CN107261127A - 免疫活性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微粒载体系统，该系统包括一种或多种蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂或其它生物活性物质，其上附着或者未附着导向分子。此外，本发明也提供了免疫调节组合物，和在非感染和感染宿主中引发保护性免疫应答的方法，以及免疫耐受性的诱导。

Description

免疫活性组合物
本申请为分案申请，原申请的申请日为2006年1月30日，申请号为200680010442.8(PCT/US2006/003349)，发明名称为“免疫活性组合物”。
发明背景
本发明提供了免疫活性组合物，其能诱导保护性免疫或者耐受性。在非感染或感染宿主中诱导保护性免疫的该组合物包括抗原表位，但排除了或者消除了参与免疫“逃逸”或诱导耐受性的表位。保护性免疫也可以通过包括病原体相关分子模式(一种或者多种病原体相关分子模式)的组合物，和/或有或者没有抗原表位的载体来诱导。诱导耐受性的另一种免疫活性组合物包括逃逸表位(一种或者多种)，或对病原体逃逸很重要的分子模式(一种或者多种)，有或者没有载体。此外，本发明提供了鉴别这样的免疫活性分子的方法。
免疫生物学的进展已经鉴定了免疫调节剂开发的主要免疫学因素，包括对诱导控制病原体的先天性免疫应答和获得性免疫应答的需求。
随着普遍的抗生素抗性的出现，免疫调节剂成为用于产生针对微生物——包括细胞内病原体的长效保护的最有效方法。免疫调节剂的当前问题焦点在于要求开发新颖的载体(vectors)、有效的运载体(carriers)和佐剂系统。
由于病原体也能诱导Th2应答和耐受性，这一认识可用于，自身免疫性疾病、移植和其它医学应用的免疫调节剂的开发。许多病原体通过皮肤和粘膜进入身体。因此这些施用途径特别适合于，针对通过皮肤、呼吸道、胃肠道或性器官进入而感染的免疫调制。传统的疫苗通过肠胃外施用，这远离感染的实际部位，并且它们的粘膜反应是不太明显的。
显然，现在除了Toll样受体(Toll-like receptors(TLRs))，还有在先天性免疫应答中起着重要作用的其它受体和途径。识别细胞内微生物的微生物基序的核苷酸-寡聚化结构域(nucleotide-oligomerization domain(NOD))蛋白质就是这样的一个实例。Mindin，一种胞外基质蛋白质，也是针对几种细菌表面成分的炎症反应的介质。这些研究和其它研究表明，先天性免疫涉及独立于TLR信号传导的其它因素，并且表明NFKB或IL-1的产生不足以控制感染。
在控制感染中涉及的先天性免疫的典型元素是：(1)促炎应答：NFKB介导的，活化许多发炎因子，过度刺激可以导致休克；(2)阳离子宿主防御肽：由细菌病原体相关分子模式(bacterial pathogen associated molecular patterns(PAMPs))所刺激的肽和信号分子的增量产生；(3)吞噬细胞激活：嗜中性粒细胞和巨噬细胞的细胞内杀死效应增加(氧化机制和非氧化机制均增强，细胞因子产生增加)；(4)趋化性：吞噬细胞的内皮粘附增加，细胞迁移至感染位点，血细胞渗出；(5)细胞外杀伤机制：补体活化，增加的铁离子螯合，抗微生物肽的分泌，降解性酶的产生；(6)感染封闭：通过纤维蛋白原活化的凝块形成；(7)创伤修复：成纤维细胞生长和粘附，血管生成；和(8)获得性免疫应答：B-细胞和T-细胞活化，通常通过树突状细胞进行。
对先天性免疫的刺激可以通过使用干扰素，单磷酰基-磷脂A，咪喹莫特(imiquimod)，CpG核苷酸或者阳离子肽实现。然而，先天性免疫具有抵挡感染的有限能力，在此种情况下，获得性免疫应答将获得控制权。
近来，已经认识到：树突状细胞对于连接先天性免疫和获得性免疫是必要的，并且，这一知识使得：免疫学家可以针对差的免疫原性抗原设计免疫调节策略。树突状细胞(Dendritic cells(DC))起源于骨髓谱系和淋巴谱系的前体细胞，但是，是主要的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells(APC))。树突状细胞(DCs)存在于每一种组织中，并且在感染期间，是与入侵病原体接触的关键免疫细胞。它们是先天性免疫应答和获得性免疫应答的桥梁。
内皮细胞和上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和其它细胞，包括未成熟的树突状细胞(DCs)，表达病原体模式识别受体(TLR受体，凝集素结构域受体和其它受体)，这些受体结合保守的病原体相关分子结构(pathogen associated molecular structures)(缩写为PAMPs)，所述结构是由病原体，如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖，来自革兰氏阳性细菌的脂磷壁酸(lipoteichoic acid)，肽葡聚糖，肽葡聚糖相关脂蛋白，细菌DNA，和来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的鞭毛蛋白，以及病毒RNA共享的结构。不同细胞表达允许对病原体产生定制(tailored)反应的不同受体。未成熟的抗原捕获DC，一旦活化，就会分化为成熟的抗原呈递DC，该抗原呈递DC能在MHC II类和I类中背景中呈递抗原，以及上调表面共刺激分子如CD80和CD86的表达。
成熟和活化DC迁移到次级淋巴器官(淋巴结、脾和丕氏斑(Peyer氏斑，Peyer’spatches)中，在这里它们转移到T细胞区域。DC与T细胞的相互作用以及T细胞的刺激依赖于细胞因子、趋化因子和粘附分子，如细胞间细胞粘附分子(intercellular cell adhesionmolecules(I-CAMs))，白细胞功能相关分子(leukocyte function associated molecule1(LFA-1))和树突状细胞特异性ICAM结合非整合素因子(dendritic cell specific ICAMgrabbing nonintegrin(DC-SIGN))。
依赖于局部细胞因子环境和抗原，在不同程度上触发了辅助性T细胞(Th1)和体液抗体介导的Th2或Treg定向的免疫应答。抗原的剂量已经表明指导Th1/Th2分化，高剂量优先刺激Th-1反应，低剂量刺激Th-2反应。已经表明：展示抗原蛋白和DNA疫苗的运载体发明物由不成熟的树突状细胞吸收，并且导致免疫应答。因此，DC代表为免疫系统的调制而开发的一个主要的、但不是唯一的靶标。
粘膜DCs，通过胞饮作用和受体介导的胞吞作用，摄取外源入侵者，特别地提供了一个重要的一线防卫。DC在粘膜免疫中起着重要的作用，因为身体粘膜就像身体内外之间的屏障一样发挥作用。可以在呼吸道和内脏的内层发现DC。朗格汉斯细胞(Langerhans细胞)是在皮肤和粘膜中发现的一个DC群。DCs和M细胞将抗原转运到下面的淋巴滤泡，这是内脏的免疫诱导位点。类似的鼻和支气管相关淋巴组织已经在呼吸道中描述。该系统在胃肠道中很重要，但在呼吸道中，下面的DC网络可能是更重要的。
在口服施用的情况下，免疫调节剂必须未降解地通过胃和上部肠道(the upperintestines)。通过鼻、眼睛或者生殖器途径施用，这样的降解不可能发生。随后，免疫调节剂必须通过肠道上皮而被摄取，因此可以被吸收，随后通过抗原呈递细胞呈递到免疫感受态细胞。免疫感受态细胞位于上皮中、固有层中或者基底膜之下。因此，免疫调节剂成分必须配制有运载体，通过该运载体接受这些免疫调节剂成分。当结合到微粒运载体上时，通常可以接受的是，分子可以通过Peyer氏斑中的M-细胞转运通过屏障层。
生物活性分子的成熟前分解或者释放，已经妨碍了颗粒基疫苗和药物给药技术的发展。这就是，为什么在公开文献中，仍然要求高剂量的抗原/药物，以便获得与注射对等物可相当的反应的最有可能的解释。除了抗原和药物的利用不足而外，其它主要的批判是M细胞在Peyer氏斑(the Peyer’s patches(PP))中运送颗粒的较差能力，和不足的免疫，以及在人体中诱导的其它反应。PP的上皮M细胞已知允许从肠转运某些细菌、病毒和原生动物。几项研究已经表明，依赖于大小的摄取——最大直径为10μm，可以通过M-细胞、DCs和Caco-2细胞发生。
关于颗粒——通过M细胞，以及PPs中、及其附近存在的不同类型树突状细胞(DCs)进行摄取——的近期信息，提供了对所涉及机制的理解。跟随在面包酵母细胞(酿酒酵母)进入到PP的摄取和动力学研究之后，是Beyer(Beyer T.等人；作为抗原投递设备的细菌载体和病毒样颗粒：树突状细胞在抗原呈递中的角色(Bacterial carriers and virus-like-particles as antigen delivery devices:Role of dendritic cells in antigenpresentation)，Curr.Drug Targets-Infect.Disord,2001 1,287-302)，从而认为它为经过粘膜转运的一种惰性模式。就酵母细胞在M细胞中、M细胞之下的细胞间袋和基底膜之下的空间中的分布，发现了与转运到不同类型的吞噬、抗原加工巨噬细胞或树突状细胞相一致的典型的时间依赖性。依赖于DCs所处的位置，发现它们一旦激活，就会：在产生Th1或Th2-指导的细胞因子的PP微环境中，有不同的功能。随后，细胞因子和趋化因子微环境将决定Th细胞分别分化为Th1和Th2亚类型，并且也影响T细胞的存活或凋亡。
而且，B细胞的分化和粘膜血浆细胞的归巢，通过各自的细胞因子(除了TGF-β、IL-4、IL-5和IL-10之外，还有IL-6)和特异性归巢受体a4b7调节。因此，可以得到这样的结论，似乎在粘膜中存在可以利用的机制，通过该机制，免疫系统的粘膜调制可以诱导更加分化的免疫应答，从而相对于其它施用途径获得的反应，可以更好地模仿针对天然感染的反应。
尽管已经得到了很多关于DC、它们的前体和其已经提出的多种DC亚型的知识，但是，完全程度的DC功能复杂性和可塑性，使得很难预测：关于一种特定疫苗对DCs以及随后的Th1、Th2和Treg反应的作用。然而，从体外成熟DC获得的一些结果可能推测为从淋巴器官分离的成熟DC，这是由于它们表现出相似特征(Shortman K.等人；Mouse and humandentritic cell subtypes.Nat.Rev.Immunol.2002Mar 2(3):151-61)。例如，已经在体外研究了支原体脂肽MALP-2调制DC反应的潜力(Weigt H.等人；Synthetic mycoplasma-derived lipopeptide MALP-2induces maturation and function of dendritic cells,lmmunobiology 2003,207(3):223-33)。DC的MALP-2处理诱导CD80、CD86的表达，和生物活性TNF-α和IL-10的释放；以及，通过后者，引起自身淋巴细胞的增殖，和IL-4、IL-5和γ-INF的产生。这些特征与刺激T细胞的能力有关，从而提示了MALP-2对DC在体内的一种可能作用。
合成的运载体，可能使抗原对MHC I类和II类呈递发挥免疫刺激作用。合成的运载体可以发展为通用系统，该系统可以被改制适合于多种潜在应用。这些运载体的特征可以显著地影响免疫应答的结果和效率。合成的运载体，如颗粒，可以减轻疫苗开发和生产中的质量保证和验证的障碍，从而缩短批准和上市时间。
不同感染微生物的几种免疫刺激成分(肽、蛋白质、脂类或多糖)可用于疫苗接种。这些成分可以合成，从微生物纯化，或者通过重组DNA技术产生。然而，当以自由的、可溶的形式进行口服或者肠胃外施用时，它们需要合适的佐剂。
几种基于颗粒的系统已经作为多种抗原和药物的载体进行了测试。壳聚糖、聚-DL-乳酸或者聚丙烯淀粉微粒，之前已经作为药物载体系统进行了描述。美国专利5,603,960和6,521,431描述了这些系统的实例。在一个报道中，发现共价结合有人血清清蛋白(human serum albumin(HAS))的淀粉微粒，作为模式抗原，当被肠胃外使用时，在老鼠中发挥着强佐剂作用，单独微粒是不能产生免疫原性的。
应当指出，尽管摄取最有可能依赖于载体结构，但也依赖于载体的可能的粘附特性。琼脂糖和其它多糖具有固有的粘膜粘附特性，这可促进它们与不同粘膜的相互作用，并且有助于摄取。
发明概述
按照本发明，描述了新颖的组合物，用作一种或多种能诱导保护性免疫或耐受性的免疫活性组合物。在非感染或感染宿主中诱导保护性免疫的该组合物，包括抗原表位，但排除了或者消除了参与免疫“逃逸”或诱导耐受性的表位。保护性免疫也可以通过组合物来诱导，该组合物包括一个或多个病原体相关分子模式，和/或带有或者没有带有表位的载体。诱导耐受性的另一种免疫活性组合物包括一个或多个逃逸表位，或对病原体逃逸很重要的一个或多个的分子模式，其带有或者不带有载体。此外，本发明提供了鉴别这样的免疫活性分子的方法。合适的实例是病原体相关分子模式(pathogen associated molecularpattern(PAMPs))识别分子，其上附着有或者没有附着修饰的支原体抗原。这样的分子组合物似乎在未感染和感染宿主中调制抗支原体免疫应答。一些抗原诱导耐受性或者免疫逃逸。
因此，本发明的一个方面是一种诱导保护性免疫的免疫活性组合物，该组合物包括：
(1)至少一种病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern)；
(2)任选地，至少一种免疫活性抗原或抗原表位；和
(3)至少一种对将组合物投递到生物有效的运载体，从而诱导保护性免疫。
在许多情况下，期望包括至少一种免疫活性抗原或抗原表位。下面进一步描述了合适的实例。典型地，该至少一种免疫活性表位缺乏逃逸表位。这对防止可能会导致病原体进化的选择压力很重要，所述病原体的复制没有被免疫应答阻断。对于病原体选择压力可能是重要的，这样的病原体的一个实例是流感病毒，该病毒突变很快，这样需要为每一个流感季节准备一种新的疫苗，以便提供针对可能导致人类疾病的一种或多种特定菌株流感的免疫。选择压力可能重要的病原体的另一个实例是人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus(HIV))，该病毒突变也很快。
因此，本发明的另一个方面是一种诱导耐受性的免疫活性组合物，该组合物包括：
(1)至少一种病原体相关分子模式；
(2)任选地，至少一种免疫活性抗原或抗原表位；和
(3)至少一种将组合物有效投递到生物的载体，从而诱导耐受性。
典型地，免疫活性抗原表位是肽、蛋白质、重组肽或者多肽、重组蛋白质、脂、碳水化合物、核酸或其它生物活性分子，或它们中任意的组合。典型地，如果免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，那么肽或蛋白质具有免疫调节的转录后调制。典型地，转录后调制涉及碳水化合物和/或脂部分。典型地，转录后调制(posttranslational modulation)含有末端甘露糖化；在这一可选方案中，典型地，免疫调节的末端甘露糖化物质是从免疫保护性组合物被贫化的。这可以通过氧化步骤、通过酶处理、或者通过糖特异性亲和结合，进行减少。可选地，转录后调制涉及脂部分，脂部分通过脱脂去除。
典型地，免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，免疫活性肽或者蛋白质没有免疫调节的转录后修饰。而且，典型地，免疫活性肽或蛋白质没有能够进行N-糖基化和/或硫辛酰基化(lipoylation)的氨基酸序列。在另一个优选的备选方案中，免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，免疫活性蛋白质或肽具有能结合细胞表面糖胺聚糖(glycosaminoglycan(GAGs))的氨基酸序列。典型地，这些氨基酸序列本质上是多碱基的，其通式是XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB或BXBXXXXXBXB，其中B是碱性氨基酸，X是任何其它氨基酸。典型地，GAG结合氨基酸序列用于产生肽或蛋白质的抗体，这些抗体能干预病原体结合到细胞表面。GAG可以选自肝素及其类似物。免疫活性抗原肽或蛋白质，单独地或者与抗体一起，可具有补体激活活性。免疫活性表位可以是众多的肽，这些肽能结合成一个单一的多肽。免疫活性抗原表位可以包括T细胞表位和B细胞表位。
典型地，病原体相关分子模式选自：
(1)TLR 1受体激动剂；
(2)TLR 2受体激动剂；
(3)TLR 3受体激动剂；
(4)TLR 4受体激动剂；
(5)TLR 5受体激动剂；
(6)TLR 6受体激动剂；
(7)TLR 7受体激动剂；
(8)TLR 8受体激动剂；
(9)TLR 9受体激动剂；
(10)NOD-1激动剂；
(11)NOD-2激动剂；
(12)DC-SIGN；
(13)L-SIGN；和
(14)甘露糖受体。
当病原体相关分子模式是NOD-1激动剂或者NOD-2激动剂时，NOD-1激动剂或者NOD-2激动剂可选自细菌肽葡聚糖及细菌肽葡聚糖的衍生物。
本发明的另一个方面是一种鉴别免疫活性肽的方法，该免疫活性肽能干预结合病原体的糖胺聚糖，所述方法包括步骤：
(1)进行肝素吸附；
(2)进行免疫亲和选择；和
(3)任选地，进行一种或多种通过免疫亲和选择分离的蛋白质的蛋白水解消化，以产生免疫活性肽。免疫亲和选择能通过本技术领域熟知的方法进行，例如在G.T.Hermanson等人,“Immobilized Affinity Ligand Techniques”(Academic Press,Inc.,San Diego,1992)中描述的方法；其它方法在本技术领域也是已知的。
本发明的另一个方面仍然是一种鉴别免疫活性肽的方法，该免疫活性肽能干预结合病原体的糖胺聚糖，包括：利用多碱价线性基序，使用生物信息学分析方法，分析序列数据。
本发明的另一个方面仍然是一种鉴别补体活化免疫活性肽的方法，该方法包括如下步骤：
(1)进行补体固定抗体与补体蛋白质的结合；
(2)使用用于蛋白质抗原的免疫亲和选择的抗体；和
(3)任选地，进行分离的蛋白质抗原的蛋白水解消化。
通过这些方法产生的免疫活性肽也是本发明的侧面。另外，保护性抗体可以基于用于解决宿主微生物中疾病的已鉴别的免疫活性肽。
在上面描述的组合物中，分子可以以混合物出现。此外，分子可以化学连接在一起。典型地，载体是微粒。优选地，微粒有窄的粒径分布范围，并且是多孔的。典型地，微粒的直径小于大约10μm；更特别地，微粒的直径小于大约5μm。典型地，微粒是用生物聚合物制成的。在一个可选的方案中，免疫活性抗原表位非共价结合到微粒上。在另一个可选的方案中，免疫活性抗原表位共价结合到微粒上。不止一种免疫活性抗原表位和不止一种模式识别受体激动剂可以与微粒相关。不止一种模式识别受体激动剂可以与微粒相关联结合。
本发明的另一个方面是一种在对象中引发免疫应答的方法，该方法包括的步骤有：施用免疫学活性有效量的组合物，该组合物包括至少一种免疫活性抗原表位，和至少一种与微粒相关联的病原体识别(pathogen recogniztion(PR))受体激动剂，其中微粒比病原体小或者与病原体的大小范围相同。该组合物包括不止一种的病原体识别受体激动剂。
本发明的另一个方面仍然是一种体内投递免疫活性组合物的方法，以便在个体中引发免疫应答，该方法包括的步骤有，施用免疫学活性有效量的组合物，该组合物包括至少一种与微粒相关的病原体识别(PR)受体激动剂，其中微粒比病原体小，或者与病原体的大小范围相同。
本发明的另一个方面仍然是一种体内投递免疫活性组合物的方法，以便在对象中引发免疫应答，该方法包括的步骤有，施用免疫活性有效量的组合物，该组合物包括至少一种免疫活性抗原表位，和至少一种与微粒相关的病原体识别(PR)受体激动剂，其中微粒比病原体小，或者与病原体的大小范围一样。
本发明的另一个方面是一种引发针对至少一种病原体的保护性免疫应答的方法，该方法包括的步骤有，以单剂量或多剂量，施用免疫活性有效量的组合物，该组合物包括一种或多种免疫活性抗原表位，和与微粒相结合的复数个的PR受体激动剂的组合，其中所述微粒比病原体小，或者与病原体的大小范围相同，并且免疫应答包括Th1或Th2反应，或者Th1和Th2反应的组合。
本发明的另一个方面仍然是一种引发针对至少一种病原体的保护性免疫应答的方法，该方法包括的步骤有，以单剂量或多剂量，施用免疫活性有效量的组合物，该组合物包括有一种或多种免疫活抗原表位，排除了参与免疫活性逃逸机制的抗原，以及包括有与微粒相结合的PR受体激动剂的组合，其中所述微粒比病原体小，或者与病原体的大小范围相同。
在根据本发明的施用或者投递方法中，组合物的施用可以通过粘膜途径、肠胃外途径或皮肤途径发生。也可以选择其它施用途径。
在根据本发明的诱导免疫性的方法中，典型地，免疫应答干预致病微生物上的糖胺聚糖结合元件(glycosaminoglycan binding elements)。
可以选择地，根据本发明的组合物可以在诱导免疫耐受性的方法中使用。一种引发针对免疫活性试剂的耐受性的方法包括有如此步骤：施用免疫活性有效量的组合物，该组合物包括一种或多种免疫活性抗原表位，和与微粒相关的PRR激动剂的组合，其中微粒比病原体小，或者与病原体的大小范围相同，免疫应答包括调节性反应的诱发，或免疫功能或免疫逃逸的下调。其中，该组合物可以包括：具有含脂部分的免疫活性抗原表位。免疫活性的含脂部分可以附着到微粒，独立于免疫活性抗原表位。免疫活性的含脂部分可以具有碳水化合物组分；碳水化合物组分可以是N-糖基化的结果。免疫活性抗原表位可以包括含有至少一个氨基酸的基序，该氨基酸选自天冬酰胺、苏氨酸和丝氨酸，其中基序是Asp-X-Ser或Asp-X-Thr基序，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
附图简述
参考说明书、所附权利要求和附图，本发明将更加易于理解，其中：
图1是图表，显示了适合在根据本发明的微粒载体组合物中使用的琼脂糖微粒的粒径分布(实施例1)；
图2是图表，显示了TNF-α通过PBMC(A)的分泌，或者组织因子(B)用如下物质处理后的分泌，肽葡聚糖(PepG)处理(白条)，或者细菌CpG DNA(细菌DNA)处理(黑条)，或者两者同时处理、且使用与它们单独加入时相同的浓度(阴影条)；P和D后面的数字分别表示PepG和细菌DNA(bactDNA)的浓度，单位为μg/ml；从左到右，它们是P3+D15,P3+D5,P3+D1.5,P1+D15,P1+D5,P1+D1.5,P0.3+D15,P0.3+D5和P0.3+D1.5。
图3是图表，显示了通过不同方法制备的颗粒对不同Th1和Th2反应的诱导，使用Con A-剥离或高碘酸钠处理的抗原，以及TLR2、TLR3、TLR4和TLR9激动剂的多种组合(灰条,TNF-αX 100,黑条,IL-10)；
图4是图表，显示了如图3那样的用不同方式制备的颗粒处理的单核细胞的TNF-α/IL-10比率；和
图5是图表，显示了暴露给微粒制剂后，树突状细胞中MHC-II和CD86的诱导。
优选实施方案的描述
本发明描述了免疫活性组合物，将分子靶向某些细胞群并且在动物模型中引发反应的方法，和产生目标组合物的方法。
存在产生更有效的免疫调节试剂和投递运载工具的需求，用于大量的疾病或状况，以及用于保护免受当前疫苗对其不能使用或无效的病原体的破坏。
使用减毒、死伤或遗传修饰病原体的传统疫苗局限于，病原体的分子模式和与免疫系统的病原体识别受体(Pathogen Recognition Receptors(PRR))的相互作用决定的免疫应答。能建立慢性感染的成功病原体具有分子模式，该分子模式可以使病原体避开身体的免疫应答，而其它病原体，如流感病毒，使用导致逃逸的突变(抗原性漂移和抗原性连续变异)时，如抗体的产生，抗体产生导致增加的病毒摄取以维持自身。
通常，病原体-特异性抗体，在感染的控制中，以多种方式发挥着重要作用。然而，在某些情况下，特异性抗体的存在对病原体是有益的。该活性已知为感染的抗体依赖的增强作用(antibody-dependent enhancement(ADE))。感染的ADE是这样一种现象，其中病原体特异性抗体增强病原体的进入；并且，在某些情况下，病原体，如病毒，通过与Fc受体的相互作用，复制到单核细胞/巨噬细胞和粒细胞中。已经针对代表无数的、具有公共和牲畜健康重要性的科和属的病原体，对该现象进行了体外和体内报导。这些病原体，如鸡毒支原体(M.gallisepticum)，具有一些共同的特征，如在巨噬细胞中的优先复制，建立持续性的能力，和抗原性的多样性。
对于某些病原体，感染的ADE已经成为通过接种疫苗进行疾病控制的重大关注点。从而，对于开发对ADE风险很小或者无风险的疫苗，已经有多种途径。与ADE相关的病原体表位的鉴别，或者中和作用，对这一目的是非常重要。此外，清楚的理解病原体通过ADE进入后的细胞内事件，对发展有效干预很重要。然而，ADE的机制仍然需要更好的理解。因此，针对这些病原体的有效疫苗很难开发。所以，我们已经鉴定了：通过干预重要的细胞附着机制而对保护性免疫而言具有重要性的基序，和需要从制剂中排除的基序，以便诱导保护性免疫，而没有逃逸。我们也鉴别了诱导逃逸或者耐受性的基序。
我们已经研究了：通过载体将免疫活性分子靶向某些细胞的可能性，该载体包括多糖，如天然琼脂糖，从而获得先天性和获得性免疫应答的免疫调制，保护免受感染。显然，本发明可以在其它应用中使用，其中其它受体也可以使用其它颗粒来靶向。琼脂糖的优势在于，它是天然多糖，可生物降解的D-半乳糖聚合物，证明与哺乳动物细胞具有相容性。已经发现，肠胃外施用的琼脂糖微颗粒表现出弱巨噬细胞活化能力，和与氢氧化铝可比的佐剂特性(Gronlund H.等人,Carbohydrate-based particles:a new adjuvant forallergen-specific immunotherapy.Immunology 2002 107,523-529)。
从最终使用者的角度而言，重要的是，疫苗生产不要求冷冻存储，仍然可以有很长的保存期。琼脂糖颗粒可以满足这些要求。而且，重要的是，疫苗或者药物投递载体的施用要尽可能的简单。这就是为什么不用针、通过粘膜、尤其是可口服施用的组合物，比肠胃外更有优势。然而，由于消化系统的作用，口服应用已经遇到稳定性问题的困扰。
我们已经确定，偶合到多孔琼脂糖基质上的抗原可以受到保护，不受消化道内部的降解的影响。配体和颗粒之间的连接确保，同一抗原加工细胞吸收佐剂和抗原。而且，琼脂糖微颗粒(<5μm)的大小使它们适合于允许颗粒进入到Peyer氏斑(PPs)中。
未甲基化CpG DNA，聚I：C，或MALP-2作为佐剂的效果提示：病原体相关分子模式(PAMPs)基序，如果与抗原共同固定化，将通过表达适当的PAMP受体的不同APCs，将免疫活性组合物的摄取定向到粘膜表面上。
多种DC亚型和其它免疫感受态细胞有不同的模式识别受体。使用配体的组合，能实现细胞的适当亚型的定向。
因此，我们认为：受体激动剂(PAMP受体)分子，如Toll样受体(TLR)，凝集素受体或NOD受体激动剂，应该与生物活性分子一起共同固定到载体上。我们认为，当免疫系统暴露给设计的“合成微生物”时，可以提高附着特性、免疫活性组合物的靶向和摄取，这可能显著地增强定向摄取，可以实现这样的免疫调节剂和定制免疫应答的效率。定制靶向也可以提高药物动力学，降低这样设计的免疫调节剂的潜在副作用。
Toll样受体(TLRs)和NOD、凝集素受体等，是微生物来源的分子的病原体模式识别受体。它们是先天性和获得性免疫系统的主要传感器。当前已识别了10个TLR(TLR1-10)。每个识别一种或多种特异性配体，且进行信号转导。在通过细菌产物的细胞活化中，有规律地发现涉及最新发现的受体和受体相互作用。这些受体之间的协作开始发挥作用，以改进配体区别和反应的特异性，该证据正在增加。在配体结合之后，也已经发现受体在脂卵筏中成簇。这样的研究也透露出，独立于和依赖于骨髓分化主要反应基因88(MyD88)的途径。
每个TLR是1型跨膜受体，该受体有富含亮氨酸的胞外结构域，和含有称作Toll/IL-1R同源(TIR)结构域的保守区域的胞内部分，该受体一旦激活，就会导致，在信号传导的依赖于MyD88形式中，补充MyD88蛋白质。使用TLRs、NOD-1和NOD-2的富含亮氨酸的结构域，一些微生物病原体也可以被内吞，并且直接在细胞质中发挥它们的活性，通常是这样，例如，在细胞内革兰氏阳性细菌肽葡聚糖感应中。然而，这些多种途径似乎朝着NF-κβ的核转运和炎症基因的活化，和不同细胞因子的产生方向趋同。TLRs 7、8和9的连接导致IFN-α和IL-12p70，从而用交叉呈递/CTL引发了强Th1反应。TLR3的活化导致INF-α和Th1反应，而TLR5通过IL-12p70诱导Th1，TLR4通过IL-12p70和INF-α产生诱导Th11，所有这些都导致交叉呈递/CTL。然而TLRs 1、2和6的连接诱导具有高IL-10水平的弱IL-12p70反应，和一些其它PRR(病原体识别受体)，如DC-SIGN导致ThO/Th2/Treg反应。
TLR-4已经是该受体家族中的被最广泛研究者。已知从革兰氏阴性细菌识别脂多糖，从革兰氏阳性细菌识别脂磷壁酸，尽管TLR-2结合细菌脂蛋白/脂肽、分枝杆菌或者支原体成分。
Lps2突变，在TLR-3和不依赖于TLR-4MyD88的途径中，鉴别出TIR抗性接头蛋白(TIR resistance adaptor protein(TIRAP))的作用。已经发现TIRAP是处于TLR-2和TLR-4下游的另一种细胞内参与者。不依赖于MyD88的途径，也显示出涉入调节DC的LPS介导成熟过程。TLR-1和TLR-6，已知作为与TLR-2受体形成的异质二聚体的另一部分而发挥作用。
TLR-3识别双链病毒RNA。TLR-5被鉴别为是从革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌来源的细菌鞭毛蛋白的受体，通过MyD88发出信号。TLR-7响应单链RNA和小的合成的免疫修饰物，如咪喹莫特、R-848、溴匹立明(bropirimine)和洛索立宾(loxoribine)。TLR-9已知检测未甲基化的细菌DNA。当前正在研究CpG DNA寡核苷酸作为佐剂并且刺激用于疫苗开发的人树突状细胞的能力。
TLR-4、TLR-7和TLR-9在疫苗开发方面是特别重要的。人TLR-8被最新鉴别为单链RNA和雷西莫特(resiquimod(R-848))的受体。最近已经提议，将TLR-7、TLR 8和TLR-9看做TLR受体家族中的亚组，原因在于它们的配体在内体/溶酶体(lysosomal)区室中被识别。
C型(钙依赖型)凝集素受体(CLRs)也被表达，它们结合到通常在病毒、细菌和其它病原体的表面糖蛋白上发现的保守寡糖上。通过DCs表达的CLRs包括甘露糖受体(CD206)、DEC-205(CD205)、Langerin(CD207)和DC特异性细胞间粘附分子3-结合非整合素因子(DC-SIGN；CD209)。这些受体不仅在DCs和其它组织的多种亚型上的表达不同，而且它们也识别不同寡糖，从而区别不同的配体。
DC-SIGN是一种44kDa的II型跨膜蛋白，其结合且内化几种病毒，如HIV、伊包拉病毒(Ebola病毒)、巨细胞病毒(CMV)、登革病毒(Dengue病毒)、肝炎C病毒，以及细菌，如分枝杆菌，虽然也涉及其它受体。其它病原体也可以与DC-SIGN相互作用。它在DC的功能中非常重要，在通过ICAM-3介导天然T细胞相互作用中，和作为滚动受体中，介导DC特异性的依赖于ICAM-2的迁移过程。
已经描述了TLR和其它免疫识别受体之间的协作。其实例是由凝集素-1(dectin-1)和TLR2的协作确定的炎症反应。复合颗粒，如酵母细胞壁，通过多个先天性免疫受体而被识别，包括TLR2-TLR6、凝集素-1(dectin-1)和CD14。TLR2-TLR6杂二聚体激活NF-κB，以及趋化因子和细胞因子如TNF-α的产生。凝集素-1(dectin-1)识别细胞壁中的α-葡聚糖，并且触发吞噬作用，以及通过NADPH-氧化酶激活活性氧产生。此外，凝集素-1(dectin-1)信号传导与TLR2-TLR6信号传导结合起来，以增强特异性细胞因子如IL-12的产生。
由于TLR受体之间的协作，结合其它受体，和胞内分子下游机制之间的相互作用，在微生物病原体化合物如脂磷壁酸、CpG DNA和肽葡聚糖之间观察到协同作用一点都不奇怪，这提示：当在免疫调节剂的开发中组合使用时，TLR活化剂作为佐剂的作用可能被扩大。
适当的PRR(pathogen recognization receptors(病原体识别受体))配体与生物活性分子的共固定化可能允许免疫应答的定向调制，导致强细胞反应(在相对强大的Th1影响下)和/或体液反应(在Th2影响下)。可选地，当用不同的组合物固定化时，可以获得免疫耐受性。
甚至在存在已建立的体液免疫或耐受性的情况下，诱导强的细胞反应是可能的。这样，我们可以预期开发出在非感染和感染宿主中都有效的免疫调节剂。这样的结果将极大地增强疫苗接种的实用性。
我们已经在小鸡模型系统中建立了，当动物在支原体侵犯之前被接种疫苗时，可达到针对鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的感染性菌株的一个显著程度的保护。此外，也可以在感染前的动物中观察到特异性病理症状的逆转，这表明这样的疫苗对于处理受感染畜群是有效的。由于各种微生物菌株的广泛抗生素抗性，以及逐渐增加着的公众和管理制度对于允许在农场动物中使用抗生素预防剂的关注，这个效应是有显著意义的。另外，我们已经发现，相对于使用已经整合了抗原的微粒的文献(Brayden,D.2001EuropeanJournal of Pharmaceutical Sciences 14:183-189)中描述的超过100μg，用该方法诱发保护性反应，每只动物仅仅需要少量的抗原(10μg)。这建议了，免疫调节剂分子尽管穿过了动物的内脏，但仍然没有被降解，并且它被以有效方式释放到靶粘膜免疫细胞中。这是对现有的免疫活性组合物的显著改进。
然而，随着抗原剂量的逐步升高，观察到保护性作用的降低，这表明在免疫亲和纯化抗原中存在有免疫抑制成分。DC-SIGN已经牵扯在病原体的逃逸机制中。DC-SIGN是C型凝集素，对含高甘露糖的脂分子有特异性。支原体膜包括高比例的脂类，不同的支原体已经显示出结合到伴力豆球蛋白A亲和树脂上，这表明在支原体表面上存在甘露糖。我们假定，参与免疫逃逸的分子，包括转录后N-糖基化分子，其包括在含有末端甘露糖部分的纯化蛋白上的转录后脂甘露聚糖修饰，可以介导该作用。随后尝试了通过酶消化或者化学分解去除末端甘露糖。此外，末端甘露糖基化脂蛋白，在甘露糖特异性的固定化凝集素-伴力球蛋白A(ConA)柱上，被吸附出来。
ConA柱保留了大约三分之一的纯化抗原组分，并且用该抗原制备的疫苗表现出最高的保护效果，以及随着抗原浓度的增加，表现出线性的剂量-反应。另一方面，从ConA柱回收的抗原在动物中引起炎症反应的抑制，而在它们的内部器官中发现了非常高水平的病原体。似乎鸡毒支原体(M.gallisepticum)的这些甘露糖化组分正在参与该病原体的逃逸机制，从而导致免疫抑制和针对病原体的耐受性的发展。我们也阐述了，适当的抗原特征有助于将免疫应答变为保护性或者耐受性。这证实了我们的假设，也支持了用固定化支原体膜进行的观察，即：脂甘露聚糖转录后修饰可能在宿主中诱导病原体耐受性。这一理解现在可用于制备免疫调节的微粒，赋予其潜在地诱导耐受性或者抑制已有免疫应答的特性。抗原的脂转录后修饰在发展针对病原体的耐受性中发挥了作用。因此，我们也尝试纯化抗原的脱酰作用，被证明是具有效果的，从而确认了脂类在支原体的病理机理中的角色。
这些实验得到的主要结论是，尽管合并到这些氨基酸基序中的配体可用于诱导耐受性，但如果想获得保护性免疫，天然蛋白质的分析得到的表位疫苗不应该含有氨基酸中富含的表位，其能经受糖基化和/或硫辛酰基化(lipoylation)(Asn,Thr,Ser)。这为根据本发明的组合物和方法提供了多个用途。
在随后的研究中，我们已经使用了来自已经接种疫苗、受到保护的动物的血液和血清，以便鉴别对于保护性负责的抗原表位。这样，我们已经集中精力开发基于表位的疫苗的科学依据，大规模产生支原体，又及：抗原蛋白的纯化对于许多应用是成本太高的。在之前的研究中，我们已经表明，多种支原体能用于结合肝素和肝素类似物(Szathmary,S.等人:Binding of mycoplasmas to solid phase adsorbents.Acta Vet Hung 2005,53(3):299-307)。糖胺聚糖(Glycosaminoglycans(GAGs))在哺乳动物细胞的表面上表达，病原体的表面上存在的糖胺聚糖结合蛋白介导对靶细胞的粘附(Wadstrom T,Ljungh A:Glycosaminoglycan-binding microbial proteins in tissue adhesion and invasion:key events in microbial pathogenicity.J Med Microbiol 1999,48(3):223-233)。已经报导了几种类型的共有序列，其特征在于区域中主要为碱性氨基酸：XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB或BXBXXXXXBXB，其中B是碱性氨基酸，X是任何其它氨基酸。考虑这一点的另一种方式是，病原性的机制中涉及线性碱性基序。这些序列对附着可能是必要的，附着作为病原体通过粘膜进入机制中的初始步骤。因此，该能力的中和作用可以保护其免受感染，并且可能允许开发针对多种病原体微生物的广谱治疗方法。这种可能性以前没有认可为疫苗开发的基础。我们认定：临近或者在空间上接近GAG结合结构域的抗原表位可以被中和，并且我们提出了这样的结合位点能结合到中和表位中的可能性。
因此，我们使用亲和层析法，在肝素Actigel树脂上，继续从鸡毒支原体(M.gallisepticum)中，分离肝素结合蛋白(Sterogene Bioseparations,Inc.,Carlsbad,CA)。随后，我们已经，从接种过针对鸡毒支原体的疫苗的小鸡身上获得的中和血浆中，纯化出IgG。纯化的IgG被固定到活化树脂Actigel ALD(Sterogene Bioseparations,Inc.,Carlsbad,CA)上，分离的肝素结合蛋白被吸附到柱上。结合蛋白通过在柱上加入胰蛋白酶来消化，含有免疫原性表位的肽片段，包括肝素结合序列，被洗脱，用MALDI-MS分析，以便得到序列信息。使用这样的抗原表位或者针对这样的表位的单克隆抗体纯化的IgGs，当体内施用时，也可以为感染宿主赋予保护性免疫。可选地，可以使用本技术领域已知的其它蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶、V-8蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶，来代替胰蛋白酶。
在平行实验中，我们已经将分离的肝素结合蛋白重新吸附到肝素Actigel上，并且进行结合蛋白的类似的胰蛋白酶消化。也通过用于序列信息的MALDI-MS分析从树脂回收的片段。
鉴别参与调理-吞噬作用(opso-phagocytosis)的表位也很重要，其使用了补体系统。特别地，从固定化C1q柱上已接种疫苗的小鸡血清中纯化补体固定抗体，这样的抗体用于鉴别能诱导这样的反应的表位。随后固定化纯化的IgG，且用于从粗MG溶解产物捕获蛋白质抗原。而在柱子上，用蛋白酶消化结合的蛋白，洗脱且用MALDI-MS分析表位序列，以便获得序列信息。使用这样的抗原表位纯化的IgGs，或者针对这样的表位的单克隆抗体，当被体内施用时，也能给感染宿主赋予保护性免疫。
当前一些基于微生物的疫苗的一个主要问题是，共同施用免疫刺激和免疫抑制表位，以及与病原体自身上存在的PRR激动剂的混合物一起，这些之中的一些诱导Th1，一些诱导Th2或者Treg反应。这些疫苗不会克服宿主中多种感染剂的持续性，并且在缺乏临床疾病的情况下，可以将宿主变为“病原体工厂”。该方法甚至给病原体施加了选择压力，可以导致更多毒力菌株的发展。相反，我们的策略是产生人工“病原体模仿”微粒，其仅仅含有免疫刺激表位，而将参与来自免疫系统的病原体逃逸的表位和/或PRR激动剂、以及合适的指导免疫应答的PRR激动剂分子排除在外。已鉴定表位也可以结合成为单一多肽，在特定抗原表位肽之间存在剪接序列或接头。通过该方法，克服了持久病原体产生的扭曲型免疫应答，发展了细胞和体液免疫应答的平衡混合，这导致感染剂的根除。当需要克服不期望的自身免疫性应答时，该逃逸表位或PRR激动剂可用于开发耐受性。
典型地，生物活性分子是免疫系统产生活性的分子，如免疫原或调制免疫功能的其它分子，如免疫刺激剂、免疫抑制剂、或诱导免疫耐受性的试剂。
生物活性分子可以非共价或共价结合到微粒上。共价结合的方法在本领域是已知的，并且已经描述，例如在P.Tijssen的"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays"(Elsevier,Amsterdam,1985,pp.283-289)，S.S.Wong的Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking"(CRC Press,Boca Raton,Florida,1993),在T.E.Creighton编著的"Protein Function:A Practical Approach"(IRL Press,Oxford,1989),和在GT.Hermanson的"Bioconjugate Techniques"(Academic Press,San Diego,1996)中，所有这些被引入本发明，作为参考。典型地，当微粒是琼脂糖时，生物活性分子附着到琼脂糖的羟基上。通常，多糖的羟基残基可以由某些化合物通过形成中间反应衍生物而活化，所述衍生物含有用于随后的亲核置换的离去基团。这些活化羟基与亲核试剂如胺(例如蛋白质或者肽中的赖氨酸基团)的反应导致稳定的共价健，其将生物活性分子交联到琼脂糖上。合适的试剂包括羰基二咪唑、氯甲酸酯衍生物、三氟乙烷磺酰氯、甲苯磺酰氯、溴化氰、二乙烯基砜、三聚氯氰和双环氧化物。可以选择地，碳水化合物如琼脂糖的羟基可以用氯乙酸修饰，以便产生羧酸酯功能基团。作为另一个备选方案，可以在多糖上产生胺功能基团；碳水化合物分子或产生的乙醛的还原末端可以与低链长度(即典型地，链上的碳原子小于大约6个)的二胺化合物反应，得到短的烷基胺间隔基，其可用于随后的偶联反应。可以使用双酰肼化合物类似地产生酰肼基团。然后使用多种反应，将所得到的功能基团偶合到生物活性分子上。例如，如果产生了羧基，它们随后通过混合酐方法、碳二亚胺方法，使用二环己基碳二亚胺，和N-羟基丁二酰亚胺酯方法，偶联到蛋白质或者肽上。脂肪族胺可以通过多种方法偶联到蛋白质或者肽上，包括碳二亚胺、甲苯-2,4-二异氰酸酯或顺丁烯二酰亚胺化合物(malemide compounds)，特别是顺丁烯二酰亚胺衍生物的N-羟基丁二酰亚胺酯。该化合物的实例是4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸。另一个实例是m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基丁二酰亚胺酯。可以使用的另一种试剂仍然是N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。而且，双功能酯，如二甲基庚二胺盐(dimethylpimelimidate)、己二亚氨二甲酯(dimethyladipimidate)或辛二甲酸二甲酯(dimethylsuberimidate)，可用于将含有氨基的部分偶合到蛋白质上。用于将化合物，包括肽、蛋白质和碳水化合物，以及其它化合物，共价连接到固体载体上的其它方法在本技术领域也是已知的。非共价连接的方法依赖于多个非共价相互作用，如氢键、疏水键和可以稳定相互作用的盐键。
典型地，生物活性分子是一种或多种的肽、蛋白质、重组肽、重组蛋白质、脂、碳水化合物、核酸、糖蛋白或糖脂。也可以使用这些分子的组合，这样多个生物活性分子可附着在相同的微粒上。
如果免疫活性分子是肽或蛋白质，它可能已经经受了免疫调节的转录后修饰。典型地，这些涉及糖和/或脂部分。一个实例是末端甘露糖化。然而，其它糖残基可以加入到蛋白质或肽上。可以选择地，可以以这样的方式分离免疫活性分子，这样，免疫活性分子的制备物基本缺乏末端甘露糖化分子。该贫化可以通过氧化步骤如高碘酸盐氧化，通过酶处理，典型地用水解酶，或者通过糖特异性亲和结合，和对贫化组分的随后纯化来进行。用于末端甘露糖基残基的贫化的其它方法，在本技术领域是已知的。
类似地，可以以这样的方式分离免疫活性分子，这样：在免疫活性分子的制备物中，基本上没有含脂的免疫调节转录后部分。该贫化可以通过化学水解或者通过十五烷酸的共沉淀来进行。可选地，含脂免疫调节的转录后部分可以用带电的去污剂封闭。特别合适的去污剂是十六烷基三甲基氯化铵(cetyl trimethyl ammonium chloride)。可选地，可以使用类似的季铵去污剂。
典型地，任选存在的靶分子是病原体模式识别分子(pathogen patternrecognition molecule)。在另一个备选方案中，病原体模式识别分子是TLR受体激动剂，如TLR1受体激动剂，TLR2受体激动剂，TLR3受体激动剂，TLR4受体激动剂，TLR5受体激动剂，TLR6受体激动剂，TLR7受体激动剂，TLR8受体激动剂，或者TLR9受体激动剂。在另一个备选方案中，病原体模式识别分子是NOD蛋白质激动剂，如NOD-1激动剂或NOD-2激动剂。典型地，NOD蛋白质激动剂是细菌肽葡聚糖或细菌肽葡聚糖的衍生物。
多于一种生物活性分子，如免疫活性分子，和不止一种的病原体模式识别分子，在存在的情况下，可以被整合到组合物中，与微粒稳定地结合。
本发明的另一个方面是，通过给目标施用上面描述的免疫活性有效量的组合物，在目标中引发免疫应答。典型地，该组合物也包括靶分子，如病原体模式识别分子。不止一种免疫活性分子和不止一种病原体模式识别分子可以整合到该组合物中。
本发明的另一个方面仍然是一种体内投递免疫活性组合物的方法，该方法包括：给具有活性免疫系统的生物，施用上面描述的组合物的有效量。而且，不止一种免疫活性分子和不止一种病原体模式识别分子可以整合到组合物中。体内投递免疫活性组合物可以通过粘膜表面、肠胃外途径、皮肤途径或皮下途径完成。可以使用其它施用途径。
本发明的另一个方面仍然是一种诱发针对至少一种病原体的保护性免疫应答的方法，该方法包括给目标施用免疫有效量的组合物，该组合物包括一种或多种免疫活性分子(即免疫原)，和与上面描述的微粒稳定结合的TLR受体激动剂的组合，以便在目标中诱发针对病原体的保护性免疫应答。保护性免疫应答包括Th1或Th2反应，或者Th1和Th2反应的组合。施用可以通过单一剂量或者多剂量的方式进行。
本发明的另一个方面仍然是诱发针对免疫活性试剂的方法，该方法包括给对象施用免疫有效量的组合物，该组合物包括一种或多种免疫活性分子(即免疫原)，和与微粒稳定结合的TLR受体激动剂和NOD蛋白质激动剂的组合，以便在目标中诱导针对免疫活性试剂的耐受性。免疫活性分子可以具有含脂部分，其可以附着到独立于免疫活性分子之剩余部分的微粒上。可选地，含脂的免疫活性部分可以进一步包括碳水化合物基团。
根据本发明的组合物的毒性和疗效可通过细胞培养物或者实验动物中的标准药物程序确定，例如用于确定LD50(可以使50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比率是疗效系数，可以表示为比率LD50/ED50。表现出大疗效系数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定法和动物研究获得的数据，可以在配置用于人类或其它动物的剂量范围中使用。这些组合物的剂量优选地在循环浓度的范围内，其包括具有很小或无毒性的ED50。该剂量可以在这样的范围内变化，该范围依赖于所用的剂量形式和所用的施用途径。
对于根据本发明的许多组合物，最初可以从细胞培养测定法估计治疗上有效的剂量。例如，可以在动物模型中配置剂量，以便获得包括在细胞培养物(即，相关于组合物对被测量的免疫系统参数的效果，获得半最大反应的测试组合物的浓度)中确定的IC50的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更准确地确定人体的有用剂量。例如可通过HPLC测定血浆水平。
精确的配方、施用途径和剂量可以由单个医师根据病人的情况来选择。(例如参考Fingl等人,在The Pharmacological Basis of Therapeutics,1975,Ch.1p.1中)。应该注意到，由于毒性或者由于器官功能障碍，主治医师将知道如何且何时终止、中断或者调整施用。相反，如果临床反应不厉害(排除毒性)，主治医师也将知道将治疗调整至更高程度。在相关的失调管理中，施用剂量的数量级将根据要治疗的疾病情况的严重程度和施用途径来变化。例如，疾病情况的严重程度可以被评估，部分地，通过标准预后评价方法来评估。进一步，剂量，以及也许是剂量频率，也将根据单一病人的年龄、体重和反应而变化。与上面讨论的程序可比的程序，可以在兽药中使用。
使用药物上可接受的载体，将此处描述的、用于本发明的实践组合物，配置为对全身施用合适的剂量，也在本发明的范围内。借助于适当的载体选择和合适的制造实践，本发明的组合物，尤其是那些配置为溶液的组合物，可以肠胃外施用，如通过静脉注射。这些组合物可以使用本技术领域熟知的、药物上可接受的载体，容易地配置为适合于粘膜或皮下施用的剂型。
下面实施例对本发明进行了示意性说明。这些实施例仅用于示意性说明的目的，没有限制本发明的意图。
实施例1
微粒的选择
1-10μm范围内的琼脂糖微粒已经由Sterogene Bioseparations,Inc.(Carlsbad,CA)生产，且使用Saturn DigiSizer 5200(Micromeritis Instrument Corp)测试。图1所示数据表明，粒径分布为：75％的是5μm以下的微粒，24％的是5-10μm的微粒，1％的高于10μm的微粒。
实施例2
鸡毒支原体(MG)的培养
在0.1ml的支原体培养基中，加入冻干形式的鸡毒支原体(K781R-16P)，放置到1.5ml的培养基中，置于37℃的培养器中。通过颜色变化(粉红到桔黄色或者黄色)，或者通过铺平板于琼脂平板上且检查菌落，来监控支原体的生长。通过将感染培养物转移到新鲜介质中，培养大体积(10-15L)的支原体培养物。随后，以5500rpm将培养物离心30分钟。用PBS洗涤沉淀物(以5500rpm进行20分钟)，直到上清液的OD280低于0.2。将沉淀物重悬于20mL的PBS中。
实施例3
用于MG抗原纯化的免疫亲和柱的制备
步骤1：
在64mL的抗-鸡毒支原体鸡血清中，将128mL去离子(DI)水加入到玻璃烧杯中。使用冰醋酸将溶液的pH调节到4.5。快速搅拌溶液，但小心避免飞溅或者起泡。将CAP-8沉淀溶液(Sterogene Bioseparations,Inc.Carlsbad,CA)用力搅拌10分钟。随后，计量拿出64mL的CAP-8沉淀溶液，并且缓慢地加入到搅拌1到2分钟的时间期间而形成的涡流的侧壁上。然后搅拌减速到仅仅使溶液运动的速率。室温下搅拌溶液30分钟，然后转移至适当大小的离心管中，沉淀物以5500rpm旋转15分钟。将上清液轻轻倒出到一个容器中，用20mL的20mM醋酸钠，pH4.8的缓冲液，将沉淀物洗涤一次。使用0.22μm注射过滤器，过滤上清液。
步骤2：
SP吞吐量增强阳离子交换树脂(Sterogene Bioseparations,Inc.Carlsbad,CA)在3柱床体积的1M NaOH中悬浮10分钟，然后用DI水洗涤至中性。随后，用10柱床体积的pH4.8的0.5M醋酸钠洗涤，然后用20柱床体积的DI水洗涤。树脂用15柱床体积的pH 4.8的20mM醋酸钠平衡，使用20mM醋酸盐，pH 4.8的填充缓冲液填充到柱中。将步骤1的上清液以3mL/分钟的流速加载到柱上，用20mM醋酸钠，pH 4.8缓冲液洗涤柱。将流经液和洗涤液组合起来。测量针对pH 4.8的20mM醋酸钠的OD280。用50mM磷酸钠，300mM NaCl，pH 8.0缓冲液洗脱柱，测量洗脱液的OD280。
步骤3：
在20mL的Actigel ALD活化树脂(Sterogene Bioseparations,Inc.Carlsbad,CA)中，以10mg/mL加入纯化的抗鸡毒支原体的鸡IgG溶液，随后加入10.5mL的1M氰基硼氢化物(ALD偶合溶液,Sterogene Bioseparations,Inc.Carlsbad,CA)。在2-8℃将悬浮液轻轻地混合20小时，随后用DI水大量洗涤。树脂储存在pH 7.0和2-8℃的PBS中。
实施例4
MG抗原的纯化
步骤1：
在20ml的洗涤MG浓缩液中，加入0.2g的Mega-10去污剂，室温混合20小时。在20小时培养后，在悬浮液中也加入1mL的Triton-X 100，室温下继续混合1小时。随后，以5000rpm旋转10分钟。从沉淀物中分离上清液，将200ml的PBS，pH 7.2，加入到上清液中。将MG蛋白质溶液于2-8℃保存5天。
步骤2：
用5柱床体积的PBS，pH 7.2，以3mL/分钟流速，平衡20mL柱床体积的抗-MG-鸡IgG-Actigel柱。将MG蛋白质溶液以8-15mL/分钟加载到柱上。将流经物收集到分离的瓶中。用10个柱床体积的PBS，pH 7.2，以8-15mL/分钟的流速洗涤柱，然后用20-40mL的0.1M柠檬酸，pH2.5，以相同流速洗脱。使用2M Tris，将洗出物的pH立即调节为7.2。使用柱流经物重复该纯化至少5次，以便吸附出所有抗原。将所有洗出物混合，且使用糖粉，在透析袋中，于2-8℃过夜浓缩。用5L的PBS，pH 7.2，于2-8℃将浓缩溶液过夜透析。进行Bradford氏蛋白质测定方法，以确定纯化蛋抗原的浓度，使用血清白蛋白作为标准。
实施例5
活化的琼脂糖微粒
用两种不同方法活化颗粒。第一种活化方法由Sterogene Bioseparations,Inc.(Carlsbad,CA)进行，使用可商购的专有的醛连接化学，其提供了极度稳定的配体连接。该化学的另一个优势是固定化的高度可重复性。该专有的醛化学允许多个配体的连续固定化。
另一种活化使用溴化氰(CNBr)活化方法进行。简单地来说，在30mL的琼脂糖微粒中，加入30mL的2M碳酸钠溶液，在冰浴中保持3-5分钟，没有混合动作。然后，称取1.5gCNBr，溶解到9mL的乙腈中。将CNBr溶液立即加入到树脂混合物中，在冰浴上有力地混合2分钟。随后，用20柱床体积的冰冷水洗涤，以4500rpm旋转，2℃，5分钟。
实施例6
MG抗原与微粒的偶合
偶合反应发生在纯化抗原上的氨基，和微粒上的醛基或CNBr-活化基团之间。当使用醛活化颗粒时，偶合用实施例3中描述的偶合试剂氰基硼氢化钠介导。抗原被以10μg/0.2mL和50μg/0.2mL微粒的浓度，固定化。
在另一个偶合反应中，以与如下相同的抗原浓度使用CNBr-活化微粒。在15mL的CNBr活化微粒中，加入pH 8.0的纯化的MG抗原溶液。于2-8℃轻轻地混合溶液20小时。离心分离上清液，用10柱床体积的DI水洗涤树脂。偶合树脂存储在2-8℃的LAL水中。用Bradford蛋白测定方法，测量上清液中未结合的蛋白质。
实施例7
支原体膜的制备和偶合
在3.0mL浓缩的支原体抗原中，加入80mL的高压灭菌的DI水，用搅拌棒于37℃混合1小时。以5000rpm将溶液离心30分钟，用高压灭菌水洗涤沉淀物两次。在10mL的PBS中再造沉淀物。在1.5mL的CNBr活化微粒中，加入0.5mL的纯化沉淀物，其是用pH8的0.1M NaHCO3稀释到1：3的。于2-8℃轻轻地混合溶液20小时。离心分离上清液，用10柱床体积的DI水洗涤树脂。将偶合树脂存储在2-8℃的LAL水中。用Bradford蛋白测定方法测量上清液中未结合的蛋白质。
实施例8
NOD1受体活化剂与微粒的偶合
肽葡聚糖(PG)，以22μg/0.2mL树脂，溶解在0.1M NaHCO3中，且加入到根据实施例6制备的CNBr-活化的微粒中。允使反应2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例9
TLR3活化剂与微粒的偶合
聚I:C，以10μg/0.2mL珠子，固定到根据实施例6的pH 8，0.1M NaHCO3的CNBr-活化的微粒中。使反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例10
TLR4活化剂与微粒的偶合
细菌脂多糖，以2μg/0.2mL树脂，溶解到pH 8，0.1M NaHCO3中，并且根据实施例6固定化到CNBr-活化的微粒上。允许反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例11
TLR5活化剂与微粒的偶合
鞭毛蛋白，以2μg/0.2mL树脂，溶解到pH 8，0.1M NaHCO3中，并且根据实施例6固定化到CNBr-活化的微粒中。允许反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例12
TLR1和TLR6活化剂与微粒的偶合
含有支原体MALP-2的表面抗原，以2μg/0.2mL树脂，溶解到pH 8，0.1M NaHCO3中，并且根据实施例6固定到CNBr-活化的微粒上。使反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例13
TLR7/TLR8活化剂与微粒的偶合
单链RNA或抗病毒咪唑喹啉咪喹莫特(Aldara)，以2μg/0.2mL树脂，溶解到pH 8，0.1M NaHCO3中，并且固定到根据实施例6的CNBr-活化的微粒上。使反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例14
TLR9活化剂与微粒的偶合
CpG DNA，以10μg/0.2mL树脂，溶解到pH 8，0.1M NaHCO3中，并且固定到根据实施例6的CNBr-活化的微粒上。使反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例15
组合PAMP识别受体激动剂分子组合物固定化到微粒上
NOD1激动剂和TLR激动剂4和9，以2μg/0.2mL树脂，10μg/0.2mL树脂和2μg/0.2mL树脂混合在一起，分别溶解到pH 8，0.1M NaHCO3中，并且固定到根据实施例6的CNBr-活化的微粒上。使反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂，于2-8℃存储在相同的溶液中。
实施例16
MG抗原与组合PAMP识别受体激动剂分子组合物一起固定化到微粒上
MG抗原在实施例6中描述的条件下偶合1小时。随后，在实施例13描述的条件下加入TLR激动剂混合物，使反应于2-8℃过夜进行。离心分离上清液，彻底地用LAL等级水，也就是存储介质，洗涤树脂。
实施例17
动物研究1
这些结果是3组实验的平均值。
给三天大小的小鸡(无鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(M.synoviae(MS))，没有用ELISA检测到MG和MS母体抗体)接种疫苗。每组有10只小鸡。在实验的第14天，用鸡毒支原体Rlow菌株攻击小鸡。研究在第28天终止。
这些组如下设置：
攻击之前用微粒疫苗组合物处理G1-G5
G1＝仅用微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G2＝用带有鸡毒支原体亲和纯化抗原(10μg/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G3＝用带有受体激动剂(10μg细菌DNA，大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G4＝用带有鸡毒支原体亲和纯化抗原(10μg/剂量)和受体激动剂(10μg细菌DNA，大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G5＝用带有鸡毒支原体膜(107/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
用微粒疫苗组合物攻击后处理G6-G7
G6＝攻击，且用带有鸡毒支原体亲和纯化抗原(10μg/剂量)和受体激动剂(10μg细菌DNA，大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)在攻击后口服处理
G7＝攻击，且用带有受体激动剂(10μg细菌DNA，大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)在攻击后口服处理
G8和G9阳性和阴性对照组
G8＝攻击，且未处理
G9＝未攻击，且未处理
时间罗列
第一天(D1)：建立G1到G9组。牺牲10只小鸡用于ELISA测定，PCR以及鸡毒支原体和滑液囊支原体的培养，以确认实验小鸡对母体抗体是阴性的，且存在鸡毒支原体和滑液囊支原体。
第0天(D0)：攻击前对G1-G5接种。
第14天(D14)：攻击G1-G8组。
第15天(D15)：攻击后对G6-G7接种。
第28天(D28)：G1-G9。安乐死、尸体剖检且对从特定器官、气管、气囊和肺的鸡毒支原体(MG)分离物铺平板。进行气管和肺的组织学检查。
D14和D28：对小鸡放血，以获得将用于测试MG特异性抗体的血清，使用血清平板凝集(SPA)试验和阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)。
在为期90天的D1，1天大小的肉种小鸡分配为8组中的1组(10只小鸡/组)。记录小鸡的单个体重。小鸡如此分配，以便每组中小鸡的平均体重不会显著不同。根据处理，和以适当形式记录的体重，每只鸡用彩色的和带编号的翅膀标签来识别。
处理
在第0天，用不同的疫苗组合物处理G1-G5的小鸡，0.2mL，每只动物1mL PBS。剂量如上描述。攻击后，在第15天处理G6-G7。
攻击
在第14天，用鸡毒支原体的毒性R-菌株的新鲜肉汤培养物，攻击G1-G8共8组动物，滴定度为大约8.0log10CFU/ml。使用喷雾技术，将10mL的该新鲜肉汤培养物施用于这些组中的每一只动物。简单地，将这些鸡放置在0.22立方米分离单元中。然后在1个大气压下，喷洒10mL的新鲜的鸡毒支原体R-菌株培养物，持续大约100秒，并且将小鸡暴露20分钟。(在实验室中，已经使用该技术在几次实验中获得成功结果)。
安乐死和病理学
在D28天，在实验研究的最后，对所有组施以安乐死。尸体剖检每只鸡，对与MG相关的粗损害记分。记录气管、左右胸气囊和腹膜中渗出物的存在情况。根据下述系统对损害记分：
在气管中：0＝没有渗出物，1＝轻微变红，和少量渗出物，2＝粘膜变红，渗出物。
左右气囊：0＝无损害，1＝浆液性渗出物，2＝带有小块纤维蛋白的浆液性渗出物，3＝浆液状、纤维蛋白性渗出物，轻微增厚的气囊壁，4＝大量纤维蛋白性渗出物，非常厚的气囊壁。
腹膜：0＝无渗出物，1＝浆液性渗出物，2＝带有小块纤维蛋白的浆液性渗出物，3＝浆液状、纤维蛋白性的渗出物。
MG分离
在尸体剖检过程中，使用拭子对气管、胸气囊、肝脏、肺、脾、肾脏和心脏进行无菌取样。然后将拭子上的材料铺平板于支原体琼脂(MA)上，于37℃，在5％CO2培养器中培养。在第2、4和7天观察平板上的支原体，然后以周为间隔，最多观察三周。用PCR测试阳性菌落，以鉴别鸡毒支原体和滑液囊支原体。
尸体剖检
在MG攻击之后，在气囊和腹膜中鉴别到显著的病理学损害。然而，与没有处理、攻击的对照组(G8)，以及仅用颗粒处理的组(G1)相比，在用颗粒加受体激动剂(G3，G6，p<0.001)，颗粒加纯化抗原(G2,p<0.001)，和纯化抗原加受体激动剂(G4,G6p<0.001)处理的组中，记录到损害得分的显著降低。然而，如果它们在攻击之前就被施用，当与攻击后施用相比时，用颗粒加纯化抗原或颗粒加纯化抗原加受体激动剂，获得了较好的结果。当用固定到颗粒上的鸡毒支原体膜处理G5时，在一些情况下，病理学损害比攻击组本身更明显。这导致这样的结论，即用鸡毒支原体膜接种，阻止了针对病原体攻击的适当免疫应答，从而引起免疫抑制，且允许更明显的感染。
支原体的再次分离
支原体可以，从未接种疫苗的、感染的对照组小鸡的内部器官中，被频繁地再次分离。与未接种疫苗的对照组(G8，P<0.01)，和仅用颗粒处理的组(G1,p<0.001-0.01)，或者用颗粒加受体激动剂(G3,G7，p<0.05)处理的组相比，在用颗粒加纯化抗原、有或者没有受体激动剂(G2、G4、G6)处理的组中，注意到再次分离率(呼吸+内部器官的再次分离率)显著降低。然而，在用颗粒加受体激动剂(G3,G6)和对照组(G8)处理的组之间，有显著较低的再次分离率(P<0.05)。当比较来自实验组的呼吸道(气管、肺、气囊)或其它内部器官(肝脏、脾、肾脏和心脏)的支原体的再次分离率时，也得到了类似结果。当用固定到颗粒上的鸡毒支原体膜处理G5时，在某些情况下，来自器官的鸡毒支原体的再次分离率高于攻击组本身。这导致这样的结论，即用鸡毒支原体膜接种疫苗可以阻止针对病原体攻击的适当的免疫应答，从而引起免疫抑制，且允许更显著的感染。
结果如表1所示。
表1
血清学结果
这些组的血清学反应在实验结束时不同。未处理的、攻击组(G8)的反应与仅用颗粒处理的组(G1)的反应不同。同时，与仅用颗粒处理的组(G1)相比，在用颗粒加纯化抗原和PRR激动剂处理的组(G4)(P<0.05)中注意到非常强烈的反应。与用颗粒加纯化抗原处理的组(G2)相比，如果加入PRR(G4，G6)，注意到非常高的血清学反应(P<0.05)。如果在攻击前(G4)或者攻击后(G6)使用颗粒加抗原加PRR，那么血清学结果之间没有显著差异。
讨论
鸡毒支原体能引起气囊和腹膜的显著炎症，伴随有气管、气囊和肺的定居现象(colonization)。也可以从内部器官频繁地检测支原体。我们已经开发了一种新型的“病原体模仿”免疫活性组合物，其包括微生物大小范围内的微粒(<5μm)，具有与不同PRR激动剂分子一起共价固定化的免疫亲和纯化抗原。
我们的结果表明，没有任何修饰的颗粒不能刺激任何免疫应答。单独颗粒不能保护小鸡，使其免受鸡毒支原体引起的腹膜炎和气囊炎的伤害，也不能保护器官的免受支原体定居。
当使用PRR激动剂、不使用抗原，涂敷颗粒时，支原体攻击的血清学反应没有受到影响。然而，支原体的器官定居降低了，病理学损害得分也降低了。这证实了我们的体外观察，即PRR激动剂确实刺激或者增强了导致增强保护的先天性免疫应答。然而，所施加的免疫调节剂的量不能完全保护动物，使其免受大剂量的高度致病菌株的攻击。这点对于先天性免疫系统也是已知的，因为它典型地不足以克服大剂量的病原体。然而，数据表明，该新颖免疫调节剂能保护动物，使其免受较低剂量的攻击。
当将纯化抗原加入到用PRR激动剂涂敷的颗粒中时，增强了支原体特异性的血清学反应。显著降低了器官的定居现象，病理学损害得分也低。当通过粘膜并且在攻击前注射疫苗时，该效果更明显，但当在攻击后通过粘膜施用疫苗时，注意到了类似的正面效果。
一个有趣的观察是，增加的抗原浓度(高达50μg/剂量)实际上降低了疫苗的保护效果。这表明亲和纯化抗原中存在免疫抑制组分。为了鉴别这些组分，并且消除它们的作用，设计了一个新的动物实验(参见下面)。
在接种疫苗后，在攻击之前，每日检查接种疫苗的小鸡，以评估疫苗的安全性。发现这些小鸡在临床上是健康的，没有显示出疫苗的任何副作用。与未接种疫苗组相比，这些鸡的饲料和水消耗没有变化。在实验过程中尸体剖检的动物没有显示出炎症症状，或者器官大小/重量的变化。疫苗表现是安全的。
实施例18
如前述实施例描述的制备亲和纯化MG抗原。将纯化抗原分为三组，用于固定化之前的下述处理。
1.内切糖苷酶H消化
在53.6mL抗原(大约1.5mg)中，加入2.5单位的酶，于37℃过夜培养。次日使混合物通过冷冻的固定化甘露聚糖柱(5mL)，收集流经物。该样品命名为Endo H抗原。
2.高碘酸盐处理
在53.6mL抗原(大约1.5mg)中，加入固体高碘酸钠，至终浓度为15mM，混合后保持冷冻1小时。以2倍摩尔使用方式加入甘油，将样品再培养1小时。针对PBS，透析过夜。透析样品命名为高碘酸盐(Periodate(PJ))抗原。
3.ConA结合抗原的去除
使纯化抗原(大约1.5mg，于53.6mL中)通过2mL固定化Con A柱。收集流经物。样品命名为Con A流经物。用pH 9.5的50mM TRIS中的1Mα-甲基甘露葡糖苷，洗脱结合的抗原。样品命名为Con A洗提物。
抗原处理
抗原的特征如表2所示。
表2
*对于Endo H处理，被处理抗原的初始量是2.51mg。(53.6ml的该制备物和40.3ml的0.0246mg/ml的之前的鸡毒支原体制备物)。
实施例19
动物研究II
这些结果是3次实验的平均。对三天大小的小鸡(无鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)，没有能通过ELISA检测到的MG和MS母体抗体)接种疫苗。每组有10只小鸡。在实验的第14天，用鸡毒支原体Rlow菌株攻击小鸡。研究在第28天结束。
这些组如下设置：
G1＝未攻击，且未处理
G2＝攻击，且未处理
攻击之前处理两周：
G3＝用带有鸡毒支原体亲和纯化抗原(10μg/剂量)和TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G4＝用带有鸡毒支原体亲和纯化抗原(50μg/剂量)和TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G5＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Con A吸附抗原(10μg)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G6＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Endo H消化抗原(10μg)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G7＝用带有鸡毒支原体亲和纯化高碘酸盐氧化抗原(10μg)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G8＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Con A吸附抗原(10μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G9＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Con A吸附抗原(50μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G10＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Endo H消化抗原(10μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G11＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Endo H消化抗原(50μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G12＝用带有鸡毒支原体亲和纯化高碘酸盐氧化抗原(10μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G13＝用带有鸡毒支原体亲和纯化高碘酸盐氧化抗原(50μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G14＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Endo H消化抗原(10μg)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)加氨基胍(i.p.)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理7天，并且攻击
G15＝用带有在珠子上的鸡毒支原体抗原Con A洗脱物的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
时间罗列
D1：建立G1到G15组。牺牲10只小鸡用于ELISA测定、PCR和鸡毒支原体和滑液囊支原体的培养，以确认实验小鸡对母体抗体是阴性，且存在支原体。
D0：攻击前，接种G3-G14。
D14：攻击G2-G15组。
D28：G1-G15。安乐死、尸体剖检且铺平板来自特定器官、气管、气囊和肺的鸡毒支原体(MG)的分离物。进行气管和肺的组织学检查。
D14和D28：对小鸡抽血，以获得用于测试MG特异性抗体的血清，使用血清平板凝集(SPA)试验和阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)。
在为期150天的D1天，1天大小的肉种小鸡分配为15组中的1组(10只小鸡/组)中。记录小鸡的个体体重。小鸡如此分配，以便每组中小鸡的平均体重不会显著不同。根据处理，每只鸡用彩色和带编号的翅膀标签来识别，以及以适当形式记录的体重。
攻击
在D14天，用鸡毒支原体的毒性R-菌株的新鲜肉汤培养物，攻击14组G2-G15动物，滴定度为大约8.0log10CFU/ml。使用喷雾技术，将10mL的该新鲜肉汤培养物施用于这些组中的每只动物。简单地，将这些鸡放置在0.22立方米的分离单元中。然后在1个大气压下，喷洒10mL的新鲜鸡毒支原体R-菌株培养物，持续大约100秒，并且将小鸡暴露20分钟。(在实验室中，已经使用该技术在几次实验中取得成功结果)。
安乐死和病理学
在D28天，在实验研究的最后，对所有组施以安乐死。尸体剖检每只鸡，对与MG相关的肉眼损害记分。记录气管、左右胸气囊和腹膜中渗出液的存在。根据下述系统对损害记分：
在气管中：0＝没有渗出液，1＝轻微变红和少量渗出液，2＝粘膜变红且有渗出液。
左右气囊：0＝无损害，1＝浆液状渗出液，2＝带有小块纤维蛋白的浆液状渗出液，3＝浆液状、有纤维蛋白性的渗出液，和轻微增厚的气囊壁，4＝大量纤维蛋白性的渗出液，和非常厚的气囊壁。
腹膜：0＝无渗出液，1＝浆液状渗出液，2＝带有小块纤维蛋白的浆液状渗出液，3＝浆液状、有纤维蛋白性的渗出液。
结果
结果如表3所示。
表3
组 损害得分 再次分离 效率
未处理，未攻击 0 0 N/A
未处理，攻击 (92)100％ 100％ 0％
G4:50μg A+TLR (52)56.5％ 66.6％ 33.4％
G9:Con A 50μg A+TLR (10)10.9％ 8.3％ 91.7％
G11:Endo H 50μg A+TLR (17)18.5％ 0％ 100％
G13:PJ 50μg A+TLR (21)22.8％ 16.7％ 83.3％
G4:Con A洗脱的A (53)57.6％ 100％ 0％
MG分离
在尸体剖检过程中，使用拭子对气管、胸气囊、肝脏、肺、脾、肾脏和心脏进行无菌取样。然后拭子上的材料铺平板于支原体琼脂(MA)上，于37℃在5％CO2培养器中，培养。在第2、4和7天观察平板上的支原体，然后以周为间隔，最多观察三周。用PCR测试阳性菌落，以鉴别鸡毒支原体和滑液囊支原体。
尸体剖检和再次分离
在MG攻击之后，在气囊和腹膜中鉴别到显著的病理学损害。然而，与没有处理、攻击的对照组相比，在用处理的纯化抗原加TLR接种的组中，记录到损害得分和再次分离率的显著降低，其中最好的是Con A柱提取抗原(G9)。然而，用Con A洗脱的抗原组分G15，病原体损害得分高，再次分离率与阳性对照组相同。这导致这样的结论，即用鸡毒支原体抗原组分接种阻止针对病原体攻击的适当免疫应答，从而引起免疫抑制，且允许更明显的感染。
讨论
这些实验的结果表明，从亲和纯化抗原汇合液中去除免疫抑制抗原，对疫苗组合物的保护作用有显著提高。此外，化学修饰或者抗原上的含糖转录后修饰的酶促分解，也导致改进的保护免疫。
相反，我们也已经发现，偶合到微粒上的分离的免疫抑制抗原的施用，导致免疫抑制和发展了针对病原体的耐受性。这样，我们已经示范性说明，适当的抗原特征可以将免疫应答改变为保护或者耐受性。保护和耐受性在开发调制免疫应答的合理方法方面非常重要。随后，我们已经决定，靶向涉入免疫应答发展中的额外抗原表面决定簇。
实施例20
如前述实施例的描述，制备亲和纯化MG抗原。将纯化抗原分为三组，用于进行固定化之前的下述处理。
1.MG抗原脱酰作用
在27mL抗原(大约0.65mg)中，加入8mL的1M NaOH和10mg的十五烷酸，于70℃将溶液轻轻地搅拌45分钟。然后调节pH至8.0，以3000rpm离心5分钟去除沉淀物。样品命名为脱酰抗原(Deacylated Antigens)。
2.高碘酸盐处理
目的在于比实施例18更严格的反应。在25mL抗原(大约0.6mg)中，加入固体高碘酸钠，至终浓度为80mM，混合后室温下保持2.5小时。然后以2倍摩尔使用方式加入甘油，将样品再培养1小时。针对PBS，过夜进行透析。透析样品命名为高碘酸盐抗原。
实施例21
动物研究III
这些结果是3次实验的平均。对三天大小的小鸡(无鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)，没有由ELISA检测到的MG和MS母体抗体)接种疫苗。每组有10只小鸡。在实验的第14天，用鸡毒支原体Rlow菌株攻击小鸡。研究在第28天结束。
这些组如下设置：
G1＝未攻击且未处理
G2＝攻击且未处理
攻击之前处理两周：
G3＝用带有鸡毒支原体亲和纯化、Con A吸附抗原(10μg/剂量)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G4＝用带有鸡毒支原体亲和纯化、脱酰抗原(10μg/剂量)+TLR激动剂(10μg细菌DNA,大肠杆菌+2μg大肠杆菌LPS和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G5＝用带有鸡毒支原体亲和纯化、ConA吸附抗原(10μg)+TLR激动剂(25μg聚I：C+10μg细菌DNA和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
G6＝用带有鸡毒支原体亲和纯化、高碘酸盐处理且脱酰的抗原(10μg)+TLR激动剂(10μg聚I：C+10μg细菌DNA和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
攻击后处理1天：
G7＝用带有鸡毒支原体亲和纯化Con A吸附抗原(10μg)+TLR激动剂(25μg聚I：C+10μg细菌DNA和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理
G8＝用带有鸡毒支原体亲和纯化高碘酸盐处理且脱酰的抗原(10μg)+TLR激动剂(25μg聚I：C+10μg细菌DNA和2μg肽葡聚糖/剂量)的微粒(0.2mL/小鸡)口服处理，并且攻击
时间罗列
D1：建立G1到G9组。牺牲10只小鸡用于ELISA测定、PCR和鸡毒支原体和滑液囊支原体的培养，以确认实验小鸡对母体抗体是阴性，且存在支原体。
D0：攻击前，接种G3-G6。
D14：攻击G2-G9组。
D15：攻击之后，接种G7-G9组。
D28：G1-G9。安乐死、尸体剖检且铺平板来自特定器官、气管、气囊和肺的鸡毒支原体(MG)的分离物。进行气管和肺的组织学检查。
D14和D28：对小鸡抽血，以获得将用于测试MG特异性抗体的血清，使用血清平板凝集(SPA)试验和阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)。
在为期90天的D1天，1天大小的肉种小鸡分配为9组中的1组(10只小鸡/组)。记录小鸡的单独体重。小鸡如此分配，以便每组中小鸡的平均体重不会显著不同。根据处理，每只鸡用彩色和带编号的翅膀标签来识别，以及，以适当形式记录体重。
攻击
在D14天，用鸡毒支原体的毒性R-菌株的新鲜肉汤培养物，攻击9组G2-G9动物，滴度为大约8.0log10CFU/ml。使用喷雾技术，将10mL的该新鲜肉汤培养物施用于这些组中的每一只动物。简单地，将这些鸡放置在0.22立方米的分离单元中。然后在1个大气压下，喷洒10mL的新鲜鸡毒支原体R-菌株培养物，持续大约100秒，并且将小鸡暴露20分钟。
安乐死和病理学
在D28天，在实验研究的最后，对所有组施以安乐死。尸体剖检每只鸡，对与MG相关的肉眼损害记分。记录气管、左右胸气囊和腹膜中渗出液的存在。根据下述系统对损害记分：
在气管中：0＝没有渗出液，1＝轻微变红和少量渗出液，2＝粘膜变红且有渗出液。
左右气囊：0＝无损害，1＝浆液状渗出液，2＝带有小块纤维蛋白的浆液状渗出液，3＝浆液状、有纤维蛋白的渗出液，轻微增厚的气囊壁，4＝大量纤维蛋白的渗出液，非常厚的气囊壁。
腹膜：0＝无渗出液，1＝浆液状渗出液，2＝带有小块纤维蛋白的浆液状渗出液，3＝浆液状、有纤维蛋白的渗出液。
结果
结果如表4所示。
表4
MG分离
在尸体剖检过程中，使用拭子对气管、胸气囊、肝脏、肺、脾、肾脏和心脏进行无菌取样。然后将拭子上的材料铺平板于支原体琼脂(MA)上，于37℃在5％CO2培养器中培养。在第2、4和7天观察平板上的支原体，然后以周为间隔，最多观察三周。用PCR测试阳性菌落，以鉴别鸡毒支原体和滑液囊支原体。
尸体剖检和再次分离
在MG攻击之后，在气囊和腹膜中鉴别到显著的病理学损害。然而，与没有处理、攻击的对照组相比，在用处理的纯化抗原加TLR组接种的组中，记录到损害得分和再次分离率的显著降低，所有组得到了可比结果，最好的是脱酰抗原(G4)。在感染后接种疫苗组中，ConA处理抗原加TLR3，4，9给出了最好的结果。甚至用该组合物感染后，似乎也能获得保护性免疫。
讨论
这些实验的结果表明，从亲和纯化抗原汇合液去除或者阻断免疫抑制逃逸抗原或者抗原决定簇，可以显著地提高对疫苗组合物的保护作用。此外，抗原上的含糖转录后修饰(N-糖基化)的去除和化学修饰也导致改进的保护免疫。另外，抗原上的脂部分被化学去除或者阻断，也导致显著的免疫保护作用。
我们也已经示意性描述，使用适当的抗原修饰，可以将免疫应答改变为保护。这在开发调制免疫应答的合理方法方面非常重要。随后，我们已经建立了一个体外系统，在组织培养物中重新产生各自的免疫应答。这样的系统可以有关于免疫活性组合物产生的免疫应答预测值，从而能缩短产品开发周期。
实施例22
体外研究
在用外周血制备，用肽葡聚糖(PepG)(Sigma,St Louis,Ml)，细菌CpG DNA(KMBiomedicals,Aurora,OH；LPS<0.2EU/ml，用鲎变形细胞裂解产物测定方法测量)，或者两者处理的PBMC中测量TNF-α分泌。通过ELISA，从5小时培养后的培养物上清液，测量TNF-α。
从用于TNF-α分析的相应的PBMC培养物中，评估单核细胞中的组织因子(TF)，其代表先天性免疫系统。使用TF ELISA(Imubind kit,American Diagnostica,Greenwich,CT)的制造商推荐的方法，用Triton-X100从粘附细胞提取TF。
结果如图2所示(P和D之后的数字分别表示PepG和细菌DNA的浓度，单位为μg/ml；从左到右，它们是P3+D15、P3+D5、P3+D1.5、P1+D15、P1+D5、P1+D1.5、P0.3+D15、P0.3+D5和P0.3+D1.5)。PBMC(A)分泌的TNF-α，和用PepG(白条)，或者细菌CpG DNA(黑条)，或者两者同时以与当单独加入时相同的浓度(阴影条)处理后的组织因子(B)。P和D之后的数字分别表示PepG和细菌DNA的浓度，单位为μg/ml。当以所有测试浓度，在PepG(3或1.5μg/mL)的效果总和之间和单独CpG DNA的作用之间进行比较时，并且当PepG和细菌DNA同时加入时，对于TNF-α和TF，P<0.05；学生t试验(Student't测试)(n＝4)。这是三个中的代表性实验。
现有结果表明了：通过PBMC中的PepG和细菌DNA诱导TNF-α和TF，和两个分子之间的协同效果。在PepG或者细菌DNA作用之后，可能涉及共同的下游信号途径的直接作用，或者由分泌化合物所介导的间接作用。TNF-α是针对致热原的宿主反应的一种重要的早期媒介，并且是能触发感染性休克的新陈代谢、血液动力学、组织和细胞因子级联反应的整个幅度范围上的唯一内源性媒介。细菌DNA和PepG的协同作用已经暗示了败血病的发病机制，如之前假设的那样，其中每一个分子，尽管在体内以低浓度存在，可能扩大另一个分子的作用。
不同颗粒组合物的不同Th1和Th2反应的体外诱导的示意性说明
通过来自健康志愿者的外周血的Ficoll分离，制备外周血单核细胞。将单核细胞以106细胞/ml的密度铺平板于1.5ml RPMI-1640(Irvine Scientific,Irvine,CA)上，用100U/ml青霉素/链霉素，2mM谷氨酰胺和3％胎牛血清补充，并且用0.15mL的微粒(在无菌PBS中)培养18小时。微粒含有Con A剥离的或高碘酸钠处理的抗原，以及TLR激动剂2、3、4和9，如下面图表中所示。实施例19中描述了珠子的制备。
结果如图3(灰条，TNF-αX 100,黑条,IL-10)和图4所示，其中给出了TNF-α/IL-10的比率。
TNF-α和IL-10比率分析表明，Con A剥离的抗原与TLR2、4、9的共固定化给出了最显著的Th1反应，发现其与体内结果相关(参见实施例19)。该组合物始终对动物中的支原体攻击给出了最好的保护作用。
实施例23
为了进一步表征针对免疫调节剂微粒的细胞反应，我们将树突状细胞暴露在这些微粒下。我们已经观察到MHC I和MHC Il分子和共刺激分子CD80和CD86的上调节。任何PRR激动剂组合的存在，似乎必须测量在18小时处理之后的树突状细胞表面上的MHC II增加。由于在细胞表面上存在MHC是个动力学过程，可能需要用ConA Ag珠子温育不同的时间，以便观察细胞表面上MHC分子的增加。MHC允许抗原呈递到T细胞，CD86与T细胞上的CD28相互作用。树突状细胞伴随的抗原呈递和B7-共刺激配体(如CD80和CD86)相互作用，导致T细胞活化。这些体外数据表明：微粒导致了标志树突状细胞成熟的变化，和导致了诱导先天性和获得性免疫所要求的变化。
18小时暴露给不同微粒制剂后，确定树突状细胞表面上的MHC I和MHC II以及CD80和CD86表达：没有抗原或者PRR激动剂固定到其上的对照组微粒(对照组)，和去除了ConA结合抗原后的鸡毒支原体抗原被固定到其上的微粒，用或者没有下述PRR激动剂组合：1)PepG、LPS、细菌DNA(细菌DNA)(ConA Ag+PRR 2、4、9)，或者2)聚I:C、LPS、细菌DNA(ConAAg+PRR 3、4、9)。图5所示为MHC-II和CD86在树突状细胞中的诱导。
结果显示了：微粒通过DCs对TNF-α分泌的作用。对照组微粒不诱导条件培养基中TNF-α的可检测分泌。与对照组微粒相比，其它三种类型的微粒(在Con A结合抗原贫化后的鸡毒支原体，和用PepG、LPS、细菌DNA和poly I:C共固定化的类似抗原)通过DCs诱导显著数量的TNF-α。有趣地是，与单独抗原相比，细菌化合物如免疫调节剂的存在，产生了较少的TNF-α。这些结果表明微粒确实与DCs相互作用，且能激活TLRs和NOD受体，以产生：与这些分子在免疫系统的细胞上的已知作用相一致的生理学反应。我们已经示意性说明了微粒能被靶向DCs。
实施例24
从MG中纯化肝素结合蛋白
如实施例2中的描述，培养鸡毒支原体，按照实施例4的步骤1中公开的那样，将浓缩且洗涤的支原体，予以灭活。简单地，在75mL粗MG膜蛋白中，加入0.75Mega-10，室温下将溶液混合20小时。随后，在溶液中加入3.75mL的Triton X-100，室温下再次混合1小时。以5000rpm旋转溶液10分钟，从沉淀中分离上清液。然后，将75mLTris缓冲液(20mM Tris,0.1MNaCI,pH 7.2)加入到上清液中。用5柱床体积的Tris缓冲液，以3ml/分钟流速平衡肝素-Actigel柱。将MG蛋白溶液以8-15mL/分钟的流速加载到柱上，将流经物收集到单独的瓶子中。用10柱床体积的Tris缓冲液，以8-15mL/分钟的流速，洗涤柱，用含有2M NaCl的Tris缓冲液，以8-15mL/分钟的流速，洗脱柱。在用10柱床体积的Tris缓冲液洗涤后，将MG蛋白溶液再次应用到柱上，如上再次洗脱。将洗脱液集中到一起，使用3500MW截留透析管，针对Tris缓冲液透析。进行蛋白质测定，以确定洗脱蛋白质的浓度。
实施例25
从中和血清纯化IgG以及制备免疫亲和柱
根据实施例3，从接种疫苗的、中和鸡血清纯化大量IgG，且固定化到Actigel ALD上。
实施例26
结合到免疫亲和柱上的肝素结合MG蛋白的胰蛋白酶消化
将2mg纯化的MG蛋白加入到2ml的免疫亲和柱上，允许结合15分钟。用10ml Tris缓冲液B(50mM Tris,pH 7.5,0.1M NaCl)洗涤柱。加入胰蛋白酶溶液，在Tris缓冲液B中为20μg/ml，于37℃轻轻地将浆液搅拌1小时。用Tris缓冲液B洗涤掉片段和游离酶，用0.1M柠檬酸盐，pH2.5，洗脱结合的肽。随后用cc.NH4OH使其变中性，浓缩，且在C-18反相旋转柱(Pierce)上纯化，用MALDI-TOF分析肽组合物。
实施例27
结合到肝素柱上的肝素结合MG蛋白的胰蛋白酶消化
将2mg纯化的MG蛋白加入到2ml的肝素Actigel柱上，使其结合1小时。用10ml Tris缓冲液B洗涤柱。加入胰蛋白酶溶液，在Tris缓冲液B中为20μg/ml，于37℃轻轻地将浆液搅拌1小时。用Tris缓冲液B洗涤掉片段和游离酶，用含有1M NaCl的Tris缓冲液B洗脱结合的肽。浓缩洗脱物，且在C-18反相旋转柱(Pierce)上纯化，用MALDI-TOF分析肽组合物。
实施例28
C1q蛋白的纯化和固定化
根据McKay,EJ的方法进行C1q的纯化，即用于从不同动物种类纯化血浆C1q的简单的两步程序(A simple two-step procedure for the purification of plasma C1qfrom different animal species)，Immunol Letters 1981,3:303-308。通过适应性修改我们的描述在美国专利5,801,063中的方法，将纯化的C1q以3mg/ml固定化到Aminogel(Sterogene Bioseparations,Inc.,Carlsbad CA)上。
实施例29
补体结合IgG的纯化和固定化
将根据实施例24纯化的多克隆中和抗体应用到10ml的固定化C1q的柱上，在Tris缓冲液B中平衡，允许结合30分钟。通过用10柱床体积的Tris缓冲液B洗涤，去除未结合的抗体，用含有1M NaCl的相同缓冲液洗脱结合的抗体。随后以3mg/ml将纯化的IgG固定化到Actigel ALD上。
实施例30
结合到免疫亲和柱上的补体活化MG蛋白的胰蛋白酶消化
如实施例2中的描述，培养鸡毒支原体，按照实施例4的步骤1中公开的那样，灭活浓缩且洗涤的支原体。在10ml的固定化补体活化抗体的柱上，以3ml/分钟应用30mL的MG溶解产物。以8ml/分钟的流速，用20柱床体积的Tris缓冲液B洗涤柱，以去除未特异性吸附的蛋白质。加入胰蛋白酶溶液，在Tris缓冲液B中为20μg/ml，于37℃轻轻地将浆液搅拌1小时。用Tris缓冲液B洗涤掉片段和游离酶，用pH 2.5的0.1M柠檬酸盐洗脱结合的肽。随后用柱色谱(cc.)NH4OH使其中和，浓缩，且在C-18反相旋转柱(Pierce)上纯化，用MALDI-TOF分析肽组合物。
免疫活性肽的一个实例显示出如下组成：
Lys-Leu-Ala-Leu-Thr-Ser-Glu-lle-Thr-Glu-Glu-lle-Tyr-Pro-Ser-Ala-Pro-Lys-Val-Ser-Arg-Lys-Gln-Arg-Gly-Val-His-Gly-Phe-Ser-Glu-Pro-Thr-Ser(SEQ IDNO:1)。
重要的是，该肽含有Arg-Lys-Gln-Arg的GAG/肝素结合结构域。另一个有用的序列是Leu-Leu-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Ser-Val-Ser-Pro-Gln-Ala-Ser-Leu-Thr(SEQ IDNO:2)。这些序列可通过接头肽连接，其含有内切蛋白酶的切割位点。这样的接头序列的实例是LIKFRSN(Leu-lle-Lys-Phe-Arg-Ser-Asn)(SEQ ID NO:3)。其它接头序列在本技术领域是已知的。
实施例31
抗原肽表位和多表位肽的合成
用FMOC方法合成抗原肽。
实施例32
确认用于疫苗的保护性抗原肽
将抗原肽与已接种疫苗小鸡的中性血清混合，用竞争性ELISA确定到固定化肝素的结合抑制。肽样品吸附到ELIS平板的壁上。随后，用封闭溶液封闭壁，接着将免疫和未免疫对照组抗血清加入到壁上，于4℃温育过夜。用洗涤溶液去除非特异性蛋白质，随后以100μg/ml加入生物素标记的肝素，在封闭缓冲液中稀释1小时。对每一未结合的肝素洗涤三次后，每次洗涤10分钟，加入链霉抗生物素蛋白过氧化物酶，以1：3000在封闭缓冲液中稀释1小时。用洗涤缓冲液洗涤三次，每次10分钟，去除过量共轭物，通过加入3,3'-二氨基联苯胺溶液显色。显色信号与中和抗体的存在成反比。
实施例33
病原体的抗原蛋白的生物信息学分析，也导致鉴别高抗原潜力的表位。已经针对鸡毒支原体MGA蛋白进行了这样的分析。在线性碱性基序的上下文中，进一步分析抗原区域。如此预计的高抗原性的线性基序的一个实例是序列：MHC I表位10-mer(10-聚体)是LLAKKTDKSV(SEQ ID NO:4)，而MHC II 15-mer是LLAKKTDKSVSPAQAS(SEQ ID NO:5)。用SYFPEITHI方法(www.syfpeithi.de)鉴别这些结构域。这表明，线性碱性基序实际上包括在高抗原倾向的斑点内。用本技术领域已知的技术进行生物信息学分析，如J.Pevsner,"Bioinformatics and Functional Genomics"(Wiley-Liss,Hoboken,N.J.,2003)中描述的技术，使用了用于数据挖掘和匹配的数据库和计算分析技术，和本技术领域已知的序列对比。
实施例34
抗表位抗体的纯化
用末端生物素标记合成鉴别的抗原肽。以1mg/ml浓度将生物素标记的肽固定化到抗生物素蛋白Actigel(Sterogene Bioseparations,Inc.Carlsbad,CA)上。以饱和浓度加入来自接种疫苗小鸡的中性抗血清，通过用pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，去除非特异性结合的蛋白质。用Actisep Elution Medium(Sterogene Bioseparations,Inc.Carlsbad,CA)洗脱特异性结合的抗体。
本发明的优点
本发明提供了改进的免疫调节组合物，和能定制的方法，例如，以便诱导免疫应答，或者引发耐受性。这些组合物是稳定的，可以用很大范围的免疫原和靶分子制备，以便对免疫应答产生期望的作用。它们提供了除肠胃外施用之外的，用于这些试剂的施用途径。它们保护免疫原和靶分子的未成熟分解或释放。颗粒具有固有的粘膜粘附特性，其可以改进与粘膜的相互作用，且有助于摄取。它们不要求其它的佐剂。
根据本发明的方法和组合物，利用了N-糖基化(甘露糖化)在免疫逃逸中的角色，以便通过从打算用作疫苗的组合物中去除适当的逃逸表位，避免免疫逃逸的发生。它们也使用了糖胺聚糖/肝素线性结合基序的鉴别，和干预这样的结合的方法。根据本发明的方法和组合物进一步使用了已经开发用于鉴别补体活化表位的方法。此外，根据本发明的方法和组合物使用了这样的发现，即使用几种TLR激动剂极大地增强了免疫应答。所有抗原和TLR激动剂能被靶向粘膜淋巴系统中的单一细胞。本发明的另一个改进的方面是在单一颗粒上使用了合成的T细胞和B细胞表位。
在缺少此处未特别公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下，此处示意性描述的本发明能合适地实践。因此，例如，术语“包含”，“包括”，“含有”等，可以广泛地理解，没有限制。另外，此处使用的术语和表达被用作描述术语，不是限制，在使用这些术语，和除将来所示和描述的任何等价表达或其任何部分的表达中，没有任何意图，而也应该认识到，在本发明所要求的范围内，多种修饰都是可能的。因此，应该理解到，尽管本发明已经通过本发明的优选的实施方案和任选的特征、修饰和变化进行了特别公开，且这些修饰和变化被认为在本发明此处公开的范围内。此处，本发明已经进行了广泛且一般地描述。落在一般公开范围内的每一个狭小类别和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括每一发明的一般描述，条件是从属中去除任何主题的否定限制，不管其中是否特别地含有已删除的材料。
此外，在本发明的特征或者方面根据马库什(Markush)组进行描述的情况下，本技术领域获得学位的那些技术人员将认识到，本发明也根据马库什组的任何单一成员或亚组进行描述。也应该理解到，上述描述的目的在于示意性而不是限制性。一旦阅读了上述描述，许多实施方案对本技术领域的熟练技术人员是显而易见的。因此，不参考上述描述，本发明的范围应该可以确定，但相反，可以参考所述权利要求，以及这样的权利要求有资格拥有的完全范围的等价表达来确定。将所有项目和参考的公开，包括专利公开，引入此处作为参考。
序列表
<110> 盖伦生物公司
S. 绍特马里
L. 斯蒂普科维茨
P. 格兰迪克斯
<120> 免疫活性组合物
<130> 8172-003-WO
<140> PCT/US 06/03349
<141> 2006-01-30
<150> US 60/648,165
<151> 2006-01-28
<160> 5
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工免疫活性肽或接头序列
<400> 1
Lys Leu Ala Leu Thr Ser Glu Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Pro Ser Ala
1 5 10 15
Pro Lys Val Ser Arg Lys Gln Arg Gly Val His Gly Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Thr Ser
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工抗原肽或接头序列
<400> 2
Leu Leu Ala Lys Lys Thr Asp Lys Ser Val Ser Pro Gln Ala Ser Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工抗原序列或接头肽
<400> 3
Leu Ile Lys Phe Arg Ser Asn
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工抗原序列或接头肽
<400> 4
Leu Leu Ala Lys Lys Thr Asp Lys Ser Val
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工抗原序列或接头肽
<400> 5
Leu Leu Ala Lys Lys Thr Asp Lys Ser Val Ser Pro Ala Gln Ala Ser
1 5 10 15

Claims (42)

1.一种免疫活性组合物，所述组合物用于诱导保护性免疫，所述组合物包括：
(a)至少一种病原体相关分子模式；
(b)至少一种免疫活性抗原或抗原表位；和
(c)至少一种对将组合物投递到生物有效的载体，从而诱导保护性免疫，其中所述载体是不带电琼脂糖微粒并且其中所述至少一种病原体相关分子模式和所述至少一种免疫活性抗原或抗原表位共价连接到相同的微粒上。
2.如权利要求1所述的组合物，其中至少一种免疫活性抗原表位缺乏逃逸表位。
3.如权利要求1所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是肽、蛋白质、重组肽或者多肽、重组蛋白质、脂、碳水化合物或其它生物活性分子，或它们中任意的组合。
4.如权利要求1所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，并且其中所述肽或者蛋白质具有免疫调节的转录后修饰。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述免疫调节的转录后修饰涉及碳水化合物和/或脂部分。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述免疫调节的转录后修饰含有末端甘露糖化。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述免疫调节性末端甘露糖化物质，是通过选自氧化步骤、酶处理和糖特异性亲和结合的方法从所述组合物被贫化。
8.如权利要求4所述的组合物，其中所述转录后修饰涉及脂部分，其中所述脂部分通过去脂作用被去除。
9.如权利要求1所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，其中免疫活性肽或者蛋白质没有免疫调节的转录后修饰。
10.如权利要求9所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，其中免疫活性肽或者蛋白质不具有能N-糖基化和/或硫辛酰基化的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，其中免疫活性蛋白质或肽具有能结合细胞表面糖胺聚糖(GAGs)的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的组合物，其中氨基酸序列本质上是多碱价的。
13.如权利要求12所述的组合物，其中氨基酸序列的通式是XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB或BXBXXXXXBXB，其中B是碱性氨基酸，X是任何其它氨基酸。
14.如权利要求11所述的组合物，其中GAG结合氨基酸序列被用于产生针对所述肽或蛋白质的抗体，这些抗体能干预病原体结合到细胞表面。
15.如权利要求11所述的组合物，其中所述GAG选自肝素及它的类似物。
16.如权利要求1所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是肽或蛋白质，所述肽或蛋白质单独地或者与抗体一起，具有补体激活活性。
17.如权利要求1所述的组合物，其中免疫活性抗原表位是众多的肽，它们能结合成为单一多肽。
18.如权利要求1所述的组合物，其中病原体相关分子模式选自：
(a)TLR 1受体激动剂；
(b)TLR 2受体激动剂；
(c)TLR 3受体激动剂；
(d)TLR 4受体激动剂；
(e)TLR 5受体激动剂；
(f)TLR 6受体激动剂；
(g)TLR 7受体激动剂；
(h)TLR 8受体激动剂；
(i)TLR 9受体激动剂；
(j)NOD-1激动剂；
(k)NOD-2激动剂；
(l)DC-SIGN激动剂；
(m)L-SIGN激动剂；
(n)甘露糖受体激动剂。
19.如权利要求18所述的组合物，其中病原体相关分子模式是NOD-1受体激动剂或者NOD-2受体激动剂，并且所述NOD-1受体激动剂或者NOD-2受体激动剂选自细菌肽葡聚糖及细菌肽葡聚糖的衍生物。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述不带电琼脂糖微粒有窄的大小分布范围。
21.如权利要求1所述的组合物，其中所述不带电琼脂糖微粒是多孔的。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述不带电琼脂糖微粒的直径小于大约10μm。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述不带电琼脂糖微粒的直径小于大约5μm。
24.如权利要求1所述的组合物，其中不止一种免疫活性抗原表位和不止一种病原体相关分子模式共价结合到所述不带电琼脂糖微粒上。
25.如权利要求1所述的组合物，其中不止一种病原体相关分子模式共价结合到不带电琼脂糖微粒上。
26.包括至少一种免疫活性抗原表位、至少一种病原体相关分子模式和微粒不带电琼脂糖载体的组合物的用途，其中所述至少一种免疫活性抗原表位和所述至少一种病原体相关分子模式共价连接到所述微粒不带电琼脂糖载体上，和其中所述载体的微粒比病原体小或者与病原体的大小范围相同，用于制造在对象中引发免疫应答中有用的药物。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述组合物包含不止一种病原体相关分子模式。
28.包括一种或多种免疫活性抗原表位、病原体相关分子模式的组合和微粒不带电琼脂糖载体的组合物的用途，用于制造引发针对至少一种病原体的保护性免疫应答的药物，其中所述至少一种免疫活性抗原表位和所述病原体相关分子模式的组合共价连接到所述微粒不带电琼脂糖载体上，其中所述载体的微粒比病原体小或者与病原体的大小范围相同，并且免疫应答包括Th1或Th2反应，或者Th1和Th2反应的组合，并且其中所述药物适合被以单剂量或者多剂量施用。
29.包括一种或多种免疫活性抗原表位，不包括参与免疫逃逸机制的抗原，以及包括病原体相关分子模式的组合和微粒不带电琼脂糖载体的组合物的用途，用于制造引发针对至少一种病原体的保护性免疫应答的药物，其中所述一种或多种免疫活性抗原表位和所述病原体相关分子模式的组合共价连接到所述微粒不带电琼脂糖载体上，其中所述载体的微粒比病原体小或者与病原体的大小范围相同，并且其中所述药物适合被以单剂量或者多剂量施用。
30.如权利要26、28或29所述的用途，其中免疫应答干预致病微生物上的糖胺聚糖结合元件。
31.一种诱导小鸡中保护性免疫的免疫活性组合物，所述组合物包括：
(a)每个剂量10μg鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)亲和纯化的抗原；
(b)受体激动剂，所述受体激动剂包括：
(i)每个剂量10μg大肠杆菌(Escherichia coli)细菌DNA；和
(ii)每个剂量2μg大肠杆菌脂多糖；和
(iii)每个剂量2μg肽葡聚糖；和
(c)不带电琼脂糖微粒；
其中所述鸡毒支原体亲和纯化的抗原和所述受体激动剂共价结合到所述不带电琼脂糖微粒上；以及
其中单位剂量的所述组合物包括每只小鸡0.2ml所述微粒。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述不带电琼脂糖微粒的大小是从约1μm到10μm。
33.如权利要求31所述的组合物，其中所述亲和纯化的鸡毒支原体抗原用内切糖苷酶H进行消化。
34.如权利要求31所述的组合物，其中所述亲和纯化的鸡毒支原体抗原用高碘酸盐进行处理。
35.如权利要求31所述的组合物，其中所述亲和纯化的鸡毒支原体抗原通过亲和色谱法进行刀豆素A结合抗原的去除。
36.如权利要求31所述的组合物，其中所述亲和纯化的鸡毒支原体抗原通过与十五烷酸反应进行脱酰作用。
37.如权利要求31所述的组合物用于制造在对象中对引发免疫应答有用的药物的用途。
38.如权利要求32所述的组合物用于制造在对象中对引发免疫应答有用的药物的用途。
39.如权利要求33所述的组合物用于制造在对象中对引发免疫应答有用的药物的用途。
40.如权利要求34所述的组合物用于制造在对象中对引发免疫应答有用的药物的用途。
41.如权利要求35所述的组合物用于制造在对象中对引发免疫应答有用的药物的用途。
42.如权利要求36所述的组合物用于制造在对象中对引发免疫应答有用的药物的用途。
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