CN115996751A - 与离子液体佐剂有关的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文描述的技术涉及含有离子液体的佐剂，以及使用或包含这样的佐剂的组合物和方法。

Description

与离子液体佐剂有关的方法和组合物

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年4月28日提交的美国临时申请号63/016,360的权益，将其内容通过引用全部并入本文。

技术领域

本文描述的技术涉及与佐剂有关的组合物和方法，例如，用于免疫接种。

背景技术

佐剂通过用来刺激免疫应答以使抗原的保护性和长期免疫记忆产生，形成有效疫苗的重要的并且通常必不可少的组分。虽然已经探索了几种材料作为佐剂使用，但只有一些(包括铝盐(明矾)、细菌脂质(单磷酰A)和外源基因组(CpG))是通常使用的。这种有限的佐剂开发的关键原因是安全性问题。设计强效和安全的佐剂造成重大的挑战，因为它们必须在强烈的局部免疫刺激和低系统性毒性之间取得微妙的平衡。在未来，新佐剂的开发是解决感染性疾病的关键方面。

发明内容

本文描述了离子液体(例如CoLa)是安全和有效的佐剂这一发现。证明了这个新类别的佐剂在注射时高效地分布抗原，保持抗原完整性，增强在注射部位的免疫浸润，并且引起针对抗原的强效免疫应答。

特别地，离子液体佐剂的使用被证明诱导Th1应答和Th2应答，认为Th1应答被更强烈地诱导。观察到的Th1应答包括树突状细胞、NK细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的增加，伴有CD4+细胞(但不是CD8+细胞)和树突状细胞向免疫部位内的浸润增加。树突状细胞还显示了活化增加的标志物。没有观察到毒性。大体上而言，CoLa和离子液体对可用佐剂的储备提供了值得注意的增加，以解决对于大流行病如COVID-19和未来感染原威胁的保护的未满足的需求。

在任何实施方式的一个方面，本文描述了对受试者进行免疫的方法，所述方法包括向受试者施用i)含有离子液体的佐剂；以及ii)至少一种抗原。在任何实施方式的一个方面，本文描述了对受试者进行免疫的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含i)含有离子液体的佐剂，以及ii)至少一种抗原。在任何实施方式的一个方面，本文描述了刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向人施用含有离子液体的佐剂。在任何实施方式的一个方面，本文描述了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：含有离子液体的佐剂；以及至少一种抗原。在任何实施方式的一个方面，本文描述了疫苗组合物用于对受试者进行免疫和/或刺激受试者的免疫应答的方法中的用途，所述疫苗组合物包含：含有离子液体的佐剂；以及至少一种抗原。

在任何方面的一些实施方式中，免疫应答是或施用导致的免疫应答是Th1和/或Th2应答。在任何方面的一些实施方式中，免疫反应是或施用导致的免疫应答是，与没有佐剂时的水平相比，Th1应答和/或Th2应答增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答是或施用导致的免疫应答是，与没有佐剂时的水平相比Th1应答增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答是或施用导致的免疫应答是，与没有佐剂时的水平相比树突状细胞的活化和/或浸润增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答是或施用导致的免疫应答是，与没有佐剂时的水平相比，CD4+细胞的数量和/或浸润增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答是或施用导致的免疫应答是，与没有佐剂时的水平相比，NK细胞和/或CD8+细胞的数量增加。

在任何方面的一些实施方式中，施用是通过注射、皮下注射或粘膜施用。在任何方面的一些实施方式中，佐剂和抗原的施用比不用佐剂施用相同剂量的抗原引起更大的免疫应答、增加的免疫应答速率和/或更大的保护。在任何方面的一些实施方式中，施用了治疗有效剂量。在任何方面的一些实施方式中，治疗有效剂量的佐剂和抗原比没有佐剂时治疗有效剂量的抗原包含更少的抗原。

在任何方面的一些实施方式中，离子液体包含季铵阳离子。在任何方面的一些实施方式中，离子液体包含胆碱阳离子。

在任何方面的一些实施方式中，离子液体包含有机酸阴离子。在任何方面的一些实施方式中，离子液体包含logP小于1的有机酸阴离子。在任何方面的一些实施方式中，离子液体包含乳酸阴离子。

在任何方面的一些实施方式中，离子液体是胆碱:乳酸(CoLa)。

在任何方面的一些实施方式中，离子液体的浓度为1％-50％w/v。在任何方面的一些实施方式中，离子液体的浓度为1％-30％w/v。在任何方面的一些实施方式中，离子液体的浓度为5％-20％w/v。在任何方面的一些实施方式中，离子液体的浓度为10％w/v。在任何方面的一些实施方式中，离子液体是处于盐水中的乳剂。在任何方面的一些实施方式中，离子液体具有1:1至1:4的阳离子:阴离子摩尔比率。在任何方面的一些实施方式中，离子液体具有1:2的阳离子:阴离子摩尔比率。

在任何方面的一些实施方式中，抗原由选自于由以下疫苗所组成的组中的疫苗所包含：冠状病毒疫苗；SARS-CoV-2疫苗；肺炎球菌疫苗；流感疫苗；乙型肝炎(HBV)疫苗；无细胞百日咳(aP)疫苗；白喉破伤风无细胞百日咳(DTaP)疫苗；甲型肝炎(HAV)疫苗；以及脑膜炎球菌(MV)疫苗。在任何方面的一些实施方式中，抗原是从以下获得或衍生而来的分子或基序(motif)：冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；流感病毒；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)；白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌(meningococcus)。

附图说明

图1A-图1G证明CoLa吸附OVA、分散OVA并抑制OVA的释放，同时保持完整性。图1A.胆碱乳酸(1:2)的¹H NMR谱。图1B.孵育的OVA吸附在佐剂上的百分比(对所有组，n＝3)。图1C.吸附的OVA从两种佐剂的百分比累计释放(对所有组，n＝3)。图1D.关于CoLa和明矾，荧光标记的OVA的猪皮肤分散的荧光图像。比例尺：1000μm。图1E.分散的OVA的定量面积覆盖(以mm²计)(对两组都是n＝6)。*：p<0.05。显著不同。(非配对t检验)图1F.用不同佐剂的OVA的SDS-PAGE分析显示在37-50kDa之间的明显条带，表明稳定的OVA。图1G.关于所有佐剂，圆二色光谱证明保守的α螺旋。图1B、图1C和图1E中的数据表示为平均值±s.e.m。

图2A-图2H证明CoLa改善注射部位处的免疫浸润，引起有效的系统性Th1免疫应答。图2A.在注射部位处浸润CD45+细胞的CD11c+的定量分析(对所有组，n＝4)。图2B.在注射部位处CD11c+细胞上的CD86的中位数荧光强度的定量分析(对所有组，n＝4)。图2C.在注射部位处浸润CD45+细胞的CD4+的定量分析(对所有组，n＝4)。图2D.不同佐剂的抗OVA IgG抗体滴度(对所有组，n＝7)。图2E.脾中CD45+细胞的CD8+CD3+的定量分析(对所有组，n＝8)。图2F.脾中CD45+细胞的NKp46+的定量分析(对所有组，n＝8)。图2G.脾中CD45+细胞的CD11c+的定量分析(对所有组，n＝8)。橙色矩形表示对CoLa和明矾的CD80的中位数荧光强度的进一步分析。图2H.脾中CD45+细胞的CD4+CD3+的定量分析(对所有组，n＝8)。绿色矩形表示对CoLa和明矾的IFN-γ+CD4+细胞的进一步分析。对于图2A-图2C，UnTx表示未处理的小鼠。对于图2A-图2H，显著不同。*：p<0.05，**：p<0.01(单因素ANOVA然后是Tukey HSD)。对于图2G和图2H中的橙色和绿色矩形，显著不同。*：p<0.05(非配对t检验)。图2A-图2H中的数据表示为平均值±s.e.m。

图3.CoLa作为佐剂的开发计划示意图

图4.作为添加到佐剂制剂的蛋白质的函数的百分比蛋白质吸附。

图5.来自荧光图像的分散抗原的深度和宽度的图解被用于识别目标区域(ROI)。使用MATLAB代码以确定该ROI内的分散面积。

图6A-图6B.增加佐剂制剂中CoLa浓度对分散的影响。图6A.扩散宽度(以mm计)。图6B.扩散深度(以mm计)。(对所有组，n＝6)。*：p<0.05，**：p<0.01。显著不同。单因素ANOVA然后是Tukey HSD检验。

图7.在注射部位处CD45+CD11c+细胞浸润的代表性流式细胞术图表。

图8.描绘了佐剂施用后24h在注射部位处来自CD45+细胞的浸润的CD8+细胞的定量分析。

图9A-图9B描绘了CoLa免疫接种的时间表和毒性评估。图9A.免疫接种和器官捕获的时间表。图9B.不同处理组的体重百分比变化。不同的处理组显示对体重变化没有影响(对所有组，n＝8)(双因素ANOVA然后是Tukey)。

具体实施方式

在任何实施方式的一个方面，本文描述了对受试者进行免疫的方法，所述方法包括向受试者施用i)含有离子液体的佐剂，以及ii)至少一种抗原。在任何实施方式的一个方面，本文描述了刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向人施用含有离子液体的佐剂。在任何实施方式的一个方面，本文描述了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：i)含有至少一种离子液体的佐剂；以及ii)至少一种抗原。

术语“免疫”和“免疫接种”在本领域中倾向于可互换使用。然而，对于如本文所述的疫苗组合物的施用以提供对疾病(例如由病原体引起的感染性疾病)的保护，应当理解“免疫接种”是指疫苗组合物的施用，并且术语“免疫”是指赋予、增加或诱导由施用的疫苗组合物赋予的被动保护的过程。

如本文在免疫、免疫应答和免疫接种的背景下所使用的，术语“佐剂”是指当与特定抗原组合使用时产生比单独的抗原更强烈的免疫应答的任何物质。当并入疫苗配方中时，佐剂一般起加快对疫苗抗原的特异性免疫应答、延长对疫苗抗原的特异性免疫应答或增强对疫苗抗原的特异性免疫应答的质量的作用。

本文所述的佐剂可以包含一种或多种离子液体。如本文所使用的术语“离子液体(IL)”是指在室温呈液体状态的有机盐或有机盐的混合物。这类溶剂已经显示在各种领域都是有用的，包括在工业加工、催化、制药和电化学中。离子液体含有至少一种阴离子和至少一种阳离子成分。离子液体可以包含额外的氢键供体(即任何可以提供-OH或-NH基团的分子)，例子包括但不限于醇类、脂肪酸和胺类。至少一种阴离子和至少一种阳离子成分可以以任何摩尔比率存在。示例性的摩尔比率(阳离子:阴离子)包括但不限于1:1，1:2，2:1，1:3，3:1，2:3，3:2，以及这些比率之间的范围。对于离子液体的进一步讨论，参见例如，Hough等，“The third evolution of ionic liquids:active pharmaceuticalingredients”，New Journal of Chemistry，31：1429(2007)；和Xu等，“Ionic Liquids:IonMobilities,Glass Temperatures,and Fragilities”，Journal of Physical ChemistryB，107(25)：6170-6178(2003)；其中的每一项都通过引用全部并入本文。在任何方面的一些实施方式中，离子液体或溶剂在低于100℃以液体存在。在任何方面的一些实施方式中，离子液体或溶剂在室温以液体存在。

特别是，胆碱及其衍生物非常适合作为本文所述的离子液体的IL阳离子。相应地，本文所述的IL的阳离子可以是包括季铵在内的阳离子。季铵是NR₄ ⁺结构的带正电的多原子离子，每个R独立地为烷基基团或芳基基团。

通用术语“季铵”涉及可以被视为通过将NH₄ ⁺离子的所有四个氢原子由有机基团替换而来源于氢氧化铵或铵盐的任何化合物。例如，季铵具有NR₄ ⁺的结构，其中每个R独立地选自于羟基、任选取代的C₁-C₁₀烷基、任选取代的C₂-C₁₀烯基、任选取代的C₂-C₁₀炔基、任选取代的芳基、或者任选取代的杂芳基。

在任何方面的一些实施方式中，阳离子具有等于或大于胆碱的摩尔质量，例如，等于或大于104.1708g/mol的摩尔质量。在任何方面的一些实施方式中，阳离子具有大于胆碱的摩尔质量，例如，大于104.1708g/mol的摩尔质量。

在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括烷基、烷烃、烯烃或芳基。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括烷基、烷烃或烯烃。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括烷烃或烯烃。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括长度不超过10个碳原子(例如，长度不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个碳原子)的碳链。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括长度不超过12个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括长度不超过15个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括长度不超过20个碳原子的碳链。

在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过10个碳原子(例如不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个碳原子)的碳链。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过12个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过15个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过20个碳原子的碳链。

在任何方面中的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过10个碳原子(例如不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个碳原子)的烷基基团。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过12个碳原子的烷基基团。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过15个碳原子的烷基基团。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括不超过20个碳原子的烷基基团。

在任何方面中的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括烷烃、烯烃、芳基、杂芳基、烷基或杂烷基。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括未取代的烷烃、未取代的烯烃、未取代的芳基、未取代的杂芳基、未取代的烷基或未取代的杂烷基。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括未取代的烷烃。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括未取代的烯烃。在任何方面的一些实施方式中，季铵的每个R基团独立地包括一个或多个取代基基团。

在任何方面的一些实施方式中，季铵的至少一个R基团包括羟基基团。在任何方面的一些实施方式中，季铵的一个R基团包括羟基基团。在任何方面的一些实施方式中，季铵的仅一个R基团包括羟基基团。

示例性、非限制性的阳离子可以包括胆碱和指定的阳离子C1-C7中的任一个，其由以下结构所定义。

阳离子的进一步非限制性实例包括以下：

1-(羟甲基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓

1-(2-羟乙基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓

1-乙基-1-(3-羟丙基)吡咯烷-1-鎓

1-(3-羟丙基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓

1-(4-羟丁基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓

1-乙基-1-(4-羟丁基)吡咯烷-1-鎓

1-(4-羟丁基)-1-丙基吡咯烷-1-鎓

1-(5-羟戊基)-1-丙基吡咯烷-1-鎓

1-乙基-1-(5-羟戊基)吡咯烷-1-鎓

1-(5-羟戊基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓

1-(羟甲基)-1-甲基哌啶-1-鎓

1-(2-羟乙基)-1-甲基哌啶-1-鎓

1-乙基-1-(2-羟乙基)哌啶-1-鎓

1-乙基-1-(3-羟丙基)哌啶-1-鎓

1-(3-羟丙基)-1-丙基哌啶-1-鎓

1-(3-羟丙基)-1-甲基哌啶-1-鎓

1-(4-羟丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓

1-乙基-1-(4-羟丁基)哌啶-1-鎓

1-(4-羟丁基)-1-丙基哌啶-1-鎓

1-丁基-1-(5-羟戊基)哌啶-1-鎓

1-(5-羟戊基)-1-丙基哌啶-1-鎓

1-乙基-1-(5-羟戊基)哌啶-1-鎓

1-(5-羟戊基)-1-甲基哌啶-1-鎓

3-乙基-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓

1-甲基-3-丙基-1H-咪唑-3-鎓

3-丁基-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓

1-甲基-3-戊基-1H-咪唑-3-鎓

1,2-二甲基-3-戊基-1H-咪唑-3-鎓

3-丁基-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓

1,2-二甲基-3-丙基-1H-咪唑-3-鎓

3-(羟甲基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(2-羟乙基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(3-羟丙基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(4-羟丁基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(5-羟戊基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(5-羟戊基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(4-羟丁基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(3-羟丙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(2-羟乙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(羟甲基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(2-羟乙基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(3-羟丙基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(4-羟丁基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓

3-(5-羟戊基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓

1-(5-羟戊基)吡啶-1-鎓

1-(4-羟丁基)吡啶-1-鎓

1-(3-羟丙基)吡啶-1-鎓

1-(2-羟乙基)吡啶-1-鎓

1-(羟甲基)吡啶-1-鎓

1-羟基吡啶-1-鎓

(羟甲基)三甲基鏻

三乙基(羟甲基)鏻

三乙基(2-羟乙基)鏻

(2-羟乙基)三丙基鏻

(3-羟丙基)三丙基鏻

三丁基(3-羟丙基)鏻

(3-羟丙基)三戊基膦

(4-羟丁基)三戊基膦

(5-羟戊基)三戊基膦

在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子是胆碱、C1、C6和/或C7。在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子是C1、C6和/或C7。在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子是胆碱。

具有低疏水性或相对短的碳链的阴离子作为佐剂提供了改进的性能。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子是疏水性的。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子是有机酸。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子包括羧酸。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子包括不是脂肪酸的羧酸。

羧酸是具有式I的结构的化合物，其中R可以为任何基团。

一般而言，所述阴离子为R-X^-，其中X为CO₂ ^-、SO₃ ^-、OSO₃ ^2-或OPO₃ ^2-；并且R为任选取代的C₁-C₁₀烷基、任选取代的C₂-C₁₀烯基、或任选取代的C₂-C₁₀炔基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基。

在一些实施方式中，R为任选取代的线性或支链的C₁-C₉烷基。例如，R为用1、2、3、4、5或6个取代基任选取代的C₁-C₉烷基，所述取代基独立地选自于由C_1-C₃烷基、羟基(OH)、卤素、氧代(＝O)、羧基(CO₂)、氰基(CN)和芳基所组成的组。在一些实施方式中，R为用1、2、3、4或5个取代基任选取代的C₁-C₆烷基，所述取代基独立地选自于由C₁-C₃烷基、羟基、羧基和苯基所组成的组。优选地，R为C₁-C₅烷基，其任选地用1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基独立地选自于由甲基、乙基、羟基、羧基和苯基所组成的组。R的示例性烷基包括但不限于甲基、羧甲基、羟甲基、乙基、1-羟乙基、2-苯乙基、丙基、丙-2-基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、3-羧基丙基、2,3-二羧基甲基-2-羟丙基、丁基、戊基、1,2,3,4,5-五羟基戊基、己基、2-乙基己基和壬基。

在一些实施方式中，R为任选取代的线性或支链的C₂-C₈烯基。例如，R为用1、2、3、4、5或6个取代基任选取代的C₂-C₉烯基，所述取代基独立地选自于由C₁-C₃烷基、羟基、卤素、氧代、羧基、氰基和芳基所组成的组。在一些实施方式中，R为用1、2、3、4或5个取代基任选取代的C₂-C₆烯基，所述取代基独立地选自于由C₁-C₃烷基、羟基、羧基和苯基所组成的组。优选地，R为C₁-C₅烯基，其用1、2、3、4或5个取代基任选取代，所述取代基独立地选自于由甲基、乙基、羟基、羧基和苯基所组成的组。R的示例性烯基包括但不限于乙烯基、2-羧基乙烯基、1-甲基丙烯基和2-甲基丙烯基。

在一些实施方式中，R为任选取代的芳基或杂芳基。例如，R为用1、2、3、4、5或6个取代基任选取代的芳基或杂芳基，所述取代基独立地选自于由C₁-C₃烷基、羟基、卤素、氧代、羧基、氰基和芳基所组成的组。在一些实施方式中，R为用1、2、3、4或5个取代基任选取代的芳基，所述取代基独立地选自于由C₁-C₃烷基、羟基、羧基和苯基所组成的组。优选地，R为用1、2或3个取代基取代的苯基，所述取代基独立地选自于由甲基、乙基、羟基、羧基和苯基所组成的组。R的示例性芳基包括但不限于苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、二羟基苯基、三羟基苯基、3,4,5-三羟基苯基和1,1-联苯-4-基。

在一些实施方式中，X为CO₂ ^-，R为甲基、羧甲基、羟甲基、乙基、1-羟乙基、2-苯基乙基、丙基、丙-2-基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、3-羧基丙基、2,3-二羧基甲基-2-羟基丙基、丁基、戊基、1,2,3,4,5-五羟基戊基、己基、2-乙基己基、壬基、乙烯基、2-羧基乙烯基、1-甲基丙烯基、2-甲基丙烯基、3,4,5-三羟基苯基或1,1-联苯-4-基。在一些其它实施方式中，X为OSO₃ ^-，R为甲基、羧甲基、羟甲基、乙基、1-羟乙基、2-苯乙基、丙基、丙-2-基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、3-羧基丙基、2,3-二羧基甲基-2-羟基丙基、丁基、戊基、1,2,3,4,5-五羟基戊基、己基、2-乙基己基、壬基、乙烯基、2-羧基乙烯基、1-甲基丙烯基、2-甲基丙烯基、3,4,5-三羟基苯基或1,1-联苯-4-基。在又一些其它实施方式中，X为OPO₃ ^2-或SO₃ ^-，并且R为2-羟基苯基、3-羟基苯基或4-羟基苯基。

除非另外说明，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指直链(即不分支的)或支链碳链(或碳)，或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括单价、双价和多价基，具有指定的碳原子数(即C₁-C₁₀表示一至十个碳)。烷基是未环化的链。饱和烃基的例子包括但不限于例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，(环己基)甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体的组。“烯基”是不饱和的烷基基团，是具有一个或多个双键键的烷基基团。不饱和烷基基团的例子包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)，以及更高级的同系物和异构体。

除非另外说明，术语“芳基”是指多不饱和、芳香族、烃取代基，其可以是单环或稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接的多环(优选1至3个环)。稠环芳基指的是稠合在一起的多个环，其中稠合环中的至少一个是芳基环。术语“杂芳基”是指含有至少一个杂原子(例如N、O或S)的芳基基团(或环)，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基基团(即多个环稠合在一起，其中稠合环中的至少一个是杂芳香环)。5,6-稠环杂亚芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有5个成员，并且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样，6,6-稠环杂亚芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有6个成员，并且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。并且6,5-稠环杂亚芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有6个成员，并且另一个环具有5个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基基团可以通过碳或杂原子附接到分子的剩余部分。示例性的芳基和杂芳基基团包括但不限于：苯基、4-硝基苯基、1-萘基、2-萘基、联苯、4-联苯、吡咯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、吡唑、3-吡唑基、咪唑、咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、苯并咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、噻唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、吡啶、2-吡啶基、萘啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、二苯甲酮吡啶基(benzophenonepyridyl)、哒嗪基、吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、吲哚基、5-吲哚基、喹啉、喹啉基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基、呋喃、呋喃基(furyl)或呋喃基(furanyl)、噻吩、苯硫基(thiophenyl)或噻吩基、二苯醚、二苯胺等。

术语“任选取代”是指特定的基团或部分是未被取代的或者被一个或多个(通常为1、2、3、4、5或6个)取代基取代的，所述取代基独立地选自于以下在“取代基”的定义中或另外指定的列出的取代基的组。术语“取代基”是指被取代的基团上在被取代的基团的任何原子处“取代”的基团。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、羧基(caboxy)、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳基、杂芳基、环基(cyclyl)、杂环基(heterocyclyl)、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、氨甲酰基、烷基氨甲酰基(alkylcarbanoyl)、芳基氨甲酰基(arylcarbanoyl)、氨基烷基、烷氧羰基、羧基、羟基烷基、烷烃磺酰基、芳烃磺酰基、烷烃磺酰胺基、芳烃磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、酰氧基、氰基或脲基。在一些情况下，两个取代基连同它们所附接的碳可以形成环。

如本文所使用的“脂肪酸”是指其中R包括饱和或不饱和脂肪族链的羧酸，例如，R具有式C_nH_2n+1。在任何方面的一些实施方式中，脂肪酸是单羧酸。脂肪酸可以是天然的或合成的。脂肪酸的脂肪族链可以是饱和的、不饱和的、支链的、直链的和/或环状的。在任何方面的一些实施方式中，脂肪族链不包含芳香族基团。在任何方面的一些实施方式中，脂肪族链包含烷基或烯烃链、由烷基或烯烃链组成或基本上由烷基或烯烃链组成。

示例性的不是脂肪酸的羧酸可以包括但不限于乳酸；乙醇酸；丙二酸；马来酸；戊二酸；柠檬酸；葡萄糖酸；以及己二酸。

在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包含不超过5个碳，或者处于直链或者支链的构型。在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包括羟基基团。在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包括一个或多个羧酸。

在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包含不超过5个碳，或者处于直链或者支链的构型，并且在R基团中包括羟基基团。在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包含1-5个碳，或者处于直链或者支链的构型，并且在R基团中包括羟基基团。

在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包含不超过5个碳，或者处于直链或者支链的构型，并且在R基团中包含一个或多个羧酸基团。在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包含1-5个碳，或者处于直链或者支链的构型，并且在R基团中包含一个或多个羧酸基团。

在一些实施方式中，不是脂肪酸的羧酸在R基团中包含1-5个碳，或者处于直链或者支链的构型，并且在R基团中包括一个羧酸基团。

当在本文中提到链中的碳数时，考虑提到的是链中的全部碳数(包括分支)。在直链的情况下，这与碳链长度相同。在支链的情况下，“链长度”指的是支链中最长的碳链分支。

在一些实施方式中，所述阴离子包含一个羧酸基团。

示例性的包含不超过4个碳的脂肪族链的羧酸可以包括丙酸(脂肪酸)；异丁酸(脂肪酸)；丁酸(脂肪酸)；3,3-二甲基丙烯酸(脂肪酸)；二甲基丙烯酸(脂肪酸)；以及异戊酸(脂肪酸)。

本文中考虑的示例性的可选阴离子包括癸酸和乙基己基硫酸酯。

示例性的芳香族阴离子包括但不限于没食子酸、氢化肉桂酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、联苯-3-羧酸和苯基磷酸。

在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子是疏水性的。疏水性可以通过分析logP来评估。“LogP”是指P(分配系数，Partition Coefficient)的对数。P是物质在脂质(油)和水之间分离程度的度量。P本身是常数。它被定义为在水相中的化合物浓度与在不混溶的溶剂中的化合物浓度的比率，作为中性分子。

分配系数，P＝[有机]/[水]其中[]＝浓度

Log P＝log₁₀(分配系数)＝log₁₀ P

在实践中，LogP值将根据它被测量的条件和分配溶剂的选择而变化。为1的LogP值意味着在有机相中的化合物浓度比在水相中的化合物浓度大10倍。为1的LogP值的增加表示在有机相中的化合物浓度与在水相中的化合物浓度相比增加十倍。

在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于1.0的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.80的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.75的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.50的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.25的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0的LogP。

在任何实施方式的一个方面中，至少一种离子液体包含：1)阴离子，所述阴离子具有小于1.0的LogP并且为非脂肪酸的羧酸；以及2)包含季铵的阳离子。在任何实施方式的一个方面，至少一种离子液体包含：1)阴离子，所述阴离子具有小于1.0的LogP并且为包含不超过4个碳的脂肪族链的羧酸；以及2)包含季铵的阳离子。在任何实施方式的一个方面，至少一种离子液体包含1)阴离子，所述阴离子具有小于1.0的LogP且为芳香族；以及2)包含季铵的阳离子。

阴离子的LogP值是在本领域中已知的和/或可以由本领域技术人员计算。例如，PubChem和SpiderChem提供了各种阴离子的这些值，并且化学品制造商通常将它们作为其产品的目录列表的一部分提供。本文中，示例性阴离子的LogP值在表1中提供。

示例性的非限制性阴离子在下表1中提供。

表1

	LogP
		乙醇酸	-1.11
丙酸	0.33
		异丁酸	0.94
丁酸	0.79
		没食子酸	0.70
乳酸	-0.72
		丙二酸	-0.81
癸酸	4.09
		马来酸	-0.48
戊二酸	-0.29
		柠檬酸	-1.64
3,3-二甲基丙烯酸	1.2
		葡萄糖酸	-3.4
己二酸	0.08
		2-乙基己基硫酸酯	3.10
4-羟基苯磺酸	0.2
		异戊酸	1.16
氢化肉桂酸	1.84
		苯基磷酸	1.05
联苯-3-羧酸	3.5

在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子是烷烃。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子是烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子包含单个羧酸基团。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链骨架包含一个或多个取代基基团，其中每个取代基基团包含至少一个碳原子。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链骨架包含一个或多个取代基基团，其中至少一个取代基基团包括甲基基团。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链骨架包含两个取代基基团，其中每个取代基基团包含至少一个碳原子。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链骨架包含两个取代基基团，其中一个取代基基团包含甲基基团。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链骨架包含两个取代基基团，其中每个取代基基团包含甲基基团。

在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子是未取代的烷烃。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子是未取代的烯烃。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链骨架包含一个或多个取代基基团。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团，其中每个取代基基团包含至少一个碳原子。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团，其中每个取代基基团为烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷烃或烯烃。在任何方面的一些实施方式中，羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团，其中每个取代基基团是未取代的烷基、未取代的芳基、未取代的杂烷基、未取代的杂芳基、未取代的烷烃或未取代的烯烃。

在任何方面的一些实施方式中，离子液体包含乳酸阴离子。

在任何方面的一些实施方式中，离子液体为胆碱:乳酸(CoLa)。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少0.01％w/v。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少0.05％w/v。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少0.1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少0.2％w/v、至少0.3％w/v、至少0.4％w/v、至少0.5％w/v、至少1％w/v或更高。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约0.01％w/v至约1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为0.01％w/v至1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约0.05％w/v至约0.5％w/v。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为0.05％w/v至0.5％w/v。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少25％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为在水中至少25％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为在盐水或生理上相容的缓冲液中至少25％w/w。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约5％w/w至约75％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为5％w/w至75％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为在水、盐水或生理上相容的缓冲液中约5％w/w至约75％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为在水、盐水或生理上相容的缓冲液中5％w/w至75％w/w。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少约0.1％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少0.1％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约10％w/w至约70％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为10％w/w至70％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约30％w/w至约50％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为30％w/w至40％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约30％w/w至约50％w/w。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为30％w/w至40％w/w。

在任何方面的一些实施方式中，IL的％w/w浓度为在水、盐水或生理上相容的缓冲液中的％w/w浓度。

在任何方面的一些实施方式中，IL为以w/w或w/v计100％。

在一些实施方式中，IL是无水盐，例如，没有稀释或溶解在水中的离子液体。在一些实施方式中，IL以水性溶液提供。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少25％w/w，并且具有至少1:3的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为在水中至少25％w/w，并且具有至少1:3的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少25％w/w，并且具有1:3或1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为在水中至少25％w/w，并且具有1:3或1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL是凝胶、或剪切稀化的牛顿凝胶。

在任何方面的一些实施方式中，IL具有约10:1至约1:10的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有10:1至1:10的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约5:1至约1:5的阳离子:阴离子的比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有5:1至1:5的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约2:1至约1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有2:1至1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约2:1至约1:10的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有2:1至1:10的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有使得其有更多量阴离子的阳离子:阴离子比率，例如，小于1:1的比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有使得其有过量阴离子的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约1:1至约1:10的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有1:1至1:10的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约1:1至约1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有1:1至1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约1:1至约1:3的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有1:1至1:3的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约1:1至约1:2的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有1:1至1:2的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有约1:1、1:2、1:3或1:4的阳离子:阴离子比率。在任何方面的一些实施方式中，IL具有1:1、1:2、1:3或1:4的阳离子:阴离子比率。在不希望被理论约束的情况下，具有相对于阳离子更多量的阴离子的组合物显示出更多的疏水性。

在任何方面的一些实施方式中，例如，当一个或多个核酸分子与IL组合提供时，阳离子:阴离子的比率大于1:1，例如，大于1:2，约1:2至约1:4，或1:2至1:4。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少20mM。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少约20mM。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少25mM。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少约25mM。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少50mM。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少约50mM。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少100mM、500mM、1M、2M、3M或更高。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为至少约100mM、500mM、1M、2M、3M或更高。

在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约50mM至约4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为50mM至4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约500mM至约4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为500mM至4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约1M至约4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为1M至4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为约2M至约4M。在任何方面的一些实施方式中，IL的浓度为2M至4M。

在任何方面的一些实施方式中，所述组合物或制剂中的IL浓度为约0.1mM至20mM。在任何方面的一些实施方式中，得到组合物或制剂中的IL浓度为约0.5mM至20mM、0.5mM至18mM、0.5mM至16mM、0.5mM至14mM、0.5mM至12mM、0.5mM至10mM、0.5mM至8mM、1mM至20mM、1mM至18mM、1mM至16mM、1mM至14mM、1mM至12mM、1mM至10mM、1mM至8mM、2mM至20mM、2mM至18mM、2mM至16mM、2mM至14mM、2mM至12mM、2mM至10mM、2mM至8mM、4mM至20mM、4mM至18mM、4mM至16mM、4mM至14mM、4mM至12mM、4mM至10mM、4mM至8mM、6mM至20mM、6mM至18mM、6mM至14mM、6mM至12mM、6mM至10mM、6mM至8mM、8mM至20mM、8mM至18mM、8mM至16mM、8mM至14mM、8mM至12mM、8mM至10mM、10mM至20mM、10mM至18mM、10mM至16mM、10mM至14mM、10mM至12mM、12mM至20mM、12mM至18mM、12mM至16mM、12mM至14mM、14mM至20mM、14mM至18mM、14mM至16mM、16mM至20mM、16mM至18mM，或18mM至20mM。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物或制剂中的IL浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。

如本文所述，“抗原”是被B细胞受体(BCR)、T细胞受体(TCR)和/或抗体特异性结合的分子，从而激活免疫应答。抗原可以是病原体衍生的，或来源于病原体。抗原可以是多肽、蛋白质、核酸或其它分子，或其部分。术语“抗原决定簇”是指被抗原结合分子，尤其是被所述分子的抗原结合位点识别的抗原上的表位。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的疫苗或组合物包含编码抗原的核酸。

在任何方面的一些实施方式中，抗原可以是从病原体获得或衍生于病原体的分子或基序，所述病原体例如冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；流感病毒；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌；白喉杆菌；破伤风梭菌；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌。在任何方面的一些实施方式中，抗原可以是在冠状病毒、SARS-CoV-2病毒、肺炎球菌、流感病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风梭菌、甲型肝炎病毒(HAV)以及脑膜炎球菌中发现的分子。在任何方面的一些实施方式中，抗原可以是与病原体中发现的分子具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多的序列一致性(核苷酸或氨基酸)的分子(或其抗原性部分)，所述病原体例如冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；流感病毒；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌；白喉杆菌；破伤风梭菌；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌。在任何方面的一些实施方式中，抗原可以是编码如下蛋白质(或其抗原性部分)的核酸：所述蛋白质(或其抗原性部分)与病原体中发现的蛋白质具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多的序列一致性，所述病原体例如冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；流感病毒；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌；白喉杆菌；破伤风梭菌；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌。在任何方面的一些实施方式中，与在病原体中发现的蛋白质具有指定的序列一致性的蛋白质保留在病原体中发现的参考蛋白质的野生型活性。

在任何方面的一些实施方式中，抗原可以是病毒棘突蛋白或其抗原性部分，例如冠状病毒或SARS-CoV-2病毒刺突蛋白或其抗原性部分。在任何方面的一些实施方式中，抗原可以是与病毒刺突蛋白具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多序列一致性的蛋白质，所述病毒刺突蛋白例如冠状病毒或SARS-CoV-2病毒刺突蛋白或其抗原性部分。

冠状病毒(coronavirus)的学名是正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)或冠状病毒亚科(Coronavirinae)。冠状病毒属于冠状病毒科、套式病毒目(order Nidovirales)、和核糖病毒域(realm Riboviria)。它们分为感染哺乳动物的甲型冠状病毒(alphacoronaviruses)和乙型冠状病毒(betacoronaviruses)，以及主要感染鸟类的丙型冠状病毒(gammacoronaviruses)和丁型冠状病毒(deltacoronaviruses)。非限制性的甲型冠状病毒的例子包括：人冠状病毒229E(Human coronavirus229E)、人冠状病毒NL63(Humancoronavirus NL63)、长翼蝙蝠冠状病毒1型(Miniopterus bat coronavirus 1)、长翼蝠冠状病毒HKU8(Miniopterus bat coronavirus HKU8)、猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus)、菊头蝙蝠冠状病毒HKU2(Rhinolophus bat coronavirusHKU2)、小黄蝠冠状病毒512(Scotophilus bat coronavirus512)、以及猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，FIPV，也被称为猫传染性肝炎病毒(FelineInfectious Hepatitis Virus))。非限制性的乙型冠状病毒的例子包括：乙型冠状病毒1型(Betacoronavirus 1，例如牛冠状病毒、人冠状病毒OC43)、人冠状病毒HKU1(Humancoronavirus HKU1)、鼠冠状病毒(Murine coronavirus，也被称为小鼠肝炎病毒(Mousehepatitis virus，MHV))、伏蝙蝠冠状病毒HKU5(Pipistrellus bat coronavirus HKU5)、棕果蝠冠状病毒HKU9(Rousettus bat coronavirus HKU9)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(例如SARS-CoV，SARS-CoV-2)、扁颅蝠冠状病毒HKU4(Tylonycteris bat coronavirusHKU4)、中东呼吸综合征(MERS)相关冠状病毒、以及Hedgehog冠状病毒1(Hedgehogcoronavirus 1，EriCoV)。非限制性的丙型冠状病毒的例子包括：白鲸冠状病毒SW1(Belugawhale coronavirus SW1)，以及传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)。非限制性的丁型冠状病毒的例子包括：鹎冠状病毒HKU11(Bulbul coronavirus HKU11)，以及猪冠状病毒HKU15(Porcine coronavirus HKU15)。

在任何方面的一些实施方式中，冠状病毒选自于由以下组成的组：严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)；严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(SARS-CoV-2)；中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)；HCoV-NL63；以及HCoV-HKu1。在任何方面的一些实施方式中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，其导致2019年的冠状病毒疾病(COVID19或简单COVID(simply COVID))。在任何方面的一些实施方式中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV或SARS-CoV-1)，其导致SARS。在任何方面的一些实施方式中，冠状病毒是中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)，其导致MERS。

前述病原体的核酸和蛋白质是在本领域已知的，例如，SARS-CoV-2Jan.2020/NC_045512.2Assembly(wuhCor1)的完整基因组是在万维网上可获得的。

在任何方面的一些实施方式中，至少一种抗原由疫苗包含。在任何方面的一些实施方式中，疫苗是减毒疫苗(attenuated vaccine)。减毒疫苗包含致病微生物的弱化或受损的版本或变体。减毒疫苗可以包括微生物的突变或工程化菌株和/或已经在培养中传代的菌株，从而导致致病性的丧失。

在任何方面的一些实施方式中，所述疫苗可以是亚单位疫苗，包括重组亚单位疫苗。亚单位疫苗不包含整个致病微生物，而只包括从致病微生物获得或衍生自致病微生物的抗原子集。亚单位疫苗可以包含多种不同的抗原。其中抗原通过重组技术生产的亚单位疫苗被称为重组亚单位疫苗。

在任何方面的一些实施方式中，至少一种抗原是由结合疫苗包含。在结合疫苗中，将来自致病微生物的多糖(例如，在微生物表面发现的多糖)与患者的免疫系统已经识别的抗原或患者的免疫系统将容易对其响应的抗原组合(例如与之缀合)施用。这增加了患者对多糖的应答，并提供了对致病微生物的活的版本的增强的保护。在任何方面的一些实施方式中，所述抗原是多糖。

适合用于本文所述方法和组合物的示例性、非限制性的疫苗可以包括冠状病毒疫苗；SARS-CoV-2疫苗；肺炎球菌疫苗；流感疫苗；乙型肝炎(HBV)疫苗；无细胞百日咳(aP)疫苗；白喉破伤风无细胞百日咳(DTaP)疫苗；甲型肝炎(HAV)疫苗；脑膜炎球菌(MV)疫苗；和/或肺炎球菌结合疫苗(PCV)13。

在任何方面的一些实施方式中，施用多种抗原。在任何方面的一些实施方式中，施用多种疫苗。

特别考虑本文所述的组合物或组合可以包含本文所述的任何类型的成分中的一个、两个、三个或更多。例如，组合物可以包含两种以上不同离子液体的混合物、溶液、组合或乳剂，和/或两种以上不同抗原的混合物、溶液、组合或乳剂。

如本文所使用，“与…组合(in combination with)”是指两种以上物质以任何分子或物理排列存在于同一制剂中，例如，在结合体(admixture)中、在溶液中、在混合物中、在悬浮液中、在胶体中、在乳剂中。制剂可以是均相的或非均相的混合物。在任何方面的一些实施方式中，所述抗原可以被超结构包含，例如纳米颗粒、脂质体、载体、细胞、支架或类似的，所述超结构是与IL在溶液、混合物、结合体、悬浮液等中。

本文所述的组合物、配方和组合可以包含如本文所述的至少一种IL，例如，一种IL、两种IL、三种IL或更多。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的组合物、配方或组合可以包含至少oLa(胆碱:乳酸)。

本文所述的组合物和方法可以向有免疫接种、免疫和/或刺激免疫应答需要的受试者施用。

如本文所使用，“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞(CD4或CD8)、调节T细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、NKT细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞(basophil)、嗜酸性粒细胞(eosinophil)或中性粒细胞)对刺激物(例如，对佐剂)的应答。在本文所述方面的一些实施方式中，应答是对具体抗原特异性的(“抗原特异性应答”)，并且是指CD4 T细胞、CD8 T细胞或B细胞通过其抗原特异性受体而来的应答。在本文所述方面的一些实施方式中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。这些细胞的此类应答可以包括，例如，细胞毒性、增殖、细胞因子或趋化因子的产生、运输或吞噬，并且可以取决于经历应答的免疫细胞的性质。免疫应答的刺激是指免疫应答的诱导或增加。

CD4+T细胞可以表现Th1或Th2表型。促炎性CD4+T细胞负责炎性Th1型细胞因子的释放。Th1型的特征细胞因子包括白介素2(IL-2)、γ-干扰素、TNFα和IL-12。在一些实施方式中，Th1型的特征细胞因子包括白介素2(IL-2)、干扰素γ和TNFα。这种促炎性细胞因子的作用是刺激免疫应答，在许多情况下导致自体组织的破坏。与抑制T细胞应答有关的细胞因子是Th2型，并包括IL-10、IL-4和TGF-β。已经发现Th1型和Th2型T细胞可以在对免疫原的应答中使用相同的抗原受体；在前者中产生刺激性应答，并且在后者中产生抑制性应答。

在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是增加或诱导Th1或Th2免疫应答、细胞因子的产生/释放、或表现Th1或Th2表型的T细胞水平。在任何方面的一些实施方式中，该增加是相对于没有佐剂时的水平或数量而言的。

在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是Th1应答。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是由Th1细胞产生细胞因子。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是Th1抗原特异性CD4+细胞水平的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是Th1CD4+细胞水平的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是Th1细胞水平的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是CD4+细胞水平的增加。在任何方面的一些实施方式中，该增加是相对于没有佐剂时的水平或数量而言的。

在任何方面的一些实施方式中，免疫应答是IgG2a/c亚类的增加。

在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是树突状细胞的活化和/或浸润的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是CD4+细胞的数量和/或浸润的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是CD4+细胞数量的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是CD4+细胞浸润的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是Th1 CD4+细胞数量和/或浸润的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是NK和/或CD8+细胞数量的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是NK细胞数量的增加。在任何方面的一些实施方式中，免疫应答可以是CD8+细胞数量的增加。在任何方面的一些实施方式中，所述增加是相对于没有佐剂时的水平或数量而言的。

对抗原的免疫应答可以是在受试者中对存在于目标抗原或疫苗组合物中的分子的体液和/或细胞介导的免疫应答的发展。对于本发明的目的，“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答，并且涉及识别和以一定亲和力结合本发明的免疫组合物中抗原的抗体的诱导和产生，而“细胞介导的免疫应答”是由T细胞和/或其它白血细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”是由抗原表位与主要组织相容性复合体(MHC)的I类或II类分子、CD1或其它非经典MHC类(MHC-like)分子联合呈递引起的。这激活了抗原特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性淋巴细胞(“CTL”)。CTL对与经典或非经典MHC编码的蛋白质联合呈递并在细胞表面表达的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏、或感染这种微生物的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞的作用是针对在其表面上与经典或非经典MHC分子联合展示肽或其它抗原的细胞，帮助刺激非特异性效应细胞的功能，并集中非特异性效应细胞的活动。“细胞介导的免疫应答”也指由活化的T细胞和/或其它白血细胞产生的细胞因子、趋化因子和其它这样的分子的产生，包括来源于CD4+和CD8+T细胞的那些。具体抗原或组合物刺激细胞介导的免疫学应答的能力可以通过多种测定来确定，例如通过淋巴增殖(淋巴细胞活化)测定、CTL细胞毒性细胞测定，通过测定致敏受试者中对抗原特异性的T淋巴细胞，或通过测量响应于用抗原再刺激的T细胞产生的细胞因子。这样的测定在本领域是众所周知的。参见，例如，Erickson等(1993)J.Immunol.151：4189-4199；和Doe等(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法包括施用有效量的本文所述的组合物，例如给受试者，以刺激免疫应答或提供针对抗原所衍生自的相关病原体的保护。提供针对相关病原体的保护是刺激免疫系统，以使以后对抗原(例如，在活的病原体上或在活的病原体中)的暴露引发比如果受试者首次接触抗原时更有效的免疫应答。保护可以包括更快的病原体清除，减少的症状严重性和/或症状时间，和/或不发展疾病或症状。如通过任何标准技术所测量的，与等效的没有处理的对照相比，这种减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。向受试者施用本文所述组合物的各种手段是本领域技术人员已知的。这样的方法可以包括但不限于口服、肠胃外、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、肺、皮肤、注射或局部施用。施用可以是局部的或系统的。在任何方面的一些实施方式中，施用可以是肌内的或皮下的。在任何方面的一些实施方式中，施用可以通过注射、皮下注射或粘膜施用。

如本文所使用的术语“有效量”是指刺激免疫系统、或与抗原组合所需要的佐剂的量，以提供对于之后感染的保护作用，并且与为提供期望作用的足够量药学组合物有关。因此，术语“治疗有效量”是指当向典型受试者施用时足以提供特定免疫刺激作用的佐剂(以及任选抗原)的量。如本文所使用的有效量在各种背景下将还包括足以延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)或预防疾病症状的量。因此，明确指出确切的“有效量”不是普遍可行的。然而，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的“有效量”。

有效量、毒性和治疗功效可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，用于确定LD50(对群体50％的致死剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。剂量可以根据采用的剂型和使用的施用途径而变化。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50比率。表现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量可以从细胞培养测定中初步估计。另外，剂量可以在动物模型中进行制定，以达到包括如在细胞培养中或在适当的动物模型中确定的IC50(即达到对症状或诱导期望应答的半最大抑制的组合物浓度)在内的循环血浆浓度范围。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱进行测量。任何具体剂量的作用可以通过合适的生物测定来监测，例如，用于抗体滴度的测定和其它方法。剂量可由医师确定并调整(必要时)，以适应观察到的处理效果。

在任何方面的一些实施方式中，治疗有效剂量的佐剂和抗原包括比没有佐剂时治疗有效剂量的抗原少的抗原。在任何方面的一些实施方式中，与没有佐剂的情况下施用的相同剂量抗原相比，治疗有效剂量的佐剂和抗原引起更大的免疫应答、增加的免疫应答速率、和/或更大的保护。在任何方面的一些实施方式中，与没有佐剂的情况下施用的相同剂量抗原相比，施用佐剂和抗原引起更大的免疫应答、增加的免疫应答速率、和/或更大的保护。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的技术涉及包含如本文所述的佐剂和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。在任何方面的一些实施方式中，所述药物组合物的活性成分包含如本文所述的佐剂。在任何方面的一些实施方式中，所述药物组合物的活性成分基本上由如本文所述的佐剂组成。在任何方面的一些实施方式中，所述药物组合物的活性成分由如本文所述的佐剂组成。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域众所周知的。可以作为药学上可接受的载体的材料的一些非限制性例子包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状的黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如镁氢氧化物和铝氢氧化物；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C₂-C₁₂醇类，例如乙醇；以及(23)药物制剂中使用的其它无毒兼容物质。润湿剂、着色剂、释放剂、包覆剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可以互换使用。在任何方面的一些实施方式中，载体抑制活性试剂(例如本文所述的佐剂)的降解。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的疫苗或其它组合物可以进一步包含一种或多种不是或不包含离子液体的佐剂。这样的佐剂在本领域是已知的，作为非限制性例子包括钾明矾；硫酸铝钾(Alum)；铝氢氧化物；磷酸铝；无定形羟基磷酸铝硫酸盐(AAHS)；单磷酸脂A(MPLA)；AS04；QS-21；MF59；CpG 1018；羟基磷灰石(calcium phosphatehydroxide)；石蜡油；佐剂65；来自皂树(Quillaja)、大豆或美远志(Polygala senega)的植物皂苷；IL-1；IL-2；IL-12；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；和角鲨烯。

在任何方面的一些实施方式中，包含本文所述的佐剂的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的施用通常绕过患者对污染物的自然防御，肠胃外剂型优选无菌或能够在施用给患者之前被灭菌。肠胃外剂型的例子包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介中的干燥产品、准备注射的悬浮液，以及乳剂。此外，还可以为患者的施用制备控制释放的肠胃外剂型，包括但不限于

型剂型和剂量倾泻。

可以用于提供如其中公开的佐剂的肠胃外剂型的合适媒介是本领域技术人员所熟知的。例子包括但不限于：无菌水；USP注射用水；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液(dextrose Injection)、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；水混溶性媒介，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。改变或修改如本文所公开的佐剂的药学上可接受的盐的溶解度的化合物也可以纳入本公开的肠胃外剂型中，包括常规和控制释放的肠胃外剂型。

常规的剂型一般提供从制剂中的快速或立即药物释放。根据药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型可以导致患者血液和其他组织中药物浓度的大范围波动。这些波动可能影响一些参数，例如剂量频率、起效时间、功效持续时间、治疗性血液水平的维持、毒性、副作用等。有利地，控制释放制剂可以用于控制药物的起效时间、作用持续时间、治疗窗口内的血浆水平和峰值血液水平。特别是，控制释放或延长释放剂型或制剂可以用于确保实现药物的最大效果，同时最小化潜在的有害反应和安全性问题，其可能来自药物剂量不足(即低于最小治疗水平)，也可能来自于超过药物的毒性水平。在任何方面的一些实施方式中，所述佐剂可以以持续释放剂型进行施用。

控制释放药物产品具有以下共同的目标：相比其非控制释放的对应物实现的药物治疗，使药物治疗有所改善。理想情况下，在医学治疗中使用最佳设计的控制释放的制剂的特点是使用最少的药物物质在最少量的时间内治愈或控制病症。控制释放制剂的优点包括：1)延长的药物活性；2)减少的剂量频率；3)增加的患者依从性；4)使用较少的药物总量；5)减少局部或系统副作用；6)最小化药物积累；7)血液水平波动减少；8)提高治疗功效；9)减少药物活性的增强作用或丧失；以及10)提高控制疾病或病症的速度。Kim,Cherng-ju，Controlled Release Dosage Form Design，2(Technomic Publishing,Lancaster，Pa.:2000)。

大多数的控制释放制剂被设计为最初释放迅速产生期望的治疗作用的一定量的药物(活性成分)，并逐渐且持续地释放其它量的药物以在延长的时间段内保持这种水平的治疗或预防作用。为了在体内保持这种恒定的药物水平，药物必须以将代替被代谢和排出体外的药物的量的速率从剂型中释放。活性成分的控制释放可以由各种条件刺激，包括但不限于pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水和其它生理条件或化合物。

各种已知的控制释放或延迟释放剂型、制剂和装置可以适合于本公开的盐和组合物的使用。例子包括但不限于在美国专利号：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；以及6,365,185B1中所描述的那些；其中每一项都通过引用并入本文。这些剂型可以用于提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控制释放，使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统(例如

(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))或其组合，以不同的比例提供期望的释放曲线。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法可以进一步包括向受试者施用第二药剂和/或治疗，例如作为联合疗法的一部分。

在任何方面的一些实施方式中，可将有效剂量的包含本文所述佐剂的组合物向患者一次施用。在任何方面的一些实施方式中，可将有效剂量的包含佐剂的组合物向患者重复施用。对于系统性施用，可以给受试者施用治疗量的包含佐剂的组合物，例如，如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。

如本文所述的组合物的剂量可以由医师确定并调整(必要时)以适应观察到的处理效果。对于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定什么时候治疗提供治疗效益，以及以确定是否增加或减少剂量、增加或减少施用频率、停止治疗、恢复治疗、或对治疗方案做出其它改变。给药时间表可以从每周一次到每天一次变化，取决于一些临床因素，例如受试者对佐剂和/或抗原的敏感性。期望的激活剂量或量可以一次性施用，或分成亚剂量，例如2-4个亚剂量，并在一段时间内施用，例如贯穿一天的适当间隔或其它适当的时间表。在任何方面的一些实施方式中，施用可以是长期的，例如，在数周或数月的时段内施用一个或多个剂量。

根据本文所述方法施用佐剂的剂量范围取决于，例如，佐剂的形式、其效力，以及期望诱导本文所述应答的症状、标志物或指标的程度，例如期望的免疫应答的诱导百分比。剂量不应该过大以至于引起有害的副作用，例如炎性反应。一般来说，剂量将随患者的年龄、病症和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在发生任何并发症的情况下，剂量也可以由个体医师来调节。

佐剂在例如诱导如本文所述的应答(例如免疫应答或免疫)的功效可由熟练的临床医生确定。然而，根据本文所述的方法治疗后，如果本文所述的病症的一个或多个病征或症状以有益的方式改变，其他临床接受的病征或症状得到改善，或诱导了期望的应答(例如至少10％)，则治疗被认为是如本文所用的术语“有效的治疗”。功效可以通过例如测量标志物、指标、症状和/或根据本文所述方法治疗的病症的发生率或任何其它合适的可测量参数来评估。免疫应答可以通过本领域技术人员已知的各种方法检测，包括但不限于抗体产生、细胞毒性测定、增殖测定和细胞因子释放测定。例如，可以从免疫接种的哺乳动物中抽取血液样品，并分析针对在各自疫苗中施用的抗原的抗体的存在，并且这些抗体的滴度可以通过本领域已知的方法确定。

可以通过评估期望的应答的物理指标(例如免疫应答、细胞因子的产生、抗体滴度等)确定药剂的功效。本领域技术人员完全有能力通过测量任何一个此类的参数或任何参数组合来监测施用和/或治疗的功效。功效可以在本文所述病症的动物模型中评估，例如猴子的免疫。当使用实验动物模型时，当观察到标志物的统计学上的显著变化时，证明了处理功效。

在本文中提供了体外和动物模型测定，其允许评估给定剂量的佐剂和/或抗原。作为非限制性的例子，可以通过测量抗体滴度或细胞因子的产生来评估佐剂剂量的效果。

还可以在动物模型中评估给定剂量组合的功效，例如如本文实施例中所述的幼猴或新生猴的免疫。

在任何实施方式的一个方面，本文所述的是包含佐剂和任选至少一种抗原的试剂盒。在任何方面的一些实施方式中，佐剂和抗原不相互接合。佐剂和抗原可以存在于试剂盒的相同制剂中，或在试剂盒的分开的制剂中，例如，用于分开施用或在施用前混合。

试剂盒是包括至少一种试剂(例如佐剂)的任何制造品(例如包装或容器)，该制造品作为执行本文所述方法的单位被推广、分发或销售。本文所述的试剂盒可以任选地包括对执行本文所述方法有用的另外组成。举例来说，所述试剂盒可以包括适合于执行根据本文所述方法的一种或多种施用的液体和组合物(例如缓冲剂、针、注射器等)、描述执行本文所述方法的指导材料等。此外，所述试剂盒可以包括说明手册。

为了方便，以下提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明，或从上下文中隐含，以下术语和短语包括以下提供的含义。提供该定义以帮助描述具体的实施方式，而不是意图限制所要求保护的发明，因为本发明的范围只受权利要求书限制。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。如果在本领域的术语用法与本文所提供的它的定义之间有明显的差异，应以说明书内提供的定义为准。

为了方便，在此收集了本文中在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。

如本文所使用的术语“治疗/处理(treatment)”(包括其变体，例如，“治疗/处理(treat/treated)”)是指以下的任何一个或多个：(i)预防感染或再感染，如传统的疫苗一样；(ii)减少症状的严重性，或消除症状；以及(iii)基本或完全消除讨论中的病原体或紊乱。因此，处理可以预防性地(在感染之前)或治疗性地(在感染之后)发生。在本发明中，预防性处理是优选的模式。根据本发明的具体实施方式，提供了针对微生物感染(例如，细菌或病毒)的处理(包括预防性和/或治疗性免疫)宿主动物的组合物和方法。本发明的方法对于给受试者赋予预防性和/或治疗性的免疫是有用的。本发明的方法也可以在生物医学研究应用的受试者上实施。

在任何方面的一些实施方式中，施用包含激动剂(任选的抗原)的佐剂的免疫原性量或免疫有效量。术语“免疫原性量”和“免疫有效量”，两者在本文中可以互换使用，是指如通过本领域技术人员已知的标准测定所测量的，足以引起免疫应答(或者是细胞(T细胞)应答或者是体液(B细胞或抗体)应答，或者是两者)的抗原或免疫原性组合物的量。

本文所使用的术语“疫苗组合物”被定义为用于引起针对组合物中的抗原的免疫应答以针对疾病保护或治疗有机体的组合物。在任何方面的一些实施方式中，疫苗组合物是减毒微生物或被杀死的微生物(例如病毒、细菌或立克次体)或者衍生自它们的抗原性蛋白的悬浮液，施用以预防、改善或治疗感染性疾病。术语“疫苗组合物”和“疫苗”可以互换使用。

术语“减少(decrease)”、“降低(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”都在本文中用于指统计学上显著量的减少。在任何方面的一些实施方式中，“降低(reduce/reduction)”或“减少(decrease)”或“抑制(inhibit)”通常是指与参考水平(例如，没有给定的治疗或药剂)相比至少10％的减少，并且可以包括，例如，至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多的减少。如本文所使用，“降低(reduction)”或“抑制(inhibition)”不包括与参考水平相比完全的抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比100％的抑制。减少可以优选下降到被接受为对没有给定紊乱的个体而言正常范围内的水平。

术语“增加(inceased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”都在本文中用于指统计学上显著量的增加。在任何方面的一些实施方式中，术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”可以指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加或高至并包括100％的增加或10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或2倍和10倍之间或更大的任何增加。在标志物或症状的背景中，“增加”是此类水平的统计学上显著的增加。

如本文所使用，“受试者”指人或动物。通常，动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括：牛；马；猪；鹿；野牛；水牛；猫科物种，例如家猫；犬科物种，例如狗、狐狸、狼；鸟类物种，例如鸡、鸸鹋、鸵鸟；以及鱼类，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在任何方面的一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可以互换使用。

优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些例子。人以外的哺乳动物可以被有利地用作代表免疫和免疫应答的动物模型的受试者。受试者可以是雄性/男性或雌性/女性。

受试者可以是先前已被诊断为有或被鉴定为患有或具有需要治疗的病症(例如对感染的敏感性)或与此类病症相关的一种或多种并发症的受试者，并且任选地，已经经历了对该病症或与该病症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可以是以前没有被诊断为有该病症或与该病症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是表现出该病症或与该病症相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者，或不表现出风险因素的受试者。

对治疗具体病症“有需要的受试者”可以是具有该病症、被诊断为具有该病症、或处于发展出该病症的风险中的受试者。

如本文所使用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用，以命名通过相邻残基的α-氨基和羧基基团之间的肽键相互连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(例如磷酸化、糖化(glycated)、糖基化(glycosylated)等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能。“蛋白质”和“多肽”通常用于指相对大的多肽，而术语“肽”通常用于指小的多肽，但这些术语在本领域的使用是重叠的。当指的是基因产物和其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白质包括基因产物、自然发生的蛋白质、同源物(homolog)、直系同源物(ortholog)、旁系同源物、片段和其它等价物、变体、片段以及前述的类似物。

如本文所使用，术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合物分子。核酸可以是单链的，或双链的。单链核酸可以是变性的双链DNA的一条核酸链。或者，它可以是不来源于任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，核酸可以是DNA。在另一个方面，核酸可以是RNA。合适的DNA可以包括，例如基因组DNA或cDNA。合适的RNA可以包括例如mRNA。

在任何方面的一些实施方式中，本文所述的多肽、核酸或细胞可以被工程化。如本文所使用，“工程化”是指被人的手操纵过的方面。例如，当多肽的至少一个方面(例如它的序列)被人类的手操纵而不同于其在自然界中存在的方面时，该多肽被认为是“工程化”的。如通常的做法和本领域技术人员所理解的，工程化细胞的后代通常仍被称为“工程化的”，即使实际操纵在先前的实体上进行。

如本文所使用，术语“药物组合物”是指活性剂与药学上可接受的载体(例如制药工业中通常使用的载体)相结合。在本文中使用短语“药学上可接受的”以指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织接触，而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是水以外的载体。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是乳膏、乳液、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是人工或工程化的载体，例如，在自然界中活性成分将不会在其中被发现的载体。

如本文所使用，术语“施用(administering)”是指通过使得药剂至少部分递送到期望部位的方法或途径将如本文公开的化合物放入受试者中。包含本文公开的化合物的药物组合物可以通过任何适当的途径施用，从而在受试者中引起有效治疗。

术语“统计学上显著”或“显著地”是指统计学显著，并且通常指两个标准差(2SD)或更大的差异。

除了在操作性实施例中，或在另外说明的情况下，本文所使用的表达成分的量或反应条件的所有数应该理解为在所有实例中由术语“约”修饰。当与百分比相连使用时，术语“约”可以指±1％。

如本文所使用的术语“包含/含有/包括(comprising)”是指除了存在的所定义的元素之外，还可以存在其它元素。使用“包含/含有/包括”表示包括而非限制。

术语“由……组成(consisting of)”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其不含任何在该实施方式的描述中没有列举的元素。

如本文所使用的术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”是指给定实施方式所需要的那些元素。该术语允许存在不实质影响本发明的该实施方式的基本和新颖的或功能性的特征的另外的要素。

在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组分，作为技术的基本要素，还对包含未指明的要素(无论是否是基本的)是开放的(“包含”)。在任何方面的一些实施方式中，在描述组合物、方法或其各自的组分中要包括的其它元素限制于不会对本技术的基本和新颖的特征产生实质影响的那些元素(例如，组合物、方法或其各自的组分“基本上由”本文所述的元素“组成”)。这同样地应用于所述方法中的步骤以及其中的组合物和组分。在任何方面的其它实施方式中，本文所描述的组合物、方法及其各自的组分意图排除不被认为是该组分、组合物或方法的基本元素的任何元素(例如，该组合物、方法或其各自的组分“由本文所描述的元素组成”)。这同样地应用于所述方法中的步骤以及其中的组合物和组分。

如本文所使用的术语“对应于(corresponding to)”是指在分子中指定或列举的位置的原子或基团，或与第二个分子中指定或列举的原子或基团对等的原子或基团。对等的指定或列举的原子/基团可以由本领域的技术人员确定，例如，通过鉴定共有的核心结构或式。

除非上下文另外明确表明，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数的所指对象。类似地，除非上下文另外明确表明，否则单词“或(or)”意图包括“和/以及(and)”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但合适的方法和材料在下文予以描述。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁文exempli gratia，在本文中用于表示非限制性的例子。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”是同义的。

本文中公开的本发明的可选要素或实施方式的分组不应被理解为限制。每个组的成员都可以单独地或以与该组的其它成员或在本文中找到的其它元素的任何组合的形式被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以包括在组中，或从组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，说明书在本文中被认为是含有经修改的组，从而满足所附权利要求中所使用的所有马库什组的书面描述。

除非在本文中另有定义，否则与本申请有关联的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。应该理解的是，本发明并不局限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述具体的实施方式的目的，并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书定义。免疫学和分子生物学中的常用术语的定义可以在以下中找到：The Merck Manual of Diagnosisand Therapy，第19版，Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia of Molecular Cell Biology andMolecular Medicine，Blackwell Science Ltd.出版，1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference，VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；WernerLuttmann的Immunology，Elsevier出版，2006；Janeway's Immunobiology，KennethMurphy，Allan Mowat，Casey Weaver(编)，Taylor&Francis Limited，2014(ISBN0815345305，9780815345305)；Lewin's Genes XI，Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing,Inc.，New York，USA(2012)(ISBN044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA，Jon Lorsch(编)Elsevier，2013(ISBN0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)，Frederick M.Ausubel(编)，John Wiley and Sons，2014(ISBN 047150338X，9780471503385)，CurrentProtocols in Protein Science(CPPS)，John E.Coligan(编)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；以及Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan，ADA MKruisbeek，David H Margulies，Ethan M Shevach，Warren Strobe(编)，John Wiley andSons,Inc.，2003(ISBN 0471142735，9780471142737)，其内容全部通过引用以其整体并入本文。

其它术语在本发明各方面的描述中在本文中定义。

整个本申请中所引用的所有专利和其它出版物(包括文献参考、已授权的专利、已公布的专利申请和共同待决的专利申请)出于描述和公开的目的通过引用的方式被明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可能与本文所述的技术一起使用的方法学。提供这些出版物仅仅因为它们的公开在本申请的提交日期之前。在这方面的任何内容都不应该被理解为承认本发明人无权凭借先前发明或出于任何其他原因将这样的公开提前。所有关于这些文件的日期的说明或这些文件的内容的陈述都是基于本申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

本公开的实施方式的描述不意图穷举或将本公开限制在所公开的精确形式上。虽然在本文中为了说明性的目的描述了本公开的具体实施方式和实例，在本公开的范围内可以进行各种等效的修改，正如相关领域的技术人员将认识到的。例如，虽然方法步骤或功能是以给定的顺序呈现，可替代的实施方式可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文所提供的本公开的教导可以视情况应用于其它程序或方法。本文所描述的各种实施方式可以组合以提供进一步的实施方式。如果必要，可以修改本公开的方面，以使用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念，来提供本公开的更进一步实施方式。此外，由于生物功能等效性的考虑，可以在蛋白质结构中做一些改变，而不在种类或数量方面影响生物或化学作用。根据详细描述，可以对本公开进行这些和其它的改变。所有这样的修改都意图被包括在所附权利要求的范围内。

任何前述实施方式的特定元素可以与其它实施方式中的元素组合或被替换为其它实施方式中的元素。此外，虽然与本公开的某些实施方式相关的优点已经在这些实施方式的背景下进行了描述，其它实施方式也可以表现出这样的优点，并且不是所有实施方式都需要必要表现出这样的优点以落入本公开的范围。

在一些实施方式中，本技术可以在任何以下编号的段落中被定义：

1.一种使受试者免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用

i)含有离子液体的佐剂；和

ii)至少一种抗原。

2.一种刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向人施用含有离子液体的佐剂。

3.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是Th1应答和/或Th2应答，或者所述施用引起的免疫应答是Th1应答和/或Th2应答。

4.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述施用是通过注射或粘膜施用。

5.前述段落中任一项所述的方法，其中，相比没有佐剂而施用的相同剂量的抗原，所述佐剂和抗原的施用引起更大的免疫应答，增加的免疫应答速率，和/或更大的保护。

6.前述段落中任一项所述的方法，其中，相比没有所述佐剂情况下的所述抗原的治疗有效剂量，所述佐剂和抗原的治疗有效剂量包含更少的抗原。

7.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：

a.含有离子液体的佐剂；以及

b.至少一种抗原。

8.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体是胆碱:乳酸(CoLa)。

9.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述抗原由选自于由以下疫苗所组成的组中的疫苗所包含：

冠状病毒疫苗；SARS-CoV-2疫苗；肺炎球菌疫苗；乙型肝炎(HBV)疫苗；无细胞百日咳(aP)疫苗；白喉破伤风无细胞百日咳(DTaP)疫苗；甲型肝炎(HAV)疫苗；以及脑膜炎球菌(MV)疫苗。

10.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述抗原是从以下获得的分子或基序或者衍生自以下的分子或基序：

冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌；白喉杆菌；破伤风梭菌；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌。

在一些实施方式中，本技术可以在任何以下编号的段落中被定义。

1.一种使受试者免疫的方法，所述方法包括向受试者施用

i)含有离子液体的佐剂；以及

ii)至少一种抗原。

2.一种刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向人施用含有离子液体的佐剂。

3.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是Th1应答和/或Th2应答，或者施用导致的免疫应答是Th1应答和/或Th2应答。

4.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比Th1应答和/或Th2应答增加；或者施用导致的免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比Th1应答和/或Th2应答增加。

5.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比Th1应答增加；或者施用导致的免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比Th1应答增加。

6.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比树突状细胞的活化和/或浸润增加；或者施用导致的免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比树突状细胞的活化和/或浸润增加。

7.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比CD4+细胞的数量和/或浸润增加；或者施用导致的免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比CD4+细胞的数量和/或浸润增加。

8.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比NK细胞和/或CD8+细胞的数量增加；或者施用导致的免疫应答是与没有佐剂的情况下的水平相比NK细胞和/或CD8+细胞的数量增加。

9.前述段落中任一项所述的方法，其中，所述施用是通过注射、皮下注射或粘膜施用。

10.前述段落中任一项所述的方法，其中，与没有所述佐剂的情况下施用的相同剂量的抗原相比，所述佐剂和抗原的施用引起更大的免疫应答，增加的免疫应答的速率，和/或更大的保护。

11.前述段落中任一项所述的方法，其中，与没有佐剂的情况下的治疗有效剂量的抗原相比，所述佐剂和抗原的治疗有效剂量包含较少的抗原。

12.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：

a.含有离子液体的佐剂；以及

b.至少一种抗原。

13.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含季铵阳离子。

14.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含胆碱阳离子。

15.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含有机酸阴离子。

16.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含具有小于1的logP的有机酸阴离子。

17.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含乳酸阴离子。

18.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体是胆碱:乳酸(CoLa)。

19.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为1％-50％w/v。

20.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为1％-30％w/v。

21.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为5％-20％w/v。

22.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为10％w/v。

23.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体是处于盐水中的乳剂。

24.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体具有1:1至1:4的阳离子:阴离子摩尔比率。

25.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体具有1:2的阳离子:阴离子摩尔比率。

26.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述抗原由选自于由以下疫苗所组成的组中的疫苗包含：

冠状病毒疫苗；SARS-CoV-2疫苗；肺炎球菌疫苗；流感疫苗；乙型肝炎(HBV)疫苗；无细胞百日咳(aP)疫苗；白喉破伤风无细胞百日咳(DTaP)疫苗；甲型肝炎(HAV)疫苗；以及脑膜炎球菌(MV)疫苗。

27.前述段落中任一项所述的方法或组合物，其中，所述抗原是从以下获得的分子或基序或者衍生自以下的分子或基序：

冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；流感病毒；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌；白喉杆菌；破伤风梭菌；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌。

本文所述的技术通过以下实施例进一步说明，所述实施例绝不应该被理解为进一步限制。

实施例

实施例1：基于离子液体的安全佐剂

佐剂在新型疫苗的设计和开发中起关键作用。尽管进行了广泛的研究，只有少数疫苗佐剂被批准用于人类使用，所述佐剂主要包含非人体本身的组分，例如铝盐、细菌脂质或外源基因组材料。本文所述的是对基于离子液体的佐剂的探索，所述佐剂使用两种人体的代谢产物胆碱和乳酸(CoLa)制成，在注射时有效地分布抗原，保持抗原完整性，增强注射部位的免疫浸润，并导致针对抗原的强效免疫应答。

当前的COVID-19大流行将疫苗带到了医学、社会和经济挑战的前沿。佐剂形成有效疫苗的重要并且通常是必不可少的组分¹。已经探索了一些材料用作佐剂，但只有几种材料(包括铝盐(明矾)、细菌脂质(单磷酰A)和外源基因组(CpG))是普遍使用的(参见cdc.gov)。这种有限的佐剂转化的关键原因是安全性问题²。虽然目前正在大力集中开发关于COVID-19的新型疫苗(截至2020年4月8日，115种候选物)³，专注于开发新型佐剂的努力却惊人地少³。设计更好的针对COVID-19和未来感染性威胁的疫苗的努力必须包括大力拓展目前的佐剂工具箱。设计强效和安全的佐剂造成重大挑战，因为它们必须在强烈的局部免疫刺激和低系统性毒性之间取得微妙的平衡^4,5。本文试图使用生物相容的离子液体来解决这个挑战。

离子液体和深共熔溶剂代表了一类具有高度可调性和可制造性的合成材料⁶。它们可以由“一般认为安全”(GRAS)的组分合成^7,8，从而提高其安全性谱。IL已经被开发并用于药物递送应用，但是，它们作为佐剂的用途还没有被探索。本文描述的是新型的液体佐剂，胆碱和乳酸(CoLa)。使用卵清蛋白作为模型抗原，证明了CoLa改善了抗原的分散，在注射部位诱导强效的抗原呈递细胞(APC)浸润，并且产生针对抗原的强烈免疫应答(图3)。

胆碱和乳酸是人体中天然并且大量存在的代谢物。此外，它们都具有一般认为安全(GRAS)分子的地位。CoLa(Co:La摩尔为1:2)是使用盐置换合成的，并且通过¹H-NMR光谱进行了验证(图1A)。纯的CoLa是无色粘性液体，其在盐水中稀释后形成乳白色的乳液。当添加CoLa(10％w/v，处于盐水中)后，OVA与CoLa乳液相联合(图1B，图4)，并在24h释放(图1C)。与明矾相比，CoLa表现出更低的吸附和更快的释放(图1B-图1C)。离体(ex vivo)猪皮肤中的OVA-明矾和OVA-CoLa注射显示，佐剂显著影响抗原的扩散。与明矾相比，CoLa诱导显著更多的抗原在皮肤中的扩散(图1D、图1E和图5)。增加CoLa的浓度减少扩散，可能是由于较高的粘度(图6A-图6B)。SDS-PAGE表明，CoLa保持了吸附的OVA的分子完整性，与明矾和盐水相似(图1F)。CD分析证明，CoLa保存了OVA的二级结构(其主要由α螺旋组成)。

CoLa和明矾对局部免疫环境的作用通过向小鼠皮下注射并在24h后测量引流的淋巴细胞来评估。与未处理和明矾处理的小鼠相比，CoLa处理的小鼠显示20％的较高树突状细胞的浸润(图2A，图7)。更重要的是，与对照组相比，这些树突状细胞还显示出CD86(活化的标志物)的显著增加(图2B)。与树突状细胞一起，与对照相比，关于CoLa组观察到了～25％的CD4细胞浸润增加(图2C)，表明进一步的抗原呈递/交叉呈递^9,10，证明了诱导强烈的全身免疫应答的能力。浸润的CD8细胞没有显示这样的效果(图8)。

最后，评价了CoLa诱导免疫应答的能力。使用标准的免疫接种时间表对小鼠进行免疫，每周注射一次，总计三周(图9A)。并行地，通过监测体重评估处理的系统性毒性(图9B)。双因素ANOVA分析表明，处理组最低程度地影响体重变化。对OVA的Th1和Th2应答二者都进行了评估。与明矾相比，CoLa诱导了不显著的Th2应答，如通过抗OVA IgG所评估的(图2D)。相反，在CoLa组中观察到了强烈的Th1应答。与对照相比，CoLa导致了5倍的CD8细胞增加(图2E)。与盐水组相比，这伴随～1.8倍的自然杀伤(NK)细胞增加(图2F)。CoLa组还具有显著更多的活化树突状细胞(CD80)(图2G)。与其它两组相比，CoLa使CD4细胞的数量增加了50％。在进一步鉴定CD4群时，关于CoLa观察到与明矾相比～3倍的IFN-γ+CD4细胞增加(图2H)。所有这些都是强效的Th1型细胞免疫应答的标志物¹¹。Th1应答在与病毒感染斗争中起决定性的作用。

本文展示的结果证明CoLa有诱导强烈的Th1免疫应答的能力。CoLa和一般的离子液体为可用佐剂的储备提供了值得注意的增加，以解决对于大流行病如COVID-19和未来感染原威胁的保护的未满足的需求。

材料和方法

材料

所有化学品和试剂都获得自Sigma Aldrich，并且除非另外提及，不进一步纯化而使用。FITC-OVA购买自Thermo Fisher。铝胶和OVA-Alexa Fluor 647购买自Invitrogen。

卵清蛋白购买自Invivogen。0.9％盐水溶液从Teknova获得。磷酸钠缓冲液购自Boston BioProducts。Tissue Tek OCT^TM化合物从Sakura Finetek获得。带正电的玻璃载玻片购买自Fisher Scientific。具有1mm的路径长度的矩形石英池(1-Q-1)从Starna Cells获得。Laemmli蛋白质样品缓冲液、4-15％的12孔预制聚丙烯酰胺凝胶、Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液、Mini-PROTEAN^TM Tetra Cell电泳系统、Precision Plus Protein^TM All Blue预染色蛋白标准品和Bio-Safe Coomassie染色剂购买自BioRad Laboratories。猪皮肤从Lampire Biological Laboratories获得。外科手术设备从Braintree Scientific,Inc.获得。

胆碱乳酸(1:2)(CoLa)的合成和鉴定。

在剧烈的搅拌下，将碳酸氢胆碱(80％，处于水中)与乳酸(85％)以1:2的摩尔比率在40℃结合。混合物留下搅拌过夜，然后在10mbar和60℃的旋转蒸发下放置2h，然后在60℃的真空炉中放置72h。得到的产品是浅黄色的粘性液体，其化学特性通过核磁共振光谱确认。¹H NMR(600MHz,d-DMSO)1.13(dt,3H,CH ₃CH(OH)COOH)；1.27(dt,3H,CH ₃CH(OH)COO)；4.10(q,H,CH₃CH(OH)COOH)；4.74(q,H,CH₃CH(OH)COO)；5.55(bs,3H,CH₃CH(OH)COOH；CH₃CH(OH)COO；NCH₂CH₂OH)；3.09(s,9H,NCH ₃)；3.38(h,2H,NCH ₂CH₂OH)；3.80(h,2H,NCH₂CH ₂OH)。

制剂制备

将用于体外实验的0.5mg mL^-1卵清蛋白(Alexa Fluor 647/FITC标记的卵清蛋白)溶解在盐水中。对于CoLa佐剂制剂，除非指定，否则添加10％w/v CoLa。使用酶标仪(Spectramax i3^TM)对吸附的OVA进行定量。

体外药物释放研究

将含有OVA的溶液(0.5mg mL^-1)和完全培养基(DMEM+10％ FBS)混合至总体积为500μL，并在37℃于管旋转器上孵育。在定期的时间点，将悬浮液在12 000xg离心15min，并收集上清液用于分析。沉淀被进一步重新悬浮在400μL新鲜的释放介质中，并孵育直到下一个时间点。在开始孵育后的1、2、4、6、12、24、48和72h取样。在酶标仪(Spectramax i3^TM)上使用OVA作为荧光团(Ex/Em 633/665)对每个释放介质中的累积释放进行定量。

体外分散

将50μL的OVA-盐水(0.5mg mL^-1)、OVA-CoLa(0.5mg mL^-1)或明矾(2％悬浮液)皮下注射入离体的猪皮肤。样品在37℃孵育5h，然后在最佳切割温度的化合物中冷冻，并使用低温恒温器(CM1950 Leica Biosystems)切成15μm的薄片。组织切片被收集在带正电的玻璃载玻片上，并在荧光显微镜上成像(Axio Zoom V16^TM，Zeiss)。用图像处理软件ImageJ^TM分析皮肤样品各处的水平和垂直溶液扩散(宽度和深度)。进一步，使用为图像处理开发的MATLAB^TM代码来确定注射部位的表面面积¹²。

OVA稳定性的评估

进行SDS-PAGE测定以评估来自OVA-CoLa或明矾样品的OVA聚集。将处于10％v/vCoLa或2％明矾中的1mg mL^-1OVA在室温(25℃)孵育1h。用处于盐水中的OVA作为阴性对照。然后，将样品在10mM pH7.4磷酸钠缓冲液(Boston BioProducts)中透析48h。在电泳之前，所有的样品在5000xg离心5min，以丢弃任何未溶解的残留物，并将清澈的上清液调整为相等的蛋白质浓度。然后将样品与Laemmli蛋白质样品缓冲液混合，并使用Mini-PROTEAN^TMTetra Cell电泳系统(BioRad)在Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液中于4-15％的12孔预制聚丙烯酰胺凝胶上分离。根据制造商的方案，用Bio-Safe Coomassie染色剂(BioRad)对蛋白质条带染色用来观察。在远UV区(190-250nm)进行圆二色分光光度法(Jasco J-1500，Easton)以收集光谱。将三种含有OVA(0.5mg mL^-1)的制剂在10,000xg离心10min。通过移液除去上清液，同时不扰动在管底的软OVA沉淀。用1mL PBS清洗沉淀，并再次离心以除去上清液。重复清洗/离心步骤直到在离心过程中不形成OVA沉淀。具有1mm的路径长度的矩形石英池(1-Q-1)装载400μL的样品。作为对照光谱，使用处于PBS中的OVA。每个光谱是三次扫描的平均。

动物

雌性Balb/C小鼠(6-8周大)购买自Charles River Laboratories。所有实验均根据由剑桥、哈佛大学、the Faculty of Arts and Sciences(FAS)的Institutional AnimalCare and Use Committee(IACUC)批准的方案进行。

体内注射部位调节研究

Balb/c小鼠在背部皮下注射50μL盐水、CoLa或明矾(对所有组，n＝4)。注射24h后，收获注射部位的皮肤，切成0.5-2mm²的块并用处于总体积5mL的PBS中的胶原酶D(2mg mL^-1)、DNAse I(0.2mg mL^-1)、RPMI-1640，在37℃于管旋转器上孵育45min。未消化的组织通过70μm网格过滤除去。悬浮液在400xg离心10min。通过移液除去上清液，并且向沉淀添加2mLACK裂解缓冲液(Thermo Fisher)。5min后，再次离心悬浮液，并用2mL FCS封闭缓冲液重新悬浮。

体内免疫接种研究。

Balb/c小鼠在背部皮下注射50μL的OVA-盐水、OVA-CoLa或明矾(对所有组，n＝8)。在第0天、第7天和第14天给予总计三次的注射。在第19天，小鼠被安乐死，收集血液和脾用于进一步分析。

抗体滴度测量

血液在4℃在5000rpm离心10分钟以将血清从细胞分离。抗OVA IgG滴度如之前描述的进行测量¹³。

免疫细胞剖析。

抗体鸡尾酒由以下制成：CD45(Biolegend，Cat no：103116，Clone：30-F11)、CD3(Biolegend，Cat no：100218，Clone：17A2)、CD4(Biolegend，Cat no：100421，Clone：GK1.5)、CD8a(Biolegend，Cat no：100711，Clone：53-6.7)、NKp46(Biolegend，Cat no：137606，Clone：29A1.4)、CD11c(Biolegend，Cat no：117307，Clone：N418)、IFN-γ(Biolegend，Cat no：505849，Clone：XMG1.2)、CD86(Biolegend，Cat no：105011，Clone：GL-1)，以及Am Cyan活/死细胞染色试剂盒(Thermo Fischer Scientific，MA，USA)。所有的抗体在其使用前都被稀释了至少200倍。

统计学分析。使用双尾t检验、使用Tukey多重比较检验的单因素或双因素方差分析进行统计学显著性分析。p值代表不同的显著性水平；p＜0.05*；p＜0.01**；p＜0.001***。流式细胞仪图表使用FCS Express 7.0^TM进行分析。所有数据分析都是用Graphpad Prism v8.0^TM进行。

参考文献

1.Di Pasquale，A.，Preiss，S.，Tavares Da Silva，F.&Garcon，N.VaccineAdjuvants：from 1920to 2015and Beyond.Vaccines(Basel)3，320-343(2015).

2.Kwok，R.Vaccines：The real issues in vaccine safety.Nature 473，436-438(2011).

3.Thanh Le，T.et al.The cOVID-19 vaccine development landscape.Nat RevDrug Discov(2020).

4.Bowen，W.S.，Svrivastava，A.K.，Batra，L.，Barsoumian，H.&Shirwan，H.Current challenges for cancer vaccine adjuvant development.Expert RevVaccines 17，207-215(2018).

5.Petrovsky，N.Comparative Safety of Vaccine Adjuvants：A Summary ofCurrent Evidence and Future Needs.Drug Saf 38，1059-1074(2015).

6.Agatemor，C.，Ibsen，K.N.，Tanner，EEL.&Mitragotri，S.Ionic liquids foraddressing unmet needs in healthcare.Bioeng TranslMed 3，7-25(2018).

7.Tanner，E.E.L.et al.Design Principles of Ionic Liquids forTransdermal Drug Delivery.Adv Mater31，e1901103(2019).

8.Zakrewsky，M.et al.Ionic liquids as a class of materials fortransdermal delivery and pathogen neutralization.Proc Natl Acad Sci U SA 111，13313-13318(2014).

9.Gareia Nores，G.D.et al.CD4(+)T cells are activated in regionallymph nodes and migrate to skin to initiate lymphedema.Nat Commun 9，1970(2018).

10.Zhao，Z.，Ukidve，A.，Dasgupta，A.&Mitragotri，S.Transdemalimmunomodulation：Principles，advances and perspectives.Adv Drug Deliv Rev 127，3-19(2018).

11.Spellberg，B.&Edwards，J.E.，Jr.Type l/Type 2immunity in infectiousdiseases.Clin Infect Dis 32，76-102(2001).

12.Cu，K.，Bansal，R.，Mitragotri，S.&Femandez Rivas，D.Delivery Strategiesfor Skin：Comparison of Nanoliter Jets，Needles and Topical Solutions.AnnBiomed Eng(2019).

13.Zhao，Z.M.et al.Rationalization ofa nanoparticle-based nicotinenanovaccine as an effective next-generation nicotine vaccine：A focus onhapten localization.Biomaterials 138，46-56(2017).

Claims (27)

1.一种使受试者免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用

i)含有离子液体的佐剂；以及

ii)至少一种抗原。

2.一种刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向人施用含有离子液体的佐剂。

3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是Th1应答和/或Th2应答；或者施用导致的免疫应答是Th1应答和/或Th2应答。

4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比Th1应答和/或Th2应答增加；或者施用导致的免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比Th1应答和/或Th2应答增加。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比Th1应答增加；或者施用导致的免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比Th1应答增加。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比树突状细胞的活化和/或浸润增加；或者施用导致的免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比树突状细胞的活化和/或浸润增加。

7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比CD4+细胞的数量和/或浸润增加；或者施用导致的免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比CD4+细胞的数量和/或浸润增加。

8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比NK细胞和/或CD8+细胞的数量增加；或者施用导致的免疫应答是与没有所述佐剂的情况下的水平相比NK细胞和/或CD8+细胞的数量增加。

9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述施用是通过注射、皮下注射或粘膜施用。

10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，与没有所述佐剂的情况下施用的相同剂量的抗原相比，所述佐剂和抗原的施用引起更大的免疫应答，增加的免疫应答速率，和/或更大的保护。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，与没有所述佐剂的情况下的治疗有效剂量的抗原相比，所述佐剂和抗原的治疗有效剂量包含更少的抗原。

12.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：

i)含有离子液体的佐剂；以及

ii)至少一种抗原。

13.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含季铵阳离子。

14.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含胆碱阳离子。

15.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含有机酸阴离子。

16.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含具有小于1的logP的有机酸阴离子。

17.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体包含乳酸阴离子。

18.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体是胆碱:乳酸(CoLa)。

19.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为1％-50％w/v。

20.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为1％-30％w/v。

21.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为5％-20％w/v。

22.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体的浓度为10％w/v。

23.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体是处于盐水中的乳剂。

24.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液体具有1:1至1:4的阳离子:阴离子摩尔比率。

25.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述离子液具有1:2的阳离子:阴离子摩尔比率。

26.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述抗原由选自于由以下疫苗所组成的组中的疫苗包含：

冠状病毒疫苗；SARS-CoV-2疫苗；肺炎球菌疫苗；流感疫苗；乙型肝炎(HBV)疫苗；无细胞百日咳(aP)疫苗；白喉破伤风无细胞百日咳(DTaP)疫苗；甲型肝炎(HAV)疫苗；以及脑膜炎球菌(MV)疫苗。

27.前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中，所述抗原是从以下获得的分子或基序或者衍生自以下的分子或基序：

冠状病毒；SARS-CoV-2病毒；肺炎球菌；流感病毒；乙型肝炎病毒(HBV)；百日咳杆菌；白喉杆菌；破伤风梭菌；甲型肝炎病毒(HAV)；以及脑膜炎球菌。

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