CN111602172B - 利用散射校正进行颜色解混 - Google Patents

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Abstract

本公开文本提供了用于通过自动选择颜色参考向量来分离图像中的颜色的系统和方法，所述系统和方法考虑了光散射的影响并且主要考虑了所述光散射在不同染色剂浓度下改变RGB通道信号在检测到的光中的比例的方式。

Description

利用散射校正进行颜色解混
背景技术
在对生物样品(诸如组织切片、血液、细胞培养物等)进行分析时，将生物样品用一种或多种荧光团或色原进行染色并且然后进行扫描或照相以供分析。观察依据扫描生成的信号实现了各种过程，包括对疾病的诊断、对治疗反应的评估和对抗击疾病的新药物的研发。测定物包括来自人类受试者的生物样品(诸如组织切片)，所述生物样品用含有与抗体缀合的荧光团或色原的染色剂进行处理，所述抗体与样品中的蛋白质、蛋白质片段或其他靶标结合。在扫描测定物后，得出包括色彩通道的图像数据的多个通道，其中，每个观察到的通道包括多个信号的混合。
多重免疫组织化学(IHC)染色是一种用于检测单个组织切片中多个生物标志物的技术并且由于其显著效率和其所包含的丰富诊断信息而广受欢迎。与多个载玻片中的单个生物标志物标记相反，多重IHC载玻片具有在一个组织切片中同时识别多个生物标记物的潜在优势。因此，它常常用于同时评估癌组织的多个特点。
通常使用颜色分离(或光谱解混)来确定特定染色剂在测定物的观察到的一个或多个通道中的浓度。这也可以称为颜色去卷积。解混过程提取染色剂特定通道，以使用针对标准类型的组织和染色剂组合公知的颜色参考向量或参考光谱确定各个染色剂的局部浓度。所扫描图像的每个像素由图像值的向量或颜色向量表示，并且每个染色剂对应于颜色参考向量。染色剂的局部浓度由颜色参考向量的比例因子表示。因此，包含不同浓度的多个共同定位的染色剂的像素的颜色向量是所有现有染色剂的参考光谱的线性组合。荧光成像颜色通道通常直接提供图像向量和参考光谱。在明场(透射)成像中，将被染色的组织所发出的光强度转化为光学密度空间，其中不同染色剂的混合由有贡献的参考光谱的线性加权组合表示。
发明内容
本公开文本涉及用于解混生物样本的所获取图像的数字病理学系统和方法。本文公开的系统和方法考虑了光散射的影响，并且具体地说，考虑了在不同染色剂浓度下，光散射改变RGB通道信号在检测到的光中的比例的方式。
如本文所指出的，组织化学染色用于增强细胞和组织样本的视觉对比并突出细胞内存在的特异性抗原。这通常是通过将吸收染料嵌入样本材料中来实现的。为了突出样本中的多个特异性细胞和组织结构，部署了具有不同光谱吸收特性的多个染色剂(即多重)。不幸的是，一些最常用的染料(诸如3,3'-二氨基联苯胺(DAB))被广泛吸收。这在试图解释通过各个染色剂的对比提供的诊断信息时提出了挑战。因此，非常期望从多重样本中重构单一染色剂对比。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下，据信，比尔-朗伯方程(Beer-Lambertequation)假定染色剂浓度较小并且吸收分子之间没有相互作用。换句话说，假设了RGB通道中的每个通道的吸收因子是影响消光的唯一因素，所述唯一因素与染色剂浓度无关。但是，由于DAB在样本加工期间有沉淀物形成反应，因此该假设不那么适用于DAB。除吸收外，散射还有助于消光过程，所述消光过程产生了光学密度值与染色剂量之间的非线性关系。鉴于此，据信，DAB在不同浓度下呈现出不同的色度性质。
因此，申请人开发了一种选择浓度依赖性染色剂的最佳颜色参考向量以用于解混所获取的多光谱图像数据的方法，其中，浓度依赖性染色剂的最佳颜色参考向量选自浓度依赖性染色剂的一组颜色参考向量，一组颜色参考向量中的每个颜色参考向量描述或表征不同浓度水平(例如1X、2X、4X、8X等)的浓度依赖性染色剂。在这方面，申请人开发了一种自动选择用于解混的颜色系统的方法，所述方法考虑了浓度依赖性染色剂在生物样本中的浓度对其对检测到的光中RGB通道中的每个通道的贡献的影响。这样，本文所描述的系统和方法允许选择最佳地表征生物样本中浓度依赖性染色剂的浓度水平的颜色参考向量。申请人已经表明，与不考虑生物样本中染色剂的浓度的其他解混方法相比，利用当前描述的系统和方法进行解混提供了更准确的浓度依赖性染色剂强度。
因此，本公开文本的一方面是一种将生物样品的图像解混的方法，其包括：(a)获取用至少第一染色剂和第二染色剂染色的所述生物样品的图像，其中所述第一染色剂和所述第二染色剂中的至少一个是浓度依赖性染色剂；(b)从获取的图像中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值；(c)获得所述第一染色剂和所述第二染色剂中的每一个的一系列颜色参考向量，其中，对于任何浓度依赖性染色剂，获得多个浓度参考向量，所述一组所述多个浓度依赖性染色剂颜色参考向量中的各个浓度依赖性染色剂颜色参考向量表征不同浓度水平的所述浓度依赖性染色剂；(d)从第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，其中，每个候选颜色系统包括第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量，并且其中，每个候选颜色系统包括来自一系列获得的颜色参考向量的不同配对的第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量；(e)从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及(f)使用选择的最佳颜色系统将所述获取的图像解混。在一些实施方案中，每个候选颜色系统是不同的，其中，每个候选颜色系统包括浓度依赖性染色剂的不同颜色参考向量。
在一些实施方案中，所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂(例如，DAB)，并且所述第二染色剂是非浓度依赖性染色剂(例如，苏木精)。在一些实施方案中，每个候选颜色系统包括浓度依赖性染色剂的预期颜色参考向量和非浓度依赖性染色剂的颜色参考向量。在一些实施方案中，所述第一染色剂是DAB。在一些实施方案中，所述第一染色剂是DAB，并且所述第二染色剂是苏木精。
在一些实施方案中，所述生物样本被两种染色剂染色。在一些实施方案中，所述生物样本被多于两种染色剂染色，并且所述获取的图像(或接收的图像数据)表示整个生物样本的一部分或所述生物样本的较大图像的一部分，所述获取的图像仅具有两种染色剂。
本公开文本的另一方面是一种将生物样品的图像解混的方法，其包括：获取用第一染色剂和第二染色剂染色的所述生物样品的图像，其中，至少所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂；从获取的图像中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值；获得多个预期第一染色剂颜色参考向量，所述多个预期第一染色剂颜色参考向量中的每个预期第一染色剂颜色参考向量表征不同浓度的所述第一染色剂；获得至少一个第二染色剂颜色参考向量；从所述第一染色剂颜色参考向量和所述第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括来自所述多个预期第一染色剂颜色参考向量的所述预期第一染色剂颜色参考向量中的一个和所述至少一个(1)第二染色剂颜色参考向量；从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及使用选择的最佳颜色系统将所述获取的图像解混。
在一些实施方案中，所述重构误差是通过计算(a)RGB颜色空间中的所述通道中的第一通道的导出的总光学密度值与(b)所述第一通道(例如，蓝色通道)的重构的总光学密度之间的绝对差来确定的(例如，参见本文的方程(4))。在一些实施方案中，所述第一通道的所述重构的总光学密度是通过对以下项进行求和来计算的：(i)所述生物样本中存在的所述第二染色剂的导出量与所述一系列候选颜色空间中的所述候选颜色系统中的一个的所述第一通道的光学密度值的乘积；以及(ii)所述生物样本中存在的所述第一染色剂的导出量与同一候选颜色系统中第一染色剂的所述第一通道的光学密度值的乘积(例如，参见本文的方程(3))。在一些实施方案中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是通过将所述RBG颜色空间中的第二通道和第三通道(例如，绿色通道和红色通道)的导出的总光学密度的向量乘以候选重构矩阵的倒数来计算的，所述候选重构矩阵包括：(i)具有与所述候选颜色系统的所述第一染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第一光学密度向量；以及(ii)具有与所述候选颜色系统的所述第二染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第二光学密度向量(例如，参见本文的方程(2))。
在一些实施方案中，所述第一染色剂是DAB。在一些实施方案中，所述第二染色剂是在标准免疫组织化学实践中使用的任何染料。在一些实施方案中，所述第二染色剂是在标准免疫组织化学实践中使用的任何非浓度依赖性染料。在一些实施方案中，所述第二染色剂选自苏木精、曙红、固红或甲基绿。在一些实施方案中，所述第一染色剂和所述第二染色剂均为浓度依赖性染色剂，并且所述至少一个第二染色剂颜色参考向量是第二浓度依赖性染色剂的一组预期颜色参考向量。在一些实施方案中，RGB颜色空间中的所述通道中的所述第一通道是蓝色通道或绿色通道。在一些实施方案中，所述生物样本被多于三种染色剂染色，并且其中，所述获取的图像是从更大的图像导出的感兴趣区域，所述感兴趣区域仅包括所述第一染色剂和所述第二染色剂。在一些实施方案中，所述生物样本被多于两种染色剂染色，并且其中，所述获取的图像是较大图像的一部分，所述图像部分包括与仅两种共同定位的染色剂相对应的信号，所述两种共同定位的染色剂中的至少一种是浓度依赖性染色剂。
本公开文本的另一方面是一种将生物样品的图像解混的方法，其包括：获取用第一染色剂和第二染色剂染色的所述生物样品的图像，其中，所述第一染色剂和所述第二染色剂均为浓度依赖性染色剂(例如，DAB)；从获取的图像中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值；从光谱参考数据库中获得多个预期第一染色剂颜色参考向量，所述多个预期第一染色剂颜色参考向量中的每个预期第一染色剂颜色参考向量表征不同浓度的所述第一染色剂；从所述光谱参考数据库中获得多个预期第二染色剂颜色参考向量，所述多个预期第二染色剂颜色参考向量中的每个预期第二染色剂颜色参考向量标准不同浓度的所述第二染色剂；从所述第一染色剂颜色参考向量和所述第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括来自所述多个预期第一染色剂颜色参考向量的所述预期第一染色剂颜色参考向量中的一个和来自所述多个第二染色剂颜色参考向量的所述预期第二染色剂颜色参考向量中的一个；从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及使用选择的最佳颜色系统将所述获取的图像解混。
本公开文本的另一方面是一种将生物样品的图像解混的方法，其包括：获取用DAB和苏木精(HEM)染色的所述生物样品的图像；从获取的图像中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值；获得多个预期DAB颜色参考向量，所述多个预期DAB颜色参考向量中的每个预期DAB颜色参考向量表征不同浓度的DAB；获得HEM颜色参考向量；从所述DAB颜色参考向量和所述HEM颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括来自所述多个预期DAB颜色参考向量的所述预期DAB颜色参考向量中的一个和所述HEM颜色参考向量；从所述一系列候选颜色系统中选择最佳地表示生物样本中的真实DAB浓度水平的最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及使用选择的最佳颜色系统将所述获取的图像解混。
本公开文本的另一方面是一种用于将被至少两种染色剂染色的生物样品的图像解混的成像系统，所述成像系统包括：(i)图像获取装置；(ii)一个或多个处理器；以及(iii)耦合到处理器的存储器，所述存储器用于存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令在由所述一个或多个处理器执行时使所述一个或多个处理器执行包括以下项的操作：获取所述生物样本的具有与第一染色剂和第二染色剂相对应的信号的图像，其中至少所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂；来自获取的图像中的像素强度值的RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值；从光谱参考数据库中获得一组预期第一染色剂颜色参考向量，所述一组预期第一染色剂颜色参考向量中的每个颜色参考向量表征不同浓度下的所述第一染色剂；从所述光谱参考数据库中获得至少一个第二染色剂颜色参考向量；从所述第一染色剂颜色参考向量和所述第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括来自所述多个预期第一染色剂颜色参考向量的所述预期第一染色剂颜色参考向量中的一个和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量；来自所述一系列候选颜色系统的最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及使用选择的最佳颜色系统将所述获取的图像中的所述信号解混。在一些实施方案中，所述成像设备是多光谱成像设备。在一些实施方案中，所述第一染色剂是DAB。在一些实施方案中，所述第二染色剂是苏木精。在一些实施方案中，所述第一染色剂是DAB，并且所述第二染色剂是苏木精。
在一些实施方案中，所述重构误差是通过计算(a)RGB颜色空间中的所述通道中的第一通道的导出的总光学密度值与(b)所述第一通道的重构的总光学密度之间的绝对差来确定的。在一些实施方案中，所述第一通道的所述重构的总光学密度是通过对以下项进行求和来计算的：(i)所述生物样本中存在的所述第二染色剂的导出量与所述一系列候选颜色空间中的候选颜色系统中的一个候选颜色系统的第一通道光学密度值的乘积；以及(ii)所述生物样本中存在的所述第一染色剂的导出量与第一染色剂在同一候选颜色系统中的第一通道光学密度值的乘积。在一些实施方案中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是通过将所述RBG颜色空间中的第二通道和第三通道的导出的总光学密度的向量乘以候选重构矩阵的倒数来计算的，所述候选重构矩阵包括：(i)具有与所述候选颜色系统的所述第一染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第一光学密度向量；以及(ii)具有与所述候选颜色系统的所述第二染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第二光学密度向量。
在一些实施方案中，所述获得所述一组预期第一染色剂颜色参考向量包括通过分析来自一系列对照载玻片的图像数据来导出所述第一染色剂的多个颜色参考向量，其中，每个对照载玻片具有不同染色剂浓度。
本公开文本的另一方面是一种用于存储计算机可执行指令的非暂态计算机可读介质，所述计算机可执行指令由处理器执行以执行包括以下项的操作：从具有第一染色剂和第二染色剂的图像或图像的一部分中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光写密度值，其中，所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂并且所述第二染色剂是非浓度依赖性染色剂；获得多个预期第一染色剂颜色参考向量，所述多个预期第一染色剂颜色参考向量中的每个预期第一染色剂颜色参考向量表征不同浓度的所述第一染色剂；获得第二染色剂颜色参考向量；从所述第一染色剂颜色参考向量和所述第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括来自所述多个预期第一染色剂颜色参考向量的所述预期第一染色剂颜色参考向量中的一个和所述第二染色剂颜色参考向量；从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及使用选择的最佳颜色系统将所述获取的图像解混。
在一些实施方案中，所述重构误差是通过计算(a)RGB颜色空间中的所述通道中的第一通道(例如，蓝色通道)的导出的总光学密度值与(b)所述第一通道(例如，所述蓝色通道)的重构的总光学密度之间的绝对差来确定的。在一些实施方案中，所述第一通道(例如，所述蓝色通道)的所述重构的总光学密度是通过对以下项进行求和来计算的：(i)所述生物样本中存在的所述第二染色剂的导出量与所述一系列候选颜色空间中的候选颜色系统中的一个候选颜色系统的第一通道光学密度值(例如，蓝色通道光学密度值)的乘积；以及(ii)所述生物样本中存在的所述第一染色剂的导出量与第一染色剂在同一候选颜色系统中的第一通道光学密度值(例如，蓝色通道光学密度值)的乘积。在一些实施方案中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是通过将所述RBG颜色空间中的第二通道和第三通道的导出的总光学密度的向量乘以候选重构矩阵的倒数来计算的，所述候选重构矩阵包括：(i)具有与所述候选颜色系统的所述第一染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第一光学密度向量；以及(ii)具有与所述候选颜色系统的所述第二染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第二光学密度向量。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局提供。
为了大致理解本公开文本的特征，参考了附图。在附图中，始终使用相同的附图标记来标识相同的要素。
图1展示了包括图像获取装置和计算机系统的代表性数字病理学系统。
图2阐述了可以在数字病理学系统中或数字病理学工作流内使用的各种模块。
图3提供了对用于将图像解混的步骤的概述。
图4提供了对用于分离图像的步骤的概述。
图5阐述了展示选择输入图像内的感兴趣区域的步骤的流程图。
图6A提供了展示选择用于解混的最佳颜色系统的步骤的流程图。
图6B提供了展示导出每个候选颜色系统的重构误差的步骤的流程图。
图7展示了在各个浓度下对DAB的消光。
图8展示了使用不同浓度的DAB制备的五张载玻片，其中，(a)1X、(b)5X、(c)15X、(d)20X、(e)25X，其是相对于OptiView(Ventana Medical Systems，Inc.)载玻片上浓度约为1.9mM DAB的。
图9A-9E展示了每个RGB通道的归一化OD值与总OD的关系。红色、绿色和蓝色的点分别用于表示RGB通道。每个点对应于载玻片中的一个1000×1000FOV。离群点是由于载玻片中可以忽略的伪影(例如，气泡)。
图10A-10F展示了每个RGB通道的归一化OD值与使用抗波形蛋白IHC方案加工的载玻片的总OD值的关系。红色、绿色和蓝色的点分别用于表示RGB通道。从覆盖组织的1000×1000个FOV中的每一个中随机选择样本。
图11阐述了利用当前公开的方法与先前方法相比进行解混的结果的视觉比较。
图12展示了保持12个肿瘤细胞系的两个载玻片的缩略图。
图13阐述了每种细胞系的平均DAB强度与基因拷贝数的对数的关系。
具体实施方式
还应当理解，除非明确相反地指示，否则在本文所要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述了所述方法的步骤或动作的顺序。
如本文所使用的，除非上下文另外明确地指示，否则单数术语“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另外明确地指示，否则单词“或”旨在包括“和”。术语“包括(includes)”是包含性地定义的，使得“包括A或B”意指包括A、B或A和B。
如本说明书和权利要求书中使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包括至少一个，但是也包括许多要素或要素列表中的多于一个要素以及任选地另外的未列项。只有明确相反地指示的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或者在权利要求中使用时的“由……组成”等将指代恰好包括许多要素或要素列表中的一个要素。一般而言，如本文所使用的，术语“或”在之后有诸如“任一个”、“……中的一个”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”等排他性术语时仅应被解释为指示排他性替代方案(即，“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”在权利要求中使用时具有如在专利法领域中使用时的普通含义。
术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等可互换地使用并且具有相同的含义。类似地，术语“包括(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”等可互换地使用并且具有相同的含义。具体地，每个术语的定义与美国专利法对“包括(comprising)”的共同定义一致并且因此被解释为开放术语，意指“至少以下项”并且也解释为不排除另外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有部件a、b和c的装置”意味着装置至少包括部件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”意味着方法至少包括步骤a、b和c。此外，虽然本文中可以按特定顺序概述步骤和过程，但是技术人员将认识到，排序步骤和过程可以变化。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的，短语“至少一个”在引用一个或多个要素的列表的情况下，应被理解为意指选自所述要素列表中的这些要素中的任何一个或多个的至少一个要素，但不一定包括在所述要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。此定义还允许除了所述要素列表内具体指明的要素之外可以任选地存在短语“至少一个”所指代的要素，而无论与具体指明的那些要素相关还是无关。因此，作为非限制性例子，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指代至少一个(任选地包括多于一个)A，而不存在B(并且任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中可以指代至少一个(任选地包括多于一个)B，而不存在A(并且任选地包括除了A以外的要素)；在又一个实施方案中可以指代至少一个(任选地包括多于一个)和至少一个(任选地包括多于一个)B(并且任选地包括其他要素)；等等。
如本文所使用的，术语“生物样本”或“组织样本”是指从包括病毒在内的任何生物体获得的包括生物分子(诸如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合)的任何样本。生物的其他例子包括哺乳动物(诸如人类；兽类，诸如猫、狗、马、牛和猪；以及实验动物，诸如小鼠、大鼠和灵长类动物)、昆虫、环节动物、蛛形纲动物、有袋动物、爬行动物、两栖动物、细菌和真菌。生物样本包括组织样本(诸如组织切片和组织穿刺活检)、细胞样本(诸如细胞学涂片(诸如巴氏涂片或血液涂片)或通过显微切割获得的细胞样品)或者细胞组分、片段或细胞器(诸如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离它们的组分获得的)。生物样本的其他例子包括血液、血清、尿液、精液、粪便物、脑脊液、间质液、粘液、泪液、汗液、脓、活检组织(例如，通过外科手术活检或穿刺活检获得的)、乳头抽吸物、耳垢、乳汁、阴道液、唾液、拭子(诸如口腔拭子)或含有源自第一生物样本的生物分子的任何材料。在某些实施方案中，如本文所使用的，术语“生物样本”是指由从受试者获得的肿瘤或其一部分制备的样本(诸如均质化或液化样本)。
如本文所使用的，术语“生物标志物”是指在血液、其他体液或组织中发现的生物分子，所述生物分子是正常或异常过程的象征或者是病状或疾病(诸如癌症)的象征。生物标志物可以用于确定身体对疾病或病状的治疗反应如何或者受试者是否易患疾病或病状。在癌症的情况下，生物标志物是指指示体内存在癌症的生物物质。生物标志物可以是肿瘤分泌的分子或身体对癌症存在的特异性反应。遗传、表观遗传学、蛋白质组学、糖组学和成像生物标志物可以用于癌症诊断、预后和流行病学。这种生物标志物可以在以非侵入性方式收集的生物流体(诸如血液或血清)中进行测定。几种基于基因和蛋白质的生物标志物已经用于患者护理，包括但不限于AFP(肝癌)、BCR-ABL(慢性髓性白血病)、BRCA1/BRCA2(乳腺癌/卵巢癌)、BRAF V600E(黑色素瘤/结肠直肠癌)、CA-125(卵巢癌)、CA19.9(胰腺癌)、CEA(结肠直肠癌)、EGFR(非小细胞肺癌)、HER-2(乳腺癌)、KIT(胃肠间质瘤)、PSA(前列腺特异性抗原)、S100(黑色素瘤)和许多其他生物标志物。生物标志物可以用作诊断物(用于鉴别早期癌症)和/或预后物(用于预测癌症的侵袭性和/或预测受试者对特定治疗的反应和/或癌症复发的可能性)。
如本文所使用的，术语“颜色通道”是指图像传感器的通道。例如，图像传感器可以具有三种颜色变化，诸如红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)。
如本文所使用的，术语“视场(FOV)”是指具有预定尺寸和/或形状的图像部分。
如本文所使用的，术语“图像数据”如本文所理解的涵盖从生物组织样本获取(诸如借助于光学传感器或传感器阵列)的原始图像数据或经过预处理的图像数据。具体地，图像数据可以包括像素矩阵。
如本文所理解的，“多通道图像”涵盖从生物组织样本获得的数字图像，其中，不同的生物结构(诸如核和组织结构)同时被特定的荧光染料、量子点、色原等染色，其中的每一种发荧光或在不同光谱带中以其他方式可检测到，从而构成了多通道图像的通道之一。
如本文所使用的，术语“RGB颜色空间”是指基于红绿蓝(RGB)颜色模型的任何加性颜色空间。特定的RGB颜色空间由红色、绿色和蓝色加性原色的三种色度定义并且可以产生是由这些原色定义的三角关系的任何色度。RGB颜色空间的完整规范还需要白点色度和γ校正曲线。
如本文所理解的，“解混图像”涵盖针对多通道图像的一个通道获得的灰度值或标量图像。通过将多通道图像解混，可以获得每个通道一个解混图像。
概述
本公开文本提供了用于通过自动选择颜色参考向量来分离图像中的颜色的系统和方法，所述系统和方法考虑了光散射的影响并且主要考虑了所述光散射在不同染色剂浓度下改变RGB通道信号在检测到的光中的比例的方式。这样，本公开文本提供了通过考虑生物样本中存在的染色剂的量来优化对颜色参考向量的选择的方法，并且这对于不严格遵循比尔-朗伯定律的染色剂特别重要，即对于染色剂的浓度与其吸光度或光学密度之间存在极少或不存在线性关系的染色剂。对于这些类型的染色剂，不同的染色剂浓度会导致不同的光谱形状，并且因此，针对这些染色剂的最佳颜色参考向量的选择可以具有浓度依赖性。
本文所公开的方法与解混具有与两种染色剂相对应的信号的图像数据有关，其中至少一种是浓度依赖性染色剂，例如DAB。这绝不意味着生物样本可以被仅两种染色剂染色。实际上，使用本文所描述的系统和方法评估的任何生物样本均可以被多于两种染色剂(例如，三种或更多种染色剂或者四种或更多种染色剂)染色。本文所描述的系统和方法适于评估整个图像(对于仅被两种染料染色的生物样本)、仅具有两种染色剂的图像(例如，较大图像)的一部分、视场(FOV)或感兴趣区域(ROI)、或图像中具有两种共同定位的染色剂的任何区域、FOV或ROI。
考虑到这一点，如本文所使用的，术语“浓度依赖性染色剂”是指不严格遵守比尔-朗伯定律(所述比尔-朗伯定律假定染色剂浓度较小并且吸收分子之间没有相互作用)的染色剂。对于这些浓度依赖性染色剂，随着染色剂浓度的增加，检测到的光中RGB通道信号的比例会由于散射增加(诸如由染色剂分子的沉淀而引起的)而发生变化。对于这些类型的染色剂，可以利用不同的光学密度颜色参考向量(在多个不同的染色剂浓度下确定的)来最好地表征染色剂的浓度依赖性，即在选择颜色参考向量时应当考虑在不同的染色剂浓度下确定的不同颜色参考向量，使得将染色剂浓度在对检测到的光中每个R、G和B通道信号的贡献中的影响考虑在内。在一些实施方案中，通过分析不同染色剂浓度下的标准化样本来得到浓度依赖性染色剂的颜色参考向量，并且所得的量可以存储在存储器(201)或数据库中以进行检索。
例如，3,3'-二氨基联苯胺(“DAB”)易于形成沉淀物，这导致光散射(即除了散射之外还导致吸收)并且因此是浓度依赖性染色剂。DAB染色剂的浓度的影响还在本文的实施例1中进行说明。由于DAB的浓度依赖性，在解混DAB时应当考虑不同的颜色参考向量。举例来说，不是具有描述DAB的单个颜色参考向量，而是可以获得DAB的多个不同的颜色参考向量，其中所述多个不同的颜色参考向量中的每个单独的颜色参考向量描述了特定浓度水平(例如1X、2X、4X、8X等)的DAB。不同DAB浓度水平的所述多个不同的颜色参考向量可以根据本领域普通技术人员已知的方法获得并且还在本文所提供的实施例中进行描述。
如本文所使用的，术语“非浓度依赖性染色剂”是指遵守或基本上遵守比尔-朗伯定律的那些染色剂。对于这些非浓度依赖性染色剂，单个颜色参考向量可以充分描述每个RGB颜色通道值。
尽管本文所公开的某些例子是指包括染色剂DAB和苏木精的双染色剂系统，但是技术人员将了解到，DAB或就此而言任何浓度依赖性染色剂可以与任何其他非浓度依赖性染色剂或浓度依赖性染色剂组合。本文所描述的数学原理和关系也将同样适用于那些其他染色剂系统。
图1中展示了用于对样品进行成像和分析的数字病理学系统200。数字病理学系统200可以包括成像设备12(例如，具有用于扫描承载样品的显微镜载玻片的装置的设备)和计算机14，由此成像设备12和计算机可以通信地耦合在一起(例如，直接地或间接地通过网络20)。计算机系统14可以包括台式计算机、膝上型计算机、平板计算机等、数字电子电路系统、固件、硬件、存储器602、计算机存储介质、计算机程序或指令集(例如，其中，所述程序存储在存储器或存储介质中)、处理器(包括经过编程的处理器)和/或类似物。图1中展示的计算系统14可以具有显示装置16和外壳18的计算机。计算机系统可以以二进制形式存储数字图像(本地地诸如存储在存储器、服务器或另一个网络连接装置中)。还可以将数字图像分成像素矩阵。像素可以包括由位深定义的具有一个或多个位的数字值。技术人员将了解到，可以利用其他计算机装置或系统，并且本文所描述的计算机系统可以通信地耦合到另外的部件，例如样品分析仪、显微镜、其他成像系统、自动载玻片制备设备等。本文还描述了这些另外的部件中的一些和可以利用的各种计算机、网络等。
成像设备12(或包括存储器中存储的预先扫描的图像的其他图像来源)通常可以包括但不限于一个或多个图像捕获装置。图像捕获装置可以包括但不限于相机(例如，模拟相机、数字相机等)、光学器件(例如，一个或多个透镜、传感器聚焦透镜组、显微镜物镜等)、成像传感器(例如，电荷耦合装置(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器等)、胶片等。在数字实施方案中，图像捕获装置可以包括协作以证明即时聚焦的多个透镜。图像传感器(例如，CCD传感器)可以捕获样品的数字图像。在一些实施方案中，成像设备12是明场成像系统、多光谱成像(MSI)系统或荧光显微镜系统。数字化的组织数据可以例如由图像扫描系统生成，诸如亚利桑那州图森市的VENTANA MEDICAL SYSTEMS公司的iSCAN CORE或其他适合的成像设备。本文还描述了另外的成像装置和系统。技术人员将了解到，由成像设备12获取的数字彩色图像通常由基本颜色像素构成。每个彩色像素在三个数字分量上编码，每个数字分量包括相同数量的位，每个分量对应于原色，通常是红色、绿色或蓝色，也由术语“RGB”分量表示。
图2提供了对在当前公开的数字病理学系统中利用的各种模块的概述。在一些实施方案中，数字病理学系统采用具有一个或多个处理器203和至少一个存储器201的计算机装置204或计算机实施的方法，所述至少一个存储器201存储非暂态计算机可读指令以由所述一个或多个处理器执行从而使所述一个或多个处理器执行一个或多个模块(例如，模块202和205至208)中的指令。可替代地，可以将指令存储在非暂态计算机可读介质(201)或计算机可用介质中。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质201可以包括除了暂态传播信号以外的所有计算机可读介质。
参考图2和图3，本公开文本提供了一种将光谱数据解混的计算机实施的方法，所述计算机实施的方法包括以下步骤：(a)运行图像获取模块202以生成或接收多通道图像数据，例如获取的图像或被至少两种染色剂染色的生物样本(步骤250)；(b)运行图像转换模块205以将图像强度数据转换为RGB颜色空间中的每个通道的光学密度值(步骤251)；(c)运行光谱参考模块206以得到或检索生物样本中的每种染色剂的存储的颜色参考向量(参考光谱)(并且，在浓度依赖性染色剂的情况下，检索或得到表征多个不同浓度的染色剂的多个颜色参考向量)(步骤252)；(d)运行数据重构模块207以确定提供最佳颜色空间(例如，接近线性和/或最佳地考虑了染色剂对检测到的光的浓度依赖性影响的颜色空间)的染色剂特定颜色参考向量(步骤253)；以及(e)运行解混模块208以使用确定的染色剂特定颜色参考向量提取对检测到的光中的每个RGB通道的染色剂特定贡献(步骤254)。当然，技术人员将认识到，描述用于每个模块中的任何指令、算法和滤波器均可以基于获取的图像的类型和/或正在研究的样品的类型进行调整或改变。技术人员还将了解到，可以向工作流程中并入另外的模块。例如，可以运行图像处理模块以将某些过滤器应用于获取的图像或识别组织样本内的某些组织学和/或形态结构。同样地，可以利用感兴趣区域选择模块来选择图像的特定部分以进行分析，诸如图像的预定部分或包含共同定位的两种染色剂的部分以进行分析。作为另外的例子，在解混之后，可以运行模块以确定样本内一种或多种染色剂的浓度。
参考图4，本公开文本提供了一种将被至少两种染色剂染色的生物样品的图像解混的方法，所述方法包括：(a)从具有第一染色剂和第二染色剂的图像或图像的一部分中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值，其中至少所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂(步骤310)；(b)获得多个预期第一染色剂颜色参考向量，所述多个预期第一染色剂颜色参考向量中的每个预期第一染色剂颜色参考向量表征不同浓度的第一染色剂(步骤320)；(c)获得至少一个第二染色剂颜色参考向量(步骤330)；(d)从第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括来自所述多个预期第一染色剂颜色参考向量的预期第一染色剂颜色参考向量中的一个和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量(步骤340)；(e)从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统(步骤350)，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色空间的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色空间来选择的；以及(f)使用选择的最佳颜色系统将获取的图像解混(步骤360)。
图像获取模块
作为初始步骤并且参考图3和图4，数字病理学系统运行图像获取模块202以捕获具有一种或多种染色剂的生物样本的图像或图像数据(步骤250和步骤300)。在一些实施方案中，接收或获取的图像是RGB图像或多光谱图像。在一些实施方案中，捕获的图像被存储在存储器201中。
图像或图像数据(在本文中可互换使用)可以使用成像设备12获取(诸如实时地)。在一些实施方案中，图像是从显微镜或能够捕获承载样品的显微镜载玻片的图像数据的其他仪器获取的，如本文所指出的。在一些实施方案中，使用2D扫描仪(诸如能够扫描图像分块的扫描仪)获取图像。可替代地，图像可以是先前已经获取(例如，扫描)并且存储在存储器201中(或者就此而言，经由网络20从服务器中检索到)的图像。
可以通过施加包含一种或多种不同标志物或显色染色剂的染色剂对样本染色。显色染色剂可以包括苏木精、曙红、固红或3,3'-二氨基联苯胺(DAB)。当然，技术人员将了解到，也可以用一种或多种荧光团对生物样本进行染色。典型的生物样本在向样本施加染色剂的自动染色/测定平台上进行加工。市场上有各种适于用作染色/检测平台的商业产品，一个例子是Ventana Medical Systems,Inc.(亚利桑那州图森市)的DiscoveryTM。相机平台还可以包括明场显微镜(一个例子是Ventana Medical Systems，Inc.的VENTANA iScan HT产品)或具有一个或多个物镜和数字成像器以及一组光谱滤镜的任何显微镜。可以使用用于捕获不同波长的图像的其他技术。适于对染色的生物样本进行成像的另外的相机平台在本领域是已知的并且可从诸如Zeiss、Canon、Applied Spectral Imaging和其他公司商购获得，并且这种平台容易适用于本主题公开文本的系统、方法和设备。
在一些实施方案中，感兴趣区域识别模块可以用于选择生物样本的一部分，应当获取所述部分的图像或所述部分的图像数据。图5提供了展示区域选择步骤的流程图。在步骤420中，区域选择模块接收识别的感兴趣区域或视场。在一些实施方案中，感兴趣区域由本公开文本的系统或通信地耦合到本公开文本的系统的另一个系统的用户识别。可替代地并且在其他实施方案中，区域选择模块从存储设备/存储器中检索感兴趣区域的位置或标识。在一些实施方案中，如步骤430所示，区域选择模块例如经由PCT/EP2015/062015中描述的方法自动生成FOV或ROI，所述文献的公开内容通过引用以其全文并入本文中。在一些实施方案中，感兴趣区域由系统基于图像中或图像的某些预定标准或特性自动地确定(例如，对于被多于两种染色剂染色的生物样本，识别图像的仅包括两种染色剂的区域)。在步骤440中，区域选择模块输出ROI。
在一些实施方案中，一旦获取多个图像或其中的感兴趣区域，就将其提供到图像转换模块205，使得可以将获取的图像内的强度数据转换为光学密度数据(步骤310)。
图像转换模块
在接收到图像数据后，可以执行图像转换模块205以用于将图像强度数据或像素强度数据转换为光学密度(OD)数据(步骤251和步骤310)。在这方面并且考虑到生物样本的获取的图像，可以导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度(检测到的光的总数)。更具体地并且使用下文识别的关系，可以导出RGB颜色空间中的蓝色通道、红色通道和绿色通道的总光学密度，并将其提供到数据重构模块207。
向光学密度空间的转换利用了比尔-朗伯定律，所述比尔-朗伯定律基于光学密度与染色剂浓度成正比的原理，如下文还详细地描述的。根据比尔-朗伯吸光定律，穿过吸收介质的单色光的透射强度由以下方程给出
I＝I0e-αs
其中，I0是入射光强度、α已知是吸收介质的吸收系数并且s是吸收介质的浓度与路径长度的乘积。比尔-朗伯定律适用于每个波长的入射光，其中，每个波长具有不同的α值。因此，对于具有N个频带的成像装置，比尔-朗伯定律可以写为
(I1,I2,I3,...,IN)＝(I01e-α 1 s,I02e-α 2 s,I03e-α 3 s,...,I0Ne-α N s)
其中，I0j是频带j中的入射光强度并且αj是频带j中的吸收系数。如果存在多种吸收介质(在组织学制备的组织样品的情况下，多种染色剂)，则吸收效果成倍增加。因此，例如，在两种染色剂的情况下，透射强度为：
(I1,I2,I3,...,IN)＝(I01e-α 1 s·e-β 1 t,I02e-α 2 s·e-β 2 t,I03e-α 3 s·e-β 3 t,...,I0Ne-αα N s·e-β N t)＝(I01e-(α 1 s+β 1 t),I02e-(α 2 s+β 2 t),I03e-(α 3 s+β 3 t),...,I0Ne-(α N s+β N t))
其中，β值是第二染色剂的吸收系数并且t是第二染色剂的浓度与路径长度的乘积。
如果Dj表示频带j中的光学密度，则光学密度由以下方程给出
(D1,D2,D3,...,DN)＝-(ln[I1/I01],ln[I2/I02],ln[I3/I03],...,ln[IN/I0N])
因此，对于两种染色剂的情况的例子，光学密度为
(D1,D2,D3,...,DN)＝([α1s+β1t],[α2s+β2t],[α3s+β3t],...,[αNs+βNt])＝s(α1,α2,α3,...,αN)+t(β1,β2,β3,...,β3N)
图像强度数据到光密度域的转换还在美国专利公开号2002/0196964中进行了描述，所述美国专利的公开内容通过引用以其全文并入本文中。
然后将RGB颜色空间中的每个通道的从图像转换模块205导出的总光学密度信息存储在存储器201中，并且由数据重构模块207用于确定用于将获取的图像解混的最佳颜色系统(步骤350)。
光谱参考模块
数字病理学系统200可以包括光谱参考模块206，所述光谱参考模块存储颜色数据，例如指示染色剂的颜色的颜色数据。颜色数据可以描述染色剂的单个频率或特征光谱轮廓。光谱参考模块206可以存储多种染色剂中的每一个的颜色数据。所述多种染色剂可以包括至少4种、至少10种、至少20种或至少100种染色剂。在一些实施方案中，光谱参考模块206仅针对存在于图像的一部分(例如，当这些染色剂存在两种共同定位的染色剂时)、感兴趣区域或视场中的染色剂选择颜色参考向量。可替代地，光谱参考模块206可以如本文所描述的导出特定染色剂的颜色数据。
在一些实施方案中，所存储的颜色数据是特定于特定染色剂的颜色参考向量。颜色参考向量对应于定义染色剂的颜色或光谱数据(例如，根据其颜色或光谱组分的贡献)，使得可以根据图像中出现的颜色(例如，指示染色剂)在预定范围内与参考颜色向量或染色剂颜色向量值相匹配还是偏离来将染色剂识别为存在于图像中。例如，对于RGB图像，颜色参考向量与RGB值相对应，所述RGB值定义了有时称为真实染色剂或纯染色剂的颜色。技术人员将了解到，可以通过测量用单种染色剂染色的载玻片中的RGB颜色通道值(IR，IG，IB)来确定每个通道的染色剂特定光学密度值。举例来说，苏木精染色剂的颜色参考向量可以是[0.18 0.20 0.08]。
在一些实施方案中，光谱参考模块206存储单个染色剂的多个颜色参考向量，其中染色剂的所述多个颜色参考向量中的每个单独的颜色参考向量表征不同浓度的染色剂。例如，对于染色剂DAB，光谱参考模块206可以包括一组DAB颜色参考向量，所述一组内的每个DAB颜色参考向量表征不同浓度的DAB的RGB贡献。例如，DAB在第一浓度(例如，1X)下的第一颜色参考向量可以是[x y x](其中，x、y和z中的每一个表示RGB颜色空间中的染色剂的光学密度值)；而DAB在第二浓度(例如，2X)下的第二颜色参考向量可以是[x'y'z']；在DAB在第三浓度(例如，4X)下的第三颜色参考向量可以是[x”y”z”]。在一些实施方案中，针对单种染色剂存储介于1个与100个之间的颜色参考向量。在其他实施方案中，针对单种染色剂存储介于1个与50个之间的颜色参考向量。在其他实施方案中，针对单种染色剂存储介于1个与25个之间的颜色参考向量。
在一些实施方案中，光谱参考模块可以用于基于从涂覆有不同染色剂浓度的颜色校准载玻片导出的图像数据，导出特定染色剂的一系列颜色参考向量。本文的实施例2中描述了制备这种“颜色校准载玻片”的方法。
假设已经制备了单种染色剂的N个参考标准载玻片并且假设每个载玻片呈现不同浓度的相同染色剂，则可以通过计算每个载玻片中的像素的平均归一化值ODR，ODG，ODB来计算一系列颜色参考向量。
红色、绿色和蓝色光谱带的光学密度(OD)由(ODR，ODG，ODB)限定，它们是RGB颜色通道值(IR，IG，IB)与最大通道值(I0R，I0G，I0B)的比值的负对数。对于8位相机，此定义表达为：
可以看出，每个通道的光学密度与染色剂的量成线性关系。此外，每种纯染色剂可以由三个(RGB)通道中的光的光学密度共同表征，这由光学密度转换的RBG颜色空间中的向量(ODR，ODG，ODB)表示。
在一些实施方案中，仅在选择的区域中计算每个载玻片中的像素的平均归一化ODR，ODG，ODB，以降低伪影的影响。如果V1、V2、……、VN分别表示载玻片1、2、……、N的参考颜色向量，则：
其中，表示归一化OD值。
制备颜色参考向量的替代方法在申请号PCT7EP2014/055028中进行了描述，所述申请的公开内容通过引用以其全文并入本文中。
可以将从颜色校准载玻片导出的颜色参考向量存储在存储器201中，所述颜色参考向量可以输出到数据重构207模块。
数据重构模块
在运行光谱参考模块206使得获得或导出颜色参考向量(步骤252、320和330)之后，将浓度依赖性染色剂的相关颜色参考向量或各组颜色参考向量提供到数据重构模块207。数据重构模块207通常利用所供应的全部颜色参考向量作为输入，并且与从图像转换模块205接收的RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度数据一起，确定用于将获取的图像数据解混的最佳颜色系统(步骤350)。数据重构模块考虑了染色剂的浓度依赖性并且因此允许提高解混后浓度依赖性染色剂强度的分辨率。
“最佳颜色系统”意味着通过考虑样本中染色剂的浓度的影响(即，浓度和/或沉淀物的形成是如何由于吸收率和/或光散射而实现消光的)在RGB颜色空间中选择最佳地估计了来自每种染色剂的检测到的光中的RGB通道信号的比例的颜色系统。技术人员将了解到，最佳颜色系统将包括浓度依赖性染色剂的对于样本中的特定染色剂浓度最佳地实现了线性的颜色参考向量。据信，与不考虑染色剂浓度的方法相比，最佳颜色系统的选择使得能够改善解混结果，如实施例6和实施例7所证明的(也参见图11)。
在随后的方法中，利用误差值即重构误差值来表征候选颜色系统并且从一系列候选颜色系统中预测最佳颜色系统。所述方法的目的是计算每个候选颜色系统的重构误差并且然后确定产生最低重构误差的候选颜色系统。因此，如果存在M个候选颜色系统，则针对每个候选颜色系统(即，针对表征第一染色剂和第二染色剂的颜色参考向量的每个唯一配对)计算重构误差，并且选择产生最小重构误差的候选系统。技术人员将了解到，通过使用该方法，候选颜色系统的数量没有限制。因此，当存在两种浓度依赖性染色剂和/或描述单种染色剂的众多浓度的大量颜色参考向量时，本文所描述的系统和方法适于用于选择颜色系统。据信，通过选择重构误差最小或接近零的颜色系统，确保了RGB颜色空间中的所有通道都尽可能接近线性。
参考图6A，确定最佳颜色系统的第一步是生成一系列候选颜色系统(步骤410)。所述一系列候选颜色系统中的每个候选颜色系统包括表征第一染色剂的颜色参考向量和表征第二染色剂的颜色参考向量。每个候选颜色系统本质上是两个颜色参考向量的矩阵(并且因此是光学密度值的矩阵)，其中，颜色参考向量表征不同的染色剂，并且其中，每个候选颜色系统是不同的。
假设第一染色剂是浓度依赖性染色剂并且光谱参考模块206提供了一组预期颜色参考向量(例如，10个离散的颜色参考向量)，其中每个单独的预期颜色参考表征多个不同浓度(例如1x、2x、4x……Nx染色剂浓度)下的浓度依赖性染色剂，则每个候选颜色系统将会包括浓度依赖性染色剂的预期颜色参考光谱中的一个预期颜色参考光谱。在该假设下，如果第二染色剂是非浓度依赖性染色剂，则每个候选颜色系统将会包括浓度依赖性染色剂的预期颜色参考光谱和非浓度依赖性染色剂的颜色参考光谱中的一个。
另一方面，如果第二染色剂也是浓度依赖性染色剂(即，系统包括第一浓度依赖性染色剂和第二浓度依赖性染色剂)，则每个候选颜色系统将会包括(i)第一浓度依赖性染色剂的预期颜色参考光谱中的一个预期颜色参考光谱；以及(ii)第二浓度依赖性染色剂的预期颜色参考光谱中的一个预期颜色参考光谱。技术人员将了解到，在这种情况下，将会需要考虑第一浓度依赖性染色剂和第二浓度依赖性染色剂的预期颜色参考向量的组合的所有置换(即，针对每个置换或配对导出的重构误差)。
一旦构建了每个候选颜色系统(步骤410)，就确定每个候选颜色系统的重构误差(步骤411)。重构误差通常是指遵循某些重构理论而测得的真实数据值与在数学上导出的数据值之间的差。
对于用浓度依赖性染色剂(“x”)(例如，DAB)和非浓度依赖性染色剂(“y”)(例如，苏木精)染色的生物样本，以下线性关系适用：
如方程(1)中使用的，Ay和Ay表示第一染色剂和第二种染色剂(例如，苏木精和DAB)的染色剂量。在某些实施方案中，[Ay Ax]被称为染色剂量的向量。
向量[ODR_组织 ODG_组织 ODB_组织]描述了RGB颜色空间内的每个通道的导出的总光学密度，即，使用图像转换模块205导出的值。
矩阵表示候选颜色系统，并且/>和指代第一染色剂(x)和第二染色剂(y)的预期颜色参考向量。和/>和/>以及/>是第一(x)和第二(y)染色剂在RGB颜色空间中的每个通道的光学密度值。例如，/>可以表示RGB颜色空间中的第一通道(例如，红色通道)中的第一染色剂的光学密度值。
举例来说，可以表示第一候选颜色系统，其中，是表征第一浓度的浓度依赖性染色剂的第一预期颜色参考向量，并且是指相同非浓度依赖性染色剂的颜色参考向量。
同样地，可以表示第二候选颜色系统，其中，是表征第二浓度的浓度依赖性染色剂的第二预期颜色参考向量，并且/>是指相同非浓度依赖性染色剂的颜色参考向量。
技术人员将了解到，对于任何给定的候选颜色系统，方程(1)是超定方程。因此，第一染色剂和第二染色剂的量A1和A2可以使用来自仅两个通道的信息确定(图6B的步骤420)。例如，通过使用RGB颜色空间中的红色通道信号和绿色通道信号并且对方程(2)进行求解，可以导出A1和A2的值。
/>
如方程(2)中使用的，矩阵在本文中被称为重构矩阵并且包括每种染色剂的RGB颜色空间中的两个通道的光学密度值。例如，重构矩阵可以包括绿色通道和蓝色通道、绿色通道和红色通道以及红色通道和蓝色通道的信号。针对每个候选颜色系统导出不同的候选重构矩阵。
在一些实施方案中，对方程(2)的Ay Ax求解包括将两个通道(在以上例子中为红色通道和绿色通道)的导出的总光学密度的向量乘以从候选颜色系统导出的候选重构矩阵的倒数，例如
根据导出的第一染色剂和第二染色剂的量，计算重构的总光学密度(步骤421)。使用RGB颜色空间中未表示在重构矩阵中的通道(即，方程(3)中未求解的第三通道)，计算重构的总光学密度。例如，当重构矩阵中提供了红色通道光学密度值和绿色通道光学密度值时，计算蓝色通道的重构的总光学密度，并且使用红色通道和绿色通道导出第一染色剂和第二染色剂的量。可以使用方程(3)计算蓝色通道的重构的总光学密度：
其中，是重构的总蓝色通道信号(从模块205)，Ay和Ax是第一染色剂和第二染色剂的导出的量，并且/>和/>分别是来自第一染色剂和第二染色剂的候选染色系统(即，来自生成并用于提供候选重构矩阵的候选颜色系统)的蓝色通道的光学密度值。
最终，使用蓝色通道的导出的总光学密度值(来自模块205)和重构的总蓝色通道光学密度计算重构误差(步骤422)。通过找到这两个值之间的绝对差来计算重构误差，如方程(4)中列出的：
步骤422的重构误差可以存储在存储器201中。针对候选颜色系统重复步骤420、421和422，即，计算每个候选颜色系统的重构误差。一旦计算出所有候选颜色系统的重构误差，就选择具有最低重构误差的候选颜色系统作为最佳颜色系统，即，考虑了任何浓度影响的最佳地表示每种染色剂的颜色系统。在一些实施方案中，选择最低重构误差可以通过对存储在存储器201中的计算的重构误差进行排序来完成。
在一些实施方案中，最佳颜色系统估计了生物样本中染色剂混合物的真实浓度依赖性染色剂浓度。最佳颜色系统然后输入到解混模块208以用于将获取的图像解混。
虽然上文中的例子计算了蓝色通道上的重构误差，但是技术人员将了解到，可以根据上文指出的程序计算绿色通道或红色通道上的重构误差。
计算误差的替代方法
(1)归一化叉积
确定重构误差的替代方法利用了如下文中指出的归一化叉积。叉积或向量积是对三维空间中的两个向量的二进制操作。给定两个线性独立的向量a和b，则叉积a×b是与a和b均垂直并且因此垂直于包含它们的平面的向量。如果两个向量具有相同方向(或具有恰好彼此相反的方向，即，不是线性独立的)或者如果任一向量具有零长度，则它们的叉积为零。
参考方程(5)，其中，向量[m n o]是第一染色剂颜色参考向量[x y z]和第二染色剂颜色参考向量[a b c]的归一化叉积，归一化叉积表示垂直于由第一染色剂颜色参考颜色向量和第二染色剂颜色参考颜色向量确定的平面的向量。
其中，x、y和z以及a、b和c分别是R、G和B通道的光学密度值。
如果可以通过第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量的线性组合完美地重构组织样本像素(在获取的图像中)的光学密度向量，则在对方程(5)求解后，A_cross将为零。因此，针对给定组织样本光学密度向量由第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量对唯一地确定的A_cross的幅值是对第一染色剂颜色参考向量和第二染色剂颜色参考向量可以重构给定组织样本光学密度向量的程度的指示。因此，A_cross的幅值可以作为去卷积误差用于选择浓度依赖性染色剂的最佳颜色系统或最佳参考向量。
非归一化参考颜色向量
在不希望受任何特定理论约束的情况下，据信，在RGB光学密度颜色空间中，极弱染色剂和极强染色剂的光学密度向量的方向可以非常接近与灰色色调相对应的方向。具体地说，极弱染色剂接近白色；而极强染色剂接近黑色。当这种染色剂存在于载玻片中时，纯粹地依赖于色调信息(或光学密度向量方向)可能在找到与正确的强度相对应的正确颜色参考向量方面不够稳健。因此，代替使用归一化参考颜色向量，可以使用非归一化参考向量将强度信息也考虑在内。设和(HEM)→表示第一染色剂(DAB)和第二染色剂(苏木精)的非归一化参考向量；设|DAB|和|HEM|表示每个向量的长度。类似于使用归一化参考向量的上述方法，对超定方程(7)或(8)进行求解以导出第一染色剂和第二染色剂(和)的量，所述量产生了最小去卷积误差。
然后，通过对方程(9)和(10)进行求解来确定第一染色剂和第二染色剂(DAB和HEM)的最终染色剂强度：
AHem＝AHem·|HEM| (9)
ADAB＝ADAB·|DAB| (10)
参考颜色向量内插
如果存在‘n’个非归一化DAB参考向量，即则使用本文识别的方法，确定/>和/>分别为产生了最小误差和第二最小误差的参考向量。然后，我们对以下线性方程进行求解/>
这是用于AHem、和/>的；并且通过以下方程我们可以找到内插的参考向量
在一些实施方案中，使用计算的来执行去卷积。这相当于找到沿着由/>和/>确定的平面与由/>和[ODR_组织 ODG_组织 ODB_组织]确定的平面的交叉点的光学密度向量。换句话说，/>和计算的/>的线性组合可以完美地重构组织信号[ODR_组织ODG_组织 ODB_组织]。同时，/>局限于是已知参考向量/>和/>的线性组合。期望和/>充分接近，使得它们的线性组合可以表示DAB染色剂的在物理上有意义的色调。
解混模块
在一些实施方案中，使用线性解混利用解混模块208将多重图像解混(步骤__)。线性解混描述于例如‘Zimmermann“Spectral Imaging and Linear Unmixing in LightMicroscopy”Adv Biochem Engin/Biotechnol(2005)95:245-265'以及C.L.Lawson和R.J.Hanson,"Solving least squares Problems",PrenticeHall,1974,第23章,第161页'，所述文献的公开内容通过引用以其全文并入本文中。在线性染色剂解混中，在任何像素处测量的光谱(S(λ))被视为染色剂光谱组分的线性混合并且等于在像素处表达的每个单独染色剂的颜色参考(R(λ))的比例或权重(A)之和
S(λ)＝A1·R1(λ)+A2·R2(λ)+A3·R3(λ).......Ai·Ri(λ)
这可以更一般地表达为以下矩阵形式
S(λ)＝ΣAi·Ri(λ)或S＝R·A
如果获取了M个信道图像并且存在N种单独的染色剂，则M x N矩阵R的列是如本文导出的最佳颜色系统、N x 1向量A是单独染色剂的未知比例并且M x 1向量S是像素处测量的多通道光谱向量。在这些方程中，每个像素中的信号(S)在获取多重图像和参考光谱期间进行测量，即最佳颜色系统如本文所描述的那样导出。各种染色剂的贡献(Ai)可以通过计算它们对测量的光谱中的每个点的贡献来确定。在一些实施方案中，使用最小二乘逆拟合法获得解，所述最小二乘逆拟合法通过对以下方程组求解使测量的光谱与计算的光谱之间的平方差最小化：
在这个方程中，j表示检测通道的数量并且i等于染色剂的数量。线性方程解通常包括允许受约束的解混强制权重(A)求和为1。
用于实践本公开文本的实施方案的其他部件
本公开文本的计算机系统还可以通信地耦合到可以对组织样品执行一个或多个制备过程的样品加工设备。制备过程可以包括但不限于对样品进行脱蜡、对样品进行调节(例如，细胞调节)、对样品进行染色、执行抗原修复、执行免疫组织化学染色(包括标记)或其他反应和/或执行原位杂交(例如，SISH、FISH等)染色(包括标记)或其他反应、以及用于制备用于显微术、微量分析、质谱法或其他分析方法的样品的其他过程。
加工设备可以将固定剂施加到样品。固定剂可以包括交联剂(诸如醛类(例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛)以及非醛类交联剂)、氧化剂(例如，金属离子和复合物，如四氧化锇和铬酸)、蛋白质变性剂(例如，乙酸、甲醇和乙醇)、未知机制的固定剂(例如，氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如，卡诺氏固定剂(Carnoy's fixative)、methacarn、波恩氏流体(Bouin's fluid)、B5固定剂、罗斯曼氏流体(Rossman's fluid)、詹德莱氏流体(Gendre'sfluid))、微波和混杂固定剂(例如，排出体积固定和蒸气固定)。
如果样品是嵌入石蜡中的样本，则可以使用一种或多种适当的脱蜡流体对样本进行脱蜡。除去石蜡后，可以相继向样品施加任何数量的物质。物质可以用于预处理(例如，用于反转蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(例如，严格洗涤)、检测(例如，将视觉或标志分子与探针链接)、扩增(例如，扩增蛋白质、基因等)、复染、盖玻等。
样品加工设备可以将广泛范围的物质施加到样品。物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、冲洗剂和/或调节剂。物质可以是流体(例如，气体、液体或气体/液体混合物)等。流体可以是溶剂(例如，极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(例如，水溶液或其他类型的溶液)等。试剂可以包括但不限于染色剂、润湿剂、抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收流体(例如，基于水性或非水性的抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等)等。探针可以是与可检测的标记或报告分子附接的分离的核酸或分离的合成寡核苷酸。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。
样品加工设备可以是自动化设备，诸如由Ventana Medical Systems,Inc.出售的BENCHMARK XT仪器和SYMPHONY仪器。Ventana Medical Systems,Inc.是公开了用于执行自动化分析的系统和方法的许多美国专利的受让人，包括美国专利号5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请号20030211630和20040052685，其各自通过引用以其全文并入本文中。可替代地，可以手动加工样品。
在对样品进行加工之后，用户可以将承载样品的载玻片运送到成像设备。在一些实施方案中，成像设备是明场成像器载玻片扫描仪。一种明场成像器是由Ventana MedicalSystems,Inc.出售的iScan Coreo明场扫描仪在自动化实施方案中，成像装置是数字病理学设备，如题为IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES(成像系统和技术)的国际专利申请号PCT/US2010/002772(专利公开号为WO/2011/049608)所公开的或于2011年9月9日提交的题为IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME(成像系统、暗盒和其使用方法)的美国专利申请号61/533,114所公开的。国际专利申请号PCT/US2010/002772和美国专利申请号61/533,114通过引用以其全文并入本文中。
成像系统或设备可以是多光谱成像(MSI)系统或荧光显微镜系统。这里使用的成像系统是MSI。MSI通常通过提供对像素级图像的光谱分布的访问用基于计算机化显微镜的成像系统来配备病理样品的分析。虽然存在各种多光谱成像系统，但是所有这些系统共有的操作方面是形成多光谱图像的能力。多光谱图像是捕获特定波长或跨电磁波谱的特定光谱带宽的图像数据的图像。可以通过光学滤波器或通过使用能够选择预定光谱分量的其他仪器来挑选这些波长，所述预定光谱分量包括在可见光范围之外的波长处的电磁辐射，如例如红外(IR)。
MSI系统可以包括光学成像系统，所述光学成像系统的一部分包含光谱选择性系统，所述光谱选择性系统可调谐以定义预定数量的即N个离散光学带。光学系统可以适于对组织样本进行成像、用宽带光源在透射中照射到光学检测器上。在一个实施方案中可以包括放大系统(如例如显微镜)的光学成像系统具有通常在空间上与光学系统的单个光学输出对准的单个光轴。当调整或调谐光谱选择系统(例如用计算机处理器)时，系统形成组织的一系列图像，诸如以确保在不同的离散光谱带中获取图像。设备可以另外包含显示器，所述显示器中出现来自所获取的图像的序列中的至少一个视觉上可感知的组织图像。光谱选择系统可以包括光学色散元件(诸如衍射光栅)、光学滤波器(诸如薄膜干涉滤光器)的集合、或适于响应于用户输入或预编程处理器的命令从光源通过样本朝向检测器透射的光谱中选择特定通带的任何其他系统。
在替代性实施方式中，光谱选择系统定义了对应于N个离散光谱带的若干个光学输出。这种类型的系统从光学系统摄入透射光输出，并且沿着N个空间上不同的光路在空间上重定向这个光输出的至少一部分，其方式为将识别的光谱带中的样本沿着对应于这个识别的光谱带的光路成像到检测器系统上。
本说明书中描述的主题和操作的实施方案可以在数字电子电路系统中或在计算机软件、固件或硬件(包括本说明书中公开的结构及其结构等同物)或其中的一个或多个的组合中实施。可以将本说明书中描述的主题的实施方案实施为一个或多个计算机程序，即在计算机存储介质上编码以用于由数据处理设备来执行或者用于控制数据处理设备的操作的计算机程序指令的一个或多个模块。本文所描述的任何模块可以包括由一个或多个处理器执行的逻辑。如本文所使用的，“逻辑”是指具有可以应用于影响处理器操作的指令信号和/或数据形式的任何信息。软件是逻辑的例子。
计算机存储介质可以是机器可读存储装置、机器可读储存基板、随机或串行存取存储器阵列或装置、或其中的一个或多个的组合。而且，虽然计算机存储介质不是传播信号，但计算机存储介质可以是编码在人工导出的传播信号中的计算机程序指令的来源或目的地。计算机存储介质还可以是或者可以包括在一个或多个单独的物理部件或介质(例如，多个CD、磁盘或其他存储装置)中。可以将本说明书中描述的操作实施为由数据处理设备对存储在一个或多个计算机可读存储装置上或从其他来源接收的数据执行的操作。
术语“编程处理器”包括用于处理数据的所有种类的设备、装置和机器，包括例如可编程微处理器、计算机、芯片上系统或多个芯片上系统、或前述项的组合。设备可以包括专用逻辑电路系统，例如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)。除了硬件之外，设备还可以包括为所讨论的计算机程序创造执行环境的代码，例如，构成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、跨平台运行时环境、虚拟机、或其中的一个或多个的组合的代码。设备和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础结构，诸如web服务、分布式计算和网格计算基础结构。
计算机程序(也称为程序、软件、软件应用、脚本或代码)可以以任何形式的编程语言书写，包括编译或解释语言、说明性或者过程性语言，并且计算机程序可以以任何形式部署，包括作为独立程序或者作为模块、部件、子例程、对象或适用于计算环境的其他单元。计算机程序可以但不需要对应于文件系统中的文件。可以将程序存储在保持其他程序或数据的文件的一部分(例如，存储在标记语言文档中的一个或多个脚本)中、专用于所讨论的程序的单个文件中、或者多个协调文件(例如，存储一个或多个模块、子程序、或代码的各部分的文件)中。计算机程序可以被部署成在一个计算机上或者在位于一个站点或跨多个站点分布并且通过通信网络互连的多个计算机上执行。
本说明书中描述的过程和逻辑流程可以由一个或多个可编程处理器实行，所述一个或多个可编程处理器执行一个或多个计算机程序以便通过对输入数据进行操作并且生成输出来执行动作。过程和逻辑流程还可以由设备执行，并且装置还可以被实施为专用逻辑电路系统，例如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)。
举例来讲，适于执行计算机程序的处理器包括通用和专用两种微处理器以及任何种类的数字计算机的任何一个或多个处理器。通常，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机的必不可少的元件是用于根据指令执行动作的处理器和用于存储指令和数据的一个或多个存储器装置。通常，计算机还将包括用于存储数据的一个或多个大容量存储装置(例如，磁盘、磁光盘或光盘)，或者被操作性地耦合以从大容量存储装置接收数据或向大容量存储装置传递数据或两者。然而，计算机不需要有这种装置。此外，计算机可以嵌入另一个装置中，仅举几例，例如移动电话、个人数字助理(PDA)、移动音频或视频播放器、游戏控制台、全球定位系统(GPS)接收器或便携式存储装置(例如，通用串行总线(USB)闪存驱动器)。适于存储计算机程序指令和数据的装置包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储装置，包括例如：半导体存储器装置，例如EPROM、EEPROM和闪存装置；磁盘，例如内部硬盘或可移动盘；磁光盘；以及CD ROM盘和DVD ROM盘。处理器和存储器可以由专用逻辑电路系统补充或斌如专用逻辑电路系统中。
为了提供与用户的交互，本说明书中描述的主题的实施方案可以实施在具有用于向用户显示信息的显示装置(例如，LCD(液晶显示器)、LED(发光二极管)显示器或OLED(有机发光二极管)显示器)以及通过其用户可以向计算机提供输入的键盘和定点装置(例如鼠标或轨迹球)的计算机上。在一些实施方案中，触摸屏可以用于显示信息并接收来自用户的输入。其他种类的装置也可以用于提供与用户的交互；例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈，例如视觉反馈、听觉反馈或触感反馈；并且来自用户的输入可以以任何形式接收，包括声学、语音或触觉输入。另外，计算机可以通过以下方式与用户交互：向用户所使用的装置发送文档以及从用户所使用的装置接收文档；例如，通过响应于从网页浏览器接收的请求来向用户的客户端装置上的网页浏览器发送网页。
本说明书中描述的主题的实施方案可以实施在包括以下的计算系统中：后端部件(例如，作为数据服务器)、或中间件部件(例如，应用服务器)、或前端部件(例如，具有图形用户界面或Web浏览器的客户端计算机，用户可以通过所述图形用户界面或所述Web浏览器与本说明书中描述的主题的实施方式交互)、或者一个或多个这种后端、中间件或前端部件的任何组合。系统的部件可以通过数字数据通信的任何形式或介质(例如，通信网络)进行互连。通信网络的例子包括局域网(“LAN”)和广域网(“WAN”)、互联网络(例如，互联网)以及对等网络(例如，自组织对等网络)。例如，图1的网络20可以包括一个或多个局域网。
计算系统可以包括任何数量的客户端和服务器。客户端和服务器通常远离彼此并且通常通过通信网络进行交互。客户端与服务器的关系借助于在相应计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序产生。在一些实施方案中，服务器将数据(例如，HTML页面)传输到客户端装置(例如，目的是向与客户端装置交互的用户显示数据和从与客户端装置交互的用户接收用户输入)。在客户端装置处生成的数据(例如，用户交互的结果)可以在服务器处从客户端装置接收。
实施例1—消光对DAB浓度的影响
比尔-朗伯方程假染色剂浓度较小并且吸收分子之间没有相互作用。换句话说，假设吸收因子cR、cG和cB是影响消光的唯一因素，所述唯一因素与染色剂浓度无关。然而，由于DAB染色剂在样本加工期间有沉淀物形成反应，因此该假设不那么适用于DAB染色剂。需要将光散射考虑在内，所述光散射使消光(即，吸收+散射)具有浓度依赖性。图7展示了染色剂浓度对消光的影响(参见Peter H.和Tobias M.,“Supplementary Information to Amodel based survey of color deconvolution in diagnostic bright fieldmicroscopy:Error Estimation and Spectral Consideration,”Sci Rep.2015；5:12096)。
如所示出的，对于给定浓度，峰值消光(所述峰值消光用作归一化因素)出现在约475nm处，这大致对应于蓝色光谱带的中心。覆盖更大波长的红色光谱带与峰值相比具有最少的消光。绿色光谱带的消光介于其间。在染色剂浓度增加时，跨不同波长与峰值消光的比值总体上增大到高于约475nm的波长。这意味着检测到的光中的RGB通道信号的比值由于散射增加并且染色剂浓度发生变化而改变。因此，需要不同的OD向量来表征不同浓度的DAB染色剂。
实例2—用控制的浓度制备DAB载玻片的方法(参考颜色集合生成)
为了研究不同浓度水平下DAB染色剂的色度特性，生成了具有控制的浓度的DAB载玻片。考虑到组织样本将引入DAB浓度的大量载玻片内变化，开发了特殊的载玻片制备过程以生成具有均匀DAB浓度分布的载玻片。这有助于在特定浓度水平下提取可靠的参考颜色向量。
DAB试剂：48.5mM二氨基联苯胺、5mM焦亚硫酸钠、0.5％(w/v)聚乙烯亚胺
H2O2试剂：118mM H2O2、385mM磷酸氢二钾、三水合物、115mM磷酸二氢钾、pH 7.3、240mM氯化钠、700mM咪唑、700mM 2-羟基吡啶、0.25％(w/v)Brij-35
明胶，起霜值50(MP Biomedicals)
OptiView抗HQ HRP(Ventana Medical Systems,Inc.)
OptiView Copper(Ventana Medical Systems,Inc.)
戊二醛溶液，I级(Sigma-Aldrich)
为了制备凝胶，制成了3％(w/v)明胶的DI H2O溶液。该溶液利用偶尔搅拌通过加热到70℃进行溶解。一旦溶液溶解，就取出其300uL并冷却至37℃持续5分钟。
在凝胶溶液冷却时，将其他试剂温热至37℃。一旦每个事物均衡化到37℃，就将100uL OptiView抗HQ HRP与明胶等分部分混合。在单独的试管中，混合300uL DAB和300uLH2O2，然后将混合物加入到明胶+抗HQ HRP混合物中，并且充分混合全部溶液。最终，将100uLOptiView Copper试剂加入到混合物中，并且再次混合每个事物。
将该明胶混合物的300uL用移液器移到澄清的SuperFrost Plus载玻片的未结霜部分上。通过轨道运动将载玻片小心倾斜以确保明胶混合物充分且均匀地覆盖载玻片的未结霜部分。将载玻片水平置于表面上、冷却到4℃并且培育3分钟以使凝胶凝固。一旦凝胶凝固，就将50uL戊二醛施加到硬化的DAB凝胶的表面，并且将玻璃1.5mm的盖玻片立即置于凝胶上以使戊二醛跨整个DAB凝胶表面扩散。然后将载玻片在室温下培育3分钟，同时将戊二醛散布到凝胶中并交联明胶颗粒。3分钟后，从载玻片的边缘小心抹去过量液体。将澄清的丙烯酸密封剂施加到盖玻片和载玻片的边缘，以将盖玻片附接到载玻片并密封DAB凝胶以免水分损失。
为了可视化不同浓度水平的DAB的色度特性，扫描样本载玻片并且计算每个载玻片的每个1000×1000视场(FOV)的平均光学密度向量。针对载玻片内的所有FOV的总光学密度值绘制每个RGB通道的归一化光学密度值。应注意，总光学密度值等于每个FOV的平均光学密度向量的长度，这指示了染色剂浓度。图8提供了使用公开的方法制备的样本载玻片的缩略图。浓度为(a)1X、(b)5X、(c)15X、(d)20X、(e)25X，所述浓度是相对于约1.9mM DAB的OptiView载玻片上浓度的。
实施例3—DAB浓度对光学密度向量的影响
为了可视化DAB浓度对光学密度向量的影响，计算每个载玻片上的1000×1000FOV的平均光学密度向量。针对载玻片内的所有FOV的总光学密度值绘制每个RGB通道的归一化光学密度值。应注意，总光学密度值等于每个FOV的平均光学密度向量的长度，这指示了染色剂浓度。图9A-9E示出了如图8所示的5个载玻片的结果。
如看到的，针对载玻片1X、5X、15X、20X观察到ODR＜ODG＜ODB，这雨如图7所示的DAB消光绘图相一致。此外，归一化的ODR，ODG，ODB值在低总OD值范围内总体上保持恒定，从而指示比尔-朗伯定律合理地非常适用于低DAB浓度。在总OD值增大时，尤其是在总OD值大于3时，观察到归一化的ODB减小并且归一化的ODR和ODG增大。该趋势对于载玻片25X是最明显的，从而指示了高DAB浓度下的强散射影响。通过得到每个载玻片(排除伪影区域)的平均归一化OD向量生成每个浓度水平的参考颜色向量。
实施例4—被具有不同浓度的DAB染色的波形蛋白载玻片
波形蛋白阳性对照载玻片旨在作为阳性对照物用于使用抗波形蛋白抗体进行免疫组织化学(IHC)染色。我们对波形蛋白载玻片进行类似的DAB分析，其中，6个载玻片分别在1X、5X、10X、15X、20X和25X浓度下染色。在我们的实验中使用肺组织(所述肺组织在标记附近)。考虑到载玻片有大的染色剂强度变化，代替计算平均OD，我们随机选择覆盖每个载玻片中的肺组织的每个1000×1000FOV中的2000个像素并且绘制归一化的ODR，ODG，ODB与每个载玻片的总OD值的关系。将结果示于图10A-10F中。
在与DAB凝胶载玻片相比总OD值增大时观察到归一化OD值具有类似的改变趋势，即，在总OD值增大时，尤其是在总OD值大于3时，观察到归一化的ODB减小并且归一化的ODR和ODG增大。该趋势对于载玻片25X是最明显的，其中，大量数据点具有大于4的总OD值，从而指示了高DAB浓度下的强散射影响。不足为奇的是，从组织载玻片收集的数据比从凝胶载玻片收集的数据的噪声更大，从而指示组织样本与入射光之间可能发生更复杂的相互作用。因此，我们相信凝胶载玻片在用于导出的参考颜色向量以进行颜色去卷积时更可靠。
基于以上分析，应当使用不同的颜色参考向量对不同浓度的DAB染色剂进行去卷积。本文所描述的方法允许选择描述特定DAB浓度的适合的DAB颜色参考向量，即便所使用的实际DAB浓度是未知的。
实施例5—用DAB和苏木精染色的样本的参考颜色选择
基于以上分析，应当使用不同的参考颜色向量对不同浓度水平的DAB染色剂进行去卷积。然而，由于我们不知道在去卷积前染色剂混合物中的DAB浓度，因此我们无法直接确定参考向量。为了解决这一问题，我们开发了用于从最佳地表示混合物中的真实DAB浓度的给定组中自动地选择DAB参考颜色向量的方法。针对真实的DAB和HTX浓度，我们考虑了双重染色剂的情形(即，仅DAB和另一种染色剂，例如苏木精)，其归一化参考颜色向量为和/>并且我们得到
如本文所指出的，方程(10)是超定方程。AHem和ADAB可以使用来自仅两个通道的信息确定。例如，通过使用红色和绿色通道信号并且对以下方程求解
我们可以获得AHem和ADAB的值。当参考颜色向量是用于真实浓度水平时，颜色系统接近线性，并且我们可以使用计算的AHem和ADAB的值来重构蓝色通道信号即
其中，是重构的蓝色通道信号。重构误差为
在实践中，考虑到HEM染色剂的散射影响可忽略，对HEM染色剂我们可以使用固定的参考颜色向量。因此，如果我们具有施用如本文所描述的方法制备的N个DAB载玻片，则每个载玻片表示一定的DAB浓度水平，我们具有N对DAB和HEM参考颜色向量。我们计算每对参考向量的重构误差，并且产生最小重构误差的一对被选择为最佳的一对，如本文所描述的。候选参考向量对的数量并无限制。较大数量的DAB载玻片通常给我们提供更宽的参考颜色选择范围并且预期将较大的DAB染色剂变化考虑在内并因此产生更好的颜色去卷积结果。
还可以的是，代替使用蓝色通道信号来计算重构误差，还可以使用红色和绿色通道信号。依据我们的实验，使用绿色通道进行误差计算实际上跨所测试的项产生了更低的平均误差。
实施例6—实验结果—视觉评估
图11示出了传统方法与提出的方法之间的视觉比较。输入图像是CEA(癌胚抗原)染色的非小细胞肺癌(NSCLC)组织样本。可以清楚地看到，在被DAB强烈染色的区域中，新的解混的HEM图像更好地绘制了核，并且新的解混的DAB图像更好地示出了原始图像的DAB变化。
实施例7—实验结果—量化的评估
为了量化的评估，使用了具有团块的组织微阵列的载玻片。总共有12个肿瘤细胞系，每个肿瘤细胞系是使用DAB染色的CEA，之后使用HEM复染色。提供通过排序确定的CEA基因拷贝数作为对CEA表达水平的指示(参见表1)，TMA1和TMA2分别对应于载玻片1(左图)和载玻片2(右图)。图12示出了保持这12个肿瘤细胞系样本的这两个载玻片的缩略图，每个细胞系的名称也在每个细胞系旁边进行指示。图13示出了每个细胞系的平均DAB强度与基因拷贝数的对数的关系。使用对数是因为原始基因拷贝数的范围太宽并且DAB强度变化会很难示出，如果再次绘制原始基因拷贝数的话。如所示出的，新方法生成了类似的平均DAB强度作为低CEA表达细胞系的比较方法，但是针对高CEA表达细胞系产生了更高的DAB强度测量结果，所述测量结果更好地与CEA基因拷贝数相关。
表1
本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用以其全文并入本文中。如果有必要，则可以修改实施方案的各方面以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供又另外的实施方案。
尽管已经参考多个说明性实施方案描述了本公开文本，但是应当理解，本领域技术人员可以设计出落入本公开文本的原理的精神和范围内的许多其他修改和实施方案。更具体地，在不脱离本公开文本的精神的情况下，可以在前述公开内容、附图和所附权利要求的范围内对主题组合布置的组成部分和/或布置进行合理的变化和修改。除了组成部分和/或布置的变化和修改之外，替代用途对于本领域技术人员而言也将是显而易见的。

Claims (15)

1.一种将用至少两种染色剂染色的生物样品的图像解混的方法，其包括：
(310)导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值，其中，RGB颜色空间中的每个通道的所述总光学密度值表示自具有第一染色剂和第二染色剂的所述图像的至少一部分的像素强度值转换的光学密度值，其中，至少所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂，其中，所述浓度依赖性染色剂包括对所述图像的所述部分产生光散射效应的沉淀物形成染色剂；
(320)获得多个预期第一染色剂颜色参考向量，所述多个预期第一染色剂颜色参考向量中的每个预期第一染色剂颜色参考向量表征不同浓度的所述第一染色剂；
(330)获得表示所述第二染色剂的至少一个第二染色剂颜色参考向量；(340)从所述多个预期第一染色剂颜色参考向量和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括所述多个预期第一染色剂颜色参考向量中的一个预期第一染色剂颜色参考向量和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量；
(350)从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色系统的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色系统来选择的，其中，所述重构误差对应于所述图像的所述至少一部分的导出的总光学密度值与为相应的候选颜色系统确定的重构的总光学密度值之间的差；以及
(360)使用选择的最佳颜色系统将所述图像解混。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一系列候选颜色系统中的一种候选颜色系统的所述重构误差是通过计算(a)所述图像的所述至少一部分的与RGB颜色空间中的通道之一对应的第一通道的导出的总光学密度值与(b)所述第一通道的重构的总光学密度值之间的绝对差来确定的(422)，其中，所述第一通道的重构的总光学密度值表示基于所述候选颜色系统的相应预期第一染色剂颜色参考向量和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量确定的光学密度值。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一通道的重构的总光学密度值是通过对以下项进行求和来计算的：(i)所述生物样品中存在的所述第二染色剂的导出量与所述第二染色剂在所述一系列候选颜色系统中的一个候选颜色系统中的第一通道光学密度值的乘积；以及(ii)所述生物样品中存在的所述第一染色剂的导出量与所述第一染色剂在同一候选颜色系统中的第一通道光学密度值的乘积，其中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是基于表示RGB颜色空间中第二通道和第三通道的导出的总光学密度值的向量确定的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是通过将RGB颜色空间中的所述第二通道和所述第三通道的导出的总光学密度值的向量乘以候选重构矩阵的倒数来计算的，所述候选重构矩阵包括：(i)具有与所述候选颜色系统的所述第一染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第一光学密度向量；以及(ii)具有与所述候选颜色系统的所述第二染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第二光学密度向量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一染色剂是DAB。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二染色剂选自苏木精、曙红、固红或甲基绿。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，与RGB颜色空间中的通道之一对应的所述第一通道是蓝色通道或绿色通道。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品被多于三种染色剂染色，并且其中，所述图像是从更大的图像导出的感兴趣区域，所述感兴趣区域仅包括所述第一染色剂和所述第二染色剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述第一染色剂和所述第二染色剂均是浓度依赖性染色剂，并且其中，所述至少一个第二染色剂颜色参考向量是多个预期第二染色剂颜色参考向量，所述多个预期第二染色剂颜色参考向量中的每个预期第二染色剂颜色参考向量表征不同浓度的所述第二染色剂。
10.一种用于将用至少两种染色剂染色的生物样品的图像解混的系统(200)，所述系统(200)包括：(i)一个或多个处理器(203)；以及(ii)耦合到所述一个或多个处理器(203)的一个或多个存储器(201)，所述一个或多个存储器(201)用于存储在由所述一个或多个处理器(203)执行时使所述一个或多个处理器(203)执行包括以下项的操作的计算机可执行指令：
(300)获取所述生物样品的具有与第一染色剂和第二染色剂相对应的信号的所述图像，其中至少所述第一染色剂是浓度依赖性染色剂，其中，所述浓度依赖性染色剂包括对获取的图像的下述部分产生光散射效应的沉淀物形成染色剂；
(310)从获取的图像中的像素强度值导出RGB颜色空间中的每个通道的总光学密度值，其中，RGB颜色空间中的每个通道的所述总光学密度值表示自获取的图像的至少一部分的像素强度值转换的光学密度值；
(320)从光谱参考数据库中获得一组预期第一染色剂颜色参考向量，所述一组预期第一染色剂颜色参考向量中的每个预期第一染色剂颜色参考向量表征不同染色剂浓度下的所述第一染色剂；
(330)从所述光谱参考数据库中获得至少一个第二染色剂颜色参考向量，其中，所述至少一个第二染色剂颜色参考向量表示所述第二染色剂；(340)从所述一组预期第一染色剂颜色参考向量和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量导出一系列候选颜色系统，每个候选颜色系统包括所述一组预期第一染色剂颜色参考向量中的一个预期第一染色剂颜色参考向量和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量；
(350)从所述一系列候选颜色系统中选择最佳颜色系统，所述最佳颜色系统是通过(i)计算每个候选颜色系统的重构误差和(ii)确定具有最小重构误差的候选颜色系统来选择的，其中，所述重构误差对应于所述图像的所述至少一部分的导出的总光学密度值与为相应的候选颜色系统确定的重构的总光学密度值之间的差；以及
(360)使用选择的最佳颜色系统将获取的图像中的所述信号解混。
11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述一系列候选颜色系统中的一种候选颜色系统的所述重构误差是通过计算(a)所述图像的所述至少一部分的与RGB颜色空间中的通道之一对应的第一通道的导出的总光学密度值与(b)所述第一通道的重构的总光学密度值之间的绝对差来确定的(422)，其中，所述第一通道的重构的总光学密度值表示基于所述候选颜色系统的相应预期第一染色剂颜色参考向量和所述至少一个第二染色剂颜色参考向量确定的光学密度值。
12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述第一通道的重构的总光学密度值是通过对以下项进行求和来计算的：(i)所述生物样品中存在的所述第二染色剂的导出量与所述第二染色剂在所述一系列候选颜色系统中的一个候选颜色系统的第一通道光学密度值的乘积；以及(ii)所述生物样品中存在的所述第一染色剂的导出量与所述第一染色剂在同一候选颜色系统中的第一通道光学密度值的乘积，其中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是基于表示RGB颜色空间中第二通道和第三通道的导出的总光学密度值的向量确定的。
13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述第一染色剂和所述第二染色剂的所述导出量是通过将RGB颜色空间中的所述第二通道和所述第三通道的导出的总光学密度值的向量乘以候选重构矩阵的倒数来计算的，所述候选重构矩阵包括：(i)具有与所述候选颜色系统的所述第一染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第一光学密度向量；以及(ii)具有与所述候选颜色系统的所述第二染色剂的所述第二通道和所述第三通道相对应的光学密度值的第二光学密度向量。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的系统，其中，获得所述一组预期第一染色剂颜色参考向量包括通过分析来自一系列对照载玻片的图像数据来导出所述第一染色剂的多个颜色参考向量，其中，每个对照载玻片具有不同染色剂浓度。
15.一种非暂态计算机可读介质，其存储指令，所述指令在由成像系统(200)的一个或多个处理器(203)执行时使所述成像系统(200)执行根据权利要求1至9中任一项所述的方法。
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