JP4976653B2 - 免疫刺激性CpGオリゴヌクレオチドを用いてバイオテロ病原体による感染症を予防する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国仮特許出願第60/422,964号(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)の利益を主張する。
本開示は、バイオテロ病原体(bioterrorism agent)によって引き起こされる感染症の抑制または治療の方法に関し、特に、CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドを用いてバイオテロ病原体に対する免疫応答を増大させる方法に関する。
バイオテロ病原体とは、環境中に故意にまき散らされてヒトまたは動物の疾患または死を引き起こす細菌、ウイルスおよび毒素のことである。バイオテロ病原体には、炭疽菌(炭疽)、ペスト菌(ペスト)、大痘瘡(疱瘡)、ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)(ダニ媒介脳炎)およびエボラウイルス(エボラ)が非制限的に含まれる。バイオテロ病原体にはまた、ある種の生物によって産生される毒素である生体毒素も含まれうる。生体毒素の例には、ボツリヌス菌によって産生されるボツリヌス毒素、およびトウゴマ種子から単離されるリシンがある。
本明細書に記載されるのは、バイオテロ病原体に曝露されたか、または曝露されるリスクのある対象における感染症を治療または予防する方法である。いくつかの態様において、本方法は、CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドを用いてバイオテロ病原体に対する免疫応答を増大させる方法である。また別の方法は、CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドおよび別の抗感染症薬を用いてバイオテロ病原体に対する免疫応答を増大させる方法である。さらに別の方法は、CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、バイオテロ病原体に対するワクチンの免疫原性を高めることを含む。
その特徴および利点は、添付した図を参照しながら進めていく、以下のいくつかの態様の詳細な説明によってさらに明らかになると考えられる。
添付した配列表に列記した核酸配列は、米国特許法施行規則1.822条(37C.F.R. 1.822)に定義されたヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略号を用いて示されている。明細書中では文字Xが任意の不特定のヌクレオチドを指して用いられるが、配列表では文字Nが任意の不特定のヌクレオチドを指して用いられることは当業者には明らかであろう。添付した配列表には以下のものがある:
SEQ ID NO 1〜16、17、18および21〜25は、免疫刺激性CpG Dオリゴヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO 19、20および26〜28は、対照Dオリゴヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO 29〜43は、Kオリゴヌクレオチド配列である。
I. 略号
A:アデニン
Ab:抗体
AVA:吸着炭疽ワクチン
C:シトシン
CpG ODN:CpGもチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド(D型またはK型)
DC:樹状細胞
EU:エンドトキシン単位
FCS:ウシ胎仔血清
G:グアニン
h:時間
IFN-α:インターフェロンα
i.m.:筋肉内
i.p.:腹腔内
IFN-γ:インターフェロンγ
μg:マイクログラム
mRNA:メッセンジャーリボ核酸
NK:ナチュラルキラー細胞
ODN:オリゴデオキシヌクレオチド
PA:防御抗原
PAMP:病原体関連分子パターン
Pu:プリン
Py:ピリミジン
rPA:組換えPA抗原
SQ:皮下
T:チミン
TLR:Toll様(Toll-like)受容体
別に指摘する場合を除き、技術用語は慣例的用法に従って用いられる。分子生物学の一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, 「遺伝子V(Genes V)」、Oxford University Press発行、1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al.(eds.), 「分子生物学事典(Encyclopedia of Molecular Biology)」、Blackwell Science Ltd.発行、1994(ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers(ed.)、「分子生物学およびバイオテクノロジー:包括的便覧(Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference)」、VCH Publishers, Inc.発行、1995(ISBN 1-56081-569-8)に記載がある。
哺乳動物および鳥類などを含むカテゴリーである、生きた多細胞脊椎生物のこと。哺乳動物という用語にはヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、「対象(subject)」という用語にはヒトおよび獣医学的な対象の両方、例えばヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれる。
動物における抗体の産生またはT細胞応答を誘発しうる化合物、組成物または物質のことであり、これには動物の体内に注射または吸収される組成物が含まれる。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む、特異的な体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、関連性のあるすべての抗原エピトープを含む。1つの態様において、抗原はバイオテロ病原体抗原である。いくつかの態様において、抗原はバイオテロ病原体に対するワクチンの成分であり、これはまき散らされて動物またはヒトにおける疾患または死を引き起こすことが可能な任意の細菌、ウイルス、真菌または生体毒素に付随する、またはそれらによって発現される抗原である。
対象の感染症の治療に用いられる物質(化合物、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の分子)。抗感染症薬には、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物および抗生物質が非制限的に含まれる。抗生物質には、アモキシシリン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セファレキシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、メトロニダゾール、テルビナフィン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、テトラサイクリンおよびアジスロマイシンが非制限的に含まれる。抗真菌化合物には、クロトリマゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、シクロピロックス、クリオキノール、クリオキノール、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナフチフィン、ニスタチン、オキシコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾールおよびトルナフテートが非制限的に含まれる。抗ウイルス化合物には、ジドプジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、テノフロビル、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インディナビル、ネルフィナビル、サキナビル、アンプレナビルおよびロピナビルが非制限的に含まれる。抗感染症薬には高度免疫グロブリンも含まれる。高度免疫グロブリンとは、目的の物質による免疫処置を受けたドナーまたはドナーのプールから単離されたガンマグロブリンのことである。特に、高度免疫グロブリンは、病原体に対する反復的なワクチン接種を受けたドナーから精製された抗体のことである。いくつかの態様において、高度免疫グロブリンは、抗原、微生物(加熱滅菌された微生物)またはウイルスによる反復的な免疫処置を受けたドナーまたはドナーのプールから単離されたガンマグロブリンである。1つの特定の非制限的な例において、炭疽菌に対する高度免疫グロブリンは、炭疽ワクチン(AVA)による反復的な免疫処置を受けたドナーからの血清を用いて製造される。
二本鎖DNA(dsDNA)には、プラス鎖と呼ばれる5'→3'鎖、およびマイナス鎖と呼ばれる3'→5'鎖(逆相補鎖)という2本の鎖がある。RNAポリメラーゼは核酸を5'→3'の向きに付加するため、転写時にはDNAのマイナス鎖がRNAのテンプレートとしての役割を果たす。このため、形成されたRNAはマイナス鎖に対して相補的であってプラス鎖とは同一な配列を有すると考えられる(塩基ウラシルがチミンに置換される点を除く)。
AVAは米国で許可されている唯一のヒト炭疽ワクチンであり、BioPort Corporation(Lansing, MI)によって製造されており、死菌も生菌も含まない炭疽菌培養物の無細胞濾液から調製される。このワクチンの調製に用いられる菌株は、V770-NP1-Rとして知られている毒素産生性無莢膜株である。濾液はPA(防御抗原)を含む細胞産物の混合物を含んでおり、これをアジュバントとしての水酸化アルミニウム(Amphogel, Wyeth Laboratories)に吸着させる。用量0.5mL当たりのPAおよび他のタンパク質の量は不明であり、製品中にはLF(致死因子)、EF(浮腫因子)およびPAという3種類の毒素成分すべてが存在する。
炭疽菌は炭疽の原因微生物であり、これは大型でグラム陽性であって運動性のない胞子形成性の桿菌である。炭疽菌には浮腫毒素、致死毒素および莢膜抗原という3つのビルレンス因子がある。炭疽菌への感染がヒトの炭疽の原因である。ヒトの炭疽には主に3種類の臨床形態がある:皮膚性、吸入性および胃腸性のものである。皮膚炭疽は皮膚を介した胞子の導入の結果であり;吸入炭疽は気道を介し;胃腸炭疽は経口摂取による。治療されなければ、いずれの形態の炭疽も敗血症および死亡に至る恐れがある。皮膚炭疽は早期に治療されれば通常治癒し、いずれの形態も回復のためには早期治療が重要である。胃腸炭疽の患者の致命率は25%〜75%と報告されている。吸入炭疽の致命率は90〜100%に近いと考えられている。
故意にまき散らされてヒトまたは動物の疾患または死を引き起こすことが可能な種々の細菌、ウイルスおよび毒素のうち任意のもの。バイオテロ病原体の例には、炭疽の原因となる炭疽菌、ペストの原因となるペスト菌、痘瘡の原因となる大痘瘡(Variola major)、ダニ媒介脳炎の原因となるダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)、およびエボラの原因となるエボラウイルスが含まれる。バイオテロ病原体には、ある種の生物によって産生される毒素である生体毒素も含まれる。生体毒素の例には、ボツリヌス菌によって産生されるボツリヌス毒素、およびトウゴマ種子から単離されるリシンがある。西側諸国の拡散対抗当局(Western counter-proliferation agencies)は現在、23種の細菌、43種のウイルスおよび14種の生体毒素を、バイオテロ病原体の可能性があるものとして認識している。
シトシンの後にリン酸結合によってグアニンが結合した核酸のことであり、シトシンのピリミジン環はメチル化されていない。「メチル化CpG」とは、ピリミジン環のシトシンのメチル化のことを指し、これは通常、ピリミジン環の5位で起こる。CpGモチーフとは、メチル化されていない中央のCpGが、中央のCpG(の3'側および5'側)に隣接する少なくとも1つの塩基によって囲まれている塩基パターンのことである。理論には拘束されないが、CpGに隣接する塩基は活性の一部をCpGオリゴデオキシヌクレオチドに付与する。CpGオリゴヌクレオチドは、少なくとも約10ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、非メチル化CpGを含む。CpGオリゴヌクレオチドはDおよびKのいずれのオリゴデオキシヌクレオチドも含む(以下を参照)。CpGオリゴデオキシヌクレオチドは一本鎖である。CpGオリゴデオキシヌクレオチドの全体がメチル化されていなくてもよく、部分がメチル化されていなくてもよい。1つの態様において、5' CG 3'の少なくともCはメチル化されていない。
リンパ球のように他の細胞の挙動に影響を及ぼす細胞によって作られるタンパク質。1つの態様において、サイトカインは細胞輸送に影響を及ぼす分子であるケモカインである。サイトカインの具体的で非制限的な例にはIFN-γ、IL-6およびIL-10がある。
式
によって表される配列を有する非メチル化CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド(式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、RはAまたはG(プリン)であり、YはCまたはT(ピリミジン)である)。D型オリゴデオキシヌクレオチドは非メチル化CpGジヌクレオチドを含む。CpGの逆位、置換またはメチル化により、Dオリゴデオキシヌクレオチドの活性は低下または消失する。
(式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、Puはプリンヌクレオチドであり、Pyはピリミジンヌクレオチドであり、XおよびWは任意のヌクレオチドであり、Mは0から10までの任意の整数であり、Nは4から10までの任意の整数である)。一般に、D ODNは細胞応答を誘発することができる。例えば、D ODNはナチュラルキラー細胞を刺激し、樹状細胞の成熟を誘発する。
抗原決定基のこと。これらは、抗原性のある、すなわち特異的な免疫応答を惹起する、分子上にある特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は特定の抗原エピトープと結合する。
例えば免疫刺激性ODNにおける、本明細書に記載したものと同じ結果が得られる配列変化のこと。このような配列変化には、欠失、塩基修飾、変異、標識および挿入が非制限的に含まれうる。
刺激に対する、免疫系の細胞、例えばB細胞またはT細胞の応答。1つの態様において、応答は特定の抗原に対して特異的である(「抗原特異的応答」)。「免疫応答のパラメーター」とは、免疫応答の測定しうる任意の特定の様相のことであり、これにはサイトカイン分泌(IL-6、IL-10、IFN-γなど)、免疫グロブリン産生、樹状細胞成熟および免疫系の細胞の増殖が非制限的に含まれる。当業者はこれらのパラメーターの任意のものの増加を既知の検査アッセイを用いて容易に決定することができる。1つの具体的で非制限的な例においては、細胞増殖を評価するために、3H-チミジンの取り込みを評価することができる。免疫応答のパラメーターの「実質的な」増加とは、対照と比較したこのパラメーターの有意な増加のことである。実質的な増加の具体的で非制限的な例は、少なくとも約50%の増加、少なくとも約75%の増加、少なくとも約90%の増加、少なくとも約100%の増加、少なくとも約200%の増加、少なくとも約300%の増加および少なくとも約500%の増加である。当業者は有意な増加を既知の統計学的方法を用いて容易に同定することができる。実質的な増加を評価するために用いられる統計学的検定の具体的で非制限的な一例は、バイオテロ病原体に対するワクチン単独に対して反応する試料の割合を、バイオテロ病原体に対するワクチンを免疫刺激性ODNと併用投与した場合に応答する試料の割合と比較するためにZ検定を用いることである。ワクチン単独によって誘導される応答の強度の差異を、ワクチンを免疫刺激性ODNと併用投与した場合に応答する試料の割合と比較するためには、ノンパラメトリックANOVAを用いることができる。この例では、p≦0.05が有意であり、免疫応答のパラメーターに実質的な増加があることを示す。当業者は有用な他の統計学的アッセイを容易に特定することができる。
疾患を「抑制すること」とは、例えば、疾患に対する素因を有することが判明している人、例えばバイオテロ病原体に曝露されたか曝露されるリスクのある人における、疾患の完全な発症を抑えることを指す。バイオテロ病原体に曝露されたか曝露されるリスクのある人の例には、軍人、郵便物取り扱い者、医療従事者および政府当局者のほか、免疫系が弱っている人、例えば高齢者、免疫抑制薬を投与されている人、癌の患者およびHIVに感染した人が非制限的に含まれる。「治療(treatment)」とは、疾患の徴候もしくは症状、またはその発症が始まった後の病的状態を改善するための治療的介入のことを指す。
「単離された」生体成分(核酸、ペプチドまたはタンパク質)は、その成分が天然に存在する生物体の細胞中の他の生体成分(すなわち他の染色体性および染色体外性のDNAおよびRNAならびにタンパク質)から実質的に分離されている、それらとは別に作製されている、またはそれらを除いて精製されている。このようにして「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。
式
によって表される非メチル化CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド(式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、QはT、GまたはAであり、WはAまたはTであり、N1、N2、N3、N4、N5およびN6は任意のヌクレオチドである)。1つの態様において、QはTである。K型CpG ODNは以前に記載されている(米国特許第6,194,388号;米国特許第6,207,646号;米国特許第6,214,806号;米国特許第6,218,371号;米国特許第6,239,116号、米国特許第6,339,068号;米国特許第6,406,705号および米国特許第6,429,199号を参照。これらは参照として本明細書に組み入れられる)。一般に、K ODNは体液性応答を誘発することができる。例えば、K ODNはIgMの産生を誘発する。
「白血球(white cell)」とも呼ばれる血液中の細胞であり、感染性微生物および異物に対する身体防御にかかわる。白血球は骨髄中で産生される。白血球には主に5つの種類があり、これは大きく2つの群に分かれる:多形核白血球(好中球、好酸球、好塩基球)および単核白血球(単球およびリンパ球)。感染が存在すると白血球の産生が増加する。
この用語にはヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、「対象」という用語にはヒトおよび獣医学的な対象がともに含まれる。
一本鎖または二本鎖の形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体であり、別に限定する場合を除き、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で核酸とハイブリダイズする、天然ヌクレオチドの既知の類似体も含まれる。
多数のヌクレオチド(すなわち、糖(例えば、リボースまたはデオキシリボース)がリン酸基および交換可能な有機塩基(これは置換ピリミジン(Py)(例えば、シトシン(C)、チミン(T)もしくはウラシル(U))または置換プリン(Pu)(例えばアデニン(A)もしくはグアニン(G))と結合したものから構成される分子)のこと。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴリボヌクレオチド(ORN)およびオリゴデオキシリボヌクレオチド(ODN)の両方のことを指す。「オリゴヌクレオチド」には、オリゴヌクレオシド(すなわち、オリゴヌクレオチドからリン酸を除いたもの)および任意の他の有機塩基重合体も含まれる。オリゴヌクレオチドは既存の核酸源(例えば、ゲノムまたはcDNA)から入手可能であるが、合成物(例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生成されるもの)であることが好ましい。
炭疽菌は、防御抗原(PA)、浮腫因子(EF)および致死因子(LF)という3種類のタンパク質から構成される毒素を分泌する。PAは宿主の細胞膜上にある細胞表面受容体と結合する。プロテアーゼによって切断された後に、PAは2つの毒性酵素EFおよびLAと結合してそれらのサイトゾルへの輸送を媒介し、それらがそこで病原性作用を発揮する。
対象に適切に投与された場合に所望の治療的または予防的な効果を誘導しうる化合物または組成物。医薬剤には、抗生物質、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物および高度免疫グロブリンなどの抗感染症薬が非制限的に含まれる。
本開示において有用な薬学的に許容される担体は通常のものである。E. W. Martinによる「レミントン薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition(1975)は、本明細書に開示した融合タンパク質の薬学的送達のために適した組成物および製剤を記載している。
Watson-Crick塩基対を形成しうる核酸配列のこと。DNAのデオキシリボ核酸単位の特徴をなす4種類の塩基はプリン(アデニンおよびグアニン)ならびにピリミジン(シトシンおよびチミン)である。アデニンは2つの水素結合によってチミンと対合し、グアニンは3つの水素結合によってシトシンと対合する。核酸配列が、同じ核酸配列中の2つまたはそれ以上の他の塩基と水素結合を形成しうる2つまたはそれ以上の塩基を配列中に含むならば、その核酸は自己相補的配列を含む。
疾患の進行を予防する、もしくは消退を引き起こす、またはその疾患によって生じる症状、例えば発熱、呼吸器症状、疼痛もしくは腫脹を緩和するのに十分な用量のこと。
感染症の抑制、予防、改善または治療のために投与される、抗原、DNA、タンパク質サブユニット、ペプチド、弱毒化した微生物(細菌およびウイルスを非制限的に含む)、生きている微生物または死滅させた微生物の調製物。いくつかの態様において、バイオテロ病原体に対するワクチンには、バイオテロ病原体由来の抗原、例えばAVAまたはPAが含まれる。
生きた細胞の内部で繁殖する微小な感染性生物。ウイルスは本質的には、タンパク質外被によって囲まれた単一の核酸であるコアからなり、生きた細胞の内部のみで繁殖する能力がある。「ウイルス複製」とは、ウイルスの少なくとも1回のライフサイクルの発生によって別のウイルスが生成されることである。ウイルスが宿主細胞の正常な機能を妨げて、細胞にウイルスにより決められた様式での挙動を行わせることもある。例えば、ウイルス感染により、サイトカインを産生する細胞またはサイトカインに応答する細胞が、感染していない細胞は通常そうでなくても生じることがある。
A. D型およびK型ODN
本開示は、免疫活性化を誘発する、例えば、B細胞、単球、樹状細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞による先天性免疫応答または適応免疫応答を誘発する、1つのクラスのDNAモチーフに関する。K型CpG ODNは以前に記載されている(米国特許第6,194,388号;米国特許第6,207,646号;米国特許第6,214,806号;米国特許第6,218,371号;米国特許第6,239,116号、米国特許第6,339,068号;米国特許第6,406,705号および米国特許第6,429,199号を参照。これらは参照として本明細書に組み入れられる)。最も大きい免疫刺激活性を示すK ODNは共通した特有の特徴を有する。これらの特徴は式IIのものともD ODNとも異なる(下記参照)。さらに、K ODNは免疫系の細胞に対して、D ODNの影響とは異なる特有の影響を及ぼす。例えば、K ODNはB細胞の増殖を誘発し、IL-6の産生を誘発する。
によって表される配列を含む(式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、WはAまたはTであり、N1、N2、N3、N4、N5およびN6は任意のヌクレオチドである)。
を有するものであり、リン酸骨格修飾を含む。1つの具体的で非制限的な例において、リン酸骨格修飾はホスホロチオエート骨格修飾である(すなわち、国際特許出願WO 95/26204号(参照として本明細書に組み入れられる)に示されているように、非架橋性酸素の1つがイオウにより置換されている)。1つの態様において、K ODNはホスホロチオエート骨格および少なくとも1つの非メチル化CpGジヌクレオチドを有する。K ODNからCpGジヌクレオチドモチーフを排除すると免疫活性化が有意に低下する。多数のCpGを単一のK ODNに組み入れると免疫刺激性が増大する。いくつかの態様において、K ODNは少なくとも12塩基長である。さらに、CpGモチーフを5'末端に含むK ODNは最も刺激性が高いが、CpGの上流に少なくとも1つの塩基が必要である。より詳細には、最も活性の高いK ODNは、CpGジヌクレオチドのすぐ5'側にチミジンを含み、TpTまたはTpAをCpGモチーフの3'側の位置に含む。CpGジヌクレオチドモチーフから2塩基対よりも隔たりのある修飾はK ODN活性にほとんど影響を及ぼさない。
によって記述することができる(式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、RはAまたはG(aプリン)であり、YはCまたはT(ピリミジン)である)。Dオリゴヌクレオチドは非メチル化CpGジヌクレオチドを含む。CpGの逆位、置換またはメチル化により、Dオリゴデオキシヌクレオチドの活性は低下または消失する。
によって表される配列を含む(式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、Puはプリンヌクレオチドであり、Pyはピリミジンヌクレオチドであり、XおよびWは任意のヌクレオチドであり、Mは0から10までの任意の整数であり、Nは4から10までの任意の整数である)。
はホスホジエステル塩基を含む。さらなる非制限的な例において、配列X1X2X3は最大1つもしくは最大2つのホスホチオエート塩基を含む、および/または配列X4X5X6は最大1つもしくは最大2つのホスホチオエート塩基を含む。さらなる非制限的な例において、X4X5X6(W)M(G)Nは少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つまたは少なくとも5つのホスホチオエート塩基を含む。すなわち、Dオリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート/ホスホジエステルのキメラ体でありうる。
が非制限的に含まれる。理論に拘束されることはないが、自己相補的な塩基配列は、免疫刺激機能が高まるようにCpGジヌクレオチドが先端部にあるステムループ構造を形成するのに役立つ。したがって、1つの具体的で非制限的な例において、Pu1 Py2とPu3 Py4が自己相補的であるDオリゴヌクレオチドは、免疫系の細胞からより高レベルのIFN-γ産生を誘導する(下記参照)。自己相補性は必ずしもPu1 Py2およびPu3 Py4には限定されない。したがって、もう1つの態様においては、CpG含有ヘキサマーの両端にある3つの塩基のそれぞれの端にある別の塩基が自己相補的配列を形成する(上記参照)。
このオリゴデオキシヌクレオチドは自己相補的でないファーフランキング領域を有し、高レベルのIFN-γおよびIFN-αを誘導する。
このオリゴデオキシヌクレオチドは免疫細胞からのサイトカインの産生および/または放出を誘導するために有用であるが、自己相補的モチーフは有していない。
によって表される配列を有するように、少なくとも2つのGが分子の5'末端に含まれる。このDオリゴデオキシヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドの5'末端にさらに別のGを含みうる。1つの具体的な例において、式IVに示された配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの5'末端に約1つまたは約2つのGが含まれる。
(式中、Xは任意の塩基であるか、または塩基が全く存在しない)。1つの具体的で非制限的な例において、XはGである。特定の非制限的な例において、このオリゴデオキシヌクレオチドには、
からなる群より選択される配列が含まれる。
本明細書に記載した免疫刺激性ODNは、治療または予防を行おうとする疾患の部位および種類に応じてさまざまなやり方で製剤化することができる。すなわち、薬学的組成物は、局所的(例えば、局所外用または吸入)使用および全身的使用のいずれのためにも提供される。したがって、本開示はその範囲内に、ヒトの医学または獣医学に用いる目的で製剤化された少なくとも1つの免疫刺激性ODNを含む薬学的組成物を含む。免疫刺激性ODNはヒトの対象に対して用いられることが典型的と思われるが、他の霊長動物、イヌ、ネコ、ウマおよびウマといった他の脊椎動物における類似または同一の疾患を治療するためにそれを用いることもできる。
本明細書では、バイオテロ病原体に曝露されたか、または曝露されるリスクのある対象における感染症の治療または予防のための方法を開示する。これらの方法は以下を含む:
1. バイオテロ病原体に曝露されたか、または曝露されるリスクのある対象に対して免疫刺激性ODNの治療的有効量を投与すること、
2. バイオテロ病原体に曝露されたか、または曝露されるリスクのある対象に対して免疫刺激性ODNの治療的有効量を抗感染症薬と組み合わせて投与し、それによって対象における感染症を治療または予防すること、および
3. 免疫刺激性Dオリゴデオキシヌクレオチドまたは免疫刺激性Kオリゴデオキシヌクレオチドの治療的有効量をバイオテロ病原体に対するワクチンと組み合わせて対象に投与すること。
実施例1
材料および方法
試薬
ホスホロチオエートODN(表1)を合成するか、または販売元から入手した。詳細には、CpG 7909およびCpG 10103はいずれも、Coley Pharmaceuticals(Wellesley, MA)から入手したK型ODNである。合成したODNはすべて、Limulusアメーバ様細胞溶解物アッセイ(QCL-1000, BioWhittaker)による評価ではODN 1mg当たりのエンドトキシン量が0.1 EU未満であった。
動物試験はすべてACUCの承認を受けており、AAALAC認定施設で行った。動物のモニタリングは獣医が毎日行った。特殊な病原体非含有BALB/cマウスはJackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から入手し、仕切り環境にある滅菌マイクロアイソレーター(micro-isolator)ケージ内で飼育した。マウスには6〜8週齡の時点でCpG ODN 50μgをi.p.注射し、その後に11〜70 LD50の炭疽菌Vollum 1B胞子によるSQでの抗原曝露を行った。
炭疽菌PAに対するIgG抗体価を固相酵素免疫アッセイ(ELISA)によりモニタリングした。抗PA抗体は炭疽菌毒素の結合を阻止することによって宿主細胞に防御を付与するため、抗PA IgGはワクチンの有効性のマーカーとみなされている(Pittman et al., Vaccine 20: 1412-1420, 2002)。また、抗PA抗体は胞子発芽を抑制し、マクロファージによる胞子の取り込みおよび排除を増大させる(Welkos et al., Microbiology 147: 1677-1685, 2001)。ワクチンとアジュバントとの併用による免疫原性の差異に関して評価するために、抗PA IgM抗体価もELISAにより評価した。
TNAアッセイは、被験血清が炭疽菌致死毒素(PAと炭疽菌致死因子(LF)との混合物)の細胞傷害作用を中和する能力をインビトロアッセイで評価するものである。炭疽菌致死毒素に対する感受性のあるマウス標的細胞株を、致死毒素と対照血清との混合物または致死毒素と被験血清との混合物とともにインキュベートする。細胞傷害性の比率(%)は、比色分析用基質MTTを添加し、残存する生細胞による加水分解によって生じる紫色のホルマザン沈殿物を溶解し、プレート読み取り装置で定量することによって決定する。有効量50(ED50)を、致死毒素の50%中和が得られた被験血清の希釈度の逆数として算出する。中和抗体の濃度は被験血清のED50と標準参照血清のED50との比を用いて算出される。
上記の免疫原性アッセイのために採取した血清試料を使用時まで-80℃で凍結保存した。各処置群の全マウスから試験第11日および別個に試験第16日に採取した同容積の血清をプールした。この血清プールの100μlを6週齡の雄性A/JCrマウス(10匹/群)にIV注射した。24時間後に、血清IgG抗PA抗体価を評価するために、これらのマウスのサブセット(計4匹)の尾静脈から血液を採取した。続いてすべてのマウスに対して、30〜60 LD50のSterne株炭疽菌胞子(PBS 500μl中に希釈)によるi.p.抗原曝露を行った。これらのマウスの生存を3週間にわたって毎日モニタリングし、死亡までの時間を記録した。いずれの群でも第10日以後の死亡は観察されなかった。実験は2回ずつ行った。
抗原曝露実験は最低5〜10匹/群のマウスを用いて行った。生存性の差はStudentのt検定を用いて評価し、血清抗PA Ab価(または結合活性)の差は多重回帰ANOVAを用いて評価した。
CpG ODNの免疫防御活性
CpG ODNに、炭疽菌Vollum 1Bによる抗原曝露を受けた正常BALB/cマウスの生存性を改善する能力があることが示された。感染後に生存したBALB/cマウスの割合、および/またはそれらの死亡までの平均期間(MTD)は、抗原曝露の3〜6日前のCpG ODN投与によって有意に改善した(表II)。投与を早期に開始するほど薬効は大きく、このことは数日かけて成熟した後に数週間持続する免疫カスケードをCpGモチーフが賦活するという仮説に合致する(Elkins et al., J. Immunol. 162: 2291, 1999;Klinman et al., Immunity 11: 123, 1999)。抗原曝露の1日前にCpG ODNを投与したマウスでは死亡までの平均期間(MTD)のわずかな延長が観察されたが、病原体の曝露と同時またはその後に投与しても生存性に対する効果はみられなかった(表II)。
BALB/cマウス(N=10/群)に対して、50〜100μgのCpG D ODNを表示した日に投与し、第0日に70個(Exp 1)または11個(Exp 2)の炭疽菌1B胞子に感染させた。生存率および死亡までの平均期間(MTD、単位は時間)を示している。*非処置マウスとの比較で生存率が有意に改善、p<.05。
ワクチンアジュバントとしてのCpG ODN
炭疽菌に対する曝露を予測しうることは稀であるため、防御ワクチンの免疫原性を高めるためにCpG ODNを用いうる可能性についても示した。種の間でCpG認識には進化的多様性があるため、齧歯動物で活性の高いCpGモチーフは霊長動物では免疫刺激性が乏しく、逆もまた同様である(Bauer et al., Immunology 97: 699, 1999;Hartmann and Krieg, J. Immunology 164: 944, 2000;Verthelyi et al., J Immunol. 166: 2372, 2001)。このため、ヒトでの使用のために開発されているCpG ODNの活性を検討するには霊長動物モデルが最適である。アカゲザルの免疫細胞は、ヒト細胞を刺激するのと同じ2つのクラスのODNに応答する(Streilein et al., Immunol. Today 18: 443, 1997)。「D」型ODNは霊長動物細胞にIFN-αおよびIFNgを分泌させる引き金となり、APCの成熟を促進させるが、一方、「K」型ODNは免疫細胞の増殖ならびにIL-6および/またはIgMの産生を誘導する(Verthelyi et al., J. Immunol. 166: 2372, 2001)。
1. 初回ワクチン接種から第63日までの全試験期間。
2. 第42日までの試験期間、これは2回目のワクチン接種の前までのデータのみを含む。
3. 第21日までの試験期間、これは初期の抗体価応答をより詳細に評価するためである。
* Wilcoxon順位和検定を用いたAVA SQとの比較でp<0.05
** 5つの処置群すべてを比較したKruskal-Wallis検定に基づくp値
マウス血清防御アッセイ
マウスに対して、初回免疫処置から11日後および16日後にNHPから採取したプール血清による受動免疫処置を行った。血清をプールしたワクチン群にはAVAのみ、AVA+CpG10103 SQ、AVA+CpG7909 SQおよびAVA+CpG7909 IMの4つが含まれる。非処置NHPの対照群からの血清および処置前血清のプールからの血清も検討した。2回の実験を行った(マウス10匹/群)。マウスにプール抗血清0.1mLをIV注射して24時間後に、血清を各群のマウス4匹から採取し、抗PA IgG抗体価を決定した。
AVAの防御効果に対するCpG ODNの効果
抗原-アジュバント併用の決定的な指標は、それが防御免疫を誘導する能力である。AVAに対するアカゲザルの免疫応答がCpG ODNの同時投与によって増強されたことを示す結果に基づき、AVAとCpG ODNとの併用の防御効果を示すための試験を試みた。致死的な炭疽菌抗原曝露を伴う試験にアカゲザルを用いることには制限が伴うため、広く認められているモルモットモデルを用いた。通常のモルモットは、50 LD50のAmes株炭疽菌胞子による抗原曝露を行うと直ちに死亡する(表VII)。AVA単独による免疫処置および追加免疫処置は生存期間を改善したが、ほとんどの個体はそれでも感染により死亡した(表III)。これに対して、CpGアジュバントを用いたワクチンによる免疫処置および追加免疫処置を行った個体の75%近くは生存した(p=.05)。CpG ODNとAVAとの同時投与は抗原曝露を行った動物のMTDもわずかに延長させたが、この効果は統計学的有意性には達しなかった。
モルモットに対して、AVA+CpG D ODN 1555、1466およびK3(いずれもこの種で活性があることが判明している)の等モル混合物100〜300μgによる免疫処置を第0日に行い、第4週に追加免疫処置を行った。6週後にモルモットに対して50 LD50のAmes胞子によるIM抗原曝露を行った。生存率および死亡までの平均期間(MTD、単位は日)を示している。
* AVA単独による免疫処置を行った個体と比べて生存率が有意に改善、p=0.05。
CpG投与の用量および時期は、エボラウイルス曝露マウスにおけるCpGを介した防御に対して影響を及ぼす
エボラウイルスに対する防御に関するCpG投与の効果を示すために、マウスに対して25〜150μgのCpG ODNを第0日に投与した後に、300 LD50のマウス適合化エボラウイルス・ザイール株による抗原曝露を行った。図3aに示されているように、100〜150μgのCpG ODNを投与したマウスはウイルスに対して非常に高度の防御を獲得した。
CpG ODNは炭疽菌胞子に曝露されたマウスの生存期間を延長させる
CpG ODNが炭疽菌胞子に曝露されたマウスの生存期間を延長させることを示すために、マウスに対して100μgのCpG ODNを図示した時点で投与し、その後に11 LD50の炭疽菌胞子による抗原曝露を行った。図4に示されているように、CpG投与により、炭疽菌胞子に曝露されたマウスの生存期間が延長した。
マウスにおけるCpG ODNのAVA/rPAとのアジュバント効果
本実施例はマウスにおけるCpG ODNのAVA/rPAとのアジュバント効果を示す。マウスに対して2.5μgのrPAまたは5μgのAVA+50μgのCpG ODNによる免疫処置を行った。2回目の免疫処置から10日後のIgG抗PA応答およびIFNγ応答の強度を以下に示す(N=マウス4匹/群)。
TBEVによる感染症を予防するCpG ODN単独での効果(抗原は用いず)
本実施例は、ダニ媒介脳炎ウイルスによる感染症の予防に関するCpG ODN単独での有効性を示す。マウスに対して図示した日に100μgのCpG ODNを注射した。マウスに対してTBECによる抗原曝露を行い、生存に関してモニタリングした。N=10/群。
抗PA応答の結合活性に対するK ODNの効果
本実施例は抗PA応答の結合活性に対するK ODNの効果を示す。動物個体に対して、Elkins et al., J. Immunol. 162: 2291, 1999に記載された通りにODNを投与した。図5はK ODNが抗PA応答の結合活性を増大させることを示している。
乳酸-グリコール酸共重合体(PLG)微粒子の効果
DNAをカチオン性乳酸-グリコール酸共重合体(PLG)微粒子の表面に形成させることは、抗原提示細胞(APC)に対するDNAの標的指向性を向上させるための手段として開発されている。このポリマーには生体分解性および生体適合性があり、複数の薬剤送達システムに用いられていることから、PLG微粒子はワクチン送達のための興味深いアプローチである(Okada et al、Adv. Drug Deliv. Rev. 28: 43-70, 1997)。さらに、PLG微粒子は封入されたワクチン抗原用の送達システムとしても長年用いられている(Singh and O'Hanagan, Nat. Biotechnol. 17: 1075-1081, 1999)。さらに最近では、PLG微粒子は封入されたDNAワクチンなどのワクチン用の送達システムとしても記載されている(Hedley et al., Nat. Med. 4: 365-368, 1998;Jones et al., Vaccine 15: 814-817, 1997;米国特許第6,309,569号;米国特許第6,565,777号;米国特許第6,548,302号)。
Claims (19)
- 炭疽菌に対するワクチンとの組み合わせにおいて該ワクチンの免疫原性を高めるための薬学的組成物の製造における、免疫刺激性Dオリゴデオキシヌクレオチドの使用であって、該DオリゴデオキシヌクレオチドがSEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 21、またはSEQ ID NO : 22を含む、前記使用。
- ワクチンが抗原ワクチン、DNAワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、ペプチドワクチン、弱毒化ワクチンまたは加熱死滅ワクチンである、請求項1記載の使用。
- ワクチンが炭疽菌からの抗原である、請求項1記載の使用。
- 抗原が組換え防御抗原または防御アンチオゲン(Antiogen)である、請求項3記載の使用。
- ワクチンが弱毒化炭疽ワクチンである、請求項1記載の使用。
- 薬学的組成物が、対象にワクチンを投与する前にオリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのものである、請求項1記載の使用。
- 薬学的組成物が、対象にワクチンを投与する2週前から1日前までにオリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのものである、請求項6記載の使用。
- 薬学的組成物が、対象にワクチンと同時にオリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのものである、請求項1記載の使用。
- 薬学的組成物が、対象にワクチンを投与した後にオリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのものである、請求項1記載の使用。
- 薬学的組成物が、対象にワクチンを投与して2週後から1日後までにオリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのものである、請求項9記載の使用。
- Dオリゴデオキシヌクレオチドが、SEQ ID NO: 17を含む、請求項1の使用。
- Dオリゴデオキシヌクレオチドが、SEQ ID NO: 21を含む、請求項1の使用。
- Dオリゴデオキシヌクレオチドが、SEQ ID NO: 22を含む、請求項1の使用。
- 治療的有効量の免疫刺激性Dオリゴデオキシヌクレオチドと、
治療的有効量の炭疽菌に対するワクチン
とを含む、炭疽菌への免疫応答を誘導するための薬学的組成物であって、
該DオリゴデオキシヌクレオチドがSEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 21、またはSEQ ID NO: 22に記載の核酸配列を含む、前記薬学的組成物。 - Dオリゴデオキシヌクレオチドが、SEQ ID NO: 17を含む、請求項14の薬学的組成物。
- Dオリゴデオキシヌクレオチドが、SEQ ID NO: 21を含む、請求項14の薬学的組成物。
- Dオリゴデオキシヌクレオチドが、SEQ ID NO: 22を含む、請求項14の薬学的組成物。
- ワクチンが防御抗原を含む、請求項14の薬学的組成物。
- ワクチンが弱毒化炭疽ワクチンである、請求項14の薬学的組成物。
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