CN111372604A - 皂苷提取 - Google Patents

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CN111372604A CN201880077052.5A CN201880077052A CN111372604A CN 111372604 A CN111372604 A CN 111372604A CN 201880077052 A CN201880077052 A CN 201880077052A CN 111372604 A CN111372604 A CN 111372604A
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J.Y.范登布格
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Abstract

含有至少QS‑21主峰和2018组分的皂树（Quillaja saponaria Molina）的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS‑21主峰的比率≤0.075，获得这样的提取物的方法和相关方面。

Description

皂苷提取
技术领域
本申请大体上涉及皂苷提取物，特别是皂树（Quillaja saponaria Molina）的粗制水性提取物、它们的制备方法和相关方面。
发明背景
在疫苗中包括佐剂以改进体液和细胞免疫反应，特别是在弱免疫原性亚单位疫苗的情况下。类似于被病原体自然感染，佐剂依赖于激活先天免疫系统以促进持久的获得性免疫。
The Adjuvant System 01 (AS01)是含有两种免疫刺激剂3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂质A（3-O-desacyl-4’-monophosphoryl lipid A）（3D-MPL）和QS-21的基于脂质体的佐剂（Garcon和Van Mechelen, 2011；Didierlaurent等人, 2017）。3D-MPL是来自沙门氏菌（Salmonella minnesota）的脂多糖的无毒衍生物（其是TLR4激动剂），QS-21是来自南美树木皂树（Quillaja saponaria Molina）树皮的天然皂苷提取物（Kensil等人, 1991；Ragupathi等人, 2011）。AS01包括在最近开发的疟疾疫苗（RTS,S - Mosquirix®）和带状疱疹疫苗（HZ/su - Shingrix®）和正在开发中的对抗例如人免疫缺陷病毒和结核杆菌之类的病原体的多种候选疫苗中。
AS01注射在动物模型中导致先天免疫的迅速和瞬时激活。嗜中性粒细胞和单核细胞在免疫时被迅速募集到引流淋巴结（dLN）。此外，AS01诱发T细胞活化所需的MHCIIhigh树状细胞（DC）的募集和激活（Didierlaurent A.M.等人, 2014）。也可获得关于AS01的组分的作用机制的一些数据。3D-MPL通过TLR4发出信号，以刺激NF-ĸB转录活性和细胞因子产生，并直接激活人体和小鼠中的抗原呈递细胞（APCs）（De Becker等人, 2000；Ismaili等人,2002；Martin等人, 2003；Mata-Haro等人, 2007）。QS-21促进小鼠的高抗原特异性抗体反应和CD8+ T细胞反应（Kensil和Kammer, 1998；Newman等人, 1992；Soltysik等人, 1995）和人类的抗原特异性抗体反应（Livingston等人, 1994）。由于其物理性质，认为QS-21可能在体内充当危险信号（Lambrecht等人, 2009；Li等人, 2008）。尽管QS-21已显示激活ASC-NLRP3炎性小体和随后的IL-1β/IL-18释放（Marty-Roix, R.等人, 2016），尚未清楚地界定皂苷的佐剂效应中涉及的精确分子途径。
关于被批准为人类药物的产品的任何组分，QS-21的生产要求使用批准的制备方法和小心控制最终组成以确保其符合所需规范。现有方法的修改需要昂贵和耗时的重新验证，仍偏离规范也会导致浪费。仍然需要用于制备QS-21的稳健方法和限定组成的QS-21材料。
发明概述
在第一方面中，本发明提供一种皂树的粗制水性提取物，其含有至少QS-21主峰和2018组分，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率≤0.075。
在第二方面中，本发明提供一种皂树的粗制水性提取物，其含有
QS-21AV1
Figure 518231DEST_PATH_IMAGE001
QS-21AV2
Figure 169792DEST_PATH_IMAGE002
1856组分：
Figure 949529DEST_PATH_IMAGE003
和
2002组分：
Figure 696072DEST_PATH_IMAGE004
（统称为QS-21主峰组分），
和2018组分：
Figure 510444DEST_PATH_IMAGE005
其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率≤0.075。
在第三方面中，本发明提供一种制备皂树的粗制水性提取物的方法，其包括下列步骤：
a) 选择具有适当的2018组分含量的皂树材料，
b) 在其中控制2018组分生成的条件下由所述材料制备水性提取物。
附图简述
图1:粗制水性皂树树皮提取物的HPLC色谱图
图2: 粗制水性皂树树皮提取物的HPLC-UV色谱图
图3:粗制水性皂树树皮提取物的UPLC-UV色谱图
图4 实验条件和观察到的对2018组分/QS-21主峰比率的影响的制表
图5 观察到的由pH和温度条件产生的对2018组分/QS-21主峰比率的影响的曲面图
图6 在pH 3.8下随时间经过温度对2018组分/QS-21主峰比率的影响。
详述
如上文提到，被批准为人类药物的产品的任何组分要求使用批准的制备方法和小心控制最终组成以确保其符合所需规范。偏离规范会导致浪费。但是，安全性和效力研究依赖于测试限定的组成，因此组分规范的调整带来风险。现有方法的修改需要昂贵和耗时的重新验证。
本发明人已经发现，皂树的粗制水性提取物在组成上有差异，特别是就在本文中被称为2018组分的组分而言，并且采用目前批准的制备方法难以分离过量的2018组分。因此，本发明提供实现限定组成的皂树的粗制水性提取物的方法，其适用于在进一步加工后制备一致的纯化提取物。
组成的变化可能归因于源材料中的天然偏差和/或归因于在提取皂苷以获得粗制水性提取物时施加的条件。
本发明人开发出限定组成的皂树的粗制水性提取物，特别是在与主要关注组分的含量相比的2018组分含量方面。所述粗制水性提取物有利地提供用于获得纯化皂苷提取物的合适起始材料，所述纯化皂苷提取物特别适合用作在与抗原一起配制并给药于对象时提供高效免疫反应和可接受的反应原性水平的免疫刺激剂。
Quil A是从南美树木皂树中分离的皂苷制品并最初由Dalsgaard等人在1974年描述为具有佐剂活性（“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung,Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254）。已通过HPLC分离Quil A的纯化级分，其保持佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性（参见例如EP0362279）。各种级分已被发现具有佐剂活性，如QS-7、QS-17、QS-18和QS-21，但它们的毒性明显不同。
本文所用的术语‘皂苷提取物’是指皂树的提取物。
本文所用的术语‘三萜苷（triterpenoid glycosides）’是指具有通过经糖苷键连接的糖衍生的三萜核的一种或多种实体。
术语‘2018组分’是指在图3中确定为‘2018’的三萜苷。合适地，2018组分在本文所述的UPLC-UV方法中可用大约5.8 min的保留时间和具有2017.9的单同位素分子量的峰的主要组分来确定。主要2018组分已通过MS/MS确定为具有以下推定结构
Figure 332907DEST_PATH_IMAGE006
。
术语‘1988组分’是指在图3中确定为QS-21主峰的一部分并具有1987.9的单同位素分子量的三萜苷。1988组分可由QS-21A V1
Figure 599940DEST_PATH_IMAGE007
和QS-21A V2组成
Figure 985791DEST_PATH_IMAGE008
。
术语‘1856组分’是指在图3中确定为QS-21主峰的一部分并具有1855.9的单同位素分子量的三萜苷。1856组分可由下式组成：
Figure 654669DEST_PATH_IMAGE009
。
术语‘2002组分’是指在图3中确定为QS-21主峰的一部分并具有2001.9的单同位素分子量的三萜苷。2002组分已通过MS/MS确定为具有以下推定结构：
Figure 648033DEST_PATH_IMAGE010
。
MS/MS技术在区分某些支化、立体化学和异构糖物类（例如芹菜糖和木糖）方面的限制意味着一些结构是推定的并基于假设的保守核（conserved core）。在推定结构不正确的情况下，推定结构因此应该被认为是指以其它方式确定的该实体的实际结构。
通过负离子电喷雾质谱法测定单同位素分子量。
术语‘QS-21主峰’是指在图2或图3中分别被确定为‘QS-21’和‘QS-21主峰（QS-21Main）’的三萜苷。合适地，QS-21具有1855.9、1987.9和2001.9 m/z的主要分子量组分。QS-21主峰可主要由下列组分组成：
QS-21A V1：
Figure 402363DEST_PATH_IMAGE011
QS-21A V2：
Figure 139374DEST_PATH_IMAGE012
1856组分：
Figure 600443DEST_PATH_IMAGE013
和
2002组分：
Figure 30287DEST_PATH_IMAGE014
。
术语‘前峰（Preceding peak）’是指在本文所述的HPLC-UV法中紧接在QS-21主峰之前的峰（见图2）。
术语‘干燥’是指已除去基本所有溶剂。干燥提取物通常含有少于5%溶剂w/w（例如少于5%水w/w）。合适地，干燥提取物含有100 ppm或更少的乙腈(w/w)。
通过水性提取获得皂树的粗制水性提取物（但不需要为水性形式，例如其可随后干燥，经过溶剂交换或重构到不同的溶剂中）。
在第一方面中，本发明提供一种皂树的粗制水性提取物，其含有至少QS-21主峰和2018组分，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率≤ 0.075。合适地，如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率≤ 0.064。理想地，如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率为至少0.005，如至少0.01。
合适地，前峰/QS-21主峰比率为0.45或更低，特别是0.4或更低（如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定）。前峰/QS-21主峰比率可为0.05或更高，特别是0.1或更高（如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定）。
通常，该粗制提取物是皂树的树皮提取物。相应地，该粗制提取物合适地获自皂树树皮。
合适地，皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少1 g/L，例如至少2 g/L，尤其是至少2.5 g/L，特别是至少2.8 g/L（例如如通过相对于已知浓度的对照样品的UV吸光度测定）。
在第二方面中，本发明提供一种皂树的粗制水性提取物，其含有：
QS-21AV1
Figure 271913DEST_PATH_IMAGE015
QS-21AV2
Figure 547036DEST_PATH_IMAGE016
1856组分：
Figure 190507DEST_PATH_IMAGE017
和
2002组分：
Figure 712624DEST_PATH_IMAGE018
（统称为QS-21主峰组分），
和2018组分：
Figure 441546DEST_PATH_IMAGE019
其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率≤ 0.075。
合适地，如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率≤0.064。理想地，如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率为至少0.005，例如至少0.01。
合适地，前峰/QS-21主峰比率为0.45或更低，特别是0.4或更低（如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定）。前峰/QS-21主峰比率可为0.05或更高，特别是0.1或更高（如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定）。
通常，该粗制提取物是皂树的树皮提取物。相应地，本发明的粗制水性提取物合适地获自皂树树皮。
合适地，皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少1 g/L，例如至少2 g/L，尤其是至少2.5 g/L，特别是至少2.8 g/L（例如如通过相对于已知浓度的对照样品的UV吸光度测定）。
皂苷提取
在第三方面中，提供了一种制备皂树的粗制水性提取物的方法，其包括下列步骤：
a) 选择具有适当的2018组分含量的皂树材料，
b) 在其中控制2018组分生成的条件下由所述材料制备水性提取物。
合适地，皂树材料是皂树树皮。
通常，在提取前，将皂树植物材料干燥和研磨。收获的植物材料可自然晾干和/或部分或完全通过施热干燥。合适地，在施热时，干燥温度在30-100℃的范围内，例如大约80℃，并可能持续几小时至8小时。一旦干燥，将所述植物材料研磨。
可采用任何水性提取法以获得根据本发明的皂树的粗制水性皂苷提取物。用于提取的溶剂基本是水，但可包括少量其它材料。该溶剂通常基本由水组成，该溶剂理想地是水。提取可在相继步骤中进行并在50℃至80℃的温度进行并可持续几小时至20小时，例如2至20小时。皂苷粗制提取物通常包含皂苷物类和非皂苷化合物如糖、盐、多酚（单宁）、悬浮固体和其它较低分子量化合物的混合物。在通常通过一系列不同的色谱纯化步骤分离不同组分以获得具有所需皂苷分布（saponin profile）的纯化皂苷提取物之前，可对皂苷粗制提取物施以澄清化以除去由非皂苷化合物构成的杂质。合适地，可将聚合物吸附剂，例如已知络合多酚的交联聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone，PVPP)，和/或粘土衍生材料，例如膨润土，添加到皂苷粗制提取物中。皂苷粗制提取物可另外例如通过纳滤或超滤浓缩。为了获得具有更长货架期的皂苷粗制提取物，所述提取物也可使用高温，如40℃至95℃，合适地60至90℃，尤其是大约86℃来巴氏灭菌。巴氏灭菌合适地进行10分钟至1小时，更合适地40至50分钟。可以使用抗微生物剂。抗微生物剂的一个实例是抗菌剂，例如苯甲酸钠。也可使用防腐剂。合适地，粗制水性提取物是基本无菌的，更合适地，是无菌的。
合适地，选择具有适当的2018组分含量的皂树材料的步骤a)包括测试皂树材料的2018组分含量和/或测定在从皂树水性提取的过程中获得的2018组分含量。通常，测定在从皂树水性提取的过程中获得的2018组分含量的步骤包括进行小规模提取和测定所得提取物中的2018组分含量。合适地对小于500 g，例如小于50 g的皂树材料进行小规模提取。
合适地对至少25 kg，例如50至500 kg，例如100至400 kg，特别是200至300 kg的皂树材料进行步骤b)。
在开发适用于制备根据本发明的皂树的粗制水性提取物的方法的同时，本发明人观察到，应该密切监测和控制与高温结合（例如在巴氏灭菌时）的该方法中的pH。特别地，本发明人观察到，低pH与高温的结合可影响皂苷的稳定性并因此影响加工的提取物的皂苷分布，而高温本身仅引发有限的影响。因此，根据所需的皂苷分布，在制备皂苷粗制提取物时需要达到pH和温度之间的平衡。特别地，本发明人观察到，当高温与低pH结合时，2018组分/QS-21主峰的比率提高。因此，当与低pH（例如在使用防腐剂如苯甲酸钠时）结合使用高温时，例如在巴氏灭菌过程中，应该尽可能最大程度地限制在高温下花费的时间。例如，为了迅速达到巴氏灭菌温度，可以使用热交换器和/或例如通过浸在冷水中而迅速冷却巴氏灭菌的皂树的粗制水性提取物。合适地，该粗制水性提取物具有3至4.5，更合适地3.6至4.0的pH。
粗制水性提取物测试
在本发明的第四方面中，提供一种测定皂树的粗制水性提取物中的2018组分/QS-21主峰比率的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 通过在214 nm的UPLC-UV吸光度测定皂树的粗制水性提取物中的2018组分含量；
(ii) 通过在214 nm的UPLC-UV吸光度测定皂树的粗制水性提取物中的QS-21主峰含量；和
(iii) 比较2018组分含量与QS-21主峰含量以测定2018组分/QS-21主峰比率。
在本发明的第五方面中，提供了一种识别用于制备纯化皂苷提取物的皂树的粗制水性提取物的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 通过在214 nm的UPLC-UV吸光度测定2018/QS-21主峰比率；和
(ii) 选择具有≤0.075的2018组分/QS-21主峰比率的粗制水性提取物。
在一个实施方案中，在步骤(ii)中选择的粗制水性提取物具有≤0.064的2018组分/QS-21主峰比率。
参考下列非限制性实施例进一步描述本发明：
实施例1：分析方法
HPLC-UV
设备
Waters Alliance 2690/2695分离模块
Waters 2487 UV检测器或2996 PDA检测器
Vydac Protein C4 4.6 x 250mm 5um柱
流动相A (MPA) – 含0.15%三氟乙酸的水/乙腈(70:30 v/v)
流动相B (MPB) – 含0.15%三氟乙酸的乙腈。
线性梯度条件:
时间 流速 (ml/min) %MPA %MPB
0 1 100 0
30 1 78.6 21.4
33 1 14.3 85.7
注入10ul样品。UV检测设定在214 nM。
使用空白注射作为参考，色谱图中的峰的积分提供总吸光度。将关注的峰（例如QS-21主峰）与总吸光度比较以测定以百分比表示的峰含量。
UPLC-UV
设备
Waters Acquity UPLC
Waters Acquity Tunable UV检测器
Waters Acquity BEH C18 2.1x100mm 1.7um柱
流动相A (MPA) – 含0.025%乙酸的水/乙腈(70:30 v/v)
流动相B (MPB) – 含0.025%三氟乙酸的水/乙腈(30:70 v/v)。
线性梯度条件:
时间 流速(ml/min) %MPA %MPB
0 0.5 88 12
10.2 0.5 65.7 34.3
11.2 0.5 10 90
13.2 0.5 10 90
柱温为28℃。注入10 ul样品。UV检测设定为214 nM。
使用空白注射作为参考，色谱图中的峰的积分提供总吸光度。将关注的峰（例如QS-21主峰）与总吸光度比较以测定以百分比表示的峰含量。
实施例2: 皂树的粗制水性提取物
通过使用C4柱和梯度洗脱的反相HPLC分离粗制水性树皮提取物：流动相A - 水/乙腈，7/3 v/v，含0.15%三氟乙酸；流动相B - 乙腈，含0.15%三氟乙酸。UV检测在214 nm。
粗制水性树皮提取物样品视需要用纯净水稀释。加入PVPP (60 mg/mL)，将混合物搅拌大约30分钟，然后离心以将PVPP树脂与上清液分离。
然后分析上清液以提供HPLC-UV色谱图。
图1提供HPLC-UV色谱图的代表性实例。指示与QS-21级分对应的峰。
实施例3: 皂树树木的水性皂苷粗制树皮提取物的UPLC-UV
通过实施例1中描述的HPLC-UV和UPLC-UV方法分析皂树的粗制水性树皮提取物的样品。
图2提供HPLC-UV的结果，且图3提供UPLC-UV的结果。
通过测定特定组分（QS-21主峰、2018组分或前峰）的峰面积，可以计算粗制提取物中的组分比率。
实施例4: pH和温度对2018组分/QS-21比率的影响
根据本文中描述的方法制备皂树的粗制水性提取物的多个样品。每次在巴氏灭菌阶段的过程中改变温度、pH或苯甲酸钠的量并在3小时后测量2018组分/QS-21主峰比率的变化。结果提供在图4中。pH和温度变化的影响以图形展示在图5中。在恒定pH 3.8下不同温度随时间经过的影响显示在图6中。
发现温度与2018组分/QS-21主峰比率成正比，除了在等于或低于40℃在测试的这3小时范围内，在此无论pH或苯甲酸钠条件如何，该比率看起来不变。发现pH与2018组分/QS-21主峰比率成反比，尤其是在较低pH下。
苯甲酸钠在升高的温度下对2018组分/QS-21主峰比率只有轻微影响。
概括而言，发现改变pH和温度对2018组分/QS-21主峰比率具有实质影响，较高温度和较低pH会提高该比率。
因此，为了获得具有适当的2018组分含量的皂树的粗制水性提取物，必须小心选择皂树原材料和以限制过量2018组分生成的方式加工。
实施例5: 具有限定2018组分组成的皂树的粗制水性提取物的大规模生产
树皮选择
从一系列批次的皂树树皮材料中获取大约37g的样品批次。分别对样品施以在大约65℃的水性提取大约5小时。提取物用PVPP处理、过滤并浓缩。在加入苯甲酸钠（0.1%）之前将pH调节到3.9并在86℃进行巴氏灭菌45分钟。
然后测定2018组分（使用UPLC-UV）和前峰含量（使用HPLC-UV）。基于结果，选择用于完整规模提取的皂树树皮材料的批次。
尽管个别批次可能不符合目标规范，为了使收率最大化，可以将目标规范之外的个别批次与其它批次（例如高含量与低含量）合并以实现在目标规范内的总体平均值。
主提取
对根据2018组分含量选择的大约280 kg的皂树树皮材料施以在70℃的水性提取至少2小时。在提取后，将pH调节到3.8。提取物用PVPP处理、过滤并浓缩。如果必要，在加入苯甲酸钠（0.1%）之前再次验证和调节pH并在86℃进行巴氏灭菌45分钟。将巴氏灭菌的材料迅速冷却以使在高温下的时间最小化，由此提供皂树的粗制水性提取物的溶液。
通过HPLC-UV（前峰/QS21主峰比率）和UPLC-UV（2018组分/QS21主峰比率）分析粗制水性提取物。
树皮选择和pH和温度暴露的控制确保粗制树皮提取物一致地符合所需规范。在缺乏树皮选择和pH和温度暴露的控制的情况下，粗制水性提取物经常不符合规范。
如实施例5中描述的方法的使用可一致地提供具有限定的2018组分/QS-21主峰比率（如始终≤ 0.075）并表现出与图3中所示的色谱图相当的色谱分布（chromatographicprofile）的皂树的粗制水性树皮提取物。
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Claims (61)

1.皂树的粗制水性提取物，其含有至少QS-21主峰和2018组分，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率≤0.075。
2.权利要求1的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率≤0.064。
3.权利要求1或2的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率为至少0.005。
4.权利要求3的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰的比率为至少0.01。
5.权利要求1至4任一项的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.45或更低。
6.权利要求5的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.4或更低。
7.权利要求1至6任一项的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.05或更高。
8.权利要求7的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.1或更高。
9.权利要求1至8任一项的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少1 g/L。
10.权利要求9的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少2 g/L。
11.权利要求10的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少2.5 g/L。
12.权利要求11的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少2.8 g/L。
13.皂树的粗制水性提取物，其含有：
QS-21AV1
Figure 41494DEST_PATH_IMAGE001
QS-21AV2
Figure 726422DEST_PATH_IMAGE002
1856组分：
Figure 498069DEST_PATH_IMAGE003
和
2002组分：
Figure 448707DEST_PATH_IMAGE004
（统称为QS-21主峰组分），
和2018组分：
Figure 331213DEST_PATH_IMAGE005
其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率≤0.075。
14.权利要求13的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率≤0.064。
15.权利要求13或14的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率为至少0.005。
16.权利要求15的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的UV吸光度测得的2018组分/QS-21主峰组分的比率为至少0.01。
17.权利要求13至16任一项的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.45或更低。
18.权利要求17的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.4或更低。
19.权利要求13至18任一项的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.05或更高。
20.权利要求19的粗制水性提取物，其中如通过在214 nm的HPLC-UV吸光度测定的前峰/QS-21主峰比率为0.1或更高。
21.权利要求13至20任一项的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少1 g/L。
22.权利要求21的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少2 g/L。
23.权利要求22的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少2.5 g/L。
24.权利要求23的粗制水性提取物，其中皂树的粗制水性提取物的水溶液中的QS-21主峰含量为至少2.8 g/L。
25.权利要求1至24任一项的粗制水性提取物，其获自皂树树皮。
26.权利要求1至25任一项的粗制水性提取物，其中所述粗制水性提取物是巴氏灭菌的。
27.权利要求1至26任一项的粗制水性提取物，其中所述粗制水性提取物是基本无菌的，特别是无菌的。
28.权利要求1至27任一项的粗制水性提取物，其中所述粗制水性提取物包含抗微生物剂，例如抗菌剂。
29.权利要求28的粗制水性提取物，其中所述抗微生物剂是苯甲酸钠。
30.权利要求1至29任一项的粗制水性提取物，其中所述粗制水性提取物具有3.0至4.5的pH。
31.权利要求30的粗制水性提取物，其中所述粗制水性提取物具有3.6至4.0的pH。
32.制备皂树的粗制水性提取物的方法，其包括下列步骤：
a) 选择具有适当的2018组分含量的皂树材料，
b) 在其中控制2018组分生成的条件下由所述材料制备水性提取物。
33.权利要求32的方法，其中选择具有适当的2018组分含量的皂树材料的步骤a)包括测试皂树材料的2018组分含量。
34.权利要求32的方法，其中选择具有适当的2018组分含量的皂树材料的步骤a)包括测定在从皂树水性提取的过程中获得的2018组分含量。
35.权利要求34的方法，其中测定在从皂树水性提取的过程中获得的2018组分含量的步骤a)包括进行小规模提取和测定所得提取物中的2018组分含量。
36.权利要求35的方法，其中对小于500 g，例如小于50 g的皂树材料进行小规模提取。
37.权利要求32至36任一项的方法，其中对至少25 kg，例如50至500 kg的皂树材料进行步骤b)。
38.权利要求37的方法，其中对100至400 kg的皂树材料进行步骤b)。
39.权利要求38的方法，其中对200至300 kg的皂树材料进行步骤b)。
40.权利要求32至39任一项的方法，其中用交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)处理皂树的粗制水性提取物。
41.权利要求40的方法，其中在PVPP处理过程中使皂树的粗制水性提取物的pH保持在一定的pH范围内。
42.权利要求32至41任一项的方法，其中所述方法包括将皂树的粗制水性提取物巴氏灭菌的进一步的步骤c)。
43.权利要求42的方法，其中在40至95℃进行巴氏灭菌。
44.权利要求43的方法，其中在60至90℃进行巴氏灭菌。
45.权利要求44的方法，其中在大约86℃进行巴氏灭菌。
46.权利要求42至45任一项的方法，其中在巴氏灭菌过程中使皂树的粗制水性提取物的pH保持在一定的pH范围内。
47.根据权利要求42至46任一项的方法，其中在巴氏灭菌前将抗微生物剂例如抗菌剂添加到皂树的粗制水性提取物中。
48.权利要求42至47任一项的方法，其中所述巴氏灭菌进行10分钟至1小时。
49.权利要求48的方法，其中所述巴氏灭菌进行40至50分钟。
50.权利要求42至49任一项的方法，其中在巴氏灭菌后主动冷却粗制提取物。
51.权利要求42至50任一项的方法，其中在巴氏灭菌后过滤皂树的粗制水性提取物。
52.权利要求51的方法，其中在过滤过程中使皂树的粗制水性提取物的pH保持在一定的pH范围内。
53.权利要求42至52任一项的方法，其中在巴氏灭菌后将皂树的粗制水性提取物浓缩。
54.权利要求53的方法，其中在浓缩过程中使皂树的粗制水性提取物的pH保持在一定的pH范围内。
55.权利要求41至54任一项的方法，其中所述pH范围是3.0至4.5。
56.权利要求55的方法，其中所述pH范围是3.6至4.0。
57.权利要求32至56任一项的方法，其中所述皂树材料是皂树树皮。
58.根据权利要求32至57任一项的方法，其用于制备权利要求1至31任一项的粗制水性提取物。
59.测定皂树的粗制水性提取物中的2018组分/QS-21主峰比率的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 通过在214 nm的UPLC-UV吸光度测定皂树的粗制水性提取物中的2018组分含量；
(ii) 通过在214 nm的UPLC-UV吸光度测定皂树的粗制水性提取物中的QS-21主峰含量；和
(iii) 比较2018组分含量与QS-21主峰含量以测定2018组分/QS-21主峰比率。
60.识别用于制备纯化皂苷提取物的皂树的粗制水性提取物的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 通过在214 nm的UPLC-UV吸光度测定2018组分/QS-21主峰比率；和
(ii) 选择具有≤0.075的2018组分/QS-21主峰比率的粗制水性提取物。
61.根据权利要求60的方法，其中在步骤(ii)中选择的粗制水性提取物具有≤0.064的2018组分/QS-21主峰比率。
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