JP2024511959A

JP2024511959A - ウイルスワクチン用の多糖類アジュバント

Info

Publication number: JP2024511959A
Application number: JP2023555766A
Authority: JP
Inventors: ザノーニ，イヴァン; ボリエッロ，フランチェスコ; レヴィ，オフェル; ドーリング，デイヴィッド，ジェイ．
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2024-03-18
Also published as: AU2022234358A1; CA3213390A1; EP4304606A1; US20240148864A1; WO2022192655A1

Abstract

本明細書で提供されるのは、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）およびインフルエンザ（A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルス）のワクチンで使用するための、真菌多糖類を含むアジュバント系、ならびに、該アジュバント系とベータコロナウイルスまたはインフルエンザウイルスの抗原とを含む、免疫原性組成物である。

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)に基づき、２０２１年３月１２日に出願された米国仮出願第63/160,667号、表題「POLYSACCHARIDE ADJUVANTS FOR SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME-RELATED CORONAVIRUS (SARS-COV) VACCINES」、および２０２１年１０月１８日に出願された米国仮出願第63/257,076号、表題「POLYSACCHARIDE ADJUVANTS FOR VIRUS VACCINES」の利益を主張する；それぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

EFS-WEB経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介しASCII形式で提出された配列表を含み、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年３月１１日作成の上記ASCIIコピーは、C123370205WO00-SEQ-ZJGとの名称で、長さ７６，３６３バイトである。

連邦政府支援研究
本発明は、国立衛生研究所（NIH）により授与された助成金番号R01AI121066および75N93019C00044の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明について一定の権利を有する。

背景
流行性およびパンデミックの感染性疾患は多くの場合、鳥類および他の哺乳類からヒトへと容易に伝染するウイルスによって引き起こされる。かかるウイルスには、フラビウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、およびフィロウイルスなどのいくつかの科のウイルスが含まれる。最も懸念されるのはベータコロナウイルスとインフルエンザウイルスであり、どちらもヒトへの、またヒトの間での伝染性が高く、多くの場合毒性である。
これらのウイルスのパンデミックの可能性は明らかである。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoVまたはSARS-CoV-1）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS-CoV-2）は、それぞれ、２００２～２００４年の重症急性呼吸器症候群（SARS）の大流行および２０１９～２０２１年進行中の２０１９コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックを引き起こしたベータコロナウイルスである。A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスは、前世紀において、季節性インフルエンザの流行だけでなく、複数のインフルエンザパンデミックを引き起こした原因である。
これらのウイルスは感染力および毒性が高いことに加えて、変異率が高いために、蔓延を防ぐ取り組みが複雑となっている。SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2はそれぞれ変異して、感染性がさらに懸念される数百の株を生成している。A型インフルエンザウイルスは持続的に遺伝子再集合を起こし、複数のウイルスサブタイプ（例：H1N1、H3N2）を生成し、これらのサブタイプはヒト集団および他の自然宿主の集団内で同時に循環する。

概要
安全かつ効果的なワクチンの発見、開発、および導入は、SARS-CoV-2のパンデミックに対処するだけでなく、インフルエンザウイルスによって引き起こされるなどの将来発生し得る流行に備えるためにも、引き続き重要である。高齢者および免疫無防備状態等の明らかに脆弱な集団の免疫化は、次善の応答をもたらす可能性があり、複数回のブースター投与が必要となり、また免疫力の低下により制限される場合もある。アジュバント添加（adjuvantation）は、ワクチンに誘導される免疫を増強するための重要なアプローチである。アジュバントは、ワクチン抗原に対する免疫応答を増強、延長、および調節して防御免疫を最大化することができ、脆弱な集団のより効果的な免疫化を可能にし得る（例えば、非常に若い人および高齢者において、または有効なワクチンが欠如している疾患について）。さらに、SARS-CoV-2ワクチンに誘導される抗体による疾患増強（ADE）のリスクにも対処しなければならない。
本開示のいくつかの側面は、ウイルスに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法を提供し、この方法は、対象にウイルス抗原と、真菌多糖類を含むアジュバント系（adjuvantation system）とを投与することを含む。

いくつかの態様において、真菌多糖類は可溶性多糖類を含む。いくつかの態様において、真菌多糖類はマンナンを含む。いくつかの態様において、真菌多糖類はCandida albicansから単離される。いくつかの態様において、アジュバント系はミョウバンをさらに含む。いくつかの態様において、真菌多糖類はミョウバンに吸着される。いくつかの態様において、真菌多糖類はミョウバンに抱合している。
いくつかの態様において、ウイルスは、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）関連コロナウイルス（SARS-CoV）-1、およびSARS-CoV-2から選択される、ベータコロナウイルスである。
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、RNAはメッセンジャーRNA（mRNA）である。いくつかの態様において、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドは、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質またはスパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質は、MERS-CoVスパイクタンパク質もしくはスパイクタンパク質受容体結合ドメイン、SARS-CoV-1スパイクタンパク質もしくはスパイクタンパク質受容体結合ドメイン、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくはスパイクタンパク質受容体結合ドメインである。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または不活化MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または弱毒化生MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む。

いくつかの態様において、ウイルスは、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスである。
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、RNAはメッセンジャーRNA（mRNA）である。いくつかの態様において、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドは、血球凝集素（HA）タンパク質、ノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、またはそれらのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または不活化A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または弱毒化生A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。

いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象はヒト新生児、ヒト乳児、成人、または高齢者である。いくつかの態様において、対象は伴侶動物または研究動物である。いくつかの態様において、対象は免疫無防備状態であり、慢性肺疾患、喘息、心血管疾患、がん、肥満、糖尿病、慢性腎臓病、および／または肝疾患を有する。
いくつかの態様において、ウイルス抗原とアジュバント系とは同時に投与される。いくつかの態様において、ウイルス抗原とアジュバント系とは別々に投与される。いくつかの態様において、投与は、筋肉内、皮内、経口的、静脈内、局所的、鼻腔内、または舌下で行われる。いくつかの態様において、投与は予防的である。

いくつかの態様において、アジュバント系は、対象において１型免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、アジュバント系は、対象における樹状細胞関連C型レクチン２（デクチン２）の活性化を促進する。いくつかの態様において、アジュバント系は、対象の自然免疫応答を引き起こす。いくつかの態様において、アジュバント系はB細胞免疫を増強する。いくつかの態様において、アジュバント系は、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原特異的抗体の産生を増強する。いくつかの態様において、アジュバント系は、抗原特異的IgG2c抗体の産生を増強する。いくつかの態様において、アジュバント系は、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原特異的T細胞のサイトカイン産生を増強する。いくつかの態様において、アジュバント系は、IFNγの産生を増強する。いくつかの態様において、アジュバント系は、自然免疫応答を濾胞性ヘルパーT（Tfh）細胞免疫に極性化させる。いくつかの態様において、アジュバント系は、自然免疫応答をヘルパーT1（Th1）細胞免疫に極性化させる。いくつかの態様において、アジュバント系は、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、対象におけるウイルス抗原に対する防御効果を延長する。いくつかの態様において、アジュバント系は、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、免疫応答の速度を増加させる。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、アジュバント系の存在下で、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原に対して同レベルの免疫応答をより低い用量で生成する。いくつかの態様において、抗体による疾患増強（ADE）の可能性が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、対象において低減される。

本開示の他の側面は、ウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、もしくはSARS-CoV-2などのベータコロナウイルス、または、例えばA型インフルエンザウイルスもしくはB型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルス）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するのに使用するための、真菌多糖類を含むアジュバント系を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、ウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、もしくはSARS-CoV-2などのベータコロナウイルス、または、例えばA型インフルエンザウイルスもしくはB型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルス）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するのに使用するための、真菌多糖類およびミョウバンを含むアジュバント系を提供する。
また本明細書で提供されるのは、ウイルス抗原と、真菌多糖類を含むアジュバント系とを含む、免疫原性組成物である。いくつかの態様において、真菌多糖類はマンナンを含む。いくつかの態様において、真菌多糖類は、Candida albicansから単離された真菌多糖類を含む。いくつかの態様において、アジュバント系はミョウバンをさらに含む。いくつかの態様において、真菌多糖類はミョウバンに吸着される。いくつかの態様において、真菌多糖類はミョウバンに抱合している。

いくつかの態様において、ウイルスは、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）関連コロナウイルス（SARS-CoV）-１、およびSARS-CoV-2から選択される、ベータコロナウイルスである。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、RNAはメッセンジャーRNA（mRNA）である。いくつかの態様において、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドは、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質またはスパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質は、MERS-CoVスパイクタンパク質もしくはスパイクタンパク質受容体結合ドメイン、SARS-CoV-1スパイクタンパク質もしくはスパイクタンパク質受容体結合ドメイン、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくはスパイクタンパク質受容体結合ドメインである。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または不活化MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または弱毒化生MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む。

いくつかの態様において、ウイルスは、A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスから選択されるインフルエンザウイルスである。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、RNAはメッセンジャーRNA（mRNA）である。いくつかの態様において、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドは、血球凝集素（HA）タンパク質、ノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、またはそれらのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または不活化A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、死滅または弱毒化生A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。
上記の概要は、本明細書に開示される技術の態様、利点、特徴、および用途のいくつかを非限定的な様式で説明することを意図している。本明細書に開示される技術の他の態様、利点、特徴、および用途は、詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

添付の図面は、一定の縮尺で描くことを意図してはいない。図面において、様々な図に示される同一またはほぼ同一の構成要素は、それぞれ同様の数字で表されている。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面でラベル付けされているわけではない。図面においては以下である：

マンナンはリンパ節に限定されたIFNシグネチャーを誘発し、これはリンパ節の増大（expansion）を駆動する。図１Ａ：マウスに、生理食塩水（Sal.）、マンナン（Mann.）、またはβ-グルカン（β-gluc.）を皮内注射した。２４時間後、注射部位を、膿瘍（abscess）の存在と皮膚病変の有無について評価した。グラフは、示された各カテゴリのマウスの割合を示す。生理食塩水、マンナン、およびβ-グルカンの注射部位の皮膚の外観の代表的な写真も示す。群あたりＮ＝５匹のマウス。図１Ｂ：生理食塩水（Sal.）、β-グルカン（β-gluc.）、またはマンナン（Mann.）の注射から６時間後に収集した皮膚試料の、トランスクリプトーム解析。生理食塩水対照と比較した、β-グルカンおよび／またはマンナンによって誘導された遺伝子の存在量（Zスコア付きlog2正規化カウント）のヒートマップ、β-グルカンとマンナン間の存在量の差によってランク付けされる。遺伝子は、ギャップにより２つのクラスターに分割される：1つはβ-グルカンによって高度に上方制御され、もう1つはマンナンによって高度に上方制御される。群あたりＮ＝３匹のマウス。図１Ｃ：マウスに生理食塩水、マンナン（Mann.）またはβ-グルカン（β-gluc.）を皮内注射した。６時間または２４時間後にdLNを収集し、重量ならびにCD45⁺、B、およびT細胞の絶対数を分析した。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝５～９匹のマウス。図１Ｄ：マウスに、生理食塩水またはマンナンの皮内注射の1日前に、ブロッキング抗CD62L抗体(αCD62L)または同用量のアイソタイプ対照(Iso CTRL)を静脈内注射した。２４時間後、dLNを収集し、その重量を測定した。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝４匹のマウス。図１Ｅ：WTおよびCcr7^-/-マウスに、生理食塩水（Sal.）または蛍光標識マンナン（Mann.）を皮内注射した。１、６、および２４時間後にdLNを収集し、均質化して総蛍光を測定した。結果は、蛍光の任意単位（A.U.）として表され、平均＋SEMで示す。時点あたりＮ＝３匹のマウス。図１Ｆ：Ccr7^-/-マウスに、生理食塩水またはマンナンを皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、図１Ｃに示すように分析した。Ｎ＝６匹のマウス。図１Ｇ：生理食塩水（Sal.）、β－グルカン（β-gluc.）、またはマンナン（Mann.）の皮内注射後６時間および２４時間後に収集されたdLNの、トランスクリプトーム解析。生理食塩水対照と比較した、β－グルカンおよび／またはマンナンによって誘導された遺伝子の存在量（Zスコア付きlog2正規化カウント）のヒートマップ、β－グルカンとマンナンとの間の存在量の差によってランク付けされる。遺伝子は、ギャップにより２つのクラスターに分割される：１つはβ－グルカンによって高度に上方制御され、もう１つはマンナンによって高度に上方制御される。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。

図１Ｈ：図１Ｇに示すようにマンナンによって上方制御されるクラスターに属する遺伝子の、経路濃縮分析。図１Ｉ：生理食塩水対照と比較した、注射の２４時間後のマンナン処置dLNにおいて上方制御された上位５０遺伝子の、平均発現レベルのヒートマップ表示。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。図１Ｊ：WTマウスとIfnar^-/-マウスに、抗IFNγブロッキング抗体（aIFNγ）または同用量のアイソタイプ対照（Iso CTRL）を－１日目と０日目に静脈内注射した。０日目にはマウスに、生理食塩水（Sal.）またはマンナン（Mann.）も皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、その重量を測定し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、反対側の生理食塩水注入LN（重量）に対する倍数、またはGapdhと比較した相対発現として表される。群あたりＮ＝４匹のマウス。図１Ｋ：WTマウスおよびIfnar^-/-Ifngr^-/-マウスに、生理食塩水（Sal.）またはLipo-CpGを皮内注射した。試料を収集し、図１Ｊのように分析した。群あたりＮ＝５匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、各群を値１（倍数表示による、反対側の対照試料を表す）と比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、異なる実験群間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。

マンナン誘発性のリンパ節自然応答は、デクチン２を発現するCD169⁺洞マクロファージを必要とする。図２Ａ：WT、Clec4n^-/-、およびFcer1g^-/-マウスに、生理食塩水またはマンナンを皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、その重量を測定し、RNAを遺伝子発現分析のために抽出した。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。遺伝子型あたりＮ＝３～５匹のマウス。図２Ｂ：WTマウスに、蛍光標識マンナン（Mann.-AF488）を皮内注射した。６時間後dLNを収集し、マンナン含有（Mann.⁺）CD3/CD19/NK1.1^－細胞の絶対数を、フローサイトメトリーにより定量化した。Ｎ＝６匹のマウス。図２Ｃ：マウスを図２Ｂと同様に処置した。イメージングサイトメトリー分析およびマンナン内部移行の定量化を、CD3/CD19/NK1.1欠損CD45⁺マンナン含有（Mann.⁺）細胞に対して実施した。Ｎ＝４匹のマウス。図２Ｄ：WTマウスに蛍光標識マンナンを皮内注射した（Mann.）。１時間後dLNを、B220およびホスホSyk（pSyk）に対する抗体を使用した共焦点顕微鏡分析のために収集した。DAPIを核対比染色に使用した。１つの代表的な画像を示す。図２Ｅ：WTマウスおよびFcer1g^-/-マウスに、生理食塩水または蛍光標識マンナンを注射した。６時間後dLNを収集し、CD3/CD19/NK1.1^- CD45⁺マンナン含有（Mann.⁺）細胞、マンナン捕捉なしのCD45⁺細胞（Mann.-）および生理食塩水注入dLNからのCD45⁺細胞（Sal.）に対するフローサイトメトリーにより、CD86発現レベルを評価した。遺伝子型ごとにＮ＝６匹のマウス。図２Ｆ：WTマウスに、蛍光標識マンナンを皮内注射した。６時間後dLNを収集し、CD3/CD19/NK1.1^- CD45⁺マンナン含有（Mann.⁺）細胞の表現型を、フローサイトメトリーにより評価した。Ｎ＝６匹のマウス。図２Ｇ～２Ｉ：DT処置のCD11c-DTR、Ccr2^-/-、およびアイソタイプ対照（Iso CTRL）処置マウスまたは抗Ly6G（αLy6G）処置マウスを、図２Ａと同様に処置および分析した。群あたりＮ＝４匹のマウス。図２Ｊ、２Ｋ：LNを未処置のWTマウスから分離し、デクチン２（D2）の発現を、示されたCD3/CD19/NK1.1^- CD45⁺細胞サブセットにおける発現のパーセンテージとしてフローサイトメトリーにより評価した。図２Ｊの場合Ｎ＝６であり、または図２Ｋの場合Ｎ＝３である。図２Ｌ：デクチン２（D2）、B220、およびCD169に対する抗体で染色された未処置のLNの共焦点顕微鏡分析。DAPIを核対比染色に使用した。１つの代表的な画像を示す。図２Ｍ：DT処置のCD169-DTRマウスを図２Ａと同様に処置し、分析した。群あたりＮ＝４匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、各群を値１（倍数表示による、反対側の対照試料を表す）または生理食塩水対照と比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、異なる実験群間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。

非標準的なNF-κBサブユニットRelBの活性化は、マンナン誘発性のリンパ節の自然応答を制御する。図３Ａ：WTマウスおよびCard9^-/-マウスを図２Ａと同様に処置し、分析した。遺伝子型あたりＮ＝９匹（LN重量について）または４匹（遺伝子発現解析について）のマウス。図３Ｂ：CD3^- CD19^- NK1.1^- Ter119^- CD45⁺ AF488-マンナン⁺ Ly6G (CD11b⁺ Ly6C⁺) CD11b⁺ CD11c⁺細胞を、WT、Fcer1g^-/-、およびCard9^-/-マウスのdLNからAF488－マンナン注射の６時間後に選別し、転写プロファイルを、標的化トランスクリプトーム配列決定により評価した。結果は、変異体とWT対照間のFテストFDRが０．０５未満、およびlog2倍数変化（FC）が１より大きい（または－１未満）である遺伝子の、ヒートマップとして示される。図３Ｃ、３Ｄ：Relb^fl/flおよびCd11c^cre Relb^fl/flマウスを、生理食塩水、マンナンまたはLipo-CpGで処置し、図２Ａと同様に分析した。遺伝子型あたりＮ＝４～１３匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、各群を値１（倍数表示による、反対側の対照試料を表す）または生理食塩水対照と比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、異なる実験群間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。

マンナン誘発性のリンパ節自然応答に必要な分子経路は、マンナンアジュバント活性の大きさを調節する。CFSE標識OT-II（図４Ａ～４Ｄ）またはOT-I（図４Ｅ～４Ｈ）CD4⁺ T細胞を、WTマウスに－１日目に静脈内注射した。０日目、マウスに、生理食塩水、オボアルブミン（OVA）、またはマンナンと組み合わせたOVA（Mann）を皮内注射した。３日後、dLNを分離し、CFSE^lo細胞（すなわち、細胞分裂の少なくとも１サイクルを経た細胞）の絶対数（図４Ａ、４Ｅ）または各分裂ピークにおける細胞のパーセンテージ（図４Ｂ、４Ｆ）を、フローサイトメトリーにより定量化した。群あたりＮ＝４匹のマウス。＃＃は、各群を生理食塩水対照と比較した場合のｐ≦０．０１を示す（図４Ａ、４Ｅ）。＊および＊＊はそれぞれ、OVAとOVA＋mannを比較した場合のｐ≦０．０５およびｐ≦０．０１を示す。（図４Ａ、４Ｂ、４Ｅ、４Ｆ）。図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇ、４Ｈ：WT、Fcer1g^-/-、およびCard9^-/-マウスを、図４Ａ、４Ｂ、４Ｅ、および４Ｆと同様に処置および分析した（ただし、すべてのマウスに、マンナンと組み合わせたOVAを投与した）。遺伝子型ごとにＮ＝４匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、WTとFcer1g^-/-（黒）またはCard9^-/-とFcer1g^-/-（青）を比較した場合のｐ≦０．０５およびｐ≦０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、WTとCard9^-/-を比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。図４Ｂおよび４Ｆおよび４Ｄおよび４Ｈの結果は、平均値＋ＳＤで表示される。マンナン誘発性のリンパ節自然応答に必要な分子経路は、マンナンアジュバント活性の大きさを調節する。CFSE標識OT-II（図４Ａ～４Ｄ）またはOT-I（図４Ｅ～４Ｈ）CD4⁺ T細胞を、WTマウスに－１日目に静脈内注射した。０日目、マウスに、生理食塩水、オボアルブミン（OVA）、またはマンナンと組み合わせたOVA（Mann）を皮内注射した。３日後、dLNを分離し、CFSE^lo細胞（すなわち、細胞分裂の少なくとも１サイクルを経た細胞）の絶対数（図４Ａ、４Ｅ）または各分裂ピークにおける細胞のパーセンテージ（図４Ｂ、４Ｆ）を、フローサイトメトリーにより定量化した。群あたりＮ＝４匹のマウス。＃＃は、各群を生理食塩水対照と比較した場合のｐ≦０．０１を示す（図４Ａ、４Ｅ）。＊および＊＊はそれぞれ、OVAとOVA＋mannを比較した場合のｐ≦０．０５およびｐ≦０．０１を示す。（図４Ａ、４Ｂ、４Ｅ、４Ｆ）。図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇ、４Ｈ：WT、Fcer1g^-/-、およびCard9^-/-マウスを、図４Ａ、４Ｂ、４Ｅ、および４Ｆと同様に処置および分析した（ただし、すべてのマウスに、マンナンと組み合わせたOVAを投与した）。遺伝子型ごとにＮ＝４匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、WTとFcer1g^-/-（黒）またはCard9^-/-とFcer1g^-/-（青）を比較した場合のｐ≦０．０５およびｐ≦０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、WTとCard9^-/-を比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。図４Ｂおよび４Ｆおよび４Ｄおよび４Ｈの結果は、平均値＋ＳＤで表示される。

水酸化アルミニウム配合のマンナンは、免疫学的機能を予測する新規な物理的特性を獲得する。図５Ａ：GM-CSF分化の骨髄由来食細胞をWTから生成し、LPS、カードラン、β－グルカン（β-gluc.）、マンナン（Mann.）、水酸化アルミニウム／マンナン（AlumOH/mann.）で刺激した。１８～２１時間後、上清を収集し、TNFおよびIL-2タンパク質濃度をELISAにより測定し、同時に細胞を採取し、CD86およびOX40Lの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。Ｎ＝５回の独立した実験。図５Ｂ：マウスに、生理食塩水（sal.）、水酸化アルミニウム（AH）、β－グルカン（β-gluc）、マンナン（Mann）、または水酸化アルミニウム／マンナン（AH/mann）を皮内注射した。２４時間後、皮膚試料を収集し、RNAを遺伝子発現分析のために抽出した。結果は、反対側の生理食塩水注入皮膚試料の倍数として表される。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。図５Ｃ：マウスに、生理食塩水（Sal.）、蛍光標識β－グルカン（β-gluc）、蛍光標識マンナン（Mann）またはその水酸化アルミニウムとの配合物（AH/mann）を皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、均質化して総蛍光を測定した。結果は蛍光の任意単位（Ａ．Ｕ．）として表し、個々のデータ点として示される（水平バーは平均を表す）。Ｎ＝３匹のマウス。（図５Ｄ）マウスを図５Ａと同様に処置した。１、７、および１４日後にdLNを収集し、その重量を測定し、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表した。結果は、平均＋SEM（左パネル）または曲線下面積（AUC、右パネル）として表される。（図５Ｅ）マウスを図５Ａと同様に処置した。２４時間後、dLNを収集し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝５匹。（図５Ｆ）Ifnar^-/-マウスおよびWTマウスをそれぞれ、ブロッキング抗IFNγ抗体（αIFNγ）または同用量のアイソタイプ対照（Iso CTRL）で－１日目および０日目に処置し、および０日目に、マウスに生理食塩水（sal.）、β－グルカン（β-gluc）、またはAH／マンナン（AH/mann）を皮内注射した。２４時間後dLNを収集し、その重量を測定した。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝５匹のマウス。（図５Ｇ）WTマウスを、ブロッキング抗IFNARと抗IFNγ（αIFNAR/IFNγ）抗体、または同用量のアイソタイプ対照（Iso CTRL）で、－１日目および０日目に処置し、および０日目に、マウスに、生理食塩水（sal.）またはAH／マンナン（AH/mann）を皮内注射した。２４時間後dLNを収集し、その重量を測定した。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝５匹のマウス。

（図５Ｈ、５Ｉ）マウスを、AH／マンナンの可溶性（Sol）または粒子状（Part）画分で処置した。２４時間後、皮膚試料（図５Ｈ）およびdLN（図５Ｉ）を収集し、dLN重量を測定し、RNAを遺伝子発現分析のために抽出した。結果は、反対側の生理食塩水注入皮膚試料またはLNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝５匹のマウス。（図５Ｊ）示された背景のマウスに、生理食塩水（sal.）またはAH／マンナン（AH/mann）を注射した。２４時間後にdLNを収集し、その重量を測定し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、反対側の生理食塩水注入試料に対する倍数として、またはGapdhと比較した相対的発現として表される。（図５Ｋ、５Ｌ）WTマウスに、－１日目および０日目に同量のPBSまたは抗アシアロGM1除去抗体（αAsGM1）を注射するか（図５Ｋ）、またはWTマウスおよびBatf3^-/-マウス（図５Ｌ）に、０日目に生理食塩水（Sal）またはAH／マンナン（AH/mann）を皮内注射した。２４時間後にdLNを収集し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、Gapdhと比較した相対的発現として報告される。群あたりＮ＝５匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、各群をその未処置対照（CTRL）または値１（倍数表示による、反対側の対照試料を表す）と比較した場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、異なる実験群間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質および水酸化アルミニウム／マンナンによる免疫化は、抗スパイク１型免疫および中和抗体を生成する。図６Ａ～６Ｅ：マウスに、生理食塩水（Sal）、融合前安定化SARS-CoV-2三量体単独（S）、またはこれとAHとの組み合わせ（S/AH）、β－グルカンとの組み合わせ（S/β-gluc.）、マンナンとの組み合わせ（S/mann）またはAH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集し、抗スパイク（図６Ａ）および抗RBD（図６Ｂ）抗体レベル、SARS-CoV-2代替ウイルス中和試験（図６Ｄ）および中和力価（図６Ｅ）を評価した。選択された実験（図６Ｃ）において、マウスを３５日目に犠牲にし、脾臓を収集し、スパイクペプチドによるin vitro再刺激のために脾細胞を分離した。９６時間後、上清を収集し、IFNｇタンパク質レベルをELISAにより測定した。群あたり、Ｎ＝１６～１８（図６Ａ、６Ｂ）、１０（図６Ｃ）、８～１０（図６Ｄ）、または１３～１５（図６Ｅ）匹のマウス。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質および水酸化アルミニウム／マンナンによる免疫化は、抗スパイク１型免疫および中和抗体を生成する。図６Ａ～６Ｅ：マウスに、生理食塩水（Sal）、融合前安定化SARS-CoV-2三量体単独（S）、またはこれとAHとの組み合わせ（S/AH）、β－グルカンとの組み合わせ（S/β-gluc.）、マンナンとの組み合わせ（S/mann）またはAH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集し、抗スパイク（図６Ａ）および抗RBD（図６Ｂ）抗体レベル、SARS-CoV-2代替ウイルス中和試験（図６Ｄ）および中和力価（図６Ｅ）を評価した。選択された実験（図６Ｃ）において、マウスを３５日目に犠牲にし、脾臓を収集し、スパイクペプチドによるin vitro再刺激のために脾細胞を分離した。９６時間後、上清を収集し、IFNｇタンパク質レベルをELISAにより測定した。群あたり、Ｎ＝１６～１８（図６Ａ、６Ｂ）、１０（図６Ｃ）、８～１０（図６Ｄ）、または１３～１５（図６Ｅ）匹のマウス。図６Ｆ～６Ｈ：マウスに、生理食塩水（Sal）、融合前安定化SARS-CoV-2三量体単独（S）、またはこれをAHと組み合わせたもの（S/AH）を皮内注射した。マンナン（Mann）を、近位部位のS/AH注射と同じ側に別々に、同日（S/AH＋Mann（D0））または前日（S/AH＋Mann（D-1））のいずれかで注射した。対照として、AHおよびマンナンと組み合わせたSARS-CoV-2三量体（S/AH/Mann）も注射した。配合物を０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に注射した。血清試料を２８日目に収集して、抗スパイク抗体レベル（図６Ｆ）およびSARS-CoV-2中和力価（図６Ｇ）を評価した。選択された実験（図６Ｈ）において、マウスを３５日目に犠牲にし、脾臓を収集し、Ｃと同様にin vitro再刺激のために脾細胞を分離した。群あたりＮ＝６～８匹のマウス。＃、＊および＃＃、＊＊はそれぞれ、異なる実験群間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示す。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質および水酸化アルミニウム／マンナンによる免疫化は、幅広いエピトープ特異性を有する交差反応性抗スパイク抗体を生成する。マウスを、図６Ａ～６Ｅのように免疫化した。VirScan分析は、２８日目に収集した血清試料に対して実施した。各列は、個々のマウスから収集した単一の血清試料を表し、各行はペプチドタイルを表す。タイルは、アミノ酸の開始位置と終了位置によってラベル付けされる。陰影の強度は、各ペプチドの濃縮度（Zスコア）を表す。影付きの線は、各ウイルスのRBD、融合ペプチド、およびヘプタッドリピート２のおよそのアミノ酸位置（AA位置）を示す。群あたりＮ＝６匹のマウス。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質および水酸化アルミニウム／マンナンによる免疫化は、幅広いエピトープ特異性を有する交差反応性抗スパイク抗体を生成する。マウスを、図６Ａ～６Ｅのように免疫化した。VirScan分析は、２８日目に収集した血清試料に対して実施した。各列は、個々のマウスから収集した単一の血清試料を表し、各行はペプチドタイルを表す。タイルは、アミノ酸の開始位置と終了位置によってラベル付けされる。陰影の強度は、各ペプチドの濃縮度（Zスコア）を表す。影付きの線は、各ウイルスのRBD、融合ペプチド、およびヘプタッドリピート２のおよそのアミノ酸位置（AA位置）を示す。群あたりＮ＝６匹のマウス。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質および水酸化アルミニウム／マンナンによる免疫化は、幅広いエピトープ特異性を有する交差反応性抗スパイク抗体を生成する。マウスを、図６Ａ～６Ｅのように免疫化した。VirScan分析は、２８日目に収集した血清試料に対して実施した。各列は、個々のマウスから収集した単一の血清試料を表し、各行はペプチドタイルを表す。タイルは、アミノ酸の開始位置と終了位置によってラベル付けされる。陰影の強度は、各ペプチドの濃縮度（Zスコア）を表す。影付きの線は、各ウイルスのRBD、融合ペプチド、およびヘプタッドリピート２のおよそのアミノ酸位置（AA位置）を示す。群あたりＮ＝６匹のマウス。

AH／マンナンアジュバント配合物は、肺のウイルス感染に対する防御を与える。図８Ａ、８Ｂ：マウスに、生理食塩水（Sal）、融合前安定化SARS-CoV-2三量体単独（S）、またはこれとAH（S/AH）との組み合わせ、AH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）、AddaS03との組み合わせ（S/AddaS03）、またはAH/PHADとの組み合わせ（S/AH/PHAD）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集して、抗スパイクおよび抗RBD抗体レベルを評価した（図８Ａ）。３５日目にマウスにSARS-CoV-2 MA10を鼻腔内感染させ、２日後に肺のプラーク形成単位（PFU）の数を定量化した（図８Ｂ）。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。図８Ｃ～８Ｆ：マウスに、生理食塩水（Sal）、Flublok単独（rHA）、またはこれとAHとの組み合わせ（rHA/AH）、AH／マンナンとの組み合わせ（rHA/AH/mann）、AddaVaxとの組み合わせ（rHA/AddaVax）、またはAH/PHADとの組み合わせ（rHA/AH/PHAD）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集し、rHA（抗rHA、Ｃ）またはIAV A/PR/8/1934組換え血球凝集素（抗rPR8、図８Ｅ）に対する抗体を評価した。３５日目にマウスにIAV A/PR/8/1934を鼻腔内感染させ、体重を７日間記録した（図８Ｄ）。群あたりＮ＝５匹（図８Ｃ、８Ｅ）または８匹（図８Ｄ）のマウス。感染後７日目にマウスを犠牲にし、肺を組織学的分析のために収集した（ヘマトキシリン・エオシン染色、図８Ｆ）。群ごとに１つの代表的な画像が表示される。＃、＊および＃＃、＊＊はそれぞれ、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示す。 AH／マンナンアジュバント配合物は、肺のウイルス感染に対する防御を与える。図８Ａ、８Ｂ：マウスに、生理食塩水（Sal）、融合前安定化SARS-CoV-2三量体単独（S）、またはこれとAH（S/AH）との組み合わせ、AH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）、AddaS03との組み合わせ（S/AddaS03）、またはAH/PHADとの組み合わせ（S/AH/PHAD）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集して、抗スパイクおよび抗RBD抗体レベルを評価した（図８Ａ）。３５日目にマウスにSARS-CoV-2 MA10を鼻腔内感染させ、２日後に肺のプラーク形成単位（PFU）の数を定量化した（図８Ｂ）。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。図８Ｃ～８Ｆ：マウスに、生理食塩水（Sal）、Flublok単独（rHA）、またはこれとAHとの組み合わせ（rHA/AH）、AH／マンナンとの組み合わせ（rHA/AH/mann）、AddaVaxとの組み合わせ（rHA/AddaVax）、またはAH/PHADとの組み合わせ（rHA/AH/PHAD）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集し、rHA（抗rHA、Ｃ）またはIAV A/PR/8/1934組換え血球凝集素（抗rPR8、図８Ｅ）に対する抗体を評価した。３５日目にマウスにIAV A/PR/8/1934を鼻腔内感染させ、体重を７日間記録した（図８Ｄ）。群あたりＮ＝５匹（図８Ｃ、８Ｅ）または８匹（図８Ｄ）のマウス。感染後７日目にマウスを犠牲にし、肺を組織学的分析のために収集した（ヘマトキシリン・エオシン染色、図８Ｆ）。群ごとに１つの代表的な画像が表示される。＃、＊および＃＃、＊＊はそれぞれ、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示す。

マンナンとβ－グルカンとは異なる直径を示す。マンナン（Mann.）およびβ－グルカン（β-gluc.）調製物の流体力学的直径を、動的光散乱により測定した。１つの代表的な実験の結果が示される。可溶性マンナンはin vitroで不活性である。GM-CSF分化した骨髄由来食細胞を、WT（図１０Ａ、１０Ｂ）、Clec7a^-/-、Clec4n^-/-およびFcer1g^-/-マウス（図１０Ｂ）から生成し、LPS、カードラン、β－グルカン（β-gluc）、可溶性マンナン（Mann）（図１０Ａ、１０Ｂ）、非コーティングマイクロビーズ（Bのみ）およびマンナンに共有結合したマイクロビーズ（B:Mann）（図１０Ｂ）で刺激した。１８～２１時間後、上清を収集し、TNFおよびIL-2濃度をELISAにより測定し、同時に細胞を採取し、CD86およびOX40Lの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。Ｎ＝４～６の独立した実験。＃＃は、各群をその未処置の対照（CTRL）と比較した場合のｐ≦０．０１を示す。結果は平均値＋SEMで表示される。可溶性マンナンはin vitroで不活性である。GM-CSF分化した骨髄由来食細胞を、WT（図１０Ａ、１０Ｂ）、Clec7a^-/-、Clec4n^-/-およびFcer1g^-/-マウス（図１０Ｂ）から生成し、LPS、カードラン、β－グルカン（β-gluc）、可溶性マンナン（Mann）（図１０Ａ、１０Ｂ）、非コーティングマイクロビーズ（Bのみ）およびマンナンに共有結合したマイクロビーズ（B:Mann）（図１０Ｂ）で刺激した。１８～２１時間後、上清を収集し、TNFおよびIL-2濃度をELISAにより測定し、同時に細胞を採取し、CD86およびOX40Lの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。Ｎ＝４～６の独立した実験。＃＃は、各群をその未処置の対照（CTRL）と比較した場合のｐ≦０．０１を示す。結果は平均値＋SEMで表示される。図１１は、図１Ｂに示すように、β－グルカンによって上方制御されるクラスターに属する遺伝子の経路濃縮分析を示す。

マンナンおよびβ－グルカンは、排出LNにおける免疫細胞の動員および活性化のユニークなパターンを誘導する。図１２Ａ～１２Ｈ：マウスに、生理食塩水（黒色プロット）、マンナン（Mann、赤色プロット）またはβ－グルカン（β-gluc、赤色プロット）を皮内注射した。６時間または２４時間後、dLNを収集し、フローサイトメトリーにより、示された集団の絶対数（図１２Ａ～１２Ｇ）またはCD86発現（図１２Ｈ）について分析した。群あたりＮ＝５～６匹のマウス。マンナンおよびβ－グルカンは、排出LNにおける免疫細胞の動員および活性化のユニークなパターンを誘導する。図１２Ａ～１２Ｈ：マウスに、生理食塩水（黒色プロット）、マンナン（Mann、赤色プロット）またはβ－グルカン（β-gluc、赤色プロット）を皮内注射した。６時間または２４時間後、dLNを収集し、フローサイトメトリーにより、示された集団の絶対数（図１２Ａ～１２Ｇ）またはCD86発現（図１２Ｈ）について分析した。群あたりＮ＝５～６匹のマウス。図１２Ｉ～１２Ｋ：マウスに、生理食塩水（Sal）またはマンナン（Mann）を皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、総IFNγ⁺細胞（図１２Ｉ）またはCD45⁺細胞（図１２Ｊ）中の示された細胞集団の絶対数について分析した。CD8⁺ T細胞またはNK細胞におけるIFNγ産生レベルは、IFNγ発現細胞中のIFNγのMFIを測定することにより評価した（図１２Ｋ）。図１２Ｌ～１２Ｎ：-１日目および０日目に同量のPBSまたは抗アシアロGM1除去抗体（aAsGM1）で処置したWTマウス（図１２Ｌ、１２Ｎ）、またはWTマウスおよびBatf3^-/-マウス（図１２Ｍ））に、生理食塩水またはマンナンを０日目に皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、RNAを遺伝子発現分析のために抽出するか（図１２Ｌ、１２Ｍ）、またはdLNを秤量し、示された集団の絶対数をフローサイトメトリーにより分析した（図１２Ｎ）。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。＃および＃＃は、処置の間（Mann対β-gluc、図１２Ａ～１２Ｈ）で、または各群を値１（倍数表示による、反対側の対照試料を表す、図１２Ｌ、１２Ｍ）と比較した場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、処置（Mann、β-gluc）とそれぞれの生理食塩水対照の間で（図１２Ａ～１２Ｈ）、または示された実験群の間で（図１２Ｋ、１２Ｌ）比較した場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。図１２Ｉ～１２Ｋ：マウスに、生理食塩水（Sal）またはマンナン（Mann）を皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、総IFNγ⁺細胞（図１２Ｉ）またはCD45⁺細胞（図１２Ｊ）中の示された細胞集団の絶対数について分析した。CD8⁺ T細胞またはNK細胞におけるIFNγ産生レベルは、IFNγ発現細胞中のIFNγのMFIを測定することにより評価した（図１２Ｋ）。図１２Ｌ～１２Ｎ：-１日目および０日目に同量のPBSまたは抗アシアロGM1除去抗体（aAsGM1）で処置したWTマウス（図１２Ｌ、１２Ｎ）、またはWTマウスおよびBatf3^-/-マウス（図１２Ｍ））に、生理食塩水またはマンナンを０日目に皮内注射した。２４時間後、dLNを収集し、RNAを遺伝子発現分析のために抽出するか（図１２Ｌ、１２Ｍ）、またはdLNを秤量し、示された集団の絶対数をフローサイトメトリーにより分析した（図１２Ｎ）。結果は、反対側の生理食塩水注入LNに対する倍数として表される。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。＃および＃＃は、処置の間（Mann対β-gluc、図１２Ａ～１２Ｈ）で、または各群を値１（倍数表示による、反対側の対照試料を表す、図１２Ｌ、１２Ｍ）と比較した場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、処置（Mann、β-gluc）とそれぞれの生理食塩水対照の間で（図１２Ａ～１２Ｈ）、または示された実験群の間で（図１２Ｋ、１２Ｌ）比較した場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。

可溶性全グルカン粒子は、LNの増大およびISGの発現を誘発する。マウスに、生理食塩水（Sal.）、分散性（WGP-D）または可溶性（WGP-S）の全グルカン粒子を皮内注射した。２４時間後、注射部位を図１Ａに示すように評価した。図１３Ａ：皮膚試料およびdLNを収集し、LN重量を測定し、RNAを遺伝子発現分析のために抽出した。図１３Ｂ：結果は、生理食塩水注入皮膚試料またはLNの中央値に対する倍数として表される。群あたりＮ＝４匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、各群を値１（倍数表示による、生理食塩水対照試料を表す）と比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、異なる実験群間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。マンナンは、dLNにおいてCARD-9非依存性応答を誘発する。遺伝子の経路分析は、図３Ｂに示すように、Fcer1g^-/-マウスと比較して、WTにおいて有意に誘導された。

水酸化アルミニウムを配合したマンナンは、免疫学的機能を予測する新規な物理的特性を獲得する。図１５Ａ：可溶性マンナン（mann）、AH、およびマンナンとAHの配合物（AH/mann）を、室温で３０分間インキュベートし、次いでスピンダウンし、上清を未結合マンナンの1H核磁気共鳴定量化のために収集した。反応物は過剰のマンナンを含有していた。結果は、AHのマンナン吸収能力が、この配合戦略ではその質量の約２倍であることを示す。結果は可溶性マンナンのパーセンテージとして表され、平均値＋ＳＤとして示される。図１５Ｂ～１５Ｉ：GM-CSF分化の骨髄由来食細胞を、WTまたは示されたノックアウトマウスから生成し、AH、マンナン（Mann）、AH／マンナン（AH/mann）で刺激した。１８～２１時間後、上清を収集し、TNFおよびIL-2タンパク質濃度をELISAにより測定した（図１５Ｂ、１５Ｃ）。細胞を採取し、CD86およびOX40Lの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した（図１５Ｄ、１５Ｅ）。代替的に、細胞を６時間刺激し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、Rpl13aと比較した相対発現として報告される（図１５Ｆ～１５Ｉ）。Ｎ＝３（図１５Ａ）または４（図１５Ｂ、１５Ｉ）の独立した実験。＃および＃＃はそれぞれ、処置間で同じ遺伝子型を比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、同じ処置の遺伝子型間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示される。水酸化アルミニウムを配合したマンナンは、免疫学的機能を予測する新規な物理的特性を獲得する。図１５Ａ：可溶性マンナン（mann）、AH、およびマンナンとAHの配合物（AH/mann）を、室温で３０分間インキュベートし、次いでスピンダウンし、上清を未結合マンナンの1H核磁気共鳴定量化のために収集した。反応物は過剰のマンナンを含有していた。結果は、AHのマンナン吸収能力が、この配合戦略ではその質量の約２倍であることを示す。結果は可溶性マンナンのパーセンテージとして表され、平均値＋ＳＤとして示される。図１５Ｂ～１５Ｉ：GM-CSF分化の骨髄由来食細胞を、WTまたは示されたノックアウトマウスから生成し、AH、マンナン（Mann）、AH／マンナン（AH/mann）で刺激した。１８～２１時間後、上清を収集し、TNFおよびIL-2タンパク質濃度をELISAにより測定した（図１５Ｂ、１５Ｃ）。細胞を採取し、CD86およびOX40Lの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した（図１５Ｄ、１５Ｅ）。代替的に、細胞を６時間刺激し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、Rpl13aと比較した相対発現として報告される（図１５Ｆ～１５Ｉ）。Ｎ＝３（図１５Ａ）または４（図１５Ｂ、１５Ｉ）の独立した実験。＃および＃＃はそれぞれ、処置間で同じ遺伝子型を比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、同じ処置の遺伝子型間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示される。水酸化アルミニウムを配合したマンナンは、免疫学的機能を予測する新規な物理的特性を獲得する。図１５Ａ：可溶性マンナン（mann）、AH、およびマンナンとAHの配合物（AH/mann）を、室温で３０分間インキュベートし、次いでスピンダウンし、上清を未結合マンナンの1H核磁気共鳴定量化のために収集した。反応物は過剰のマンナンを含有していた。結果は、AHのマンナン吸収能力が、この配合戦略ではその質量の約２倍であることを示す。結果は可溶性マンナンのパーセンテージとして表され、平均値＋ＳＤとして示される。図１５Ｂ～１５Ｉ：GM-CSF分化の骨髄由来食細胞を、WTまたは示されたノックアウトマウスから生成し、AH、マンナン（Mann）、AH／マンナン（AH/mann）で刺激した。１８～２１時間後、上清を収集し、TNFおよびIL-2タンパク質濃度をELISAにより測定した（図１５Ｂ、１５Ｃ）。細胞を採取し、CD86およびOX40Lの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した（図１５Ｄ、１５Ｅ）。代替的に、細胞を６時間刺激し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。結果は、Rpl13aと比較した相対発現として報告される（図１５Ｆ～１５Ｉ）。Ｎ＝３（図１５Ａ）または４（図１５Ｂ、１５Ｉ）の独立した実験。＃および＃＃はそれぞれ、処置間で同じ遺伝子型を比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、同じ処置の遺伝子型間で比較した場合のｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示される。

AH／マンナン配合のSARS-CoV-2スパイクによる免疫化により活性化されるBおよびT細胞応答は、AH／マンナン誘発性のLIRと同じ細胞要件および分子要件を有する。WTマウス、トランスジェニックマウスまたはWTマウスを、－１、０、１３および１４日目にブロッキング抗IFNARと抗IFNγ（αIFNAR/IFNγ）抗体、または同用量のアイソタイプ対照（Iso CTRL）で処置し、これらのマウスに、融合前安定化SARS-CoV-2三量体とAHとの組み合わせ（S/AH）またはAH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目（図１６Ｂ～１６Ｇ）または９８日目（図１６Ａ、WTマウス）に収集して、抗スパイク抗体レベルを評価した。選択された実験（図１６Ｂ、１６Ｃ）において、マウスを３５日目に犠牲にし、脾臓を収集し、スパイクペプチドによるin vitro再刺激のために脾細胞を分離した。９６時間後、上清を回収し、IFNγタンパク質レベルをELISAにより測定した。群あたりＮ＝４～７匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、S/AHおよびS/AH/mann対Sal（図１６Ａ）またはS/AH/mann対S/AH（図１６Ｂ～１６Ｇ）を比較する場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、S/AH/mann対S/AH（図１６Ａ）または処置もしくは遺伝子型にわたってS/AH/mann（図１６Ｂ～１６Ｇ）を比較する場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示される。 AH／マンナン配合のSARS-CoV-2スパイクによる免疫化により活性化されるBおよびT細胞応答は、AH／マンナン誘発性のLIRと同じ細胞要件および分子要件を有する。WTマウス、トランスジェニックマウスまたはWTマウスを、－１、０、１３および１４日目にブロッキング抗IFNARと抗IFNγ（αIFNAR/IFNγ）抗体、または同用量のアイソタイプ対照（Iso CTRL）で処置し、これらのマウスに、融合前安定化SARS-CoV-2三量体とAHとの組み合わせ（S/AH）またはAH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目（図１６Ｂ～１６Ｇ）または９８日目（図１６Ａ、WTマウス）に収集して、抗スパイク抗体レベルを評価した。選択された実験（図１６Ｂ、１６Ｃ）において、マウスを３５日目に犠牲にし、脾臓を収集し、スパイクペプチドによるin vitro再刺激のために脾細胞を分離した。９６時間後、上清を回収し、IFNγタンパク質レベルをELISAにより測定した。群あたりＮ＝４～７匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、S/AHおよびS/AH/mann対Sal（図１６Ａ）またはS/AH/mann対S/AH（図１６Ｂ～１６Ｇ）を比較する場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。＊および＊＊はそれぞれ、S/AH/mann対S/AH（図１６Ａ）または処置もしくは遺伝子型にわたってS/AH/mann（図１６Ｂ～１６Ｇ）を比較する場合の、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示される。

AH/mannアジュバント配合物は、肺のウイルス感染に対する防御を与える。図１７Ａ、１７Ｂ：マウスに、生理食塩水（Sal）、融合前安定化SARS-CoV-2三量体単独（S）、またはこれとAHとの組み合わせ（S/AH）、AH／マンナンとの組み合わせ（S/AH/mann）、AddaS03との組み合わせ（S/AddaS03）、もしくはAH/PHADとの組み合わせ（S/AH/PHAD）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。血清試料を２８日目に収集して、SARS-CoV-2代替ウイルス中和試験（図１７Ａ）および中和力価（図１７Ｂ）を評価した。群あたりＮ＝４～５匹のマウス。図１７Ｃ、１７Ｄ：マウスに、生理食塩水（Sal）、Flublok単独（rHA）、またはこれとAHとの組み合わせ（rHA/AH）、AH／マンナンとの組み合わせ（rHA/AH/mann）、AddaVaxとの組み合わせ（rHA/AddaVax）、もしくはAH/PHADとの組み合わせ（rHA/AH/PHAD）を、０日目（プライム）および１４日目（ブースト）に皮内注射した。３５日目に、マウスにIAV A/PR/8/1934を鼻腔内感染させた。４２日目に血清試料を収集して、抗IAV A/PR/8/1934組換え血球凝集素（抗rPR8）レベルを評価した（図１７Ｃ）。肺画像の組織学的スコアは、図８Ｆのように収集した（図１７Ｄ）。群あたりＮ＝５匹のマウス。＃および＃＃はそれぞれ、ｐ≦０．０５および０．０１を示す。比較は陰影で示される。

特定の態様の詳細な説明
ヒトの免疫は健康状態および病気の両方にとって極めて重要であり、感染性疾患、アレルギー、およびがんを含む複数の主要な疾患において重要な役割を果たしている。感染性疾患は、生命の極限における罹患率と死亡率の主な原因である。COVID-19の原因物質であるSARSコロナウイルス２（SARS-CoV-2）は、２０１９年末に中国で最初に発生した。世界中で１億１，５００万人以上が感染し、２５０万人以上の死亡が特に高齢者の間で生じている。しかし、SARS-CoV-2のパンデミック中であっても、インフルエンザウイルスを含む他の多くのウイルスは、依然として人間の健康に大きな懸念を与え続けている。安全で効果的なワクチンの発見、開発、および導入は、現在のSARS-CoV-2パンデミック、および将来発生し得るその他の伝染病の両方に対処する鍵となるだろう。
高齢者および免疫無防備状態等の明らかに脆弱な集団の免疫化は、次善の応答をもたらす可能性があり、複数回のブースター投与が必要となり、また免疫力の低下により制限される場合もある。アジュバント添加は、ワクチンに誘導される免疫を増強するための重要なアプローチである。アジュバントは、ワクチン抗原に対する免疫応答を増強、延長、および調節して防御免疫を最大化することができ、脆弱な集団のより効果的な免疫化を可能にし得る（例えば、非常に若い人および高齢者において、または有効なワクチンが欠如している疾患について）。さらに、SARS-CoV-2ワクチンに誘導される抗体による疾患増強（ADE）のリスクにも対処しなければならない。

本開示のいくつかの側面は、ウイルス抗原と、真菌種由来の多糖類を含むアジュバント系とを含む、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）を提供する。いくつかの態様において、アジュバント系はさらにミョウバンを含む（例えば、真菌多糖類にミョウバンが配合される）。いくつかの態様において、真菌多糖類（例：マンナン）はミョウバン中に吸着される。いくつかの態様において、真菌多糖類（例：マンナン）は、ミョウバンに共有結合している。本明細書で提供される免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、それを必要とする対象で抗原に対する免疫応答を誘導する方法において使用することができ、この方法は、有効量のウイルス抗原および有効量のアジュバント系（例：真菌多糖類のみを含むか、または真菌多糖類とミョウバンを含む）を、対象に投与することを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、新生児、成人、または高齢者（例：６５歳以上）である対象において、免疫応答を誘導するために使用され得る。

「ベータコロナウイルス」は、コロナウイルスの４つの属（アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ）のうちの１つである。ベータコロナウイルスは、Nidovirales（ニドウイルス）目Coronaviridae（コロナウイルス）科のOrthocoronavirinae（オルトコロナウイルス）亜科に属する。これらは、人獣共通感染症由来の、エンベロープを持つポジティブセンス一本鎖RNAウイルスである。ヒトにとって臨床的に最も重要なベータコロナウイルスとしては、SARS-CoV-1（SARSの原因）、SARS-CoV-2（COVID-19新型コロナウイルス感染症の原因）、およびMERS-CoV（MERSの原因）などが挙げられる。
「インフルエンザウイルス」とは、次の４種類のインフルエンザウイルスのうちの１つを指す：A型インフルエンザウイルス（IAV）、B型インフルエンザウイルス（IBV）、C型インフルエンザウイルス、およびD型インフルエンザウイルス。インフルエンザウイルスは、Articulavirales（アーティキュラウイルス）目Orthomyxoviridae（オルソミクソウイルス）科に属する。D型インフルエンザを除くすべてのウイルスは、ヒトに病気を引き起こすことが知られているが、A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスは流行のリスクが最も高く、したがって臨床的に最も重要である。インフルエンザウイルスは多くの場合、サブタイプに応じて分類される。特にA型インフルエンザウイルスは、血球凝集素タンパク質（HA）およびノイラミニダーゼタンパク質（NA）のどのバリアントをそれがコードするかに応じて分類される。１８の異なる血球凝集素のバリアント（すなわちH1～H18）と１１の異なるノイラミニダーゼのバリアント（すなわちN1～N11）があり、理論的には合計１９８のA型インフルエンザのサブタイプが考えられる。A型インフルエンザおよびインフルエンザの株は、クレードとサブクレードに従ってさらに分類し得る。特に臨床的に重要なA型インフルエンザサブタイプには、A/H1N1（1918「スペイン風邪」および2009豚インフルエンザ）、A/H5N1（2008鳥インフルエンザ）、およびA/H7N9（2013鳥インフルエンザ）が含まれる。特に臨床的に重要なB型インフルエンザサブタイプには、B／ビクトリアおよびB／ヤマガタが含まれる。

「真菌多糖類」は、真菌界に属する任意の細胞種によって合成される炭水化物（例：糖）のポリマーである。真菌多糖類は、真菌細胞によって生成および分泌され得るか、または真菌細胞の成分として（例：真菌細胞壁の構造成分として）存在し得る。真菌多糖類は、例えば限定されないがタンパク質（例：真菌細胞の表面に発現される糖タンパク質）などの別の化学部分に共有結合することができる。真菌多糖類は、多糖類を形成するような方法で共有結合した１つまたは複数タイプの炭水化物モノマーから構成され得る。真菌多糖類は、溶液、特に水溶液に可溶性、部分的に可溶性、または不溶性であり得る。真菌多糖類は、その長さ（直径）に従って測定することができ、直径として１ｎｍ以上、５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、２５ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、７５ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または１０００ｎｍ以上を有し得る。真菌多糖類は、長さが均一でも不均一でもよく、例えば多糖類の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ほぼ同じ直径を有する。真菌多糖類は、真菌オリゴ糖であってもよい。真菌多糖類は、誘導体真菌多糖類、例えば真菌細胞から元々単離された多糖類の短縮型（すなわち、低分子量）または伸長型（すなわち、高分子量）などであり得る。真菌多糖類は、抗原性の特性を有し得る（すなわち、動物またはヒト対象における免疫応答を活性化する）。真菌多糖類は、動物またはヒト対象の細胞の、抗原特異的受容体のリガンドであり得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）および方法で使用するための真菌多糖類は、マンナン（すなわち、マンノースポリマー）である。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）および方法で使用するための真菌多糖類は、β-グルカンである。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）および方法で使用するための真菌多糖類は、対象において免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）および方法で使用するための真菌多糖類は、Candida albicansなどの、免疫応答を誘発する病原性真菌から単離される。真菌多糖類（例：マンナン、β-グルカンなど）の、ベータコロナウイルス、特にSARS-CoV-1およびSARS-CoV-2、またはインフルエンザウイルスに対する免疫化におけるワクチンアジュバントとしての効果は、これまで調査も実証もされていない。

「アジュバント系」とは、１つ以上のアジュバントを含む組成物を指す。「アジュバント」とは、例えばワクチン中の抗原などの他の薬剤の効果を改変する、薬理学的または免疫学的薬剤を指す。アジュバントは典型的には、レシピエント対象の抗原に対する免疫応答を強化するために、ワクチンに含まれる。アジュバントの使用により、対象においてより強力な免疫応答を同じ用量の抗原で誘導することができ、または、同様のレベルの免疫応答をより低い用量の抗原の注射により誘導することができる。アジュバントはいくつかの方法で機能すると考えられており、これには、抗原の表面積を増やすこと、抗原の体内での保持期間を延長しそれによってリンパ系が抗原にアクセスできる時間を確保すること、抗原の放出を遅らせること、抗原をマクロファージに標的化すること、マクロファージを活性化すること、抗原提示細胞（例：単球、マクロファージ、および／または樹状細胞）などの白血球を活性化すること、または免疫系の細胞の広範な活性化を誘発することなどを含み、例えば、H. S. Warren et al, Annu. Rev. Immunol., 4:369 (1986)を参照されたい；これは参照により本明細書に組み込まれる。したがって、特定のタイプの免疫応答を誘導および増加させるアジュバントの能力、およびその能力の同定は、特定の病原体に対するワクチン用途のために特定のアジュバントを選択する際の、重要な要素である。当業者に知られているアジュバントには、限定はされないが以下が含まれる：アルミニウム塩（例：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなど、本明細書では集合的に「ミョウバン」と呼ぶ）、リポソーム、リポ多糖類（LPS）またはその誘導体、例えばモノホスホリル脂質A（MPLA）およびグリコピラノシル脂質A（GLA）など、抗原の分子ケージ、細菌細胞壁の成分、エンドサイトーシスされた核酸、例えば二本鎖RNA（dsRNA）、一本鎖DNA（ssDNA）、および非メチル化CpGジヌクレオチド含有DNAなど。典型的なアジュバントには、フロイントアジュバントおよびMF59などの水および油のエマルション、およびミョウバンなどの化合物が含まれる。現在、米国で認可されているワクチンには限られた数のアジュバントのみが含有されており、これには、ヘルパーT2型（Th2）細胞の産生を促進するミョウバンおよび、Toll様受容体４（TLR4）を介して自然免疫を活性化するMPLAなど含まれる。最も効果的なアジュバントの多くには、細菌またはその産物が含まれ、例えば、Mycobacterium bovis（ウシ型結核菌）の弱毒株、Bacille Calmette-Guerin（カルメットとゲランの菌）（BCG）；微生物構成要素、例えば、ミョウバン沈殿物ジフテリアトキソイド、細菌性リポ多糖類（「エンドトキシン」）、およびMPLAおよびGLAなどのそれらの誘導体である。

いくつかの態様において、本開示のアジュバント系は、真菌多糖類（例：マンナン）を含む。いくつかの態様において、本開示のアジュバント系は、真菌多糖類（例：マンナン）とアルミニウム塩（本明細書では「ミョウバン」と称される）を含む。いくつかの態様において、ミョウバンは、Alhydrogel（登録商標）（InvivoGen, USA）である。いくつかの態様において、真菌多糖類（例：マンナン）とミョウバンを含むアジュバント系において、真菌多糖類（例：マンナン）はミョウバンに吸着される（例えば、Jones et al., Journal of Biological Chemistry 280, 13406-13414, 2005に記載のように；これは参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、真菌多糖類（例：マンナン）を含むアジュバント系において、真菌多糖類（例：マンナン）は、以下のようなアジュバントに共有結合されている：ミョウバン、リポソーム、またはリポ多糖類（LPS）またはそれらの誘導体、例えばモノホスホリル脂質A（MPLA）およびグリコピラノシル脂質A（GLA）等。

アジュバントまたはアジュバント系は、免疫原性組成物（例：本明細書に記載のウイルス免疫原性組成物（例：ワクチン組成物））において使用される。用語「ワクチン組成物」および「ワクチン」は、本明細書では互換的に使用される。「免疫原性組成物」は、抗原に対する対象の免疫応答を、ワクチンが対象に投与された後に、活性化または増強する組成物である。ワクチン組成物は、免疫原性組成物の一種である。いくつかの態様において、免疫原性組成物は、対象の免疫系を刺激して、抗原（例：ベータコロナウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原）を外来のものとして認識させ、対象が後に病原体（例：ベータコロナウイルス、インフルエンザウイルス）に暴露されると、弱毒化、不活化、死滅かどうかにかかわらず対象の免疫応答を増強する。ワクチンは予防的なものであってもよく、例えば、病原体（例：ベータコロナウイルス、インフルエンザウイルス）への将来の曝露による有害な影響を予防もしくは改善するなどであり、または治療的なものであってもよく、例えば、対象が病原体（例：ベータコロナウイルス、インフルエンザウイルス）に感染した後に、対象の病原体に対する免疫応答を活性化するなどである。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、生物を、疾患（例：MERS、SARS、COVID-19、および／またはインフルエンザ）から防御または処置するために使用される。

いくつかの態様において、ワクチンは、以下である：サブユニットワクチン（例えば、組換えサブユニットベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルス、またはB型インフルエンザウイルス）ワクチン）、弱毒化ワクチン（例えば、弱毒化ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）、または弱毒化インフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）のウイルスゲノムを含有するもの）、生ワクチン（例えば、弱毒化生ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）、または弱毒化生インフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）を含有するもの）、または結合型ワクチン（conjugated vaccine）（例えば、免疫原性が弱く、かつ比較的免疫原性の高い抗原に共有結合している抗原（例えば、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）抗原、インフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）抗原）を含有するワクチン）。結合型ワクチンの１つの非限定的な例は、強力なタンパク質抗原に結合したLPSを含む。いくつかの態様において、ワクチンは、死滅／不活化されたベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）、または死滅／不活化されたインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）を含む。いくつかの態様において、ワクチンは、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）のウイルス粒子を含む。

「抗原」とは、抗体もしくは受容体が結合する実体、または抗体の産生を誘導する実体を指す。いくつかの態様において、抗原は、抗原に特異的に結合する抗体の産生を増加させる。いくつかの態様において、抗原は、タンパク質またはポリペプチドを含む。かかるタンパク質またはペプチドは、本明細書では「免疫原性ポリペプチド」と呼ばれる。いくつかの態様において、「抗原」という用語は、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸（例：DNAまたはRNA分子）を包含する。いくつかの態様において、抗原は、微生物病原体に由来する。例えば抗原は、細菌、ウイルス、真菌、および他の微生物の一部（外皮、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素）を含み得る。本明細書で使用される場合、「ウイルス抗原」という用語は、ウイルスに由来する抗原を、またはタンパク質／ポリペプチドおよび核酸抗原の場合には、内因性ウイルスタンパク質／ポリペプチドまたは核酸と同一または実質的に類似（相同）な配列を有する抗原を指し得る。本開示の目的のために、抗原は、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）の一部を含み得る。

いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチド抗原は、野生型（すなわち、「天然」）タンパク質またはポリペプチドである。いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチド抗原は、野生型タンパク質またはポリペプチドに対するポリペプチドバリアントである。用語「ポリペプチドバリアント」とは、アミノ酸配列が天然配列または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。いくつかの態様において、ポリペプチドバリアントは、天然配列または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの態様において、バリアントは、天然配列または参照配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を共有する。
いくつかの態様において、ポリペプチドバリアントは、置換、挿入、および／または欠失を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドバリアントは、共有結合バリアント（covalent variant）および誘導体を包含する。用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義に使用されるが、一般に、参照分子または出発分子に対して何らかの形で修飾および／または変更された分子を指す。

いくつかの態様において、１つ以上のリジンなどの配列タグまたはアミノ酸を、ペプチド配列に（例えば、N末端またはC末端に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置特定に使用することができる。リジンを使用して、ペプチドの溶解度を高め、またはビオチン化を可能にすることができる。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意に欠失させて、切断された配列を提供し得る。代替的に、特定のアミノ酸（例えば、C末端残基またはN末端残基）は、例えば、可溶性または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部としての配列の発現など、配列の使用に応じて欠失され得る。
いくつかの態様において、ポリペプチドバリアントは、天然配列または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに同じ位置に挿入された異なるアミノ酸を含む。置換は、分子内の１つのアミノ酸のみが置換される単一の場合もあれば、同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換される複数の場合もある。いくつかの態様において、抗原は、参照タンパク質と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の置換を含む、ポリペプチドである。

いくつかの態様において、置換は、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸を、同様のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、およびロイシンなどの非極性（疎水性）残基を、別の非極性残基で置換することが含まれる。同様に、保存的置換の例には、ある極性（親水性）残基から別の残基への置換、例えばアルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、およびグリシンとセリンの間などが含まれる。さらに、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの塩基性残基を別の塩基性残基に置換すること、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの酸性残基を別の酸性残基に置換することも、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基を、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基で置換すること、または非極性残基を極性残基で置換することが含まれる。

いくつかの態様において、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質が、本開示に従って抗原として使用される。例えば、抗原は、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基短いが、それ以外は同一である、ポリペプチド配列を意味する）であって、アミノ酸の長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるものを含み得る。別の例では、本明細書における参照タンパク質（例：微生物病原体からのタンパク質）と、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一である、２０、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を、本開示に従って利用することができる。
いくつかの態様において、抗原は、２つ以上の免疫原性タンパク質またはポリペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）を含む。いくつかの態様において、２つ以上の免疫原性タンパク質またはポリペプチドは、１つのタンパク質（例えば、異なる断片または１つのタンパク質）に由来する。いくつかの態様において、２つ以上の免疫原性タンパク質またはポリペプチドは、複数のタンパク質（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のタンパク質）に由来する。

いくつかの態様において、抗原は、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、抗原は、免疫原性タンパク質または免疫原性ポリペプチド、および免疫原性タンパク質または免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含む。用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、その最も広い意味で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、典型的には、オープンリーディングフレーム（ORF）および１つ以上の制御配列を含む。核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、以下であってもよいし、以下を含んでもよい：例えば、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、トレオース核酸（TNA）、グリコール核酸（GNA）、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（LNA、これは以下を含む：β－D－リボ配置を有するLNA、α－L－リボ配置を有するα－LNA（LNAのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－LNA、および２'－アミノ官能基化を有する２'－アミノ－α－LNA）、エチレン核酸（ENA）、シクロヘキセニル核酸（CeNA）またはそれらのキメラもしくは組み合わせ。

いくつかの態様において、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸は、DNA（例：免疫原性タンパク質または免疫原性ポリペプチドの発現ベクター）である。いくつかの態様において、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸は、RNA（例：メッセンジャーRNA）である。「メッセンジャーRNA」（mRNA）とは、（少なくとも１つの）ポリペプチド（アミノ酸の、天然に存在する、非天然に存在する、または修飾された、ポリマー）をコードし、かつ翻訳されて、コードされたポリペプチドをin vitro、in vivo、in situ、またはex vivoで生成することができる、任意のポリヌクレオチドを指す。mRNA分子の基本構成要素は、典型的には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（UTR）、３’UTR、５’キャップおよびポリＡテールを含む。

いくつかの態様において、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸（例：DNAまたはRNA）のコード領域は、コドン最適化されている。コドン最適化方法は当技術分野で知られており、本明細書で提供されるように使用することができる。いくつかの態様において、コドン最適化を使用して標的生物と宿主生物のコドン頻度を一致させ、適切なフォールディングを確保し；GC含有量にバイアスをかけてmRNAの安定性を高めるか、または二次構造を低減し；遺伝子の構築または発現を損ない得るタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化し；転写および翻訳制御領域をカスタマイズし；タンパク質輸送配列を挿入または除去し；コードされたタンパク質の翻訳後修飾部位（例：グリコシル化部位）を除去／追加し；タンパク質ドメインを追加、除去、またはシャッフルし；制限部位を挿入または除去し；リボソーム結合部位およびmRNA分解部位を修飾し；翻訳速度を調整して、タンパク質の様々なドメインが適切に折りたたまれるようにし；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減または除去することができる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは当技術分野で知られており、非限定的な例としては、GeneArt（Life Technologies）、DNA2.0 (Menlo Park CA)のサービス、および／または独自の方法が挙げられる。いくつかの態様において、オープンリーディングフレーム（ORF）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。

いくつかの態様において、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする天然に存在するかまたは野生型のmRNA配列）と、９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする天然に存在するかまたは野生型のmRNA配列）と、９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする天然に存在するかまたは野生型のmRNA配列）と、８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする天然に存在するかまたは野生型のmRNA配列）と、８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする天然に存在するかまたは野生型のmRNA配列）と、７５％未満の配列同一性を共有する。

いくつかの態様において、免疫原性タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、１つ以上の化学修飾を含む。用語「化学修飾」および「化学修飾された」とは、アデノシン（A）、グアノシン（G）、ウリジン（U）、チミジン（T）またはシチジン（C）のリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドについて、それらの位置、パターン、パーセント、または集団の少なくとも１つにおける修飾を指す。
いくつかの態様において、核酸（例：DNAまたはRNA）は、様々な（２つ以上の）異なる修飾を含む。いくつかの態様において、核酸（例：DNAまたはRNA）の特定の領域は、１つ、２つまたはそれ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの態様において、細胞または生物に導入された修飾核酸（例：DNAまたはRNA）は、未修飾の核酸と比較して、それぞれ細胞または生物において低減された分解を示す。いくつかの態様において、細胞または生物に導入された修飾核酸（例：DNAまたはRNA）は、それぞれ細胞または生物において低減された免疫原性（例：低減された自然応答）を示し得る。

修飾された核酸（例：DNAまたはRNA）は、天然に存在する修飾、非天然に存在する修飾を含むことができ、またはポリヌクレオチドは、天然に存在する修飾と非天然に存在する修飾の組み合わせを含むことができる。ポリヌクレオチドは、例えば糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合の、任意の有用な修飾を含み得る（例：結合しているリン酸への、ホスホジエステル結合への、またはホスホジエステル主鎖への）。いくつかの態様において、修飾核酸（例：DNAまたはRNA）は、所望の機能または特性を達成するために、ポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンまたはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成によって、またはポリメラーゼ酵素によって鎖の末端または鎖の他の場所に導入することができる。核酸の任意の領域が、化学的に修飾され得る。

いくつかの態様において、化学修飾された核酸は、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。「ヌクレオシド」は、糖分子（例：ペントースまたはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例：プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、例えば化学的、酵素的、または組換えなどの任意の有用な方法により合成して、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めることができる。ポリヌクレオチドは、結合したヌクレオシドの領域（単数または複数）を含んでもよい。かかる領域は、可変の主鎖結合を有し得る。結合は標準的なホスホジエステル結合であってもよく、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むことになる。
いくつかの態様において、修飾核酸塩基は修飾ウリジンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドの例には、Ｎ４－アセチル－シチジン（ac4C）、５－メチル－シチジン（m5C）、５－ハロ－シチジン（例：５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（hm5C）、１－メチル－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン（s2C）、および２－チオ－５－メチル－シチジンが含まれる。

いくつかの態様において、修飾核酸塩基は修飾ウリジンである。例示的な核酸塩基およびいくつかの態様において、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾ウリジンを有するヌクレオシドには、５－シアノウリジン、および４’－チオウリジンが含まれる。
いくつかの態様において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドには、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（m1A）、２－メチル－アデニン（m2A）、およびＮ６－メチル－アデノシン（m6A）が含まれる。
いくつかの態様において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドには、イノシン（I）、１－メチル－イノシン（m1I）、ウィオシン（imG）、メチルウィオシン（mimG）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（preQ0）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（preQ1）、７－メチル－グアノシン（m7G）、１－メチル－グアノシン（m1G）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンが含まれる。
いくつかの態様において、抗原は、ウイルスタンパク質および／またはウイルスタンパク質をコードする核酸（例：ウイルスの構造タンパク質または非構造タンパク質）を含む。いくつかの態様において、抗原は、ウイルスゲノムをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ウイルスゲノムを改変して、弱毒化された改変ウイルスを生成する。

本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、参照分子（例：参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）、例えば野生型分子と、ある程度の配列類似性または同一性を共有し得る。当技術分野で知られている用語「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の文字列間の一致数によって決定される、それらの間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例：「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を備えた２つ以上の配列のうちの、小さい方の配列間の同一一致のパーセントを測定する。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性％」は、最大の同一性パーセントを達成するために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、候補アミノ酸または核酸配列中の、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野でよく知られている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算で導入されたギャップおよびペナルティにより、値が異なり得ることを理解すべきである。一般に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され当業者に知られている配列アライメントプログラムおよびパラメーターによって決定される、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、ただし１００％未満の配列同一性を有する。かかるアライメント用ツールには、BLASTスイートのツールが含まれる（Stephen F. Altschul, et al (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。もう１つの一般的なローカルアラインメント技法は、Smith-Watermanアルゴリズムに基づく(Smith, T.F. ＆ Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)。動的プログラミングに基づく一般的グローバルアラインメント技法は、Needleman-Wunschアルゴリズムである（Needleman, S.B. ＆ Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453）。最近では、高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（FOGSAA）が開発され、これは、Needleman-Wunschアルゴリズムなどの他の最適グローバルアライメント法よりも高速で、ヌクレオチドおよびタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するとのことである。他のツールについては、本明細書で特に以下の「同一性」の定義において説明する。

本明細書で使用する用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば核酸分子間（例：DNA分子および／またはRNA分子）および／またはポリペプチド分子間の、全体的な関連性を指す。一致する残基のアラインメントによって決定される類似性または同一性の閾値レベルを共有する、ポリマー分子（例えば、核酸分子（例：DNA分子および／またはRNA分子）および／またはポリペプチド分子）は、相同であるとされる。相同性は、分子間の関係を説明する定性的な用語であり、定量的類似性または同一性に基づくことができる。類似性または同一性は、比較される２つの配列間の配列一致の程度を記述する、定量的な用語である。いくつかの態様において、ポリマー分子が互いに「相同」であるとみなされるのは、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、同一または類似である場合である。「相同」という用語は必ず、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列が相同であるとみなされるのは、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％、同一または類似である場合である。いくつかの態様において、相同なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の一意に特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けられる。長さが６０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４～５個の一意に特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力により決定される。２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同であると見なされる。

相同性は、比較される配列が、進化の過程において共通の起源から分岐したことを意味する。用語「相同体」は、共通の祖先の配列からの系統によって第２のアミノ酸配列または核酸配列に関連する、第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（DNAまたはRNA）またはタンパク質配列）を指す。用語「相同体」は、種形成の事象によって分離された遺伝子および／またはタンパク質間の関係、または遺伝子の複製の事象によって分離された遺伝子および／またはタンパク質間の関係に適用され得る。「オルソログ」とは、種形成によって共通の先祖遺伝子（またはタンパク質）から進化した、異なる種の遺伝子（またはタンパク質）である。典型的には、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。「パラログ」とは、ゲノム内の複製によって関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは進化の過程で同じ機能を保持するが、一方パラログは、新規な機能を、それらが元の機能に関連しているとしても、進化させる。

「同一性」という用語は、ポリマー分子間の、例えばポリヌクレオチド分子間（例：DNA分子および／またはRNA分子）、および／またはポリペプチド分子間の、全体的な関連性を指す。２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることにより行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために、同一でない配列は無視することができる)。いくつかの態様において、比較目的で整列させた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１配列内の位置が第２配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数であり、ここで、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップ数および各ギャップの長さが考慮される。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して遂行可能である。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、以下に記載されているような方法を使用して決定することができる：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., AcADEmic Press, New York, 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., AcADEmic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、MeyersおよびMillerのアルゴリズム（CABIOS、1989、4:11-17）を使用して決定でき、これはALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、PAM120重み残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。代替的に、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して、NWSgapdna.CMPマトリックスを用いて決定することもできる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に使用される方法としては、以下に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない：Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)；これは本明細書に参照により組み込まれる。同一性を決定するための技術は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定はされないが、以下である：GCGプログラムパッケージ、Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA、Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、ベータコロナウイルス抗原（例：任意のベータコロナウイルスからの抗原、例えばMERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2からの抗原）に対する、またはベータコロナウイルス（MERS-CoV、SARS-CoV-1、または SARS-CoV-2などの任意のベータコロナウイルス種）に対する、免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物で使用されるベータコロナウイルス抗原は、MERS-CoVからの抗原（例：タンパク質または核酸）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物で使用されるベータコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-1からの抗原（例：タンパク質または核酸）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物で使用されるベータコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-2からの抗原（例：タンパク質または核酸）を含む。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、MERS-CoV、SARS-CoV-1、および／またはSARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導する。異種免疫が本明細書において企図される。異種免疫とは、ある病原体に対して生じた抗原特異的応答が、第２の病原体に応答して再活性化される現象を指す。例えば、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）はSARS-CoV-1抗原を含み、SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2の両方に対する免疫応答を誘導し得る。同様に、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）はSARS-CoV-2抗原を含み、SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2の両方に対する免疫応答を誘導し得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に使用されるベータコロナウイルス抗原は、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）のタンパク質もしくはポリペプチド、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に使用されるベータコロナウイルス抗原は、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、MERS-CoVスパイクタンパク質、MERS-CoVエンベロープタンパク質、MERS-CoV膜タンパク質、MERS-CoVヌクレオカプシドタンパク質、またはその免疫原性断片（例：スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD））を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、MERS-CoVスパイクタンパク質、MERS-CoVエンベロープタンパク質、MERS-CoV膜タンパク質、MERS-CoVヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片（例：スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD））を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-1スパイクタンパク質、SARS-CoV-1エンベロープタンパク質、SARS-CoV-1膜タンパク質、SARS-CoV-1ヌクレオカプシドタンパク質、またはその免疫原性断片（例：スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD））を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-1スパイクタンパク質、SARS-CoV-1エンベロープタンパク質、SARS-CoV-1膜タンパク質、SARS-CoV-1ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片（例：スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD））を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質、SARS-CoV-2エンベロープタンパク質、SARS-CoV-2膜タンパク質、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、またはその免疫原性断片（例：スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD））を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質、SARS-CoV-2エンベロープタンパク質、SARS-CoV-2膜タンパク質、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片（例：スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD））を含む。
本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に含まれる例示的なベータコロナウイルス抗原のアミノ酸配列を、表１に提供する。

表１．ベータコロナウイルスタンパク質抗原

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、配列番号１～１５のいずれか１つと、少なくとも７０％（例：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、配列番号１～１５のいずれか１つと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、配列番号１～１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、配列番号１～１５のいずれか１つと、少なくとも７０％（例：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、配列番号１～１５のいずれか１つと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のベータコロナウイルス抗原は、配列番号１～１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、インフルエンザウイルス抗原（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスからの抗原などの、任意のインフルエンザウイルスからの抗原）に対する、または、A型インフルエンザウイルスもしくはB型インフルエンザウイルス（すなわち、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスの任意の株）に対する、免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物で使用されるインフルエンザウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスからの抗原（例：タンパク質または核酸）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物で使用されるインフルエンザウイルス抗原は、B型インフルエンザウイルスからの抗原（例：タンパク質または核酸）を含む。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する。異種免疫が本明細書において企図される。異種免疫とは、ある病原体に対して生じた抗原特異的応答が、第２の病原体に応答して再活性化される現象を指す。例えば、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、A型インフルエンザウイルス抗原を含み得て、A型インフルエンザウイルスとB型インフルエンザウイルスの両方に対する免疫応答を誘導し得る。同様に、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、B型インフルエンザウイルス抗原を含み得て、B型インフルエンザウイルスとA型インフルエンザウイルスの両方に対する免疫応答を誘導し得る。同様に、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、A型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプ（株）またはB型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプ（株）に対する免疫応答を誘導し得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に使用されるインフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス）のタンパク質もしくはポリペプチド、あるいはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に使用されるインフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス）のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片もしくはバリアントを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）タンパク質、A型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、またはその免疫原性断片を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のA型インフルエンザウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）タンパク質、A型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（NA）タンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、B型インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）タンパク質、B型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、またはその免疫原性断片を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のA型インフルエンザウイルス抗原は、B型インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）タンパク質、B型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（NA）タンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）、またはその免疫原性断片を含む。
本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に含まれる例示的なインフルエンザウイルス抗原のアミノ酸配列を、表２に提供する。

表２．インフルエンザウイルスタンパク質抗原

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、配列番号１６～１９のいずれか１つと、または当技術分野で知られている別のインフルエンザウイルス抗原（例：別のサブタイプのインフルエンザウイルス抗原）のアミノ酸配列と、少なくとも７０％（例：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、配列番号１６～１９のいずれか１つと、または当技術分野で知られている別のインフルエンザウイルス抗原（例：別のサブタイプのインフルエンザウイルス抗原）のアミノ酸配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、配列番号１６～１９のいずれか１つのアミノ酸配列、または当技術分野で知られている別のインフルエンザウイルス抗原（例：別のサブタイプのインフルエンザウイルス抗原）のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、配列番号１６～１９のいずれか１つと、または当技術分野で知られている別のインフルエンザウイルス抗原（例：別のサブタイプのインフルエンザウイルス抗原）のアミノ酸配列と、少なくとも７０％（例：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、配列番号１６～１９のいずれか１つと、または当技術分野で知られている別のインフルエンザウイルス抗原（例：別のサブタイプのインフルエンザウイルス抗原）のアミノ酸配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）中のインフルエンザウイルス抗原は、配列番号１６～１９のいずれか１つのアミノ酸配列、または当技術分野で知られている別のインフルエンザウイルス抗原（例：別のサブタイプのインフルエンザウイルス抗原）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸（例：DNAまたはmRNAなどのRNA）を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、対象への投与のために製剤化される。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤と組み合わせて、製剤化または投与される。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせなどの少なくとも１つの追加の活性物質を含む。免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、滅菌された、パイロジェンフリーの、または滅菌かつパイロジェンフリーの両方であり得る。免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）などの医薬剤の製剤化および／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2005（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の製剤は、薬理学の分野で既知の、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、抗原および／またはアジュバント（例：真菌多糖類、または真菌多糖類とミョウバン）を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と会合させ、その後必要に応じて、および／または所望により、生成物を所望の単回用量または複数回用量の単位に分割、成形および／または包装する。

本開示による医薬組成物中の抗原、アジュバント、薬学的に許容し得る賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、処置対象の身元、サイズ、および／または状態に応じて、さらには組成物が投与される経路に依存して、変化するであろう。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化されて、（１）安定性を高める；（２）細胞のトランスフェクションを増加させる；（３）持続放出または遅延放出を可能にする（例：デポー製剤から）；（４）体内分布を変更する（例：特定の組織または細胞型を標的化する）；（５）コードされたタンパク質の翻訳をin vivoで増加させる；および／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルをin vivoで変更する。あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などの従来の賦形剤に加えて、賦形剤は、限定することなく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、DNAまたはRNAワクチンでトランスフェクトされた細胞（例：対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、およびそれらの組み合わせを含むことができる。

いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、水溶液中に製剤化される。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、脂質ナノ粒子と呼ばれる脂質－ポリカチオン複合体中に製剤化される。脂質ナノ粒子の形成は、当技術分野で知られている方法、および／または米国特許第20120178702号に記載の方法により達成され得る；これは参照により本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば限定することなくポリリシン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなど、および米国特許公開WO2012013326または米国特許US20130142818に記載のカチオン性ペプチドを含み得る；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、限定はされないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）などの非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中に製剤化される。

いくつかの態様において、本明細書に記載のワクチン製剤は、少なくとも１つの脂質を含むナノ粒子である（「脂質ナノ粒子」または「LNP」と呼ばれる）。脂質は以下から選択され得るが、これらに限定されない：DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂質およびアミノアルコール脂質。いくつかの態様において、脂質は、限定はされないが、DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMAおよびアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってもよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開US20130150625に記載の脂質、および／またはこれに記載の方法によって作製される脂質であってもよい。非限定的な例として、カチオン性脂質は以下であってよい：２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（US20130150625の化合物１）；２－アミノ－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（US20130150625の化合物２）；２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－［（オクチルオキシ）メチル］プロパン－１－オール（US20130150625の化合物３）；および２－（ジメチルアミノ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（US20130150625の化合物４）；またはその任意の薬学的に許容し得る塩もしくは立体異性体。

脂質ナノ粒子組成物およびそれらの製造方法の非限定的な例は、例えば、Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176；Jayarama et al. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533；およびMaier et al. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578に記載されている（それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、直径が約１０～約１００ｎｍ、例えば限定はされないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍおよび／または約９０～約１００ｎｍの、脂質ナノ粒子に製剤化され得る。

いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有し得る。いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、直径が１００ｎｍを超える、１５０ｎｍを超える、２００ｎｍを超える、２５０ｎｍを超える、３００ｎｍを超える、３５０ｎｍを超える、４００ｎｍを超える、４５０ｎｍを超える、５００ｎｍを超える、５５０ｎｍを超える、６００ｎｍを超える、６５０ｎｍを超える、７００ｎｍを超える、７５０ｎｍを超える、８００ｎｍを超える、８５０ｎｍを超える、９００ｎｍを超える、９５０ｎｍを超える、または１０００ｎｍを超える。
いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、リポソーム中に製剤化される。リポソームは人工的に調製されたベシクルであり、主に脂質二重層で構成されており、栄養素および医薬製剤を投与するための送達媒体として使用され得る。リポソームは、異なるサイズであることができ、限定はされないが、直径が数百ナノメートルで、狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含有し得る多層ベシクル（MLV）、直径が５０ｎｍ未満である小さい単細胞ベシクル（SUV）、および直径が５０～５００ｎｍの間である大きい単層ベシクル（LUV）などである。リポソームの設計には、限定はされないが、不健康な組織へのリポソームの付着を改善するため、またはエンドサイトーシスなどのイベント（これに限定されない）を活性化するための、オプソニンまたはリガンドが含まれ得る。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低いまたは高いｐＨを含有する場合がある。

リポソームの形成は、例えば、封入された医薬製剤およびリポソーム成分、脂質ベシクルがその中に分散する媒体の性質、封入された物質の有効濃度およびその潜在的毒性、ベシクルの適用および／または送達中に関与する追加プロセス、目的の用途におけるベシクルの最適化サイズ、多分散性および貯蔵寿命、およびバッチ間の再現性および安全で効率的なリポソーム製品の大量生産の可能性などの、物理化学的特性に依存し得るが、これらに限定されない。
非限定的な例として、合成の膜ベシクルなどのリポソームは、以下に記載の方法、装置およびデバイスによって調製され得る：米国特許公開US20130177638、US20130177637、US20130177636、US20130177635、US20130177634、US20130177633、US20130183375、US20130183373、およびUS20130183372；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）には、限定はされないが、以下から形成されたリポソームが含まれ得る：１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（DODMA）リポソーム、Marina Biotech（Bothell, WA）からのDiLa2リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（DLin-DMA）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（DLIN-KC2-DMA）、およびMC3（US20100324120；参照により本明細書に組み込まれる）、および小分子薬剤を送達し得るリポソーム、例えば、限定はされないが、Janssen Biotech, Inc.（Horsham, PA）のDOXIL（登録商標）など。
いくつかの態様において、抗原および／またはアジュバント系は、親水相が分散されている連続疎水相を含む油中水型エマルション中に、製剤化され得る。非限定的な例として、エマルションは、国際公開WO201087791に記載の方法により製造することができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
抗原、アジュバント系、および／または任意に第２のアジュバントは、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られている方法のいずれかを、個別にまたは一緒に使用して製剤化することができる。例えば、抗原およびアジュバント系は、1つの脂質ナノ粒子または２つの別々の脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。いくつかの態様において、抗原、アジュバント系は、同じ水溶液または２つの別個の水溶液中に製剤化される。

本開示の他の側面は、ウイルスまたはウイルス抗原に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法を提供し、該方法は、有効量のウイルスまたはウイルス抗原、および、真菌多糖類（例：マンナン）を含む有効量のアジュバント系を、対象に投与することを含む。いくつかの態様において、本開示は、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）に対する、または、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）もしくはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）の抗原に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法を提供し、該方法は、有効量のベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）の抗原、および、真菌多糖類（例：マンナン）を含む有効量のアジュバント系を、対象に投与することを含む。いくつかの態様において、アジュバント系はミョウバンをさらに含む。いくつかの態様において、真菌多糖類（例：マンナン）は、ミョウバンに吸着される。

いくつかの態様において、アジュバント系（例えば、マンナンなどの真菌多糖類を単独で、または真菌多糖類とミョウバンを含む）は、ウイルス抗原とは別に投与される。いくつかの態様において、アジュバント系（例えば、マンナンなどの真菌多糖類を単独で、または真菌多糖類とミョウバンを含む）は、ウイルス抗原の投与前に投与される。アジュバント系（例えば、マンナンなどの真菌多糖類を単独で、または真菌多糖類とミョウバンを含む）は、ウイルス抗原の投与後に投与される。いくつかの態様において、アジュバント系（例えば、マンナンなどの真菌多糖類を単独で、または真菌多糖類とミョウバンを含む）とウイルス抗原は、同時に投与される。いくつかの態様において、アジュバント系（例えば、マンナンなどの真菌多糖類を単独で、または真菌多糖類とミョウバンを含む）とウイルス抗原は、混合物として投与される。

投与が企図される「対象」とは、ヒト（すなわち、任意の年齢層の男性または女性、例えば小児対象（例：乳児、子ども、または青年）または成人対象（例：若年成人、中年成人、または高齢成人））、または非ヒト動物を指す。いくつかの態様において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、霊長類（例：カニクイザルまたはアカゲザル）、商業的関連の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、またはイヌ）、または鳥類（例：ニワトリ、アヒル、ガチョウ、またはシチメンチョウなどの商業的関連の鳥類））である。いくつかの態様において、非ヒト動物は、魚類、爬虫類、または両生類である。非ヒト動物は、雄であっても雌であっても、発育の任意の段階であってもよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物または遺伝子操作された動物であり得る。「それを必要とする対象」とは、ベータコロナウイルス（例：MERS、SARS、またはCOVID-19を有する対象）またはインフルエンザウイルス（例：インフルエンザを有する対象）などのウイルスによる感染の処置を必要とする対象（例えば、ヒト対象または非ヒト哺乳動物）、またはベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスによる感染を発症するリスクを軽減する必要のある対象を指す。いくつかの態様において、ウイルス抗原、例えばベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）の抗原、および本明細書に記載のアジュバント系（例：マンナンなどの真菌多糖類を単独で、または真菌多糖類とミョウバンを含む）を、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスによって引き起こされる感染を有する対象に投与することは、疾患（MERS、SARS、COVID-19、またはインフルエンザ）を処置する（すなわち、これらに対する治療用途がある）。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗原およびアジュバント系（例えば、マンナンなどの真菌多糖類を単独で含むか、または真菌多糖類とミョウバンを含む）を、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスによる感染を発症するリスクのある対象に投与することは、対象が感染を発症する可能性を、（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）低減する（予防的使用）。

いくつかの態様において、対象はヒト対象、例えば、ヒトの新生児、乳児、子ども、成人、または高齢者である。いくつかの態様において、ヒト対象において、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスに対する免疫応答を増強するためのアジュバント系で使用される真菌多糖類は、マンナン（例：マンナン単独またはミョウバンと配合されたマンナン）である。いくつかの態様において、ヒト対象において、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスに対する免疫応答を増強するためのアジュバント系で使用される真菌多糖類は、β-グルカン（例：β-グルカン単独またはミョウバンと配合されたβ-グルカン）である。いくつかの態様において、ヒト対象において、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスに対する免疫応答を増強するためのアジュバント系で使用される真菌多糖類は、Candida albicansから単離された真菌多糖類（例えば、単独で、またはミョウバンとの配合）である。

いくつかの態様において、ウイルス（例：ベータコロナウイルスまたはインフルエンザウイルス）に対する免疫応答を増強するために企図されたアジュバント系が投与されるヒト対象は、新生児、または生後１か月、２か月、３か月、４か月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳より上の年齢である。いくつかの態様において、ヒト対象は成人（例：１８歳より歳上）である。いくつかの態様において、ヒト対象は高齢者（例：６０歳より歳上）である。いくつかの態様において、ヒト対象は６５歳より歳上である。いくつかの態様において、ヒト対象は、本明細書に記載されるワクチンの１以上の用量を受け取る（すなわち、投与される）。

いくつかの態様において、ヒト対象は、免疫系が未発達（例：乳児または新生児）、免疫系が弱い（高齢者）、または免疫系が低下している。免疫無防備状態の対象には、敗血症、HIV感染、およびがんに罹患している対象などの原発性免疫不全または後天性免疫不全を有する対象を含み、これには化学療法および／または放射線治療を受けている対象も含まれるが、これらに限定はされない。いくつかの態様において、ヒト対象は基礎疾患を有しており、そのためベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）および／またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）感染などのウイルスによって引き起こされる感染に対し、より感受性が高くなっている。いくつかの態様において、ヒト対象は免疫無防備状態にあり、慢性肺疾患、喘息、心血管疾患、がん、肥満、糖尿病、慢性腎臓病、および／または肝疾患を有する。
いくつかの態様において、対象は伴侶動物（すなわち、ペットまたは介助動物）である。本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の、獣医用ワクチンにおける使用もまた本開示の範囲内である。本明細書で使用される「伴侶動物」とは、ペットおよび他の家畜を指す。伴侶動物の非限定的な例としては、イヌおよびネコ；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；およびマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物が挙げられる。いくつかの態様において、対象は研究動物である。研究動物の非限定的な例には、げっ歯類（例：フェレット、ブタ、ラット、マウス、モルモット、およびハムスター）、ウサギ、または非ヒト霊長類が含まれる。

本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、投与されると、対象に免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、免疫応答は、B細胞からのIgE抗体の産生および分泌、血管拡張、および白血球の血管外遊出を特徴とする１型免疫応答である。いくつかの態様において、免疫応答は、自然免疫応答である。いくつかの態様において、免疫応答は、組成物またはワクチン中の抗原に特異的な、適応免疫応答である。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、B細胞免疫を活性化する。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、抗原に対する抗体（免疫グロブリン、例えば、IgE、IgG、IgA、IgM、またはそのサブタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4）の産生を誘発する。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を活性化する。いくつかの態様において、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、抗原特異的T細胞によるサイトカイン（例：ケモカイン、インターフェロン、インターロイキンなど）の産生を誘発する。

いくつかの態様において、ヒト対象における、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスに対する免疫応答を増強するためのアジュバント系において使用される真菌多糖類は、対象の免疫細胞上のパターン認識受容体（PRR）を活性化することによって、自然免疫応答を誘発する。PRRは自然免疫にとって重要であり、特定の微生物抗原の存在を検出し、それに応答して炎症性サイトカインの産生および分泌のシグナル伝達を行うことにより作用する。いくつかの態様において、PRRは、C型レクチン受容体（CLR）などのレクチン（すなわち、特定の炭水化物に結合する受容体）である。いくつかの態様において、PRRは、樹状細胞関連C型レクチン１（デクチン１）である。いくつかの態様において、PRRは、樹状細胞関連C型レクチン２（デクチン２）である。

いくつかの態様において、本明細書に記載のアジュバント系（例：真菌多糖類単独、またはミョウバンと配合された真菌多糖類）は、単独で投与しても、ウイルス抗原との混合物で投与しても、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原のより広い（すなわち、より広範な）範囲のエピトープを標的とする抗体（免疫グロブリン、例えば、IgE、IgG、IgA、IgM、またはそのサブタイプ（例：IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4））の産生をもたらす。「エピトープ」は、抗原の他のアミノ酸配列と比較して、抗体によって特異的に標的とされる抗原のアミノ酸配列として定義される。いくつかの態様において、例えば、抗原特異的抗体が産生されるエピトープの範囲は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下では、１倍増加、２倍増加、３倍増加、４倍増加、５倍増加、６倍増加、７倍増加、８倍増加、９倍増加、１０倍増加、または１０倍を超えて増加し得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載のアジュバント系（例：真菌多糖類単独、またはミョウバンと配合された真菌多糖類）は、対象における炎症促進性サイトカイン（例：IFNγ⁺）の産生を増強する。いくつかの態様において、炎症促進性サイトカイン（例：IFNγ⁺）のレベルは、アジュバント系の存在下では、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、少なくとも２０％増加する。例えば、炎症促進性サイトカイン(例えば、IFNγ⁺）のレベルは、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上、増加し得る。いくつかの態様において、炎症促進性サイトカイン（例：IFNγ⁺）のレベルは、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上、増加する。

いくつかの態様において、本明細書に記載のアジュバント系（例：真菌多糖類単独、またはミョウバンと配合された真菌多糖類）は、単独で投与しても、ウイルス抗原との混合物で投与しても、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、自然免疫応答を増強する。いくつかの態様において、本明細書に記載のアジュバント系（例：真菌多糖類単独、またはミョウバンと配合された真菌多糖類）は、新生児または高齢者の末梢血単核細胞（PBMC）を活性化する。いくつかの態様において、活性化されるPBMCの数は、本明細書に記載のアジュバント系（例：真菌多糖類単独、またはミョウバンと配合された真菌多糖類）の存在下で、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、少なくとも２０％増加する。例えば、活性化されるPBMCの数は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上、増加し得る。いくつかの態様において、活性化されるPBMCの数は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上増加する。

いくつかの態様において、アジュバント系は、自然免疫記憶（訓練された免疫（trained immunity）とも呼ばれる）を増強する。「自然免疫記憶」は、様々な病原体に対する広範な防御を提供する、異種免疫を与える。いくつかの態様において、自然免疫記憶は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で少なくとも２０％増加する。例えば、自然免疫記憶は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上、増加する。いくつかの態様において、自然免疫記憶は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上増加する。

いくつかの態様において、アジュバント系は、ウイルス抗原との混合物として投与される場合、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）もしくはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）の抗原などのウイルス抗原に対する抗特異的免疫応答、または、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）もしくはインフルエンザウイルス（例、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などのウイルスに対する抗特異的免疫応答を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、増強する。いくつかの態様において、アジュバント系は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、対象における抗原特異的抗体力価の生成を（例えば、少なくとも２０％）増強する。例えば、アジュバント系は、抗原特異的抗体力価の生成を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、対象において少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上、増強し得る。いくつかの態様において、アジュバント系は、抗原特異的抗体力価の生成を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上、増強する。当業者は、抗体力価のレベルを例えばELISAにより評価する方法に精通している。

いくつかの態様において、アジュバント系は、サイトカインおよび／またはケモカイン応答のパターンを細胞内病原体に対する宿主防御に重要なヘルパーT1（Th1）免疫に向けて形成することにより、自然および適応免疫応答を極性化させる。いくつかの態様において、アジュバント系は、自然免疫応答を濾胞性ヘルパーT（Tfh）細胞免疫に極性化させる。
いくつかの態様において、アジュバント系は、対象におけるワクチンの効果を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、（例えば、少なくとも２０％）延長する。例えばアジュバント系は、ワクチンの効果を、対象において、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上、延長し得る。いくつかの態様において、アジュバント系は、ワクチンの効果を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上、延長する。

いくつかの態様において、アジュバント系は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、免疫応答の速度を増加（加速）させる。例えばアジュバント系は、対象における免疫応答の速度を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上、増加させ得る。いくつかの態様において、アジュバント系は、免疫応答の速度を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上、増加させる。「免疫応答の速度の増加」とは、対象の免疫系がベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2）もしくはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）などの侵入ウイルス、または、例えばベータコロナウイルス抗原もしくはインフルエンザウイルス抗原などのウイルス抗原に反応するのに必要な時間が、短縮されることを意味する。

いくつかの態様において、抗原は、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）の抗原などのウイルス抗原に対する同レベルの免疫応答を、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下でより低い用量で生成する。いくつかの態様において、同じレベルの免疫応答を生成するのに必要なウイルス抗原の量は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で少なくとも２０％低減される。例えば、同じレベルの免疫応答を生成するのに必要な抗原の量は、アジュバント系がない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上、低減され得る。いくつかの態様において、同じレベルの免疫応答を生成するのに必要な抗原の量は、アジュバント系が存在しない場合またはウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、アジュバント系の存在下で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上、低減される。

本明細書に記載のアジュバント系または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の予防的または治療的使用もまた、本開示の範囲内である。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、本明細書に記載の組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の有効量を対象に予防的に投与することにより、対象にワクチン接種する方法において使用される。「対象にワクチン接種する」とは、免疫原を、典型的にはワクチンに配合された抗原を、ベータコロナウイルス抗原（例：MERS-COV、SARS-COV-1、SARS-COV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）抗原などのウイルス抗原に対する、したがってウイルス（例：ベータコロナウイルス（例：MERS-COV、SARS-COV-1、SARS-COV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス））に対する免疫応答を増加または活性化するのに有効な量で、対象に投与するプロセスを指す。いくつかの態様において、「対象にワクチン接種する」という用語は、ウイルスに対する完全な免疫の創出を必要としない。いくつかの態様において、「対象にワクチン接種する」という用語は、ウイルス抗原または病原体に対する免疫応答の、臨床的に好ましい増強を包含する。免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の製剤化、ならびに用量、投与経路および投与スケジュール（例：初回用量および１つ以上のブースター用量）の選択を含む、免疫化の方法は、当技術分野でよく知られている。いくつかの態様において、対象へのワクチン接種は、ベータコロナウイルス（例：MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2）またはインフルエンザウイルス（例：A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルス）感染などのウイルス感染症、および、ウイルス感染の結果として起こる疾患、例えばベータコロナウイルス感染（例：MERS、SARSおよび／またはCOVID-19）またはインフルエンザウイルス感染（例：インフルエンザ）によって引き起こされる疾患を発症するリスクを低減する。

いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、対象への投与のために製剤化される。いくつかの態様において、組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。「薬学的に許容し得る」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なしで、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で使用される。「薬学的に許容し得る担体」という語句は、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などであって、対象薬剤を１つの器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へと担持または輸送することに関与する、前記材料等を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者の組織を傷つけない（例：生理学的適合性、滅菌、生理的ｐＨなど）という意味で、「許容し得る」ことが必要である。用語「担体」は、適用を容易にするために有効成分と組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を意味する。本明細書に記載の組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の成分はまた、本開示の分子と、および相互に、所望の薬効を実質的に害する相互作用がないような方法で混合することができる。薬学的に許容し得る担体として機能し得る物質のいくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）糖類、例えばラクトース、グルコース、スクロース：（２）デンプン類、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび座薬ワックス；（９）油類、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG）；（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリーの水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDL；（２２）Ｃ２～Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；および（２３）医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および酸化防止剤もまた、製剤中に存在することができる。

本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。「単位用量」という用語は、本開示の本明細書に記載される組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）に関して使用される場合、対象への単位投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤すなわちビヒクル担体またはビヒクルと会合して望ましい治療効果を生み出すように計算された、所定量の活性物質を含有する。
本明細書に記載の組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の製剤は、投与経路に依存し得る。非経口投与または腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内もしくは病巣周囲投与に適した注射用調製物には、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液が含まれ、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物はまた、例えば、１，３プロパンジオールまたは１，３ブタンジオール中の溶液など、非経口的に許容し得る非毒性の希釈剤または溶媒中の、滅菌注射用溶液、懸濁液または乳濁液であってもよい。使用することができる許容し得るビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液、U.S.P.および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の無刺激の固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用される。注射用製剤の滅菌は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によるか、または、滅菌剤を、使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解または分散可能な滅菌固体組成物の形態で組み込むことにより、実施することができる。

局所投与の場合、本明細書に記載の組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、当技術分野で一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化することができる。局所投与には、当技術分野で周知の経皮送達システムを利用することができる。一例は皮膚パッチである。
経口投与に適した組成物は、それぞれ所定量の抗炎症剤を含有する、カプセル剤、錠剤、トローチ剤などの個別の単位として提供され得る。他の組成物には、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えばシロップ、エリキシル剤またはエマルションなどが含まれる。

他の送達システムには、徐放性（time-release）、遅延放出性、または持続放出性の送達システムが含まれ得る。かかるシステムは、抗炎症剤の反復投与を回避することができ、対象および医師の利便性を高めることができる。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。これらには、ポリマーベースシステム、例えばポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリシュウ酸塩、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などが含まれる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許5,075,109に記載されている。送達システムには、次のような非ポリマー系も含まれる：コレステロール、コレステロールエステルなどのステロールを含む脂質、および脂肪酸または中性脂肪、例えばモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング; 従来の結合剤と賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分的融合インプラントなど。特定の例としては、限定はされないが以下が挙げられる：（ａ）抗炎症剤がマトリックス内の形態で含まれる浸蝕系（erosional system）、例えば米国特許第4,452,775号、第4,667,014号、第4,748,034号および第5,239,660号に記載されているものなど、および（ｂ）活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系、例えば米国特許第3,832,253号および第3,854,480号に記載されているものなど。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用することもでき、そのいくつかは移植に適している。

長期間の持続放出インプラントの使用は、慢性状態の処置に特に適する可能性がある。本明細書で使用される長期放出とは、インプラントが、治療レベルの活性成分を少なくとも３０日間、好ましくは６０日間送達するように、構築および配置されていることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者に周知であり、上記の放出システムのいくつかを含む。
いくつかの態様において、治療的投与に使用される本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、滅菌でなければならない。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）を介して濾過することによって容易に達成される。代替的に、保存剤を使用して微生物の増殖または作用を防ぐこともできる。様々な保存剤がよく知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。環状Psapペプチドおよび／または本明細書に記載の組成物もしくは免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、通常、熱変性および酸化変性に対して安定性が高い場合には凍結乾燥形態で、または水溶液として保存されるであろう。調製物のｐＨは、典型的には約６～８であるが、場合によっては、より高いかまたはより低いｐＨ値も適切であり得る。本開示のキメラ構築物は、可溶性免疫原性担体分子に抱合させることによって、ワクチンとして使用することができる。適切な担体分子には、好ましい担体タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンを含むタンパク質が含まれる。キメラ構築物は、標準的な方法を使用して担体分子に抱合させることができる。（Hancock et al., “Synthesis of Peptides for Use as Immunogens,” in Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 23-32 (Humana Press 1992)）。

いくつかの態様において、本開示は、薬学的に許容し得る注射可能なビヒクルを含む、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）を企図する。本開示のワクチンは、他の標準的な担体を含むかまたは含むことなく、従来のビヒクル中で、注射可能な溶液または懸濁液の形態で投与され得る。追加される担体は、免疫化手順の過程で総免疫応答を高める薬剤から、選択され得る。
リポソームは、適切な担体として提案されている。アルミニウムの不溶性塩、すなわちリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムは、ヒトにおける日常的な臨床応用において担体として利用されてきた。ポリヌクレオチドおよび高分子電解質、およびムラミルジペプチドなどの水溶性担体が使用されている。
本開示の注射用ワクチンの調製には、免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）をムラミルジペプチドまたは他の担体と混合することが含まれる。得られた混合物は、モノオレイン酸マンニド／スクアレンまたはスクアランビヒクル中で乳化され得る。モノオレイン酸マンニド１体積部当たり４体積部のスクアレンおよび／またはスクアランが使用される。免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）を製剤化する方法は、当業者に周知である。（Rola, Immunizing Agents and Diagnostic Skin Antigens. In: Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition, Gennaro (ed.), (Mack Publishing Company 1990) pages 1389-1404）。

追加の医薬担体を用いて、治療用途におけるワクチンの作用持続時間を制御することができる。制御放出製剤は、ポリマーを使用してキメラ構築物を複合化または吸着することにより調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）のマトリックス、およびステアリン酸ダイマーとセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが含まれる。(Sherwood et al. (1992) Bio/Technology 10: 1446)。かかるマトリックスからのキメラ構築物の放出速度は、構築物の分子量、マトリックス内の構築物の量、および分散粒子のサイズに依存する。(Saltzman et al. (1989) Biophys. J. 55: 163；Sherwood et al, 前出；Ansel et al. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea ＆ Febiger 1990)；および Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)。キメラ構築物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に抱合させて、安定性を改善し、バイオアベイラビリティー時間を延長することもできる（例えば、Katre et al.;米国特許第4,766,106号）。

用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」とは、本明細書に記載の疾患を逆転させる、軽減する、発症を遅延させる、または進行を阻害することを指す。いくつかの態様において、処置は、疾患の１以上の徴候または症状が発生または観察された後に、施すことができる。他の態様において、処置は、疾患の兆候または症状がない状態で施すことができる。例えば処置は、感受性のある対象に対して、症状の発現前に（例えば、症状の病歴を考慮して、および／または病原体への曝露を考慮して）施されてもよい。処置は、症状が解消した後も継続することができ、例えば再発を遅らせ、または予防する。予防的処置とは、疾患を有しておらず有したこともないが、疾患を発症するリスクがある対象、または、疾患を有したことがあるが今は有しておらず、しかし疾患が再燃するリスクがある対象の、処置を指す。いくつかの態様において、対象は、集団の平均的な健康なメンバーよりも、疾患を発症するリスクが高いか、または疾患が再燃するリスクが高い。

本明細書に記載の組成物の「有効量」とは、所望の生物学的反応を誘発するのに十分な量を指す。本明細書に記載の組成物の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、処置される状態、投与様式、対象の年齢および健康状態などの要因に応じて変化し得る。いくつかの態様において、有効量は治療有効量である。いくつかの態様において、有効量は予防的処置である。いくつかの態様において、有効量は、本明細書に記載の化合物の単回用量における量である。いくつかの態様において、有効量は、本明細書に記載の化合物の複数回用量における合計量である。本明細書において組成物の有効量に言及する場合、それは、対象および／または処置される疾患に応じて、その量が予防的および／または治療的に有効であることを意味する。有効量または投薬量の決定は、当業者の能力の範囲内である。

用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」とは、本明細書に記載の化合物またはその組成物を、対象体内または対象上に移植する、吸収させる、摂取させる、注射する、吸入する、またはその他の方法で導入することを指す。本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の組成物は、全身的（例：静脈内注射を介して）または局所的に（例：局所注射を介して）投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）の組成物は、経口的、静脈内、局所的、鼻腔内、または舌下に投与される。非経口投与も企図される。本明細書で使用される用語「非経口」には、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技法が含まれる。いくつかの態様において、組成物は予防的に投与される。

いくつかの態様において、組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、１回または複数回（例：２、３、４、５回、またはそれ以上）投与される。複数回投与の場合、投与は一定期間にわたって行われてもよい（例：１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、または１０年を超えて）。いくつかの態様において、組成物または免疫原性組成物（例：ワクチン組成物）は、２回投与される（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３か月後、０日目と６か月後、０日目と９か月後、０日目と１２か月後、０日目と１８か月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後に）。

緒言
免疫系の自然系と適応系との間の対話は現代免疫学の中心的なパラダイムであり、感染症に対する防御にとって、ならびに自己免疫疾患、アレルギーおよび炎症性疾患の病因に重要である（Banchereau and Steinman, 1998；Iwasaki and Medzhitov, 2004；Janeway and Medzhitov, 2002；Matzinger, 1994）。現在のモデルによれば、末梢組織の感染および／または損傷は、自然免疫食細胞の活性化と流入リンパ節（draining lymph node）（dLN）への遊走を引き起こし、そこで食細胞は抗原依存性の適応免疫応答を開始する。代替的に、先天性刺激（innate stimuli）、または特定の物理的特性（例：ナノメートル範囲の直径）を有する微生物は、dLNに直接流入し、LNに常在する自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化することができる（Bachmann and Jennings, 2010; Irvine et al., 2020）。dLNは、適応免疫応答をホストするその能力について徹底的に精査されてきたが、最近の報告では、抗原依存性適応免疫応答が、抗原非依存性リンパ節の自然応答（LIR）に先行してこれによりサポートされることが強調されている（Acton et al., 2014；Coccia et al., 2017；De Giovanni et al., 2020；Didierlaurent et al., 2014；Kastenmuller et al., 2012；Lian et al., 2020；Lynn et al., 2015；Martin-Fontecha et al., 2004；Soderberg et al., 2005；Wong et al., 2019；Wong et al., 2018；Xu et al., 2015b)）。特徴付けが不完全ではあるものの、LIRは、効果的な適応免疫応答の発現に重要な、少なくとも２つの要素から構成される：抗原非依存性LNの増大、および炎症促進環境の確立である（Acton and Reis e Sousa, 2016；Grant et al., 2020）。LIRが末梢からの食細胞の遊走によって駆動される場合、またはLN常在の自然免疫細胞の直接標的化によって支配される場合に、LIRが異なるのか、またどのように異なるのかは、依然として謎である。

自然免疫細胞は、パターン認識受容体（PRR）を介して病原体関連分子パターン（PAMP）を認識する（Janeway and Medzhitov, 2002）。これまでにいくつかのクラスのPRRが同定されており、すなわち、Toll様受容体（TLR）、RIG-I様受容体、サイトゾルDNAセンサー、NOD様受容体、およびC型レクチン受容体（CLR）である（(Brubaker et al., 2015））。自然免疫細胞内でのPRRの活性化は、炎症の誘発とそれに続く適応免疫応答の発達にとって重要である。このため、PRR標的化はワクチンの開発に利用されてきた（O'Hagan et al., 2020）。TLR4およびTLR9リガンド（それぞれモノホスホリル脂質A（MPL）およびCpG）を含むアジュバント配合物は、強力で長期にわたる適応免疫応答を促進し、FDA承認ワクチンのアジュバント成分となった。いくつかの追加のPRRリガンドが、免疫化の前臨床モデルで試験され、現在臨床試験で評価中である（O'Hagan et al., 2020）。PRRの中でも、CLRの生物学およびワクチンアジュバント標的としてのその可能性は、あまり研究されていない。

CLRスーパーファミリーは、炭水化物結合ドメインを共有し、かつ細胞壁多糖類の認識を介して真菌感染に対する自然免疫応答および適応免疫応答の発達において重要な役割を果たす、数百のタンパク質で構成されている（Borriello et al., 2020；Brown et al., 2018）。前臨床および臨床データは、ワクチン接種時に強力な細胞性免疫および体液性免疫を誘発するために、CLRミンクルを標的とするという概念を裏付けている（Pedersen et al., 2018）。さらに、CLRのデクチン１（Clec7a）とデクチン２（Clec4n）が、それぞれの多糖類リガンドであるβ－グルカンとマンナンによって活性化されると、免疫化の実験モデルにおいて抗原特異的適応免疫が促進されるという証拠がある（Petrovsky and Cooper, 2011）。しかしデクチンの作用メカニズムは、依然としてほとんど無視されている。β－グルカンおよびマンナンなどの真菌多糖類は、化学構造および物理的形態（寸法および溶解度など）によって異なるため、メカニズム解析がさらに複雑となる。PRRリガンドの物理的特性は、その局在化（末梢滞留対LN排出）に影響を与えるだけでなく、自然免疫細胞による認識と活性化にも影響する。デクチン１およびデクチン２は、可溶性および不溶性の形態で真菌多糖類に結合するが、しかし後者のみが、効率的な受容体のクラスタリングと活性化を誘導する（Goodridge et al., 2011；Zhu et al., 2013）。結果として粒子状多糖類のみが、免疫刺激が可能であると広く信じられている。

この研究では、このパラダイムを再検討し、可溶性マンナンがin vitroおよびin vivoの注射部位ではほとんど不活性であるが、その直径によりリンパ節に輸送されて、強力なLIRを誘発することが見出された。注目すべきことに、観察された応答は、樹状細胞の末梢からdLNへの遊走の必要性を回避している。また、マンナンの物理的特性をさらに調節すると、in vitroでの自然免疫細胞の完全な活性化および末梢とLNの同時標的化などの、新規な免疫学的特性がもたらされることも実証された。ウイルス糖タンパク質抗原（A型インフルエンザウイルス（IAV）血球凝集素またはSARS-CoV-2スパイク）を配合したアジュバント系として試験した場合、マンナンは、幅広いエピトープ特異性を持つ中和抗体の誘導を可能にし、IAVまたはSARS-CoV-2による感染をそれぞれ防御した。全体として、データは、LNの自然免疫応答と適応免疫応答の質が、マンナンの物理的特性を調節することによって調整できることを実証し、アジュバント設計およびワクチン開発についての重要な意味を裏付けている。

結果
マンナンはLNに制限されたIFNシグネチャーを誘発し、これはLNの増大を促進する
デクチン１および２は、真菌の細胞壁多糖類β－グルカンおよびマンナンに結合し、どちらもキナーゼSykを、直接（デクチン１）またはFcRγ鎖を介して（デクチン２）活性化する（Borriello et al., 2020；Lionakis et al., 2017；Netea et al., 2008）。Candida albicansから単離されたβ－グルカンおよびマンナンの調製物を使用する；各々は、不溶性で直径約５００ｎｍ、および可溶性で直径約２０ｎｍの、異なる物理的形態を示す（図９）。現在のデクチン活性化モデル（Goodridge et al., 2011；Zhu et al., 2013）に沿って、可溶性マンナンではなく、粒子状β－グルカンは、GM-CSF分化した骨髄由来の食細胞によるサイトカイン産生および共刺激分子の発現を、誘発することができた（図１０Ａ）。予想通り、β－グルカンシグナル伝達にはデクチン１が必要であった（図１０Ｂ）。可溶性マンナンとは対照的に、マンナンのマイクロビーズ上への固定化は、デクチン２およびFcRγ依存性の食細胞活性化をもたらした（図１０Ｂ、リポ多糖類（LPS）およびカードランを対照として使用した）。したがって、β－グルカンは、in vivo皮内注射時に皮膚膿瘍と病変の形成を誘発したが、一方マンナンは、皮膚炎症の兆候を誘導しなかった（図１Ａ）。これらの結果は、生理食塩水、β－グルカンおよびマンナンを注射した皮膚試料のトランスクリプトーム解析により確認された（図１Ｂ）。β－グルカンによって上方制御される差次的発現遺伝子（DEG）のクラスターの経路解析により、炎症促進性経路およびII型インターフェロン（IFN）経路の濃縮が明らかになり、これはC. albicansの皮膚感染によって誘発される自然免疫応答と一致する（図１１）。（Santus et al., 2017）。可溶性マンナンは皮膚の炎症を誘導しなかったが、これらの真菌リガンドは、dLNの増大およびリンパ球の増加を、注射後６時間（h.p.i）という早い段階で誘導し、これは２４h.p.iまで持続し（図１Ｃおよび１２Ａ～１２Ｃ）、循環白血球の動員に依存する（図１Ｄ）。

β－グルカンもLN増大を誘発したが、２４h.p.iにおいてのみであった（図１Ｃ、１２Ａ～１２Ｃ）。マンナンとβ－グルカンとの両方が、dLNにおける骨髄細胞数を増加させ（図１２Ｄ～１２Ｇ）、β－グルカンは、おそらくは好中球の皮膚注射部位からの排出により、好中球数を優先的に増加させた（図１２Ｄ）。しかし、CD86発現の増加によって測定されるように、マンナンのみが骨髄細胞活性化を誘導することができた（図１２Ｈ）。したがって、β－グルカンとマンナンは、局所炎症反応およびdLN炎症反応を誘導する能力が異なり、後者は前者よりも速い速度でLIRを誘導する。マンナンに対する反応の動態およびその直径（リンパ排液と適合する）を考慮すると、マンナンは、最終的にdLNの増大につながるLN固有の回路を活性化する可能性があると推論された。この仮説に適合して、マンナンは急速にdLNに蓄積し（６h.p.i以内）（図１Ｅ）、免疫細胞の周囲（すなわち皮膚）からdLNへの遊走が消失されているCcr7^-/-マウスにおいてさえも、dLNの増大を誘導することができた（図１Ｆ）（Ohl et al., 2004）。まとめると、これらのデータは、末梢（皮膚）炎症および／または食細胞のdLNへの遊走がない状態で、マンナンが強力なLIRを活性化することを実証する。生理食塩水、β－グルカン、およびマンナンを注射したマウスから分離されたdLNのトランスクリプトーム解析を行って、LNの増大に関連する分子事象をさらに特徴付けた。皮膚と比較すると完全に反対のプロファイルが見出され、マンナンはβ－グルカンと比較して、より早期かつより顕著な転写応答を誘発した（図１Ｇ）。経路分析により、マンナンによって上方制御されるDEGのクラスターは、I型およびII型IFN経路が豊富であることが明らかになった（図１Ｈ）；これは、対照と比較してマンナン処置dLNにおいて上方制御された上位５０遺伝子の発現レベルにより、確認されている（図１Ｉ）。

マンナン処置したdLN中のII型IFN（IFNγ）産生細胞の存在を、フローサイトメトリーにより確認した（図１２Ｉ）。IFNγ産生細胞の大部分はCD8^＋ T細胞およびNK細胞であり（図１２Ｊ）、NK細胞はより高いレベルでIFNγを発現していることが判明した（図１２Ｋ）。NK細胞がマンナン処置dLNにおけるIFNγの主な供給源であるかどうかを評価するために、NK細胞を除去し、マンナン誘発性のIfng発現の障害を観察した（図１２Ｌ）。cDC1は、NK細胞の活性化およびIFNγ産生を誘導するサイトカインを産生する（Cancel et al., 2019）。したがって、それらはマンナンに誘導されるLIRに寄与している可能性がある。この仮説を評価するために、cDC1を欠くBatf3^-/-マウスを使用したが、マンナンに誘導されるIfng発現の障害は観察されなかった（図１２Ｍ）。注目すべきことに、NK細胞の除去は、LNの増大および細胞の発生に部分的にのみ影響を及ぼした（図１２Ｎ）。これと一致して、IFNγの遮断は、マンナン注射後のLNの増大を部分的にしか減少させなかった（図１Ｊ）。さらに、I型およびII型IFNの同時遮断（Ifnar^-/-マウスおよび抗IFNγブロッキング抗体を使用）は、マンナン誘発性のLN増大およびISGの誘導を防止した（図１Ｊ）。このメカニズムはマンナンに限定されなかったが、なぜなら、良好に特徴付けられたLNを標的とするTLR9リガンドであるLipo-CpGによって誘発されるLN増大およびISG誘導（Liu et al., 2014）もまた、Ifnar^-/-Ifngr^-/-マウスで損なわれていたからである（図１Ｋ）。したがって、結果は、C. albicansから単離された可溶性マンナンが、β－グルカンによって誘導されるもの、すなわちISGの誘導において誘導されるものとは異なるLIRを誘発することを実証する。これらの違いが、真菌多糖類の異なる物理的形態によるものであるかどうかをさらに確立するために、全グルカン粒子（WGP）に対する応答を、それぞれデクチン１アゴニストおよびアンタゴニストとして特徴付けられている分散型（D）または可溶型（S）において評価した（Goodridge et al., 2011）。マンナンで観察されたパターンと一致して、WGP-Sは皮膚炎症を誘導しなかったが、LN増大およびISG発現を誘発した（図１３Ａ～１３Ｂ）。まとめると、これらの結果は、真菌多糖類の物理的形態が、dLN増大とISG誘導とを特徴とするLIRを駆動するというモデルを裏付ける。

マンナン誘発性LIRは、デクチン２を発現するCD169+洞マクロファージを必要とする
デクチン２はマンナンの主要な受容体であり（Borriello et al., 2020；Lionakis et al., 2017；Netea et al., 2008）、デクチン２およびFcRγもまた、マンナン誘発性LIRに必要であることが、in vitroデータと一致して見出された（図２Ａ）。デクチン２は、主に骨髄細胞によって発現される（Tayloretal., 2005）。したがって、蛍光標識マンナンを使用し、dLNの非リンパ系（CD3/CD19/NK1.1^-）区画の免疫表現型分析を可能にして、マンナンの細胞標的を同定した。マンナン含有細胞の大多数は、CD45⁺細胞であった（図２Ｂ）。イメージングサイトメトリー分析により、これらの細胞がマンナンを内部移行したことが確認された（図２Ｃ）。さらに、１h.p.iでのマンナンのdLNの共焦点顕微鏡分析は、ホスホSykとマンナンの共局在を示し（図２Ｄ）、これはデクチン２／FcRγ媒介性の活性化を示している（Borriello et al., 2020）。したがってマンナン含有細胞は、FcRγ依存的に、自然免疫細胞活性化のマーカーであるCD86の最高レベルの発現を示した（図２Ｅ）。マンナン含有細胞の表現型をさらに特徴付けして、５０％以上がLy6G^-(CD11b⁺ Ly6C⁺)^- CD11c⁺細胞であり、一方、それほど豊富ではない細胞サブセットは、好中球（CD11b⁺ Ly6G⁺）および単球／単球由来細胞（MoCsLy6G^- CD11b⁺ Ly6C⁺）（図２Ｆ）であったことが見出された。興味深いことに、CD11c-DT受容体（DTR）マウスにおけるジフテリア毒素（DT）媒介性のCD11c⁺細胞除去を使用すると、マンナン誘発性LIRが消失した（図２Ｇ）。一方、マンナン誘発性LIRは、Ccr2^-/-マウス（骨髄からの単球の放出が障害されている）（図２Ｈ）または抗体媒介性の好中球除去（図２Ｉ）においては、影響を受けなかった。CD11c⁺細胞は、CD11bの発現に基づいてさらに区別することができる（図２Ｆ）。デクチン２はマンナン誘発性LIRにとって重要であるため、その発現を、定常状態のCD11b^- CD11c⁺細胞およびCD11b⁺ CD11c⁺細胞で評価した。デクチン２は主に、CD11b⁺ CD11c⁺細胞によって発現され（図２Ｊ）、CD11b⁺ CD11c⁺ デクチン２^＋細胞の大部分は、被膜下および髄洞マクロファージマーカーCD169を発現した（図２Ｋ）。共焦点顕微鏡分析により、LN被膜下洞の内側を裏打ちする細胞上での、CD169およびデクチン２の共局在が確認された（図２Ｌ）。さらに、CD169-DTRマウスにおけるDT媒介性のCD169⁺細胞の除去は、CD11c-DTＲマウスで得られた結果を表現型模写し、マンナン誘発性LIRを完全に消失させた（図２Ｍ）。これらの結果は、リンパ系物質の歩哨としてのCD169⁺洞マクロファージの役割を実証する（Moran et al., 2019）。

非標準的なNF-κBサブユニットRelBの活性化がマンナン誘発性LIRを制御する
LNに常在するマンナン含有細胞における、１h.p.i.という初期でのSykリン酸化の証拠は、デクチン２下流のシグナル伝達経路の活性化を指し示す。デクチン受容体－Syk経路の重要なステップは、CARD9の活性化であり、これにより、MAPKおよび標準的NF-κBを含むいくつかのシグナル伝達分子および転写因子の活性が調節される（Borriello et al., 2020）。したがって、Card9^-/-マウスを使用して、マンナン誘発性LIRに関連する分子事象を特徴付けた。驚くべきことに、マンナン誘発性のLN増大は、野生型（WT）マウスとCard9^-/-マウスとの間で同等であった（図３Ａ）。LIRの駆動におけるIFNシグネチャーの関連性と適合して、ISG誘導は、WT、Clec4n^-/-およびFcer1g^-/-マウスでは完全に消失したが（図２Ａ）、Card9^-/-マウスでは大部分が維持された（図３Ａ）。特に、I型IFN依存性遺伝子は、Card9^-/-においてはWTマウスと比較して変化しなかったが、一方II型IFN依存性ISGは、WTマウスと比較して大幅に減少したものの、依然として部分的に誘導された（図３Ａ）。マンナン含有細胞のCARD9依存性および非依存性の活性化に関連する分子事象について、さらに洞察を得るために、WT、Fcer1g^-/-、およびCard9^-/-マウスから分離されたマンナン含有CD11b⁺ CD11c⁺細胞の標的化トランスクリプトーム解析を実施した。いくつかの遺伝子は、WTマウスまたはCard9^-/-マウスとFcer1g^-/-マウスの間で差次的に発現したが、WTマウスおよびCard9^-/-マウスから分離された細胞は、驚くほど類似したトランスクリプトームを示した（図３Ｂ）。経路濃縮分析により、WTおよびFcer1g^-/-から分離された細胞の間のDEGが、TNF／NF-κB、I型およびII型IFN経路に表示されることが明らかになった（図１４）。この表現型を説明するために、モデルではデクチン２－Syk軸が、CARD9非依存性経路を活性化する可能性があると推論された。注目すべきことに、SykはキナーゼNIKを活性化し、これが次に非標準的NF-κB転写因子RelBのCARD9非依存性活性化を引き起こす（Gringhuis et al., 2009；Xu et al., 2018）。したがって、CD11c⁺区画内のRelBが条件付きで欠失しているマウス（Cd11c^cre Relb^fl/fl）を作製した。特に、マンナンに誘導されるLN増大およびI型およびII型両方のIFN依存性ISGの発現が、対照（Relb^fl/fl）マウスと比較して、有意に減少することが見出された（図３Ｃ）。RelB要件がマンナンに限定されるかどうかを検証するために、Lipo-CpGを使用したところ、Lipo-CpGによって誘発されるLN増大およびI型IFN依存性ISG発現が、Cd11c^cre Relb^fl/flマウスにおいて損なわれることが判明した（図３Ｄ）。これらの結果は、RelBが、LN標的化刺激によって誘発されるLN増大およびI型IFN依存性ISG発現を調節し、さらにCARD9依存性経路と協力して、マンナンに誘導されるII型IFN依存性ISG発現を調節する、というモデルを裏付ける。

マンナン誘発性LIRに必要な分子経路がマンナンアジュバント活性の大きさを調節する
LIRが適応免疫応答の発生を制御するために不可欠であることを示唆する証拠が存在する（Coccia et al., 2017；De Giovanni et al., 2020；Lynn et al., 2015；Martin-Fontecha et al., 2004；Soderberg et al., 2005）。マンナンが誘導するリンパ球の増加およびIFNシグネチャーは、T細胞のその同族抗原との出会い、および自然免疫区画によるその効率的な提示を促進し、それによって適応免疫応答を改善する可能性があると推論された。CFSE標識されたOVA特異的OT-II CD4⁺ T細胞の養子移入のモデルを使用して、T細胞増殖の調節を評価した（図４Ａ～４Ｈ）。マンナンとOVAを組み合わせると、生理食塩水またはOVA単独を注射したマウスと比較して、dLN中のOT-II細胞およびOT-I細胞の数が大幅に増加した（図４Ａおよび４Ｅ）。この増加は、dLNへのOT-II CD4⁺ T細胞動員の増加および、LN常在自然免疫細胞によるより効率的な抗原提示／共刺激によるものと考えられる。実際、OVA単独と比較して、OVAとマンナンで処置したマウスでは、より低い割合の非増殖性T細胞が検出されると共に、より高い割合の６または７分裂を起こしたT細胞が検出された（図４Ｂおよび４Ｆ）。注目すべきことに、T細胞増殖に対するマンナンの効果はFcer1g^-/-マウスでは消失したが、Card9^-/-マウスでは減弱されたのみであった（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇ、および４Ｈ）。これらの結果は、マンナン誘発性LIRに必要な経路が、抗原特異的適応免疫応答に対するマンナンのアジュバント活性にも重要であることを示している。

水酸化アルミニウムを配合したマンナンは、免疫学的機能を予測する新規な物理的特性を獲得する
マンナンの物理的特性をさらに調節するためには、他の分子で示されているように、マンナン調製物中のリン酸基の存在が、水酸化アルミニウム（AH）への吸着を促進する可能性があると推論された（(Morefield et al., 2005；Moyer et al., 2020）。マンナンとAHとの配合物を特徴付けるために、¹H-NMR分析を、マンナンのAHへの吸着後に収集した上清に対して実施した。マンナンの約４０％がAHに吸着したが、残りの部分は可溶性のままであることが判明した（図１５Ａ）。これらの実験で使用した配合物では、AHがその質量の約２倍のマンナンに結合していることも定量化された。

GM-CSF分化骨髄由来食細胞を用いたin vitro実験により、マンナンのAHとの配合（AH/mann）により、可溶性マンナンと比較して、炎症促進活性が完全に変化したことが明らかになった。AH（alumOH/mann）を配合したマンナンは、有意な共刺激分子の発現およびサイトカイン産生を誘導した（図５Ａ）。AHまたはマンナン単独ではなく、AH/mannは、有意なTNFおよびIL-2サイトカイン産生を、デクチン２およびCARD9依存的に誘導した（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。AH/mannはまた、デクチン２依存性ではあるがCARD9非依存性の様式で、共刺激分子の発現を誘発した（図１５Ｄおよび１５Ｅ）。最後に、WT細胞においてAH/mannに応答してのみ有意に上方制御されたCXCL1を除き、AH単独ではなくマンナンとAH/mannの両方が、デクチン２依存的だがCARD9非依存的にISG発現を誘導した（図１５Ｆ～１５Ｉ）。

AH/mann配合物は、マウスに注射すると、グルカンとマンナンの組み合わせ作用と同様の表現型をもたらした。特に、AH/mannは皮膚炎症（可溶性マンナンではなくグルカンで観察される表現型）を誘発したが（図５Ｂ）、CCR7非依存的にLNにも排出された（図５Ｃ）。LN重量の経時的な評価により、AH/mannが、AH、マンナンまたはβ－グルカンと比較して、より高い累積LN増大を誘導することが明らかになった（図５Ｄ）。さらに、マンナンおよびAH/mannは、dLNにおいて２４h.p.i.で同等のISG発現を誘発した。（図５Ｅ）。予想通り、β－グルカンはLN増大を誘導したが、大部分がLNから排除され、ISG発現を誘導しなかった（図５Ｃ～５Ｅ）。さらに、抗IFNγブロッキング抗体で処置したIfnar^-/-マウスでは、AH/mannによって誘導されたLN増大は損なわれたが、β－グルカンによって誘導されたLN増大は損なわれなかった（図５Ｆ）。同様の結果が、野生型マウスを抗IFNARおよび抗IFNγブロッキング抗体で処置することによってIFN産生を一時的に遮断した場合にも、得られた（図５Ｇ）。全体として、これらの結果は、粒子画分（AHに吸着されたマンナン）が皮膚の炎症を促進する一方で、可溶性画分（未結合マンナン）がLNに排出され、AH/mann配合物で観察されたISG発現を誘導する、というモデルと適合する。AH/mannの粒子画分または可溶性画分のいずれかをマウスにサイド・バイ・サイドで注射することにより、このモデルを検証した。予想通り、粒子および可溶性画分はそれぞれ、皮膚炎症（図５Ｈ）およびISGの強力なLN発現（図５Ｉ）を誘導した。最後に、AH/mannに誘導されるLIRが、マンナンに誘導されるLIRと同一の細胞および分子メカニズムを必要とするかどうか、または以前に記載されたAHの免疫調節機能（Eisenbarth et al., 2008）が、これらの要件を完全に再配線するかどうかを評価した。AH/mann誘発性LN増大およびISG誘導は、デクチン２受容体複合体を欠くマウス（すなわち、WT、Clec4n^-/-およびFcer1g^-/-）では損なわれることが判明した（図５Ｊ）。さらに、dLNにおけるAH/mannに誘導されるIfng発現は、マンナンに誘導されるLIRで観察されたように、NK細胞除去抗アシアロGM1抗体で処置したマウスでは減少し（図５Ｋ）、cDC1を欠くBatf3^-/-マウスでは維持された（図５Ｌ）。全体として、AHの配合は、マンナンに、物理的特性（すなわち、粒子対可溶性）に基づいて予測可能な強化された免疫学的機能を与え、マンナン依存性のデクチン２活性化経路の誘発を反映する。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質と水酸化アルミニウム／マンナンによる免疫化は、抗スパイク１型免疫と幅広いエピトープ特異性を有する交差反応性中和抗体を生成する
マンナンとAHを配合することにより観察された新規な免疫学的特性は、翻訳関連の免疫化モデルにおけるアジュバント活性の調査を促した。この目的を達成するために、融合前安定化されたSARS-CoV-2スパイク三量体を使用した；これは、COVID-19を予防する抗原タンパク質として検証されている（Corbett et al., 2020；Jackson et al., 2020；Keech et al., 2020；Mercado et al., 2020；Walls et al., 2020；Walsh et al., 2020；Wrapp et al., 2020）。マウスの免疫化を、スパイク単独、またはAH、β－グルカン、マンナンもしくはAH／マンナンと混合したスパイクで、プライム（０日目）－ブースト（１４日目）スケジュールで行った。β－グルカンを使用して、皮膚に制限されたデクチン活性化を制御した（図１Ａ、１Ｂおよび５Ｂ～５Ｄ）。プライム後１４日目にマンナン配合物は、抗スパイク抗体を誘発した（図６Ａ）。２８日目（ブースト後１４日）、AH／マンナンは最高レベルの抗スパイク抗体を誘導した（図６Ａ）。同じことが、スパイクの受容体結合ドメイン（RBD）に対する抗体にも当てはまり（図６Ｂ）、これは、ヒトACE2への結合およびSARS-CoV-2細胞侵入に関与する。注目すべきことに、可溶性マンナンおよびAH／マンナンは両方とも、抗スパイクIgG2c（IFNγによって誘導される抗体サブクラス）およびIFNγ産生に偏った抗原特異的T細胞を誘導することによって、抗スパイク１型免疫を促進し（図６Ａ～６Ｃ）、したがって初期の時点でのISGのLN発現と相関する（図５Ｄ）。この証拠には臨床的関連性があり、なぜならば、抗原特異的１型免疫は、ウイルス感染時のワクチン関連の呼吸器疾患増強リスクの低減と関連しているからである（Graham, 2020）。注目すべきことに、抗スパイクIgG1およびIgG2cのレベルの上昇は、免疫化後９８日まで維持された（図１６Ａ）。免疫化モデルで誘発された抗スパイク抗体の防御能力をさらに評価するために、代用ウイルス中和試験と、実際のSARS-CoV-2中和試験を実施した；ここでは、血清試料の中和活性を、in vitroでのヒトACE2またはSARS-CoV-2細胞感染に対する組換えRBD結合の阻害の程度により、それぞれ測定する。両方のアッセイにおいて、スパイクおよびAH／マンナンで免疫化されたマウスは、最も高い中和レベルを示した（図６Ｄおよび６Ｅ）。

AH/mann配合物のアジュバント効果に空間的および時間的制約があるかどうかも、マウスに対し、AH/mannを配合したスパイク、AHおよびマンナンを配合したスパイクを、同日または前日に隣接する注射部位に注射することによって試験した。興味深いことに、抗スパイク中和抗体の増強は、スパイクにAH/mannを配合した場合にのみ観察された（図６Ｆおよび６Ｇ）。B細胞応答とは対照的に、抗原特異的T細胞によるIFNγ産生は、マウスをAHおよびマンナンで免疫化したすべての条件において、マンナンを注射した時期および場所に関係なく観察された（図６Ｈ）。

次に、AH/mannのアジュバント効果の細胞的および分子的要件を調査した。AH/mannに誘導される抗スパイクIgG応答および抗原特異的T細胞によるIFNγ産生は、WT、Clec4n^-/-マウスでは抑制されたが（図１６Ｂ）、Card9^-/-マウスでは部分的にのみ損なわれ（図１６Ｃ）、マンナンおよびAH/mannに誘導されるLIRの観察と一致する。マンナン依存性応答の駆動における転写因子RelBの重要な役割と適合して、Cd11c^cre Relb^fl/flマウスの免疫化もまた、抗スパイクIgG応答の障害を示した（図１６Ｄ）。次に、AH/mannアジュバント効果がI／II型IFN経路を必要とするかどうかを試験した。Ifnar^-/- Ifngr^-/-マウス、またはIFNシグナル伝達が一時的に抑制されたWTマウスのいずれかを、抗IFNARおよび抗IFNγ抗体の投与による免疫化段階中に使用した。IFNシグナル伝達の構成的阻害および急性阻害の両方が、AH／ミョウバン配合物の効果を無効にすることが観察された（図１６Ｅおよび１６Ｆ）。最後に、AH/mannアジュバント効果には、Batf3^-/-マウスにおけるIgG産生障害によって評価されるように、cDC1が必要であった（図１６Ｇ）。

AH/mann配合物の優れたアジュバント活性に起因した、より広範囲の抗スパイク抗体を誘導するその能力を試験した。この点に対処するため、VirScan分析を実施して、様々なアジュバント配合物により誘発された抗体によって標的化されるスパイクエピトープを調べた（Shrock et al., 2020；Xu et al., 2015a）。興味深いことに、すべての配合物はSARS-CoV-2ヘプタッドリピート２に対応する領域に対する抗体を誘導したが、AH／マンナンのみは、SARS-CoV-2融合ペプチドおよびRBDに対する抗体を誘導した（図７）。このエピトープ標的化プロファイルは、SARS-CoV-2とSARS-CoVスパイクタンパク質間で同等であったが、一方、より少数のエピトープがMERSスパイクを標的化し（図７）、これら３つのコロナウイルスのスパイクタンパク質配列相同性と一致している（Hicks et al., 2020）。まとめると、結果は、マンナン配合物が抗スパイク抗体レベルを増強し、抗スパイク１型免疫を促進し、AH／マンナンが、幅広いエピトープ特異性を有する抗スパイク中和抗体の誘導に特に効果的であることを示す。

AH/mann配合物は肺のウイルス感染に対する防御を与える。
幅広いエピトープ特異性を有する中和抗体を誘導するAH/mannの能力は、AH/mann配合物と、現在のFDA承認ワクチンの一部である他のアジュバントとの比較を促した（O’Haganetal.,2020）。AH/mannを、スクアレンベースの水中油型ナノエマルション（AS03様AddaS03またはMF59様AddaVax）、およびAHとモノホスホリル脂質Aの合成構造類似体であるPHADとの単純な混合によって調製されたAS04様配合物AH/PHADに対して、ベンチマーク評価（benchmarked）した。
マウスの、AH/mann、AddaS03、またはAH/PHADを配合したスパイクによる免疫化は、匹敵するレベルの抗スパイクおよび抗RBD抗体IgGを誘発した（図８Ａ）。以前の結果と適合して、抗スパイク抗体および抗RBD抗体の増加は、AH単独と比較して中和能力の有意な増加と相関した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。これらの抗体反応の機能的関連性を証明するために、免疫化マウスをマウス適応型SARS-CoV-2 MA10株に感染させたところ（Leist et al., 2020）、生理食塩水処置マウスまたはAH免疫化マウスと比較して、ウイルス肺力価の顕著な低下がAH/mann、AddaS03またはAH/PHADで免疫化したマウスにおいて見出された（図８Ｂ）。

これらの結果は、AH/mannが、抗原特異的抗体反応の大きさと幅の両方を増強することを示す。これらの属性は、A型インフルエンザウイルス（IAV）血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）など、高い抗原性の変動を特徴とする追加のウイルス糖タンパク質に関連している可能性がある。抗原の多様性と系統解析に基づいて、これまでに１８のHAタンパク質と１１のNAタンパク質が同定されており、それらが組み合わさって複数のIAVサブタイプ（例：H1N1）が形成される。多くのウイルス株が各サブタイプ内で同定されており、サブタイプの高い多様性を生み出している（Sangesland and Lingwood, 2021）。したがって、AH/mannは、インフルエンザワクチン免疫化に、標的抗原に対する強力な抗体応答を促進するだけでなく、異種亜型免疫も促進する可能性があると推論された。この目的のために、臨床的に関連する組換えHA（rHA）ワクチンFlublok（2020-2021シーズン、IAV A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 [H1N1]、IAV A/HongKong/2671/2019 [H3N2]、B型インフルエンザウイルスB/Washington/02/2019、およびB型インフルエンザウイルスB/Phuket/3073/2013からのHAから構成される）を使用した。マウスを、Flublok単独で、またはFlublokにAH、AH/mann、Addavax、もしくはAH/PHADを配合して、免疫化した。抗rHA抗体は、rHAおよびAH/mann、AddaVaxまたはAH/PHADで免疫化したマウスにおいて、有意に増加した（図８Ｃ）。次にマウスに対し、H1N1サブタイプに属するがHAがFlublokワクチンの一部ではないIAV株A/PR/8/1934を、鼻腔内にチャレンジした。驚くべきことに、AH/mannを配合したFlublokで事前に免疫化したマウスのみが、体重減少の低減（図８Ｄ）および肺における細胞浸潤（図８Ｆおよび１７Ｄ）によって測定されるように、有意に防御された。これらの結果は、他のアジュバント配合物ではなく、FlublokとAH/mannで免疫化したマウスにおける、A/PR/8/1934（rPR8）由来の組換えHAに対する高いIgGレベルと相関した（図８Ｅ）。
全体として、これらのデータは、AH/mannアジュバント配合物が、臨床関連の免疫化モデルにおける複数のウイルス糖タンパク質に対する抗体反応の大きさと幅の両方を増強することを実証する。

考察
自然免疫細胞のPRRリガンドによる活性化は、適応免疫応答の開始にとって重要なステップとみなされている（Banchereau and Steinman, 1998；Iwasaki and Medzhitov, 2004；Janeway and Medzhitov, 2002；Matzinger, 1994）。PRR媒介性の自然免疫細胞の活性化によって引き起こされる細胞的および分子的事象は、自然免疫応答を形成するシグナル伝達細胞小器官、代謝経路、および遺伝子発現プロファイルを特定する、集中的研究分野となっている（Brubaker et al., 2015）。しかし、PRRの活性化およびシグナル伝達の細胞固有の特徴は、先天性刺激によって引き起こされるin vivo炎症反応の複雑さを説明するには十分ではない。実際、細胞および生物レベルでのそれらの局在は、自然免疫細胞の活性化状態を決定する上で重要な役割を果たす（Evavold and Kagan, 2019）。最近の証拠により、PRRリガンド、特にTLRアゴニストの物理的特性（例：溶解度および直径）を調整することが、組織標的化および自然免疫活性化プロファイルの調節に重大な影響を与えることが示されている。TLRアゴニストの、可溶性リガンドと比較した、サブミクロンサイズの粒子を形成するポリマーへの抱合により、リンパ節へのより効果的な輸送と自然免疫細胞の活性化が可能になる。これは、免疫化モデルにおけるより強力なB細胞およびT細胞応答に翻訳される（Lynn et al., 2015）。これらの結果は、PRRリガンドの物理的特性の調節が、自然免疫細胞の活性化の位置および大きさにどのような影響を与えるかを定義することの重要性を示す。この点に関して、CLR、特にデクチン１および２の研究は特に興味深いものである。これらの受容体は、真菌の細胞壁多糖類であるβ－グルカン（デクチン１）およびマンナン（デクチン２）に結合し、それらの物理的特性に特に敏感であるが、何故ならば真菌多糖類の粒子状形態のみが、効率的な受容体のクラスター化および活性化を誘導するからである（Goodridge et al., 2011; Zhu et al., 2013）。可溶性マンナンは、LNの増大とI型およびII型IFN転写応答の発現を特徴とする、強力なLIRを刺激することが示された。可溶性マンナンはdLN内のCD169⁺洞マクロファージを標的とし、これらの真菌成分が注射部位（皮膚）でin vitroおよびin vivoで炎症性反応を誘発しなかったため、これらの真菌リガンドによって誘導されるLIRは、この解剖学的位置に特異的であった。マンナンの物理的および免疫学的特性のさらなる調節は、マンナンを水酸化アルミニウム（AH）に吸着させ、マンナンが可溶性および粒子状（すなわち、AHに結合）の両方の形態でほぼ同じ比率で存在する配合物を生成することにより、なされた。その物理的特性から予測されるように、この配合物は、末梢とdLNの両方で、in vitroおよびin vivoで炎症促進性反応を誘発する。SARS-CoV-2スパイクタンパク質による免疫化の実験モデルで試験した場合、可溶性マンナンとAHを配合されたマンナンの両方が、抗スパイク１型免疫を促進する。ただし、後者のみが、SARS-CoVスパイクと交差反応し、FDA承認ワクチンの一部であるアジュバント配合物と同程度に、SARS-CoV-2 MA10のチャレンジを防御する、幅広いエピトープ特異性を持つ抗スパイク中和抗体を誘発する。注目すべきことに、AHおよびマンナンを配合した組換え血球凝集素（rHA）ベースのFlublokワクチンによる、マウスの免疫化は、Flublokワクチンには含まれていないA型インフルエンザH1N1株（A/PR/8/1934）のrHAに向けられたIgGの誘導、およびA/PR/8/1934チャレンジに対する防御効果によって評価されるように、異種亜型免疫を誘発した。全体として、この研究は、リンパ節の自然応答および適応応答を引き起こし、かつウイルス糖タンパク質に対する抗体応答の大きさおよび範囲の強化をもたらす、マンナン配合物により活性化される分子経路に、光を当てる。

デクチン１および２は、主に真菌感染に対する自然免疫応答および適応免疫応答の発生に関与している（Borriello et al., 2020；Brown et al., 2018；Lionakis et al., 2017；Netea et al., 2008）。それらのリガンド（例：β－グルカンおよびマンナン）が、ワクチンアジュバントとして使用可能であるといういくつかの証拠がある。しかし、それらの作用メカニズムの詳細な理解は不足している（Petrovsky and Cooper, 2011）。以前に報告されたように、マンナンではなくβ－グルカンが、in vitroおよびin vivoで注射部位において自然免疫細胞を活性化することが判明した。予想外なことに、β－グルカンとマンナンの両方はLNの増大を誘発し、後者はLNに制限されたユニークなI型およびII型IFNシグネチャーも誘導することが判明した。これらの結果は、シグナル伝達経路の違いではなく、これら多糖類の物理的形態によって説明でき、なぜならば、デクチン１とデクチン２の両方は同じ経路を活性化するが、マンナンは可溶性で直径が小さいためLNに輸送されるのに対し、β－グルカンは大きく不溶性であるため、皮膚に滞留するからである。この点をさらに確認するために、研究は、可溶性グルカンの調製物が、皮膚炎症の非存在下でもLN増大およびISG発現を誘導できることを実証している。これらの結果は、いくつかの理由から興味深いものである：１）それらは、真菌多糖類の物理的形態とLN自然免疫応答との間の関係を確立する；２）それらは、デクチン受容体をLNに標的化する実現可能性を示し、これは適応免疫を誘発するための効果的な戦略である（Lian et al., 2020；Liu et al., 2014；Lynn et al., 2015；Scales et al., 2018；Woodruff et al., 2014）；３）LN内の初期のアジュバントに誘導されるII型IFNは、哺乳動物種全体で保存されており、ワクチンの免疫原性を促進する（Coccia et al., 2017）。

I型およびII型の両方のIFNが、マンナンに誘導されるのリンパ球増加とLN増大の維持に必要である。このモデルにおいて、I型およびII型IFNが同じ細胞サブセットに作用するのか、または異なる細胞サブセットに作用するのかはまだ不明であり、おそらくはそれらの受容体の遍在分布のために発生する可能性がある。IFNは、骨髄細胞とリンパ節間質細胞の両方に作用し、ケモカインの発現および血管透過性を含む一連の機能を調節する（Barrat et al., 2019；Ivashkiv, 2018）。したがってこの結果は、マンナン誘発性のIFNシグネチャーがLNに常在する骨髄および間質区画に影響を与え、最終的にはリンパ球の動員につながる可能性を高める。

マンナンに誘導されるLIRの詳細なメカニズム解析が本明細書に提供され、これがデクチン２を発現するCD169⁺洞マクロファージを必要とするが、cDC1は必要ではないことを示している。予想外の発見は、デクチン受容体の下流にある重要なシグナル伝達分子であり、かつ標準的NFkBサブユニットの活性化に必要な、CARD9の部分的要件である（Borriello et al., 2020）。しかし、非標準的なNFkBサブユニットp52およびRelBのNIK依存性活性化を含む、CARD9非依存性経路も報告されている（Gringhuis et al., 2009；Xu et al., 2018）。NIK、p52、またはRelBを欠くマウスは、二次リンパ器官の発達に重大な欠陥があるため（Sun, 2017）、CD11c発現細胞でRelBが選択的に欠失しているマウスが使用された；その理由は、これらの細胞はマンナンに誘導されるLIRに必要であり、二次リンパ器官発達を保存するからである。結果は、RelBが、マンナンに誘導されるI型ISGの発現を調節し、CARD9と協力してII型ISGの発現を調節することを示す。IFN応答およびISG発現の調節におけるRelBの役割に関する対照的な証拠が、これまでに提出されている（Le Bon et al., 2006；Saha et al., 2020）。受容体特異的および細胞特異的差異が、重要な役割を果たす可能性が高く、マンナンに誘導されるISG発現におけるRelBの役割を完全に理解するには、それを考慮する必要があるだろう。

この研究の注目すべき特徴は、AHを配合したマンナンが、新規な免疫学的特性、すなわちin vitroおよびin vivoでの注射部位およびdLNの両方における炎症促進性反応の誘導を、獲得することである。AHとマンナン間の相乗作用を排除することはできないが、これらの結果は、AH／マンナン配合物中に非結合マンナンとAH吸着マンナンとが同時に存在することによって、より容易に説明される。前者はdLNにおけるISG発現に関与し、後者は皮膚の炎症を媒介する。融合前安定化SARS-CoV-2スパイク三量体を用いた免疫化モデルにおけるAH/mannの評価は、このモデルを支持している。AHとマンナンを別々に、しかし近接して注射した場合、AHとマンナンの炎症活性の間の直接的な相乗作用は排除され、それらの抗スパイクIgGを増強する能力は失われた。興味深いことに、これは、AHとの共配合とは無関係にマンナンの存在によって促進された、T細胞媒介性応答には当てはまらない。融合前安定化SARS-CoV-2スパイク三量体を用いた免疫化モデルにおける可溶性マンナンおよびAH／マンナンの分析により、両方の配合物が体液性免疫および細胞性１型免疫を誘導することが明らかになり、dLNにおけるI型およびII型IFNシグネチャーの早期誘導が、適応免疫応答の極性化（polarization）を説明するのに十分であることが示唆されている。IFNγは、IgG2c抗体スイッチングおよびTh1極性化の両方を促進することができる（Finkelman et al., 1988；Martin-Fontecha et al., 2004）。特に、ブロッキング抗体の投与によるI／II型IFNシグナル伝達の一過性の阻害により、抗スパイクIgGが大幅に減少したことから、dLNにおける初期のIFNシグネチャーが免疫応答の長期的な増強につながることが示唆された。

AH／マンナン配合物のユニークな特性は、SARS-CoV-2スパイクで免疫化したマウスにおける、幅広いエピトープ特異性を有し、かつSARS-CoVスパイクと、および程度は低いがMERSスパイクと交差反応する、中和抗スパイク抗体の誘導である。これらの抗体の産生には、AH/mannによって誘導されるLIRと同じ分子要件および細胞要件があるが、ただし、LIRではなくIgG応答の駆動に重要な役割を果たすcDC1は除外される。中和抗体は、実験動物モデルでのSARS-CoV-2感染に対する防御において、重要な役割を果たす（Cao et al., 2020；Hassan et al., 2020；Lv et al., 2020；McMahan et al., 2020；Rogers et al., 2020；Schafer et al., 2021；Shi et al., 2020；Tortorici et al., 2020；Zheng et al., 2020；Zost et al., 2020）。したがって、スパイクおよびAH/mannで免疫化したマウスは、AddaS03およびAH/PHADなどの臨床関連アジュバント配合物で免疫化したマウスと同様に、検出不可能な肺ウイルス力価をSARS-CoV-2 MA10感染後に示す。さらに、AH／マンナンで免疫化したマウスで観察されたエピトープ特異性プロファイルは、COVID-19患者で観察されたものと同等であり、結果の翻訳関連性を強調する（Shrock et al., 2020）。これらの発見をさらに拡張するために、AH/mannを、インフルエンザの免疫化モデルにおいて、２つのA型インフルエンザ株と２つのB型インフルエンザ株からの組換えHA（rHA）で構成される、臨床的に適切なFlublokワクチンを使用して試験し、これを、MF59様Adda VaxおよびAS04様AH/PHADアジュバント配合物と比較した。すべてのアジュバントがFlublokに対する抗体応答を増強したが、AH/mannのみが異種亜型免疫を、すなわち、その株中のHAがFlublokワクチンに含有されていないところのH1N1 A型インフルエンザ株（A/PR/8/1934）によるチャレンジに対する防御を誘導した。これらの結果は、AH/mannで免疫化したマウスのみにおいてA/PR/8/1934のHAに対する抗体が検出されることと類似していた。この現象については、相互に排他的ではない少なくとも２つの説明が考えられる：１）AH／マンナン配合物は、末梢とdLNを同時に標的とすることで高度の自然免疫活性化を誘導し、それによって適応免疫を増強する；２）AHは、抗原をdLNにゆっくりと放出するデポーを生成し、および／またはAHは、抗原多量体の形成を促進し、結合していないマンナンによって誘導されるLIRと共に、胚中心反応を促進することができる（(Moyer et al., 2020；Pedersen et al., 2020）。将来的には、AH／マンナンがどのように抗原特異的適応免疫を増強し、胚中心動態とB細胞レパートリー選択を調節するかを解明することが重要となるだろう。そのために、本明細書に記載のin vivo実験では、１：５のモル比のAH／マンナンの有効な配合物を利用したが、その後の実験では、２：５のAH／マンナン配合物が、骨髄由来のin vitroサイトカイン発現をさらに増強することが示唆され、これにより、AHの、マンナンの免疫原性を強化するための重要性が強調される。翻訳的観点から、エピトープ特異性の増大は以下を示唆する；すなわち、適切な抗原と組み合わせたAH/mann配合物は、複数のコロナウイルスまたはA型インフルエンザ株を標的とする開発ワクチンの有望な候補となる可能性がある。

全体として、この研究は、マンナンの物理的形態の調節によって可能になるデクチン２標的化の様々な様式および、より効果的なワクチンの開発のためのそれらの翻訳的影響についてのメカニズムの理解を提供し、先天性刺激の物理的形態とLNの自然免疫応答および適応免疫応答との関係についての知識を、さらに拡張する。

方法
マウス：C57BL/6J（Jax 00664）（野生型）、CB6F1（Jax 100007）、B6.129P2(C)-Ccr7^tm1Rfor/J（Ccr7^-/-、Jax 006621）、B6.129S2-Ifnar1^tm1Agt/Mmjax（Ifnar^-/-、Jax 32045-JAX）、B6.Cg-Ifngr1^tm1Agt Ifnar1^tm1.2Ees/J（Ifnar^-/- Ifngr^-/-、Jax 029098）、B6.FVB-1700016L21Rik^{Tg(Itgax-DTR/EGFP)57Lan}/J（CD11c-DTR、Jax 004509）、B6.Cg-Tg(Itgax-cre)1-1Reiz/J（Cd11c^cre、Jax 008068）、B6.Cg-Relbt^m1Ukl/J（Relb^fl/fl、Jax 028719）、B6.129S4-Ccr2^tm1Ifc/J（Ccr2^-/-、Jax 004999）、B6.129-Card9^tm1Xlin/J（Card9^-/-、Jax 028652）およびB6.129S6-Clec7a^tm1Gdb/J（Clec7a^-/-、Jax 012337）はJackson Labsから購入した。B6.129P2-Fcer1g^tm1Rav N12（Fcer1g^-/-、モデル583）はTaconicから購入した。Clec4n^-/-マウスはDr. Nora A. BarrettおよびDr. Yoichiro Iwakuraの厚意により提供された。B6;129-Siglec1（CD169-DTR）マウスはDr. F. Pucciの厚意により理研研究所（No. RBRC04395）から提供され、Dr. Kenji KohnoおよびDr. Masato Tanakaより寄託された（Miyake et al., 2007; Saito et al., 2001）。B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J（OT-II、Jax 004194）はJuan Manuel Leyva-Castilloの厚意により提供された。すべての実験で雌のマウスを使用した。マウスはBoston Children’s Hospitalで病原体フリーの特定条件下で飼育され、すべての手順はInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）の下で承認され、Children’s Hospitalのdepartment of Animal Resources（ARCH）の監督下で実施された。

試薬および抗体：フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、および共焦点顕微鏡実験では、次の試薬および抗体を使用した：抗CD45 BV510（30-F11）、抗CD45 Alexa Fluor 700（30-F11）、抗CD45 APC（30-F11）、抗CD3 PE/Dazzle 594（17A2）、抗CD3 BV510（17A2）、抗CD19 PE/Dazzle 594（6D5）、抗CD19 BV650（6D5）、抗NK1.1 PE/Dazzle 594（PK136）、抗Ter119 PE/Dazzle 594（TER-119）、抗I-A/I-E PE/Cy7（M5/114.15.2）、抗Ly6G PerCP/Cy5.5（1A8）、抗CD11b Pacific Blue（M1/70）、抗Ly6C BV711（HK1.4）、抗CD11c BV785（N418）、抗CD11c APC（N418）、抗CD86 APC/Cy7（GL-1）、抗CD86 APC（GL-1）、抗OX40L PE（RM134L）、抗CD169 APC（3D6.112）、抗CD169 Alexa Fluor 647（3D6.112）、抗CD4 APC/Fire 750（GK1.5）、抗CD45R/B220 Alexa Fluor 594（RA3-6B2）、抗CD3ビオチン（145-2C11）、抗CD19ビオチン（6D5）、抗NK1.1ビオチン（PK136）、抗Ter119ビオチン（TER-119）、TrueStain FcX（93）、True-Stain Monocyte BlockerおよびZombie Red Fixable Viability KitはBiolegendから購入した；抗デクチン２PE（REA1001）はMiltenyi Biotecから購入した；ラット抗デクチン２（D2.11E4）はGeneTexから購入した；抗ホスホSyk（Tyr525/526）（C87C1）はCell Signaling Technologyから購入した；CellTrace CFSE細胞増殖キット、Alexa Fluor 488 NHS Ester（スクシンイミジルエステル）およびDAPIはThermo Fisher Scientificから購入した。

in vitroおよびin vivo実験では、次の試薬を使用した：Iscove改変Dubecco培地（IMDM）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ペニシリン／ストレプトマイシン（pen/strep）、およびL－グルタミン（L-Gln）はLonzaから購入した；ウシ胎児血清（FBS）はThermo Fisher Scientificから購入した；Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼ、ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼ（DNase）I、およびディスパーゼIIはMilliporeSigmaから購入した；TLRGrade Escherichia coli LPS（血清型O555:B5、１μｇ／ｍｌ）はEnzo Life Sciencesから購入した；カードラン（１０μｇ／ｍｌ）は和光化学工業から購入した；マンナン、β－グルカン、およびそれらのAlexa Fluor 488抱合体（in vitro実験の場合は１０μｇ／ｍｌ、in vivo実験の場合は５００μｇ／マウス）はMichael D Kruppa、Zuchao MaおよびDavid L Williams（East Tennessee State University）から提供された；カルボキシルラテックスビーズ３μｍはThermo Fisher Scientificから購入し、直接使用するか（in vitro実験では細胞：ビーズ比１：１０）、またはMichael D Kruppa、Zuchao MaおよびDavid L Williams（East Tennessee State University）から提供されたジアミノプロパン誘導体化マンナンでコーティングした後に使用した；WGP-SおよびWGP-D（in vivo実験用に５００μｇ／マウス）はInvivogenから購入した；Lipo-CpGは、Darrell J. Irvine（Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT）により提供された；Corynebacterium diphtheriae由来のジフテリア毒素（ニックなし）（CD11-DTＲマウスの場合は２００ｎｇ／マウス、CD169-DTRマウスの場合は５００ｎｇ／マウス）はCayman Chemicalから購入した；オボアルブミン（OVA）EndoFit（５μｇ／マウス）およびアルヒドロゲルアジュバント２％（水酸化アルミニウム、in vitro実験の場合は２μｇ／ｍｌ、in vivo実験の場合は１００μｇ／マウス）はInvivogenから購入した；組換え融合前安定化SARS-CoV-2スパイク三量体（１μｇ／マウス）およびRBDは、それぞれDr. Berney S. Graham（NIH Vaccine Research Center）およびDr. Aaron G. Schmidt（Ragon Institute）から寛大に提供されたプラスミドから発現させ、精製した；SARS-CoV-2スパイクペプチドプール（PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S）はMiltenyi Biotecから購入した；抗CD62L（Mel-14、１００μｇ／マウス）、抗IFNγ（XMG1.2、２００μｇ／マウス）、抗Ly6G（1A8、５０μｇ／マウス）およびそれらのアイソタイプ対照ラットIgG2a（2A3）およびラットIgG1（HRPN）はBio X Cellから購入した。

AH／マンナン（AH/mann）配合物は、AH（１００μｇ／１０μｌ）、マンナン（５００μｇ／２５μｌ）および生理食塩水（１５μｌ）を混合することによって得た。抗原（例：SARS-CoV-2スパイク三量体または2020シーズンFlublok）を配合した場合、生理食塩水の量は減少させて、総量を一定に保った。この配合物については、Vaccine Adjuvant Compendium（https://vac.niaid.nih.gov）にさらに説明されている。
2020シーズンFlublok組換え血球凝集素（rHA）はSanofi Pasteurから市販されており、以下のインフルエンザウイルス株からのrHAが等モル比で含有されている：A型インフルエンザ/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019［H1N1］、A型インフルエンザ/HongKong/2671/2019［H3N2］、B型インフルエンザウイルスB/Washington/02/2019、およびB型インフルエンザウイルスB/Phuket/3073/2013。

マンナンのC. albicansからの単離。Candida albicans SC5314株は、３７℃で増殖させた血液寒天（Remel）プレート上に維持した。マンナンを単離するために、C. albicansを１５リットルのYPD（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）に播種し、３７℃で２０時間増殖させた。細胞を、５０００ｇで５分間遠心分離することにより採取した。これにより、１５リットルの培地から１００ｇのペレットを得た。マンナンの単離およびNMR特性評価には標準プロトコルを使用した（Kruppa et al., 2011；Lowman et al., 2011）。簡単に説明すると、細胞ペレットを２００ｍｌのアセトンに懸濁し、細胞を２０分間脱脂した後、５０００ｇで５分間遠心分離し、アセトンを除去し、ペレットを１時間乾燥させた。乾燥ペレットを粉砕し、ビードビーターに移した。等量の酸で洗浄したガラスビーズおよび２００ｍｌのｄＨ_２Ｏを混合物に加えた。細胞を、３０秒パルスで３回ビーズビーティングに供した後、混合物全体を１リットルのフラスコに移した。材料を２時間オートクレーブにかけ、放冷し、次いで５０００ｇで５分間遠心分離した。上清を保持し、細胞ペレットを廃棄した。濾過滅菌し、６５℃で２０分間熱処理したプロナーゼ（２０ｍｌのｄＨ_２Ｏ中５００ｍｇ）（グリコシド活性を除去するため）を、アジ化ナトリウムと共に１ｍＭの濃度まで上清に加えた。混合物を次に３７℃で一晩（２０時間）インキュベートして、溶液中の任意のタンパク質を分解させた。マンナンを、プロテアーゼ処理したマンナン溶液に等量のフェーリング溶液を加えて抽出し、室温で１時間混合した。混合後、溶液を２０分間放置して、マンナンの沈殿を促進した。上清をデカントし、沈殿物を１０ｍｌの３ＭのＨＣｌに溶解して、マンナンの還元末端から銅を放出させた。溶解したマンナン溶液に、メタノール：酢酸の８：１混合物５００ｍｌを加え、混合物を撹拌して、マンナンを一晩沈殿させた。物質が沈降した後、上清をデカントし、５００ｍｌのメタノールで再度洗浄し、マンナンが沈降するまで６時間放置した。上清をデカントし、残った沈殿物を２００ｍｌのｄＨ_２Ｏに溶解した。マンナンを、２０００ＭＷカットオフ膜を使用して、２００倍変化するｄＨ_２Ｏに対して４８時間かけて透析し、残留酸、メタノール、およびその他の化合物を抽出プロセスから除去した。その後透析液を凍結乾燥し、必要になるまで－２０℃で保存した。物質の少量の試料（１０ｍｇ）をNMRに供し、N結合マンナンの純度を確認し（Lowman et al., 2011）、分子量を評価した（Kruppa et al., 2011）。in vitroまたはin vivoで使用する前に、マンナンをパイロジェン除去して残留エンドトキシンを取り除き、フィルター滅菌した。

ジアミノプロパン（DAP）誘導体化マンナンの調製。マンナン（１００ｍｇ）を１時間撹拌した後、４ｍｌバイアル中の１ｍｌのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。１，３－ジアミノプロパン（１００μＬ）を加え、周囲温度で３時間撹拌した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ）を加え、反応混合物を４８時間撹拌し、続いて水素化ホウ素ナトリウム（５０ｍｇ）を加えて２４時間撹拌した。酢酸（２００．０μｌ）を０℃で滴下して反応を停止させ、反応混合物を周囲温度で３時間撹拌し、次いで1000 MWCO RC膜を用いて超純水に対して透析した（１０００ｍｌ×４）。保持液（retentate）を採取し、凍結乾燥して、DAP付着マンナンを得た。回収率は８８．５ｍｇ、約８８％であった。マンナン－DAPは¹H-NMRによって特性評価し、化合物の同一性を確認した。

Alexa Fluor 488 NHS Ester（スクシンイミジルエステル）との抱合のために、約１５ｍｇのマンナン－DAPを１ｍｌのホウ酸ナトリウム抱合緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、少なくとも２４時間溶媒和させた。次に、３５μｌのDMSOに再懸濁した１ｍｇのAlexa Fluor 488 NHS Esterを溶液に添加し、穏やかに撹拌しながら室温、暗所で一晩インキュベートした。反応混合物を6000-8000 MWCO RC膜を用いて生理食塩水（１０００ｍｌ×４）に対して透析し、保持液を濾過滅菌した。
３μｍのカルボキシルラテックスビーズとの抱合のために、マンナン－DAPを１０ｍｇ／１ｍｌの濃度のBupH MES抱合緩衝液、ｐＨ４．５（Thermo Fisher Scientific）に再懸濁し、少なくとも２４時間溶媒和させた。１ｍｌのマンナン－DAPを５０×１０^６のビーズに添加し、次に純水に再懸濁した４ｍｇ／１ｍｌのEDC（Thermo Fisher Scientific）と混合した。反応混合物を、暗所、室温で穏やかに撹拌しながら４時間インキュベートした。次いで、ビーズを生理食塩水で２回洗浄し（４０００ｇで１０分間）、生理食塩水に１０^８ビーズ／ｍｌの濃度で再懸濁した。

Candida albicansβ－グルカン粒子の調製。β－グルカン粒子をCandida albicans SC5314から、研究室で以前に記載されているように単離した（Lowman et al., 2014）。簡単に説明すると、グルカンをC. albicansから塩基／酸抽出アプローチを使用して単離し、純度≧９５％の水不溶性グルカン粒子を得た。グルカンの構造と純度は、DMSO-d6中の¹H-NMRにより決定した（Lowman et al., 2014）。in vitroまたはin vivoで使用する前に、β－グルカン粒子からパイロジェンを除去し、濾過滅菌する。

ジアミノプロパン（DAP）誘導体化β－グルカンの調製。β－グルカン粒子（２０ｍｇ）を１時間撹拌した後、４ｍｌバイアル中の１ｍｌのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。１，３－ジアミノプロパン（１００μＬ）を加え、周囲温度で３時間撹拌した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ）を加え、反応混合物を４８時間撹拌し、続いて水素化ホウ素ナトリウム（５０ｍｇ）を加え、２４時間撹拌した。酢酸（２００μｌ）を０℃で滴下して反応を停止させ、反応混合物を周囲温度で３時間撹拌した。β－グルカン粒子を採取し、遠心分離（８６２ｇ）により水で５回洗浄した。回収率は＞９５％であった。グルカン－DAPを¹H-NMRにより特徴付けして、マンナンの構造が変化していないことを確認し、またDAPの存在を検出した。グルカン－DAPを凍結乾燥で乾燥させ、必要になるまで暗所のデシケーター内で－２０℃で保存した。
Alexa Fluor 488 NHS Ester（スクシンイミジルエステル）との抱合のために、２０ｍｇのグルカン－DAPを１ｍｌのホウ酸ナトリウム抱合緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）に懸濁し、４℃で少なくとも２４時間水和させた。次に、３５μｌのDMSOに再懸濁した１ｍｇのAlexa Fluor 488 NHS Esterを溶液に添加し、穏やかに撹拌しながら室温、暗所で一晩インキュベートした。反応混合物を遠心分離し、５回洗浄し（８６２ｇ）、４８８個の標識グルカン粒子を採取した。

水酸化アルミニウム／マンナン配合物中のマンナンの定量化。上清をAH／マンナン混合物から採取した。上清を凍結乾燥した。凍結乾燥した上清と、AHと混合しなかったマンナン（４．０ｍｇ）を、０．０１％（Ｗ／Ｖ）の内部標準TMSP-2,2,3,3-D₄（９８．０％Ｄ）を含む５００μｌの酸化重水素（９９．９％Ｄ）に溶解した。¹H NMRデータは、Bruker Avance 400MHz Ultra Shield NMR分光計を２９５Ｋで、すべての試料に対して同じ取得パラメーターを使用して収集した。NMRスペクトルは、Avance 400MHz NMRで動作するTOPSPIN 2.1を使用して処理した。環プロトン共鳴（３．２５～４．５０ｐｐｍ）は、１として校正された内部標準の積分値（－０．０２～０．０２ｐｐｍ）を参照して積分した。標準マンナン質量（４．０ｍｇ）とその環プロトン積分値（平均３９．１２）の比率に基づき、上清中のマンナン質量は、検出された環プロトン積分を使用して計算し、ブランクに対して調整した。AHによって吸収されたマンナンの量は、配合後の上清中のマンナンの相対質量損失により決定した。

皮膚およびLN応答の分析。皮膚およびLNのLN自然応答を評価するために、マウスに対して、０日目に、示された化合物を５０μｌの量で、背中の両側に皮内注射した（片側は化合物であり、反対側はビヒクル対照の生理食塩水であった）。注射後６時間または２４時間で、注射部位の皮膚試料および排出（上腕）LNを後の分析のために収集した。
皮膚試料をビードビーターに移し、１ｍｌのTRI試薬（Zymo Research）中で均質化した。次に、試料を１２０００ｇで１０分間遠心分離し、８００μｌの透明な上清を次のRNA単離のために新しいチューブに移した。
LNは、ビードビーターに移す前に分析スケールで重量を量り、皮膚試料用に示されているようにTRI試薬中で均質化するか、以前に公開されたプロトコル（Fletcher et al., 2011）の修正版により処理してLN細胞懸濁液を生成した。簡単に説明すると、個々のLNを、４００μｌの消化混合物（IMDM＋pen／strep＋FBS２％＋コラゲナーゼ１００ｍｇ／ｍｌ＋ディスパーゼIIを１００ｍｇ／ｍｌ＋DNaseを１０ｍｇ／ｍｌ）中で、３７℃で２０分間インキュベートした。次にLNを、１０００μｌチップでピペッティングすることにより粉砕し、上清を新しいチューブに移して４℃に保ち、その間２００μｌの消化混合物をペレットに加え、３７℃で１０分間インキュベートした。このサイクルをもう１回繰り返した後、個々のLNのプールされた上清を２つのアリコートに分割した：１つはフローサイトメトリー分析用で、もう１つは３００ｇで５分間遠心分離し、その後のRNAの単離のために細胞ペレットを８００μｌのTRI試薬に再懸濁した。
特定の実験のために、マウスを以下を用いて処置した：抗CD62Lブロッキング抗体またはアイソタイプ対照、－１日目に静脈内注射；抗IFNγブロッキング抗体またはアイソタイプ対照、－１日目および０日目に静脈内注射；抗Ly6G除去抗体またはアイソタイプ対照、－１日目および０日目に腹腔内注射；ジフテリア毒素、CD11c-DTRマウスの場合は－１日目の静脈内注射および０日目の皮内注射（マンナンと同時注射）、CD169-DTRマウスの場合は－２日目に腹腔内注射。

GM-CSF分化した骨髄由来食細胞のin vitro刺激。骨髄由来食細胞を、IMDM＋１０％B16-GM-CSF由来の上清＋１０％FBS＋pen／strep＋L-Gln中で骨髄から分化させ、７日間の培養後に使用した。次に細胞を採取し、平底９６ウェルプレートに、IMDM＋１０％FBS＋pen／strep＋L-Gln中、１０^５細胞／２００μｌ／ウェルの密度でプレーティングし、指定の化合物で１８～２１時間刺激した。刺激の終了時、上清を採取し、TNFおよびIL-2濃度をELISA（Biolegend）により製造業者のプロトコルに従って測定した。細胞を、２ｍＭのPBS＋EDTAで剥がし、その後のフローサイトメトリー染色および分析のために丸底９６ウェルプレートに移した。代替的に、細胞を６時間刺激し、TRI試薬で溶解し、RNAを遺伝子発現解析のために抽出した。

蛍光標識されたβ－グルカンおよびマンナンのin vivo定量化。マウスに、５００μｇ／マウスのAlexa Fuor 488抱合β－グルカンおよびマンナンを皮内注射した（選択された実験では、注射前にマンナンを１００μｇ／マウスのAHと配合した）。示された時点でdLNを収集し、ビードビーターに移し、４００μｌの脱イオン水中で均質化した。次に、試料を遠心分離し（１２０００ｇで１０分間）、透明な上清を９６ウェル透明底黒色プレートに移した。蛍光値は、SpectraMax i3xマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定し、バックグラウンド（脱イオン水）を差し引いた後、任意単位で表した。

フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、イメージングサイトメトリー、および共焦点顕微鏡検査。フローサイトメトリー分析では、細胞は初めにPBS中のZombie Red Fixable Viabilityで４℃で５分間染色し、PBS＋BSA ０．２％＋ＮａＮ_３０．０５％（３００ｇで５分間）で１回洗浄し、その後、PBS＋BSA ０．２％＋ＮａＮ_３０．０５％中に希釈した表面抗原に対する抗体で、４℃で２０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定し、再度洗浄し、PBS＋BSA ０．２％＋ＮａＮ_３０．０５％に再懸濁した。試料を、BD LSRFortessaフローサイトメーターで取得し、データをFlowJo v.10ソフトウェア（BD Biosciences）を使用して分析した。CountBright Absolute Counting Beadsを使用して、絶対細胞数を定量化した。選択された実験では、２％パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞を、サポニンベースの透過化緩衝液（BioLegend）を用いて４℃で１０分間インキュベートして透過化し、透過化緩衝液で希釈した細胞内サイトカインに対する抗体で、４℃で２０分間染色した。次に、細胞を透過化緩衝液で洗浄し、PBS＋BSA ０．２％＋ＮａＮ_３０．０５％に再懸濁し、前に示したように取得した。

FACSおよびイメージングサイトメトリーのために、マウスにAF488－マンナンを皮内注射し、６時間後にdLNを採取して、LN細胞懸濁液を得た。FACSでは、細胞を、PBS＋BSA ０．２％で希釈した表面抗原に対する抗体で、４℃で２０分間染色した。次に細胞を１回洗浄し、１ｍｌのPBS＋BSA ０．２％に再懸濁し、７０μｍのセルストレーナー（Fisher Scientific）で濾過し、Sony MA900セルソーターで１ｍｌのTRI試薬に直接ソートした。以下の細胞サブセットをソートした：CD3 CD19 NK1.1^- Ter119^- CD45⁺ AF488-マンナン^＋ Ly6G^-(CD11b⁺ Ly6C⁺) CD11b⁺ CD11c⁺。イメージングサイトメトリーでは、細胞からのリンパ系細胞および赤血球系細胞の除去を、抗CD3、抗CD19、抗NK1.1、抗Ter119およびストレプトアビジンマイクロビーズ（MiltenyiBiotec）に対するビオチン化抗体で製造業者のプロトコルに従って連続染色することにより実施した。残りの細胞を抗CD45 APCで染色し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、１回洗浄し、６０μｌのPBS＋DAPI（０．２μｇ／ｍｌ）に再懸濁した。次に試料をAmnis ImageStream X Mark II（Luminex Corporation）で取得した。マンナン内部移行は、Amnis Ideasソフトウェアで分析し、内部移行機能によりAPCマスク内のAF488シグナルとして計算した。

共焦点顕微鏡検査の場合、dLNを、定常状態またはAF488－マンナンの注射後１時間で分離し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。組織スライドは、凍結LN試料から、Beth Israel Deaconess Medical Center（BIDMC）Histology Core Facilityで調製し、BIDMC Confocal Imaging Core Facilityで染色した。簡単に説明すると、凍結切片を３０分間風乾し、再水和した。切片を、０．０５％のTriton X-100を使用して室温で１０分間透過処理し、TBSで３回洗浄した。次いで、切片を５％正常ロバ血清（Jackson ImmunoResearch Lab）と共に室温で１時間インキュベートした。定常状態のLNのデクチン２染色については、スライドをラット抗デクチン２と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドを３回洗浄し、Alexa Fluor 488抱合ロバ抗ラット二次抗体（Jackson ImmunoResearch Lab）と共に室温で９０分間インキュベートし、４回洗浄した。次いでスライドをAlexa Fluor 647抱合ラット抗CD169一次抗体およびAlexa Fluor 594抱合ラット抗CD45R/B220一次抗体と共に、室温で９０分間インキュベートし、その後TBSで洗浄した。AF488－マンナン処置したLNのホスホSyk染色では、スライドをウサギ抗ホスホSyk（Cell Signaling Technology）と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドを３回洗浄し、Alexa Fluor 647抱合ロバ抗ウサギ二次抗体（Jackson ImmunoResearch Lab）と共に室温で９０分間インキュベートし、４回洗浄した。次いでスライドをAlexa Fluor 594抱合ラット抗CD45R/B220一次抗体と共に室温で９０分間インキュベートし、その後TBSで洗浄した。ウサギ抗ホスホSyk（Cell Signaling Technology）。試料をHoechst 33342（Thermo Fisher Scientific）で対比染色し、TBSで３回洗浄した。スライドはProlong Gold褪色防止用封入剤（Thermo Fisher Scientific）で封入し、Boston Children’s Hospital Harvard Digestive Disease CenterのZeiss 880レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像化した。

RNA単離、qPCR、トランスクリプトームおよび経路解析。RNAをTRI試薬試料から、フェノールクロロホルム抽出またはカラムベースの抽出システム（Direct-zol RNA Microprep and Miniprep, Zymo Research）を使用し、製造業者のプロトコルに従って単離した。RNA濃度および純度（２６０／２８０および２６０／２３０比率）は、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific）により測定した。
精製RNAの遺伝子発現をqPCRにより、CFX384リアルタイムサイクラー（Bio-rad）で、Cxcl9（RM1_Cxcl9およびFM1_Cxcl9）、Gbp2（RM1_Gpb2およびFM1_Gbp2）、Ifit2（RM1_Ifit2およびFM1_Ifit2）、Rsad2（RM1_Rsad2およびFM1_Rsad2）、Il6（RM1_Il6およびFM1_Il6）、Cxcl1（RM1_Cxcl1およびFM1_Cxcl1）に特異的な事前設計されたKiCqStart SYBR Green Primers（MilliporeSigma）、または、Gapdh（Mm.PT.39a.1）に特異的な事前設計されたPrimeTime qPCR Primers（Integrated DNA Technologies）を用いて、分析した。

バルクRNA配列解析のために、LN試料から単離されたRNAをGenewizに提出した。RNA試料はQubit 2.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量し、RNAの完全性をAgilent 2200 TapeStation（Agilent Technologies）のRNA Screen Tapeを用いてチェックした。RNA配列決定ライブラリの調製は、TruSeq Stranded mRNAライブラリ調製キットを使用し、製造元のプロトコル（Illumina、Cat＃ RS-122-2101）に従って調製した。簡単に説明すると、最初にmRNAをOligod(T)ビーズで濃縮した。濃縮されたmRNAを９４℃で８分間断片化した。続いて、第一鎖および第二鎖のcDNAを合成した。cDNAの第二鎖は、合成中にdUTPを組み込むことによってマークした。cDNA断片の３’末端をアデニル化し、インデックス付きアダプターをcDNA断片にライゲートした。制限サイクルPCRを用いてライブラリを濃縮した。第二鎖cDNAに組み込まれたdUTPは、第二鎖の増幅を抑制し、これは鎖の特異性を維持するのに役立った。配列決定ライブラリは、Agilent 2200 TapeStation（Agilent Technologies）のDNA Analysis Screen Tapeを使用して検証し、Qubit 2.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）および定量的PCR（Applied Biosystems）を用いて定量化した。配列決定ライブラリを多重化し、フローセルの１レーン上にクラスター化した。クラスタリング後、フローセルをIllumina HiSeq装置に製造業者の指示に従って負荷した。試料は、２×１５０ペアエンド（PE）高出力構成を用いて配列決定した。画像解析および塩基呼び出しは、HiSeq装置上のHiSeq Control Software（HCS）により実施した。Illumina HiSeqから生成された生の配列データ（.bclファイル）をfastqファイルに変換し、Illumina bcl2 fastqプログラムバージョン2.17を使用して逆多重化した。１つの不一致がインデックス配列の識別に許容された。読み取りは、FastQCを用いて品質管理した。Illuminaアダプターは、cutadaptを用いて除去した。トリミングされたリードは、Kallistoを用いてEnsemblアノテーションに基づき、マウストランスクリプトーム（GRCm38）にマッピングした（Bray et al., 2016）。転写産物数は、tximportを用いてインポートし、遺伝子数に集計した（Soneson et al., 2015）。遺伝子数は、ＲパッケージDESeq2を用いて分析した（Love et al., 2014）。該当する場合、統計モデルのブロッキング因子としてバッチを使用した。差次的発現遺伝子（DEG）は、FDR有意性閾値（皮膚では０．０５、リンパ節では０．０１、反復回数が多いため検出力が大きいお陰で、より厳しい閾値）をパスするものとして同定した；ここで、代替仮説は、絶対log2 FCは０より大であった。生理食塩水に対して、マンナンまたはグルカン処置によって誘導された遺伝子は、RパッケージComplexHeatmapを用い、Zスコアのlog2正規化存在量を使用して、ヒートマップにプロットした。遺伝子は、グルカンとマンナンの間の存在量デルタ（必要に応じて複数の時点から集約）によって配置され、ギャップによって２つのクラスターが区切られた：マンナン刺激でより高度に発現される遺伝子ｖｓグルカン刺激でより高度に発現される遺伝子である。経路解析は、RパッケージhypeR（Federico and Monti, 2020）を使用し、目的のクラスターに属する遺伝子の超幾何濃縮試験と、Broad InstituteのMSigDBコレクションのHallmark遺伝子セットコレクションを用いて実施した。

標的化トランスクリプトーム配列決定では、ソートされた細胞から単離された２５ｎｇのRNAを、SuperScript VILO cDNA合成キット（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNAに逆転写した。バーコード付きライブラリを、Ion AmpliSeq Transcriptome Mouse Gene Expression Kitを使用し製造業者のプロトコルに従って調製し、Ion S5システム（Thermo Fisher Scientific）を用いて配列決定した。差次的遺伝子発現解析は、ampliSeqRNAプラグイン（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。DEGの数を定量化するために、遺伝子レベルの倍数変化＜－１．５または＞１．５、および遺伝子レベルのｐ値＜０．０５（ANOVA）を考慮した。ヒートマップ表示では、DEGは、変異体とWT対照の間のF試験FDRが０．０５未満、およびlog2倍数変化（FC）が１より大（または－１未満）として定義した。階層的クラスタリングを、ピアソン相関と平均連鎖を用いて実施した。経路解析は、RパッケージhypeRで、Kolmogorov Smirnov テストを用いて、log2FCに従ってランク付けした遺伝子について実施した。

in vivoのCD4⁺およびCD8⁺ T細胞増殖アッセイ。OT-IIまたはOT-Iマウスから脾臓を分離し、シリンジのプランジャー端で潰した。次に、脾細胞の細胞懸濁液をACK溶解緩衝液（２ｍｌ、室温で２分間）で処理し、PBSで洗浄し（３００ｇで５分間）、７０ｍｍセルストレーナーで濾過した。CD4⁺およびCD8⁺ T細胞をそれぞれ、CD4 (L3T4)またはCD8a (Ly-2) MicroBeads（Miltenyi Biotec）を使用し製造業者のプロトコルに従って精製し、CellTrace CFSE（PBS＋FBS ２．５％中で５ｍＭ、暗所で２０分間）で染色した。インキュベーションの最後に、細胞をPBSで２回洗浄し、５×１０^５細胞／１００ｍｌ生理食塩水の濃度で再懸濁し、１００ｍｌの細胞懸濁液を各マウスに静脈内注射した。２４時間後（０日目）、マウスにOVA（５ｍｇ／マウス）を単独で、またはマンナンと組み合わせて（５００ｍｇ／マウス）、皮内注射した。生理食塩水を注射したマウスを対照として使用した。＋３日目にdLNを採取し、LN細胞懸濁液を、抗CD19、抗Ter119、抗CD3および抗CD4または抗CD8抗体で染色した。養子移入したCFSE標識OT-II細胞およびOT-I細胞は、それぞれ、CD19^- Ter119^- CD3⁺ CD4⁺ゲートおよびCD19^- Ter119^- CD3⁺ CD8⁺ゲートで検出された。結果は、CD19^- Ter119^- CD3⁺ CD4⁺ CFSE^loまたはCD19^- Ter119^- CD3⁺ CD8⁺ CFSE^lo細胞（すなわち、少なくとも１回の分裂サイクルを経た細胞）の絶対数、またはCD19^- Ter119^- CD3⁺ CD4⁺ゲートもしくはCD19^- Ter119^- CD3⁺ CD8⁺ゲート内の、各分裂ピークのパーセンテージとして表される。

SARS-CoV-2スパイクおよびRBDの発現および精製。全長SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質とRBD構築物（アミノ酸残基R319～K529）は、どちらもHRV3Cプロテアーゼ切断部位、TwinStrepTagおよび8XHisTagをC末端に有し、それぞれDr. FBarney S. Graham（NIH Vaccine Research Center）およびDr. Aaron G. Schmidt（Ragon Institute）から入手した。これらの発現ベクターを使用して、Expi293細胞（Thermo Fisher Scientific）をポリエチレンイミン（Polysciences）を使用して一時的にトランスフェクトした。タンパク質は、濾過した細胞上清から、StrepTactin樹脂（IBA）またはCobalt-TALON樹脂（Takara）を使用して精製した。アフィニティータグを、溶出タンパク質試料からHRV3Cプロテアーゼにより切断し、タグを除去したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、PBS（ｐＨ７．４）緩衝液中Superose 6 10/300カラム（GE Healthcare）またはSuperdex 75 10/300 Increaseカラム（GE Healthcare）を用いて、追加の精製に供した。

免疫化および抗体定量化。CB6F1マウスを、以下の皮内注射により０日目と＋１４日目に免疫化した：スパイク（１ｍｇ／マウス）単独、またはスパイクとAH（１００ｍｇ／マウス）、β－グルカン（５００ｍｇ／マウス）、マンナン（５００ｍｇ／マウス）、AH／マンナン（AH/mann）、AddaS03もしくはAH/PHADとの配合。代替的に、C57BL/6マウスを、以下の皮内注射により０日目と＋１４日目に免疫化した：Flublokワクチン（１μｇのFlubok2020；rHAあたり０．２５μｇ）単独、またはFlublokワクチンとAH（１００μｇのAH）、AH/mann（１００μｇのAH、５００μｇのマンナン）、AddaVaxもしくはAH/PHADとの配合。生理食塩水を注射したマウスを対照として使用した。血液試料を、＋１４日目（ブースト前）および＋２８日目に後眼窩採血により採取し、血液試料を２回、１５００ｇで１０分間遠心分離した後、血清試料を分離した。選択した実験では、血液試料をチャレンジ後＋９８日目または７日目に採取した。血清試料中のスパイク、RBD、Flublok、およびrPR8特異的IgG、IgG1、IgG2c抗体レベルを、ELISAにより以前に記載のプロトコルを修正して定量化した（Borriello et al., 2017）。簡単に説明すると、高結合平底９６ウェルプレートを、PBS中の０．５μｇ／ｍｌのスパイク、１μｇ／ｍｌのRBD、１μｇ／ｍｌのFlublokまたは１μｇ／ｍｌのrPR8でコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、PBS＋０．０５％Tween-20（PBST）で１回洗浄し、PBS＋BSA１％で室温で１時間ブロックした。次に血清試料を、PBS＋BSA１％で１：１００の初期希釈および１：４の段階希釈で加えて、１１点曲線を作成し、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTで３回洗浄し、HRP抱合抗マウスIgG、IgG1またはIgG2c（Southern Biotech）抗体と共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、プレートをPBSTで５回洗浄し、テトラメチルベンジジン（スパイク、rHA、およびrPR8用のBD OptEIA基質溶液；RBD用のThermo Fisher Scientific 1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液）で５分間発色させ、その後、２ＮのＨ_２ＳＯ_４で停止させた。光学密度（OD）をSpectraMax iD3xマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて４５０ｎｍで読み取り、エンドポイント力価を、バックグラウンドの光学密度の３倍をカットオフとして用いて算出した。１００未満の値は２５として報告した。

脾細胞再刺激アッセイ。免疫化マウスを３５日目に犠牲にし、脾臓を収集した。脾細胞を分離するために、脾臓を７０μｍセルストレーナーを通して潰し、得られた細胞懸濁液をPBSで洗浄し、ACK溶解緩衝液（２ｍｌ、室温で２分間）と共にインキュベートして赤血球を溶解した。脾細胞を再度PBSで洗浄し、平底９６ウェルプレートにプレーティングした（ウェル当たり２×１０^６細胞）。次に、SARS-CoV-2スパイクペプチド（PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S、Miltenyi Biotec）を最終濃度０．６ｎｍｏｌ／ｍｌで添加した（細胞培養総量、ウェルあたり２００μｌ）。９６時間後、上清を採取し、IFNγレベルをELISA（Thermo Fisher Scientific）により製造業者のプロトコルに従って測定した。

SARS-CoV-2代替ウイルスの中和試験。代替ウイルス中和試験は、以前に公開されたプロトコルを修正して実施した（Tan et al., 2020）。簡単に説明すると、高結合平底９６ウェルプレートを、PBS中の２μｇ／ｍｌ組換えヒトACE2（hACE2、MilliporeSigma）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、PBSTで３回洗浄し、PBS＋BSA１％で室温で１時間ブロックした。その間、各血清試料（最終希釈１：１６０）を、PBS＋BSA１％中の３ｎｇのRBD-Fc（R＆D Systems）と共に室温で１時間プレインキュベートし、その後、hACE2でコーティングしたプレートに移した。陽性対照として、RBD-Fcも、血清試料とのプレインキュベーションなしでhACE2でコーティングしたウェルに添加した。室温で１時間後、プレートをPBSTで３回洗浄し、HRP抱合抗ヒトIgG Fc抗体（Southern Biotech）と共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、プレートをPBSTで５回洗浄し、テトラメチルベンジジン（BD Biosciences）で５分間発色させ、その後、２ＮのＨ_２ＳＯ_４で停止した。光学密度は、SpectraMax iD3xマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて４５０ｎｍで読み取った。hACE2へのRBD結合の阻害率は、次の式で計算した：阻害（％）＝［１－（試料のＯＤ値－バックグラウンドＯＤ値）／（対照のＯＤ値－バックグラウンドＯＤ値）］×１００。

SARS-CoV-2中和力価の決定。すべての血清試料は、補体を除去するために５６℃で３０分間加熱不活化し、中和力価のための処理の前に、室温に平衡化した。試料を１：５または１：１０の初期希釈までデュプリケートで希釈し、続いて１：２に段階希釈し、各ウェルが１００μｌを含有する１２段階希釈系列を得た。すべての希釈は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（熱不活化、MilliporeSigma）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Gemini Bio-products）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン（最終濃度２ｍＭ、Thermo Fisher Scientific）を補充したDMEM（Quality Biological）で行った。次に、希釈プレートをBSL-3研究室に輸送し、１００μｌの希釈SARS-CoV-2（WA-1、Dr. Natalie Thornburg／CDC)の厚意）接種物を各ウェルに添加して滴定プレートに移した際に、多重感染（MOI）０．０１をもたらした。未処理のウイルスのみの対照および模擬感染対照を各プレートに含めた。次に、試料／ウイルス混合物を、３７℃（５．０％ＣＯ_２）で１時間インキュベートした後、コンフルエントなVeroE6細胞を有する９６ウェルタイタープレートに移した。タイタープレートを３７℃（５．０％ＣＯ_２）で７２時間インキュベートした後、細胞変性効果（CPE）をプレートの各ウェルについて決定した。CPEを示す最初の試料希釈は、試験したSARS-CoV-2濃度の＞９９％を中和するのに必要な最小の試料希釈として報告された（neut99）。

ウイルススキャン。ファージIPおよび配列決定は、以前に記載されているもの（Xu et al., 2015a）にわずかな修正を加えて実施した。SARS-CoV-2に最も近縁な６種類のHCoVおよび３種類のコウモリコロナウイルスのプロテオームを通して２８アミノ酸ごとにタイリングする、５６merのペプチドライブラリをコードするサブライブラリ（Shrock et al., 2020）を、元のVirScanライブラリと混合して、SARS-CoV-2エピトープのマッピングを可能にする。各VirScan反応には、０．６μｌのマウス血清、または約２μｇのIgGが含まれていた。免疫沈降は、以前に記載されているように（Xu et al., 2015a）、プロテインAおよびプロテインGの磁気Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。

統計。必要に応じて、データを統計分析の前に対数変換して、正規分布に近づけた。１試料ｔ検定を使用して、各群を値１（または倍数表示による反対側の対照試料を表す、対数変換後の０）と比較した。１つのカテゴリ変数を持つデータセット内の群間の統計的差異は、２試料ｔ検定（２群）または多重比較用に補正された一元配置分散分析（３群以上）により評価した。２つのカテゴリ変数を含むデータセット内の群間の統計的差異は、多重比較用に補正された二元配置分散分析によって評価した。＃または＊、および＊＊または＃＃は、それぞれｐ≦０．０５および０．０１を示す。

参考文献
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均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される態様の多くの均等物を認識するか、日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
「a」、「an」、「the」などの冠詞は、逆の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味する。グループの２つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、逆の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、複数、またはすべてが存在する場合に、満たされると見なされる。２つ以上のグループメンバー間に「または」を含むグループの開示は、グループの正確に１つのメンバーが存在する態様、グループの複数のメンバーが存在する態様、およびグループの全てのメンバーが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は本明細書で個別に詳述されていないが、これらの態様の各々が本明細書に提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることが、理解されるであろう。

本開示は、１つ以上のクレームからの、または説明の１つ以上の関連部分からの１つ以上の限定、要素、条項、または説明用語が、別のクレームに導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包含することを理解されたい。例えば、別のクレームに従属するクレームは、同じ基本クレームに従属する他のクレームに見出される１つ以上の限定を含むように、修正することができる。さらに、クレームに組成物が記載されている場合、本明細書に開示される製造方法または使用方法のいずれかによる、または当技術分野で知られている方法が存在する場合にはそれによる、組成物の製造または使用方法が含まれると理解されるべきであるが、ただし、別段の記載がある場合、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかである場合を除く。

要素がリストとして、例えばマーカッシュグループ形式で提示される場合、要素のすべての可能なサブグループも開示され、任意の要素または要素のサブグループをグループから除去できることを、理解されたい。また、「含む」という用語はオープンであることが意図されており、追加の要素またはステップの包含が許容されることにも留意されたい。一般に、態様、製品、または方法が特定の要素、特徴、またはステップを含むとされる場合、かかる要素、特徴、またはステップからなる、または本質的にそれらからなる態様、製品、または方法もまた提供されることを理解されたい。簡潔にするために、これらの態様は本明細書で個別に詳述されていないが、これらの態様の各々が本明細書に提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることが理解されるであろう。

範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値は、いくつかの態様において、文脈上明らかに別段の指示がない限り、記載された範囲内の任意の特定の値を、範囲の下限の単位の１０分の１まで想定し得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は本明細書で個別に詳述されていないが、これらの値の各々が本明細書に提供されており、具体的に特許請求または放棄され得ることが理解されるであろう。また、別段の指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定し得ることも理解されたい；ここで該部分範囲のエンドポイントは、範囲の下限の単位の１０分の１と同程度の精度で表される。

ウェブサイトが提供される場合、URLアドレスはブラウザーで実行できないコードとして提供され、それぞれのウェブアドレスのピリオドは括弧内に示される。実際のWebアドレスに括弧は含まれない。
さらに、本開示の任意の特定の態様は、任意の１つ以上のクレームから明示的に除外され得ることを理解されたい。範囲が指定されている場合、範囲内の値は任意の１つ以上のクレームから明示的に除外され得る。本開示の組成物および／または方法の態様、要素、特徴、用途、または側面は、任意の１つ以上のクレームから除外することができる。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外されている態様のすべてが、本明細書で明示的に記載されているわけではない。

Claims

ウイルスに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、対象に、ウイルス抗原と、真菌多糖類を含むアジュバント系とを投与することを含む、前記方法。
真菌多糖類が可溶性多糖類である、請求項１に記載の方法。
真菌多糖類がマンナンである、請求項１または２に記載の方法。
真菌多糖類が、Candida albicansから単離される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、ミョウバンをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
真菌多糖類が、ミョウバンに吸着される、請求項５に記載の方法。
ウイルスが、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）関連コロナウイルス（SARS-CoV）-1、およびSARS-CoV-2から選択されるベータコロナウイルスである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
核酸が、DNAまたはRNAである、請求項９に記載の方法。
RNAが、メッセンジャーRNA（mRNA）である、請求項１０に記載の方法。
ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドが、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質またはスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質が、MERS-CoVスパイクタンパク質、SARS-CoV-1スパイクタンパク質、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質RBDが、MERS-CoVスパイクタンパク質RBD、SARS-CoV-1スパイクタンパク質RBD、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質RBDである、請求項１２に記載の方法。
ウイルス抗原が、MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2のウイルス粒子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、死滅または不活化MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、死滅または弱毒化生MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
ウイルスが、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスである、請求項1～６のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項１～６または請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１～６または請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
核酸が、DNAまたはRNAである、請求項２０に記載の方法。
RNAが、mRNAである、請求項２１に記載の方法。
A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドが、血球凝集素（HA）タンパク質、ノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、またはそれらのポリペプチドである、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
抗原が、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのウイルス粒子を含む、請求項１～６または請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
抗原が、死滅または不活化A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む、請求項１～６または請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
抗原が、死滅または弱毒化生A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む、請求項１～６または請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
対象がヒトである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
対象が、ヒト新生児、ヒト乳児、成人、または高齢者である、請求項２７に記載の方法。
対象が、伴侶動物または研究動物である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
対象が免疫無防備状態であり、慢性肺疾患、喘息、心血管疾患、がん、肥満、糖尿病、慢性腎臓病、および／または肝疾患を有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原とアジュバント系とが、同時に投与される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原とアジュバント系とが、別々に投与される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原およびアジュバント系が、筋肉内、皮内、経口的、静脈内、局所的、鼻腔内、または舌下に投与される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
投与が予防的である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
投与が、対象において１型免疫応答を誘発する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、対象における樹状細胞関連C型レクチン２（デクチン２）の活性化を促進する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、対象の自然免疫応答を引き起こす、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、B細胞免疫を増強する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原特異的抗体の産生を増強する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原特異的抗体の産生を増強し、任意にここで、抗特異的抗体がIgG2c型である、請求項３９に記載の方法。
アジュバント系が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、より広範囲のエピトープを標的とする抗原特異的抗体の産生を増強する、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、サイトカインの産生を増強する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
サイトカインがIFNγを含む、請求項４２に記載の方法。
アジュバント系が、自然免疫応答を濾胞性ヘルパーT（Tfh）細胞免疫に極性化させる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、自然免疫応答をヘルパーT1（Th1）細胞免疫に極性化させる、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、対象におけるウイルス抗原に対する防御効果を延長する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
アジュバント系が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、免疫応答の速度を増加させる、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス抗原が、アジュバント系の存在下で、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、抗原に対する同レベルの免疫応答をより低い用量で生成する、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
抗体による疾患増強（ADE）の可能性が、ウイルス抗原を単独で投与する場合と比較して、対象において低減される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
ウイルスに対する免疫応答をそれを必要とする対象において誘導するのに使用するための、真菌多糖類を含むアジュバント系。
ウイルスに対する免疫応答をそれを必要とする対象において誘導するのに使用するための、真菌多糖類およびミョウバンを含むアジュバント系。
ウイルス抗原と、真菌多糖類を含むアジュバント系とを含む、免疫原性組成物。
真菌多糖類が可溶性多糖類である、請求項５２に記載の免疫原性組成物。
真菌多糖類がマンナンである、請求項５３に記載の免疫原性組成物。
真菌多糖類がCandida albicansから単離される、請求項５４に記載の免疫原性組成物。
アジュバント系が、ミョウバンをさらに含む、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
真菌多糖類が、ミョウバンに吸着される、請求項５６に記載の免疫原性組成物。
ウイルスが、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）関連コロナウイルス（SARS-CoV）-1、及び SARS-CoV-2から選択される、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
核酸が、DNAまたはRNAである、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
RNAが、メッセンジャーRNA（mRNA）である、請求項６１に記載の免疫原性組成物。
ベータコロナウイルスのタンパク質またはポリペプチドが、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質またはスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）を含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質が、MERS-CoVスパイクタンパク質、SARS-CoV-1スパイクタンパク質、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質である、請求項６３に記載の免疫原性組成物。
ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質RBDが、MERS-CoVスパイクタンパク質RBD、SARS-CoV-1スパイクタンパク質RBD、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質RBDである、請求項６４に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2のウイルス粒子を含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、死滅または不活化MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、死滅または弱毒化生MERS-CoV、SARS-CoV-1、またはSARS-CoV-2を含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルスが、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスである、請求項５２～５７のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項５２～５７および請求項６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項５２～５７および請求項６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
核酸が、DNAまたはRNAである、請求項７１に記載の免疫原性組成物。
RNAが、mRNAである、請求項７２に記載の免疫原性組成物。
A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスのタンパク質またはポリペプチドが、血球凝集素（HA）タンパク質、ノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、またはそれらのポリペプチドである、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザのウイルス粒子を含む、請求項５２～５７および請求項６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、死滅または不活化A型インフルエンザまたはB型インフルエンザを含む、請求項５２～５７および請求項６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ウイルス抗原が、死滅または弱毒化生A型インフルエンザまたはB型インフルエンザを含む、請求項５２～５７および請求項６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。