BR112020010635A2

BR112020010635A2 - extração de saponina

Info

Publication number: BR112020010635A2
Application number: BR112020010635-6A
Authority: BR
Inventors: Ahmad Taimour BAIG; Juan Jose Diaz Garcia; Chad Austin FARRENBURG; Kent Raymond MYERS; Jeri Kay SANDVICK; Jeb Yeatts VANDENBURG
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-11-10
Also published as: JP2023182592A; EP3717005A1; CN111372604A; JP2021504429A; US20240024467A1; US20200323980A1; US11744890B2; CL2020001439A1; MX2020005480A; WO2019106191A1; CA3083059A1; US20230355752A1

Abstract

A presente invenção refere-se a extratos aquosos brutos de Quillaja saponaria Molina que contém pelo menos o pico principal de QS-21 e o componente 2018, em que a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 é = 0,075, como medida pela absorvência de UV em 214 nm, métodos para obter esses extratos e aspectos relacionados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXTRA- ÇÃO DE SAPONINA".

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se de uma forma geral aos ex- tratos de saponina, em particular extratos aquosos brutos de Quillaja saponaria Molina, métodos para sua fabricação e aos aspectos asso- ciados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os adjuvantes são incluídos nas vacinas para melhorar as respostas imunológicas humorais e celulares, particularmente no caso de vacinas de subunidades fracamente imunogênicas. Semelhante às infecções naturais por patógenos, os adjuvantes contam com a ativa- ção do sistema imunológico inato para promover imunidade adaptativa duradoura.

[003] O Sistema Adjuvante 01 (AS01) é um adjuvante à base de lipossomos que contém dois imunoestimulantes, o 3-O-desacil-4'- monofosforil lipídeo A (3D-MPL) e o QS-21 (Garcon and Van Meche- len, 2011; Didierlaurent et al., 2017). O 3D-MPL é um derivado não tóxico do lipopolissacarídeo de Salmonella minnesota, que é um ago- nista do TLR4) e o QS-21 é um extrato natural de saponina da casca da árvore da América do Sul Quillaja saponaria Molina (Kensil et al., 1991; Ragupathi et al., 2011). O AS01 está incluído nas vacinas recen- temente desenvolvidas para malária (RTS,S - Mosquirix®) e Herpes zoster (HZ/su - Shingrix®), e em várias vacinas candidatas em desen- volvimento contra patógenos tais como o vírus da imunodeficiência humana e Mycobacterium tuberculosis.

[004] A injeção de AS01 resulta na ativação rápida e transitória da imunidade inata em modelos animais. Neutrófilos e monócitos são rapidamente recrutados para os gânglios linfáticos de drenagem (dLN) após a imunização. Além do mais, o AS01 induz o recrutamento e a ativação de células dendríticas MHCIIelevadas (DC), que são necessárias para a ativação das células T (Didierlaurent A.M. et al., 2014). Alguns dados também estão disponíveis sobre o mecanismo de ação dos componentes do AS01. Os sinais de 3D-MPL por meio do TLR4, que estimulam a atividade de transcrição de NF-ĸB e a produção de citoci- nas, ativam diretamente as células apresentadoras de antígenos (APCs), tanto em seres humanos quanto em camundongos (De Bec- ker et al., 2000; Ismaili et al., 2002; Martin et al., 2003; Mata-Haro et al., 2007). O QS-21 promove altas respostas de anticorpos específicos do antígeno e respostas de células T CD8+ em camundongos (Kensil and Kammer, 1998; Newman et al., 1992; Soltysik et al., 1995) e res- postas de anticorpos específicos do antígeno em seres humanos (Li- vingston et al., 1994). Devido às suas propriedades físicas, acredita-se que o QS-21 possa atuar como um sinal de perigo in vivo (Lambrecht et al., 2009; Li et al., 2008). Embora o QS-21 tenha demonstrado ativar o inflamassoma ASC-NLRP3 e a subsequente liberação de IL-1β/IL-18 (Marty-Roix, R. et al., 2016), as vias moleculares exatas envolvidas no efeito adjuvante das saponinas ainda devem ser claramente definidas.

[005] Como em qualquer componente de um produto aprovado como um medicamento humano, a produção de QS-21 requer o uso de processos de fabricação aprovados e controle cuidadoso da com- posição final para garantir que ele atenda às especificações exigidas. A modificação dos processos existentes requer a revalidação dispen- diosa e demorada, mas os desvios das especificações também resul- tam em desperdício. Há uma necessidade contínua de métodos robus- tos para a fabricação de QS-21 e para o material QS-21 de composi- ção definida.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[006] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina contendo pelo menos o pico principal de QS-21 e o componente 2018, em que a re- lação do componente 2018/pico principal de QS-21 é ≤ 0,075, como medido pela absorvência de UV em 214 nm.

[007] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina contendo QS-21AV1 , QS-21AV2 , componente 1856:

e componente 2002: (coletivamente referido como componentes do pico principal de QS- 21), e componente 2018:

O O O O O OH O OH OH O HO O HO O O O O HO O HO O OH HO OH O O OH H O O O OH OH OH O HO O HO O O OH HO OH OH OH HO HO

OH , em que a relação do componente 2018/componentes do pico principal de QS-21 é ≤ 0,075, como medido pela absorvência de UV em 214 nm.

[008] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a preparação de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, compreendendo as seguintes etapas: a) selecionar o material de Quillaja saponaria Molina com um teor de componente 2018 apropriado, b) preparar um extrato aquoso do material sob condições em que a geração do componente 2018 é controlada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Cromatograma de HPLC de um extrato aquoso bruto da cas- ca de Quillaja saponaria Molina Figura 2: Cromatograma de HPLC-UV de um extrato aquoso bruto da casca de Quillaja saponaria Molina Figura 3: Cromatograma de UPLC-UV de um extrato aquoso bruto da casca de Quillaja saponaria Molina Figura 4: Tabulação das condições experimentais e do impacto obser- vado sobre a relação do pico principal de componente 2018/QS-21 Figura 5: Gráfico de superfície do impacto observado sobre a relação do pico principal de componente 2018/QS-21 que surge das condições de pH e temperatura Figura 6: Impacto da temperatura na relação do pico principal de com- ponente 2018 para QS-21 ao longo do tempo em pH 3,8

DESCRIÇÃO DETALHADA

[009] Como mencionado precedentemente, qualquer componente de um produto que está autorizado como um medicamento humano requer o uso de processos de fabricação aprovados e controle cuida- doso da composição final para garantir que ele atenda às especifica- ções exigidas. Desvios da especificação resultam em desperdício. No entanto, a investigação de segurança e eficácia conta com o teste de composições definidas, portanto, a adaptação das especificações dos componentes apresenta riscos. A modificação dos processos existen- tes requer uma revalidação dispendiosa e demorada.

[0010] Os presentes inventores descobriram que os extratos aquosos brutos de Quillaja saponaria Molina variam na composição, em particular no que diz respeito a um componente no presente do- cumento referido como o componente 2018, e que fica difícil separar o componente 2018 em excesso mediante a aplicação dos processos de fabricação aprovados existentes. Consequentemente, a presente in- venção fornece métodos para alcançar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina de uma composição definida, adequado para a preparação de extratos purificados consistentes após processamen- to adicional.

[0011] A variação na composição pode ser devida a desvios natu- rais no material de origem e/ou devido às condições aplicadas quando se extrai as saponinas para obter o extrato aquoso bruto.

[0012] Os inventores desenvolveram um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina de composição definida, em particular em termos do teor de componente 2018 em comparação com o teor de componentes de interesse principal. O referido extrato aquoso bruto vantajosamente fornece um material de partida adequado com o qual se obtém um extrato de saponina purificado que é particularmente adequado para uso como imunoestimulante, fornecendo uma resposta imune eficiente e um nível aceitável de reatogenicidade quando formu- lado com um antígeno e administrado a um indivíduo.

[0013] Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore da América do Sul Quillaja saponaria Molina e foi descrita pela primeira vez como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254). As frações purificadas de Quil A foram isoladas por HPLC que retêm a atividade adjuvante sem a toxi-

cidade associada ao Quil A (ver, por exemplo, EP0362279). Várias frações foram observadas de possuir atividade adjuvante, tais como QS-7, QS-17, QS-18 e QS-21, embora sua toxicidade varie considera- velmente.

[0014] O termo "extrato de saponina" como usado nesta invenção, significa um extrato de Quillaja saponaria Molina.

[0015] O termo "glicosídeos triterpenóides" como no presente do- cumento usado, significa uma entidade ou entidades tendo um núcleo triterpenóide derivado de açúcares que são ligados por meio de liga- ções glicosídicas.

[0016] O termo 'componente 2018' significa os glicosídeos triter- penóides identificados como '2018' na Figura 3. Adequadamente, o componente 2018 nos métodos de UPLC-UV no presente documento descritos pode ser identificado com um tempo de retenção de aproxi- madamente 5,8 min, e o componente primário do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 2017.9. O componente 2018 primário foi identificado como tendo a estrutura putativa

OH por MS/MS.

[0017] O termo 'componente 1988' significa os glicosídeos triter- penóides identificados como parte do pico principal de QS-21 na Figu- ra 3 e tendo um peso molecular monoisotópico de 1987,9. O compo- nente 1988 pode consistir em QS-21A V1:

e QS-21A V2 .

[0018] O termo "componente 1856" significa os glicosídeos triter- penóides identificados como parte do pico principal de QS-21 na Figu- ra 3 e tendo um peso molecular monoisotópico de 1855,9. O compo- nente 1856 pode consistir em: .

[0019] O termo 'componente 2002' significa os glicosídeos triter- penóides identificados como parte do pico principal de QS-21 na Figu-

ra 3 e tendo um peso molecular monoisotópico de 2001,9. O compo- nente 2002 foi identificado como tendo a estrutura putativa: por MS/MS.

[0020] As limitações da técnica MS/MS na diferenciação de certas espécies de açúcar ramificado, estereoquímico e isomérico (por exemplo, apiose e xilose) significa que algumas estruturas são putati- vas e baseadas em um núcleo conservado presumido. Estruturas pu- tativas devem, portanto, ser consideradas de significar a estrutura real da entidade que foi identificada de outra forma, no caso em que a es- trutura putativa esteja incorreta.

[0021] Os pesos moleculares monoisotópicos são determinados por espectrometria de massa por electrospray de íons negativos.

[0022] O termo 'pico principal de QS-21' significa os glicosídeos triterpenóides identificados como 'QS-21' e 'QS-21 Main' na Figura 2 ou na Figura 3, respectivamente. Adequadamente, o QS-21 possui os principais componentes de peso molecular de 1855,9, 1987,9 e 2001,9 m/z. O pico principal de QS-21 pode consistir principalmente em QS- 21A V1: ,

QS-21A V2: , componente 1856: e componente 2002: .

[0023] O termo 'pico precedente' significa o pico imediatamente precedente ao pico principal de QS-21 nos métodos de HPLC-UV no presente documento descritos (ver a Figura 2).

[0024] O termo "seco" significa que substancialmente todo o sol- vente foi removido. Um extrato seco tipicamente conterá menos do que 5% de solvente em peso (tal como menos do que 5% de água em peso). Adequadamente, o extrato seco conterá 100 ppm ou menos de acetonitrila (p/p).

[0025] O extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é obti- do através da extração aquosa (mas não precisa estar na forma aquo- sa, por exemplo, pode ter sido subsequentemente seco, sujeito à troca de solvente ou reconstituído em um solvente diferente).

[0026] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina contendo pelo me- nos o pico principal de QS-21 e o componente 2018, em que a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 é ≤ 0,075, como medido pela absorvência de UV em 214 nm. Adequadamente, a relação do componente 2018/pico principal de QS-21 é ≤ 0,064, como medida pe- la absorvência de UV em 214 nm. Desejavelmente, a relação do com- ponente 2018/pico principal de QS-21 é de pelo menos 0,005, tal como pelo menos 0,01, como medido pela absorvência de UV em 214 nm.

[0027] Adequadamente, a relação do pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,45 ou inferior, em particular 0,4 ou inferior (como determinado pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm). A re- lação do pico precedente para o pico principal de QS-21 pode ser 0,05 ou superior, em particular 0,1 ou superior (como determinado pela ab- sorvência de HPLC-UV em 214 nm).

[0028] Tipicamente, o extrato bruto é um extrato da casca de Quil- laja saponaria Molina. Em conformidade, adequadamente o extrato bruto é obtido a partir da casca de Quillaja saponaria Molina.

[0029] Adequadamente, o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, especialmente pelo menos 2,5 g/L e, em particular, pelo menos 2,8 g/L (por exemplo, co- mo determinado pela absorvência de UV em relação à amostra de controle de concentração conhecida).

[0030] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina contendo: QS-21AV1

, QS-21AV2

, componente 1856:

e componente 2002:

(coletivamente referido como componentes do pico principal de QS- 21), e componente 2018:

OH , em que a relação de componentes 2018/componentes do pico princi- pal de QS-21 é ≤ 0,075, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

[0031] Adequadamente, a relação de componente 2018/componentes do pico principal de QS-21 é ≤ 0,064, como medida pela absorvência de UV em 214 nm. Desejavelmente, a relação de componente 2018/componentes do pico principal de QS-21 é de pelo menos 0,005, tal como pelo menos 0,01, como medido pela absorvên- cia de UV em 214 nm.

[0032] Adequadamente, a relação do pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,45 ou menos, em particular 0,4 ou menos (como determinado pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm). A re-

lação do pico precedente para o pico principal de QS-21 pode ser 0,05 ou maior, em particular 0,1 ou maior (como determinado pela absor- vência de HPLC-UV em 214 nm).

[0033] Tipicamente, o extrato bruto é um extrato de casca de Quil- laja saponaria Molina. Em conformidade, adequadamente o extrato aquoso bruto da invenção é obtido a partir da casca de Quillaja sapo- naria Molina.

[0034] Adequadamente, o teor do pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, especialmente pelo menos 2,5 g/L e, em particular, pelo menos 2,8 g/L (por exemplo, co- mo determinado pela absorvência de UV em relação a uma amostra de controle de concentração conhecida). Extração de saponina

[0035] Em um terceiro aspecto, é fornecido um método para a preparação de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, que compreende as seguintes etapas: a) selecionar o material de Quillaja saponaria Molina tendo um teor de componente 2018 apropriado, b) preparar um extrato aquoso do material sob condições em que a geração de componente 2018 é controlada.

[0036] Adequadamente, o material de Quillaja saponaria Molina é a casca de Quillaja saponaria Molina.

[0037] Tipicamente, antes da extração, as matérias vegetais de Quillaja saponaria Molina são secadas e moídas. As matérias vegetais colhidas podem ser deixadas secar naturalmente e/ou são secadas parcial ou totalmente por estarem submetidas ao calor. Adequadamen- te, quando submetida ao aquecimento, a temperatura de secagem es- tá na faixa de 30 a 100 °C, tal como ao redor de 80 °C, e pode durar algumas horas até 8 horas. Assim que secas, a matérias vegetais são moídas.

[0038] Qualquer processo de extração aquosa pode ser aplicado para obter um extrato aquoso bruto de saponina de Quillaja saponaria Molina, de acordo com a invenção. O solvente usado para extração será substancialmente água, mas pode incluir pequenas quantidades de outros materiais. O solvente tipicamente consistirá essencialmente em água, desejavelmente o solvente será a água. A extração pode ocorrer em etapas sucessivas e ser executada em uma temperatura que varia de 50 °C a 80 °C e pode durar algumas horas a 20 horas, tal como de 2 a 20 horas. Os extratos brutos de saponina tipicamente compreendem uma mistura de espécies de saponina e compostos não saponínicos, tais como açúcares, sais, polifenóis (taninos), sólidos em suspensão e outros compostos de peso molecular mais baixo. Antes da separação dos diferentes componentes a fim de alcançar um extra- to de saponina purificado tendo um perfil de saponina desejado, tipi- camente por uma série de diferentes etapas de purificação cromato- gráfica, os extratos brutos de saponina podem ser submetidos à clarifi- cação para remover impurezas feitas de compostos que não são sa- ponina. Adequadamente, os adsorventes poliméricos, tais como polivi- nilpolipirrolidona (PVPP), conhecidos por polifenóis complexos, e/ou materiais derivados de argila, tais como bentonita, podem ser adicio- nados aos extratos brutos de saponina. Os extratos brutos de saponi- na podem ser adicionalmente concentrados, por exemplo, através da nanofiltração ou ultrafiltração. A fim de obter extratos brutos de sapo- nina tendo uma vida útil mais longa, os referidos extratos também po- dem ser pasteurizados, usando alta temperatura, tal como variando de 40 °C a 95 °C, adequadamente de 60 °C a 90 °C, especialmente ao redor de 86 °C. A pasteurização adequada é executada durante 10 minutos a 1 hora, mais adequadamente de 40 a 50 minutos. Agentes antimicrobianos podem ser usados. Um exemplo de um agente antimi-

crobiano é um agente antibacteriano, tal como benzoato de sódio. Um conservante também pode ser usado. Adequadamente, o extrato aquoso bruto é substancialmente estéril e, mais adequadamente, esté- ril.

[0039] Adequadamente, a etapa a) de seleção do material de Quil- laja saponaria Molina tendo um teor de componente 2018 apropriado compreende o teste do teor de componente 2018 do material de Quil- laja saponaria Molina e/ou a determinação do teor de componente 2018 que seria obtido durante a extração aquosa da Quillaja saponaria Molina. Tipicamente, a etapa de determinar o teor de componente 2018 que seria obtido durante a extração aquosa da Quillaja saponaria Molina compreende a execução de uma extração em pequena escala e a determinação do teor de componente 2018 no extrato resultante. Adequadamente, a extração em pequena escala é executada com menos de 500 g, tal como menos de 50 g, de material de Quillaja sa- ponaria Molina.

[0040] Apropriadamente, a etapa b) é executada em pelo menos 25 kg, tal como de 50 a 500 kg, tal como de 100 a 400 kg e, em parti- cular, de 200 a 300 kg de material de Quillaja saponaria Molina.

[0041] Enquanto se desenvolvia um processo adequado para a preparação de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina de acordo com a invenção, os presentes inventores observaram que o pH ao longo do processo, em combinação com alta temperatura, tal como na pasteurização, deve ser monitorado e controlado de perto. Em particular, os inventores observaram que a combinação de pH bai- xo com alta temperatura pode influenciar a estabilidade das saponinas e, assim, afetar o perfil da saponina de um extrato sendo processado, enquanto que a alta temperatura por si só, apenas desencadeou um impacto limitado. Portanto, é necessário alcançar um equilíbrio entre o pH e a temperatura ao se preparar um extrato bruto de saponina, de-

pendendo do perfil de saponina desejado. Em particular, os presentes inventores observaram que a relação do componente 2018/pico princi- pal de QS-21 aumenta quando uma alta temperatura é combinada com um pH baixo. Portanto, quando se usa alta temperatura, tal como durante a pasteurização, em combinação com um pH baixo, tal como quando se usa um conservante como benzoato de sódio, o tempo gas- to na alta temperatura deve ser limitado na máxima extensão possível. Por exemplo, para alcançar rapidamente a temperatura de pasteuriza- ção, um trocador térmico pode ser usado e/ou o extrato aquoso bruto pasteurizado de Quillaja saponaria Molina pode ser esfriado rapida- mente, por exemplo, através da imersão em água fria. Adequadamen- te, o extrato aquoso bruto possui um pH de 3 a 4,5, mais adequada- mente de 3,6 a 4,0. Teste de extrato aquoso bruto

[0042] Em um quarto aspecto da invenção, é fornecido um método para determinar a relação do componente 2018/pico principal de QS- 21 em um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, dito mé- todo compreendendo as etapas de: (i) determinar o teor de componente 2018 no extrato aquo- so bruto de Quillaja saponaria Molina através da absorvência de UPLC-UV em 214 nm; (ii) determinar o teor de pico principal de QS-21 no extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina através da absorvência de UPLC-UV em 214 nm; e (iii) comparar o teor de componente 2018 com o teor de pi- co principal de QS-21 para determinar a relação de componente de 2018/pico principal de QS-21.

[0043] Em um quinto aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina para uso na fabricação de um extrato de saponina purificado, dito mé-

todo compreendendo as etapas de: (i) determinar a relação de 2018/pico principal de QS-21 através da absorvência de UPLC-UV em 214 nm; e (ii) selecionar um extrato aquoso bruto tendo uma relação de componente 2018/pico principal de QS-21 que é ≤ 0,075.

[0044] Em uma modalidade, o extrato aquoso bruto selecionado na etapa (ii) possui uma relação de componente 2018/pico principal de QS-21 que é ≤ 0,064.

[0045] A invenção será ainda descrita por referência aos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1: Métodos analíticos HPLC-UV Equipamento Módulo de separações Waters Alliance 2690/2695 Waters 2487 Detector UV ou 2996 PDA Detector Coluna Vydac Protein C4 4,6 x 250 mm 5 μm Fase Móvel A (MPA) - ácido trifluoroacético a 0,15% em água/acetonitrila (70:30 v/v) Fase Móvel B (MPB) - ácido trifluoroacético a 0,15% em acetonitrila Condições de gradiente linear: Tempo Taxa de vazão (ml/min) %MPA %MPB 0 1 100 0 30 1 78,6 21,4 33 1 14,3 85,7 10 µl da amostra são injetados. A detecção de UV é ajustada em 214 nM.

[0046] Usando uma injeção em branco como referência, a integra- ção de picos no cromatograma fornece uma absorvência total. O pico de interesse (por exemplo, pico principal de QS-21) é comparado à absorvência total para determinar o teor máximo como uma porcenta- gem.

UPLC-UV Equipamento Waters Acquity UPLC Waters Acquity Tunable UV Detector Coluna Waters Acquity BEH C18 2,1 x 100 mm 1,7 μm Fase Móvel A (MPA) - ácido acético a 0,025% em água/acetonitrila (70:30 v/v) Fase Móvel B (MPB) - ácido trifluoroacético a 0,025% em água/acetonitrila (30:70 v/v) Condições de gradiente linear: Tempo Taxa de vazão (ml/min) %MPA %MPB 0 0,5 88 12 10,2 0,5 65,7 34,3 11,2 0,5 10 90 13,2 0,5 10 90 Temperatura de coluna 28 graus C. 10 µl da amostra são injetados. A detecção de UV é ajustada em 214 nM.

[0047] Usando uma injeção em branco como referência, a integra- ção de picos no cromatograma fornece uma absorvência total. O pico de interesse (por exemplo, pico principal de QS-21) é comparado à absorvência total para determinar o teor máximo como uma porcenta- gem. EXEMPLO 2: Extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina

[0048] Um extrato aquoso bruto de casca foi separado por HPLC de fase inversa usando uma coluna C4 e eluição gradiente: fase móvel A - água/acetonitrila, 7/3 v/v com ácido trifluoroacético a 0,15%; fase móvel B - acetonitrila com ácido trifluoroacético a 0,15%. A detecção de UV foi em 214 nm.

[0049] As amostras de extrato aquoso bruto de casca são diluídas como necessário com água purificada. PVPP (60 mg/ml) foi adiciona- da, a mistura foi agitada durante aproximadamente 30 minutos e de-

pois centrifugada para separar a resina de PVPP do sobrenadante.

[0050] O sobrenadante foi então analisado para fornecer um cro- matograma de HPLC-UV.

[0051] A Figura 1 fornece um exemplo representativo de um cro- matograma de HPLC-UV. O pico correspondente à fração QS-21 é in- dicado. EXEMPLO 3: UPLC-UV de um extrato aquoso de casca de saponina em bruto da árvore de Quillaja saponaria Molina

[0052] Uma amostra de extrato aquoso bruto de casca de Quillaja saponaria Molina foi analisada pelos métodos de HPLC-UV e UPLC- UV descritos no Exemplo 1.

[0053] A Figura 2 fornece os resultados da HPLC-UV e a Figura 3 fornece os resultados da UPLC-UV.

[0054] Através da determinação da área máxima para os compo- nentes particulares (pico principal de QS-21, componente 2018 ou pico precedente), é possível calcular as relações dos componentes no ex- trato bruto. EXEMPLO 4: Efeito do pH e da temperatura na relação de componen- te 2018/QS-21

[0055] Várias amostras de extrato aquoso bruto de Quillaja sapo- naria Molina foram preparadas de acordo com os métodos no presente documento descritos. Em cada ocasião, a temperatura, o pH ou a quantidade de benzoato de sódio variaram durante a fase de pasteuri- zação e a alteração na relação de componente 2018/pico principal de QS-21 foi medida após 3 horas. Os resultados são fornecidos na Figu- ra 4. O impacto da variação de pH e temperatura é representado grafi- camente na Figura 5. O impacto de diferentes temperaturas ao longo do tempo em pH constante de 3,8 é ilustrado na Figura 6.

[0056] Observou-se que a temperatura era diretamente proporcio- nal à relação de componente 2018/pico principal de QS-21, exceto a

40 °C ou abaixo durante este intervalo de 3 horas testado, em que a relação não parece alterar independentemente das condições de pH ou benzoato de sódio. Verificou-se que o pH era inversamente propor- cional à relação de componente 2018/pico principal de QS-21, especi- almente em pHs mais baixos.

[0057] O benzoato de sódio teve apenas um efeito secundário so- bre a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 em tempe- raturas elevadas.

[0058] Em resumo, observou-se que a variação de pH e a tempe- ratura teve um impacto substancial na relação de componente 2018/pico principal de QS-21, com temperaturas mais elevadas e pH mais baixo aumentando a relação.

[0059] Consequentemente, para obter um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina com níveis adequados de componente 2018, uma seleção cuidadosa da matéria-prima de Quillaja saponaria Molina e processamento de maneira a limitar a geração excessiva de compo- nentes 2018 é necessária. EXEMPLO 5: Produção em grande escala de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo composição definida de componente 2018 Seleção da casca

[0060] Lotes de amostra de aproximadamente 37 g foram retirados de uma extensão de bateladas de material de casca de Quillaja sapo- naria Molina. As amostras foram separadamente submetidas à extra- ção aquosa ao redor de 65 °C durante aproximadamente 5 horas. O extrato foi tratado com PVPP, filtrado e concentrado. O pH foi ajustado para 3,9 antes da adição de benzoato de sódio (0,1%) e a pasteuriza- ção foi executada a 86 °C durante 45 minutos.

[0061] O teor de componente 2018 (usando UPLC-UV) e de pico precedente (usando HPLC-UV) foi então determinado. Com base nos resultados, bateladas de material de casca de Quillaja saponaria Moli- na foram selecionadas para uso na extração em escala natural.

[0062] Embora as bateladas individuais possam não atender à es- pecificação alvo, para maximizar o rendimento, é possível combinar bateladas individuais que estão fora da especificação alvo com outras bateladas (por exemplo, alto teor com baixo teor), de tal modo que uma média geral dentro da especificação alvo seja alcançada. Extração principal

[0063] Aproximadamente 280 kg de material decasca de Quillaja saponaria Molina selecionado com relação ao teor de componente 2018 foram submetidos à extração aquosa ao redor de 70 °C durante pelo menos 2 horas. Após a extração, o pH foi ajustado para 3,8. O extrato foi tratado com PVPP, filtrado e concentrado. O pH foi verifica- do e ajustado novamente, se necessário, antes da adição de benzoato de sódio (0,1%) e pasteurização executada a 86 °C durante 45 minu- tos. O material pasteurizado foi rapidamente esfriado para minimizar o tempo em temperatura elevada, fornecendo assim uma solução de ex- trato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina.

[0064] O extrato aquoso bruto foi analisado por HPLC-UV (relação de pico precedente/pico principal de QS21) e UPLC-UV (relação de componente 2018/pico principal de QS21).

[0065] A seleção de casca e o controle de pH e exposição à tem- peratura garantiram que o extrato bruto da casca atendesse consisten- temente à especificação desejada. Na ausência de seleção de casca e controle de pH e exposição à temperatura, o extrato aquoso bruto fre- quentemente falhava em atender às especificações.

[0066] O uso do processo como descrito no Exemplo 5, pode con- sistentemente fornecer um extrato aquoso bruto de casca de Quillaja saponaria Molina tendo uma relação definida de componente 2018/pico principal de QS-21, tal como consistentemente ≤ 0,075, e apresentando um perfil cromatográfico comparável ao cromatograma mostrado na Fig. 3. Bibliografia Dalsgaard et al. 1974 “Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254. De Becker, G., V. Moulin, B. Pajak, C. Bruck, M. Francotte, C. Thiriart, J. Urbain, and M. Moser. 2000. The adjuvant monophos- phoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Inter- national immunology. 12:807-815. Didierlaurent A.M., Collignon C., Bourguignon P., Wouters S., Fierens K., Fochesato M., Dendouga N., Langlet C., Malissen B., Lambrecht B.N., Garcon N., Van Mechelen M., and S. Morel. 2014 Enhancement of Adaptive Immunity by the Human Vaccine Adjuvant AS01 Depends on Activated Dendritic Cells Journal of Immunology 193(4):1920-1930. Didierlaurent et al, 2017 Adjuvant system AS01: helping to overcome the challenges of modern vaccines Expert Reiews of Vacci- nes 16(1): 55-63. Garcon, N., and M. Van Mechelen. 2011. Recent clinical experience with vaccines using MPL- and QS-21-containing adjuvant systems. Expert review of vaccines. 10:471-486. Ismaili, J., J. Rennesson, E. Aksoy, J. Vekemans, B. Vin- cart, Z. Amraoui, F. Van Laethem, M. Goldman, and P.M. Dubois.

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Kensil. 1995. Structure/function studies of QS-21 adjuvant: assessment of triterpene aldehyde and glucuronic acid roles in adjuvant function.

Vaccine. 13:1403-1410.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina con- tendo pelo menos o pico principal de QS-21 e o componente 2018, ca- racterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/pico prin- cipal de QS-21 é ≤ 0,075, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

2. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 é ≤ 0,064, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

3. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 é de pelo menos 0,005, como medida pela absor- vência de UV em 214 nm.

4. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 é de pelo menos 0,01, como medida pela absor- vência de UV em 214 nm.

5. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,45 ou menos, como determinado pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm.

6. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,4 ou menos, como determinado pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm.

7. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,05 ou maior, como determinado pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm.

8. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,1 ou maior, como determinado pela ab- sorvência de HPLC-UV em 214 nm.

9. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 1 g/L.

10. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 2 g/L.

11. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 2,5 g/L.

12. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 2,8 g/L.

13. Extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, con- tendo: QS-21AV1 ,

QS-21AV2

, componente 1856:

e componente 2002:

(coletivamente referido como componentes de pico principal de QS- 21), e componente 2018:

O O

O

O O

OH O OH

OH O

HO O HO O

O O O

HO O HO O OH

HO OH O O

OH H

O

O O OH OH OH

O HO O

HO O O

OH HO

OH

HO HO

OH , caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 é ≤ 0,075, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

14. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/componentes de pico principal de QS-21 é ≤ 0,064, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

15. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/componentes de pico principal de QS-21 é de pelo menos 0,005, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

16. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a relação de componente 2018/componentes de pico principal de QS-21 é de pelo menos 0,01, como medida pela absorvência de UV em 214 nm.

17. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,45 ou menos, como determinada pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm.

18. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,4 ou menos, como determinada pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm.

19. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,05 ou maior, como determinada pela absorvência de HPLC-UV em 214 nm.

20. Extrato aquoso em bruto de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a relação de pico precedente para o pico principal de QS-21 é de 0,1 ou maior, como determinada pela ab- sorvência de HPLC-UV em 214 nm.

21. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 1 g/L.

22. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 2 g/L.

23. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 2,5 g/L.

24. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é de pelo menos 2,8 g/L.

25. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é obtido da casca de Quillaja saponaria Molina.

26. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto é pasteurizado.

27. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto é substancialmente estéril, em particular, estéril.

28. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto compreende um agente antimicrobiano, tal como um agente an- tibacteriano.

29. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o agente antimicrobiano é benzoato de sódio.

30. Extrato aquoso bruto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto possui um pH de 3,0 a 4,5.

31. Extrato aquoso bruto de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto possui um pH de 3,6 a 4,0.

32. Método para a preparação de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, caracterizado pelo fato de que compre- ende as seguintes etapas: a) selecionar o material de Quillaja saponaria Molina tendo um teor de componente 2018 apropriado, b) preparar um extrato aquoso do material sob condições em que a geração de componente 2018 é controlada.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que a etapa a) de selecionar o material de Quillaja sa- ponaria Molina tendo um teor de componente 2018 apropriado com- preende o teste do teor de componente 2018 do material de Quillaja saponaria Molina.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que a etapa a) de selecionar o material de Quillaja sa-

ponaria Molina tendo um teor de componente 2018 apropriado com- preende a determinação do teor de componente 2018 que seria obtido durante a extração aquosa da Quillaja saponaria Molina.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que a etapa a) de determinar o teor de componente 2018 que seria obtido durante a extração aquosa da Quillaja saponaria Molina compreende a execução de uma extração em pequena escala e a determinação do teor de componente 2018 no extrato resultante.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que a extração em pequena escala é executada em menos do que 500 g, tal como menos de 50 g, de material de Quillaja saponaria Molina.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 36, caracterizado pelo fato de que a etapa b) é executada em pelo menos 25 kg, tal como de 50 a 500 kg de material de Quillaja saponaria Molina.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que a etapa b) é executada em 100 a 400 kg de mate- rial de Quillaja saponaria Molina.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracteriza- do pelo fato de que a etapa b) é executada em 200 a 300 kg de mate- rial de Quillaja saponaria Molina.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 39, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é tratado com polivinilpolipirrolidona (PVPP).

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que o pH do extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é mantido dentro de uma faixa de pH durante o tratamento com PVPP.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 32 a 41, caracterizado pelo fato de que o método compreende a etapa c) adicional de pasteurizar o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que a pasteurização é executada em 40 a 95 °C.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que a pasteurização é executada em 60 a 90 °C.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a pasteurização é executada ao redor de 86 °C.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 45, caracterizado pelo fato de que o pH do extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é mantido dentro de uma faixa de pH durante a pasteurização.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 46, caracterizado pelo fato de que um agente antimicrobia- no, tal como um agente antibacteriano, é adicionado ao extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina antes da pasteurização.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 47, caracterizado pelo fato de que a pasteurização é execu- tada durante 10 minutos a 1 hora.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que a pasteurização é executada durante 40 a 50 mi- nutos.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 49, caracterizado pelo fato de que, após a pasteurização, o extrato bruto é ativamente esfriado.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 50, caracterizado pelo fato de que, após a pasteurização, o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é filtrado.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracteriza-

do pelo fato de que o pH do extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é mantido dentro de uma faixa de pH durante a filtração.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 52, caracterizado pelo fato de que, após a pasteurização, o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é concentrado.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o pH do extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é mantido dentro de uma faixa de pH durante a concentração.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 41 a 54, caracterizado pelo fato de que a faixa de pH é de 3,0 a 4,5.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que a faixa de pH é de 3,6 a 4,0.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 56, caracterizado pelo fato de que o material de Quillaja sa- ponaria Molina é a casca de Quillaja saponaria Molina.

58. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 57, caracterizado pelo fato de que é para a preparação do extrato aquoso bruto como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 31.

59. Método para a determinação da relação de componente 2018/pico principal de QS-21 em um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, caracterizado pelo fato de que o método compreen- de as etapas de: (i) determinar o teor de componente 2018 no extrato aquo- so bruto de Quillaja saponaria Molina através da absorvência de UPLC-UV em 214 nm; (ii) determinar o teor de pico principal de QS-21 no extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina através da absorvência de UPLC-UV em 214 nm; e

(iii) comparar o teor de componente 2018 com o teor de pi- co principal de QS-21 para determinar a relação de componente de 2018/pico principal de QS-21.

60. Método para a identificação de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina para uso na fabricação de um extrato de saponina purificado, caracterizado pelo fato de o método compreender as etapas de: (i) determinar a relação de componente 2018/pico principal de QS-21 através da absorvência de UPLC-UV em 214 nm; e (ii) selecionar um extrato aquoso bruto tendo uma relação de componente 2018/pico principal de QS-21 que é ≤ 0,075.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o extrato aquoso bruto selecionado na etapa (ii) possui uma relação de componente 2018/pico principal de QS-21 que é ≤ 0,064.