CN103533953A

CN103533953A - 针对肺炎链球菌的疫苗

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Publication number: CN103533953A
Application number: CN201280023465.8A
Authority: CN
Inventors: P.德内尔; J.波尔曼; V.弗兰特; H.瓦莱马克
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2014-01-22
Also published as: EP2709658A1; US20140072622A1; KR20140033127A; CA2834834A1; SG194733A1; EA201391456A1; JP2014515035A; MX339058B; AU2012257771C1; TW201309327A; WO2012156391A1; AR086405A1; UY34073A; AU2012257771B2; ZA201308537B; AU2012257771A1; MX2013013444A; BR112013029514A2; IL229051A0

Abstract

本发明涉及改善的免疫原性组合物和疫苗、用于制备它们的方法以及它们在医药中的用途。具体而言，本发明涉及选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）蛋白的免疫原性组合物，其包含含有QS21和单磷酰脂质A（MPL）的佐剂，并且以脂质体的形式存在。

Description

针对肺炎链球菌的疫苗

技术领域

本发明涉及改善的免疫原性组合物和疫苗、用于制备它们的方法以及它们在医药中的用途。具体而言，本发明涉及选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）蛋白的免疫原性组合物，其包含含有QS21和单磷酰脂质A（MPL）的佐剂，并且以脂质体的形式存在。

技术背景

肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia (S. pneumoniae)）也已知为肺炎球菌，是革兰氏阳性细菌。肺炎链球菌是全世界主要的公共健康问题，并且引起相当大的发病率和死亡率，尤其在婴儿、老年人和无免疫应答的人中。肺炎链球菌导致大范围的重要人类病理学，其包括群落获得性肺炎、急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窝组织炎和脑脓肿。每年仅在美国肺炎链球菌就被估计为3,000例脑膜炎、50,000例菌血症、500,000例肺炎和7,000,000例中耳炎的导致因素(Reichler, M. R.等, 1992, J. Infect. Dis. 166: 1346; Stool, S. E.和Field, M. J., 1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11)。在来自发达国家和发展中国家的年龄小于5岁的儿童中由于肺炎球菌疾病的死亡率尤其高。老年人、无免疫应答的和患有其他潜在状况（糖尿病、哮喘）的患者也对疾病特别易感。

由肺炎链球菌导致的主要临床综合征是在所有标准医学教科书中广泛认可并且讨论的(Fedson D S, Muscher D M. In: Plotkin S A, Orenstein W A, editors. Vaccines. 第4版. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588)。例如，将侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）定义为其中从血液或另一通常无菌部位中分离到肺炎链球菌的任何感染(Musher D M. Streptococcus pneumoniae.In Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (编辑).Principles and Practice of Infectious diseases (第5版).New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147)。

慢性阻塞性肺病是肺的慢性炎性疾病并且是全世界发病率和死亡率的主要原因。在2005年在美国大约20例死亡中有一例具有COPD作为潜在原因。(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。估计在2020年COPD将上升为失能调整生命年（disability adjusted life year）、慢性无效性疾病(chronic validating disease)的第五位导致原因以及死亡率的第三位最重要的原因(Lancet 349:1498-1504 (1997))。

COPD的过程表征为空气流动限制的渐进性恶化和肺功能的减退。COPD可以与常见的和复发的急性加重（AE）并发，其与巨大的健康护理费用和高发病率相关。(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554–564 (2007))。一个研究暗示COPD中大约50％的症状的急性加重是由非典型性流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）导致。(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。流感嗜血杆菌发现于20-30%的COPD加重中；肺炎链球菌发现于10-15%的COPD加重中；以及粘膜炎莫拉菌发现于10-15%的COPD加重中。(New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008))。已显示流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和粘膜炎莫拉菌是在香港、韩国和菲律宾的支气管炎的急性加重中的原发性病原体，而克雷伯氏菌属种（Klebsiella spp.）、铜绿假单胞菌和不动杆菌属种（Acinetobacter spp.）构成了在包括印度尼西亚、泰国、马来西亚和台湾的其他亚洲国家/地区的大部分病原体(Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。在孟加拉国，20％的患有COPD的患者显示对假单胞菌属（Pseudomonas）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的阳性痰培养，而65％的患有AECOPD的患者显示出对假单胞菌属、克雷伯氏菌属、不动杆菌属（Acinetobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、粘膜炎莫拉菌及其组合的阳性培养。(Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010))。然而，已经表明预防COPD加重的两种最重要的措施是主动免疫和药物疗法的慢性维持。(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554–564 (2007))。

尽管抗微生物药的来到已经降低了肺炎球菌疾病的总体死亡率，但肺炎链球菌的抗生素抗性菌株的出现是严重而快速增加的问题。因此开发针对肺炎链球菌的有效疫苗是重要的。有效的肺炎球菌疫苗可以对与肺炎链球菌疾病相关的发病率和死亡率具有主要影响。

本发明涉及以脂质体形式存在的非缀合的肺炎链球菌蛋白的免疫原性组合物。脂质体制剂在本领域是已知的，并且已经表明可用作佐剂组合物(WO96/33739, WO07/068907)。WO96/33739公开了含有抗原、来源于Quillaja Saponaria Molina的树皮的免疫活性级分诸如QS21和甾醇的某些疫苗，其可以以脂质体形式存在，以及用于制备脂质体的方法。WO07/068907公开了包含抗原或抗原制剂的某些免疫原性组合物，组合有包含以脂质体和脂多糖形式存在的来源于Quillaja Saponaria Molina的树皮的免疫活性皂苷级分的佐剂，其中所述皂苷级分和脂多糖均以如低于30μg的水平的人剂量存在。

然而，仍存在对改善的疫苗组合物的需求，尤其是将在老年人中和在幼儿中预防或改善肺炎球菌疾病中更有效的疫苗组合物。本发明提供了基于非缀合的肺炎链球菌蛋白和佐剂的具体组合的改善的疫苗。

发明陈述

本发明人已经发现组合有包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在的选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白的疫苗或免疫原性组合物具有有利的特性。已经发现非缀合的肺炎链球菌蛋白和佐剂的该组合提供增强的免疫原性应答。

因此，在本发明的第一方面，提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。

在本发明的另一方面，提供疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。

在本发明的进一步的方面，提供治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的方法，其包括向需要其的受试者肌内施用，包括向所述受试者施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。

在本发明的进一步的方面，提供免疫原性组合物在生产用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。

附图简述

图1：血液中总dPly特异性T细胞应答：AS03B相比于AS01B。在PIII（即在第三次免疫后）时表达任何细胞因子（IFN-g、IL-2、IL-17、IL-13）的T细胞。

图2：血液中总PhtD特异性T细胞应答：AS03B相比于AS01B。表达任何细胞因子（IFN-g、IL-2、IL-17、IL-13）的T细胞。

图3：dPly特异性Th1应答：AS03B相比于AS01B。表达IFNg的T细胞(Th1)。

图4：PhtD特异性Th1应答：AS03B相比于AS01B。表达IFNg的T细胞(Th1)。

图5：dPly特异性Th17应答：AS03B相比于AS01B PIII。

图6：PhtD特异性Th17应答AS03B相比于AS01B。

图7：AS01B相比于AS03B：抗体应答。图7a：PhtD剂量IgG总计。图7b：dPly剂量IgG总计。

图8：在致死攻击模型中AS01B和AS01E的评价。

图9：在肺建群模型中AS01B和AS01E的评价。

发明详述

本发明提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。肺炎链球菌蛋白是“非缀合的”，其表示蛋白没有与糖共价连接例如作为载体蛋白。

肺炎链球菌溶血素

在一方面，本发明提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物每人剂量包含3-90、3-20、20-40或40-70 μg (例如10、30或60 μg)非缀合的肺炎球菌的肺炎链球菌溶血素。

通过肺炎链球菌溶血素或“Ply”，它表示：来自于肺炎球菌的天然的或野生型肺炎链球菌溶血素、重组肺炎链球菌溶血素及其片段和/或变体。在一个实施方案中，肺炎链球菌溶血素是来自于肺炎球菌的天然的或野生型肺炎链球菌溶血素或重组肺炎链球菌溶血素。肺炎链球菌溶血素是发现于所有肺炎链球菌菌株中的53kDa硫羟活化的溶细胞素，其在自溶中释放并且促成肺炎链球菌的发病。它是高度保守的，在不同血清型的Ply蛋白之间仅存在几个氨基酸取代。肺炎链球菌溶血素是具有不同的溶细胞的（溶血的）和补体活化活性的多功能的毒素(Rubins et al., Am .Respi.Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996))。它的作用包括例如由人单核细胞产生的炎性细胞因子的刺激、人呼吸上皮上纤毛的拍打的抑制和杀菌活性的降低及中性粒细胞的迁移。肺炎链球菌溶血素最明显的作用是在红细胞的溶胞中，其涉及与胆固醇的结合。野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆是本领域已知的。例如，见Walker等(Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell 等(Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989)和Mitchell等(NAR, 18:4010 (1990))。WO2010/071986描述了野生型Ply, 例如SEQ ID 2-42 (例如SEQ ID 34、35、36、37、41)。在一方面，肺炎链球菌溶血素是WO2010/071986的Seq ID No. 34。在另一方面，肺炎链球菌溶血素是WO2010/071986的Seq ID No. 35。在另一方面，肺炎链球菌溶血素是WO2010/071986的Seq ID No. 36。在另一方面，肺炎链球菌溶血素是WO2010/071986的Seq ID No. 37。在另一方面，肺炎链球菌溶血素是WO2010/071986的Seq ID No. 41。此外，EP1601689B1描述了在去污剂和高盐存在的情况下通过层析纯化细菌溶细胞素诸如肺炎球菌肺炎链球菌溶血素的方法。

如本说明书中使用的术语“片段”是能够在宿主动物中引起体液和/或细胞免疫应答的部分。可以使用本领域已知的技术例如重组地、通过蛋白水解消化、或通过化学合成来产生蛋白的片段。可以通过从编码多肽的核酸的一端（对于末端片段）或两端（对于内部片段）去除一个或多个核苷酸来产生多肽的内部或末端片段。通常，片段包含全长序列的至少10、20、30、40或50个邻近的氨基酸。可以通过从N末端和C末端之一或两者中添加或去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个氨基酸来容易地修饰片段。

如本说明书中使用的术语“保守的氨基酸取代”包括用非天然残基取代天然氨基酸残基，从而使在那一位置上的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性几乎没有影响或没有影响，并且不导致降低的免疫原性。例如，这些可以是以下组中的取代：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。对多肽序列的保守氨基酸修饰（和对编码核苷酸的相应修饰）可以产生具有与亲本多肽的那些相似的功能和化学特征的多肽。

如本说明书中所用的术语“缺失”是从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任一位点上缺失不超过约1-6个残基（例如1-4个残基）。

如本说明书中所用的术语“插入”是在蛋白序列中添加一个或多个非天然氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任一位点上插入不超过约1-6个残基（例如1-4个残基）。

在一个实施方案中，本发明包括与野生型序列相比具有核酸或氨基酸序列中的差异的肺炎链球菌溶血素的片段和/或变体。在使用肺炎链球菌溶血素片段的位置，这些片段将是长度上至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个连续的氨基酸残基。在本发明的一个实施方案中，肺炎链球菌溶血素的免疫原性片段包含全长序列的至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个连续的氨基酸残基，其中所述多肽能够引起对所述氨基酸序列特异性的免疫应答。已知肺炎链球菌溶血素由四个主要结构域组成(Rossjohn等Cell.1997 May 30; 89(5):685-92)。这些结构域可以通过去除和/或修饰这些结构域的一个或多个来修饰。在一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少1个、2个或3个结构域。在另一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2个或3个结构域。在另一个实施方案中，所述片段或每一片段包含至少3个结构域。所述片段或每一片段可以是与野生型肺炎链球菌溶血素序列大于50、60、70、80、90或100%同一性的。

根据本发明，肺炎链球菌溶血素的变体包括与野生型序列相比其中一个或多个氨基酸被取代和/或缺失和/或插入的序列。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、插入或其任何组合可以在单一变体中组合，只要该变体是免疫原性多肽。肺炎链球菌溶血素的变体通常包括任何肺炎链球菌溶血素或肺炎链球菌溶血素的任何片段，其与野生型肺炎链球菌溶血素序列共享至少80、90、94、95、98或99%氨基酸序列同一性，例如来自WO2010/071986的SEQ ID 2-42(例如SEQ ID 34、35、36、37、41)。在一个实施方案中，肺炎链球菌溶血素的变体通常包括任何肺炎链球菌溶血素或肺炎链球菌溶血素的任何片段，其与来自WO2010/07198的SEQ ID 36共享至少80、90、94、95、98或99%的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，本发明包括片段和/或变体，其中几个、5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸以任何组合取代、缺失或添加。在另一个实施方案中，本发明包括包含B细胞或T细胞表位的片段和/或变体。此类表位可以使用2D结构预测例如使用PSIPRED程序(来自David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK)和基于由Jameson和Wolf描述的方法计算的抗原指数(CABIOS 4:181-186 [1988])的组合来预测。肺炎链球菌溶血素的变体例如描述于WO04/43376、WO05/108580、WO05/076696、WO10/071986、WO10/109325 (SEQ ID 44、45和46)和WO10/140119 (SEQ ID 50和51)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素的变体，例如，描述于WO05/108580、WO05/076696、WO10/071986中的那些。

在本发明的一个实施方案中，肺炎链球菌溶血素及其片段和/或其变体具有与肺炎链球菌溶血素的野生型序列共享至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列，例如来自WO2010/071986的SEQ ID 34、35、36、37、41。在本发明的另一个实施方案中，肺炎链球菌溶血素及其片段和/或其变体包含至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个连续的肺炎链球菌溶血素野生型序列的氨基酸残基。

肺炎链球菌溶血素通常在解毒（即当以适合于保护的剂量提供时对人表现为非毒性的）后施用。如本文所用，理解术语“dPly”指适合于医学用途的（即非毒性的）解毒的肺炎链球菌溶血素。肺炎链球菌溶血素可以化学解毒和/或遗传解毒。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含dPly。

可以通过化学方法例如使用交联剂诸如甲醛、戊二醛和含有N-羟基琥珀酰亚胺酯和/或马来酰亚胺基团（例如GMBS）或这些的组合的交联剂来完成肺炎链球菌溶血素的解毒作用。此类方法在本领域中对于多种毒素是熟知的，例如见EP1601689B1、WO04/081515、WO2006/032499。化学解毒作用中使用的肺炎链球菌溶血素可以是天然的或重组蛋白或已经遗传工程化以降低其毒性的蛋白（见下文）。肺炎链球菌溶血素的融合蛋白或肺炎链球菌溶血素的片段和/或变体还可以通过化学方法解毒。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含已经化学解毒例如通过甲醛处理的肺炎链球菌溶血素。

肺炎链球菌溶血素还可以是遗传解毒的。因此，本发明包含例如可以是突变的蛋白的肺炎球菌蛋白。本文使用的术语“突变的”表示已经例如通过使用用于位点定向诱变的众所周知的技术或任何其他常规方法进行一个或多个氨基酸（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸）的缺失、添加或取代的分子。在一个实施方案中，分子已经进行1-15个、合适的10-15氨基酸的缺失或取代。突变的序列可以去除不需要的活性诸如膜渗透、细胞溶解和针对人红细胞和其他细胞的溶细胞活性，以降低毒性，而保留在向人施用后诱导抗肺炎链球菌溶血素保护性的和/或中和抗体的能力。肺炎链球菌溶血素的融合蛋白或肺炎链球菌溶血素的片段和/或变体还可以通过遗传方法解毒。可以使用标准分子生物学和生物化学技术引入任何这些修饰。例如，如上文描述，可以改变突变体肺炎链球菌溶血素蛋白，从而使它是生物学失活的而同时仍保持它的免疫原性表位，例如见WO90/06951、Berry等(Infect Immun, 67:981-985 (1999))和WO99/03884。例如，肺炎链球菌溶血素蛋白可以通过包含T₆₅至C、G₂₉₃至C和C₂₄₈至A三个氨基酸取代来解毒。可以用于本发明中的遗传解毒的肺炎链球菌溶血素的另一个实例是来自WO2011/075823的SEQ ID 9。因此，在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含已经遗传解毒的肺炎链球菌溶血素。

可以使用技术的组合来将肺炎链球菌溶血素解毒。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含已经化学和遗传解毒的肺炎链球菌溶血素。

多组氨酸三联体家族蛋白

在另一个方面，本发明提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种选自：多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物每人剂量包含3-90、3-20、20-40或40-70 μg (例如10、30或60 μg)选自：多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白。

Pht (多组氨酸三联体, PhtX)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族表征为脂化序列、由富含脯氨酸区分隔的两个结构域和可能参与金属或核苷酸结合或酶活性的几个组氨酸三联体、（3-5个）卷曲螺旋区、保守的N末端和异质的C末端。

术语“多组氨酸三联体家族的一个或多个成员”包括全长多组氨酸三联体家族(Pht)蛋白、其片段或融合蛋白或免疫功能等价物。这些可以选自具有与WO00/37105或WO00/39299中公开的序列共享至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列的PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白。当使用Pht蛋白片段时（单独地或作为融合蛋白的部分），这些片段将是长度为至少约15个、至少约20个、至少约40个或至少约60个连续的例如来自WO00/37105或WO00/39299中的Pht氨基酸序列的氨基酸残基，其中所述多肽能够引起对WO00/37105或WO00/39299中的所述氨基酸序列特异性的免疫应答。在一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序（任选地，具有2个或更多个三联体之间的天然Pht序列、或与天然的肺炎球菌三联体内Pht序列为大于50、60、70、80、90或100％同一性的三联体内序列。在一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2个、3个或4个卷曲螺旋区。融合蛋白可以由2个、3个或4个PhtA、PhtB、PhtD、PhtE的全长或片段组成，例如PhtA/B、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/E、PhtE/A、PhtE/B、PhtA/D、PhtB/D、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E和PhtE/D，其中蛋白在N末端与第一个提及的连接（例如见WO01/98334）。

关于PhtX蛋白，公开于WO98/18930中的PhtA也指Sp36。它是来自多组氨酸三联体家族的蛋白并且具有II型信号基序。PhtB公开于WO00/37105，并且也指Sp036B。如WO00/17370中所公开，PhtB家族的另一成员是C3降解多肽。该蛋白也来自多组氨酸三联体家族的蛋白并且具有II型信号基序。免疫功能等价物是公开于WO98/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物（大约79kD）公开于WO99/15675，其也被认为是PhtX家族的成员。PhtE公开于WO00/30299，并且被称为BVH-3。

在一个实施方案中，选自多组氨酸三联体家族的一个或多个成员的肺炎链球菌蛋白是PhtD。如本文使用的术语“PhtD”包括附有信号序列的全长蛋白或信号肽（例如在N末端的20个氨基酸）去除的成熟全长蛋白、和其片段、变体和/或融合蛋白，例如WO00/37105的SEQ ID NO:4。PhtD也指“Sp036D”。在一方面，PhtD是附有信号序列的全长蛋白，例如WO00/37105的SEQ ID NO:4。在另一方面，PhtD是包含信号肽（例如在N末端的20个氨基酸）去除的成熟全长蛋白的序列，例如WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸21-838。适合地，PhtD序列包含N末端甲硫氨酸。本发明还包括PhtD多肽，其是PhtD的免疫原性片段、PhtD的变体和/或PhtD的融合蛋白。例如，如WO00/37105、WO00/39299、US6699703和WO09/12588中描述。

当使用PhtD蛋白片段时（单独地或作为融合蛋白的部分），这些片段将是长度为至少约15个、至少约20个、至少约40个或至少约60个连续的例如来自WO00/37105或WO00/39299中的PhtD氨基酸序列的氨基酸残基，诸如WO00/37105的SEQ ID NO:4。在本发明的一个实施方案中，PhtD蛋白的免疫原性片段包含至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个连续的WO00/37105的SEQ ID NO: 4中显示的序列的氨基酸残基，其中所述多肽能够引起对所述氨基酸序列特异性的免疫应答。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含例如描述于WO05/12601、WO05/98334、WO10/12588中的PhtD的片段。当使用PhtD蛋白片段时（单独地或作为融合蛋白的部分），每一片段任选包含此类多肽的一个或多个组氨酸三联体基序。组氨酸三联体基序是具有序列HxxHxH的多肽的部分，其中H为组氨酸并且x为组氨酸之外的氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序（任选地，具有2个或更多个三联体之间的天然PhtD序列、或三联体内序列），其中所述片段与天然的肺炎球菌三联体内PhtD序列（例如显示于WO00/37105的SEQ ID NO: 4的三联体内序列）为大于50、60、70、80、90或100％同一性的。PhtD蛋白的片段任选包含一个或多个此类多肽的卷曲螺旋区。卷曲螺旋区是通过“螺旋”算法预测的区域Lupus, A等(1991) Science 252; 1162-1164。在本发明的一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2个、3个或4个卷曲螺旋区。在本发明的一个实施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2个、3个或4个卷曲螺旋区，其中所述片段与天然的肺炎球菌PhtD序列（例如显示于WO00/37105的SEQ ID NO: 4中的序列）为大于50、60、70、80、90、95、96或100％同一性的。在本发明的另一个实施方案中，所述片段或每一片段包括一个或多个组氨酸三联体基序以及至少1个、2个、3个或4个卷曲螺旋区。

在其中PhtD多肽为变体的情况下，尽管一个或多个这些区域中可以形成变异，但变异通常在其组氨酸三联体残基和卷曲螺旋区之外的部分中。根据本发明，多肽变体包括与野生型序列相比其中一个或多个氨基酸被取代和/或缺失和/或插入的序列。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、插入或其任何组合可以在单一变体中组合，只要该变体是免疫原性多肽。PhtD的变体通常包括PhtD的任何片段或变体，其与野生型PhtD序列例如WO00/37105的SEQ ID NO:4共享至少80、90、95、96、98或99％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，本发明包括片段和/或变体，其中几个、5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸以任何组合取代、缺失或添加。在另一个实施方案中，本发明包括包含B细胞或T细胞表位的片段和/或变体。此类表位可以使用2D结构预测例如使用PSIPRED程序(来自David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK)和基于由Jameson和Wolf描述的方法计算的抗原指数(CABIOS 4:181-186 [1988])的组合来预测。可以通过常规分子生物学技术产生变体。本文使用的变体还可以包括来自于替代的链球菌菌株的天然产生的PhtD等位基因，其在同源PhtD基因内的一个或多个位点展示出多态性。

融合蛋白由PhtD和PhtA、PhtB和/或PhtE的全长或片段组成。融合蛋白的实例为PhtA/D、PhtB/D、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E和PhtE/D，其中所述蛋白在N末端与第一个提及的连接（例如见WO01/98334）。例如，可以通过重组技术或使用适合的接头将之前制备的多肽或活性片段融合来产生融合片段或融合多肽。

在本发明的一个实施方案中，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白包含与WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸序列21-838共享至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白具有与WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸序列21-838具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。适合地，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白包含具有N末端甲硫氨酸的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白包含至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个或至少约100个、或至少约200个、或至少约400个或至少约800个连续的显示于WO00/37105的SEQ ID NO:4中的序列的氨基酸残基。

在本发明的一个实施方案中，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白包含与WO00/39299的氨基酸序列SEQ ID NO:73具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白具有与WO00/39299的氨基酸序列SEQ ID NO:73具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，PhtD及其片段、变体和/或其融合蛋白包含至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个或至少约100个、或至少约200个、或至少约400个或至少约800个连续的显示于WO00/39299的SEQ ID NO:73中的序列的氨基酸残基。在本发明的另一个实施方案中，PhtD序列是来自WO2011/075823的SEQ ID NO. 1-5。

本发明还包括以不涉及氨基酸序列的方式与天然产生的肺炎链球菌多肽不同的PhtD蛋白。非序列修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化中的改变。还在本发明的范围内是具有提高肽稳定性的修饰的那些；此类类似物例如可以在肽序列中包含一个或多个非肽键（其代替肽键）。还在本发明的范围内的是包括天然产生的L-氨基酸之外的残基例如D-氨基酸或非天然产生的或合成的氨基酸例如β或γ氨基酸的类似物和环状类似物。

在一方面，本发明的免疫原性组合物包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素（例如dPly）和PhtD（例如包含WO00/37105的SEQ ID NO: 4的氨基酸21-838的序列）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。本发明的免疫原性组合物还可以包含两个多多个不同的非缀合的肺炎链球菌蛋白抗原。在另一方面，本发明的免疫原性组合物包含2个或更多个选自：肺炎链球菌溶血素和PhtD的非缀合的肺炎链球菌蛋白。在另一方面，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素和PhtD。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含非缀合的肺炎链球菌溶血素例如dPly和非缀合的肺炎球菌PhtD。

QS21

本发明人已经发现结合至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）的佐剂的免疫原性组合物提供有利的特性。

QS-21是来自南美树皂树（Quillaja saponaria）的树皮提取物的纯化的皂苷级分。QS21通常包含两种主要的异构体，其共享三萜、支链三糖和糖基化的假二聚酰基链。两种异构形式区别在于线性四糖区段内末端糖的组成，其中主要的异构体QS-21-Api掺入β-D-芹菜糖残基，并且次要的异构体QS-21-Xyl在β-D-木糖取代基处终止。(Cleland, J. L.等 J. Pharm. Sci. 1996, 85, 22–28)。

QS21可以通过HPLC纯化从Quil A中制备。由Dalsgaard等在1974年将Quil A描述为具有佐剂活性(“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, 第44卷, Springer Verlag, Berlin, p243-254)。用于产生QS21的方法描述于US5057540 (作为QA21)和EP0362278中。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含以基本上纯的形式的QS21，也就是说，所述QS21为至少90％纯，例如至少95％、或至少98％纯。

QS21的剂量能够合适地在人中增强对抗原的免疫应答。具体而言，合适的QS21量是这样的量，与非佐剂化的组合物相比，或者与用另一QS21量佐剂化的组合物相比，所述量改善了组合物的免疫潜力，同时从反应原性概况上是可接受的。例如，QS21可以以每组合物剂量1-100 μg的量例如以每组合物剂量10-50 μg的量使用。例如，QS21合适的量是每组合物剂量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg中的任何。在一个实施方案中，QS21量的范围为每组合物剂量 25-75 μg。在一个实施方案中，QS21量的范围为每组合物剂量1-30 μg，合适地为每组合物剂量5-20 μg，例如每组合物剂量5-15 μg、或每组合物剂量6-14 μg或每组合物剂量7-13 μg。在一个实施方案中，每ml疫苗组合物包含100 μg的QS21的终浓度，或每0.5 ml疫苗剂量50 μg。在另一个实施方案中，每ml疫苗组合物包含50 μg的QS21的终浓度，或每0.5 ml疫苗剂量25 μg。具体而言，0.5 ml疫苗剂量体积包含每剂量25 μg或50 μg的QS21。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含5-60、45-55或20-30 μg (例如20、25、30、35、40、45或50 μg)的QS21。例如，本发明的免疫原性组合物每人剂量可以包含50 μg的QS21。适合地，肺炎链球菌蛋白:QS21的比例为以重量计(w/w) (μg)为0.05:1-3:1，例如1:1-3:1。

单磷酰脂质A

单磷酰脂质A(MPL)是革兰氏阴性细菌例如明尼苏达沙门氏菌（Salmonella minnesota）R595的脂多糖(LPS)的无毒衍生物。它保持LPS的佐剂特性同时显示出降低的毒性(Johnson等1987 Rev. Infect.Dis.9 Suppl:S512-S516)。MPL由一连串4'-单磷酰脂质A种类组成，其在脂肪酸取代的程度和位置中不同。它可以通过用温和的酸和碱水解处理LPS随后通过纯化修饰的LPS来制备。例如，LPS可以在中等强度的无机酸溶液（例如0.1 M HCl）中回流大约30分钟的时期。该处理导致在1位的脱磷酸化和在6'位的脱糖化（decarbohydration）。如本文所用的术语“单磷酰脂质A(MPL)”包括单磷酰脂质A的衍生物。单磷酰脂质A的衍生物包括3D-MPL和合成的衍生物。

3D-MPL是3-0-脱酰单磷酰脂质A（或3 脱-0-酰化单磷酰脂质A）。化学上它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。3D–MPL可以通过GlaxoSmithKline Biologicals North America在商标MPL?下购得。3-0-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。它具有进一步降低的毒性同时还保持佐剂性，并且通常可以通过温和的碱水解来制备，例如见US4912094。碱水解通常在有机溶剂诸如氯仿/甲醇的混合物中通过用弱碱的水溶液诸如以pH 10.5的0.5 M碳酸钠饱和进行。对于3D-MPL制备的进一步的信息见GB2220211A 和WO02078637 (Corixa Corporation)。在本发明的一方面，可以使用小颗粒3 D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的颗粒大小使它可以经0.22μm滤器无菌过滤。此类制备描述于国际专利申请号WO94/21292中。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含3-0-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。

来自革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS）及其衍生物或其片段包括3D-MPL是TLR-4（Toll样受体4）配体，能够导致经TLR-4信号传递途径的信号传递应答(Sabroe等, JI 2003 p1630-5)。Toll样受体(TLRs)是在昆虫和人之间进化上保守的I型跨膜受体。目前已确定了10个TLR (TLRs 1-10)。TLR家族的成员具有相似的胞外域和胞内域；它们的胞外域已显示具有富含亮氨酸的重复序列，并且它们的胞内域与白细胞介素– 1受体(IL-1R)的胞内域是相似的。TLR细胞在免疫细胞和其他细胞（包括血管上皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肠上皮细胞）中差别表达。TLRs的胞内域可以与衔接蛋白Myd88相互作用，其还在它的胞质域内具有IL-1R结构域，导致细胞因子的NF-KB活化；该Myd88途径是一种由此细胞因子释放受TLR活化影响的方式。目前为止进行的研究已经发现虽然某些激动剂对于几个TLRs是共同的，但TLRs识别不同类型的激动剂。

脂质A的合成衍生物是已知的，并且被认为是TLR4激动剂，包括但不限于：OM174 (2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰基氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯), (WO95/14026);

OM 294 DP (3S, 9 R) –3--[(R)-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1,10-二醇,1,10-双(二氢磷酸酯（dihydrogenophosphate）) (WO99 /64301 and WO00/0462); OM 197 MP-Ac DP ( 3S-, 9R) -3-[(R) -十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1,10-二醇,1 -二氢磷酸酯 10-(6-氨基己酸酯) (WO01/46127)。

单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的剂量能够合适地在人中增强对抗原的免疫应答。具体而言，单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的量是这样的量，与非佐剂化的组合物相比，或者与用另一MPL量佐剂化的组合物相比，所述量改善了组合物的免疫潜力，同时从反应原性概况上是可接受的。例如，单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL可以以每组合物剂量1-100 μg的量例如以每组合物剂量10-50 μg的量使用。例如，单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL合适的量是每组合物剂量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg中的任何。在一个实施方案中，单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的量的范围为每组合物剂量 25-75 μg。在一个实施方案中，3D-MPL量的范围为每组合物剂量1-30 μg，合适地为每组合物剂量5-20 μg，例如每组合物剂量5-15 μg、或每组合物剂量6-14 μg或每组合物剂量7-13 μg。在一个实施方案中，每ml疫苗组合物包含100 μg的单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的终浓度，或每0.5 ml疫苗剂量50 μg。在另一个实施方案中，每ml疫苗组合物包含50 μg的单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的终浓度，或每0.5 ml疫苗剂量25 μg。具体而言，0.5 ml疫苗剂量体积包含每剂量25 μg或50 μg的单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL。在一方面，本发明的免疫原性组合物包含5-60、45-55或20-30 μg (例如20、25、30、35、40、45或50 μg)的单磷酰脂质A(MPL)。例如，本发明的免疫原性组合物每人剂量可以包含50 μg的3D-MPL。适合地，肺炎链球菌蛋白:单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的比例为以重量计(w/w) (μg)0.05:1-3:1，例如1:1-3:1。

在另一个实施方案中，将TLR分子的其他天然或合成激动剂用作任选的额外免疫刺激剂。这些可以包括但不限于对TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9或其组合的激动剂(例如见Sabroe等, JI 2003 p1630-5)。可以使用的其他TLR4配体为氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)诸如公开于WO9850399或US6303347中的那些（还公开了制备AGPs的方法）、或如US6764840中公开的AGPs的药学上可接受的盐。某些AGPs是TLR4激动剂，并且某些是TLR4拮抗物。认为两者均可用作佐剂。其他合适的TLR激动剂为：热休克蛋白(HSP) 10、60、65、70、75或90；表面活性剂蛋白A、乙酰透明质酸寡糖、类肝素硫酸酯片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原和b-防卫素-2、胞壁酰二肽（MDP）或呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一个实施方案中，TLR激动剂为HSP 60、70或90。

在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物的每人剂量中QS21和单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL以相同的终浓度存在。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的人剂量包含50 μg的单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL和50 μg的QS21的终水平。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物的人剂量包含25 μg的单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL和25 μg的QS21的终水平。

脂质体载体

用于本发明的组合物的佐剂包含脂质体载体。可以使用本领域已知的技术从磷脂（诸如二油酰磷脂酰胆碱, DOPC）和甾醇例如胆固醇来制备脂质体。此类脂质体载体可以携带QS21和/或单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL。合适的本发明的组合物是那些组合物，其中最初在无MPL的情况下制备脂质体（如WO96/33739中所描述），并且随后添加MPL，适合地为小于100 nm颗粒的小颗粒或容易经0.22 μm膜无菌过滤的颗粒。因此MPL不包含在小泡膜内（称为MPL在外）。其中MPL包含在小泡膜内（称为MPL在内）的组合物也形成本发明的方面。非缀合的肺炎链球菌蛋白可以包含在小泡膜内或包含在小泡膜外部。合适地可溶性抗原在外部，并且疏水的或脂化的抗原包含在膜的内部或者外部。脂质体内的胶囊化描述于US4235877中。

本发明的脂质体包含磷脂，例如磷脂酰胆碱，其可以在室温下是非结晶的，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱或二月桂基磷脂酰胆碱。适合地，磷脂是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。进一步的方面是包含0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1 mg (例如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5-1 mg)磷脂的本发明的免疫原性组合物。在本发明的一个具体实施方案中，DOPC的量为每人剂量1000 μg。在本发明的另一个具体实施方案中，DOPC的量为每人剂量500 μg。

本发明的脂质体包含甾醇。甾醇提高脂质体结构的稳定性。合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。这些甾醇是本领域熟知的，例如胆固醇公开于Merck Index，第11版，第341页，作为动物脂肪中发现的天然产生的甾醇。在本发明的一个具体实施方案中，甾醇是胆固醇。通常，如WO96/33739中所描述，可以在抗原制备过程中使用用甾醇猝灭的QS21来添加甾醇。

甾醇对磷脂的量为1-50% (w/w)，适合地为20-35%，例如25%。QS21:甾醇的比例适合地在1:10-1:1 (w/w)之间，存在适合地过量的甾醇，QS21:甾醇的比例为至少1:2 (w/w)，例如1:5 (w/w)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25 mg (例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25-0.125 mg)甾醇。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含每人剂量250 μg的甾醇例如胆固醇。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含每人剂量125 μg的甾醇例如胆固醇。

本发明的脂质体将适合地包含在液体培养基中。液体培养基包含生理可接受液体诸如水、盐水溶液和缓冲溶液，例如PBS等。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含水和磷酸钠缓冲液。

在本发明的一方面，佐剂为AS01B (例如见WO96/33739)。在本发明的另一方面，佐剂为AS01E (例如见WO2007/068907)。

额外抗原

本发明的免疫原性组合物可以包含能够引起针对人或动物病原体的免疫应答的额外抗原。这些额外的抗原例如包括额外的肺炎链球菌抗原，例如肺炎链球菌蛋白抗原。当额外抗原为肺炎球菌蛋白时，所述蛋白例如任选与糖类缀合。任选地，肺炎球菌蛋白是非缀合的或者作为游离蛋白存在于免疫原性组合物中。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少1种选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合蛋白）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的额外蛋白。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两种或更多种选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合蛋白）、PspA、PsaA和Sp128的额外蛋白。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两种或更多种选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合蛋白）和Sp128的额外蛋白。

关于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员包含N末端区(N)、保守的重复区(R1和/或R2)、富含脯氨酸区(P)和保守的胆碱结合区(C)，由多个重复组成，其包含大约蛋白的一半。如本申请中使用，术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自如WO97/41151中鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO97/41151中。CbpD和CbpG公开于WO00/29434中。PspC公开于WO97/09994中。PspA公开于WO98/21337中。SpsA为公开于WO98/39450中的胆碱结合蛋白。任选地，胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。

本发明的一个实施方案包含CbpX截短物，其中“CbpX”在上文定义并且“截短物”指缺少胆碱结合区(C)的50％或更多的CbpX蛋白。任选地，此类蛋白缺少整个胆碱结合区。任选地，此类蛋白截短物缺少(i)胆碱结合区和(ii)以及蛋白的N末端一半的部分，仍保留至少一个重复区(R1或R2)。任选地，截短物具有2个重复区(R1和R2)。此类实施方案的实例为如WO99/51266或WO99/51188中说明的NR1xR2和R1xR2，然而，认为其他缺少类似胆碱结合区的胆碱结合蛋白也在本发明的范围内。在另一个实施方案中哦功能，本发明的免疫原性组合物可以包含PcpA的免疫原性多肽，例如选自肺炎链球菌TIGR4、肺炎链球菌14453、肺炎链球菌B6 (GenBank登记号CAB04758)、或肺炎链球菌R6 (GenBank登记号NP_359536)。在一个实施方案中，免疫原性多肽PcpA缺少N末端信号序列。在另一个实施方案中，免疫原性多肽PcpA缺少在天然产生的序列中发现的胆碱结合域锚定序列。在另一个实施方案中，免疫原性多肽PcpA缺少信号序列和一个或多个胆碱结合域。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含与WO2011/075823的SEQ ID No. 2具有至少50、60、70、80、90、95、97、99%同一性的PcpA的免疫原性多肽。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含具有WO2011/075823的序列SEQ ID No. 7的PcpA的免疫原性多肽。

LytX家族是与细胞溶解相关的膜相关蛋白。N末端结构域包含一个或多个胆碱结合域，然而，LytX家族不具有上文提及的CbpA家族中发现的所有特征，并且因此对于本发明而言，认为LytX家族与CbpX家族不同。与CbpX家族相反，C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化结构域。家族包含LytA、B和C。关于LytX家族，LytA公开于Ronda等, Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)中。LytB公开于WO98/18930中，并且也被称为Sp46。LytC也公开于WO98/18930中，并且也被称为Sp91。本发明的一个实施方案包含LytC。

另一个实施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定义并且“截短物”指缺少胆碱结合区的50％或更多的LytX蛋白。任选地，此类蛋白缺少整个胆碱结合区。本发明的仍另一个实施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合蛋白）。任选地，这包含CbpX的NR1xR2 (或R1xR2)和LytX的C末端部分(Cterm, 即, 缺少胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。任选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任选地，它是CbpA。任选地，LytX是LytC（也称作Sp91）。本发明的另一个实施方案是缺少胆碱结合域(C)并且表达为与LytX的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。任选地，LytX是LytC。

关于PsaA和PspA，两者都是本领域已知的。例如，PsaA及其跨膜缺失变体已经由Berry和Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62所描述。PspA及其跨膜缺失变体已经例如在US5804193、WO92/14488和WO99/53940中公开。

Sp128和Sp130公开于WO00/76540中。Sp125是具有LPXTG（其中X为任何氨基酸）的细胞壁锚定基序的肺炎球菌表面蛋白的实例。已经发现具有该基序的肺炎球菌表面蛋白的这一类中的任何蛋白均可用在本发明的背景中，并且因此被认为是本发明的进一步的蛋白。Sp125自身公开于WO98/18930中，并且也已知为ZmpB – 锌金属蛋白酶。Sp101公开于WO98/06734（其中它具有参考# y85993）。将它表征为I型信号序列。Sp133公开于WO98/06734（其中它具有参考# y85992）。将它也表征为I型信号序列。

本发明的免疫原性组合物还可以包含肺炎链球菌荚膜糖（合适地与载体蛋白缀合）。所述糖（例如多糖）可以来源于肺炎球菌的血清型诸如血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一个实施方案中，至少四种血清型包括在组合物中，例如6B、14、19F和23F。在另一个实施方案中，至少7种血清型包括在组合物中，例如4、6B、9V、14、18C、19F和23F。适合地，糖类的每一种与载体蛋白缀合。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素和/或多组氨酸三联体家族的一个或多个成员（例如PhtD）作为载体蛋白。

剂量

如本文所用的术语“人剂量”表示以适合于人使用的体积的剂量。通常，终剂量体积（疫苗组合物体积）可以为0.25-1.5 ml、0.4-1.5 ml或0.4-0.6 ml。在一个实施方案中，人剂量为0.5 ml。在进一步的实施方案中，人剂量高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在进一步的实施方案中，人剂量为1 ml-1.5 ml。在另一个实施方案中，尤其是当免疫原性组合物用于儿科人群，人剂量可以为少于0.5 ml诸如0.25-0.5 ml。

选择每一剂量中肺炎链球菌蛋白的量为在一般接种者中诱导免疫保护应答而不具有明显的不良副作用的量。这样的量将根据使用的具体免疫原以及它如何呈现而有所不同。通常，期望每一剂量将包含1-1000 μg的蛋白抗原，例如1-500 μg、1-100 μg或1-50 μg。对具体免疫原性组合物的最佳量可以通过关于在受试者中观察合适的免疫应答的标准研究来确定。

接种

本发明提供包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。本文中本发明涉及“免疫原性组合物”的实施方式也适用于本发明涉及“疫苗”的实施方式，并且反之亦然。在一个实施方案中，疫苗包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。

本发明的疫苗可以通过任何合适的递送途径来施用，诸如皮内、粘膜例如鼻内、口腔、肌内或皮下。其他递送途径在本领域是广泛知晓的。疫苗制剂通常描述于Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Powell M. F.和Newman M.J.编辑)(1995) Plenum Press New York)中。

在一方面，本发明的免疫原性组合物通过肌内递送途径施用。肌内施用可以向大腿或上臂进行。注射通常经针（例如皮下针），但或者可以使用无针注射。通常的肌内剂量为0.5 ml。

疫苗的皮内施用形成本发明的一个实施方案。人皮肤包含被称为角质层（stratum corneum）外“角质”层，其覆盖表皮。在该表皮下是被称为真皮的层，其依次覆盖皮下组织。皮内注射的常规技术“mantoux方法”包括清洁皮肤并随后用一只手伸展的步骤，并且使狭窄的计量针(26-31量规)的斜面向上，将针以10-15°的角插入。一旦针的斜面插入，针筒降低并且进一步向前，同时提供轻微压力以在皮肤下使其升高。随后液体由此非常缓慢地注入，在皮肤表面上形成疱或肿块，随后缓慢地抽出针。

更近期，已经描述了特别设计来向皮肤内或经皮肤施用液体药剂的设备，例如描述于WO99/34850和EP1092444中的设备，以及例如描述于WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520, 639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537中的喷射注射设备。疫苗制剂的皮内施用的可选方法可以包括常规注射器和针、或设计用于固体疫苗发射递送的设备(WO99/27961)、或透皮贴剂(WO97/48440、WO98/28037)、或用于皮肤表面的(透皮或经皮肤递送WO98/20734、WO98/28037)。

当将本发明的疫苗向皮肤（或者更具体而言向真皮内）施用时，疫苗为小的液体体积，具体为约0.05 ml-0.2 ml的体积。

另一个合适的施用途径是皮下途径。可以使用任何合适的设备进行皮下递送，例如经典的针。在本发明的一方面，使用无针喷射注射器服务，诸如发表于WO01/05453、WO01/05452、WO01/05451 、WO01/32243、WO01/41840、WO01/41839、WO01/47585、WO01/56637、WO01/58512、WO01/64269、WO01/78810、WO01/91835、WO01/97884、WO02/09796、WO02/34317中。在本发明的另一方面，用液体疫苗制剂将设备预先充满。

或者，鼻内施用疫苗。通常，将疫苗向鼻咽区域局部施用，例如不被吸入肺内。期望使用鼻内递送设备，其向鼻咽区域递送疫苗制剂，它不会或基本上不会进入肺。用于本发明的疫苗的鼻内施用的优选设备为喷雾设备。合适的商品化鼻腔喷雾设备包括Accuspray? (Becton Dickinson)。

在一个实施方案中，用于鼻内使用的喷雾设备是设备的性能不依赖于由使用者施加的压力的设备。已知这些设备为压力阈值设备。只有当施加阈值压力时，才从喷嘴中释放液体。这些设备使得其更容易获得具有规则小滴大小的喷雾。适合用于本发明的压力阈值设备是本领域已知的，并且例如描述于WO91/13281和EP311 863和EP516636中，其通过引用并入本文。此类设备可以商业上购自于Pfeiffer GmbH，并且还描述于Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999。

在另一个实施方案中，鼻内设备产生1-200 μm例如10-120 μm范围内的小滴（使用水作为液体测量）。低于10 μm存在吸入风险，因此期望具有不多于约5％的低于10 μm的小滴。120 μm以上的小滴无法如更小的小滴散布那么好，因此期望具有不多于约5％的超过120 μm的小滴。

双剂量递送是用于本发明疫苗的鼻内递送系统的另一个实施方案。双剂量设备包含单次疫苗剂量的两个亚剂量，一个亚剂量用于向每一鼻孔施用。通常，两个亚剂量存在于单一室中，并且设备的结构允许单一亚剂量在一次的有效递送。或者，单剂量设备可以用于施用本发明的疫苗。

本发明的进一步的方面是本发明的疫苗的生产方法，其包括将非缀合的肺炎链球菌蛋白与佐剂组合物混合的步骤。

尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量施用，其组分也可以在同一时间或在不同时间一同共施用（例如，肺炎球菌糖缀合物可以单独、在疫苗的任何细菌蛋白组分施用的同一时间或其后1-2周施用，以获得彼此相关的免疫应答的最适协调）。初始接种后，受试者可以接受一次或适当分隔开的几次加强免疫。

在本发明的一方面，目标人群是未接触过抗原的人群，是首次用于实验的或者是之前已经无法对感染或接种应答。在另一方面，目标人群是年龄为65岁和以上的适合的老年人、更年轻的高风险成人（即年龄18-64岁之间）诸如在健康机构中工作的人、或那些具有风险因素诸如心血管和肺疾病或糖尿病的年轻成人。另一目标人群是年龄为6个月及以上的所有儿童，尤其是年龄为6-23个月的儿童。另一目标人群是无免疫应答的人。

本发明的免疫原性组合物可以用于预防和治疗目的。由肺炎链球菌感染导致的疾病包括肺炎、急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窝组织炎和脑脓肿。在本发明的一个实施方案中，肺炎链球菌感染包括肺炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症。在一个实施方案中，由肺炎链球菌导致的疾病是肺炎，例如群落获得性肺炎。在另一个实施方案中，由肺炎链球菌导致的疾病是侵入性肺炎球菌疾病（IPD），即其中可以从血液或另一通常无菌部位中分离到肺炎链球菌的感染。在另一个实施方案中，由肺炎链球菌导致的疾病是肺炎，例如重症肺炎。已知为“重症肺炎”的状况根据由多个组织包括American Thoracic Society (ATS) (Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:1730-1754)提出的指导方针进行表征。例如，除了对重症肺炎诊断的其他标准之外，ATS要求至少一个主要标准，诸如需要机械通气或感染性休克。通常，重症肺炎可以产生自急性肺病、肺炎性疾病或由于诸如炎症或凝固因素的肺功能中的任何干扰。本发明的免疫原性组合物还可以用于AECOPD的治疗或预防中。在一方面，本发明的免疫原性组合物可以用于由肺炎链球菌导致的AECOPD的治疗或预防中。

本发明的进一步方面包括：

- 通过用本发明的免疫原性组合物免疫哺乳动物引起免疫应答的方法；

- 治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的方法，包括向需要其的受试者例如人肌内施用，包括向所述受试者例如人施用本发明的免疫原性组合物；

- a 治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的方法，包括向经受肺炎链球菌感染或对肺炎链球菌感染易感的患者肌内施用本发明的免疫原性组合物；

- 用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的本发明的免疫原性组合物；

- 本发明的免疫原性组合物在制造用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的药物中的用途；

- 本发明的免疫原性组合物在制造用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的肌内疫苗中的用途。

免疫原性特性

本发明的进一步的方面是能够在哺乳动物中引起T细胞应答的本发明免疫原性组合物。在一方面，T细胞应答可以是溶细胞性T细胞应答。溶细胞性T细胞应答可以使用标准试验来测量，例如通过使用铬释放试验测量T细胞的细胞毒性活性，例如将向靶细胞添加⁵¹Cr并且测量由溶解的细胞释放的⁵¹Cr的量，或通过流失细胞术测定参与T细胞细胞毒性的分子（例如粒酶B、穿孔蛋白）的表达。

在一方面，与用相应的非佐剂化的组合物（即不包含任何外源佐剂（本文也称为‘简单组合物（plain composition）’））和/或本领域已知的其他佐剂化的化合物获得的CD4 T细胞免疫应答相比，本发明的免疫原性组合物能够诱导针对至少一种或多种组分抗原或抗原组合物之一的改善的CD4 T细胞免疫应答。

“改善的CD4 T细胞免疫应答”指在施用佐剂化的免疫原性组合物之后，在哺乳动物例如人中获得了比在施用无佐剂和/或具有其他已知佐剂的相同组合物之后所获得的应答更高的CD4应答。例如，与在施用非佐剂化的免疫原性组合物和/或本领域已知的其他佐剂化的组合物后诱导的应答相比，施用本发明的免疫原性组合物在哺乳动物中获得了更高的CD4 T细胞应答。

可以通过测量产生任何以下细胞因子的细胞的数目来评价改善的CD4 T细胞免疫应答：

· 产生任何细胞因子（IFNγ、IL-2、IL-17、IL-13）的细胞

· 产生IFNγ的细胞

· 产生IL-17的细胞

与施用非佐剂化的组合物和/或其他佐剂化的组合物相比，当施用本发明的免疫原性组合物后产生任何上述细胞因子的细胞将为更高的量时，将存在改善的CD4 T细胞免疫应答。在一个实施方案中，本文上述的三个条件中的至少一个将会实现。在另一个实施方案中，本文上述的三个条件中的至少两个将会实现。在另一个实施方案中，本文上述的所有三个条件均将会实现。在进一步的方面，本发明的免疫原性组合物能够刺激IFNγ产生。可以如本文实施例中描述的测量IFNγ产生。例如，可以通过使用对应于IFNγ的抗原例如PhtD和dPly体外再刺激外周血抗原特异性CD4和CD8、常规免疫荧光标记和通过流式细胞术的测量来确定在CD4或CD8细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8 T细胞的频度来测量IFNγ产生。在进一步的方面，本发明的免疫原性组合物能够刺激IL-17产生。可以如本文实施例中描述的测量IL-17产生。例如，可以通过使用对应于IL-17的抗原例如PhtD和dPly体外再刺激外周血抗原特异性CD4和CD8、常规免疫荧光标记和经流式细胞术测量来确定在CD4或CD8细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8 T细胞的频度来测量IL-17产生。

本发明将通过参考以下非限制性实施例来进一步描述：

实施例1 在PhtD和dPly的小鼠模型(C57Bl6)中AS01B相比于AS03B Th应答的临床前比较

用9 μg或3 μg配制于AS01B或AS03B中的PhtD或dPly在第0、14和28天通过IM途径免疫六周龄的C57bl6小鼠。用5 μg配制于AS15中的PhtD、dPly或Sivp27（将Sivp27用作阳性对照）免疫对照组。在第二次和第三次免疫后7天进行对全血的FACS分析，并且在第三次免疫后9天进行对脾脏的FACS分析。

实验1：

实验2：

佐剂制剂的制备

AS01B的最终组合物/剂量：

脂质体：DOPC 1000ug、胆固醇250ug、3D-MPL 50ug

QS21 50ug

PBS至体积0.5ml

AS01E的最终组合物/剂量：

脂质体：DOPC 500ug、胆固醇125ug、3D-MPL 25ug

QS21 25ug

PBS至体积0.5ml。

AS03B的最终组合物/剂量：

水包油乳状液：角鲨烯和DL-α-生育酚

多乙氧基醚（吐温80）

AS15的最终组合物/剂量：

脂质体：DOPC 1000ug、胆固醇250ug、3D-MPL 50ug

QS21 50μg

CpG7909 :420μg。

MPL/QS21脂质体佐剂AS01的制备：名为AS01的佐剂包含3D-MPL和用胆固醇猝灭形式的QS21，并且如WO 96/33739中所描述来制备，通过引用并入本文。具体而言，AS01佐剂基本上如WO 96/33739的实施例1.1制备。AS01B佐剂包含：脂质体，其依次包含二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇和3D MPL [以1000μg DOPC、250 μg胆固醇和50 μg 3D-MPL的量，每疫苗剂量近似给出每一值]、QS21 [50μg/剂量]、磷酸盐NaCl缓冲液和水至0.5ml的体积。

AS01E佐剂包含相同成分但以比AS01B更低的浓度，以500μg DOPC、125μg胆固醇、25μg 3D-MPL和25μg QS21的量，磷酸盐NaCl缓冲液和水至0.5ml的体积。

在包含MPL DOPC（二油酰磷脂酰胆碱）的脂质体的生产过程中，将胆固醇和MPL溶于乙醇中。通过在真空下溶剂蒸发形成脂质薄膜。添加为pH 6.1的磷酸缓冲盐溶液(9 mM Na₂HPO₄、4 1 mM KH₂PO₄、100 mM NaCl)并且将混合物进行预均质化，随后以15,000 psi高压均质化（约15-20个循环）。这导致脂质体的产生，其在无菌（100级）区经0.22 μm膜无菌过滤。随后将无菌产物分装至无菌玻璃容器中并在冷室中储存(+2 to +8℃)。

以这种方式，所产生的脂质体包含在膜内的MPL（WO 96/33739的“MPL在内”的实施方案）。

将QS21添加到水溶液中至所需浓度。

水包油乳状液和佐剂制剂AS03B的制备：除非另有所述，用于以下实施例中的油/水乳状液由2种油（α-生育酚和角鲨烯）构成的有机相和含吐温80作为乳化剂的PBS的水相组成。除非另有所述，制备包含以下水包油乳状液组分的用于以下实施例中的水包油乳状液佐剂制剂（给出了终浓度）：2.5%角鲨烯(v/v)、2.5% α-生育酚(v/v)、0.9% 聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(v/v) (吐温80)，见WO 95/17210。在以下实施例中称为AS03的该乳状液如下制备作为两倍浓缩液。

乳状液SB62的制备：通过在强烈搅拌下混合由疏水组分（DL-α-生育酚和角鲨烯）组成的油相和含水溶性组分的水相（阴离子去污剂吐温80和PBS mod（改良的）, pH 6.8）来进行SB62乳状液制备。当搅拌时，将油相（1/10总体积）转移至水相（9/10总体积），并在室温下将混合物搅拌15分钟。随后将所获的混合物在微流化器的相互作用室中经受剪切力、冲击力和气蚀力(15000 PSI - 8个循环，或者在实施例III中报道的临床试验中使用的佐剂中3个循环)以产生亚微粒小滴（分布于100-200 nm）。所获的pH为6.8 ± 0.1之间。随后将SB62乳状液经0.22 μm膜过滤进行灭菌，并将无菌容积乳状液在2-8℃下冷却储存在Cupac容器中。将无菌惰性气体（氮气或氩气）冲入SB62乳状液最终容积容器的死体积中至少15秒。

SB62乳状液的最终组合物如下：吐温80：1.8 % (v/v) 19.4 mg/ml; 角鲨烯:5 % (v/v) 42.8 mg/ml; α-生育酚:5 % (v/v) 47.5 mg/ml; PBS-mod:NaCl 121 mM、KCl 2.38 mM、Na₂HPO₄ 7.14 mM、KH₂PO₄ 1.3 mM; pH 6.8 ± 0.1 。

佐剂制剂AS15的制备：佐剂体系AS15之前已经描述于WO 00/62800。

AS15是两种佐剂体系的组合，AS01B（第一种）由包含3D-MPL和QS21的脂质体组成，并且第二种由在磷酸缓冲盐溶液中的CpG 7909（也已知为CpG 2006）组成。

抗原的制备

dPly的制备：制备肺炎球菌肺炎链球菌溶血素并如WO2004/081515和WO2006/32499中描述用甲醛解毒作用来解毒。

PhtD的表达和纯化：

PhtD的表达：PhtD蛋白是表征为存在组氨酸三联体的肺炎球菌组氨酸三联体(Pht)蛋白家族的成员。PhtD是838氨基酸的分子并且具有5个组氨酸三联体（见Medlmmune WO00/37105 氨基酸序列SEQ ID NO: 4，和DNA序列SEQ ID NO: 5）。PhtD还在中部包含富含脯氨酸区（氨基酸位置348-380）。PhtD具有20 个氨基酸的N末端信号序列。PhtD的制备和纯化描述于WO2007/071710（见实施例1b）。

转移材料的描述：SIV-p27 批次PE04MY1901

缓冲液：DPBS ( NaCl 136.87 mM、KCl 2.68 mM、Na₂HPO₄ 8.03 mM、KH₂PO₄1.47 mM)

重组蛋白：来自SIV mac 251的SIV p27描述于WO2009/077436 (SEQ ID No. 19)。

制备：

大肠杆菌表达、在50 mM TRIS-HCl pH 8.0中提取、BLUE Trisacryl Plus、硫酸铵沉淀、DPBS回收、DPBS透析、Acticlean Etox、浓缩、Acticlean Etox、浓缩。

蛋白特征：

分子量 27477 Da

摩尔消光系数:38010±5%

1A(280)=0.72 mg/ml

等电点：5.77。

具有佐剂的疫苗组合物的制备

1. AS01B

1.1 2倍浓缩的AS01B的制备

当稀释10倍时将磷酸缓冲盐溶液pH6.1添加到注射用水中，以在最终制剂中分别达到10mM磷酸盐和140mM NaCl浓度。将浓缩的脂质体（由DOPC、胆固醇和MPL构成）添加QS21并且在室温下通过磁力搅拌混合15分钟。将由脂质体和QS21构成的混合物添加到稀释的缓冲液中并在室温下通过磁力搅拌混合30分钟。检查pH以在6.0左右。

在两倍浓缩的佐剂中，QS21的浓度为200μg/ml并且MPL的浓度为200μg/ml。

1.2 最终制剂的制备

在AS01B中以180或60μg/ml的PhtD或dPly

按照以下顺序临时制备制剂：注射用水＋当10倍稀释时pH6.1的盐缓冲液＋2倍浓缩的佐剂，室温下在轨道摇床上混合5分钟，

＋抗原（添加量以达到180μg/ml或60μg/ml的终浓度），室温下在轨道摇床上混合5分钟，

单独AS01B

按照以下顺序临时制备制剂：注射用水＋当10倍稀释时pH6.1的盐缓冲液＋2倍浓缩的佐剂，室温下在轨道摇床上混合2 x 5分钟。

2. AS15

2.1 2倍浓缩的AS15的制备

当稀释10倍时将磷酸缓冲盐溶液pH6.1添加水中用于注射，以在最终制剂中分别达到10mM磷酸盐和NaCl 140mM浓度。将浓缩的脂质体（由DOPC、胆固醇和MPL构成）添加QS21并且在室温下通过磁力搅拌混合15分钟。将由脂质体和QS21构成的混合物添加到稀释的缓冲液中并在室温下通过磁力搅拌混合30分钟。将CpG添加以在浓缩的佐剂中为1680μg/ml。在室温下通过磁力搅拌将佐剂混合15分钟。检查pH以在6.0左右。

在两倍浓缩的佐剂中，QS21的浓度为200μg/ml，MPL的浓度为200μg/ml，并且CpG的浓度为1680μg/ml。

2.2 最终制剂的制备

在AS15中以100μg/ml的PhtD或dPly或p27gag

＋抗原（添加量以达到100μg/ml的终浓度），室温下在轨道摇床上混合5分钟。

3. AS03B

3.1 最终制剂的制备

在AS03B中以180μg/ml或60μg/ml的PhtD或dPly

按照以下顺序临时制备制剂：注射用水＋当10倍稀释时pH6.8的盐缓冲液＋SB62水包油乳状液（250μl/ml最终制剂），室温下在轨道摇床上混合5分钟，＋抗原（添加量以达到180μg/ml或60μg/ml的终浓度），室温下在轨道摇床上混合5分钟。

单独AS03B

按照以下顺序临时制备制剂：注射用水＋当10倍稀释时pH6.8的盐缓冲液＋SB62水包油乳状液（250μl/ml最终制剂），室温下在轨道摇床上混合2 x 5分钟。

T细胞应答

简述之，将来自来自28只小鼠/组和用于阳性对照的14只小鼠/组的外周血淋巴细胞(PBLs)收集并合并（7只小鼠/组的4个或2个库）。在将细胞以每孔一百万个细胞铺至圆形96孔板上之前，进行红细胞溶解。随后将细胞体外用重叠的15聚体肽的库（以1μg/ml/包含两种抗体CD49d和CD28的肽）再刺激2小时。将保留在培养基中的细胞（无肽刺激）用作阴性对照用于背景应答。用肽库共培养后两个小时，向孔中添加布雷菲尔德菌素A（以抑制细胞因子分泌）并且将细胞在37℃下与5% CO₂进一步孵育过夜。随后将细胞对以下标记物染色：CD4、CD8、IL-2、IFN-γ、IL13和IL17。通过流式细胞术分析样品。

胞内细胞因子染色

在抗原再刺激步骤后，将PBLs在布雷菲尔德菌素(1 μg/ml)在存在的情况下在37℃下孵育过夜以抑制细胞因子分泌。

如下进行IFN-γ/IL17/IL3或IL5/IL2/CD4/CD8染色：将细胞悬浮液洗涤，在50 μl包含2% Fc封闭（抗CD16/32）剂(1/50)的PBS 1% FCS中重悬。

在4℃下孵育10分钟后，添加50 μl的抗CD4太平洋蓝(1/50)和抗CD8 perCp-Cy5.5 (1/50)的混合物并在4℃下孵育30分钟。在PBS 1% FCS中洗涤后，通过在200 μl的Cytofix-Cytoperm (kit BD^TM)中重悬将细胞透化处理并在4℃下孵育20分钟。随后用Perm Wash (试剂盒BD^TM)洗涤细胞并用50 μl在Perm wash中稀释的抗IFN- γ APC (1/50) + 抗IL-2-FITC (1/50) + 抗IL13或IL5-PE (1/50) +抗IL17-Alexa 700 (1/50)的混合物重悬。孵育1小时后，将细胞用BD^TM稳定-固定液(BD Biosciences)洗涤。通过FACS进行样品分析。将活细胞设门（gated）(FCS/SSC)并以≈ 10 000 CD8细胞进行采集。计算在CD4和CD8+设门群中IFN-γ+ 或IL17+ 或IL3或IL5+或IL2的百分比。

通过细胞因子流式细胞术(CFC)评价细胞介导的免疫

如果与它们的对应抗原孵育，外周血抗原特异性Cd4和CD8 T细胞可以体外再刺激以产生IFNγ、IL2、IL13、IL17。因此，可以在细胞表型的常规免疫荧光标记以及胞内细胞因子产生后流式细胞术来计数抗原特异性CD4和CD8 T细胞。在本研究中，使用PhtD和dPly蛋白以及来源于这些特异性链球菌蛋白的肽作为抗原来再刺激特异性T细胞。将结果表示为在CD4或CD8细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8 T细胞的频度。

IgG的定量：

将纯化的PhtD和Ply在PBS中分别以1和4 μg/ml在37℃下包被在高结合微滴定板(NUNC Maxisorp)上2小时。稀释小鼠抗血清并随后在微量培养板中进行进一步的两倍稀释并在室温下摇动孵育30分钟。洗涤后，使用在PBS-吐温 0.05%中稀释1/2500的Jackson ImmunoLaboratories Inc. 过氧化物酶缀合的亲和纯的山羊抗小鼠IgG (H+L) (ref:115-035-003)检测结合的抗体。将这些检测抗体在室温下摇动孵育30分钟。洗涤后，在室温下黑暗中使用4 mg OPD+5 μl H₂O₂/10 ml PH4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液显色15分钟。用50 μl 1N HCl终止反应，并在490-620 nm读取光密度（OD）。血清样品中存在的抗PhtD和抗dPly IgG的水平通过与参考曲线比较来测量并且以μg/ml表示。

结果和结论总结

在C57BL6小鼠中第三次免疫后的血液中评价了由AS01B或AS03B中的dPly/PhtD诱导的抗原特异性T细胞应答。用AS01B中的dPly/PhtD诱导了高抗原特异性T细胞应答，而用AS03B观察到低应答或无应答。AS01B主要诱导分泌IFN-γ的CD4+ T细胞(Th1)。在第三次免疫后7天，AS01B主要诱导了对dPly特异性的Th17，而用AS03B可以诱导几乎无法检测到的Th17应答。使用AS15/sivP27或dPly/AS15作为阳性对照用于Th17诱导。由AS01B诱导的对两种蛋白的抗体IgG应答也高于用AS03B诱导的应答。

实施例2：在致死攻击模型(用4CDC菌株的MF1)中佐剂的评价

在致死攻击模型中评价不同的佐剂。在第0天和第14天用2次剂量的用不同佐剂体系(AS01B、AS01E和AS03)配制的3μg/50μl PhtD抗原肌内(IM)免疫OF1雌性小鼠（4周龄）。仅用佐剂体系接种对照小鼠。随后用5x10⁶ CFU的肺炎链球菌型4CDC鼻内攻击小鼠。记录死亡率8天。结果显示于图8中。

用组合有PhtD的AS01E和AS03的针对菌株4CDC的保护几乎是完全的（90％左右）。对于所有佐剂观察到显著差异（PhtD/AS（接种的小鼠）和单独AS（阴性对照）之间）。然而，对于AS01E观察到了接种的小鼠和相应的阴性对照之间的最佳差异。

在肺建群模型中佐剂的评价

在肺建群模型中评价两种佐剂。在第0、14和28天用以不同佐剂体系（AS01B、AS01E）配制的PhtD肌内（IM）免疫CBAJ雌性小鼠。仅用佐剂体系接种对照小鼠。随后用2x10⁷ CFU的肺炎链球菌型19F/2737鼻内攻击小鼠。通过在攻击后3天和5天收集的肺中菌落计数测量细菌负荷量。结果显示于图9中。

与仅接受相应的单独佐剂的阴性对照组相比，在用AS01B或AS01E佐剂化的PhtD免疫后，在该模型中诱导了显著的保护。

Claims

1. 一种免疫原性组合物，其包含至少一种选自：肺炎链球菌溶血素和多组氨酸三联体家族的一个或多个成员的非缀合的肺炎链球菌蛋白；和包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇的佐剂，以脂质体的形式存在。

2. 权利要求1中所述的免疫原性组合物，其中肺炎链球菌蛋白：单磷酰脂质A（MPL）的比例为0.05:1-3:1 (w/w)。

3. 权利要求1-2中所述的免疫原性组合物，其中肺炎链球菌蛋白：QS21的比例为0.05:1-3:1 (w/w)。

4. 权利要求1-3中所述的免疫原性组合物，其包含5-60、45-55、5-20或20-30 μg (例如20、25、30、35、40、45或50 μg)的单磷酰脂质A(MPL)。

5. 权利要求1-4中所述的免疫原性组合物，其包含5-60、45-55、5-20或20-30 μg (例如20、25、30、35、40、45或50 μg)的QS21。

6. 权利要求1-5中所述的免疫原性组合物，其包含0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1 mg (例如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或1 mg)的磷脂。

7. 权利要求1-6中所述的免疫原性组合物，其包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25 mg (例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25-0.125 mg)的甾醇。

8. 权利要求1-7中所述的免疫原性组合物，其中所述单磷酰脂质A（MPL）为3-0-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。

9. 权利要求8中所述的免疫原性组合物，其中每人剂量3D-MPL的量为50 μg。

10. 权利要求1-9中所述的免疫原性组合物，其中每人剂量QS21的量为50 μg。

11. 权利要求1-10中所述的免疫原性组合物，其中磷脂是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。

12. 权利要求11中所述的免疫原性组合物，其中每人剂量DOPC的量为1000 μg。

13. 权利要求1-12中所述的免疫原性组合物，其中甾醇是胆固醇。

14. 权利要求13中所述的免疫原性组合物，其中每人剂量胆固醇的量为250 μg。

15. 权利要求1-14中所述的免疫原性组合物，其能够在哺乳动物中引起溶细胞性T细胞应答。

16. 权利要求1-15中所述的免疫原性组合物，其能够刺激干扰素γ产生。

17. 权利要求1-16中所述的免疫原性组合物，其能够刺激IL-17产生。

18. 权利要求1-17中所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是解毒的肺炎链球菌溶血素(dPly)。

19. 权利要求18中所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素已经被化学解毒。

20. 权利要求18或19中所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素已经被遗传解毒。

21. 权利要求1-20中所述的免疫原性组合物，其每人剂量包含3-90、3-20、20-40或40-70 μg (例如10、30或60 μg)非缀合的肺炎球菌肺炎链球菌溶血素。

22. 权利要求1-21中所述的免疫原性组合物，其中所述多组氨酸三联体家族的成员为PhtD。

23. 权利要求22中所述的免疫原性组合物，其中所述PhtD包含与在WO00/37105的序列ID No. 4的氨基酸21-838处的序列至少90％同一性的氨基酸序列。

24. 权利要求22中所述的免疫原性组合物，其中所述PhtD具有与在WO00/37105的序列ID No. 4的氨基酸21-838处的序列至少90％同一性的氨基酸序列。

25. 权利要求22中所述的免疫原性组合物，其中所述PhtD具有包含WO00/37105的序列ID NO: 4的氨基酸21-838的氨基酸序列。

26. 权利要求22中所述的免疫原性组合物，其中所述PhtD具有包含WO00/37105的序列ID No. 4的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列。

27. 权利要求1-26中所述的免疫原性组合物，其每人剂量包含3-90、3-20、20-40或40-70 μg (例如10、30或60 μg)非缀合的PhtD。

28. 权利要求1-27中所述的免疫原性组合物，其包含非缀合的肺炎链球菌溶血素和非缀合的肺炎球菌PhtD。

29. 权利要求1-28中所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种进一步的抗原。

30. 权利要求1-28中所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种肺炎链球菌荚膜糖。

31. 前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述剂量体积为0.4-1.5 ml。

32. 权利要求31中所述的免疫原性组合物，其中所述剂量体积为0.5 ml。

33. 包含权利要求1-32中所述的免疫原性组合物的疫苗。

34. 生产权利要求33中请求保护的疫苗的方法，其包括将所述非缀合的肺炎链球菌蛋白与所述佐剂组合物混合的步骤。

35. 通过用权利要求1-32的免疫原性组合物免疫哺乳动物引起免疫应答的方法。

36. 一种治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的方法，其包括向经受肺炎链球菌感染或对肺炎链球菌感染易感的患者施用权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物。

37. 一种治疗或预防AE COPD的方法，其包括向经受AE COPD或对AE COPD易感的患者施用权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物。

38. 一种治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的方法，其包括向需要其的受试者肌内施用，包括向所述受试者施用权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物。

39. 一种治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的方法，其包括向需要其的人肌内施用，包括向所述人施用权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物。

40. 权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病。

41. 权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防AE COPD。

42. 权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物在制造用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的药物中的用途。

43. 权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物在制造用于治疗或预防由肺炎链球菌感染导致的疾病的肌内疫苗中的用途。

44. 权利要求1-32中任一项中所述的免疫原性组合物在制造用于治疗或预防AE COPD的药物中的用途。