完整胞外结构域(包含大约氨基酸1-645)或其片段，以及大约C末端580个氨基酸的至少免疫原性部分或完整胞内结构域。具体地说，胞内部分应包含磷酸化结构域或其片段。这种构建体公开于WO00/44899。一种特别优选的构建体被称为ECD PD，第二种被称为ECD PD。参见WO00/44899。在此使用的Her-2neu可来源于大鼠、小鼠或人类。

所述组合物可包含与肿瘤支持机制(例如血管生成、肿瘤侵入)相关的抗原，例如tie 2、VEGF。

可预见的是，本发明的组合物可使用来源于博氏疏螺旋体属(Borrelia sp.)的抗原。例如，抗原可包括核酸、病原体衍生的抗原或抗原制备物、重组生产的蛋白或肽以及嵌合融合蛋白。具体地说，所述抗原是OspA。OspA可为借助于宿主细胞(大肠杆菌)的脂质化形式的完整成熟蛋白，称为(Lipo-OspA)，或者可为非脂质化的衍生物。此非脂质化衍生物包括具有流感病毒非结构蛋白(NS1)的前81个N-末端氨基酸的非脂质化NS1-OspA融合蛋白、完整OspA蛋白以及另一个MDP-OspA，MDP-OspA是携带3个额外的N-末端氨基酸的OspA的非脂质化形式。

本发明的组合物可用于变态反应的预防或治疗。这种疫苗应包含变应原特异性抗原(例如Der p1)和变应原非特异性抗原(例如来源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP 0 477 231 B1))。

本发明的组合物还可用于变态反应、癌症或感染性疾病之外的慢性疾病的预防或治疗。这种慢性疾病是诸如动脉硬化和Alzheimer病的疾病。

本发明的组合物特别适合于诸如慢性病症和癌症的疾病的免疫治疗性治疗，而且适合于持续感染的治疗。因此，本发明的组合物特别适合于感染性疾病的免疫治疗，所述感染性疾病例如为结核病(TB)、AIDS和乙型肝炎(HepB)病毒感染。

另外，在AIDS背景下，提供一种治疗易感或患有AIDS的个体的方法。该方法包括给予所述个体本发明的疫苗，由此降低由随后的HIV感染引起的CD4+T细胞减少量，或者减慢或阻止已感染HIV的个体中的CD4+T-细胞减少。

除了上述肺炎球菌抗原以外(包括或不包括肺炎球菌抗原)，其它抗原包括细菌(优选荚膜)糖类。多糖抗原吸附到磷酸铝上，便利地储存于原液中-因此通过将所述原液与本发明的含油乳液即时混合直接产生本发明的疫苗组合物。优选地，所述其它细菌糖类选自：脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A荚膜糖类(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖类(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖类(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W-135荚膜糖类(MenW)、B组链球菌I组荚膜糖类、B组链球菌II组荚膜糖类、B组链球菌III组荚膜糖类、B组链球菌IV组荚膜糖类、B组链球菌V组荚膜糖类、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)5型荚膜糖类、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖类、得自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi糖类、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS、卡他莫拉菌(M.catarrhalis)LPS和流感嗜血菌LPS。所述LPS是指天然脂多糖(或脂寡糖)或其中脂质A部分已通过众多已知方法中的任一种解毒的脂多糖(参见例如WO 97/18837或WO98/33923)，或任何包含衍生于所述LPS的O-多糖的分子。所述脑膜炎奈瑟氏球菌LPS是指12种已知免疫型(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11或L12)中的1种或多种。

特别优选的组合是含以下组分的组合物：1)缀合Hib、级合MenA和缀合MenC；2)缀合Hib、缀合MenY和缀合MenC；3)缀合Hib和缀合MenC；和4)缀合MenA、缀合MenC、缀合MenY和缀合MenW-135。在每种上述缀合物中的PS量可为每0.5mL人剂量各5或10μg。优选地，Hib、MenA、MenC、MenW-135和MenY是TT缀合物。

与多糖接种方法有关的问题是多糖本身为弱免疫原这一事实。为克服此问题，可将本发明的糖类与蛋白载体缀合，所述载体可提供旁观T细胞辅助作用。因此，优选本发明所用的糖类连接至这种蛋白载体。目前常用于产生糖类免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔

血蓝蛋白(KLH)、来自流感嗜血杆菌的D蛋白(EP 594610-B)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的OMPC以及结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。

所述糖类可通过任何已知方法(例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757中的方法)连接至载体蛋白。优选地，可进行CDAP缀合(WO 95/08348)。

优选地，所述缀合物的蛋白∶糖类(重量∶重量)比例是0.3∶1到1∶1，更优选0.6∶1到0.8∶1，最优选约0.7∶1。

本发明包括提供抗肺炎球菌和不同病原体的保护作用的抗原组合。目前许多儿科疫苗以联合疫苗形式给子，以减少儿童必须接受的注射次数。因此，对于儿科疫苗来说，来自其它病原体的其它抗原可以与本发明的肺炎球菌疫苗一起配制。例如，本发明的疫苗可以用公知的‘三价’联合疫苗配制(或同一时间分别给予)，该联合疫苗包含白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)和百日咳成分[通常是脱毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，以及任选的粘附素(pertactin，PRN)和/或凝集素1+2]，例如市售疫苗INFANRIX-DTPa^TM(SmithKlineBeecham Biologicals)，其包含DT、TT、PT、FHA和PRN抗原，或带有完整百日咳细胞成分，例如SmithKlineBeechamBiologicals s.a.销售的Tritanrix^TM。联合疫苗还可以包含其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)、卡他莫拉菌(Moraxella Catarrhalis)外膜蛋白、非典型流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。

可包含在联合疫苗中(特别是用于预防中耳炎)的优选卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)蛋白抗原的实例为：OMP106[WO 97/41731(Antex)和WO 96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO 97/13785和WO 97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME等，(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO 93/03761(德州大学)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977.2)；lipo10(GB 9918208.1)；lipo11(GB 9918302.2)；lipo18(GB 9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE。可包含在联合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的非典型流感嗜血菌抗原的实例包括：丝束蛋白[(US 5766608-俄亥俄州研究基金会)]和含来自该蛋白的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US 5843464(OSU)或WO 99/64067]；OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]；P6[EP 281673(纽约州立大学)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；D蛋白(EP 594610)；P2和P5(WO 94/26304)。

设想的其它组合是本发明的肺炎链球菌糖类和蛋白与病毒抗原的组合，所述病毒抗原例如来自流感病毒(减毒的、裂解的或亚单位的)[例如表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)]。参见例如：Chaloupka I.等，Eur.Journal Clin.Microbiol.Infect.Dis.1996，15：121-127]；RSV(例如F和G抗原或F/G融合体，参见例如：Schmidt A.C.等，J Virol，2001年5月，4594-4603页)；PIV3(例如HN和F蛋白，参见Schmidt等，出处同上)；水痘病毒(例如减毒的、糖蛋白I-V等)以及MMR(麻疹、流行性腮腺炎、风疹)的任意(或全部)组分。

本发明设想用于整体治疗或预防中耳炎的优选儿科联合疫苗包含：一种或多种肺炎链球菌糖类抗原(优选缀合至D蛋白)、一种或多种肺炎球菌蛋白(优选上述肺炎球菌蛋白)和一种或多种来自卡他莫拉菌和/或非典型流感嗜血菌的表面暴露抗原。D蛋白可有利地用作肺炎球菌糖类(如上所述)的蛋白载体，因为其自身为能够产生B细胞介导的抗非典型流感嗜血菌(ntHi)保护作用的免疫原。卡他莫拉菌或非典型流感嗜血菌抗原可包含在亚单位形式的疫苗中，或者可作为存在于由细菌制备的外膜囊泡(疱)表面上的抗原被加入。

优选抗原

如上所述，在一个方面，本发明涉及含以下物质的组合物在生产免疫原性组合物中的用途：

(a)抗原，和

(d)水包油乳液佐剂；和

(e)3D MPL

其中所述水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂，所述免疫原性组合物用于预防感染和/或疾病。

因此，本发明的组合物用于能够通过该组合物预防或缓解的感染和/或疾病，适宜地，其中所述抗原来源于与疾病相关的病原体(例如细菌或病毒)或与该病原体相关。

来自甲型和乙型流感病毒、HPV抗原、RSV A和B、SARS、链球菌、VZV、鼻病毒、副流感病毒的抗原优选用于本发明，例如裂解流感抗原、VZV gE、VZV IE63和来自肺炎链球菌的PhtD。但是，可使用任意合适的抗原。

在一个实施方案中，用于本发明的组合物不包含流感亚单位抗原和MF59^TM佐剂。

对于本发明的所有方面，优选抗原包含CD4T细胞表位或B细胞表位，或适宜地包含这二者。

流感病毒株和抗原

按照本发明使用的流感病毒或其抗原性制备物可为裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物。在一个替代实施方案中，流感病毒制备物可包含另一类型的失活流感抗原，例如失活全病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)，或流感病毒颗粒。在再另一个实施方案中，流感病毒可为减毒活流感病毒制备物。

适宜地，按照本发明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物为失活病毒制备物，其中病毒颗粒用溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏。适宜地，裂解病毒或其裂解病毒抗原性制备物如下制备：用溶解浓度的有机溶剂或去污剂片段化感染性或失活的全流感病毒，随后去除全部或大部分溶解剂和某些或大部分病毒脂质物质。所述其裂解病毒抗原性制备物指相比于裂解病毒可能已经受了一定程度的纯化而保留了裂解病毒组分的大部分抗原特性的裂解病毒制备物。例如，当在卵中生产时，裂解病毒可由卵杂蛋白中去除，或者在细胞培养物中生产时，裂解病毒可由宿主细胞杂质中去除。裂解病毒抗原性制备物可包含一种以上病毒株的裂解病毒抗原性组分。含裂解病毒的疫苗(叫做‘裂解流感疫苗’)或含裂解病毒抗原性制备物的疫苗一般包含残余的基质蛋白和核蛋白，有时包含脂质以及膜包膜蛋白。这种裂解病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒结构蛋白，但不一定和它们在全病毒中存在的比例相同。

在另一个实施方案中，流感病毒制备物为纯化的亚单位流感疫苗形式。亚单位流感疫苗一般包含两种主要的包膜蛋白HA和NA，可能具有超越全病毒体疫苗的额外优势，因为它们一般无反应原性，尤其是在年轻的接种者中。亚单位疫苗可重组生产，或者可由破裂的病毒颗粒纯化。

在另一个实施方案中，流感病毒制备物为病毒体形式。病毒体是球形的单层囊泡，其保留了真实构象的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA，插入病毒体的磷脂双层膜中。

所述流感病毒或其抗原性制备物可为卵源的或组织培养源的。

例如，本发明的流感病毒抗原或其抗原性制备物可来源于常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的尿囊液。卵可在短时间内大量累积。或者，它们可来源于任何使用组织培养物的新生产方法，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基质包括例如狗肾细胞，例如MDCK或MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括Vero细胞，合适的猪细胞系，或适于生产疫苗用途的流感病毒的任意其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基质还包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如原初细胞，如小鸡胚成纤维细胞，还包括禽细胞系。

流感病毒抗原或其抗原性制备物可通过众多工业用方法中的任一种生产，例如在专利号DD 300833和DD 211444(通过引用结合到本文中)中描述的裂解流感病毒法。裂解流感病毒传统上使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚组合Tween^TM(称作“Tween-醚”裂解)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如在专利号DD155875(通过引用结合到本文中)中描述的脱氧胆酸钠。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)；其它离子去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子去污剂，如上述的一种，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals 28，95-103描述的方法中)和Triton N-101；或者任何两种或更多种去污剂的组合。

裂解疫苗的制备方法可包括众多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交换)步骤，以及任选的例如采用热、甲醛或β-丙酸内酯或紫外线的失活步骤，其可在裂解前或后进行。裂解过程可以分批、连续或半连续过程进行。用于裂解免疫原性组合物的优选裂解和纯化方法描述于WO02/097072。

本发明的优选裂解流感疫苗抗原制备物包括生产过程剩余的残余量的Tween 80和/或Triton X-100，但这些物质可在裂解抗原制备后加入或调整其浓度。优选地，Tween 80和Triton X-100都存在。疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为：

Tween 80：0.01-1％，更优选为约0.1％(体积/体积)

Triton X-100：0.001-0.1％(重量/体积)，更优选为0.005-0.02％(重量/体积)。

在一个具体实施方案中，Tween 80的终浓度在0.045％-0.09％(重量/体积)的范围内。在另一个具体实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Tween 80浓度在0.045％-0.2％(重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。

在另一个具体实施方案中，Triton X-100的终浓度在0.005％-0.017％(重量/体积)的范围内。在另一个具体实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Triton X-100浓度在0.005％-0.034％(重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。

优选地，流感病毒制备物在低水平硫柳汞存在下制备，或优选地在没有硫柳汞的情况下制备。优选地，获得的流感制备物在没有有机汞防腐剂的情况下是稳定的，具体地说，所述制备物不含残余硫柳汞。具体地说，流感病毒制备物包含在没有硫柳汞的情况下或在低水平硫柳汞(一般来说为5μg/ml或以下)的情况下稳定的血细胞凝集素抗原。具体地说，乙型流感毒株的稳定利用α生育酚衍生物如α生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯，即VES)来实施。这种制备物及其制备方法公开于WO 02/097072。

优选的组合物含3种失活的裂解病毒体抗原，它们由WHO推荐的适宜流感季的毒株制备。

优选地，流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂包含在同一容器中。这被称为‘单瓶法’。优选地，所述瓶为预填充注射器。在一个替代实施方案中，流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂包含在单独的容器或瓶中，并在给予给受试者之前不久或给予给受试者时混合。这被称为‘双瓶法’。作为实例，当疫苗为0.7ml总剂量体积的2组分疫苗时，浓缩抗原(例如浓缩三价失活裂解病毒体抗原)存在于1个瓶(335μl)(抗原容器)中，预填充注射器含佐剂(360μl)(佐剂容器)。在注射时，使用含佐剂的注射器将含浓缩的三价失活裂解病毒体抗原的瓶中的内容物由瓶中取出，接着轻微混合注射器。在注射前，使用的针用肌内针替换，体积调整到530μl。一剂重配的佐剂化流感疫苗候选物相当于530μl。

本发明的优选组合物包含具有CD4T细胞表位和任选的B细胞表位的抗原。

HPV抗原

在本发明的另一个方面，组合物包含源于人乳头瘤病毒(HPV)的抗原，例如来自被认为导致生殖器疣的病毒(HPV6或HPV11等)，或者来自导致子宫颈癌HPV病毒(HPV16、HPV18等)。在一个方面，预防性或治疗性组合物包含HPV 16或18抗原。HPV 16和HPV 18的感染涉及癌症的发展。

本发明可使用不同HPV基因型的抗原组合，例如HPV 16和HPV18抗原的组合，适宜地为VLP形式。可与16和/或18一起纳入的其它VLP类型的抗原包括其它已知引起癌症的类型的抗原，例如HPV31、45、33、58和52。

在一个方面，HPV抗原是L1或L2抗原单体。在一个方面，本发明涉及与壳粒或病毒样颗粒(VLP)一起存在的相同基因型的HPVL1和L2抗原的组合。在一个方面，HPV抗原是以VLP或壳粒结构形式存在的L1蛋白(没有L2抗原)。这类抗原、病毒样颗粒和壳粒本身是已知的。参见例如WO 94/00152，WO 94/20137、WO94/05792和WO93/02184。

在一个方面，截短的L1蛋白可用于本发明，例如作为在WO 96/11272中公开的蛋白。优选地，使用L1的C-末端截短物，例如HPV16的34个氨基酸C末端截短物，或其它HPV类型的等同截短物。

在本发明的一个方面，组合物包含得自HPV 16和HPV 18连同HPV 31和/或HPV 45的HPV病毒样颗粒或壳粒的组合。在本发明的一个方面，组合物包含得自HPV 16和HPV 18连同HPV 33和/或HPV 58的HPV病毒样颗粒或壳粒的组合。在本发明的一个方面，组合物包含得自HPV 16和HPV 18的HPV病毒样颗粒或壳粒，连同一种或多种引起癌症的HPV类型的VLP或壳粒的组合，所述HPV类型例如为HPV 31、33、45、52和58中的1种、2种、3种、4种或全部。

本发明因此在一个方面涉及一种含HPV 16、18、31和45的病毒样颗粒的组合物，所述病毒样颗粒与佐剂组合，所述佐剂含3D MPL和如本文所述的水包油乳液。

在本发明的一个方面，组合物包含仅HPV 16、18、31、33、45、52和58 L1的病毒样颗粒或壳粒的混合物。L1或L2蛋白可以融合蛋白的形式提供。

特别适宜形式的生殖器疣预防或治疗性组合物包含L1颗粒或壳粒和融合蛋白，该融合蛋白包含一种或多种选自HPV 6和HPV 11蛋白的抗原，例如E6、E7、L1和L2。

癌症类型的HPV抗原可与生殖器疣类型的抗原组合，例如HPV16和/或18与HPV 6和/或11。例如，设想了含HPV 16、18、6和11的组合物。在本发明的一个方面，仅HPV 16、18、31、33、45、52和58 L1的病毒样颗粒或壳粒的组合可用于和HPV 6和/或HPV 11的病毒样颗粒或壳粒组合。

在一个方面，可包含单独或组合的早期蛋白，例如E7、E2或E5，或其可为融合蛋白；其实施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。

在一个方面，融合蛋白是公开于WO 96/26277的L2E7或公开于GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)的D蛋白(1/3)-E7。

在一个方面，HPV 16抗原包含与D蛋白载体融合的早期蛋白E6或E7，以形成HPV 16的D蛋白-E6或E7融合体，或其组合；或者E6或E7与L2的组合(WO 96/26277)。

或者，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可在一个分子中存在，例如D蛋白-E6/E7融合蛋白。这种组合物可任选包含HPV 18的E6和E7之一或二者，例如为D蛋白-E6或D蛋白-E7融合蛋白或D蛋白E6/E7融合蛋白的形式。

水包油乳液佐剂组分

本发明的佐剂组合物包含水包油乳液佐剂，优选地所述乳液包含可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。

为了使任意水包油组合物适于人给予，乳液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢可定义为‘能够通过代谢被转化’(Dorland′s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。所述油可为任意植物油、鱼油、动物油或合成油，它们对接受者是无毒的，能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常用的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括商品化油，例如NEOBEE

等。特别合适的可代谢油是鲨烯。鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的特别优选的油。鲨烯是可代谢油缘于以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(Merck index，第10版，编目流水号8619)。

水包油乳液自身在本领域众所周知，已表明可用作佐剂组合物(EP 399843；WO 95/17210)。

适宜地，可代谢油以免疫原性组合物总体积的0.5％至20％(终浓度)的量存在，优选以总体积的1.0％至10％的量存在，优选以总体积的2.0％至6.0％的量存在。

在一个具体实施方案中，可代谢油以免疫原性组合物总体积的约0.5％、1％、3.5％或5％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，可代谢油以免疫原性组合物总体积的约0.5％、1％、3.57％或5％的最终量存在。

优选地，本发明的水包油乳液系统具有亚微米范围的小油滴粒度。适宜地，油滴的直径大小在120-750nm的范围内，更优选直径大小在120-600nm的范围内。最优选地，水包油乳液包含油滴，其至少70％(以强度计)的直径低于500nm，更优选至少80％(以强度计)的直径低于300nm，更优选至少90％(以强度计)的直径在120-200nm的范围内。

本发明的油滴粒度，即直径，以强度给出。有几种方法测定以强度计的油滴直径大小。强度使用粒度测量仪检测，适宜地通过例如Malvern Zetasizer 4000或优选Malvern Zetasizer 3000HS的动态光散射检测。详细的方法在实施例II.2给出。第一个可能性是通过动态光散射(PCS-光子相关光谱法)测定z平均直径ZAD；该方法额外给出了多分散指数(PDI)，ZAD和PDI这二者均用累积量算法计算。这些值不需要粒子折射率的信息。第二个方法是通过Contin或NNLS的另一种算法或自动化“Malvern”法(由粒度测量仪提供的默认算法)测定整体粒度分布来计算油滴直径。多数情况下由于复杂组合物的粒子折射率是未知的，所以只能考虑强度分布，如果有需要，由该分布获得强度平均值。

水包油乳液包含甾醇。甾醇在本领域众所周知，例如胆固醇是周知的，例如公开于Merck Index，第11版，341页，为动物脂肪中天然存在的甾醇。其它适宜的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、α-生育酚和麦角钙化甾醇。所述甾醇适宜地以免疫原性组合物总体积的0.01％至20％(重量/体积)的量存在，优选以0.1％至5％(重量/体积)的量存在。优选地，当甾醇为胆固醇时，其以免疫原性组合物总体积的0.02％至0.2％(重量/体积)的量存在，更优选以0.5ml疫苗剂量体积的0.02％(重量/体积)的量存在，或者以0.5ml疫苗剂量体积的0.07％(重量/体积)的量存在，或者以0.7ml疫苗剂量体积的0.1％(重量/体积)的量存在。

适宜地，甾醇是α-生育酚或其衍生物，例如α-生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯)。优选地，α-生育酚以免疫原性组合物总体积的0.2％至5.0％(体积/体积)的量存在，更优选以0.5ml疫苗剂量体积的2.5％(体积/体积)的量存在，或者以0.5ml疫苗剂量体积的0.5％(体积/体积)的量存在，或者以0.7ml疫苗剂量体积的1.7-1.9％(体积/体积)、优选1.8％的量存在。为明晰起见，以体积/体积给出的浓度可通过应用以下转换系数转变为以重量/体积表示的浓度：5％(体积/体积)α-生育酚浓度等于4.8％(重量/体积)α-生育酚浓度。

水包油乳液还可含有乳化剂。以免疫原性组合物重量计(重量/重量)乳化剂可以0.01-5.0％的量存在，优选以重量计(重量/重量)以0.1-2.0％的量存在。以总组合物的重量计(重量/重量)优选的浓度为0.5-1.5％。

乳化剂可适宜地为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)。在一个具体实施方案中，0.5ml疫苗剂量体积含1％(重量/重量)Tween80，0.7ml疫苗剂量体积含0.7％(重量/重量)Tween 80。在另一个具体实施方案中，Tween 80的浓度是0.2％(重量/重量)。

水包油乳液佐剂可用于其它佐剂或免疫刺激剂，因此本发明的一个重要实施方案是含鲨烯或另一种可代谢油、α-生育酚和tween 80的水包油制剂。水包油乳液还可包含span 85和/或卵磷脂。典型地，水包油包含免疫原性组合物总体积的2-10％的鲨烯，2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween 80，并可按照WO 95/17210中描述的方法生产。优选地，鲨烯：α-生育酚的比率等于或小于1，因为其提供了更稳定的乳液。Span 85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯)也可例如以1％的水平存在。

3D-MPL

组合物可包含另外的佐剂3脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL是一种TRL-4配体佐剂，是脂质A的无毒衍生物。

3D-MPL由Corixa公司以商标MPL

销售，在整个文件中称为MPL。主要促进具有IFNγ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。其可按照GB 2220211A中公开的方法生产。在化学上，其是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选地，在本发明组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒度使得其可通过0.22μm滤器除菌过滤。此制备描述于WO94/21292和实施例II。

3D-MPL可以例如每个组合物剂量1-100μg(重量/体积)的量使用，优选以每个组合物剂量10-50μg(重量/体积)的量使用。3D-MPL的适宜量例如为每个组合物剂量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg(重量/体积)中的任一个。更优选地，3D-MPL的量在每个组合物剂量25-75μg(重量/体积)的范围内。通常，组合物剂量将在约0.5ml至约1ml的范围内。典型的疫苗剂量为0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1ml。在一个优选实施方案中，每ml疫苗组合物包含50μg 3D-MPL的终浓度，或每0.5ml疫苗剂量包含25μg 3D-MPL的终浓度。在其它优选实施方案中，每ml疫苗组合物包含35.7μg或71.4μg 3D-MPL的终浓度。具体地说，0.5ml疫苗剂量体积每剂含25μg或50μg 3D-MPL。

MPL的剂量适宜地能够在人中增强针对抗原的免疫应答。具体地说，相比于无佐剂组合物，或相比于用另一种MPL量佐剂化的组合物，适宜的MPL量改善所述组合物的免疫效力，同时反应原性模式可接受。

3D MPL为TRL-4配体，为脂质A的无毒衍生物。本发明设想使用其它合适的TRL-4配体替代3D-MPL，包括脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。还设想了脂质A的无毒衍生物，具体地说为单磷酰脂质A。

合成的脂质A衍生物是已知的，其中一些被描述为TLR-4激动剂，其可能适用于本发明，包括但不限于：

OM174  (2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026)

OM 294DP  (3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197  MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127)

用于本发明第一次接种的免疫原性组合物的免疫原性特性

相比于用无佐剂(即不含任何外源佐剂)或至少没有佐剂组合物两种组分中的一种(3D-MPL或水包油乳液佐剂)的对应组合物(本文称为‘普通组合物’)获得的CD4T-细胞免疫应答，本发明组合物适宜地诱导抗至少一种组成抗原或抗原性组合物的改善的CD4T-细胞免疫应答。

所述‘改善的CD4T-细胞免疫应答’指在给予有佐剂免疫原性组合物之后在人类患者中获得的CD4应答高于在给予无佐剂或没有佐剂组合物两种组分中的至少一种的相同组合物后获得的免疫应答。例如，与给予含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物的免疫原性组合物之后诱导的应答相比，在给予含裂解流感病毒或其裂解流感抗原性制备物连同水包油乳液佐剂的免疫原性组合物时于人类患者中获得较高的CD4T-细胞应答。这种制剂将有利地用于诱导抗流感病毒的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子提呈的流感表位。

对于流感而言，优选地，由本发明的佐剂化裂解流感病毒组合物诱导的所述免疫应答高于用任意其它无佐剂常规流感疫苗(例如亚单位流感疫苗或全流感病毒疫苗)诱导的免疫应答。

具体地但非排它性地，所述‘改善的CD4T-细胞免疫应答’在免疫学上“未初免的”患者(即对所述抗原为血清阴性的患者)中获得。此血清阴性可能是从未面对这种抗原的所述患者(例如还没有感染病毒或含所述抗原的细菌-所谓的‘原初’患者)的结果，或者是在遭遇时不能对所述抗原应答的所述患者的结果。

改善的CD4T-细胞免疫应答可通过检测产生任何以下细胞因子的细胞数来评价：

·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞

·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞

·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞

·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞

·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞

当和给予无佐剂组合物相比在给予有佐剂组合物后产生任何以上细胞因子的细胞的量较高时，将存在改善的CD4T-细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少一种、优选两种将被实现。在一个具体实施方案中，与无佐剂组相比，有佐剂组中生产全部4种细胞因子的细胞将以更高量存在。

由本发明佐剂化流感组合物赋予的改善的CD4 T-细胞免疫应答实际上可在单次给予后获得。例如在快速发展的爆发情况下单剂方法将有极为重大的意义。在某些情况下，尤其是对于老年人群，或者对于首次接种抗疾病如流感的小孩(9岁以下)，给予两剂相同的该季组合物可能是有益的。第二剂所述相同组合物(仍被看作是‘用于首次接种的组合物’)可在初始免疫应答正在发展的过程中给予，并有足够的时间间隔。通常，第二剂组合物在首剂后数周或约1个月(例如2周、3周、4周、5周或6周)给予，以帮助触发无应答或低应答个体的免疫系统。

因此，本发明涉及含以下物质的组合物在生产免疫原性组合物中的用途：

(a)抗原，和

(f)水包油乳液佐剂；和

(g)3D MPL

其中所述水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂，所述免疫原性组合物用于诱导抗所述抗原的改善的CD4T细胞应答。

本发明还涉及一种诱导抗抗原的改善的CD4T细胞应答的方法，所述方法包括传递含以下物质的组合物：

(a)抗原，和

(b)如本文定义的水包油乳液佐剂；和

(C)3D-MPL。

在一个具体实施方案中，与用无佐剂组合物或没有佐剂组合物两种组分中一种的组合物免疫的个体中诱导的B记忆细胞应答相比，给予所述免疫原性组合物在给予有佐剂免疫原性组合物的患者中替代地或额外地诱导改善的B-记忆细胞应答。改善的B-记忆细胞应答意指在遭遇抗原时能够分化为分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率增加，这通过体外分化刺激检测(参见实施例部分，例如Elispot B细胞记忆的方法)。

在再另一个具体实施方案中，用有佐剂的首次接种用组合物接种对CD8应答无可检测的影响。

优选地，所述改善的CD4T细胞应答在免疫应答受损受试者中获得，例如老年个体，通常至少50、55、60或65岁或以上，或者具有高风险医疗状况的55岁以下成人(‘高风险’成人)，或2岁以下的儿童。

本申请人已令人惊奇地发现，含可代谢油、甾醇和乳化剂以及3DMPL的水包油乳液佐剂在免疫应答受损人群中有效促进T细胞应答。本申请人已表明，对于流感来说，根据在老年人群中进行抗流感再接种后流感疫苗保护作用的关联性评价，与用无佐剂裂解疫苗接种相比，给予单剂如本发明所述的首次接种用免疫原性组合物能够提供更好的血清保护作用。相比于无佐剂制剂获得的免疫应答，要求保护的有佐剂制剂还能够诱导抗流感病毒的改善的CD4T-细胞免疫应答。该观察结果可能与接种或面对流感抗原性接触的感染时增加的应答性相关。而且，其还可能与交叉反应性相关，即对变体流感株应答的能力较高。这种改善的应答可能在免疫受损的人群如老年人群(例如50、55、60、65岁和以上)以及尤其是高风险老年人群中特别有益。这可导致降低整体的发病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感类疾病的紧急入院。这还可对婴儿群体(5岁以下，优选2岁以下)有益。而且，与用无佐剂制剂诱导的应答相比，其允许诱导时间更持久的CD4T细胞应答，例如在首次接种后1年仍存在。

本发明人还已经能够表明，相比于用无佐剂组合物获得保护性抗体水平的个体，要求保护的有佐剂组合物能够在更多的个体中不仅诱导而且保持抗疫苗中存在的全部3种毒株的保护性抗体水平(例如参见表43)。

因此，在再另一个实施方案中，要求保护的组合物能够确保抗流感相关疾病的持续性免疫应答。具体地说，所述持续性指HI抗体免疫应答能够在接种后至少3个月后、优选至少6个月后满足管理标准。具体地说，要求保护的组合物能够在至少3个月后在＞70％的个体中、适宜地在＞80％的个体中或适宜地在＞90％的个体中诱导针对疫苗中存在的至少一种流感株、优选所有毒株的保护性抗体水平。在一个具体方面，在接种后至少6个月获得抗疫苗组合物中存在的至少一种、适宜地两种或全部毒株的＞90％的保护性抗体水平。

采用流感得到的这些观察结果适用于其它疾病和抗原，因为其已表明还用于HPV抗原(参见实施例XIII)。

因此，本发明还涉及本发明组合物在免疫应答受损的人类个体或群体(例如高风险成人或老年人)中和生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于接种免疫应答受损的人类个体或群体，例如高风险成人或老年群体。

我们已确定，使用抗原连同本文定义的水包油乳液可产生针对变体抗原的交叉反应性应答。

优选地，CD4 T-细胞免疫应答，例如在未初免受试者中获得的改善的CD4T-细胞免疫应答，包括诱导交叉反应性CD4T辅助应答。具体地说，增加交叉反应性CD4T细胞的量。所述‘交叉反应性’CD4应答指CD4T-细胞靶向流感株之间的共有表位。

对于流感而言，例如，可用的流感疫苗通常仅有效对抗具有相似抗原性特征的血细胞凝集素的流感病毒感染株。当感染(循环)性流感病毒已经历了表面糖蛋白(具体地说是血细胞凝集素)的微小变化(例如点突变或点突变的累积，导致例如氨基酸改变)时(抗原漂移变体病毒株)，疫苗仍可提供一些保护作用，但其可能仅提供有限的保护作用，因为新产生的变体可能逃脱先前流感感染或接种诱导的免疫性。抗原漂移是两次大流行期间发生的年度流行的原因(Wiley &Skehel，1987，Ann.Rev.Biochem.56，365-394)。交叉反应性CD4T细胞的诱导为本发明组合物提供了额外的优势，因为其还可提供交叉保护作用，换句话说是抗异源感染的保护作用，所述异源感染即由为免疫原性组合物中包含的流感病毒株的变体(例如漂移变体)的循环流感病毒株引起的感染。这在循环毒株难以在卵中繁殖或难以在组织培养物中生产时可能是有利的，使漂移株用作备选工作株。这在受试者以几个月或一年间隔接受第一次和第二次接种时也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性组合物中的流感株是用于首次接种的组合物中使用的毒株的漂移变体株。

在实施例3中给出的临床前数据例如显示了根据体温读数确定的本发明组合物抗异型流感感染和疾病的保护能力。在再接种研究中获得的临床实验数据适用相同的结论。

在本发明的另一方面，提供本发明组合物抗由病原体引起的感染或疾病的保护作用的用途，所述病原体是由其获得第一种组合物中抗原的病原体的变体。还提供本发明组合物抗由病原体引起的感染或疾病的保护作用的结果，所述病原体包含为本发明组合物中抗原的变体的抗原。

变体病原体和/或抗原适宜地与第一种病原体和/或抗原具有共同的CD4T细胞表位和/或B细胞表位，但它们不完全相同。

交叉反应性CD4T-细胞的检测(例如在用流感疫苗接种后)

在给予经典的三价流感疫苗后(3周)，对抗原性毒株制备物(全病毒或裂解抗原)应答的外周血CD4 T-细胞的频率显著增加，所述抗原性毒株制备物与疫苗中存在的一种抗原(H3N2：A/巴拿马/2007/99；H1N1：A/新喀里多尼亚/20/99；B：B/山东/7/97)(参见实施例III)同源。如果用分类为漂移株(H3N2：A/悉尼/5/97，H1N1：A/北京/262/95，B：B/山梨/166/98)的流感株再刺激外周血CD4 T-细胞，则可以见到相当大的频率增加。

相反，如果由本领域的专家用分类为转换株(H2N2：A/新加坡/1/57；H9N2：A/香港/1073/99)的流感株再刺激外周血CD4 T-细胞，则在接种后没有可观测的增加。

能够同时识别同源和漂移的流感株的CD4 T-细胞在本文件中已命名为“交叉反应性”。

已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4 T-细胞表位(Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995 J Virol.1995 69(12)：7497-506)。

在一个具体实施方案中，有佐剂组合物可提供额外利益，该利益提供了抗循环毒株的更好保护作用，所述循环毒株经历了血细胞凝集素的大改变(例如基因重组，例如两个不同物种之间的基因重组)(抗原转变)，目前可用疫苗对其无效。

其它佐剂

组合物可包含另外的佐剂，适宜地例如为TRL-4配体佐剂或脂质A的无毒衍生物。适宜的TLR-4配体为脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。

合成的脂质A衍生物是已知的，其中一些被描述为TLR-4激动剂，其包括但不限于：

OM174  (2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026)

OM 294  DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197  MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127)

其它合适的TLR-4配体例如为脂多糖及其衍生物、胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞体病毒的F蛋白。

用于本发明的另一种合适的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美奎拉雅属皂树(Quilaja Saponaria Molina)的皂苷制备物，首先由Dalsgaard等在1974年描述(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamte Virusforschung，44卷，Springer Verlag，Berlin，243-254页)具有佐剂活性。已通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留了佐剂活性，没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS-21是一种来源于奎拉雅属皂树(Quilaja Saponaria Molina)树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答，在本发明范围内是优选的皂苷。

业已描述了QS21的具体制剂，它们是特别优选的，这些制剂还包含甾醇(WO96/33739)。构成本发明一部分的皂苷可为水包油乳液形式(WO 95/17210)。

再接种

本发明的一个方面提供抗原在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用抗原或其片段或变体与3DMPL和如本文定义的水包油乳液佐剂接种的人。

通常，再接种于首次接种后至少6个月进行，优选8-14个月后进行，更优选约10-12个月后进行。

优选地，提供以下物质在生产免疫原性组合物中的用途：

(1)抗原和

(2)水包油乳液佐剂

所述免疫原性组合物用于再接种先前用抗原或其片段或变体、3DMPL和如本文定义的水包油乳液佐剂接种的人。

优选地，提供以下物质在生产免疫原性组合物中的用途：

(1)抗原和

(2)水包油乳液佐剂，和

(3)3D MPL

所述免疫原性组合物用于再接种先前用抗原或其片段或变体、3DMPL和如本文定义的水包油乳液佐剂接种的人。

在一个优选实施方案中，本发明提供以下物质在生产免疫原性组合物中的用途：

(1)抗原和

(2)水包油乳液佐剂，和

(3)3D MPL

所述免疫原性组合物用于再接种先前用所述抗原或其片段或变体接种的人。

在一个具体实施方案中，用于再接种的组合物适宜地与用于首次接种的组合物共有共同的CD4T-细胞表位。就此方面而言，其被看作是用于首次接种的抗原的变体。

用于再接种的免疫原性组合物(加强组合物)可包含与用于首次接种的免疫原性组合物相同类型的抗原制备物，例如亚单位/裂解/全失活病毒。或者，加强组合物可包含另一种类型的抗原制备物。例如，对于流感而言，首次接种可用裂解制备物，加强接种采用另一种失活的流感抗原，例如失活的全病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)。加强组合物可有佐剂或无佐剂。

对于流感而言，无佐剂的加强组合物可为肌内给予的Fluarix^TM/α-Rix

。所述制剂包含3种由WHO推荐的适宜流感季毒株制备的失活裂解病毒体抗原。

变体可为与用于首次接种的抗原性组合物共有共同的CD4T-细胞表位(一般被认为是由T细胞受体识别和结合的抗原性决定簇)的抗原，但其与该抗原性组合物不完全相同。

变体可为与用于首次接种的抗原性组合物共有共同的B-细胞表位(一般被认为是由B细胞受体识别和结合的抗原性决定簇)的抗原，但其与该抗原性组合物不完全相同。

T细胞和B细胞表位可使用本领域众所周知的技术预测，或者使用本文描述的技术由免疫应答推断。

所述水包油乳液佐剂优选包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。

在一个具体实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物(下文也称为‘加强组合物’)包含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物，它们与用于首次接种的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。

一般来说，对于所有抗原来说，共同的CD4 T-细胞表位意指可由相同的CD4细胞识别的不同抗原的肽/序列/表位(参见例如以下描述的表位：Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995 J Virol.199569(12)：7497-506)。

在流感背景下，在一个优选实施方案中，流感株可与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的潜力。具体地说，当疫苗是多价疫苗如二价疫苗或三价疫苗时，至少一种毒株与大流行爆发相关，或者具有与大流行爆发相关的潜力。合适的毒株为但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。

通常，加强组合物在使用时于下一个流感季给予，例如在第一个免疫原性组合物之后约1年给予。加强组合物还可随后每年给予(第三次、第四次、第五次接种等)。加强组合物可与第一种组合物相同。适宜地，加强组合物包含毒株或得自其的抗原性制备物，所述毒株为用于首次接种的流感病毒的变体株。

用于再接种的流感抗原或抗原性组合物优选包含佐剂或适宜地如上所述的水包油乳液。所述佐剂可为如上文所述的水包油乳液佐剂，其是优选的，任选地包含额外的佐剂，例如TLR-4配体，如3D-MPL或皂苷，或者可为另一种合适的佐剂，例如铝。

对于本发明的所有抗原来说，相比于用无佐剂裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物第一次接种后诱导的对等应答，再接种诱导以下的任一个、优选两个或全部：(i)抗流感病毒或其抗原性制备物的改善的CD4应答，或(ii)改善的B细胞记忆应答或(iii)改善的体液应答。优选地，用本文定义的有佐剂裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物再接种后诱导的免疫应答高于用无佐剂组合物再接种后诱导的对应应答。优选地，在用有佐剂裂解流感病毒组合物首次接种的人群中，用无佐剂流感病毒、优选裂解的流感病毒再接种后诱导的免疫应答高于在用无佐剂裂解流感病毒组合物首次接种的人群中的对应应答。

在本发明的另一方面，提供以下物质在生产免疫原性组合物中的用途：

(1)来自第一病毒株或细菌菌株的抗原，和

(2)水包油乳液佐剂

(3)3D MPL

所述免疫原性组合物用于抗由病毒株或细菌菌株引起的感染或疾病的保护作用，所述病毒株或细菌菌株是所述第一病毒株或细菌菌株的变体。

例如，对于流感而言，与对照疫苗赋予的保护作用相比，本发明的佐剂化组合物能够诱导更好的抗漂移株(下一流感季的流感株)的保护作用。

流感病毒株及其抗原

对于含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物的组合物来说，所述组合物适宜地为单价的或多价的，例如二价或三价或四价。优选地，裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物是三价的或四价的，具有来自3种不同流感毒株的抗原。

任选地，至少一种毒株与大流行爆发相关，或者具有与大流行爆发相关的潜力。

作为背景，在大流行之间的时间段内，与之前大流行的流感病毒相关的流感病毒传播。病毒以和生命早期感染不同的免疫性水平在人之间传播。在通常2-3年的时间段内，这种传播促进对已改变得足以在一般群体中再引起流行病的新毒株的选择；此过程称为‘抗原漂移’。‘漂移变体’在任一年中在不同的社区、地区、国家或洲都具有不同影响，尽管在几年内其总体影响经常是相似的。换句话说，当出现人群对其没有免疫性的新流感病毒时，发生流感大流行。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。老年人或患有基础性慢性疾病的人最有可能体验此并发症，而幼儿也可能患严重疾病。

在不可预见的间隔内出现新流感病毒，其具有与之前季节流行的毒株完全不同亚型的关键表面抗原血细胞凝集素。此时，产生的抗原可以先前于人中循环的毒株的对应蛋白的20％至50％变化。这可导致病毒逃逸‘群体免疫’，并建立大流行。此现象叫做‘抗原转换’。一般认为，至少在过去已发生了大流行，当时不同物种的流感病毒如禽或猪流感病毒已穿过种间屏障。如果这些病毒具有人与人之间传播的潜力，它们可在数月至一年内全球扩散，导致大流行。例如，在1957年(亚洲流感大流行)，H2N2亚型取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少从首先分离到该病毒的1918年开始就在人群中循环。H2HA和N2NA在1957年至1968年之间经历了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出现的H3N2流感病毒亚型替代，此后N2NA连同H3HA继续漂移(Nakajima等，1991，Epidemiol.Infect.106，383-395)。

给予其引起大流行爆发潜力的流感病毒株特征是：与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素，其可伴有或不伴有神经氨酸酶亚型的改变；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的乃至整个群体以前都没有遇到抗原，在免疫学上对抗原是原初态的。

一般来说，在大流行环境下，某些群体被流感感染的风险增加。老年人、慢性疾病患者和小孩尤其易感，但许多年轻人和表面上健康的人也有风险。对于H2流感，1968年后出生的部分群体的风险增加。对这些群体重要的是尽快地和以简单的方式有效地保护。

风险增加的另一个人群是旅行者。今天，人们比以往任何时候都更常旅行，出现最多新病毒的地区中国和东南亚在近些年已成为受欢迎的旅行目的地。传播模式的这种改变能使新病毒在约数周内而不是数月或数年内到达全球。

因此，对于这些人群来说，在大流行情况下或潜在大流行的情况下特别需要接种保护来对抗流感。适宜的毒株是但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。

任选地，所述组合物可包含3价以上，例如两种非大流行毒株加一种大流行毒株。或者，所述组合物可包含3种大流行毒株。

在再一个实施方案中，本发明涉及一种接种方案，其中首次接种使用含至少一种流感毒株的裂解流感组合物进行，其中所述流感毒株可潜在地引起大流行爆发，再接种用流行株或者经典株的循环毒株进行。

HA中的CD4表位

此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表位区。已知病毒用于逃避宿主免疫系统的适应性应答的不同流感株之间CD4和B细胞表位的任意差异都将在流感接种中起重要作用，并确实如此。

已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4T-细胞表位(参见例如：Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 JVirol.70(7)：4787-90；和Gelder CM等，1995 J Viroi.1995 69(12)：7497-506)。

在一个具体的实施方案中，再接种使用含流感病毒或其抗原性制备物的加强组合物进行，所述流感病毒或其抗原性制备物与用于第一次接种的裂解流感病毒抗原或其裂解病毒抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。

因此，本发明涉及含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和如本文定义的水包油乳液佐剂以及3D MPL的免疫原性组合物在生产多剂量疫苗的首次接种组分中的用途，所述多剂量疫苗还包含作为加强剂量的流感病毒或其抗原性制备物，它们与第一次接种时所给予剂量的裂解流感病毒抗原或其裂解病毒抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。

接种

本发明的组合物可通过任意合适的传递途径给予，例如皮内、粘膜如鼻内、口服、肌内或皮下。其它传递途径在本领域众所周知。

肌内传递途径对佐剂化流感组合物是优选的。

皮内传递是另一个适宜的途径。任意合适的装置都可用于皮内传递，例如在US 4,886,499、US 5,190,521、US 5,328,483、US5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662中描述的短针装置。皮内疫苗还可通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的装置给予，例如描述于WO99/34850和EP1092444的装置及其功能等同物，这两个文献通过引用结合到本文中。快速注射装置也是适宜的，其经液体快速注射器或经刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针传递液体疫苗至真皮。快速注射装置描述于例如US5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。喷射粉末/颗粒传递装置也是适宜的，其使用压缩气体加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规注射器可用于皮内给予的经典结核菌素皮内试验法。

另一个合适的给予途径是皮下途径。任意合适的装置都可用于皮下传递，例如经典的针。优选地，使用例如在WO 01/05453、WO01/05452、WO 01/05451、WO 01/32243、WO 01/41840、WO 01/41839、WO 01/47585、WO 01/56637、WO 01/58512、WO 01/64269、WO01/78810、WO 01/91835、WO 01/97884、WO 02/09796、WO 02/34317中公开的无针快速注射器服务。更优选地，所述装置用液体疫苗制剂预填充。

或者，疫苗鼻内给予。典型地，疫苗局部给予于鼻咽部，优选没有吸入到肺中。理想的是使用将疫苗制剂传递入鼻咽部而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内传递装置。

本发明疫苗的优选鼻内给予装置是喷雾装置。适宜的商用鼻喷雾装置包括Accuspray^TM(Becton Dickinson)。雾化器产生非常细小的雾滴，其可被轻易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。

用于鼻内用途的优选喷雾装置的性能与使用者提供的压力无关。这些装置称为压力域装置。只有在提供临界压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压力域装置在本领域是已知的，描述于例如WO 91/13281和EP 311863 B和EP 516 636，这些文献通过引用结合到本文中。这种装置可由Pfeiffer GmbH购买，还描述于Bommer，R.PharmaceuticalTechnology Europe，1999年9月。

优选的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体检测)范围为1-200μm，优选10-120μm。小于10μm存在吸入风险，因此理想的是10μm以下的液滴不超过约5％。120μm以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超过约5％。

双剂量传递是用于本发明疫苗的鼻内传递系统的又一优选特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔给予一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于一个容器中，装置的构造允许每次有效传递单个亚剂量。任选地，可使用单剂量装置给予本发明疫苗。

或者，本发明还设想了表皮或经皮接种途径。

在本发明的一个具体方面，首次给予的有佐剂免疫原性组合物可肌内给予，有佐剂或无佐剂的加强组合物可通过不同途径给予，例如皮内、皮下或鼻内。在另一个具体实施方案中，首次给予的组合物可包含每个流感毒株15μg的标准HA含量，加强组合物可包含低剂量的HA，即低于15μg，并根据给予途径可以较小体积给予。

接种群体

接种的目标群体优选为人群体或个体。

接种的目标群体可为免疫应答受损的人。和健康成人相比，免疫应答受损的人一般不能很好地对抗原、尤其是流感抗原应答。

优选地，目标群体是未对流感初免的群体，他们或者是原初态的(例如相对于大流行毒株)，或者先前对感染或接种不能应答。优选地，目标群体是老年人，适宜地为55岁和以上，较年轻的高风险成人(即18-54岁)，例如在保健机构工作的人，或者具有高风险因素如心血管病和肺病或糖尿病的年轻成人。另一个目标群体是所有6个月和以上的儿童，尤其是6-23个月龄的儿童，他们经历了相对高的流感相关住院率。优选地，目标群体是65岁以上的老年人。

接种方案、给药和附加的效力标准

各疫苗剂量中糖类(或其缀合物)抗原的量应选择为在通常的疫苗中能诱导免疫保护性应答而又不引起明显有害副作用的量。此量将随使用的具体免疫原和其存在的方式而变化。通常，期望每个剂量含0.1-100μg糖类，优选0.1-50μg，优选0.1-10μg，其中1-5μg为最优选的范围。

疫苗中蛋白抗原的含量通常为1-100μg的范围内，优选5-50μg，最常用的范围为5-25μg。

特定疫苗的成分最佳量可通过标准研究确定，标准研究包括观察受试者中的适宜免疫应答。在初始接种后，受试者可接受间隔足够的一次或几次加强免疫。

疫苗制备一般描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(Powell M.F.和Newman M.J.编辑)(1995)Plenum Press NewYork)。Fullerton的美国专利4,235,877描述了脂质体中的囊化。

流感抗原剂量

对于流感来说，适宜地，本发明的免疫原性组合物在大部分情况下为标准0.5ml注射剂量，据据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)检测，含各个流感株的15μg血细胞凝集素抗原组分。适宜地，疫苗剂量体积在0.5ml至1ml之间，具体地说是标准0.5ml或0.7ml疫苗剂量体积。根据原液样品中的HA浓度，可常规地轻微调整剂量体积。

适宜地，所述免疫原性组合物含低剂量的HA抗原-例如每流感株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14μg HA中的任一种。适宜的低剂量HA在每流感株1-7.5μg HA之间，适宜地在每流感株3.5-5μg HA之间，例如每流感株3.75μg HA，典型地约每流感株5μg HA。

有利地，本发明的疫苗剂量，尤其是低剂量疫苗，可以比一般为每剂约0.5、0.7或1ml的常规注射裂解流感疫苗小的体积提供。本发明的小体积剂量优选每剂不到500μl，更优选每剂不到300μl，最优选每剂不超过约200μl或以下。

因此，按照本发明一个方面，优选的小体积疫苗剂量是在小体积中具有低抗原剂量的剂量，例如在约200μl体积中有约15μg或约7.5μg HA或约3.0μg HA(每毒株)。

本发明的流感药物优选满足疫苗的某些国际标准。

国际上提出了检测流感疫苗效力的标准。在下表1中显示了有效抗流感的欧盟官方标准。理论上，为满足欧盟要求，对疫苗中包含的所有流感株来说，流感疫苗仅需满足表中的一项标准。本发明的组合物适宜地满足这些标准中的至少一项。

然而，在实践中，所有病毒株必须满足所述标准中的至少两项或全部三项，特别是对于新型疫苗(例如经不同途径传递的新型疫苗)而言。在某些情况下，两项标准可能足够了。例如，可以接受所有病毒株满足三项标准中的两项，而部分但不是全部病毒株满足第三项标准(例如三种病毒株中的两种)。对成年人群体(18-60岁)和老年人群体(大于60岁)的要求是不同的。

表1

	18-60岁	＞60岁
			血清阳转率*	＞40％	＞30％
转变因子**	＞2.5	＞2.0
			保护率***	＞70％	＞60％

^*血清阳转率定义为接种后针对每种疫苗株的血清血细胞凝集素抑制(HI)滴度增加达至少4倍的接种者的百分率。

^**转变因子定义接种后针对每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数。

^***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于或高于1∶40的接种者的百分率，通常可被看作指示保护作用。

再一方面，本发明提供一种针对疾病设计疫苗的方法，该疾病已知要通过CD4+T细胞活化治愈或治疗，该方法包括：

1)选择含CD4+表位的抗原，和

2)组合所述抗原和在上文定义的水包油乳液佐剂与3D MPL，其中所述疫苗在所述哺乳动物中给予时能够在所述哺乳动物中诱导增强的CD4T细胞应答。

本申请的所有参考文献(包括专利申请和已授予专利)的教导都完全通过引用结合到本文中。

为避免疑惑，本发明人意图为本文的术语‘包含’在每种情况下都任选地可被术语“由......组成”替代。

本发明将参考以下的非限制性实施方案进一步描述：

实施例I描述了在小鼠、雪貂和人研究中使用的免疫解读方法。

实施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐剂制剂的制备和表征。

实施例III描述了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗进行的临床实验。

实施例IV描述了第二个临床实验-再接种实验-在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗进行。

实施例V显示了有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价(研究I和研究II)。检测温度监测、病毒脱落和CD4 T-细胞应答。

实施例VI显示了有佐剂和无佐剂的流感疫苗在C57BI/6原初小鼠和初免小鼠中的临床前评价。

实施例VII显示了有佐剂和无佐剂的裂解和亚单位流感疫苗在用异源毒株初免的C57BI/6小鼠中的临床前评价。

实施例VIII描述了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验，所述制备物含AS03佐剂、AS03+MPL佐剂或没有外源佐剂。

实施例IX显示了有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价(研究III)。检测温度监测、病毒脱落和HI滴度。

实施例X显示了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验：在90天和180天时的免疫原性持久性数据，所述制备物含AS03，有或没有MPL佐剂。

实施例XI显示了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验，所述制备物含AS03和MPL佐剂。

实施例XII显示了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验，所述制备物含AS03和两个浓度的MPL佐剂。

实施例XIII显示了两种有佐剂HPV疫苗在小鼠中的临床前评价。检测抗体和B细胞记忆应答。

实施例I-免疫解读方法

I.1.小鼠法

I.1.1.血凝反应抑制测试

测试程序

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制小鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。热失活血清预先用高岭土和小鸡RBC处理，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶20，所以不可检测水平记录为等于10的滴度。

统计学分析

使用UNISTAT对接种后的HI滴度进行统计学分析。用于分析方差的方法可如下简述：

■数据的对数转换

■对各个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性

■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性

■对各组进行的双因素方差分析

■用于多重比较的Tukey HSD检验

I.1.2.胞内细胞因子染色

该技术允许根据细胞因子生产定量抗原特异性T淋巴细胞：效应子T细胞和/或生产IFN-γ的效应子-记忆T细胞和/或生产IL-2的中枢记忆性T细胞。在免疫后7天收集PBMC。

在分泌性抑制剂(Brefeldine)存在下体外再刺激淋巴样细胞。然后使用荧光抗体(CD4、CD8、IFN-γ和IL-2)通过常规免疫荧光法处理这些细胞。结果表示为CD4/CD8 T细胞中细胞因子阳样的细胞的频率。在第二次免疫后7天对PBMC进行T细胞的胞内细胞因子染色。由小鼠收集血液，并合并在肝素化培养基RPMI+添加物中。对于血液，RPMI+添加物稀释的PBL悬浮液按照推荐的方法(于室温以2500rpm离心20分钟)在Lympholyte-Mammal梯度上分层。去除分界面处的单核细胞，用RPMI+添加物清洗2次，用RPMI 5％胎牛血清将PBMC悬浮液调整至2×10⁶个细胞/ml。

用Whole FI(1μg HA/毒株)以1×10⁷个细胞/ml(管式FACS)的终浓度对PBMC进行体外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(均为1μg/ml)的情况下于37℃温育2小时。

在抗原再刺激步骤后，在Brefeldin(1μg/ml)存在下于37℃过夜温育PBMC，以抑制细胞因子分泌。

IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色如下进行：清洗细胞悬浮液，重悬浮在含2％Fc封闭试剂(1/50；2.4G2)的50μl PBS 1％FCS中。于4℃温育10分钟后，加入抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8 perCp(3/50)的50μl混合物，于4℃温育30分钟。在PBS 1％ FCS中清洗后，通过重悬浮在200μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)中并于4℃温育20分钟使细胞透化。然后用Perm Wash(Kit BD)清洗细胞，并用以Perm Wash稀释的抗-IFN-γ APC(1/50)+抗-IL-2 FITC(1/50)的50μl混合物重悬浮。于4℃温育最少2小时最长过夜后，用Perm Wash清洗细胞并重悬浮在PBS 1％ FCS+1％多聚甲醛中。通过FACS进行样品分析。门控(FSC/SSC)活细胞，对CD4+T细胞上的约20,000事件(淋巴细胞)或35,000个事件进行探测。针对CD4+和CD8+门控的群计算IFN-γ+或IL2+的百分率。

I.2.雷貂法

I.2.1.血凝反应抑制测试(HI)

测试程序

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制小鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热失活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。

统计学分析

使用UNISTAT对HI滴度(41天，攻击前)进行统计学分析。用于分析方差的方法可如下简述：

■数据的对数转换

■对各个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性

■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性

■对单因素ANOVA的交互作用的检验

■用于多重比较的Tukey HSD检验

I.2.2.体温监测

在攻击期间用传感器并通过遥测法记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI(Data Sciences International，Centaurusweg 123，5015 TC Tilburg，The Netherlands)进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。

在攻击前4天直至攻击后7天每15分钟记录温度。

I.2.3.鼻清洗

通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于干冰上的样品容器中。

鼻清洗液的病毒滴定

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染物。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育5-7天。

在5-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20 WST-1的培养基，再温育18小时。

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3 OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD＜截取值时定义为阳性得分，相反，OD＞截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。

I.3.评价人中免疫应答的测定

I.3.1.血凝反应抑制测定

使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta，USA(1991)描述的方法通过检测HI抗体测定免疫应答。

使用4个血凝反应抑制单位(4HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬浮液，用标准的和综合验证过的微量法对融化的冷冻血清样品进行抗体滴度检测。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。

评价所获血清的HI抗体水平。以1∶10起始稀释度开始制备连续稀释度(乘以因数2)，直至最终稀释度1∶20480。将显示完全抑制(100％)血凝反应的最高稀释度步骤视为滴定终点。所有实验都以双份进行。

I.3.2.神经氨酸酶抑制测定

在包被胎球蛋白的微量滴定板中进行测定。制备2倍连续稀释的抗血清，与标准化量的甲型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。测试基于由胎球蛋白酶促释放神经氨酸的神经氨酸酶生物活性。在切下末端神经氨酸后，β-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出来。向各孔加入来自落花生的辣根过氧化物酶(HRP)标记的花生凝集素，其特异性结合半乳糖结构。可在与四甲基联苯胺(TMB)的底物反应中检测和定量结合凝集素的量。表明仍抑制病毒神经氨酸酶活性达至少50％的最高抗体稀释度为NI滴度。

I.3.3.中和抗体测定

对融化的冷冻血清样品进行中和抗体检测。包含在血清中的抗体的病毒中和以微量中和实验来测定。血清在实验中无需进一步处理即可使用。

各个血清以三重测定进行测试。将标准化量的病毒与连续稀释的血清混合并温育，以使抗体结合病毒。然后将含限定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入病毒和抗血清的混合物中，于33℃温育。在温育期后，通过小鸡红细胞的凝集反应显现病毒复制。利用Reed andMuench的方法计算血清的50％中和滴度。

I.3.4.通过细胞因子流式细胞仪(CFC)评价细胞介导的免疫性

外周血抗原特异性CD4和CD8T细胞可在体外被再刺激，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFN，如果与其对应抗原温育。因此，抗原特异性CD4和CD8T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞仪计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8T细胞的频率。

I.3.5.统计方法

I.3.5.1.主要终点

·在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中诉求的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同接种的关联。

·在接种后的21天随访期(即接种日和随后20天)以及整个过程中主动诉求的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同与接种的关联。

·整个研究过程中严重不良事件的发生。

I.3.5.2.次要终点

对于体液免疫应答：

观测变量：

·在0天和21天：血清血凝反应抑制(HI)和NI抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。

·在0天和21天：中和抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试。

衍生变量(具有95％置信区间)：

·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMT)

·21天时具有95％CI的血清阳转率^*

·21天时具有95％CI的转变因子^**

·21天时具有95％CI的血清保护率^***

·在所有时间点的血清NI抗体GMT(具有95％置信区间)

^*血清阳转率定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI滴度时增加达至少4倍的接种者百分率。

^**转变因子定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。

^***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于40的接种者百分率，通常将该百分率看作指示保护作用。

对于细胞介导的免疫(CMI)应答

观测变量

在第0天和21天：不同测试中每10⁶当中细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试都定量CD4/CD8T细胞针对以下物质的应答：

·肽流感(pf)抗原(这些抗原的精确性质和来源不需要给出/解释)

·裂解流感(sf)抗原

·全流感(wf)抗原

衍生变量：

·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞

·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞

·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞

·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞

·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞

I.3.5.3.免疫原性分析

免疫原性分析基于总接种群体。对于每个治疗组，计算以下参数(具有95％置信区间)：

·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)

·在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)

·21天时的转变因子

·21天时的血清阳转率(SC)，定义为相比于第0天在第21天时血清HI滴度增加达至少4倍的接种者百分率。

·21天时的保护率，定义为血清HI滴度＝1∶40的接种者百分率。

·在各个时间点(第0天、第21天)针对每个接种组和针对每种抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和全流感(wf)抗原)总结CD4/CD8T-淋巴细胞分泌应答的频率(描述统计)。

·在各5种不同测试中对于每个接种组和每种抗原(pf、sf和wf)，在时间点(接种后-接种前)之间个体应答差异的描述统计。

·使用无参数检验(Kruskall-Wallis检验)比较3组之间的局部差异，在各5种不同测试中计算每种抗原的统计学p-值。所有显著性检验都是双尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是统计学显著的。

实施例II-水包油乳液和佐剂制剂的制备和表征

除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的油/水乳液由水相和油相组成，有机相由2种油(α-生育酚和鲨烯)组成，水相为含Tween80作为乳化剂的PBS。除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的水包油乳液佐剂制剂都制成含以下的水包油乳化组分(给出终浓度)：2.5％鲨烯(体积/体积)、2.5％ α-生育酚(体积/体积)、0.9％聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(体积/体积)(Tween 80)，参见WO 95/17210。该乳液在随后的实施例中称为AS03，如下制备为2倍浓缩物。

II.1.乳液SB62的制备

II.1.1.实验室规模的制备

将Tween 80溶解在磷酸缓冲盐水(PBS)中，获得2％的PBS溶液。为提供100ml的2倍浓缩乳液，涡旋5g DLα生育酚和5ml鲨烯，以彻底混合。加入90ml PBS/Tween溶液，彻底混合。然后将获得的乳液通过注射器，最后使用M110S微流控设备微射流。获得的油滴具有约120-180nm的大小(表示为通过PCS检测的Z均值)。将其它佐剂/抗原组分加入为单一混合物的乳液中。

II.1.2.放大规模的制备

通过在强搅拌下混合由疏水组分(α-生育酚和鲨烯)组成的油相和含水溶性组分(Tween 80和PBS mod(改良型)，pH 6.8)的水相，制备SB62乳液制备物。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转移至水相(9/10总体积)，于室温搅拌混合物15分钟。然后在微流控器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000PSI，8个循环)，以产生亚微米油滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。然后使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将除菌的乳化原液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或氩气)通入SB62乳化半成品容器的死体积中达至少15秒。

SB62乳液的最终组成如下：

Tween 80：1.8％(体积/体积)19.4mg/ml；鲨烯：5％(体积/体积)42.8mg/ml；α-生育酚：5％(体积/体积)47.5mg/ml；PBS-mod：NaCl 121mM，KCl2.38mM，Na₂HPO₄ 7.14mM，KH₂PO₄ 1.3mM；pH 6.8±0.1。

II.2.检测油滴粒度的动态光散射

II.2.1.简介

油滴直径的大小按照以下方法并在以下实验条件下测定。油滴粒度检测以强度检测提供，并表示为通过PCS检测的z均值。

II.2.2.样品制备

对水包油乳液佐剂进行粒度检测，所述水包油乳液佐剂为：按照放大规模方法制备的SB62、AS03和AS03+MPL(50μg/ml)，后两种临使用前制备。样品的组成在下文给出(参见章节II.2.4)。样品用PBS 7.4稀释4000倍至8000倍。

作为对照，用10mM NaCl稀释PL-Nanocal粒度标准品100nm(目录号6011-1015)。

II.2.3.Malvern Zetasizer 3000HS粒度检测

所有的粒度检测都用两台Malvern Zetasizer 3000HS检测。样品以合适的稀释度(通常为4000倍至20000倍的稀释度，取决于样品浓度)在用于Malvern分析的塑料比色皿中检测，并采用两种光学模式：

-或者真实的粒子折射率0和假想折射率0。

-或者真实的粒子折射率1.5和假想折射率0.01(按照在文献中可见的值，对乳液采用适合的光学模式)。

技术条件是：

-激光波长：532nm(Zeta3000HS)。

-激光功率：50mW(Zeta3000HS)。

-于90°检测的散射光(Zeta3000HS)。

-温度：25℃，

-持续时间：由软件自动确定，

-次数：3次连续检测，

-z均值直径：通过累积量分析

-粒度分布：通过Contin或自动化方法。

自动化Malvern算法使用累积量、Contin和非负最小二乘(NNLS)算法的组合。

由于Mie理论，强度分布可转变为体积分布。

II.2.4.结果(参见表2)

累积量分析(Z均值直径)：

表2

样品	稀释度	记录	计数率	ZAD	多分散性
						SB62	5000	123平均值	7987752065867364	153153152153	0.060.060.070.06
SB62(实施例IV)	8000	123平均值	8640865686348643	151151150151	0.030.000.000.01
						SB62+MPL25μg(*)	8000	123平均值	8720865987108697	154151152152	0.030.030.020.02

(^*)如下制备：注射用水、PBS 10x浓缩液、250μl SB62乳液和25μg MPL混合在一起，以达到280μl终体积。

z均值直径(ZAD)大小以样品中各种粒度的散射光量来度量。该值与样品的单模式分析相关，主要用于重现目的。

计数率(CR)是散射光的检测结果：其对应于每秒成千上万的光子。

多分散性(Poly)指数是分布的宽度。其是分布广泛性的无量纲检测结果。

Contin和自动化分析：

已按照以上阐述并带有些微改变的方法制备和评价两种另外的SB62制备物(2倍浓缩的AS03)：

在为获得用于Zetasizer 3000HS的最佳计数率值而确定的两个稀释度：10000x和20000x，在用于Malvern分析的塑料比色皿中检测样品，光学模式与以上实施例中使用的相同。

结果示于表3。

表3

“-”此时获得的值不一致。

这些结果的示意图示于图1的制剂1023。由其可见，大部分粒子(例如至少80％)以强度计具有小于300nm的直径。

II.2.5.整体结论

用Malvern Zetasizer 3000HS和两种光学模式检测不同稀释度的SB62制剂。以上评价的制剂的粒度ZAD(即通过累积量分析获得的强度平均值)约为150-155nm。

当使用累积量算法时，我们观察到稀释度对ZAD和多分散性没有影响。

II.3.含MPL的AS03的制备

II.3.1.MPL液体悬浮液的制备

MPL(在整个文件中使用，其是3D-MPL即3-O-脱酰单磷酰脂质A的缩写)原液由MPL冻干粉制备。MPL原液是稳定的原料浓缩(约1mg/ml)水分散体，其随时可用于疫苗或佐剂配制。制备过程的示意图在图2中给出。

对于最大批量12g，MPL原液制品储存在无菌玻璃容器中。MPL的分散由以下步骤组成：

-将MPL粉末悬浮在注射用水中

-通过加热解聚任意大的聚集物(热处理)

-通过微射流将粒度缩小至100nm至200nm

-用Sartoclean预过滤装置0.8/0.65μm预过滤制品

-于室温除菌过滤制品(Sartobran P装置，0.22μm)

MPL粉末通过微射流冻干，产生稳定的胶体水性分散体(MPL粒度小于200nm)。MPL冻干粉末分散在注射用水中，以便获得粗制的10mg/ml悬浮液。然后在搅拌下对悬浮液进行热处理。冷却至室温后，开始微射流处理，以便降低粒度。使用微流控装置M110EH，以限定压力通过微射流相互作用腔连续循环分散液达最小通过量(循环次数：n_min)进行微射流。代表循环次数的微射流持续时间基于检测的流速和分散体积计算。对于给定压力下的给定设备，获得的流速可在一个至另一个相互作用腔之间以及特定相互作用腔的整个活动周期中有所变化。在本实施例中，使用的相互作用腔是F20Y型微流控器。由于微射流效力与压力-流速对相关，所以处理时间可在一批至另一批之间变化。1次循环需要的时间基于流速计算。所认定的流速是就在将MPL导入装置前用注射用水检测的流速。1次循环被定义为MPL总体积通过装置1次所需要的时间(以分钟表示)。如下计算获得n次循环需要的时间：

n×要处理的MPL的量(ml)/流速(ml/分钟)

由此相应地修改循环次数。描述了对所用的优选设备和相互作用腔要实施的最小循环量(n_min)。根据n_min循环后进行的粒度检测结果确定要实施的总循环量。基于历史数据确定粒度限制(d_lim)。检测通过光子相关光谱法(PCS)技术实现，d_lim表示为单模式结果(Z_均值)。在该限度之下，可在n_min循环后终止微射流。在该限度之上，继续微射流，直至获得满意的粒度减小，最多再进行50个循环。

如果在微射流后不立即开始过滤，则将分散的MPL储存在+2至+8℃，等待转移至过滤区域。

在微射流后，用注射用水稀释分散液，通过0.22μm滤器在层流下除菌过滤。最终的MPL浓度是1mg/ml(0.80-1.20mg/ml)。

II.3.2.AS03+MPL佐剂化疫苗的制备：单瓶法

向AS03佐剂制剂加入MPL，终浓度在每剂疫苗10-50μg之间。

将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween、TritonX-100和VES(维生素E琥珀酸酯，即α-生育酚琥珀酸酯)的SB62混合物加入注射用水中。量计入流感株中存在的去污剂，以便达到目标终浓度：750μg/ml Tween 80、110μg/ml Triton X-100和100μg/mlVES。在5分钟搅拌后，加入15μg的每种目标流感株(例如在经典3价疫苗中的毒株H1N1、H3N2和B)。在15分钟搅拌后，加入250μlSB62乳液，然后加入25μg或50μg MPL。

制备过程的示意图在图3中给出。表4给出了每个人体剂量中含MPL的AS03的最终组成。

表4

^*PBS mod 10x浓缩液pH 6.8＝KH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、KCl-HCl

^**MPL是每剂25μg或50μg

II.3.3.AS03+MPL佐剂化的疫苗的制备：双瓶法

可通过混合2倍浓缩的抗原或抗原制备物和AS03(SB62250μl)或AS03+MPL(SB62250μl+25μg或50μg MPL)佐剂，由双瓶法制备相同制剂。在此情况下，其如下进行。AS25-佐剂化流感疫苗的生产由3个主要步骤组成：

1)配制无佐剂的三价半成品(2x浓缩)并分装入抗原容器中

2)制备AS03+MPL佐剂

3)即时重配AS03+MPL佐剂化裂解病毒疫苗。

1)配制无佐剂的三价半成品(2x浓缩)并分装入抗原容器中

3种单价原液的体积基于配制前各个单价原液中检测的HA含量，并基于1100ml的目标体积。浓缩的磷酸缓冲盐水以及Tween 80、Triton X-100和α-生育酚氢琥珀酸酯的预混合物稀释在注射用水中。然后将3种浓缩的单价原液(A/新喀里多尼亚、A/纽约、B/江苏)连续稀释入获得的磷酸缓冲盐水/Tween 80-Triton X-100-α-生育酚氢琥珀酸酯溶液(pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.47mM KH₂PO₄，990μg/ml Tween 80，150μg/ml Triton X-100和130μg/mlα-生育酚氢琥珀酸酯)中，以便具有终浓度39.47μg A毒株(H1N1、H3N2)的HA/ml三价半成品(15μg HA/A毒株/380μl三价半成品)和46μgB毒株的HA(17.5μg HA/B毒株/380μl三价半成品)。在加入每种单价原液之间，于室温搅拌混合物达10-30分钟。在加入最后一种单价原液后，搅拌15-30分钟，检查pH，并用HCl或NaOH将pH调节至7.2±0.2。

抗原的三价半成品无菌分装入3-ml无菌I型(欧洲药典)玻璃瓶中。每瓶含470μl体积(380μl+90μl过充)。

2)制备AS03/MPL佐剂原液并分装入佐剂容器中。

通过混合两种组分制备佐剂AS03/MPL：SB62乳液(章节II.1.2中的方法)和MPL(章节II.3.1中的方法)。1倍浓缩的PBS mod(通过将10x浓缩的PBS mod稀释在注射用水中制备)和SB62原液和1mg/ml的MPL原液。测定MPL浓度，以达到10-50μg的最终含量，适宜地为每个最终人用疫苗剂量约25μg。混合物于室温搅拌5-30分钟，用NaOH(0.05或0.5M)/HCl(0.03M或0.3 M)将pH调节至6.8±0.1。于室温再搅拌5-30分钟后，将混合物通过0.22μm膜过滤除菌。实施无菌惰性气体(氮气)通入，以在最少1分钟的过程中在分装容器中产生惰性顶空气体。无菌AS03+MPL佐剂储存在+2-8℃，直至无菌分装入1.25-ml无菌I型(欧洲药典)玻璃注射器中。每个注射器含80μl超量体积(320μl+80μl过充)。

在注射时，将含佐剂的预填充注射器的内容物注入含浓缩的三价失活裂解病毒体抗原的小瓶中。在混合后，将内容物吸入到注射器中，针用肌内针替换。1剂重配的AS25佐剂化流感候选疫苗相当于0.7mL。

II.4.在水包油乳化制剂中含流感抗原和任选的MPL的免疫原性组合物的制备

向II.1的SB62乳液中加入等体积的2倍浓缩的裂解流感抗原(Fluarix^TM)(15μg每种毒株的HA)并混合。适宜时将其与50μg/ml MPL混合，获得最终制剂。

实施例III-在65岁以上的老年人中用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗进行的临床实验(Explo-Flu-001)

在2003年于65岁以上的老年人群中进行I期开放随机研究，以便评价含佐剂AS03的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性。在肌内给予1剂AS03佐剂化疫苗或WV疫苗后21天检测体液免疫应答(即抗血细胞凝集素抗体滴度、中和抗体滴度和抗神经氨酸酶抗体滴度)和细胞介导的免疫应答(CD4和/或CD8T细胞应答)。Fluarix^TM用作参比。

III.1.研究设计

3组受试者平行地肌内接受以下疫苗：

■1组50名受试者接受1剂重配和佐剂化的SV流感疫苗(FluAS03)

■1组50名受试者接受1剂全病毒流感疫苗(FluWVV)

■1组50名受试者接受1剂Fluarix^TM(Fluarix)＝对照

接种程序：在第0天注射1次流感疫苗，收集血样，在21天进行解读分析(HI抗体测定、NI抗体测定、中和抗体测定和CMI分析)，并得出研究结论。

在该研究中使用的标准3价裂解流感疫苗-Fluarix^TM是一种在2003年由GlaxoSmithKline Biologicals开发并生产的商品化疫苗。

III.2.疫苗组成和给予(表5)

III.2.1.疫苗制备

AS03佐剂化的流感疫苗

AS03佐剂化的流感疫苗候选物是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶(335μl)(抗原容器)中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含SB62乳液的预填充I型玻璃注射器(335μl)(佐剂容器)组成。在注射时，抗原容器的内容物借助于SB62乳液预填充注射器被取出，接着轻微混合注射器。SB62乳液与疫苗抗原混合重配AS03佐剂。在注射前，使用的针被肌内针替换，并将体积调整到500μl。

1剂重配的AS03佐剂化流感疫苗相当于0.5ml，含在已注册的Fluarix^TM/α-Rix疫苗中的每种流感病毒株的15μg HA，并包含10.68mg鲨烯、11.86mg DL-α生育酚和4.85mg聚山梨醇酯80(Tween 80)。

制备

AS03佐剂化的流感疫苗的生产包括3个主要步骤：

1)配制无佐剂的3价半成品并分装入抗原容器中

3种单价原液的体积基于配制前各个单价原液中检测的HA含量，并基于800ml的目标体积。浓缩的磷酸缓冲盐水以及Tween 80、Triton X-100和α-生育酚氢琥珀酸酯的预混合物稀释在注射用水中。然后将3种浓缩单价原液(毒株A/新喀里多尼亚-、毒株A/巴拿马-、毒株B/山东-)连续稀释入获得的磷酸缓冲盐水/Tween 80-Triton X-100-α-生育酚氢琥珀酸酯溶液(pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.47mM KH₂PO₄，1500μg/ml Tween 80，220μg/mlTriton X-100和200μg/mlα-生育酚氢琥珀酸酯)中，以便具有终浓度60μg A毒株的HA/ml三价半成品(15μg HA/A毒株/250μl三价半成品)和70μg B毒株的HA(17.5μg HA/B毒株/250μl三价半成品)。在加入每种单价原液之间，于室温搅拌混合物达10分钟。在加入最后一种单价原液后，搅拌15分钟，检查pH，并用HCl或NaOH将pH调节至7.2±0.1。

将抗原的3价半成品无菌分装入3-ml I型无菌玻璃瓶中。每瓶含34％体积超出量(335μl总体积)。

2)制备SB62乳液无菌原液并分装入佐剂容器中

·水相：在搅拌的同时，将902ml Tween 80与44105ml PBS-mod缓冲液混合(用HCl调节后pH＝6.8)。

·油相：在搅拌的同时，将2550ml鲨烯加入2550mlα-生育酚中。

·混合水相和油相：在搅拌的同时，将5000ml油相(1/10总体积)转移至45007ml水相(9/10总体积)。混合物于室温搅拌15分钟。

·乳化：在微流控器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000PSI，8个循环)，以产生亚微米液滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。

·除菌过滤：使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将无菌乳化原液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或氩气)通入SB62乳化半成品容器的死体积中达至少15秒。

给出的所有成分的量都用于制备50L乳液，并以体积给出。实际上，量以成分的密度计量。PBS的密度被视为等于1。

SB62乳液的最终组成如下：

表5

Tween 80：	1.8％(体积/体积)	19.4mg/ml
			鲨烯：	5％(体积/体积)	42.8mg/ml
α-生育酚	5％(体积/体积)	47.5mg/ml
			PBS-mod
NaCl		121mM
			KCl		2.38mM
Na2HPO4		7.14mM
			KH2HPO4		1.3mM
pH		6.8±0.1

然后将无菌SB62乳化原液无菌分装入1.25-ml无菌I型玻璃注射器中。每个注射器含34％的体积超出量(335μl总体积)。

3)AS03佐剂化的裂解病毒疫苗的即时重配。

在注射时，含浓缩3价失活裂解病毒体抗原的瓶的内容物借助于含SB62乳液的注射器由瓶中取出，接着轻微混合注射器。SB62乳液与疫苗抗原混合重配AS03佐剂。

III.2.2.疫苗组成(表6)和给予

表6

疫苗	配方	组别
			FluarixTM	3种流感株的HA(总HA＝45μg)·A/新喀里多尼亚/20/99(IVR-116)：15μg·A/巴拿马/2007/99(RESVIR-17)：15μg·B/山东/7/97：15μg硫柳汞含量：5μg在0.5ml的预填充注射器中	Fluarix
WVV	3种流感株的HA(总HA＝45μg)·A/新喀里多尼亚/20/99(IVR-116)：15μg·A/巴拿马/2007/99(RESVIR-17)：15μg·B/山东/7/97：15μg硫柳汞含量：5μg在0.5ml的小瓶中	FluWVV
			Fluarix+AS03	3种流感株的HA(总HA＝45μg)·A/新喀里多尼亚/20/99(IVR-116)：15μg·A/巴拿马/2007/99(RESVIR-17)：15μg·B/山东/7/97：15μg硫柳汞含量：5μg在0.335ml的小瓶(2倍浓缩液)中+含水包油SB62乳液的注射器(0.335ml)(放大规模制备)	Flu-AS03

疫苗肌内给予于非惯用臂的三角肌区。密切观察接种者至少30分钟，对于给予疫苗后罕有的过敏性反应实施容易利用的适宜药物治疗。

III.3.研究群体结果

该研究总共招录了148名受试者：49名受试者在FluAS03组，49名受试者在Fluarix组，50名受试者在FluWVV组。总接种群体的平均年龄在接种时为71.8岁，标准偏差6.0岁。受试者的平均年龄和性别分布在3个疫苗组之间是相似的。

III.4.安全性结论

在研究群体(即65岁以上的老年人)中给予AS03佐剂化的流感疫苗是安全的，在临床上是良好耐受的。

III.5.免疫原性结果

对总接种群体的免疫原性进行分析。

III.5.1.体液免疫应答

为了评价由AS03佐剂化的疫苗诱导的体液免疫应答，计算每个治疗组的以下参数(具有95％置信区间)：

·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)

·在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)

·21天时的血清阳转率(SC)，定义为相比于第0天在第21天时的血清HI滴度增加达至少4倍的接种者百分率。

·21天时的转变因子，定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。

·21天时的保护率定义为血清HI滴度＝1∶40的接种者百分率。

III.5.1.1抗血细胞凝集素抗体应答

a)HI几何平均滴度(GMT)

具有95％CI的HI抗体的GMT示于表7(抗HI抗体的GMT)。3个组中针对所有疫苗株的接种前抗体GMT处于相同范围内。在接种后，抗血细胞凝集素抗体水平显著增加。在接种后有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3种疫苗株的HI抗体的GMT较高，尽管Fluarix组和FluWVV组之间的95％CI有一些重叠。

表7

N＝结果可用的受试者数目；

95％CI＝95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限；

MIN/MAX＝最小/最大；

PRE＝接种前第0天；

PI(D21)＝接种后第21天

b)抗HI抗体滴度的转变因子、血清保护率和血清阳转率(与人中保护作用的关联)

结果示于表8。

转变因子代表相比于第0天在第21天时针对各个疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。转变因子根据病毒株和疫苗由6.1至13.6变化。此转变因子大大地优于欧洲官方要求的2.0倍GMT增加。

血清保护率代表在第21天时血清HI滴度≥40的受试者比例。在研究开始时，所有组的一半受试者(范围在34.0％-69.4％之间)对所有毒株都具有保护性抗体水平。在第21天时，3个组中对不同病毒株的血清保护率在88.0％至100％的范围内。就保护作用而言，这意味着超过88％的受试者在接种后具有≥40的血清HI滴度，被认为具有抗3种毒株的保护作用。该比率大大地优于欧洲官方要求的≥60岁老年人群中60％的血清保护率。

血清阳转率代表相比于第0天在第21天时血清HI滴度具有达至少4倍增加的受试者比例。对3种毒株的整体应答率在3个组中基本上是相等的。为了被认为有效和符合欧盟标准，疫苗应当在＝60岁的老年人群中诱导超过30％的血清阳转率。在该研究中，3个组的血清阳转率超过50％。

表8

N＝受试者总数

总结：

·在接种后有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3种疫苗株的HI抗体的GMT较高，尽管Fluarix组和FluWVV组之间的95％CI有一些重叠。

·转变因子根据病毒株和疫苗由6.1至13.6变化。此转变因子大大优于欧洲官方要求的2.0倍GMT增加。

·在第21天时，3个组中对不同病毒株的血清保护率在88.0％至100％的范围内。该比率大大优于欧洲官方要求的≥60岁老年人群中60％的血清保护率。

·在该研究中，3个组的血清阳转率超过50％。对3种毒株的整体应答率在3个组中基本上是相等的。

III.5.1.2中和抗体滴度

为了更好地表征老年人中针对流感接种的免疫应答，评价针对中和抗原的血清抗体应答。结果示于表9(血清保护率和抗中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT))和表10(在接种后21天抗中和的血清阳转率(增加倍数＝4))。

检测免疫前和免疫后血清中抗3种流感株的中和抗体滴度。测定以下参数：

·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清中和抗体的几何平均滴度(GMT)

·在21天时具有95％CI的血清阳转率，定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的HI滴度具有达至少4倍增加的接种者百分率。

表9

组1：Flu疫苗混合佐剂2x浓缩的Flu疫苗；

组2：Flu疫苗Flu疫苗；

组3：Flu疫苗Flu WVV疫苗；

N＝结果可用的受试者数目；

n/％＝滴度在特定范围内的受试者的数目/百分率；

95％CI＝95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限；

PRE＝接种前第0天；

PI(D21)＝接种后第21天

表10

组1：Flu疫苗(DFLU58A16)混合佐剂(D621024A8)2x浓缩的Flu疫苗；

组2：Flu疫苗(18854B9)Flu疫苗；

组3：Flu疫苗(DFLU59A2)Flu WVV疫苗；

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目；

n＝应答者数目；

％＝应答者百分率(n/N×100)；

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限；

主要发现是：

·对于3种疫苗，在21天时，对两种A毒株获得100％的血清保护率。对于B毒株，3组中的血清保护率在92％至100％的范围内。

·接种后，3个组中针对所有毒株的GMT都有显著增加。然而，有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3个疫苗株的中和抗体的GMT比在FluWVV中高，尽管Fluarix组和FluWVV组之间的95％CI有一些重叠。

·对于血清阳转率，针对3种毒株的总体应答率在3个组中基本上是相等的。

在所有组中，结果都与针对抗血细胞凝集素抗体进行分析所获得的结果相一致。

III.5.1.3神经氨酸酶(NA)抗体滴度

为了更好地表征老年人群中对流感接种的免疫应答，评价对神经氨酸酶抗原的血清抗体应答。与HI抗体滴度类似，测定以下终点：

·GMT(采用对数滴度转化平均值的反对数)

·血清阳转率，定义为相比于第0天在21天时对每种疫苗株的HI滴度具有达至少4倍增加的接种者百分率。

在表11(抗NA抗体GMT)和表12(接种后的NA血清阳转率(第21天)(4倍增加))中显示了NI抗体的GMT和血清阳转率具有95％CI。

表11

FluAS03：与AS03佐剂(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16)

Fluarix：Flu疫苗(18854B9)

FluWVV：Flu WVV疫苗(DFLU59A2)

PRE＝接种前，PI(D21)＝接种后第21天

95％CI、LL和UL＝95％置信区间、下限和上限

表12

FluAS03：与AS03佐剂(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16)，Fluarix：Flu疫苗(18854B9)，FluWVV：Flu WVV疫苗(DFLU59A2)

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目；

n＝应答者数目；

％＝应答者比例(n/N×100)；

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限

主要发现是：

·对血细胞凝集素观察到的GMT和血清阳转率的值高于对神经氨酸酶观察到的值。

·在3个组中针对所有疫苗株的接种前抗体GMT都在相同范围内。在接种后，抗神经氨酸酶抗体水平显著增加。至于HI抗体滴度，在接种后有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3种疫苗株的HI抗体的GMT较高，尽管Fluarix组和FluWVV组之间的95％CI有一些重叠。

·关于血清阳转率，在3个组中以及对3种毒株来说，针对3种毒株的总体应答率基本上相等。

我们的结果表明，在该研究中抗流感接种的健康老年人发展出针对神经氨酸酶抗原的良好抗体应答，无论哪种流感疫苗。但是，针对神经氨酸酶抗原的应答低于针对血细胞凝集素抗原的应答。

III.5.2.细胞免疫应答

可在体外再刺激外周血抗原特异性CD4和CD8T细胞，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFNγ，如果与其对应抗原温育。因此，抗原特异性CD4和CD8T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞仪计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作抗原来再刺激流感特异性T细胞。在表13-18中提供了CD4和CD8T细胞应答的结果。

表13以产生至少两种不同细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4T-细胞应答：对接种前和接种后的CD40L/IL2/TNF-α/IFN-γ的描述统计(总接种群体)

组1：FluAS03：Flu疫苗Fluarix^TM，与AS03佐剂混合

组2：Fluarix：Flu疫苗Fluarix^TM

组3：FluWVV：Flu WVV疫苗

SD＝标准偏差；Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数；Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

P-值＝Kruskall-Wallis检验(非参数方法)，测试3组之间于第21天时的局部差异(Wilcoxon秩和检验)

表14以产生至少两种不同细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种群体)

表15以产生至少CD40L和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种群体)

表16已产生至少IFNγ和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种群体)

表17以产生至少IL2和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种群体)

表18以产生至少TNFα和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种群体)

结果还表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8T细胞的频率，并示于图4和图5。

在相似的分析中，使用漂移株(A/H1N1/北京/262/95(H1N1d)、A/H3N2/悉尼/5/97(H3N2d)、B/山梨/166/98(Bd))或转换株(A/新加坡/1/57(H2N2)、A/香港/1073/99(H9N2))的流感抗原评价交叉反应性CD4 T-细胞应答。结果表示为细胞因子阳性的CD4T细胞的频率，示于图6。

主要发现是：

·用Fluarix和全病毒接种稍微加强CD4T-细胞应答。用Flu AS03接种诱导强CD4 T-细胞应答(图4)，其在统计学上是显著的。对于用裂解抗原或全病毒在体外刺激后以及研究的所有细胞因子(IL-2、IFNγ、TNFα和CD40L)得出相同的结论。

·大部分个体具有抗全流感病毒的CD8T-细胞应答，但是接种对CD-8T细胞应答没有可检测的影响(即接种前＝接种后)，无论哪一个研究组(图5)。

用Fluarix接种仅诱导低水平的交叉反应性CD4 T-细胞应答(图6)。用FluAS03接种诱导抗漂移流感株的强CD4 T-细胞应答，其在统计学上是显著的(图6)。基本没有检测到抗转换株的应答。

III.5.3.B-细胞EIISPOT记忆

III.5.3.1目标

为了更好地表征由AS03佐剂化的流感疫苗诱导的CMI应答，评价使用流感疫苗株或抗人免疫球蛋白体外诱导分化为浆细胞的B-细胞Elispot记忆应答，以便计数抗流感或分泌IgG的浆细胞。结果描述于表19和表20以及图7。

选择22名首次接受1剂FluAS03疫苗的受试者和21名首次接受1剂Fluarix疫苗的受试者中的一部分，以使用B-细胞记忆Elispot技术评价接种对流感特异性记忆B细胞的影响。测定以下终点：

·在第0天和第21天：已通过B-细胞Elispot检测了所有受试者中的流感特异性记忆B细胞。结果表示为每百万个(10⁶)抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。

·接种后(第21天)和接种前(第0天)之间的差异也表示为每百万个(10⁶)抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。

III.5.3.2统计方法

各个接种组在第0天和第21天的描述统计表示为每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。第21天和第0天之间(接种后-接种前)个体差异的描述统计为每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。

Wilcoxon检验用于对比两个组之间的局部差异，计算针对3种毒株(A/新喀里多尼亚、A/巴拿马和B/山东)中的每种的统计学p-值。

III.5.3.3结果

相比于Fluarix组，存在一种有利于AS03佐剂化的疫苗的趋势。对于A/新喀里多尼亚株，相比于Fluarix存在有利于FluAS03的统计学显著差异(p-值＝0.021)。对于A/巴拿马和B/山东株没有观察到两个组之间的统计学差异。

表19B-细胞记忆：对接种前(第0天)和接种后(第21天)的描述统计以及10⁶个产IgG浆细胞(一部分受试者)中抗原-浆细胞的接种后(第21天)频率的推论统计

组1：Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐剂

组2：Flu疫苗Fluarix^TM

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

P-值＝Wilcoxon检验(非参数方法)，测试2组之间于第21天时的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

表20B-细胞记忆：对10⁶个产IgG浆细胞(一部分受试者)中抗原特异性浆细胞频率在接种后(第21天)和接种前(第0天)之间的差异的描述统计和推论统计

组1：Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐剂

组2：Flu疫苗Fluarix^TM

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

P-值＝Wilcoxon检验(非参数方法)，测试2组之间于第21天时的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

III.6.整体结论

III.6.1.反应原性和安全性结果

尽管流感免疫显著降低了肺炎和相关死亡的风险，但老年人接种仅提供了23-72％的抗流感疾病的保护作用。疫苗抗原和有效佐剂的制剂是一种增强对亚单位抗原的免疫应答的有吸引力方法。本研究设计用于评价(1)用水包油乳液即AS03佐剂化的流感疫苗在健康老年人中安全性和反应原性，(2)抗体和细胞介导的免疫应答。反应原性数据表明，用AS03佐剂化的流感疫苗比其它两种疫苗诱发更多的局部和全身症状。但是，对于主动诉求的不良事件，未观察到3种疫苗之间的差异。由这些结果可得出结论，候选疫苗的反应原性和安全性是令人满意的，在临床上是可接受的。

III.6.2.免疫原性结果

就免疫应答而言，3种疫苗超出了欧洲官方对每年注册的裂解病毒体流感疫苗的要求(“关于协调流感疫苗要求的指引说明”，用于免疫学评价年度毒株变化-CPMP/BWP/214/96)。在本研究中测试的3种流感疫苗在健康老年人中是免疫原性的，这些老年人对流感血细胞凝集素发展出良好的抗体应答，并中和抗原(表21)。

表21

变量	抗体应答的欧洲标准	结果
			转变因子	＞2.0	＞6.1
血清阳转率	＞30％	＞50％
			保护率	＞60％	＞88％

对于细胞介导的免疫(CMI)应答，用AS03佐剂化的流感疫苗诱导的CD4应答(包括漂移株)显著强于其它两种疫苗(Fluarix和全流感病毒疫苗)。但是，接种对CD8应答没有可检测的影响。

关于B细胞记忆应答，相比于无佐剂疫苗，存在有利于有佐剂流感疫苗的趋势。

实施例IV-用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗在65岁以上的老年人群中的临床实验-Explo-Flu-002

为评价含佐剂AS03的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗在先前于2003年在Explo-Flu-001临床实验中接种候选疫苗的65岁以上老年人群中的反应原性和免疫原性，已进行了开放、可控的I/II期研究。对于免疫原性和安全性评价，Fluarix^TM疫苗(在比利时称为o-rix^TM)已用作参比。

IV.1.目标

在肌内给予1剂AS03佐剂化的疫苗之后21天，检测体液免疫应答(即抗血细胞凝集素抗体滴度)和细胞介导的免疫应答(CD4和/或CD8T细胞应答)和B记忆细胞应答。Fluarix^TM用作参比。

目标是：

1)确定AS03佐剂化的Flu(40名受试者)相对于Fluarix(18名受试者)是否证实了其对流感抗原接种个体的CD4-和/或CD8-介导免疫性的最强免疫刺激活性；

2)使用纵向分析研究AS03做佐剂对2004年接种前的免疫应答(正是2003年首次接种后1年的应答)的影响。

IV.2.研究设计、疫苗组成和终点

■40名＞65岁的受试者，他们先前在2003年的Explo-Flu-001临床实验中接受了1剂AS03佐剂化的流感疫苗(FluAS03)。

■1个约20名65岁以上受试者的对照组，他们先前在2003年的Explo-Flu-001临床实验中接受了1剂Fluarix^TM(Fluarix)。

IV.2.1.疫苗组成

疫苗组成类似于用于研究Explo-Flu-001的疫苗组成，只是包含在疫苗(2004年疫苗)中的流感株不同。毒株如下：

·A/新喀里多尼亚/20/99(IVR-116)(H1N1)＝A/新喀里多尼亚/(H1N1)-类似毒株

·A/怀俄明/3/2003(X-147)(H3N2)＝A/福建(H3N2)-类似毒株

·B/江苏/10/2003＝B/上海-类似毒株

IV.2.2.免疫原性(HI)终点

·GMT(采用对数滴度转化平均值的反对数)

·转变因子(相比于第0天在第21天时血清HI GMT的增加倍数)

·血清阳转率(相比于第0天在第21天时对每种疫苗株的HI滴度具有达至少4倍增加的接种者百分率)

·保护率(在第21天时血清HI滴度≥1∶40的接种者百分率)

IV.2.3.CMI-终点

观测变量：

在第0天和第21天：每10⁶个细胞中针对4种不同细胞因子的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试都定量针对以下的CD4/CD8T细胞应答：

■以下3种抗原的混合物

■新喀里多尼亚抗原

■怀俄明抗原

■江苏抗原

衍生变量：

在5种不同测试(细胞因子)中由以下表示的抗原特异性CD4T细胞和CD8T细胞应答：

1.产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞

2.产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞

3.产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞

4.产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞

5.产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞

IV.2.4.CMI分析

首个CMI分析基于总接种群体(FluAS03组N＝40名受试者，Fluarix组N＝18名受试者)。

纵向分析基于Explo-Flu-001(裂解蛋白)和Explo-Flu-002(混合的flu抗原)研究的动态群体：

■接种前：FluAS03组N＝36名受试者，Fluarix组N＝15名受试者。

■接种后-接种前：FluAS03组N＝34名受试者，Fluarix组N＝15名受试者。

(a)通过对每种抗原、每种细胞因子、每个疫苗组和每个时间点(接种前和接种后)的描述统计总结CD4/CD8T-淋巴细胞分泌应答的频率。

(b)对每种抗原、每种细胞因子和每个疫苗组在时间点(接种前和接种后)之间的个体应答差异的描述统计制表。

(c)对于接种后和(接种后-前)的时间点，使用非参数Wilcoxon检验比较两个疫苗组之间的局部差异，并就4种不同细胞因子计算以下的统计学p-值：

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏和3种毒株的混合物的CD4 T-细胞应答

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏和3种毒株的混合物的CD8 T-细胞应答

(d)非参数检验(Wilcoxon-检验)还用于：

-依据各个疫苗组中Explo-Flu-001和Explo-Flu-002之间特异性CD4的频率研究接种前(第0天)免疫应答的动力学

-依据在Explo-Flu-001和Explo-Flu-002研究的每一个中2个疫 苗组之间的特异性CD4的频率研究接种前(第0天)免疫应答的动力学

-依据各个疫苗组中Explo-Flu-001和Explo-Flu-002之间特异性CD4的频率差异(接种后-接种前)研究免疫应答的动力学

-依据在Explo-Flu-001和Explo-Flu-002研究的每一个中2个疫 苗组之间的特异性CD4的频率差异(接种后-接种前)研究免疫应答的动力学

所有显著性检验都是双尾的。小于或等于0.05的P-值被认为是统计学显著的。

IV.3.结果

结果表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8T细胞的频率。

IV.3.1.抗原特异性CD4 T-淋巴细胞

通过对每种抗原、每种细胞因子、每个疫苗组和每个时间点(接种前和接种后)的描述统计总结抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。

在表22中显示了对于每种抗原、各5种不同的细胞因子和每个疫苗组在时间点(接种后-接种前)之间CD4 T-淋巴细胞应答个体差异的描述统计。

表22接种后(在第21天)和接种前(在第0天)之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞应答差异的描述统计(总接种群体)

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的测试受试者的数目

疫苗诱导的CD4T细胞显示出能够持续至少1年，因为用Fluarix接种的个体和前一年用Fluarix/AS03接种的个体之间相比，接种前CD4T-细胞应答水平存在可观测的差异。结果还示于图8，表明了再接种之前和之后针对裂解流感病毒抗原的CD4T-细胞应答。D0对应于首年接种后12个月，因此指示持续性。

相比于接种后2个组之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞的频率差异(依据Wilcoxon检验)，几乎所有的p-值都小于0.05，被认为是统计学上显著的(参见表23)，这有利于FluAS03组。

表23推论统计：在第21天由2个疫苗组之间的Wilcoxon秩和检验获得的抗原特异性CD4T-淋巴细胞应答的p值(总接种群体)

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试第21天时2个组之间的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

通过Wilcoxon检验对比2个组之间抗原特异性CD4-T淋巴细胞应答频率的个体差异(接种后-接种前)，以下抗原-细胞因子组合出现小于0.05并被认为是统计学显著的p-值：混合的流感病毒抗原-alldouble、混合的流感病毒抗原-IFNγ和江苏-IFNγ，这有利于FluAS03组(表24)。

表24推论统计：不同组之间通过Wilcoxon秩和检验计算的抗原特异性CD4T-淋巴细胞应答在接种后(第21天)和接种前(第0天)之间 差异的p值(总接种群体)

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

IV.3.2.抗原特异性CD8 T-淋巴细胞

通过对每种抗原、每种细胞因子、每个疫苗组和每个时间点(接种前和接种后)的描述统计总结抗原特异性CD8 T-淋巴细胞分泌应答的频率，类似于对CD4 T细胞应答采用的方法。

通过Wilcoxon检验对比接种后2个组之间抗原特异性CD8 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都高于0.05，被认为不是统计学显著的。通过Wilcoxon检验对比2个组之间抗原特异性CD8 T-淋巴细胞应答频率的个体差异(接种后-接种前)的差异，所有p-值都高于0.05，被认为不是统计学显著的。

IV.3.3.动力学分析：接种前(于2003年首次接种后1年)的免疫应答

通过对表25中每种细胞因子和每个疫苗组和两个研究的每一个的描述统计、对表27中的两个研究的每一个和每个疫苗组的描述统计，总结接种前抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。推理统计在表26和表28中给出。

表25对接种前(第0天)特异性CD4T淋巴细胞应答接种的描述统计(动力学)

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

通过Wilcoxon检验对比2个研究之间针对各个疫苗组的抗原特异性CD4T-淋巴细胞的频率差异，仅对于FluAS03组和采用TNFα细胞因子的情况出现小于0.05并被认为是统计学显著的p-值(有利于Explo-Flu-002)(参见表26)。

表26推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同研究之间第0天抗原特异性CD4T-淋巴细胞应答的p-值(动力学)

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间在第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

表27对接种前(第0天)特异性CD4T淋巴细胞应答接种的描述统计(动力学)

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

通过各个研究的Wilcoxon检验对比2个疫苗组之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞频率的差异，Explo-Flu-002的所有p值都小于0.05，被认为是统计学显著的(有利于FluAS03)(参见表28)。

表28推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同组之间第21天抗原特异性CD4T-淋巴细胞应答的p-值(动力学)

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间在第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

IV.3.4.动力学分析：接种后减去接种前的免疫应答

通过对表29中每种细胞因子和每个疫苗组和每个研究的描述统计、对表31中的每个研究和每个疫苗组的描述统计，总结在(接种后-接种前)时间点的抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。推理统计在表30和表32中给出。

表29接种后(第21天)和接种前(第0天)之间特异性CD4T淋巴细胞应答接种的描述统计(动力学)

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

通过各个疫苗组的Wilcoxon检验对比2个研究之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞频率的差异，FluAS03组的所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的(有利于Explo-Flu-001)(参见表30)。

表30对接种后(第21天)和接种前(第0天)之间差异的推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同研究之间第21天抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p-值(动力学)

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

表31对接种后(第21天)和接种前(第0天)之间特异性CD4 T淋巴细胞应答接种差异的描述统计(动力学)

SD＝标准偏差

Min、Max＝最小，最大

Q1＝第一四分位数

Q3＝第三四分位数

N＝结果可用的受试者数目

通过各个研究的Wilcoxon检验对比2个疫苗组之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞频率的差异，仅Explo-Flu-001的p值小于0.05，被认为是统计学显著的(有利于FluAS03)(参见表32)。

表32推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同组之间第21天抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p-值(动力学)

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间在第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。

IV.4.HI滴度

结果示于图9和表33-36。

表33：抗HI滴度的几何平均滴度(GMT)和血清阳性率(GMT针对接种的受试者计算)

PRE＝接种前

PI(D21)＝接种后21天

95％CI、LL和UL＝95％置信区间、下限和上限

S+＝血清阳性的受试者数目

表34：抗HI滴度的转变因子(所有接种的受试者)

N＝受试者总数

GMR＝几何平均比率(第21天/第0天滴度比率的平均对数的反对数)

95％CI＝95％置信区间

表35：抗HI滴度的血清保护率(所有接种的受试者)

PRE＝接种前

PI(D21)＝接种后21天

N＝结果可用的受试者数目

n＝滴度在特定范围内的受试者数目

％＝滴度在特定范围内的受试者百分率

表36：在PI第21天的血清阳转率(增加倍数＝4)(全部接种的受试者)

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目

n＝应答者数目

％＝应答者比例(n/N×100)

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限

IV.5.整体结论

由此临床研究证实，就流感特异性CD4T细胞的频率而言，另外就至再接种研究的D0(Explo Flu 002，即±1年后)为止首次Flu-AS03接种(在Explo Flu 001中的初免接种)激发的免疫应答的持久性而言，佐剂化疫苗Flu-AS03优于对等的无佐剂疫苗Fluarix。而且，该应答能够识别新疫苗中存在的漂移流感株，并识别2004年流感疫苗的毒株。

与第一年接种相反，在再接种先前用佐剂化Fluarix^TM接种的个体时显示出比无佐剂Fluarix^TM接种的个体增加的HI滴度响应性。可观察到一种趋势：抗H1N1和H3N2毒株的HI滴度增加至1.5-2倍，抗B毒株的HI滴度具有已表明的统计学增加。

实施例V-有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价

第一个研究-新制剂AS03和AS03+MPL的效力

V.1.基本原理和目标

就感染的敏感性和临床应答这二者而言，雪貂模型中的流感感染酷似人流感。

在先前未进行病毒株免疫的情况下，雪貂对甲型流感和乙型流感这二者的感染极为敏感。因此，其为研究由给予的流感疫苗赋予的保护作用提供了极佳的模型系统。

该研究研究了有佐剂或无佐剂的各种3价裂解疫苗在用同源毒株攻击的雪貂中减轻病征(体温)和减少鼻分泌物中病毒脱落的效力。

该实验的目标是表明有佐剂流感疫苗相比于普通(无佐剂)疫苗的效力。

终点是：

1)主要终点：减少同源攻击后鼻清洗液中的病毒脱落；

2)次要终点：通过IHA分析体液应答以及监测初免和攻击前后的温度。

V.2.实验设计

V.2.1.治疗/组别(表37)

由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))(6只雪貂/组)。雪貂在第0天用异种亚型毒株H1N1 A/斯德哥尔摩/24/90(4 Log TCID₅₀/ml)初免。在第21天，用全人剂量(500μg疫苗剂量，15μg HA/毒株)的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97的组合肌内注射雪貂。然后在第41天通过鼻内途径用同型毒株H3N2 A/巴拿马/2007/99(4.51 Log TCID₅₀/ml)攻击雪貂。

表37

组别	抗原+剂量	制剂+剂量	注释(日期/途径/攻击)	其它治疗
					1	三价普通疫苗	全人剂量：15μgHA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免
2	三价AS03	全人剂量：15μgHA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免
					3	三价AS03+MPL	全人剂量：15μg HA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免
4	PBS		IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免

V.2.2.疫苗制剂的制备

制剂1：三价普通(无佐剂)制剂(500μl)：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，按顺序加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

制剂2：用AS03佐剂化的三价裂解流感制剂(500μl)：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

制剂3：用AS03+MPL为佐剂的三价裂解流感制剂

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入得自如实施例II.3.1详述制备的悬浮液的25μg MPL。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

备注：在每种制剂中，加入PBS 10倍浓缩液至等渗，在最终体积中为1倍浓缩液。计算H₂O的体积以达到目标体积。

V.2.3.解读(表38)

表38

解读	时间点	样品类型	I/P	分析方法
					病毒脱落	D-1至初免后D+7D-1至攻击后D+5	鼻清洗液	In	滴定
T°监测	D-1至初免后D+3D-2至攻击后D+3	腹腔中的植入物	In	遥测
					IHA	接种前、初免后、免疫后、攻击后	血清	In	IHA

In＝单独的/Po＝混合的

V.3.结果

结果的示意图在图10和图11中给出。

V.3.1.温度监测

用传感器并通过遥测记录(按照在I.2.2中详述的方法)监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地图养在单独的笼中。

在攻击前3天直至攻击后5天每15分钟记录温度，由日中计算出平均值。基线至基线体温的结果示于图10A(显示了-1至+3天的结果)和10B(显示了-2至+3天的结果)。

在攻击后，仅在用三价裂解普通疫苗或PBS免疫后观察到体温峰值。在用AS03或AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗免疫后未观察到峰值。

V.3.2.病毒脱落(图11)

对每组6只动物进行鼻清洗液的病毒滴定。

通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于-80℃(干冰)的样品容器中。

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育，直至对照细胞达到细胞汇合，例如5-7天。在6-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲

染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD＜截取值时定义为阳性得分，相反，OD＞截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。

相比于三价裂解普通疫苗或PBS，用AS03或AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗在攻击后观察到较低的病毒脱落。采用AS03的保护作用比AS03+MPL稍好(参见攻击后第2天)。由于每组的动物数量少，所以不能确定统计学显著性。

V.3.3.实验结论

相比于三价裂解普通疫苗，用AS03或AS03+MPL为佐剂的三价裂解疫苗观察到针对全部3种毒株的较高体液应答(HI滴度)(对3种毒株中的2种(即H3N2和B毒株)至少为2倍)。

就在雪貂中的保护效力而言，AS03和AS03+MPL制剂显示出额外的利益(较低的病毒脱落和温度)(图10和11)。

攻击后，用AS03或AS03+MPL为佐剂的三价裂解疫苗免疫后没有观察到体液应答的加强。

第二个研究-在雪貂中的异型攻击研究：表明测试的新制剂的效力

V.4.基本原理和目标

本研究研究了有佐剂或无佐剂的各种三价裂解疫苗的效力(依据其减轻病征(体温)的能力)，以及其对异源攻击后免疫雪貂鼻分泌物中的病毒脱落的作用。

V.5.实验设计

由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))(6只雪貂/组)。测试4个小组：

^*Fluarix

^*三价裂解疫苗AS03

^*三价裂解疫苗AS03+MPL

^*PBS

雪貂在第0天用异种亚型毒株H1N1 A/斯德哥尔摩/24/90(4LogTCID₅₀/ml)初免。在第21天，用全人剂量(500μg疫苗剂量，15μg HA/毒株)的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97(17.5μg HA)的组合肌内注射雪貂。然后在第43天通过鼻内途径用异种亚型毒株H3N2 A/怀俄明/3/2003(4.51 Log TCID₅₀/ml)攻击雪貂。

V.6.结果

结果的示意图在图12和图13中给出。

V.6.1.温度监测

在攻击期间用传感器并通过遥测记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。

结果(图12)表明：

-在初免前后观察一组与另一组之间的高可变性。基线看起来在初免前比初免后高。

-尽管体温存在高可变性，但仅在PBS(6/6雪貂)、三价裂解普通疫苗(5/6雪貂)和以AS03为佐剂的三价裂解疫苗(2/6雪貂)免疫的雪貂中于攻击后观测到峰值。在用以AS03+MPL为佐剂的三价裂解疫苗免疫后未观测到峰值(0/6雪貂)。

-就发热预防而言，AS03抗异源毒株看起来不如AS03+MPL有效。我们不能断定佐剂间差异是源于不同的攻击前抗体水平的可能性。

V.6.2.病毒脱落(图13)

通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于-80℃(干冰)的样品容器中。

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育，直至对照细胞达到细胞汇合，例如达5-7天。在6-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20 WST-1的培养基，再温育18小时。

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲

染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3 OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD＜截取值时定义为阳性得分，相反，OD＞截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。

初免后的病毒脱落

检测初免前1天至初免后7天12只血貂的病毒脱落。结果以混合方式表示。

在初免后7天观测所有雪貂中的病毒清除。

攻击后的病毒脱落

检测6只雪貂/组由攻击前1天至攻击后7天的病毒脱落。

攻击后2天，相比于用三价裂解普通疫苗和PBS免疫的雪貂，在用AS03和AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗免疫的雪貂中观测到统计学显著较低的病毒滴度(与普通疫苗相比，佐剂组AS03/AS03+MPL的差异分别为1.25/1.22log和1.67/1.64log)。

在第50天，在鼻清洗液中未检测到病毒。

V.6.3.血凝反应抑制测试(HI滴度)(图14A和B)

在初免前1天、初免后21天、免疫后22天和攻击后14天收集血清样品。

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对H3N2流感病毒(疫苗株和攻击株)的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制小鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热失活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感毒株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的最高血清稀释度的倒数。由于第一个血清稀释度为1∶10，所以将不可检测的水平记录为等于5的滴度。

结果：

结果示于图14A和14B。在用H3N2 A/巴拿马免疫后，在用AS03或AS03+MPL佐剂化三价裂解疫苗免疫的雪貂中观测到的体液应答(HI滴度)比用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)免疫雪貂后观测到的体液应答高。

在用AS03或AS03+MPL佐剂化的H3N2 A/巴拿马免疫的雪貂中观测到相似的HI滴度。

仅在用含A/巴拿马H3N2毒株、AS03或AS03+MPL佐剂化的疫苗免疫后观测到针对异源毒株A/怀俄明H3N2的交叉反应性HI滴度(在用三价裂解普通疫苗免疫后未观测到)。

在用异源毒株A/巴拿马H3N2免疫并用A/怀俄明H3N2攻击的雪貂中观测到A/怀俄明特异性HI滴度的增强。正如所料，与同源攻击相反，异源攻击导致用AS03和AS03+MPL佐剂化的A/巴拿马H3N2免疫的雪貂中A/巴拿马特异性HI滴度增加。

V.6.4.该实验的结论

正如所料，与同源攻击后的情况(无加强)相比，在异源攻击后观测到抗H3N2 HI滴度的加强。

但是，在异源和同源攻击后观测到相似的保护作用(病毒脱落)。实施例VI-有佐剂和无佐剂的流感疫苗在C57BI/6初免小鼠中的临床前评价

VI.1.实验设计和目标

与Fluarix普通(无佐剂)疫苗相比，在Explo-Flu-001临床研究(参见实施例III)中观察到针对三价流感裂解疫苗AS03的CD4 T细胞应答显著较高。在这两个组之间未观察到CD8 T细胞和体液应答这二者的差异。

目标是选择解读方式，以在小鼠中诱导类似于人中观察到的CMI应答。具体地说，目标是通过使用裂解疫苗AS03或裂解疫苗AS03+MPL在小鼠中显示出比裂解普通疫苗高的CMI应答。

VI.1.1.治疗/组别

由Harlan Horst，Netherland获得6-8周龄的雌性C57BI/6小鼠(15只小鼠/组)。测试组是：

-三价裂解普通疫苗

-三价裂解疫苗AS03

-三价裂解疫苗AS03+MPL

-PBS

小鼠在第0天用异种亚型毒株(5μg HA全失活H1N1 A/约翰内斯堡/82/96、H3N2 A/悉尼/5/97、B/哈尔滨/7/94)初免。在第28天，用1.5μg HA三价裂解疫苗(A/新喀里多尼亚/20/99、A/巴拿马/2007/99、B/山东/7/97)普通疫苗或有佐剂疫苗(参见以下组别)肌内注射小鼠。

VI.1.2.疫苗制剂的制备

在每种制剂中，加入PBS 10倍浓缩液以达到等渗，在最终体积中为1倍浓缩液。计算H₂O的体积以达到目标体积。

裂解三价普通(无佐剂)制剂：

制剂1(达500μl)：将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、Triton X-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μgTween 80、110μg Triton X-100和100μg VES。5分钟搅拌后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

用水包油乳液佐剂AS03佐剂化的裂解三价制剂：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μlSB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

用AS03+MPL为佐剂的三价裂解制剂

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μlSB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入25μg MPL。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

VI.1.3.解读

CMI分析(ICS：CD4/CD8、IL-2/IFNg染色)

在免疫后7天收集初免小鼠的PBMC。它们在混合物/组别中测试。

VI.2.结果

通过使用C57BI/6初免小鼠和作为再刺激抗原的全失活病毒1μg/ml，确定显示出较高CD4和CD8+T细胞频率以及较低背景的条件。结果示于图15(CD4 T-细胞应答)和图16(CD8 T-细胞应答)。

在这些条件下，有可能诱导：

·相比于裂解普通疫苗针对裂解AS03疫苗的较高的CD4T细胞应答，如在人中所观察到的。

·相比于裂解普通疫苗针对裂解AS03+MPL疫苗的较高的CD4 T细胞应答。

·在裂解普通疫苗和裂解AS03疫苗之间相似的CD8 T细胞应答，如在人中所观察到的。

·与裂解AS03疫苗或裂解普通疫苗相比针对AS03+MPL的CD8T细胞应答较高的趋势。

实施例VII-有佐剂和无佐剂的裂解和亚单位流感疫苗在异源毒株初免C57BI/6小鼠中的临床前评价

VII.1.实验设计和目的

与Fluarix普通(无佐剂)疫苗相比，在Explo-Flu-001临床研究(参见实施例III)中观察到针对三价流感病毒裂解AS03疫苗的CD4T细胞应答显著较高。在这两个组之间未观察到CD8T细胞和体液应答这二者的差异。

使用异源毒株初免的C57BI/6小鼠开发出一种动物模型，该模型重现了在人中观察到的相似的免疫模式。对于ICS(胞内细胞因子染色)，再刺激用失活全病毒进行。

目的是比较GlaxoSmithKline商用裂解疫苗(Fluarix^TM)相对于亚单位疫苗(Chiron的疫苗Fluad^TM)诱导的CMI应答以及用AS03或AS03+MPL或另一种水包油乳液佐剂(OW)佐剂化的这些疫苗获得的CMI应答。

VII.1.1.治疗/组别

由Harlan Horst，Netherland获得6-8周龄的雌性C57BI/6小鼠(24只小鼠/组)。小鼠在第0天用异种亚型毒株(5μg HA全甲醛失活H1N1A/约翰内斯堡/82/96、H3N2 A/悉尼/5/97、B/哈尔滨/7/94)鼻内初免。在第29天，用1.5μg HA三价裂解(A/新喀里多尼亚/20/99、A/怀俄明/3/2003、B/江苏/10/2003)普通疫苗或有佐剂疫苗(参见以下表39中的组别)肌内注射小鼠。

表39

组别	抗原/制剂	其它治疗
			1	三价裂解疫苗*/普通疫苗(无佐剂)＝FluarixTM	D0异源初免
2	三价裂解疫苗*/OW	D0异源初免
			3	三价裂解疫苗*/AS03	D0异源初免
4	三价裂解疫苗*/AS03+MPL(2.5μg/剂)	D0异源初免
			5	Gripguard(＝FluadTM)＝在水包油乳液中的亚单位	D0异源初免
6	AggripalTM(亚单位)/AS03	D0异源初免
			7	AggripalTM(亚单位)/AS03+MPL(2.5μg/剂)	D0异源初免
8	AggripalTM(亚单位)/OW**	D0异源初免
			9	AggripalTM(亚单位)	D0异源初免
10	PBS	D0异源初免

^*Fluarix^TM

^**如在以下部分中的阐述生产的OW

VII.1.2.疫苗制剂的制备

OW的制备

按照在Chiron Behring FluAd疫苗中包含的说明书小册子中公布的处方，制备叫做OW的水包油乳液。

将注射用水、36.67mg柠檬酸和627.4mg柠檬酸钠二水合物混合在一起，将体积调整至200ml。将470mg Tween 80与94.47ml该缓冲液混合，此混合物叫做“溶液A”。通过在磁力搅拌下混合3.9g鲨烯和470mg Span 85制备油性混合物。然后将溶液A加入油性混合物中，获得的终体积是100ml。然后，混合物首先通过18G×1¹/₂针，然后被以两个样品放入M110S微流控器(得自Microfluidics)中，以减小油滴大小。当每个样品获得约150nm的粒度时，合并两个样品，经0.2μm滤器过滤。在T0时对合并的样品获得143nm的z均值，多分散性为0.10，在4℃储存4个月后获得145nm的z均值，多分散性为0.06。该粒度使用Zetasizer 3000HS(得自Malvern)在以下技术条件下获得：

-激光波长：532nm(Zeta3000HS)

-激光功率：50mW(Zeta3000HS)

-于90°检测的散射光(Zeta3000HS)

-温度：25℃

-持续时间：由软件自动确定

-次数：3次连续检测

-z均值直径：利用累积量分析

组1的制剂(对于1ml)：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组2的制剂(对于1ml)：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl OW乳液。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组3的制剂(对于1ml)：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组4的制剂(对于1ml)：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入25μg MPL。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组5的制剂(对于1ml)：

混合等体积的PBS和FluAd^TM/Gripguard^TM疫苗(商用疫苗)。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组6的制剂(对于1ml)：

将250μl PBS mod pH 7.4加入1剂500μl的Aggripal^TM(商用疫苗)中。搅拌15分钟后，加入250μl SB62(按照对大规模生产详述的方法制备)。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组7的制剂(对于1ml)：

将PBS mod pH 7.4加入1剂500μl的Aggripal^TM(商用疫苗)中(以达到终体积1ml)。搅拌15分钟后，加入250μl SB62(按照对大规模生产详述的方法制备)。然后加入25μg MPL。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组8的制剂(对于1ml)：

将250μl PBS mod pH 7.4加入1剂500μl的Aggripal中。搅拌15分钟后，加入250μl如对组2制备的OW，搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

组9的制剂(对于1ml)：

混合等体积的PBS mod pH 7.4和Aggripal。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

VII.1.3.解读(表40)

CMI(ICS)：免疫后7天。

IHA/中和测定：免疫后21天。

表40

解读	时间点	样品类型	I/P	分析方法
					ICS(CD4、CD8、IL-2、IFN-γ)	D35	PBL	Po	FACS分析
体液应答	D14、D44	血清	In	IHA、中和

In＝单独的/Po＝混合的

CMI分析(ICS：CD4/CD8、IL-2/IFNg染色)

在免疫后7天由24只小鼠/组收获PBMC，在混合物/组别中测试。

VII.2.结果

VII.2.1.体液免疫性

在鼻内异源初免后14天和免疫后16天检测24只动物/组的血清中抗3种疫苗株的血凝反应抑制活性。

对于3种毒株和所有组，在免疫后观测到加强的HI滴度。

·对于相同佐剂和3种毒株，亚单位疫苗和裂解疫苗诱导相似的HI滴度。

·对于3种毒株，和Aggripal OW相比对Fluad观测到相似的HI滴度。

·对于H1N1和B毒株，没有观察到Fluarix和Aggripal之间的差异。

·对于3种毒株，与普通流感疫苗相比，用有或没有MPL的AS03佐剂化流感疫苗(裂解疫苗或亚单位疫苗)时观察到统计学上显著较高的HI滴度。

·与普通流感疫苗相比，用OW佐剂化的流感疫苗(裂解疫苗或亚单位疫苗)中仅对A/怀俄明毒株的HI滴度在统计学上显著较高。

VII.2.2.细胞介导的免疫应答(在免疫后7天的ICS)

CD4 T细胞应答-图17上部

在免疫后7天收集24只小鼠/组的PBMC，并在1个混合物/组中测试。失活的三价全病毒(1μg/ml)用作再刺激抗原。结果示于图17上部。

就表达IL-2、IFN-γ或这两种细胞因子的流感全病毒特异性CD4+T细胞而言(图17上部)：

1.GSK佐剂显示出和先前观测(实施例VI)相同的趋势：AS03+MPL优于AS03，AS03又优于用普通疫苗获得的结果。对于裂解疫苗或亚单位疫苗这二者均观察到此趋势。

2.无论哪种制剂(普通疫苗、AS03或AS03+MPL)，裂解疫苗都诱导比亚单位疫苗高的CD4+T细胞应答。

3.Fluad(亚单位+水包油乳液OW-参见制备部分)看起来诱导与Fluarix普通疫苗相似的频率。

4.制剂三价裂解疫苗/AS03或三价裂解疫苗/AS03+MPL诱导高于制剂亚单位/水包油乳液OW的CD4+T细胞应答。

CD8T细胞应答-图17下部

在免疫后第7天由24只小鼠/组收集PBMC，并在1个混合物/组中测试。失活的三价全病毒(1μg/ml)用作再刺激抗原。

就表达IL-2、IFN-γ或两种细胞因子的流感全病毒特异性CD8+T细胞而言(图17下部)：

·该实验的截取值相对较高，原因是对PBS阴性对照组观测到的背景高。

·但是，与其它疫苗制剂相比，对于用三价裂解疫苗/AS03+MPL免疫的小鼠观测到较高的特异性CD8T细胞应答。

VII.3.结果概述和结论

获得以下结果：

1)在免疫后7天通过ICS获得的流感病毒特异性CD4+T细胞表明：

1.与Fluarix相比对Fluad获得相似的应答。

2.与无佐剂疫苗相比，对于裂解流感疫苗(如在人中观测到的)和亚单位疫苗(Aggripal)(在人中未评价)这二者来说，有佐剂制剂均诱导较高的免疫应答。补加MPL的水包油乳液佐剂AS03(组4和组9)产生比水包油乳液佐剂AS03(组3和组8)高的应答。

3.与裂解疫苗/AS03相比，针对裂解疫苗/AS03+MPL的CD4应答有较高的趋势(图17)。

4.由裂解疫苗诱导的应答优于用亚单位疫苗获得的应答(对比组1-4和组5-9)。

5.裂解疫苗，无论用有还是没有MPL的AS03做佐剂(组3和4)，都显示出比亚单位疫苗(Fluad(组5)或者Aggripal+OW(组7))高的CD4+T细胞应答。

2)在免疫后7天通过ICS获得的流感病毒特异性CD8+T细胞表明，在裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗(如在人中观测到的)之间未观测到差异。与裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗相比，使用裂解疫苗/AS3+MPL获得的CD8+T细胞应答有较高的趋势。

3)对于相同佐剂和3种毒株，亚单位疫苗和裂解疫苗诱导相似的HI滴度。对于3种毒株，与普通流感疫苗相比，当流感疫苗(亚单位疫苗或裂解疫苗)用AS03或AS03+MPL做佐剂时观察到统计学上显著较高的滴度(仅对于A/怀俄明毒株流感疫苗OW＞普通流感疫苗)。

实施例VIII-用含裂解流感抗原制备物和有或没有MPL佐剂的AS03的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验

VIII.1.实验设计

在65岁以上(≥65岁)老年人群中进行开放、随机、可控的I期研究，以便评价与Fluarix^TM疫苗(在比利时称为α-Rix^TM)相比肌内给予的含佐剂AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性。

评价3个平行组：

·1组50名受试者接受1剂重配和AS03佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03)

·1组50名受试者接受1剂重配和Flu AS03+MPL佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03+MPL)

·1组50名受试者接受1剂Fluarix^TM(Fluarix)

VIII.2.疫苗组成和给予

在3种疫苗中使用的毒株是已由WHO推荐用于2004-2005北半球流感季的毒株，即A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亚/3/2003(H3N2)和B/江苏/10/2003。同Fluarix^TM/α-Rix^TM一样，商用疫苗用作对比物，有佐剂疫苗(AS03或AS03+MPL)每剂含每种流感病毒株的15μg血细胞凝集素(HA)。

有佐剂流感候选疫苗是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含佐剂(AS03或AS03+MPL)的预填充I型玻璃注射器组成。它们如在实施例II中的详述制备。用于有佐剂流感候选疫苗配制的3种失活裂解病毒体抗原(单价原液)与用于配制商用Fluarix^TM/α-Rix的活性成分完全相同。

AS03佐剂化的疫苗：

AS03佐剂化的流感候选疫苗是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶(抗原容器)中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原(335μl)和含SB62乳液(335μl)的预填充I型玻璃注射器(佐剂容器)组成。AS03候选疫苗的描述和组成阐述于实施例III。

AS03+MPL佐剂化的疫苗：

简而言之，AS03+MPL佐剂化的流感疫苗候选物是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶(抗原容器)中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原(335μl)和含AS03+MPL佐剂(360μl)的预填充I型玻璃注射器(佐剂容器)组成。在注射时，抗原容器的内容物通过使用含AS03+MPL佐剂的注射器由瓶中被取出，接着轻微混合注射器。在注射前，使用的针被肌内针替换，并将体积调整到530μl。1剂重配的AS03+MPL佐剂化流感候选疫苗相当于530μl。为在AS03+MPL佐剂化疫苗重配时获得每种流感株的15μg HA，与Fluarix^TM(即30μgHA/ml)相比，失活的裂解病毒体抗原在抗原容器中被浓缩2倍(即60μg HA/ml)。

1剂重配的佐剂化流感疫苗的组成与表45(参见实施例XI)中报告的相同，只是流感株不同。两种疫苗都肌内给予。

VIII.3.CMI目标、终点和结果

CMI目标是确定相对于无任何佐剂的组合物，用AS03或AS03+MPL佐剂化的制剂之间哪种免疫原性组合物对流感抗原接种个体的CD4和CD8介导免疫性具有最强的免疫刺激活性。

VIII.3.1.CMI终点和结果

观测变量

在第0天和第21天：每10⁶个细胞中针对5种不同细胞因子的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试定量针对以下的CD4/CD8T细胞应答：

-以下3种抗原的混合物

-新喀里多尼亚抗原

-怀俄明抗原

-江苏抗原

衍生变量：

在5种不同测试中用以下细胞表示的抗原特异性CD4和CD8-T-细胞应答：

(a)产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞

(b)产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞

(c)产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞

(d)产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞

(e)产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞

CMI应答分析：

CMI分析基于总接种群体。

(a)对于每个治疗组，针对每个接种组、每个时间点(第0天、第21天)和每种抗原：新喀里多尼亚、怀俄明和江苏以及合并的3种不同毒株，测定CD4/CD8T-淋巴细胞分泌应答的频率。

(b)针对各5种不同的细胞因子，在时间点(接种后-接种前)之间对各个接种组和各种抗原的应答的个体差异的描述统计。

(c)就5种不同细胞因子对比3组的以下方面：

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏以及合并的3种毒株的CD4 T-细胞应答

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏以及合并的3种毒株的CD8 T-细胞应答

(d)非参数检验(Kruskall-Wallis检验)用于对比3组间的局部差异，针对各5种不同细胞因子计算各种抗原的统计学p-值。

(e)Wilcoxon检验分别用于检验Flu AS03+MPL对Fluarix、FluAS03+MPL对Flu AS03以及Flu AS03对Fluarix之间的2组成对比较。

(f)所有显著性检验都是双尾的。小于或等于0.05的P-值被认为是统计学显著的。

VIII.3.2.CMI结果

结果表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8T细胞的频率。

抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率

(a)与在实施例III中所实施的类似，针对每个接种组、每个时间点(第0天、第21天)和每种抗原(合并的、新喀里多尼亚、怀俄明和江苏)，测定抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。

(b)通过Kruskall-Wallis检验对比3个组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。

(c)通过Wilcoxon检验对比Flu AS03+MPL和Fluarix组之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。

(d)通过Wilcoxon检验对比Flu AS03和Fluarix组之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。

(e)通过Wilcoxon检验对比Flu和Flu AS03+MPL组之间抗原特异性CD4T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都大于0.05，被认为不是统计学显著的。

在时间点(接种后-接种前)之间CD4 T-淋巴细胞的个体差异

(a)与已在实施例III中实施的类似，针对各5种不同细胞因子每个接种组和每种抗原在时间点(接种后-接种前)之间的CD4 T-淋巴细胞应答的个体差异做描述统计。

(b)通过Kruskall-Wallis检验对比3个组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都小于0.001，被认为是高度统计学显著的。

(c)使用Wilcoxon检验对比Flu AS03+MPL和Fluarix之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。

(d)使用Wilcoxon检验对比Flu AS03和Fluarix之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都小于0.001，被认为是高度统计学显著的。

(e)使用Wilcoxon检验对比Flu AS03+MPL和Flu AS03之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都大于0.05，被认为不是统计学显著的。

VIII.4.B细胞记忆应答目标、终点和结果

研究的目标是研究与老年人群中的Fluarix相比，在用含佐剂AS03+MPL或AS03的流感候选疫苗进行1次肌内接种时，对流感病毒抗原特异性的记忆B细胞的频率是否被显著诱导。记忆B细胞的频率通过B细胞Elispot测定评价。

VIII.4.1.B细胞记忆应答终点

终点是：

(a)在第0、21天时：就百万(10⁶)个产IgG浆细胞中的特异性抗原浆细胞频率而言，在所有受试者中都通过B细胞ELISPOST检测在体外培养记忆B细胞中产生的细胞。

(b)在接种后(第21天)和接种前(第0天)之间的差异也表示为每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。

VIII.4.2.B细胞记忆应答结果

测定每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。结果表明，通过Wilcoxon检验获得的Flu AS03+MPL和Fluarix组之间流感病毒抗原特异性记忆B细胞的频率对B/江苏毒株而言显著(p＜0.05)较高，而对其它两种毒株(A毒株新喀里多尼亚和怀俄明)则不会这样。

还测定了对流感抗原特异性的记忆B细胞在时间点(接种后-接种前)之间的个体差异。结果表明，通过Kruskall-Wallis检验获得的Flu AS03+MPL和Fluarix组之间流感病毒抗原特异性记忆B细胞的频率在时间点(接种后-接种前)之间的个体差异对B/江苏毒株而言显著(p＜0.05)较高，而对其它两种毒株(A毒株新喀里多尼亚和怀俄明)不会这样。

结果示于图18。

实施例IX-有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价(研究III)

IX.1.基本原理和目标

本研究对比无佐剂的(Fluarix^TM)或用AS03+MPL佐剂化的GSK商用三价裂解流感疫苗和两种其它商用亚单位疫苗：

-Fluad^TM，Chiron的佐剂化亚单位疫苗(佐剂为Chiron的MF59佐剂)，

-Agrippal^TM，Chiron的无佐剂商用亚单位疫苗，其在本研究中用AS03佐剂做佐剂。

本实验的目标是评价这些疫苗在用异源毒株攻击的雪貂的鼻分泌物中减轻病征(体温和病毒脱落)的能力。

终点是：

1)主要终点：在异源攻击后减轻鼻清洗液中的病毒脱落：

2)次要终点：通过IHA分析体液应答，并监测初免和异源攻击前后的温度。

IX.2.实验设计

IX.2.1.治疗/组

由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))。雪貂在第0天用异种亚型毒株H1N1 A/斯德哥尔摩/24/90(4 Log TCID₅₀/ml)鼻内初免。在第21天，用全人剂量(1ml疫苗剂量，15μg HA/毒株)的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/怀俄明/3/2003和B/江苏/10/2003的组合肌内注射雪貂。然后在第42天用异型毒株H3N2 A/巴拿马/2007/99(4.51 LogTCID₅₀/ml)通过鼻内途径攻击雪貂。组别(6只雪貂/组)描述于表41。要实施的解读方式详述于表42。

表41

组别	抗原+剂导	制剂+剂量	注释(例如：日期/途径/攻击)	其它治疗
					1	三价普通疫苗(FluarixTM)	全人剂量：15μg HA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免
2	三价AS03+MPL	全人剂量：15μg HA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免
					3	FluadTM	全人剂量：15μg HA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免
4	AgrippalTMAS03	全人剂量：15μg HA/毒株	IM；第21天	第0天H1N1(A/斯德哥尔摩/24/90)初免

IX.2.2.疫苗制剂的制备

三价裂解普通(无佐剂)制剂：配制成1ml：

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有375μg Tween 80、55μg TritonX-100和50μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

用AS03+MPL佐剂化的三价裂解制剂：配制成1ml

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有375μg Tween 80、55μg TritonX-100和50μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入25μg MPL。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。

FluAd^TM制剂：配制成1ml：

在PBS缓冲液pH 7.4中配制FluAd^TM疫苗的2倍稀释液。

Agrippal^TMAS03制剂：配制成1ml：

将250μl PBS缓冲液pH 7.4加入1剂Aggripal^TM中。混合后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的详述制备)。混合物于室温搅拌。

IX.2.2.解读

表42

解读	时间点	样品类型	I/P	分析方法
					病毒脱落	D-3至初免后D+7攻击后D+1至D+5	鼻清洗液	In	滴定
T°监测	D-3至初免后D+4D-2至攻击后D+4	在腹腔中的植入物	In	遥测
					IHA	接种前、初免后、免疫后、攻击后	血清	In	IHA

In＝单独的/Po＝混合的

IX.3.结果(图19-22)

IX.3.1.温度监测

用传感器并用通过遥测记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。由攻击前2天直至攻击后4天每15分钟记录温度，由日中计算出平均温度。结果示于图19。

结果：

攻击后，用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)或亚单位疫苗Fluad^TM(其含MF59水包油乳液)免疫雪貂后观测到体温峰值。在用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗和用AS03佐剂化的亚单位Agrippal^TM免疫雪貂后均未观测到峰值。总之，对于裂解和亚单位测试疫苗，均显示出含AS03的疫苗在攻击后防止体温升高的附加价值，相反含MF59的疫苗于攻击后的雪貂中不能防止此体温升高。

IX.3.2.病毒脱落

对每组6只动物进行鼻清洗物的病毒滴定。通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于干冰(-80℃)上的样品容器中。

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育5-7天。在5-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲

染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD＜截取值时定义为阳性得分，相反，OD＞截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。

结果：

结果示于图20。与用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)或Fluad^TM亚单位疫苗免疫雪貂后观察到的非常低的病毒脱落减少相比，用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或用AS03佐剂化的Agrippal^TM亚单位疫苗攻击后观察到较低的病毒脱落。

与针对体温升高所讨论的相类似，相比于含MF59的疫苗观察到含AS03疫苗的附加价值。

IX.3.3.HI滴度

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对H3N2流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制小鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理并热失活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。

结果：

在用H3N2 A/怀俄明免疫后，与用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)或Fluad^TM亚单位疫苗免疫雪貂后观察到的体液应答相比，在用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或AS03佐剂化的Agrippal^TM亚单位疫苗免疫的雪貂中观测到较高的体液应答(HI滴度)(图21)。

在用H3N2 A/怀俄明免疫后，与用三价裂解普通疫苗或Fluad免疫的雪貂相比，在用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或AS03佐剂化的Agrippal^TM免疫的雪貂中还观测到针对用做攻击株的漂移株H3N2 A/巴拿马的较高体液应答(HI滴度)(图22)。

用我们的佐剂(AS03或AS03+MPL)观测到的针对异源毒株的此交叉反应与用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或AS03佐剂化的Agrippal^TM亚单位疫苗免疫并随后用此异源毒株攻击的雪貂中观测到的保护作用相关联。由含AS03疫苗诱导的针对异源毒株的此交叉反应性不由MF59佐剂化的疫苗(FluAd^TM)诱导。

实施例X-用含裂解流感抗原制备物和有或无MPL佐剂的AS03的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验：在第90天和180天的免疫原性持久性数据

X.1.研究设计

于65岁以上(≥65岁)的老年人群中进行开放、随机、可控的I期研究，以便评价与Fluarix^TM疫苗(在比利时称为α-Rix^TM)相比肌内给予的含佐剂AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性。该研究遵循在实施例VIII中报告的研究。

评价三个平行组：

·1组50名受试者接受1剂重配和AS03佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03)

·1组50名受试者接受1剂重配和Flu AS03+MPL佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03+MPL)

·1个对照组50名受试者接受1剂Fluarix^TM(Fluarix)

X.2.免疫原性结果

X.2.1.体液免疫应答终点和结果

为了评价由AS03和AS03+MPL佐剂化的疫苗诱导的体液免疫应答及其持久性，针对各个治疗组计算以下参数。

在第0、21、90和180天：针对在疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种单独测试的血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。

·在第0、21、90和180天具有95％CI的血清HI抗体GMT

·在第21、90和180天具有95％CI的血清阳转率

·在第21天具有95％CI的转变因子

·在第0、21、90和180天具有95％CI的血清保护率

结果

具有95％CI的HI抗体的GMT示于图23。3个组中针对全部3种疫苗株的抗体的接种前GMT处于相同范围内。在接种后，抗血细胞凝集素抗体水平显著增加。但是，接种后针对3种疫苗株的抗体的接种后GMT对所有疫苗而言都仍在相同的范围内。在第21天，对于A/新喀里多尼亚和B/江苏毒株来说，观察到和Fluarix相比有利于2种有佐剂疫苗的轻微趋势，在两种有佐剂疫苗中，用FLU AS03观察到针对A/怀俄明和B/江苏毒株的较高GMT。

在第90天观察到相同的趋势。在第180天，对3种疫苗来说，针对3种疫苗株的抗体GMT在相同范围内。

在60岁以上的受试者中，所有流感疫苗都满足欧洲官方对每年注册的流感失活疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。

在接种后3个月(90天)和6个月(180天)，无论哪个所考察的研究组，血清保护率都仍高于欧洲官方要求的最低60％的保护率。在第90天，在3个疫苗组中对所有疫苗株都仍达到欧洲官方要求的30％的最低血清阳转率，Fluarix的A/新喀里多尼亚株除外。在第180天，用3种疫苗对A/怀俄明和B/江苏株仍可达到该血清阳转率，但对A/新喀里多尼亚株不行(表43和表44)。

表43以血清血凝反应抑制滴度高于或等于1∶40的接种者百分率表示的血清保护率(免疫原性的ATP群体)

N＝结果可用的受试者数目

n/％＝滴度在特定范围内的受试者的数目/百分率

PRE＝接种前滴度

PI(D21)＝在第21天采接种后血样

PI(D90)＝在第90天采接种后血样

PI(D180)＝在第180天采接种后血样

表44代表血凝反应抑制(HI)抗体滴度的血清阳转率，定义为相比于第0天在各个接种后时间点的血清HI滴度具有至少达4倍增加的接种者百分率(免疫原性的ATP群体)

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目

n/％＝具有至少达4倍增加的受试者数目/百分率

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限

X.2.2.CMI应答终点和结果

为了评价由有佐剂疫苗诱导的细胞免疫应答及其持久性，针对各个治疗组计算以下参数：

在各个时间点(第0、21、90和180天)：在不同测试中每10⁶个细胞中细胞因子阳性的CD4/CD8细胞的频率(在第0天和21天单独考察的以及合并的新喀里多尼亚、怀俄明和江苏抗原；在第90天和180天单独考察的以及合并的新喀里多尼亚、怀俄明、江苏和纽约抗原)。

·All double：产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IFN-γ、IL-2、TNF-α)的细胞。

·CD40L：产生至少CD40L和另一种细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α)的细胞。

·IFN-γ：产生至少IFN-γ和另一种细胞因子(CD40L、IL-2、TNF-α)的细胞。

·IL-2：产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、IFN-γ、TNF-α)的细胞。

·TNF-α：产生至少TNF-α和另一种细胞因子(CD40L、IFN-γ、IL-2)的细胞。

结果

主要发现是(图24)：

(a)接种后21天，相比于Fluarix组，在2个有佐剂的疫苗组中细胞因子阳性的CD4T细胞(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)的频率显著较高。但是，在两种佐剂之间没有显著差异。

(b)有佐剂疫苗和Fluarix之间的所有统计差异至第90天和第180天都得以保持，在第180天以下几项除外：

·对于All double、CD40L、IFN-γ和IL2(仅怀俄明株)和对于Alldouble、CD40L和TNF-α(仅纽约株)，在FluAS03/MPL和Fluarix之间没有发现统计学显著差异，

·对于IL2(仅江苏株)，在FluAS03和Fluarix之间没有发现统计学显著差异，

(c)至第90天和第180天，证实在两种有佐剂的疫苗之间没有统计学显著的差异。

(d)对于两种有佐剂的疫苗，针对所研究的所有细胞因子(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)，接种前和接种后(第21天)之间CD4T-淋巴细胞应答的差异显著高于Fluarix^TM。但是，在两种佐剂之间没有检测到显著差异。

(e)接种对CD8应答没有可检测的影响，无论哪一个治疗组。实施例XI-用含裂解流感抗原制备物以及AS03和MPL佐剂的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验

XI.1.研究设计和目标

在65岁以上(＞65岁)老年人群中进行开放、可控的I/II期研究，以便评价含AS03+MPL佐剂的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性，所述老年人群先前于2004年用相同候选疫苗接种。为进行免疫原性和安全性评价，Fluarix^TM疫苗(在比利时称为-Rix^TM)用作参比。

评价2个平行组：

·1组约50名受试者，他们先前已在先前的临床实验中接受了1剂重配的佐剂化流感疫苗

·1个对照组(Fluarix)约50名受试者，他们在先前的临床实验当中已预先接受了1剂Fluarix

此研究的1个目标是评价在首次剂量给予后约1年给予佐剂化流感疫苗Flu AS03+MPL进行的再接种的体液免疫应答(抗血细胞凝集素和抗-MPL滴度)。为比较目的，已在先前实验中接受Fluarix^TM的受试者接受1剂商用疫苗，并构成该实验的对照组。

XI.2.疫苗组成和给予

在3种疫苗中使用的毒株是已由WHO推荐用于2005-2006北半球流感季的毒株，即A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亚/7/2004(H3N2)和B/江苏/10/2003。同Fluarix^TM/α-Rix^TM一样，商用疫苗用作对比物，AS03+MPL佐剂化的疫苗(后文简称为“有佐剂疫苗”)每剂含每种流感病毒株的15μg血细胞凝集素(HA)。

有佐剂的流感候选疫苗是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含AS03+MPL佐剂的预填充I型玻璃注射器组成。它们已按照实施例II中详述的方法制备。

在注射时，将含佐剂的预填充注射器的内容物注入含浓缩三价失活裂解病毒体抗原的瓶中。在混合后将内容物吸入到注射器中，针用肌内针替换。1剂重配的佐剂化流感候选疫苗相当于0.7ml。佐剂化流感候选疫苗是无防腐剂的疫苗。

1剂重配的佐剂化流感疫苗的组成在表45中给出。两种疫苗都肌内给予。

表45重配有佐剂(AS03+MPL)流感候选疫苗的组成

组分	每剂的量
		失活裂解病毒体-A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)-A/新加利福尼亚/7/2004(H3N2)-B/江苏/10/2003	15μg HA15μg HA15μg HA
佐剂SB62乳液-(鲨烯)-(DL-α-生育酚)-(聚山梨醇酯80-Tween 80)MPL	10.68mg11.86mg4.85mg25μg HA

XI.3.免疫原性结果

XI.3.1.抗-HA体液免疫应答终点和结果

观测变量：

在0天和21天：血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。

衍生变量(具有95％置信区间)：

(f)接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMT)

(g)21天时具有95％CI的血清阳转率^*

(h)21天时具有95％CI的血清转变因子^**

(i)21天时具有95％CI的血清保护率^***

^*血清阳转率定义为针对每种疫苗株的接种前HI滴度＜1∶10且接种后滴度≥1∶40的接种者百分率，或接种前滴度≥1∶10且接种后滴度增加至最少4倍的接种者百分率。

^**血清转变因子定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。

^***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度≥40的接种者百分率，通常将该百分率看作指示保护作用。

结果

正如所料，在接种前2个组中的大部分受试者对3种毒株已经是血清阳性的。针对全部3种疫苗株的接种前GMT在2个组中处于相同范围内。相比于Fluarix组，在Flu AS03+MPL组中针对全部3种疫苗株的接种后GMT有较高的趋势，尽管95％CI是重叠的(图25)。

在60岁以上的受试者中，2种流感疫苗满足欧洲官方对每年注册的流感失活疫苗的要求[关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)](表46)。

表46在第21天时的血清保护率、血清阳转率和转变因子(免疫原性的ATP群体)

毒株	组别	N	血清保护率(HI滴度≥40)％	血清阳转率(≥4倍增加)[95％CI]％	血清转变因子[95％CI]％
						EU标准株(＞60)			＞60％	＞30％	＞2.0
A/新喀里多尼亚	Flu+MPL-AS03	38	89.5[75.20-97.06]	31.6[17.5-48.7]	3.1[2.2-4.4]
							Fluarix	45	82.2[67.95-92.00]	31.1[18.2-46.6]	2.5[1.8-3.5]
A/纽约(H3N2)	Flu+MPL-AS03	38	92.1[78.62-98.34]	78.9[62.7-90.4]	8.8[6.1-12.5]
							Fluarix	45	95.6[84.85-99.46]	68.9[53.4-818]	6.0[4.4-8.3]
B/江苏(B)	Flu+MPL-AS03	38	100[90.75-100]	57.9[40.8-73.7]	5.1[3.7-7.0]
							Fluarix	45	100[92.13-100]	37.8[23.8-53.5]	3.1[2.4-4.0]

N＝受试者总数；％＝在第21天时滴度处于特定范围内的受试者百分率；CI＝置信区间

实施例XII-用含裂解流感抗原制备物、以AS03和两个不同浓度的MPL佐剂化的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验

XII.1.研究设计和目标

与在成人(18-40岁)中给予的Fluarix^TM(在比利时称为α-Rix^TM)相比，对在老年人群(65岁及以上)中给予的含各种佐剂的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的细胞介导免疫应答来说，开放的随机I/II期研究表现出非劣效性。

评价4个平行组：

(a)在一个对照组中的75名成人(18-40岁)，他们接受1剂Fluarix^TM(Fluarix组)

(b)200名老年受试者(65岁及以上)，按照3∶3∶2随机分为3组：

-一组75名受试者，他们接受以AS03+MPL为佐剂的流感疫苗(浓度1-25μg)

-一组75名受试者，他们接受以AS03+MPL为佐剂的流感疫苗(浓度2-50μg)

-具有50名受试者的参比Flu组，他们接受1剂Fluarix^TM

首要目标

首要目标是就产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、TNF-α、IFN-γ)的流感特异性CD4T-淋巴细胞的频率而言，与在成人(18-40岁)中给予的Fluarix^TM相比，在老年受试者(65岁或以上)中给予的流感佐剂化疫苗在接种后21天表现出非劣效性。

次要目标

次要目标是

(a)评价在老年人(65岁及以上)中肌内给予疫苗后的21天当中用佐剂化候选流感疫苗接种的安全性和反应原性。Fluarix^TM用作参比。

(b)评价用佐剂化流感候选疫苗接种后21、90和180天的体液免疫应答(抗血细胞凝集素滴度)。Fluarix^TM用作参比。

第三目标

第三目标是评价用佐剂化流感疫苗接种后21、90和180天的细胞介导的免疫应答(产生IFN-γ、IL-2、CD40L和TNF-α以及记忆B-细胞应答)。Fluarix^TM用做参比。

XII.2.疫苗组成和给予

用AS03+MPL(每剂25μg)系统佐剂化的流感疫苗也用于在实施例XI中阐述的研究。用AS03+MPL(每剂50μg)系统佐剂化的流感疫苗具有相同组成，只是MPL浓度加倍。方法与实施例VIII中针对AS03+MPL佐剂化流感疫苗描述的方法相同，唯一的区别是MPL浓度加倍。

对照：全剂量Fluarix^TM，通过IM给予。

每名受试者进行4次预定随访：于0、21、90和180天的每次随访时收集血样，以评价免疫原性。

接种程序：在第0天进行1次流感疫苗注射。

XII.3.免疫原性结果

XII.3.1.CMI终点和结果

主要终点评价

在第21天：在产生至少两种不同细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和CD40L)的测试中，依据每10⁶个细胞中流感特异性CD4T-淋巴细胞频率的所有受试者的CMI应答

为评价CMI应答，如下分析流感特异性CD4的频率：

使用涉及对数变换滴度的ANCOVA模型依据佐剂化疫苗和FluYNG接种的组之间流感特异性CD4的频率获得GM比率。ANCOVA模型包括作为固定效果的疫苗组和作为回归量的接种前对数变换滴度。GM比率及其98.75％CI来源于模型中相反的对应组的指数变换。调整的GM的98.75％CI通过以上ANCOVA模型的组最小平方法的98.75％CI的指数变换获得。

结果-推理分析(表47)

在用“合并的抗原II”体外再刺激后于第21天产生至少两种细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和CD40L)的流感特异性CD4T-淋巴细胞的已调整GM和GM比率(及其98.75％CI)示于表47。对于每种佐剂化流感疫苗，GM比率的双侧98.75％CI的上限远低于2.0的临床限度。这表明了相比于在18-40岁的成人中给予的Fluarix^TM疫苗，给予给老年受试者的两种佐剂化流感疫苗就流感特异性CD40的接种后频率而言的非劣效性。

表47第21天产生至少两种细胞因子的流感特异性CD4的已调整GM比率(免疫原性的ATP群体)

已调整的GM＝根据基线滴度调整的几何平均抗体；N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目；98.8％CI＝调整的GM比率的98.8％置信区间(Ancova模型：对基线调整)；LL＝上限；UL＝下限。

结果-描述分析(图26)

主要发现是：

·接种前CMI应答如果在年轻人中比在老年人中高

·接种后，

ο流感疫苗对年轻成人(18-40岁)中的CMI应答有加强作用

ο已接受佐剂化流感疫苗的老年人中的CMI应答与年轻成人中的CMI应答相当。

·当我们对比Fluarix(18-40岁)和FlU/AS03+MPL(浓度1)时，除了IFNγ之外，对于所有测试，与Fluarix^TM(18-40岁)相比，接种前和接种后之间针对所研究的所有细胞因子(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)的CD4T淋巴细胞应答差异在采用佐剂化疫苗时都显著较高。

应当指出的是，体外刺激用Flu株(i)B/江苏，(ii)A/H3N2/纽约和(iii)A/H3N2/怀俄明进行，而不是包含在疫苗中的A/H1N1/新喀里多尼亚。但是，来自一部分受试者的包含A/H1N1/新喀里多尼亚疫苗株的初步数据表明结果是相似的。

结果-评价第三终点(表48)

为了评价第三终点，在第0、21、90和180天检测流感特异性CD4/CD8T-淋巴细胞和记忆B细胞的频率。

总结了对于每种抗原、每个疫苗组在第0和21天的流感特异性细胞因子阳性CD4/CD8T-淋巴细胞的频率(描述统计)。

非参数检验(Wilcoxon检验)用于对比两个组之间的局部差异(佐剂化流感疫苗对Fluarix^TM)，计算在各个测试中针对每种抗原的统计学p-值。在各个测试中针对每个接种组和每种抗原计算21天/0天(接种后/接种前)之间的应答个体差异的描述统计。

非参数检验(Wilcoxon检验)用于对比个体差异(接种后/接种前接种)，计算每个不同检验中每种抗原的统计学p-值。

用于对比流感特异性CD4 T-淋巴细胞频率差异的Wilcoxon检验的p-值示于表48。

表48推理统计：由Kruskal-Wallis检验获得的CD4 T细胞在各个时间点的p-值(免疫原性的ATP群体)

组1：用AS03+MPL佐剂化的流感疫苗(浓度1)

组2：用AS03+MPL佐剂化的流感疫苗(浓度2)

主要结论是：

(a)流感特异性CD4的接种前GM频率在所有老年受试者组中都是相似的，但在18-40岁的成人中较优。

(b)在用佐剂化疫苗接种的老年受试者中和在Fluarix^TM接种的18-40岁成人中，流感特异性CD4T淋巴细胞的接种后(第21天)频率是相似的。

(c)与Fluarix^TM相比，在用佐剂化疫苗接种后，老年受试者中流感特异性CD4T淋巴细胞的接种后(第21天)频率显著较高。

(d)流感特异性CD8T细胞的接种前和接种后GM频率在所有组中都基本相似。

结果-体液免疫应答终点的评价

观测变量：

在第0、21、90和180天：血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度，针对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种单独测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B抗体)。

抗所有疫苗抗原的HI抗体的截取值在分析前由实验室确定(等于1∶10)。血清阴性受试者是其抗体滴度低于截取值的受试者。血清阳性受试者是其抗体滴度大于或等于截取值的受试者。低于测定截取值的抗体滴度以一半截取值的任意值给出。

基于HI抗体滴度，计算以下参数：

(j)在第0天和21天的HI抗体的几何平均滴度(GMT)，采用对数滴度转换平均值的反对数计算

(k)第21天时的血清转变因子(SF)，定义为相比于第0天在第21天时血清HI GMT的增加倍数。

(I)第21天时的血清阳转率(SC)，定义为接种前HI滴度＜1∶10且接种后滴度≥1∶40的接种者百分率，或接种前滴度≥1∶10且接种后滴度有最少达4倍增加的接种者百分率。

(m)第21天时的血清保护率(SPR)，定义为血清HI滴度≥1∶40的接种者的百分率。

分别获得每个组的GM的95％CI。首先获得对数转换滴度平均值的95％CI，假定对数转换滴度以未知方差正态分布。然后通过对数转换滴度平均值的95％CI的指数转换获得GM的95％CI。

具体抗体检测的缺失的血清学结果不被替换。因此，在给定时间点无血清学结果的受试者不影响该时间点的测定分析。

体液免疫应答结果(图27和表49)

全部3种疫苗株的HI抗体的接种前GMT在4个治疗组中都处于相同范围内。在接种后，相比于相同群体中的标准Fluarix，增加老年人中体液应答的2种佐剂有明显的作用。

GMT是

·对于AS03+MPL(浓度2)，针对H1N1的GMT显著较高，

·对于两种佐剂，针对H3N2和B的GMT显著较高，

接种后21天，Fluarix(18-40岁)受试者对新喀里多尼亚和B/江苏株的HI应答较高。

如表49所示，在60岁以上的受试者中，佐剂化流感疫苗超出了欧洲官方对每年注册的裂解病毒体流感疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。

在接种后，就HI抗体的血清保护率而言，Fluarix(≥65岁)组和以下组具有统计学差异：

·对于A/新喀里多尼亚株，Flu AS03+MPL(浓度2)

对于各个疫苗株，2种佐剂化流感疫苗组的血清保护率相比于Fluarix(18-40岁)组处于相同范围内。

就HI抗体的血清阳转率而言，Fluarix(≥65岁)组和以下组具有统计学差异：

·对于A/新喀里多尼亚株的Flu AS03+MPL(浓度2)

·对于B/江苏株的Flu AS03+MPL(浓度1)

对于各个疫苗株，2种佐剂化流感疫苗组的血清阳转率相比于Fluarix(18-40岁)组处于相同范围内，新喀里多尼亚株除外。

表49在第21天的血清保护率、血清阳转率和转变因子(免疫原性的ATP群体)

N＝受试者总数；％＝在21天时滴度处于特定范围内的受试者百分率；CI＝置信区间

XII.3.2.免疫原性结论

(a)相比于18-40岁的成人，老年人中的流感特异性CD4的接种前频率明显较差。在用Fluarix^TM接种后，相比于年轻人，老年人中的接种后频率(第21天)仍较差。相反，相比于在18-40岁成人中用Fluarix^TM接种，在用佐剂化疫苗接种老年受试者后表现出流感特异性CD4的接种后频率的非劣效性。

(b)关于依据HI抗体应答的体液免疫应答，所有流感疫苗都满足欧洲官方对每年注册的流感失活疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。在老年人中，有佐剂疫苗介导至少一种趋势：针对流感血细胞凝集素的体液免疫应答比Fluarix^TM高。表50总结了相比于Fluarix^TM在老年受试者中由有佐剂疫苗介导的针对每种疫苗株的体液免疫应答之间的差显著异。相比于用Fluarix^TM接种的18-40岁成人，用有佐剂疫苗接种的老年受试者显示出一种趋势：在第21天时抗A/纽约株的接种后GMT和血清转变因子较高。

表50在老年受试者中佐剂化疫苗和Fluarix之间体液免疫应答的显著差异

	接种后GMT	血清转变因子	血清保护率	血清阳转率
					Flu  AS03+MPL(浓度1)	A/纽约B/江苏	A/纽约	-	B/江苏
Flu AS03+MPL(浓度2)	A/纽约B/江苏A/新喀里多尼亚	A/新喀里多尼亚	A/新喀里多尼亚	A/新喀里多尼亚

XII.4.反应原性结果

XII.4.1.不良事件(AE)的记录

记录在7天随访期(接种日和随后的6天)当中出现的诉求症状(参见表51)。还记录了在21天随访期(接种日和随后的20+3天)当中出现的主动诉求症状。如在表52中所述评价以下AE的强度。

表51诉求的局部/全身不良事件

诉求的局部AE	诉求的全身AE
		注射部位疼痛注射部位发红注射部位肿胀血肿	疲劳发热头疼肌肉疼寒颤注射臂关节痛其它部位关节痛

注意：温度在晚上记录。在一天中的其它时间应另外进行温度检测，记录最高温度。

表52成人中诉求症状的强度等级

^*发热定义为腋下体温≥37.5℃(99.5°F)

局部注射部位发红/肿胀的最大强度如下记录：

0是0mm；1是＞0至≤20mm；2是＞20至≤50mm；3是＞50mm。

如下记录发热的最大强度：

1是＞37.5至≤38.0℃；2是＞38.0至≤39.0℃；3是＞39.0℃。

研究者针对所有其它AE进行强度判断，其它AE即主动诉求的症状，包括在研究当中报告的SAE。评价基于研究者的临床判断。记录的每种AE的强度指定为以下的一种类别：

1(轻微)＝受试者容易耐受的AE，引起最低的不适，且不干扰每天的活动；

2(中等)＝不适足以干扰每日正常活动的AE；

3(严重)＝阻碍每日正常活动的AE(在成人/青少年中，这种AE例如会阻碍上班/上学，应必须给予正确的治疗)。

XII.4.2.不良事件(AE)的记录

就局部和全身症状这二者来说，发现采用佐剂化疫苗在老年受试者中观察到的反应原性比相同群体中用Fluarix^TM观察到的高。但是，其显示出与成人群体中观察到的水平相似。相比于用Fluarix^TM在老年受试者中观察到的反应原性，用有佐剂疫苗接种后症状的发病率和强度增加(图28)。在所有情况下，症状都快速消退。

3级症状表现出一种趋势：与接受其中MPL为较低浓度的有佐剂疫苗的组别相比，在接受最高MPL浓度佐剂化疫苗的组别中较高。但是，在所有情况下，症状都快速消退。

实施例XIII-使用AS03+MPL佐剂化的HPV疫苗在小鼠中的临床前研究

XIII.1.简介

用含各2.5μg的4种不同抗原HPV 16 L1、HPV 18 L1、HPV 31 L1和HPV 45 L1的佐剂化混合物(为病毒样颗粒形式)注射BALB/C小鼠。对于HPV16而言，每种L1蛋白都是除去34个氨基酸(或其它序列中的等同区域)的C-末端截短物。

例如WO 03/077942所述在杆状病毒表达系统中表达和纯化HPV蛋白。

四价VLP组合与2种不同佐剂中的1种组合。

测试的佐剂是：

1氢氧化铝和3-D MPL的混合物(称为AS04)。

2 AS03+3D-MPL的混合物，基本如实施例2所述制备。

佐剂AS04用于仅含HPV 16和HPV 18 L1病毒样颗粒的疫苗，该疫苗在如The Lancet，364卷，947期，2004年11月13日，1757-1765所述的II期临床实验中测试。因此，其为与AS03+3D-MPL对比提供了良好的基础。该佐剂可如例如WO 01/17751和WO 00/23105所述制备。

对疫苗的每种组分进行抗体滴度分析。另外，在总IgG分子群中对HPV 16和HPV 18特异性的B记忆细胞进行分析。

XIII.2.材料和方法

XIII.2.1.动物模型

用2.5μg HPV-16/18/31/45 L1在1条腿肌内免疫(第0天和28天)2组BALB/c小鼠(n＝10)，HPV-16/18/31/45 L1用AS04(Al(OH)₃50μg+MPL 5μg)或基本如实施例2制备的AS03+3D-MPL的混合物(含50μl乳液+MPL 5μg)配制。

XIII.2.2.抗HPV-16/18/31/45 L1血清学：Ig

使用HPV-16 L1(批号E16L1P093)、HPV-18 L1(批号E18L1P079)、HPV-31 L1(批号EA31L1P329)和HPV-45 L1(批号EA45L1P328)作为包被抗原，通过ELISA进行抗HPV-16/18/31/45 L1抗体的定量。HPV-16/18/31/45 L1和抗体溶液以50μl/孔使用；仅饱和溶液以100μl孔使用。HPV-16/18/31/45 L1用PBS稀释至终浓度0.5μg/ml，并于4℃过夜吸附至96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，Denmark)的孔。在去除包被溶液后，接着将平板与含1％牛血清白蛋白的PBS(饱和缓冲液)于37℃温育1小时。在去除饱和溶液后将在稀释缓冲液(饱和缓冲液+0.1％ Tween20)中稀释2倍的小鼠血清加入包被平板，并于37℃温育1小时30分钟。用PBS 0.1％Tween20清洗平板4次，并向每孔加入在饱和缓冲液中稀释的缀合生物素的抗小鼠Ig 1/1000(Dako)，于37℃温育1小时30分钟。在清洗步骤后，加入在饱和缓冲液中稀释1/3000的抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶复合物(Dako，UK)，再于37℃温育30分钟。如上清洗平板4次，于室温与邻苯二胺(Sigma MO，USA)0.04％H₂O₂ 0.03％的0.1％Tween20 0.05M柠檬酸盐缓冲溶液pH 4.5温育20分钟。加入H₂SO₄ 2N终止反应，于490/630nm对平板读数。

ELISA滴度计算

使用连接计算机的微量滴定板读板器检测光密度(OD)。数据用SoftMaxPro软件捕获。为了滴定每个样品，每个板上包含标准品。使用4参数逻辑对数函数计算标准曲线。通过标准曲线的内插计算每个测试样品稀释度的抗体浓度。

通过平均落入标准曲线工作范围(20-80％OD)中的所有稀释度的值获得抗体滴度。ELISA滴度以EU/ml表示。

XIII.2.3.B记忆细胞ELISPOT

在第2次免疫后33天或75天，处死小鼠，通过Lymphoprep梯度分离脾细胞。然后将PBMC重悬浮在含添加物(丙酮酸钠1mM、MEM非必需氨基酸、Pen/Strep、谷氨酰胺和β-2巯基乙醇)、5％胎牛血清、50U/ml rhIL-2(eBioscience)和3μg/ml CpG(硫代磷酸化CpGODN-7909-5′-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3′-SEQ IDNO.1)的RPMI 1640培养基(Gibco)中。其它CpG序列也适用于此B记忆细胞评价法。细胞以10⁶个细胞/ml的终浓度、以5ml/平底6孔培养5天。在采用乙醇的活化步骤后，用10μg/ml HPV-16/18 L1或用PBS稀释至1/200的山羊抗小鼠Ig(GAM；Sigma)包被硝酸纤维素板(Multiscreen-IP；Millipore)。在采用完全培养基的饱和步骤后，将100μl的2.10⁶个细胞/ml加入HPV-16/18 L1包被的平板，将100μl 10⁶和5.10⁵个细胞/ml加入GAM板。在37℃温育2小时后，平板于4℃过夜储存。用PBS 0.1％ Tween 20清洗平板4次，将在PBS 1％ BSA 5％FCS(稀释缓冲液)中稀释至1/200的抗小鼠Ig Biot分配入平板，并于37℃温育2小时。在清洗步骤后，加入用稀释缓冲液稀释至1/550的Extravidin HRP(Sigma)，再于37℃温育1小时。如上清洗平板，并于室温与AEC(Sigma)溶液温育10分钟。通过在自来水下轻微淋洗板终止反应。在干燥后，平板用自动化ELISPOT图象分析系统(ZeissKS400)读取。

对HPV-16/18 L1特异性的B记忆细胞的百分率对应于HPV-16/18 L1阳性斑点相比于总IgG斑点的比率。

XIII.3.血清学结果(表53-55)

表53

表54

^*组间的统计学差异

表55-B细胞记忆

XIII.4.结论

在测试的动物模型系统中，AS03+3D-MPL佐剂对抗体生产和B细胞记忆这二者表现出的免疫原性结果等于(或者有时大于)用AS04产生的结果，这取决于评价的HPV类型。

序列表

<110>GlaxoSmithKline Biologicals sa

<120>组合物

<130>VB61319

<160>1

<170>FastSEQ for Windows Vers ion 4.0

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                    24

Claims (36)

1.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：

(a)抗原或抗原性组合物，

(b)水包油乳液佐剂；和

(c)3D MPL，

其中所述水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述可代谢油以所述免疫原性组合物总体积的0.5％至20％的量存在。

3.权利要求1或权利要求2的免疫原性组合物，其中所述可代谢油以所述免疫原性组合物总体积的1.0％至10％的量存在。

4.权利要求1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述可代谢油以所述免疫原性组合物总体积的2.0％至6.0％的量存在。

5.权利要求1-4中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述甾醇是α-生育酚。

6.权利要求1-5中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述甾醇以所述免疫原性组合物总体积的1.0％至20％的量存在。

7.权利要求6中要求保护的免疫原性组合物，其中所述α-生育酚以所述免疫原性组合物总体积的1.0％至5.0％的量存在。

8.权利要求1-7中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述乳化剂为Tween 80。

9.权利要求1-8中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述乳化剂以所述免疫原性组合物的0.01％至5.0％重量(重量/重量)的量存在。

10.权利要求9中要求保护的免疫原性组合物，其中所述乳化剂以所述免疫原性组合物的0.1％至2.0％重量(重量/重量)的量存在。

11.权利要求1-10中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中3D-MPL以每剂组合物10-50μg(重量/体积)的量存在。

12.权利要求11中要求保护的免疫原性组合物，其中3D-MPL以每剂组合物25μg(重量/体积)的量存在。

13.权利要求11-12中要求保护的免疫原性组合物，其中所述组合物剂量为约0.5ml、在0.5-1ml之间或约1ml。

14.含以下物质的组合物在生产权利要求1-14中任一项定义的免疫原性组合物中的用途：

(a)抗原或抗原性组合物

(b)水包油乳液佐剂；和

(c)3D MPL

所述免疫原性组合物用于预防与接触所述抗原或含所述抗原的病原体或其变体相关的感染和/或疾病。

15.一种接种方法，所述方法包括将抗原或抗原性组合物、3DMPL和权利要求1-10中任一项定义的水包油乳液佐剂传递至有需要的个体或群体。

16.权利要求14或15中任一项的用途或方法，所述用途或方法用于诱导抗所述抗原的以下至少一种：i)改善的CD4 T-细胞应答，ii)改善的B细胞记忆应答，iii)改善的抗体应答。

17.权利要求14-16中任一项的用途或方法，所述用途或方法用于免疫应答受损的人类个体或群体。

18.权利要求14-17中任一项的用途或方法，所述用途或方法用于抗病原体引起的感染或疾病的保护作用，所述病原体为由其获得免疫原性组合物中抗原的病原体的变体。

19.权利要求14-18中任一项的用途或方法，所述用途或方法用于抗病原体引起的感染或疾病的保护作用，所述病原体包含的抗原为所述免疫原性组合物中的抗原的变体。

20.权利要求18或19的用途或方法，其中保护作用通过被感染的个体或群体的体温评价。

21.权利要求1-20中任一项的组合物、用途或方法，其中所述免疫原性组合物包含具有CD4 T细胞表位的抗原。

22.权利要求1-21中任一项的组合物、用途或方法，其中所述免疫原性组合物包含具有B细胞表位的抗原。

23.抗原在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用抗原或抗原性组合物或其片段或变体、3D-MPL和水包油乳液佐剂接种的个体。

24.权利要求23的用途，其中所述用于再接种的抗原与用于先前接种的抗原或抗原性组合物共有共同的CD4 T-细胞表位。

25.权利要求23或24的用途，其中所述用于再接种的抗原或抗原性组合物有佐剂。

26.权利要求25的用途，其中所述佐剂是权利要求1-10中任一项定义的水包油乳液。

27.权利要求25或26的用途，其中所述佐剂还包含3D-MPL。

28.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括组合本文定义的水包油乳液、抗原或抗原性组合物以及3D-MPL。

29.权利要求1-14中任一项的免疫原性组合物，所述组合物与药物可接受的载体组合。

30.一种用于药物的组合物，所述组合物包含：

(a)抗原

(b)本文定义的水包油乳液佐剂；和

(c)3D MPL。

31.权利要求1-30中任一项的组合物、用途或方法，其中所述抗原或抗原性制备物选自：流感病毒、HPV。

32.权利要求31的组合物、用途或方法，其中所述流感抗原选自：裂解流感病毒、全流感病毒、亚单位流感病毒、流感病毒颗粒及其抗原性制备物。

33.权利要求31的组合物、用途或方法，其中所述HPV抗原与癌症或生殖器疣相关。

34.权利要求33的组合物、用途或方法，其中所述癌症相关的HPV是HPV 16型和/或HPV 18型。

35.权利要求34的组合物、用途或方法，其中得自引起癌症的HPV类型的一种或多种另外抗原与HPV 16和/或18抗原一起使用，所述抗原选自以下HPV类型：HPV 31、45、33、58和52。

36.权利要求34或35的组合物、用途或方法，其中所述抗原为病毒样颗粒形式。

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