KR20120137346A - 면역학적 활성 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 분자의 부착 여부에 관계없이 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 다른 생체활성 물질 중 하나 이상을 포함하는 미세입자 담체 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 비감염 및 감염 숙주 모두에서 예방성 면역 반응을 유도하는 면역 조절성 조성물 및 방법뿐만 아니라 면역 내성을 유도하는 방법도 제공한다.

Description

면역학적 활성 조성물{Immunologically active compositions}
본 발명은 표적 분자의 부착 여부에 관계없이 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 다른 생체활성 물질 중 하나 이상을 포함하는 미세입자 담체 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 비감염 및 감염 숙주 모두에서 예방성 면역 반응을 유도하는 면역 조절성 조성물 및 방법뿐만 아니라 면역 내성을 유도하는 방법도 제공한다.
본 발명은 보호 면역이나 내성을 유도할 수 있는 면역학적 활성 조성물을 제공한다. 비감염 또는 감염 숙주 모두에서 보호 면역을 유도하는 조성물은 항원 에피토프들로 구성되나, 면역 "회피(escape)"에 관여하거나 내성을 유도하는 에피토프는 배제되거나 제거된다. 보호 면역은 또한 항원 에피토프의 존재 유무에 관계없이 병원체 관련 분자 패턴(들) 및/또는 담체를 포함하는 조성물에 의해 유도될 수 있다. 내성을 유도하는 다른 면역학적 활성 조성물은 담체 존재 유무에 관계없이 병원체 회피에 중요한 분자 패턴(들) 또는 회피 에피토프(들)을 포함한다. 또한, 본 발명은 이러한 면역학적 활성 분자를 동정하는 방법을 제공한다.
면역생물학의 진보로 인해, 면역 조절인자의 개발에 필수적인 면역 인자, 예컨대 병원체를 억제하는 선천성 및 후천성 면역 반응을 유도하기 위한 필요 인자 등이 동정되었다.
광범위 항생제 내성의 도래로 인해, 면역 조절인자는 세포내 병원체를 비롯한 미생물에 대하여 장기 지속적인 방어 작용을 전달하기 위한 가장 효과적인 시도일 수 있다. 현재 면역 조절인자에 집중된 사안은 신규 벡터, 유효 담체 및 보강제 시스템의 개발을 필요로 한다.
병원체는 또한 Th2 반응과 내성을 유도할 수 있는 바, 이러한 이해는 자가면역질환, 이식 및 다른 의학적 용도를 위한 면역 조절인자의 개발에 사용될 수 있을 것이다. 대부분의 병원체는 피부 및 점막을 통해 체내로 들어간다. 따라서, 이러한 투여 경로는 특히 피부, 기도, 위장관 또는 성기관을 통해 유입되는 감염에 대한 면역 조절에 특히 적합하다. 종래 백신은 실제 감염 부위에서 떨어진 부위로 비경구 투여되며, 이들의 점막 반응은 현저하지 않다.
현재 밝혀진 선천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는 수용체로는 Toll 유사 수용체(TLR) 외에 다른 수용체와 경로가 있다. 그 일 예가 세포내 미생물의 미생물 모티프를 인식하는 뉴클레오타이드-올리고머화 도메인(NOD)이다. 또한, 세포외 매트릭스 단백질인 민딘(Mindin)은 여러 세균 표면 성분에 대한 염증 반응의 매개인자이다. 이러한 연구와 여타 연구들을 통해, 선천성 면역이 TLR 시그널링과 무관한 추가 인자를 수반하고 NFκB 또는 IL-1의 생산이 감염을 조절하는데 충분하지 않을 수 있음을 암시했다.
감염 조절에 수반되는 선천성 면역의 일반적인 요소들은 (1) 전염증성 반응: NFκB 매개성이며, 염증의 많은 인자들을 활성화시키고, 과다자극은 쇼크를 초래할 수 있다; (2) 양이온성 숙주 방어 펩타이드: 세균 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 및 시그널링 분자에 의해 자극된 펩타이드들의 생산 증가; (3) 포식세포 활성화: 호중구 및 대식세포의 세포내 사멸을 증가시켰고(산화성 및 비산화성 기전의 증강), 사이토킨 생산을 증가시켰다; (4) 화학주성: 포식세포의 내피 부착, 감염 부위에 대한 세포 이동, 혈구누출을 증가시켰다; (5) 세포외 사멸 기전: 보체 활성화, 철 킬레이트화 증강, 항미생물성 펩타이드 분비, 분해 효소의 생산; (6) 감염 근절: 피브리노겐 활성화를 통한 응혈 형성; (7) 상처 수복: 섬유아세포 성장 및 부착, 혈관형성; 및 (8) 후천성 면역 반응: B-세포 및 T-세포 활성화, 종종 수지상 세포를 통해.
선천성 면역의 자극은 인터페론, 모노포스포릴-지질 A, 이미퀴모드, CpG 뉴클레오타이드 또는 양이온성 펩타이드를 사용하여 수행할 수 있다. 하지만, 선천성 면역은 감염을 방어하는 능력이 제한적이고, 이러한 상황에서, 후천성 면역 반응이 역할을 한다.
최근, 수지상 세포가 선천 및 후천성 면역을 연계시키는데 필수적인 것으로 인식되었고, 이러한 지식은 면역학자들이 불량한 면역원성 항원들에 대한 면역조절 전략을 설계할 수 있게 했다. 수지상 세포(DC)은 골수양 및 림프양 계열의 전구체들에서 유래되지만, 주요 항원 전달 세포(APC)이다. DC는 모든 조직에 존재하고, 감염 동안 침입성 병원체와 접촉하게 하는 주요 면역 세포이다. DC는 선천 및 후천성 면역 반응 사이의 가교이다.
내피 세포 및 상피 세포, 단핵구, 대식세포 및 여타 세포, 예컨대 미성숙 DC는 병원체가 공유하는 보존적 병원체 관련 분자 구조(간단히 PAMP), 예컨대 그램 음성균 유래의 리포폴리사카라이드, 그램 양성균 유래의 리포테이코산, 그램 음성균과 그램 양성균 유래의 펩티도글리칸, 펩티도글리칸 관련 지질단백질, 세균 DNA 및 플라겔린, 뿐만 아니라 바이러스 RNA 등에 결합하는 병원체 패턴 인식 수용체(TLR 수용체, 렉틴 도메인 수용체 및 여타 수용체)를 발현한다. 다른 세포는 병원체에 적합 반응을 일으키는 다른 수용체를 발현한다. 미성숙 항원 포획 DC는 활성화 시 성숙 항원 전달 DC로 분화하고, MHC 클래스 II 및 클래스 I 측면에서 항원을 전달할 수 있고, 뿐만 아니라 CD80 및 CD86과 같은 표면 공동자극 분자의 발현을 상향조절한다.
활성화된 성숙 DC는 2차 림프양 기관(림프절, 비장, 파이어판)으로 이동하여, 여기서 T 세포 영역으로 전위한다. T 세포 자극과 DC의 상호작용은 사이토킨, 케모카인 및 부착 분자, 예컨대 세포간 세포 부착 분자(I-CAM), 백혈구 기능 관련 분자 1(LFA-1) 및 수지상 세포 특이 ICAM 포착성 비인테그린(DC-SIGN)에 의존적이다.
국소적인 사이토킨 환경과 항원에 따라, 세포 T-헬퍼(Th1) 및 체액 항체 매개의 Th2- 또는 Treg 지향성 면역 반응은 다양한 정도로 유발된다. 항원 용량이 Th1/Th2 분화를 유도하는 것으로 밝혀져 있고, 고용량은 Th-1 반응을, 저용량은 Th-2 반응을 주로 자극한다. 항원 단백질과 DNA 백신을 표시하는 담체 도구는 미성숙 수지상 세포에 의해 흡수되어 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, DC는 면역계의 조절을 위한 개발의 주요 표적이지만 유일한 표적은 아니다.
구체적으로, 점막 DC는 세포흡수작용 및 수용체 매개 세포내이입 작용을 통해 이종 침입자를 소화하여 방어의 중요한 제1선을 제공한다. DC는 체점막이 신체 내부와 외부 사이에 장벽처럼 작용하는 바, 점막 면역에 중요한 역할을 한다. DC는 호흡관과 소화관의 내막에서 발견될 수 있다. 랑게르한스 세포는 피부와 점막에서 발견되는 DC 집단이다. DC와 M 세포는 소화관의 면역 유도 부위인 하부의 림프양 소절로 항원을 수송한다. 이와 유사한 비측 및 기관지 관련 림프양 조직은 호흡관에서 개시되어 있다. 이러한 시스템은 위장관에서는 중요하지만, 기도에서는 하부 DC 망이 더욱 중요할 수 있다. 경구 투여 시, 면역 조절인자는 분해되지 않은 상태로 위와 상부 장을 통해 통과해야만 한다. 이러한 분해는 비측, 안구 또는 생식기 투여경로를 통해서는 일어날 가능성이 없다. 이어서, 면역 조절인자는 장 상피를 통해 흡수되어야 하고, 따라서 항원 전달 세포에 의해 면역 적격 세포에 흡착되어, 후속적으로 전달될 수 있다. 면역 적격 세포는 상피, 점막 고유층, 또는 기저막 아래에 위치해 있다. 따라서, 면역 조절인자 성분은 이 장벽을 통과시키는 담체와 조제되어야 한다. 미립 담체에 결합되었을 때에는, 일반적으로 상기 분자가 파이어판의 M세포에 의해 상기 장벽 위로 수송될 수 있는 것으로 인정받고 있다.
생체활성 분자의 조기 붕괴 또는 방출은 입자 기반 백신과 약물 전달 기술의 개발을 방해했다. 이것은 공개된 문헌에서 주사된 대응물과 비슷한 반응을 달성하기 위해 고용량의 항원/약물이 필요한 이유를 설명해줄 수 있다. 항원과 약물의 불량한 이용 외에도, 다른 주요 단점은 파이어판(PP)의 M 세포의 입자를 수송하는 부족한 능력과 사람에서 유도된 불충분한 면역 반응 및 다른 반응들이다. PP의 상피 M 세포는 장으로부터 특정 세균, 바이러스 및 원생동물의 수송을 허용하는 것으로 알려져 있다. 여러 연구를 통해, 최대 직경이 10㎛인 크기 의존적 흡수가 M 세포, DC 및 Caco-2 세포에 의해 일어날 수 있다는 것이 밝혀져 있다.
PP 및 이의 인접에 존재하는 수지상 세포(DC)의 여러 종류와 M 세포에 의한 입자 흡수에 관한 최근의 정보는 관련 기전의 이해를 제공한다. 바이엘(Beyer T., et al.; Bacterial carriers and virus-like-particles as antigen deliver devices: Role of dendritic cells in antigen presentation. Curr.Drug Targets-Infect.Disord., 2001 1, 287-302)는 빵 효모세포(사카로마이세스 세리비지에(Saccharomyces cerevisiae))의 PP로의 흡수 및 동력학을 연구했고, 그 결과 점막을 통한 수송의 불활성 모델인 것으로 추정했다. 여러 종류의 포식성, 항원 처리 대식세포 또는 수지상 세포로의 수송에 양립되는 전형적인 시간 의존성은 M 세포, M 세포 아래의 세포내 포킷 및 기저막 아래의 공간에서의 효모 세포의 분포로 인해 발견되었다. DC가 위치하는 부위에 따라, DC는 활성화 시 Th1 또는 Th2 지향성 사이토킨을 생산하는 PP 미세환경에서 다른 기능이 있는 것으로 발견되었다. 사이토킨 및 케모카인 미세환경은 그 다음 Th 세포의 Th1 및 Th2 아형으로의 분화를 각각 결정하고, 또한 T 세포의 생존 또는 아폽토시스에 영향을 미칠 것이다.
또한, B 세포의 분화 및 점막 혈장 세포의 귀소는 다른 사이토킨(IL-6뿐만 아니라 TGF-β, IL-4, IL-5 및 IL-10) 및 특정 귀소 수용체 a4b7에 의해 조절된다. 따라서, 점막에서 이용가능한 기전들이 있을 것으로 생각되며, 이에 따라 면역계의 점막 조절은 여타 투여 경로에 의해 수득되는 것보다 자연 감염에 대한 반응과 더욱 유사한, 더욱 분화된 면역 반응을 유도할 수 있을 것으로 결론지을 수 있다.
DC, 이의 전구체 및 제안된 각종 DC 아형에 대해서 많은 것을 알고 있을 지라도, DC의 완전한 기능적 복잡성과 적응성은 DC 및 후속 Th1, Th2 및 Treg 반응에 미치는 특정 백신의 효과에 대한 예측을 어렵게 한다. 하지만, 시험관내에서 성숙화된 DC에서 수득되는 일부 결과들은 유사한 특징을 나타내는 바, 림프양 기관에서 분리된 성숙 DC에도 추정 사용될 수 있을 것이다(Shortman K., et al.; Mous and human dentritic cell subtypes. Nat.Rev.Immunol. 2002 Mar 2(3): 151-61). 예를 들어, DC 반응을 조절하는 마이코플라스마 지질펩타이드 MALP-2의 잠재력이 시험관내에서 연구되었다(Weigt H., et al; Synthetic mycoplasma-derived lipopeptide MALP-2 induces maturation and function of dendritic cells. Immunobiology 2003, 207(3): 223-33). DC의 MALP-2 처리는 CD80, CD86의 발현 및 생체활성 TNF-α 및 IL-10의 방출 뿐만 아니라 자가 림프구의 증식 및 자가 림프구에 의한 IL-4, IL-5 및 γ-INF의 생산을 유도했다. 이러한 특징들은 T 세포를 자극하는 능력과 상관 관계가 있고, 따라서 생체내에서 DC에 미치는 MAPL-2의 가능한 효과를 암시한다.
합성 담체는 MHC 클래스 I 및 II 제시를 위한 항원의 면역자극 효과를 가능하게 해줄 수 있다. 합성 담체는 가능한 각종 용도들에 따라 맞추어질 수 있는 다능성 시스템으로 발전될 수 있다. 이러한 담체의 특성은 면역 반응의 결과 및 효능에 유의적으로 영향을 미칠 수 있다. 입자와 같은 합성 담체는 백신 개발 및 생산 시의 품질 보증 및 확인의 장애를 극복할 수 있게 하며, 따라서 승인과 제품화 시간을 단축시켜준다.
다른 감염성 미생물의 몇가지 면역 자극 성분(펩타이드, 단백질, 지질 또는 다당류)은 백신접종에 사용될 수 있다. 이러한 성분들은 합성되거나, 미생물로부터 정제되거나 또는 재조합 DNA 기술로 생산할 수도 있다. 하지만, 이 성분들은 유리의 용해성 형태로 경구 또는 비경구 투여될 때 적당한 보강제를 필요로 한다.
몇몇 입자 기반 시스템이 각종 항원과 약물의 담체로서 검사되었다. 키토산, 폴리-DL-락트산 또는 폴리아크릴 전분 미세입자는 약물 담체 시스템으로서 이미 개시된 바 있다. 이러한 시스템의 예는 미국 특허 5,603,960 및 6,521,431에 기술되어 있다. 한 보고서에 따르면, 모델 항원으로서 공유 결합된 사람 혈청 알부민(HSA)을 보유한 전분 미세입자는 마우스에서 비경구 투여 시에 강한 보강제로서 작용한 반면, 미세입자 단독물은 면역원성이 아닌 것으로 관찰되었다.
또한, 흡수가 담체의 구조 및 가능한 접착성에 의존적일 가능성이 크다는 것을 유념해야 한다. 아가로스와 다른 다당류는 고유의 점막접착성을 갖고 있고, 이 성질은 여러 점막과의 상호작용을 향상시키고 흡수를 용이하게 할 수 있다.
발명의 개요
본 발명에 따라, 보호 면역 또는 내성을 유도할 수 있는 면역학적 활성 조성물 또는 조성물들에 대한 신규 조성물이 개시된다. 비감염 또는 감염 숙주에서 모두 보호 면역을 유도하는 조성물은 항원 에피토프로 이루어지지만, 면역 "회피"에 관여하거나 내성을 유도하는 에피토프들은 배제되거나 제거된다. 보호 면역은 또한 항원 에피토프의 존재 유무에 관계없이 병원체 관련 분자 패턴(들) 및/또는 담체를 포함하는 조성물에 의해 유도될 수 있다. 내성을 유도하는 다른 면역학적 활성 조성물은 담체 존재 유무에 관계없이 병원체 회피에 중요한 분자 패턴(들) 또는 회피 에피토프(들)을 포함한다. 또한, 본 발명은 이러한 면역학적 활성 분자를 동정하는 방법을 제공한다. 적당한 예는 변형된 마이코플라스마 항원이 부착되거나 부착되지 않은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 인식 분자이다. 이러한 분자 조성물은 비감염 숙주 또는 감염 숙주 모두에서 항마이코플라스마 면역 반응을 조절하는 것으로 보인다. 이러한 항원 일부는 내성 또는 면역 회피를 유도했다.
따라서, 본 발명의 일 관점은 보호 면역을 유도하는 면역학적 활성 조성물로서,
(1) 적어도 하나의 병원체 관련 분자 패턴;
(2) 경우에 따라, 적어도 하나의 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프; 및
(3) 보호 면역이 유도되도록 본 조성물을 유기체에 전달하는데 효과적인 적어도 하나의 담체를 포함하는 조성물이다.
대부분의 경우, 적어도 하나의 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 예는 이하에 추가 기술된다. 통상, 적어도 하나의 면역 활성 항원 에피토프는 회피 에피토프들이 없는 것이다. 이것은 면역 반응에 의해 복제가 차단되지 않는 병원체의 발생을 유도할 수 있는 선택압(selection pressure)을 방지하는데 중요하다. 선택압이 중요할 것 같은 병원체의 일 예는 인플루엔자 바이러스로서, 이 바이러스는 독감 계절마다 사람에게 병을 유발할 가능성이 있는 특정 인플루엔자 균주 또는 균주들에 대한 면역을 제공하기 위해 새로운 백신이 제조되어야 할 정도로 많이 빠르게 변이한다. 선택압이 중요할 것 같은 병원체의 다른 일 예는 또한 빠르게 변이하는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)이다.
본 발명의 다른 관점은 내성을 유도하는 면역학적 활성 조성물로서,
(a) 적어도 하나의 병원체 관련 분자 패턴;
(b) 적어도 하나의 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프; 및
(c) 내성이 유도되도록 유기체에 조성물을 전달하는데 효과적인 적어도 하나의 담체를 포함하는 면역학적 활성 조성물이다.
통상, 면역 활성 항원 에피토프는 펩타이드, 단백질, 재조합 펩타이드 또는 멀티펩타이드, 재조합 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 다른 생물활성 분자 또는 이들의 임의의 조합이다. 통상, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이면, 이 펩타이드 또는 단백질은 면역조절성 전사후 조절능이 있다. 통상, 전사후 조절은 탄수화물 및/또는 지질 잔기를 수반한다. 전사후 조절은 일반적으로 말단 만노실화를 포함하고; 즉, 이러한 대안에서 면역 조절성 말단 만노실화된 물질은 면역 보호 조성물로부터 제거된다. 이러한 제거는 산화 단계, 효소 처리 또는 당 특이적 친화성 결합에 의해 제거될 수 있다. 또는, 전사후 조절은 지질 잔기를 수반하고 지질 잔기는 탈지질화에 의해 제거된다.
보통, 면역 활성 항원 에피토프는 펩타이드 또는 단백질이고, 이러한 면역 활성 펩타이드 또는 단백질은 면역조절성 전사후 변형이 없다. 또한, 이러한 면역 활성 펩타이드 또는 단백질은 N-당화 및/또는 지질화할 수 있는 아미노산 서열이 없다. 다른 바람직한 대안에 따르면, 면역 활성 항원 에피토프는 펩타이드 또는 단백질이고, 이러한 면역 활성 단백질 또는 펩타이드는 세포 표면 글리코사미노글리칸(GAG)에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖고 있다. 일반적으로, 이러한 아미노산 서열은 본래 다염기성이며, 일반식 XBBXBX, XBBBXXBX, BBXXBBBXXBB, BBBXXB, BXBXB, BBB, BXBXXXBXB 또는 BXBXXXXXBXB으로 표시되는 것으로, 여기서 B는 염기성 아미노산이고 X는 다른 임의의 아미노산이다. 일반적으로, GAG 결합성 아미노산 서열은 세포 표면에 대한 병원체 결합을 방해할 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 대한 항체를 생산하는데 사용된다. GAG는 헤파린 및 이의 유사체로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 면역 활성 항원 펩타이드 또는 단백질은 단독적으로 또는 항체와 함께 보체 활성화 활성을 보유할 수 있다. 면역 활성 항원 에피토프는 단일 멀티펩타이드로 조합되는 복수의 펩타이드일 수 있다. 면역 활성 항원 에피토프는 T-세포 에피토프 및 B-세포 에피토프를 포함할 수 있다.
일반적으로, 병원체 관련 분자 패턴은 다음과 같은 효능제(agonist)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다:
(1) TLR1 수용체 효능제;
(2) TLR2 수용체 효능제;
(3) TLR3 수용체 효능제;
(4) TLR4 수용체 효능제;
(5) TLR5 수용체 효능제;
(6) TLR6 수용체 효능제;
(7) TLR7 수용체 효능제;
(8) TLR8 수용체 효능제;
(9) TLR9 수용체 효능제;
(10) NOD-1 효능제;
(11) NOD-2 효능제;
(12) DC-SIGN;
(13) L-SIGN; 및
(14) 만노스 수용체.
병원체 관련 분자 패턴이 NOD-1 효능제 또는 NOD-2 효능제인 경우, NOD-1 효능제 또는 NOD-2 효능제는 세균 펩티도글리칸 및 세균 펩티도글리칸의 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은
(1) 헤파린 흡착을 수행하는 단계;
(2) 면역친화성 선발을 수행하는 단계; 및
(3) 경우에 따라, 면역친화성 선발에 의해 분리된 단백질 또는 단백질들의 단백분해성 절단을 수행하여 면역 활성 펩타이드를 수득하는 단계를 포함하여, 병원체의 글리코사미노글리칸 결합을 방해할 수 있는 면역 활성 펩타이드를 동정하는 방법이다. 면역친화성 선발은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예컨대 문헌[G.T. Hermanson et al., "Immobilized Affinity Ligand Techniques"(Academic Press, Inc. San Diego, 1992)]에 기술되어 있고, 다른 방법도 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 다염기성 선형 모티프를 이용하는 생물정보학 분석법을 통해 서열 데이터를 분석하는 것을 포함하여, 병원체의 글리코사미노글리칸 결합을 방해할 수 있는 면역 활성 펩타이드를 동정하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 관점은
(1) 보체 단백질에 대한 보체 고정화 항체의 결합을 수행하는 단계;
(2) 상기 항체를 이용하여 단백질 항원의 면역친화성 선발을 수행하는 단계; 및
(3) 경우에 따라, 분리된 단백질 항원의 단백분해성 절단을 수행하는 단계를 포함하는, 보체 활성화 면역활성 펩타이드를 동정하는 방법이다.
이러한 방법들에 의해 생산된 면역활성 펩타이드들은 또한 본 발명의 관점들이다. 또한, 숙주 유기체의 질환을 극복하기 위하여, 동정된 면역활성 펩타이드를 기초로 한 보호용 항체가 수득될 수 있다.
앞에서 설명한 바와 같은 조성물에서, 분자들은 혼합물로서 존재할 수 있다. 또는, 분자들은 함께 화학적으로 결합될 수 있다. 담체는 일반적으로 미세입자이다. 이러한 미세입자는 크기 분포 범위가 좁고 다공성인 것이 바람직하다. 전형적으로, 미세입자는 직경이 약 10㎛ 미만이고, 더욱 전형적으로, 미세입자는 직경이 약 5㎛ 미만이다. 전형적으로, 미세입자는 생체중합체로 제조된 것이다. 다른 대안예에 따르면, 면역활성 항원 에피토프는 미세입자에 비공유부착되어 있다. 또 다른 대안예에서는 면역활성 항원 에피토프는 미세입자에 공유부착되어 있다. 하나 이상의 면역활성 항원 에피토프 및 하나 이상의 패턴 인식 수용체 효능제가 미세입자에 결합될 수 있다. 하나 이상의 패턴 인식 수용체 효능제가 미세입자에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 미세입자와 결합되어 있는 적어도 하나의 병원체 인식(PR) 수용체 효능제와 적어도 하나의 면역 활성 항원 에피토프를 포함하고 상기 미세입자가 병원체와 같은 크기 범위이거나 병원체보다 작은 크기인 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 피험체의 면역 반응을 유도하는 방법이다. 이 조성물은 하나 이상의 병원체 인식 수용체 효능제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 미세입자와 결합되어 있는 적어도 하나의 병원체 인식(PR) 수용체 효능제를 포함하고, 상기 미세입자가 병원체와 같은 크기 범위이거나 병원체보다 작은 크기인 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 피험체의 면역 반응을 유도하기 위해 면역학적 활성 조성물을 생체내 전달하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 관점은 미세입자와 결합되어 있는 적어도 하나의 병원체 인식(PR) 수용체 효능제와 적어도 하나의 면역 활성 항원 에피토프를 포함하고, 상기 미세입자가 병원체와 같은 크기 범위이거나 병원체보다 작은 크기인 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 피험체의 면역 반응을 유도하기 위해 면역학적 활성 조성물을 생체내 전달하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 관점은 미세입자와 결합되어 있는 PR 수용체 효능제의 혼합물과 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프를 포함하고, 상기 미세입자가 병원체와 같은 크기 범위이거나 병원체보다 작은 크기인 조성물의 면역학적 유효량을 단일 용량으로 또는 다회 용량으로 투여하는 단계를 포함하여 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 면역 반응이 Th1 또는 Th2 반응 또는 이의 조합 반응을 포함하는 것인 방법이다.
본 발명의 또 다른 관점은 미세입자와 결합되어 있는 PR 수용체 효능제의 혼합물 및 면역학적 회피 기전에 관여하는 항원을 제외한 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프를 포함하고, 상기 미세입자가 병원체와 같은 크기 범위이거나 병원체보다 작은 크기인 조성물의 면역학적 유효량을 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여하는 단계를 포함하여, 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법이다.
본 발명에 따른 투여 또는 전달 방법에 있어서, 조성물의 투여는 점막 경로, 비경구 경로 또는 피부 경로를 통해 일어날 수 있다. 다른 투여 경로가 대체 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 면역을 유도하는 방법에서, 일반적으로 면역 반응은 병원성 미생물 위에 글리코사미노글리칸 결합 인자를 방해한다.
또는, 본 발명에 따른 조성물은 면역학적 내성을 유도하는 방법에 사용될 수 있다. 면역학적 활성제에 대한 내성을 유도하는 방법은 미세입자에 결합되어 있는 PRR 효능제의 혼합물과 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프를 포함하고 상기 미세입자가 병원체와 같은 크기 범위이거나 병원체보다 작은 크기인 조성물의 면역학적 유효량을 투여하고, 면역 반응이 면역 기능 또는 면역 회피의 조절 반응 또는 억제조절의 유도를 포함하는 방법이다. 조성물은 지질 함유 잔기를 보유한 면역 활성 항원 에피토프를 포함할 수 있다. 면역학적 활성 지질 함유 잔기는 면역 활성 항원 에피토프와 무관하게 미세입자에 부착될 수 있다. 면역학적 활성 지질 함유 잔기는 탄수화물 구성체를 보유할 수 있고, 이 탄수화물 구성체는 N-당화의 결과물일 수 있다. 면역 활성 항원 에피토프는 아스파라긴, 트레오닌 및 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 모티프를 포함할 수 있고, 이 모티프는 Asp-X-Ser 또는 Asp-X-Thr 모티프이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.
이하, 명세서, 첨부되는 청구의 범위 및 부속 도면을 참고로 하여 본 발명이 더 상세히 설명될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 미세입자 담체 조성물에 사용하기에 적합한 아가로스 미세입자(실시예 1)의 입자 분포를 보여주는 그래프이다;
도 2는 펩티도글리칸(PepG) 처리 후(백색 막대), 또는 세균 CpG DNA(bactDNA) 처리 후(흑색 막대) 또는 단독 첨가했을 때와 같은 농도를 동시에 처리한 후(교차 평행선이 그어진 막대)의 PBMC에 의한 TNF-α의 분비(A) 또는 조직 인자의 분비(B)를 보여주는 그래프로서, P 및 D 다음의 숫자는 각각 PepG 및 bactDNA의 농도(㎍/ml)를 각각 나타내고, 좌측에서 우측으로 P3+D15, P3+D5, P3+D1.5, P1+D15, P1+D5, P1+D1.5, P0.3+D15, P0.3+D5 및 P0.3+D1.5이다;
도 3은 Con-A 제거된 항원 또는 과요오드산나트륨 처리된 항원과 함께 다양한 조합의 TLR2, TLR3, TLR4 및 TLR9 효능제(회색 막대, TNF-αx100, 흑색 막대, IL-10)를 가지고 다양한 방식으로 제조한 입자에 의한 다른 Th1 및 Th2 반응의 유도를 보여주는 그래프이다;
도 4는 도 3과 다른 방식으로 제조된 입자로 처리된 단핵구의 TNF-α/IL-10 비를 보여주는 그래프이다;
도 5는 미세입자 제조물에 노출 후 수지상 세포에서의 MHC-II 및 CD86의 유도를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 면역학적 활성 조성물, 특정 세포 집단에 대한 분자를 표적화하고 동물 모델에서의 반응을 유도하는 방법, 및 피험체 조성물의 생산 방법을 개시한다.
백신이 현재 이용가능하지 않거나 또는 비효과적인 병원체에 대한 보호용 뿐만 아니라 다수의 질환 또는 상태에 대한 더욱 효과적인 면역 조절제 및 전달 매개제(vehicle)를 생산할 필요성이 있다.
약독화, 사멸 또는 유전자 변형된 병원체를 이용하는 통상적인 백신은 병원체의 분자 패턴과 면역계의 병원체 인식 수용체(PRR)와의 상호작용이 결정하는 면역 반응에 국한되어 있다. 만성 감염을 확립시킬 수 있는 성공적인 병원체는 체내 면역 반응을 회피하게 하는 분자 패턴을 보유하지만, 인플루엔자 바이러스와 같은 여타 병원체는 돌연변이(항원 변위 및 소폭변이)를 이용하여 항체 생산과 같은 회피를 초래하고, 그 결과 자신을 유지하기 위해 바이러스 흡수를 증가시킨다.
일반적으로, 병원체 특이적 항체는 다양한 방식으로 감염 조절에 중요한 역할을 한다. 하지만, 몇몇 경우에는 특이적 항체의 존재가 병원체에 유리할 수 있다. 이러한 활성은 감염의 항체 의존적 증강작용(ADE)으로 알려져 있다. 감염의 ADE는 병원체 특이적 항체가 병원체의 유입을 증강시키고, 몇몇 경우에는 Fc 수용체와의 상호작용을 통해 단핵구/대식세포 및 과립구 세포로의 바이러스와 같은 병원체의 복제를 증강시키는 현상이다. 이러한 현상은 공중 보건 및 수의 보건상 중요성이 있는 다수의 과 및 속을 나타내는 병원체들에서 시험관내 및 생체내 실험을 통해 보고되었다. 이러한 병원체, 예컨대 엠. 갈리셉티쿰(M. gallisepticum)은 대식세포에서의 우선 복제, 지속성을 확립하는 능력 및 항원 다양성과 같은 약간의 공통 특징을 공유한다.
일부 병원체에서, 감염의 ADE는 백신접종에 의한 질병 억제에 큰 문제가 되고 있다. 결과적으로, ADE의 위험이 최소이거나 위험이 없는 백신 개발을 위해 많은 시도가 이루어졌다. ADE 또는 중화와 관련된 병원체 에피토프의 동정은 이러한 목적에 중요하다. 또한, ADE를 통해 병원체가 유입된 후의 세포 변화의 명확한 이해는 효과적인 중재 시술의 개발에 중요해지고 있다. 하지만, ADE의 기전은 여전히 더 분명한 이해가 필요하다. 따라서, 이러한 병원체에 대한 유효 백신의 개발은 어려운 상황이다. 따라서, 본 발명자들은 회피 없이 보호 면역을 유도하기 위해, 제형으로부터 제거할 필요가 있는 모티프 및 중요한 세포 부착 기전을 방해하여 보호 면역에 중요한 모티프를 동정했다. 또한, 본 발명자들은 회피 또는 내성을 유도하는 모티프를 동정했다.
본 발명자들은 천연 아가로스와 같은 다당류로 이루어진 담체를 이용하여 특정 세포에 대한 면역학적 활성 분자를 표적화하고, 이로써 선천적 면역 반응은 물론 후천적 면역 반응의 면역 조절 및 감염 예방을 달성할 수 있는 가능성을 조사했다. 본 발명은 또한 다른 입자에 의해 다른 수용체가 표적화될 수 있는 다른 용도들에도 분명하게 사용될 수 있다. 아가로스는 생체분해성이고 포유동물 세포와 화합성인 것으로 입증된 D-갈락토스 중합체인 천연 다당류라는 장점이 있다. 비경구 투여된 아가로스 미세입자는 약한 대식세포 활성화능 및 수산화알루미늄과 비슷한 보강제 성질을 나타내는 것으로 밝혀져 있다(Gronlund H. et al., Carbohydrate-based particles: a neu adjuvant for allergen-specific immunotherapy. Immunology 2002 107, 523-529).
최종 사용자 측면에서, 백신 산물은 동결 보관될 필요가 없고 장기간 보관기간을 유지하는 것이 중요하다. 아가로스 입자는 이러한 조건을 만족시킬 수 있다. 또한, 백신 또는 약물 전달 매개제의 투여는 가능한 한 간단해야만 한다. 이것은 주사 없이 점막, 특히 경구 투여가능한 조성물이 비경구 조성물에 비해 유리한 이유이다. 하지만, 경구 용도들은 소화계 효과로 인한 안정성 문제가 골칫거리이다.
본 발명자들은 다공성 아가로스 매트릭스에 커플링된 항원이 GI 관 내부에서의 분해로부터 보호될 수 있을지 모른다는 생각을 했다. 리간드와 입자 사이의 결합은 같은 항원 처리 세포가 보강제와 항원을 흡수하게 해준다. 또한, 아가로스 미세입자(<5㎛)의 크기는 이 입자가 파이어판(PP)으로 통과하기에 적당한 정도가 되게 할 수 있다.
보강제로서 메틸화되지 않은 CpG DNA, 폴리 I:C 또는 MALP-2의 효과는 항원과 공동 고정화되는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 모티프가 적당한 PAMP 수용체를 발현하는 여러 APC에 의한 점막 표면에서의 면역학적 활성 조성물의 흡수를 표적화할 수 있음을 암시한다.
각종 DC 아군 및 다른 면역 적격 세포는 다른 패턴 인식 수용체를 보유한다. 리간드 조합의 사용은 적당한 세포 아군의 표적화가 달성될 수 있게 해준다.
따라서, 본 발명자들은 수용체 효능제(PAMP 수용체) 분자, 예컨대 Toll 유사 수용체(TLR), 렉틴 수용체 또는 NOD 수용체 효능제가 생체활성 분자와 함께 담체에 공동 고정화되어야 한다고 생각했다. 또한, 본 발명자들은 면역학적 활성 조성물의 부착 성질, 표적화 및 흡수가 설계된 "합성 미생물"에 면역계의 노출 시 개선될 수 있고, 이것은 그러한 면역 조절인자의 표적화된 흡수 및 효능을 크게 증강시킬 수 있으며, 맞춤 면역 반응이 달성될 수 있을 것으로 생각했다. 맞춤 표적화는 또한 그와 같이 설계된 면역 조절인자의 약동학을 향상시키고 가능한 부작용을 감소시킬 수 있을 것이다.
Toll 유사 수용체(TLR) 및 NOD, 렉틴 수용체 등은 미생물 유래 분자의 병원체 패턴 인식 수용체이다. 이 수용체들은 선천적 및 후천적 면역계의 주요 센서이다. 현재 동정된 TLR에는 10가지(TLR1-10)가 있다. 각 TLR은 1종 이상의 특이적 리간드를 인식하고 시그널 전달을 수행한다. 새로 발견된 수용체와 수용체 상호작용은 항상 세균 생성물에 의한 세포 활성화에 관여하는 것으로 발견된다. 이러한 수용체 사이의 협력이 리간드 식별과 반응의 특이성을 구별하는 역할을 한다는 증거가 쌓이고 있다. 또한, 지질 부교(raft)에 수용체의 클러스터링은 리간드 결합 후 발견되었다. 이러한 연구들은 또한 골수양 분화 주 반응 유전자 88(MyD88) 의존적 및 독립적 경로를 밝혀냈다.
각 TLR은 세포외 류신 풍부 도메인과 Toll/IL-1R 상동성(TIR) 도메인으로 불리는 보존 영역을 함유하는 세포내 부분을 보유하여, 활성화 시 MyD88 단백질을 MyD88 의존적 형태의 시그널링으로 MyD88 단백질이 모집되게 하는 타입 I 경막 수용체이다. 또한, 세포내 그램 양성균 펩티도글리칸 감지(sensing) 등의 경우처럼, 일부 미생물 병원체는 NOD-1, NOD-2 및 TLR의 류신 풍부 도메인을 이용하여 세포내이입되어, 세포질 내에서 직접 활성을 발휘할 수 있다. 하지만, 이러한 다양한 경로는 NF-κB의 핵 전위, 염증성 유전자의 활성화 및 여러 사이토킨의 생산쪽으로 집중되는 것으로 보인다. TLR 7, 8 및 9의 결합은 IFN-α 및 IL-12p70을 초래하고, 교차 제시/CTL과 함께 강한 Th1 반응을 유도해낸다. TLR3의 활성화는 INF-α 및 Th1 반응을 초래하지만, TLR5는 Th1 내지 IL-12p70을 유도하고 TLR4는 Th1 내지 IL-12p70 및 INF-α 생산을 유도하며, 모두 교차 제시/CTL을 유도한다. 하지만, TLR 1, 2 및 6의 결합은 높은 IL-10 수준 및 일부 다른 PRR(병원체 인식 수용체)과 함께 약한 IL-12p70 반응을 유도하고, 예컨대 DC-SIGN은 Th0/Th2/TReg 반응을 초래한다.
TLR-4는 이러한 수용체과로 가장 널리 연구되었다. TLR-4는 그램음성균 유래의 리포폴리사카라이드와 그램양성균 유래의 리포테이코산을 인식하는 반면, TLR-2는 세균 지질단백질/지질펩타이드, 마이코박테리아 또는 마이코플라스마 성분에 결합하는 것으로 알려져 있다.
Lps2 돌연변이는 TLR-3 및 TLR-4 MyD88 독립적 경로에서 TIR 내성 어뎁터 단백질(TIRAP)의 역할을 확인시켜 주었다. TIRAP는 TLR-2 및 TLR-4 하류의 다른 세포내 역할자로서 발견되었다. 또한, MyD88 독립적 경로는 DC의 LPS 매개 성숙 조절에 관여하는 것으로 밝혀져 있다. TLR-1 및 TLR-6은 TLR-2 수용체와 이종이량체의 다른 부분으로서 작용하는 것으로 알려져 있다.
TLR-3은 이본쇄 바이러스 RNA를 인식한다. TLR-5는 그램음성균 및 그램양성균 유래의 플라겔린에 대한 수용체로서 동정되었고, MyD88을 통해 시그널화되었다. TLR-7은 일본쇄 RNA 및 작은 합성 면역 변경인자, 예컨대 이미퀴모드, R-848, 브로피리민 및 록소리빈에 반응한다. TLR-9는 비메틸화된 세균 DNA를 검출하는 것으로 알려져 있다. CpG DNA 올리고뉴클레오타이드는 백신 개발을 위해 보강제로서 작용하고 사람 수지상 세포를 자극하는 능력에 대해 현재 연구 중이다.
TLR-4, TLR-7 및 TLR-9는 특히 백신 개발에 있어서 중요하다. 사람 TLR-8은 최근 일본쇄 RNA와 레시퀴모드(R-848)의 수용체로서 확인되었다. TLR-7, TLR8 및 TLR-9는 최근 이들의 리간드가 엔도솜/리소좀 구획에서 인식된다는 점에서 TLR 수용체과의 아군으로 생각된다고 제안된 바 있다.
C형(칼슘 의존적) 렉틴 수용체(CLR)는 또한 발현되어, 바이러스, 세균 및 다른 병원체의 표면 당단백질에서 일반적으로 발견되는 보존적 올리고사카라이드에 결합한다. DC에 의해 발현되는 CLR에는 만노스 수용체(CD206), DEC-205(CD205), 랑게린(CD207) 및 DC 특이적 세포간 부착 분자 3 포착 비인테그린(DC-SIGN; CD209)이 있다. 이러한 수용체들은 각종 DC 아군 및 다른 조직에서의 발현이 다를 뿐만 아니라, 다른 올리고사카라이드를 인식하여 상이한 리간드 간을 구별한다.
DC-SIGN은 다른 수용체가 수반되기도 하지만, 여러 바이러스, 예컨대 HIV, 에볼라 바이러스, CMV, 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스 및 세균, 예컨대 마이코박테리아에 결합하여 내재화시키는 44kDa 타입 II 경막 단백질이다. 또한, 다른 병원체들도 DC-SIGN과 상호작용할 수 있다. 이것은 ICAM-3을 통해 순수 T 세포 상호작용을 매개하는 데 있어서, 그리고 DC 특이적 ICAM-2 의존적 이동 과정을 매개하는 롤링 수용체로서의 DC의 기능에 매우 중요하다.
TLR과 다른 면역 인식 수용체 사이의 협동 작용도 기술된 바 있다. 이의 일 예는 덱틴-1 및 TLR2에 의한 염증 반응의 협동 측정이다. 효모 세포벽과 같은 복합 입자는 TLR2-TLR6, 덱틴-1 및 CD14를 비롯한 복수의 선천적 면역 수용체에 의해 인식된다. TLR2-TLR6 이종이량체는 NF-κB, 및 TNF-α와 같은 사이토킨 및 케모카인의 생산을 활성화시킨다. 덱틴-1은 세포벽의 α-글루칸을 인식하고 포식작용을 유발할 뿐만 아니라 NADPH 옥시다제에 의한 반응성 산소 생산을 활성화시킨다. 또한, 덱틴-1 시그널링은 TLR2-TLR6 시그널링과 조합하여 IL-12와 같은 특정 사이토킨의 생산을 증강시킨다.
TLR 수용체 사이 및 다른 수용체와의 협동작용 및 세포내 분자 하류 기전 사이의 상호작용으로 인해, 리포테이코산, CpG DNA 및 펩티도글리칸과 같은 미생물 병원성 화합물 사이의 상승 효과를 관찰하는 것은 놀라운 것이 아니며, 이것은 보강제로서 TLR 활성인자의 효과가 면역 조절인자의 개발과 함께 사용될 때 증폭될 수 있음을 암시한다.
생체활성 분자와 함께 적당한 PRR(병원체 인식 수용체) 리간드의 공동 고정화는 면역 반응의 표적화된 조절을 허용하여 강한 세포 반응(비교적 강한 Th1 영향 하에) 및/또는 체액 반응(Th2 영향 하에)을 유도한다. 또는, 다른 조성물로 면역화되었을 때에는 면역 내성이 수득될 수 있다.
특히, 확립된 체액 면역 또는 내성의 존재 하에서도 강한 세포 반응이 유도되는 것이 가능할 수도 있다. 이로써, 감염 및 미감염 숙주 모두에서 효과적인 면역 조절인자의 개발을 기대할 수 있다. 이러한 결과는 백신접종의 유용성을 크게 증강시킨다.
본 발명자들은 마이코플라스마 챌린지 전에 동물에게 백신을 접종했을 때 마이코플라스마 갈리셉티쿰의 감염성 균주에 대하여 상당한 보호성이 수득될 수 있는 병아리 모델 시스템을 확립시켰다. 또한, 예비감염된 동물에서 특징적인 병리학적 증후군의 반전이 관찰되는 바, 이러한 백신이 감염군을 치료하는데 효과적임을 시사한다. 이것은 미생물의 다양한 균주가 가진 광범위한 항생제 내성 및 가축에 예방적으로 항생제를 사용하게 하는 것에 대한 공중 및 규제 문제점으로 인해, 중요한 결과이다. 또한, 본 발명자들은 항원이 포함된 미세입자를 사용하는 문헌에 기술된 100㎍ 이상의 용량에 반해, 본 방법에 의해 방어 반응을 유도해내는 데에는 동물 1마리당 극소량의 항원(10㎍)만을 필요로 한다는 것을 발견했다(Brayden, D. 2001 European Journal of Pharmaceutical Sciences 14:183-189). 이것은 면역 조절인자 분자(들)이 동물의 위를 통과하는 동안에 분해되지 않고 효율적인 방식으로 표적화된 점막 면역 세포까지 전달된다는 것을 암시한다. 이것은 기존 면역학적 활성 조성물에 비해 유의적인 개선이다.
하지만, 단계적 확대 항원 용량 사용 시, 보호 효과의 저하가 관찰되었고, 이는 면역친화성 정제된 항원 중에 면역 억제 성분의 존재를 암시한다. DC-SIGN은 병원체의회피 기전에 연루되어 있다. DC-SIGN은 다량의 만노스 함유 지질 분자에 특이적인 C형 렉틴이다. 마이코플라스마의 막은 높은 비율의 지질로 구성되어 있고 여러 마이코플라스마들이 콘카나발린 A 친화성 수지에 결합하는 것으로 밝혀져 있고, 이것은 마이코플라스마 표면 위에 만노스의 존재를 시사한다. 본 발명자들은 정제된 단백질(들) 함유 말단 만노스 잔기 위에 전사후 리포만난 변형을 포함하는 전사후 N-당화 분자를 비롯한 면역학적 회피에 관여하는 분자가 이러한 효과를 매개하는 것으로 추정했다. 이에, 후속적으로 효소적 분해 또는 화학적 붕괴를 이용한 말단 만노스의 제거를 시도했다. 또한, 말단 만노실화된 지질단백질을 만노스 특이적 고정화 렉틴-콘카나발린 A(ConA) 칼럼 위에 흡착시켰다.
ConA 칼럼은 정제된 항원의 성분의 약 1/3을 보유했고, 이 항원으로 제조된 백신은 최고의 보호 효과 및 항원 농도 증가에 따라 직선 용량 반응을 나타냈다. 한편, ConA 칼럼에서 회수된 항원은 내부 기관에서 매우 높은 수준의 병원체 존재가 발견된 동물에서 염증 반응을 억제시켰다. 이러한 엠.갈리셉티쿰의 만노실화된 성분은 이 병원체의 회피 기전에 관여하여, 병원체에 대한 내성 발생 및 면역 억제를 초래하는 것으로 보인다. 또한, 본 발명자들은 적당한 항원 특이들이 면역 반응을 보호 또는 내성쪽으로 이동시키는데 도움을 줄 수 있음을 입증했다. 이 발견은 본 발명자들의 추정을 확인시켜 주며, 리포만나 전사후 변형이 숙주의 병원체 내성을 유도할 수 있다는 고정화된 마이코플라스마 막을 이용한 관찰도 지지한다. 이러한 이해는 이제 기존 면역 반응을 억제하거나 잠재적으로 내성을 유도하는 성질이 있는 면역 조절성 미세입자를 제조하는데 이용될 수 있다. 또한, 항원의 지질 전사후 변형은 병원체에 대한 내성을 발생시키는데 관여한다. 따라서, 효능적인 것으로 입증된 정제된 항원의 탈아실화를 시도했고, 이로써 마이코플라스마의 병리기전(pathomechanism)에서 지질의 역할을 확인했다.
이러한 실험들의 주요 결론은 천연 단백질의 분석 유래의 에피토프 백신이 보호 면역을 획득하고자 한다면 당화 및/또는 지질화(Asn, Thr, Ser)를 일으킬 수 있는 아미노산이 풍부한 에피토프를 함유하지 않아야 하지만, 이러한 아미노산 모티프들을 함유하는 리간드는 내성을 유도하는데 사용될 수 있다는 것이다. 이것은 본 발명에 따른 조성물 및 방법의 다중 용도를 제공한다.
이후 연구에서 본 발명자들은 보호에 주요 역할을 하는 항원 에피토프를 동정하기 위해 백신접종하여 보호된 동물 유래의 혈액과 혈청을 사용했다. 이로써, 마이코플라스마의 대량 생산뿐만 아니라 항원 단백질의 정제가 많은 용도들에서 엄청난 비용을 발생시킬 수 있는 바, 에피토프 기반 백신의 과학적 근거를 밝혀내는 데 집중했다. 이전 연구에서 본 발명자들은 다양한 마이코플라스마가 헤파린 및 헤파린 유사체에 결합할 수 있음을 밝힌 바 있다(Szathmary, S. et al.: Binding of mycoplasmas to solid phase adsorbents. Acta Vet Hung 2005, 53(3): 299-307). 글리코사미노글리칸(GAG)은 포유동물 세포의 표면에서 발현되고, 병원체 표면 상의 글리코사미노글리칸 결합 단백질은 표적 세포에 대한 부착을 매개한다(Wadstrom T, Ljungh A: Glycosaminoglycan-binding microbial proteins in tissue adhesion and invasion: key events in microbial pathogenicity. J Med Microbial 1999, 48(3):223-233). 일정 영역에 주로 염기성 아미노산을 특징으로 하는 여러 타입의 콘센서스 서열이 보고되었다: XBBXBX, XBBBXXBX, BBXXBBBXXBB, BBBXXB, BXBXB, BBB1 BXBXXXBXB, 또는 BXBXXXXXBXB, 여기서 B는 염기성 아미노산이고 X는 임의의 다른 아미노산이다. 이를 조사한 다른 이유는 선형 염기성 모티프가 병원성의 기전에 관여하기 때문이다. 이 서열들은 아마도 병원체의 점막 유입 기전에 최초 단계로서 작용하는 부착에 필수적이다. 따라서, 이 능력의 중화는 감염을 방지할 수 있고, 아마도 각종 병원성 미생물에 대한 광범위한 치료법의 개발을 제공할 것이다. 이러한 가능성은 백신 개발의 기반으로서 종래 인식된 적이 없었다. 본 발명자들은 GAG 결합 도메인에 인접하거나 입체적으로 가까운 항원 에피토프가 중화될 수 있음을 추정하고, 이러한 결합 부위를 중화성 에피토프에 혼입시킬 수 있다는 가능성을 제기했다.
따라서, 본 발명자들은 헤파린 액티겔 수지(Sterogene Bioseparations, Inc., Carlsbad, CA) 상의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 엠.갈리셉티쿰으로부터 헤파린 결합 단백질의 분리를 시도했다. 이어서, 본 발명자들은 엠.갈리셉티쿰에 대한 백신접종된 병아리에서 수득한 중화성 혈청으로부터 IgG를 정제했다. 정제된 IgG는 활성화된 수지 액티겔 ALD(Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA)에 고정시키고, 분리된 헤파린 결합 단백질을 칼럼에 흡착시켰다. 결합된 단백질은 칼럼에 트립신을 첨가하여 분해하고, 헤파린 결합 서열을 포함하는 면역원성 에피토프를 함유한 펩타이드 단편을 용출시켜 MALDI-MS로 분석하여 서열 정보를 수득했다. 이러한 항원 에피토프 또는 이러한 에피토프들에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 정제한 IgG는 생체내 투여시 감염된 숙주에 보호 면역을 부여할 수 있다. 대안적으로, 트립신 대신에 당업계에 공지된 다른 단백분해 효소, 예컨대 키모트립신, 엘라스타제, 브로멜라인, V-8 프로테아제, 펩신 및 써모리신을 사용할 수도 있다.
병행 실험으로 분리된 헤파린 결합 단백질을 헤파린 액티겔에 재흡착시키고 결합된 단백질의 트립신 분해를 유사하게 수행했다. 이 수지로부터 회수한 단편을 또한 서열 정보를 위해 MALDI-MS로 분석했다.
또한, 보체 시스템을 이용하는 항체매개 포식작용(opso-phagocytosis)에 관여하는 에피토프를 동정하는 것이 중요하다. 구체적으로, 보체 고정화 항체는 고정화된 C1q 칼럼을 이용하여 백신접종된 병아리 혈청으로부터 정제하고, 상기 항체를 이용하여 이러한 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 동정했다. 정제된 IgG를 그 다음 고정시키고 미정제 MG 용해물로부터 단백질 항원을 포획하는데 사용했다. 결합된 단백질을 칼럼에 있는 동안 프로테아제로 분해하고, 에피토프 서열을 용출시킨 뒤, MALDI-MS로 분석하여 서열 정보를 수득했다. 이러한 항원 에피토프 또는 이 에피토프에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 정제한 IgG도 역시 생체내 투여 시 감염된 숙주에 보호 면역을 부여할 수 있다.
현재 미생물 기반 백신 일부가 보유한 주요 문제점은 병원체 자체에 존재하는 PRR 효능제의 혼합물과 함께 면역 자극성 에피토프 및 면역 억제성 에피토프의 공동투여로서, 이 중 일부는 Th1 반응을, 일부는 Th2 반응 또는 Treg 반응을 유도한다. 이 백신들은 숙주에서 각종 감염성 인자의 지속을 이기지 못하고, 임상적 질환의 부재 하에 "병원체 제조공장"으로 변환될 수 있다. 이 시도는 특히 병원체에 선택압을 가할 수 있고 더욱 독성인 균주의 개발을 유도할 수 있다. 이와 대조적으로, 본 발명자들의 전략은 적당한 면역 반응 유도성 PRR 효능제 분자와 함께, 면역계로부터 병원체의 회피에 관여하는 에피토프 및/또는 PRR 효능제를 제외한 면역 자극성 에피토프만을 함유하는 합성 "병원체-모방" 미세입자를 제조하는 것이었다. 이와 같이 동정된 에피토프들은 또한 특정 항원 에피토프 펩타이드 간에 단일 멀티펩타이드 전달 접목 서열 또는 링커로 결합시킬 수 있다. 이러한 시도로 인해, 지속적인 병원체에 의해 유발된 왜곡된 면역 반응이 극복되고, 감염성 인자의 근절을 유도하는 세포 및 체액 면역 반응의 균형적 혼합이 발생된다. 회피 에피토프 또는 PRR 효능제는 원하지 않는 자가면역 반응을 극복하는데 필요한 경우, 내성 발생 목적으로 이용될 수 있다.
일반적으로, 생물학적 활성 분자는 면역계에서 활동적인 분자로서, 예컨대 면역 기능을 조절하는 면역원 또는 다른 분자, 구체적으로 면역 자극인자, 면역 억제인자 또는 면역학적 내성을 유도하는 인자이다.
생체활성 분자는 미세입자에 비공유 또는 공유 부착될 수 있다. 공유 부착하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 문헌(Elsevier, Amsterdam, 1985, pp. 283-289, in S. S. Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking" (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993), in T. E. Creighton, ed., "Protein Function: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 1989), and in GT. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Academic Press, San Diego, 1996)(이 문헌 모두 본원에 참고인용됨)에 기술되어 있다. 일반적으로, 미세입자가 아가로스인 경우, 생체활성 분자는 아가로스의 하이드록시 기에 부착한다. 일반적으로, 다당류의 하이드록시 잔기는, 후속 친핵 치환 반응에 양호한 이탈기를 함유하는 중간 반응성 유도체를 형성하는 특정 화합물에 의해 활성화될 수 있다. 이와 같이 아민(예, 단백질 또는 펩타이드 중의 리신 기)과 같은 친핵체와 상기 활성화된 하이드록시의 반응은 생체활성 분자를 아가로스에 가교시키는 안정한 공유 결합을 초래한다. 적당한 시약에는 카르보닐디이미다졸, 클로로포르메이트 유도체, 트레실 클로라이드, 토실 클로라이드, 시아노겐 브로마이드, 디비닐설폰, 시아누릭 클로라이드 및 비스-에폭사이드가 있다. 대안적으로, 아가로스와 같은 탄수화물의 하이드록시 기는 클로로아세트산에 의해 변형되어 카르복실레이트 작용기를 형성할 수 있다. 또 다른 대안으로서, 아민 작용기가 다당류 위에 형성될 수 있고, 탄수화물 분자의 환원성 말단 또는 생성된 알데하이드는 사슬 길이가 짧은(즉, 보통 사슬내 탄소원자가 약 6개 미만) 디아민 화합물과 반응시켜 후속 접합 반응에 사용될 수 있는 짧은 알킬아민 스페이서를 생산한다. 하이드라지드 기는 비스 하이드라지드 화합물을 이용하여 유사하게 제조할 수 있다. 수득되는 작용기는 그 다음 다양한 반응을 통해 생체활성 분자에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 카르복시기가 생성된다면, 이는 단백질 또는 펩타이드에 혼합 무수법, 디시클로헥실카르보디이미드를 이용한 카르보디이미드법, 및 N-하이드록시숙신이미드 에스테르법을 통해 접합시킬 수 있다. 예컨대 카르보디이미드, 톨릴렌-2,4-디이소시아네이트 또는 말레미드 화합물, 특히 말레미드의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 유도체를 포함하는 지방족 아민은 다양한 방법에 의해 단백질 또는 펩타이드에 접합시킬 수 있다. 이러한 화합물의 일 예는 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시산이다. 다른 예는 m-말리이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르이다. 사용될 수 있는 또 다른 시약은 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트이다. 또한, 디메틸피멜리미데이트, 디메틸아디피미데이트 또는 디메틸수베리미데이트와 같은 이작용기성 에스테르는 아미노기 함유 잔기를 단백질에 커플링시키는데 사용될 수 있다. 펩타이드, 단백질 및 탄수화물을 비롯한 화합물 및 여타 화합물을 고체 지지체에 공유 결합시키는 다른 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 비공유 부착 방법은 상호작용을 안정화시킬 수 있는 수소 결합, 소수성 결합 및 염 결합과 같은 다수의 비공유 상호작용에 따라 달라진다.
일반적으로, 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 재조합 펩타이드, 재조합 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산, 당단백질 또는 당지질 중 하나 이상이다. 또한, 이들의 혼합물은 복수의 생물학적 활성 분자를 같은 미세입자에 부착시키기 위해 사용할 수 있다.
면역 활성 분자가 펩타이드 또는 단백질인 경우에, 면역 조절성 전사후 변형을 일으킨 것일 수 있다. 일반적으로, 이들은 당 및/또는 지질 잔기를 수반한다. 일 예는 말단 만노실화이다. 하지만, 다른 당 잔기를 단백질이나 펩타이드에 첨가할 수도 있다. 대안적으로, 면역활성 분자의 제조 시, 실질적으로 말단 만노실화된 분자가 제거되도록 면역 활성 분자를 분리할 수 있다. 이러한 제거는 과요오드산염 산화와 같은 산화 단계, 통상 가수분해 효소를 이용하는 효소 처리, 또는 당 특이적 친화성 결합 및 차후의 제거된 분획의 정제를 통해 수행될 수 있다. 말단 만노실 잔기를 제거하는 또 다른 방법도 역시 당업계에 공지되어 있다.
이와 유사하게, 면역 활성 분자의 제조 시 지질 함유 면역 조절성 전사후 잔기가 제거되도록 면역 활성 분자가 분리될 수 있다. 이것은 화학적 가수분해 또는 펜타데칸산과의 공침전에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 지질 함유 면역 조절성 전사후 잔기는 하전된 세제를 이용하여 차단할 수 있다. 특히 적합한 세제는 세틸 트리메틸 암모늄 클로라이드이다. 이와 유사한 4급 암모늄 계면활성도 대체 사용할 수 있다.
선택적으로 존재하는 표적 분자는 일반적으로 병원체 패턴 인식 분자이다. 1가지 대안예에 따르면, 병원체 패턴 인식 분자는 TLR 수용체 효능제, 예컨대 TLR1 수용체 효능제, TLR2 수용체 효능제, TLR3 수용체 효능제, TLR4 수용체 효능제, TLR5 수용체 효능제, TLR6 수용체 효능제, TLR7 수용체 효능제, TLR8 수용체 효능제 또는 TLR9 수용체 효능제이다. 또 다른 대안예에 따르면, 병원체 패턴 인식 분자는 NOD 단백질 효능제, 예컨대 NOD-1 효능제 또는 NOD-2 효능제이다. 통상, NOD 단백질 효능제는 세균 펩티도글리칸 또는 세균 펩티도글리칸의 유도체이다.
하나 이상의 생물학적 활성 분자, 예컨대 면역 활성 분자, 및 하나 이상의 병원체 패턴 인식 분자(존재한다면)는 조성물에 포함될 수 있고, 미세입자에 안정하게 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 피험체에게 전술한 조성물의 면역학적 유효량을 투여하여 피험체의 면역 반응을 유도하는 방법이다. 통상, 조성물은 추가로 표적 분자, 예컨대 병원체 패턴 인식 분자를 포함한다. 하나 이상의 면역 활성 분자와 하나 이상의 병원체 패턴 인식 분자는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 전술한 조성물의 유효량을 활성 면역계를 보유한 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 면역학적 활성 조성물의 생체내 전달 방법이다. 다시, 하나 이상의 면역 활성 분자와 하나 이상의 병원체 패턴 인식 분자가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 면역학적 활성 조성물의 생체내 전달은 점막 표면, 비경구 경로, 피부 경로 또는 피하 경로를 통해 이루어질 수 있다. 다른 투여 경로도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 피험체 중의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 피험체에게 전술한 미세입자에 안정하게 결합된 TLR 수용체 효능제의 혼합물과 하나 이상의 면역학적 활성 분자(즉, 면역원)를 함유하는 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법이다. 보호 면역 반응은 Th1 또는 Th2 반응 또는 Th1과 Th2 반응의 조합을 포함한다. 투여는 단일 용량 또는 다회 용량으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 피험체 중의 면역학적 활성제에 대한 내성을 유도하기 위해 피험체에게 미세입자에 안정하게 결합된 NOD 단백질 효능제와 TLR 수용체 효능제의 혼합물과 하나 이상의 면역학적 활성 분자(즉, 면역원)를 함유하는 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 면역학적 활성제에 대한 내성을 유도하는 방법이다. 여기서, 면역학적 활성 분자는 지질 함유 잔기를 보유할 수 있고, 이 잔기는 면역학적 활성 분자의 나머지와 상관없이 미세입자에 부착될 수 있다. 대안적으로, 면역학적 활성 지질 함유 잔기는 추가로 탄수화물 기를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물을 이용한 표준 약학 절차, 예컨대 LD50(개체 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(개체 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 측정하여 확인할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, LD50/ED50로 표현될 수 있다. 치료 지수가 큰 화합물이 바람직하다. 이러한 세포 배양 분석과 동물 연구에서 수득된 데이터는 사람용 또는 다른 동물용의 투여량 범위를 조제하는데 사용될 수 있다. 이러한 조성물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 혈행 농도의 범위 내인 것이 바람직하다. 이 범위 내에서 투여량은 사용된 투약 형태 및 이용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 임의의 조성물에서 치료적 유효 용량은 먼저 세포 배양 분석으로부터 산정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 세포 배양물에서 측정된 IC50(즉, 측정되는 면역계 매개변수에 미치는 조성물의 효과에 대한 최대 반응의 절반에 이르는 검사 조성물의 농도)을 포함하는 혈행 혈장 농도 범위에 이르도록 동물 모델에서 조제될 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 사람에게 유용한 용량을 더욱 정확하게 측정할 수 있다. 혈장 중의 수준은 예컨대 HPLC로 측정할 수 있다.
정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태를 진찰한 각 의사가 선택할 수 있다(예컨대, Fingl, et al., in The Phamacological Basis for Therapeutics, 1975, Ch.1 p.1). 담당 의사라면, 독성 또는 기관 기능이상으로 인해 투여를 중지하거나 중단하거나 조정할 시기와 방법을 잘 알 것이다. 역으로, 담당 의사는 임상 반응이 적당하지 않다면(독성 제외) 더 높은 수준으로 치료 조정하는 방법을 잘 알고 있을 것이다. 당해 장애의 치료 시 투여된 용량의 크기는 치료되는 상태의 병도 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 상태의 병도는 예컨대 부분적으로 표준 예후 평가법으로 평가할 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 횟수도 각 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 앞에서 논의한 것과 비슷한 프로그램은 수의용 약물에도 사용할 수 있다.
본 발명의 실시를 위해 본 명세서에 설명한 조성물을 전신 투여에 적합한 용량으로 조제하는 약제학적으로 허용되는 담체의 용도는 본 발명의 범주에 속하는 것이다. 담체 및 적당한 제조 실례의 적당한 선택에 따라, 본 발명의 조성물, 특히 용액제로 조제된 조성물은 정맥내 주사와 같은 비경구로 투여될 수 있다. 조성물은 점막 또는 피하 투여에 적합한 투여량으로 당업계에 공지된 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 쉽게 조제할 수 있다.
이하 본 발명은 실시예를 통해 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
미세입자의 선별
1 내지 10㎛ 범위의 아가로스 미세입자는 제조원[Sterogene Bioseparations, Inc.(Carlsbad, CA)]으로부터 제조되었고 Satum DigiSizer 5200(Micromeritis Instrument Corp)을 사용하여 시험되었다. 도 1에 나타낸 데이타는 입자 분포에 있어서 75%가 5㎛ 미만이고 24%가 5 내지 10㎛이고 1%가 10㎛ 초과임을 보여준다.
실시예 2
마이코플라스마 갈리셉티쿰(MG)의 배양
0.1ml의 마이코플라스마 성장 배지에 동결건조된 형태의 엠. 갈리셉티쿰(K781R-16P)을 첨가하고 37℃에서 배양기의 배양 배지 1.5mL에 넣는다. 마이코플라스마 성장을 색상 변화(분홍색에서 오렌지 또는 황색으로) 또는 한천 플레이트상에 도말하고 콜로니를 조사하여 모니터하였다. 감염된 배양물을 새로운 배지에 이전시킴에 의해 거대 용적(10 내지 15L)의 마이코플라스마 배양물을 증식시켰다. 이어서, 배양물을 30분동안 5500rpm에서 원심분리하였다. 상등액의 OD280이 0.2 미만일때까지 펠렛을 PBS로 세척하였다(5500rpm에서 20분). 펠렛을 20ml의 PBS에 재현탁시켰다.
실시예 3
MG 항원 정제를 위한 면역친화성 칼럼의 제조
단계 1:
유리 비이커중의 항-엠. 갈리셉티쿰 닭 혈청 64ml에 128mL의 탈이온(DI)수를 첨가하였다. 용액 pH를 빙초산을 사용하여 4.5로 조정하였다. 용액을 급하게 교반시키되 기포 생성이나 튀기지 않도록 주의한다. CAP-8 침전 용액(Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA)을 10분동안 강하게 진탕시켰다. 이어서, 64ml의 CAP-8 침전 용액을 측정하고 1 내지 2분동안 교반시킴에 의해 생성된 보르텍스의 측벽으로 서서히 가하였다. 이어서 교반 속도를 감소시켜 단지 용액만이 움직이도록 하였다. 실온에서 용액을 30분동안 교반시킴에 이어서 적당한 크기의 원심분리 튜브로 옮기고 침전물을 5,500 rpm에서 15분동안 회전시켜 침강시켰다. 상등액을 용기에 버리고 펠렛을 20mM Na 아세테이트, pH 4.8 완충액으로 1회 세척하였다. 상등액을 0.22㎛ 주사기 필터를 사용하여 여과시켰다.
단계 2:
SP 쓰루풋 플러스 양이온 교환 수지(Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA)를 3 베드 용적의 1M NaOH중에 현탁시킴에 이어서 탈이온수로 세척하여 중화시킨다. 이어서, 10 베드 용적의 0.5M 나트륨 아세테이트(pH4.8)으로 세척함에 이어서 20 베드 용적의 탈이온수로 세척하였다. 수지를 15베드 용적의 20mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 평형화시키고 20mM 아세테이트(pH 4.8) 팩킹 완충액을 사용함에 의해 칼럼에 충전시켰다. 단계 1의 상등액을 3ml/분의 유속으로 칼럼 상으로 로딩하고 칼럼을 20mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8) 완충액을 사용하여 세척하였다. 유동 통과 및 세척을 조합하였다. OD280을 20mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)에 대해 측정하였다. 칼럼을 50mM 인산나트륨, 300mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 용출시키고 용출물의 OD280을 측정하였다.
단계 3:
액티겔 ALD 활성화 수지(Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA) 20ml에 정제된 항-엠. 갈리셉티쿰 닭 IgG 용액을 10mg/ml로 첨가함에 이어서 10.5ml의 1M 나트륨 시아노보로하이드라이드(ALD Coupling Solution, Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA)를 첨가하였다. 현탁액을 2 내지 8℃에서 20시간동안 약하게 혼합함에 이어서 탈이온수로 광대하게 세척하였다. 수지를 pH 7.0의 PBS 및 2 내지 8℃에서 저장하였다.
실시예 4
MG 항원의 정제
단계 1:
세척된 20ml의 MG 농축물에, 0.2g의 메가-10 세제를 첨가하고 실온에서 20시간동안 혼합하였다. 20시간 항온처리 후, 1ml의 트리톤 X-100을 또한 현탁액에 첨가하고 실온에서 또 다른 시간동안 계속 혼합하였다. 이어서, 10분동안 5,000rpm에서 회전 침강시켰다. 상등액을 펠렛으로부터 분리하고 200ml의 PBS(pH 7.2)를 상등액에 첨가하였다. MG 단백질 용액을 5일동안 2 내지 8℃에서 방치하였다.
단계 2:
20ml의 베드 용적의 항-MG-닭 IgG-Actigel 칼럼을 3ml/분의 유속으로 5 베드 용적의 PBS(pH 7.2)로 평형화시켰다. MG-단백질 용액을 8 내지 15ml/분으로 칼럼상에 로딩하였다. 통류물(flow-through)을 별도의 병에 수거하였다. 칼럼을 8 내지 15ml/분의 유속에서 10 베드 용적의 PBS(pH 7.2)로 세척하고 이어서 동일한 유속에서 20 내지 40ml의 0.1M 시트르산으로 용출시켰다. 2M 트리스를 사용하여 용출물의 pH를 즉시 7.2로 조정하였다. 당해 정제를 칼럼 통류물을 사용하여 5회 이상 반복하여 모든 항원을 탈착시켰다. 모든 용출물을 배합하고 2 내지 8℃에서 분말 당을 갖는 투석 백중에서 밤새 농축시켰다. 농축된 용액을 2 내지 8℃에서 5L의 PBS(pH 7.2)에 대해 투석하였다. 브래드포드 단백질 분석을 수행하여 표준물로서 혈청 알부민을 사용하여 정제된 항원의 농도를 결정하였다.
실시예 5
활성화된 아가로스 미세입자
입자는 2가지 상이한 방법으로 활성화시켰다. 제1 활성화 방법은 리간드의 고도로 안정된 접착을 제공하는 시판되는 전매 특허의 알데하이드 연결 화학적 방법을 사용하여 제조원[Sterogene Bioseparations, Inc.(Carlsbad, CA)]에 의해 수행되었다. 당해 화학적 방법의 또 다른 잇점은 높은 재현성의 고정화이다. 이러한 전매 특허 알데하이드 화학적 방법은 다양한 리간드를 연속적으로 고정화시킨다.
또 다른 활성화는 시아노겐 브로마이드(CNBr) 활성화 방법을 사용하여 수행하였다. 간략하게, 30ml의 아가로스 미세입자에, 30ml의 2M 탄산나트륨 용액을 첨가하고 3 내지 5분동안 혼합 없이 빙욕조에 유지시켰다. 이어서, 1.5g의 CNBr을 칭량하고 9ml의 아세토니트릴에 용해시켰다. 즉시, CNBr 용액을 수지 혼합물에 첨가하고 2분동안 빙욕조상에서 강하게 혼합하였다. 이어서, 2℃에서 5분동안 4,500rpm에서 회전 침강시킴에 의해 20 베드 용적의 빙냉수로 세척하였다.
실시예 6
MG 항원의 미세입자로의 커플링
커플링 반응은 정제된 항원상의 아미노 그룹과 미세입자상의 알데하이드 그룹 또는 CNBr-활성화된 그룹간에 일어난다. 알데하이드 활성화된 입자가 사용되는 경우, 커플링은 실시예 3에 기재된 바와 같은 나트륨 시아노보로하이드라이드의 커플링 시약으로 매개되었다. 항원은 10ug/0.2ml 및 50ug/0.2ml의 미세입자 농도에서 고정화시켰다.
또 다른 커플링 반응에서, CNBr-활성화된 미세입자는 다음과 같이 동일한 항원 농도로 사용하였다. 15ml의 CNBr 활성화된 미세입자에, 정제된 MG 항원 용액을 pH 8.0에서 첨가하였다. 당해 용액을 20시간동안 2 내지 8℃에서 약하게 혼합하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를 20베드 용적의 탈이온수로 세척하였다. 커플링된 수지를 2 내지 8℃에서 LAL 물중에 저장하였다. 브래드포드 단백질 분석을 사용하여 상등액중에 미결합된 단백질을 측정하였다.
실시예 7
마이코플라스마 막의 제조 및 커플링
3.0ml의 농축된 마이코플라스마 항원에, 80ml의 오토클레이빙된 탈이온수를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 교반 막대와 함께 혼합하였다. 용액을 20분동안 5000rpm에서 원심분리하고 펠렛을 오토클레이빙된 물로 2회 세척하였다. 펠렛을 10ml의 PBS중에서 재구성하였다. 1.5ml의 CNBr 활성화된 미세입자에 pH 8에서 0.1M NaHCO3와 1:3으로 희석된 정제된 펠렛 0.5ml을 첨가하였다. 용액을 20시간동안 2 내지 8℃에서 약하게 혼합하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를 10베드 용적의 탈이온수로 세척하였다. 커플링된 수지를 2 내지 8℃에서 LAL 물중에 저장하였다. 브래드포드 단백질 분석을 사용하여 상등액중에 미결합된 단백질을 측정하였다.
실시예 8
NOD1 수용체 활성화인자의 미세입자로의 커플링
2ug/0.2ml 수지에서 펩티도글리칸(PG)을 0.1M NaHCO3에 용해시키고 실시예 6에 따라 제조된 CNBr-활성화된 미세입자에 첨가하였다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 9
TLR3 활성화인자의 미세입자로의 커플링
10ug/0.2ml 비드에서 폴리 I:C를 실시예 6에 따라 pH 8의 0.1M NaHCO3중의 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 반응을 밤새 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 10
TLR4 활성화인자의 미세입자로의 커플링
2ug/0.2ml 수지에서 세균 리포폴리사카라이드를 0.1M NaHCO3(pH 8)에 용해시키고 실시예 6에 따라 제조된 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 11
TLR5 활성화인자의 미세입자로의 커플링
2ug/0.2ml 수지에서 플라겔린을 0.1M NaHCO3(pH 8)에 용해시키고 실시예 6에 따라 제조된 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 12
TLR1 및 TLR6 활성화인자의 미세입자로의 커플링
2ug/0.2ml 수지에서 마이코플라스마 MALP-2 함유 표면 항원을 0.1M NaHCO3(pH 8)에 용해시키고 실시예 6에 따라 제조된 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 13
TLR7/TLR8 활성화인자의 미세입자로의 커플링
2ug/0.2ml 수지에서 일본쇄 RNA 또는 항바이러스 이미다조퀴놀린 이미퀴이모드(Aldara)를 0.1M NaHCO3(pH 8)에 용해시키고 실시예 6에 따라 제조된 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 14
TLR9 활성화인자의 미세입자로의 커플링
10ug/0.2ml 수지에서 CpG DNA를 0.1M NaHCO3(pH 8)에 용해시키고 실시예 6에 따라 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급 수로 완전히 세척하였다.
실시예 15
조합된 PAMP 인지 수용체 효능제 분자 조성물의 미세입자로의 고정화
NOD1 효능제 및 TLR 효능제 4 및 9를 각각 2ug/0.2m: 수지, 10ug/0.2ml 수지 및 2ug/0.2ml 수지에서 함께 0.1M NaHCO3(pH 8)중에 혼합하고 실시예 6에 따라 CNBr-활성화된 미세입자에 고정화시켰다. 2 내지 8℃에서 밤새 반응을 수행하였다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를 LAL 등급 수로 완전히 세척하고 2 내지 8℃에서 동일한 등급수에서 저장하였다.
실시예 16
조합된 PAMP 인지 수용체 효능제 분자 조성물과 함께 MG 항원의 미세입자로의 고정화
MG 항원을 1시간동안 실시예 6에 기재된 조건하에 커플링시켰다. 이어서, 실시예 13에 기재된 TLR 효능제 혼합물을 첨가하고 반응을 2 내지 8℃에서 밤새 진행시켰다. 상등액을 원심분리로 분리하고 수지를, 또한 저장 매체인 LAL 등급수로 완전히 세척하였다.
실시예 17
동물 연구 I
결과는 3회 실험된 것의 평균 값이다.
3일된 병아리(엠. 갈리셉티쿰(MG) 및 엠. 시노비애(MS) 부재 및 ELISA에 의해 어떠한 MG 및 MS 모 항체도 검출되지 않음)에 백신 접종하였다. 각각의 그룹은 10마리의 닭으로 구성되었다. 실험 14일째에, 닭에 엠. 갈리셉티쿰 Rlow 균주를 챌린지하였다. 당해 연구는 28일째에 종료하였다.
당해 그룹을 다음과 같이 설정하였다.
챌린지 전 미세입자 백신 조성물을 사용한 G1-G5 처리
- G1 = 단지 미세입자(0.2ml/닭)를 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
- G2 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 항원(10ug/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
- G3 = 수용체 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
- G4 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 항원(10ug/투여량) 및 수용체 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
- G5 = 엠. 갈리셉티쿰 막(107/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리함
챌린지 후 미세입자 백신 조성물을 사용한 G6-G7 처리
- G6 = 챌린지시키고 챌린지 후, 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 항원(10ug/투여량) 및 수용체 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리함
- G7 = 챌린지 시키고 챌린지 후 수용체 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리함
G8 및 G9 양성 및 음성 대조군
- G8 = 챌린지시키고 처리하지 않음
- G9 = 챌린지시키지 않고 처리하지 않음
기간
-1일: 그룹 G1-G9 설정. ELISA 분석, PCR 및 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애의 배양을 위해 10마리의 닭을 희생시키고 실험 닭이 모항체 및 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애의 존재에 대해 음성인지를 확인한다.
0일: 챌린지 전 G1-G5의 백신 접종.
14일: 그룹 G1-G8의 챌린지.
15일: 챌린지 후 그룹 G6-G7의 백신 접종.
28일: G1-G9. 특정 기관, 기관, 공기 주머니 및 폐로부터 엠. 갈리셉티쿰(MG)의 분리를 위한 안락사, 해부 및 플레이팅. 기관 및 폐의 조직 검사를 수행하였다.
14일 및 28일: 닭에서 채혈하여 혈청 플레이트 응집(SPA) 및 블록킹 ELISA를 사용한 MG-특이적 항체에 대해 시험될 혈청을 수득한다.
-1일째에, 총 90마리의 1일된 영계 종축 닭을 8마리의 그룹중 하나에 할당하였다(10마리의 조류/그룹). 닭 개개의 체중을 기록하였다. 각각의 그룹에서 닭의 평균 체중이 현저하게 상이하지 않도록 닭을 할당하였다. 각각의 조류는 처리에 따른 색 및 번호로 표시된 날개 태그 및 적정한 형태로 기록된 이의 체중에 의해 확인하였다.
처리
0일째, G1-G5의 닭을 동물당 1ml PBS중의 0.2ml의 상이한 백신 조성물로 처리하였다. 투여량은 상기된 바와 같다. G6-G7은 챌린지 후 15일째에 처리하였다.
챌린지
14일째, 동물 G1-G8의 8개 그룹에 엠. 갈리셉티쿰의 독성 R-균주의 신선한 배양액을 사용하여 약 8.0 log10 CFU/ml의 역가로 챌린지시켰다. 당해 10ml의 신선한 배양액을 분무 기술을 사용하여 당해 그룹 각각에 투여하였다. 간략하게, 조류를 0.22 입방 미터 분리 유니트에 놓았다. 이어서 약 100초의 지속 시간동안 1기압의 압력하에 10ml의 신선한 엠. 갈리셉티쿰 R-균주 배양물을 분무시키고 닭이 20분동안 노출되도록 방치하였다.(실험실에서, 성공적인 결과는 당해 기술을 사용한 여러 실험에서 수득되었다)
안락사 및 병리학
실험 연구 종료 시점인 28일째, 모든 그룹을 안락사켰다. 각각의 조류를 해부하고 MG와 관련된 전체 병변에 대해 스코어하였다. 기관, 좌측 및 우측 흉부 공기 주머니 및 복막내 삼출물의 존재를 기록하였다. 하기의 시스템에 따라 병변을 스코어하였다:
기관내: 0 = 삼출물 부재, 1= 약간의 붉기 및 소량의 삼출물, 2 = 점막의 붉기, 삼출물.
좌측 및 우측 공기 주머니: 0 = 병변 부재, 1 = 혈청 삼출물, 2 = 작은 피브린 조각을 갖는 혈청 삼출물, 3 = 혈청 섬유성 삼출물, 약간 비대해진 공기 주머니 벽, 4 = 다량의 섬유성 삼출물, 매우 비대해진 공기 주머니 벽.
복막: 0 = 삼출물 부재, 1 = 혈청 삼출물, 2 = 작은 피브린 조각을 갖는 혈청 삼출물, 3 = 혈청 섬유성 삼출물.
MG 분리
해부 검사 동안에, 기관, 흉부 공기 주머니, 간, 폐, 비장, 신장 및 심장을 면봉을 사용하여 무균적으로 샘플링하였다. 이어서 면봉의 물질을 마이코플라스마 한천(MA)상으로 플레이팅하고 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 2일, 4일 및 7일째에 이어서 최대 3주 동안 매주 마이코플라스마에 대해 플레이트를 관찰하였다. PCR에 의해 양성 콜로니를 시험하여 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애를 확인하였다.
해부
MG 챌린지에 이어서, 상당한 병리학적 병변이 공기 주머니 및 복막에서 인지되었다. 그러나, 입자 + 수용체 효능제(G3, G6 p<0.001), 입자 + 정제된 항원(G2, p< 0.001) 및 정제된 항원 + 수용체 효능제(G4, G6 p<0.001)처리된 그룹에서는 단지 입자로만 처리된 그룹(G1) 뿐만 아니라 챌린지된 그룹, 비처리된 대조군(G8)과 대조적으로 병변 스코어가 상당히 감소한 것으로 기록되었다. 그러나, 보다 우수한 결과는 챌린지 후 투여와 비교하여 챌린지 전에 투여되는 경우 입자 + 정제된 항원 또는 입자 + 정제된 항원 + 수용체 효능제에 대해 수득되었다. G5가 입자 고정화된 엠. 갈리셉티쿰 막으로 처리되는 경우, 몇몇 경우에 병리학적 병변은 챌린지 그룹 자체에서 보다 명백하다. 이것은 엠. 갈피셉티쿰 막으로의 백신 접종이 병원체를 사용한 챌린지에 대한 적당한 면역반응을 방해하여 면역 억제를 유발하고 보다 현저한 감염을 허용한다는 결론에 이르게 하였다.
마이코플라스마의 재분리
마이코플라스마는 백신접종되지 않고 감염된 대조군 닭의 내부 기관으로부터 흔히 재분리될 수 있다. 재분리율의 상당한 감소(호흡기 + 내부 기관으로부터)가, 비-백신접종된 대조군(G8, p <0.01) 그룹 및 입자로만 처리된 그룹(G1, p<0.001-0.01) 또는 입자 + 수용체 효능제로만 처리된 그룹(G3, G7 p<0.05)과는 대조적으로 수용체 효능제의 존재 또는 부재(G2, G4, G6)하에 입자 + 정제된 항원으로 처리된 그룹에서 명백하게 나타났다. 그러나, 입자 + 수용체 효능제(G3, G6)과 대조군 (G8)으로 처리된 그룹간에는 재분리율이 상당히 저하되었다(p < 0.05). 실험 그룹의 호흡기(기관, 폐, 공기 주머니)로부터 또는 기타 내부 기관(간, 비장, 신장 및 심장)으로부터의 마이코플라스마의 재분리율이 비교되는 경우 유사한 결과가 수득되었다. G5가 입자에 고정화된 엠. 갈리셉티쿰 막으로 처리되는 경우, 몇몇 경우에 기관으로부터의 엠. 갈리셉티쿰의 재분리율은 챌린지 그룹 자체에서 보다 높았다. 이것은 엠. 갈리셉티쿰 막을 사용한 백신 접종이 병원체를 사용한 챌린지에 대한 적당한 면역 반응을 방해하고 명역 억제를 유발하며 보다 현저한 감염을 허용한다는 결론에 이르게 하였다.
당해 결과는 표 1에 나타낸다.
Figure pat00001
혈청학적 결과
그룹의 혈청학적 반응은 실험 종료 시점에서 상이하였다. 비처리된 챌린지된 그룹(G8)의 반응은 입자로만 처리된 그룹(G1)과 상이하지 않았다. 동시에, 입자로만 처리된 그룹(G1)에 비해 매우 강한 반응이 입자 + 정제된 항원 및 PRR 효능제로 처리된 그룹(G4)(p<0.05)에서 관찰되었다. 입자 + 정제된 항원으로 처리된 그룹(G2)와 비교하여, PRR이 첨가되는 경우(G4, G6), 상당히 높은 혈청학적 반응이 관찰되었다(p<0.05). 항원 및 PRR을 갖는 입자가 챌린지 전(G4) 또는 챌린지 후(G6)에 사용되는 경우 혈청학적 결과에는 별 차이가 없었다.
토론
엠. 갈리셉티쿰은 공기 주머니 및 복막내에서 상당한 염증을 유발할 수 있고 기관, 공기 주머니 및 폐에 콜로니화를 수반한다. 마이코플라스마는 또한 흔히 내부 기관으로부터 검출될 수 있다. 본 발명자는 미생물의 크기 범위(<5um)에서 미세입자로 이루어진 면역학적 활성 조성물과 유사하고 상이한 PRR 효능제 분자와 함께 공유적으로 고정화된 면역친화성 정제된 항원을 갖는 신규 유형의 병원체를 개발하였다.
본 결과는 임의의 변형되지 않은 입자가 어떠한 면역 반응을 자극시키지 않음을 보여주었다. 단독의 입자는 엠. 갈리셉티쿰에 의해 유발된 복막염 및 공기 주머니염증으로부터 닭을 보호하지 않았고 또한 마이코플라스마에 의한 기관의 콜로니화를 막지 못했다.
입자가 항원 없이 PRR 효능제로 피복되는 경우, 마이코플라스마 챌린지에 대한 혈청학적 반응은 영향받지 않았다. 그러나, 기관의 마이코플라스마에 의한 콜로니화는 감소하였고 병리학적 병변의 스코어는 감소하였다. 이것은 PRR 효능제가 보호를 증가시키는 고유 면역 반응을 자극하거나 증진시킨다는 본 시험관내 관찰을 확인시켜 준다. 그러나, 적용된 면역 조절제의 양은 고도의 병원성 균주에 의한 막대한 투여량의 챌린지에 대해서는 동물을 완전히 보호할 수 없었다. 이것은 또한 전형적으로 막대한 양의 병원체를 극복하기에는 불충분한 것으로서 고유 면역계에 대해 공지되어 있다. 그러나, 데이타는 당해 신규한 면역 조절제가 능히 소량의 챌린지로부터 동물을 보호할 수 있음을 지적한다.
정제된 항원이 PRR 효능제로 피복된 입자에 첨가되는 경우, 마이코플라스마 특이적 혈청학적 반응이 증진된다. 기관의 콜로니화는 상당히 감소하였고 병리학적 병변의 스코어도 낮았다. 이러한 효과는 백신이 점막으로 도입되는 경우 및 챌린지전에 보다 현저하게 나타났지만 유사한 양성 효과가 백신이 챌린지 후 점막으로 투여되는 경우 나타났다.
항원 농도의 증가(50ug/투여량)는 실질적으로 백신의 보호 효과를 감소시키는 것은 흥미로운 관찰이었다. 이것은 친화성 정제된 항원에서 면역억제 성분이 존재함을 시사하였다. 당해 성분을 동정하고 이들의 효과를 제거하기 위해, 새로운 동물 시험을 디자인하였다(하기 참조).
백신 접종 후, 챌린지하기 전에 접종된 닭을 매일 조사하여 백신의 안정성에 대해 평가하였다. 닭은 임상적으로 건강한 것으로 나타났고 백신으로부터의 어떠한 부작용을 나타내지 않았다. 당해 조류의 공급물 및 물 소비는 백신접종되지 않은 그룹과 비교하여 변화하지 않았다. 시험 과정동안에 해부된 동물은 염증의 징후 또는 기관 크기/중량의 변화를 나타내지 않았다. 백신은 안전한 것으로 나타난다.
실시예 18
친화성 정제된 MG 항원을 이전의 실시예에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 정제된 항원은 고정화시키기 전에 하기의 처리를 위해 3개의 그룹으로 나누었다.
1. 엔도글리코시다제 H 분해
53.6ml의 항원(약 1.5mg)에 2.5 유니트의 효소를 첨가하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 혼합물을 냉각 고정화된 만난 칼럼(5ml)에 통과시키고 통류물을 수거하였다. 이러한 샘플을 엔도 H 항원으로 지정하였다.
2. 과요오드산염 처리
53.6ml의 항원(약 1.5mg)에 고형 나트륨 과요오드산염을 최종농도가 15mM이 되도록 첨가하고 혼합 후, 1시간동안 냉각된 상태로 방치하였다. 2배 몰 근접량의 글리세린을 첨가하고 또 다른 시간동안 샘플을 항온처리하였다. PBS에 대한 투석을 밤새 수행하였다. 투석된 샘플은 과요오드산염(PJ) 보강제로 지정하였다.
3. ConA 결합 항원의 제거
정제된 항원(약 53.6ml중의 약 1.5mg)을 2ml의 고정화된 ConA 칼럼에 통과시켰다. 통류물을 수거하였다. 당해 샘플을 ConA 통류물로 지정하였다. 결합된 항원을 50mM TRIS(pH 9.5)중의 1M 알파-메틸 만노글루코사이드로 용출시켰다. 당해 샘플을 ConA 용출물로 지정하였다.
항원 처리
항원의 특징은 표 2에 나타낸다.
Figure pat00002
*엔도 H 처리 동안, 처리된 초기량의 항원은 2.51mg이었다. (당해 제제 53.6ml 및 0.0246 mg/ml의 이전의 엠. 갈리셉티쿰 제제의 40.3ml)
실시예 19
동물 연구 II
당해 결과는 3회 실험에 대한 평균값이다. 3일된 병아리(엠. 갈리셉티쿰(MG) 및 엠. 시노비애(MS) 부재 및 ELISA에 의해 어떠한 MG 및 MS 모 항체도 검출되지 않음)에 백신 접종하였다. 각각의 그룹은 10마리의 닭으로 구성되었다. 실험 14일째에, 닭에 엠. 갈리셉티쿰 Rlow 균주를 챌린지하였다. 당해 연구는 28일째에 종료하였다.
당해 그룹을 다음과 같이 설정하였다.
G1 = 비-챌린지 및 비-처리
G2 = 챌린지 및 비-처리
챌린지 2주 전 처리됨:
G3 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 항원(10ug/투여량) 및 TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G4 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 항원(50ug/투여량) 및 TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G5 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 ConA 흡착된 항원(10ug)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G6 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 엔도 H 분해된 항원(10ug)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G7 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 과요오드산염 산화된 항원(10ug)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G8 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 ConA 흡착된 항원(10ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G9 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 ConA 흡착된 항원(50ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G10 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 엔도 H 분해된 항원(10ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G11 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 엔도 H 분해된 항원(50ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G12 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 과요오드산염 산화된 항원(10ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G13 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 과요오드산염 산화된 항원(50ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G14 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 엔도 H 분해된 항원(10ug) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량) + 아미노구아니딘(i.p.)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 7일동안 처리하고 챌린지시킴
G15 = 비드상의 엠. 갈리셉티쿰 항원 ConA 용출물과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
기간
-1일: 그룹 G1-G15 설정. ELISA 분석, PCR 및 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애의 배양을 위해 10마리의 닭을 희생시키고 실험 닭이 모항체 및 마이코플라스마의 존재에 대해 음성인지를 확인한다.
0일: 챌린지 전 G3-G14의 백신 접종.
14일: 그룹 G2-G15의 챌린지.
28일: G1-G15. 특정 기관, 기관, 공기 주머니 및 폐로부터 엠. 갈리셉티쿰(MG)의 분리를 위한 안락사, 해부 및 플레이팅. 기관 및 폐의 조직 검사를 수행하였다.
14일 및 28일: 닭에서 채혈하여 혈청 플레이트 응집(SPA) 및 블록킹 ELISA를 사용한 MG-특이적 항체에 대해 시험될 혈청을 수득한다.
-1일째에, 총 150마리의 1일된 영계 종축 닭을 15개 그룹중 하나에 할당하였다(10마리의 조류/그룹). 닭 개개의 체중을 기록하였다. 각각의 그룹에서 닭의 평균 체중이 현저하게 상이하지 않도록 닭을 할당하였다. 각각의 조류는 처리에 따른 색 및 번호로 표시된 날개 태그 및 적정한 형태로 기록된 이의 체중에 의해 확인하였다.
챌린지
14일째, 동물 G2-G15의 14개 그룹에 엠. 갈리셉티쿰의 독성 R-균주의 신선한 배양액을 사용하여 약 8.0 log10 CFU/ml의 역가로 챌린지시켰다. 당해 10ml의 신선한 배양액을 분무 기술을 사용하여 당해 그룹 각각에 투여하였다. 간략하게, 조류를 0.22 입방 미터 분리 유니트에 놓았다. 이어서 약 100초의 지속 시간동안 1기압의 압력하에 10ml의 신선한 엠. 갈리셉티쿰 R-균주 배양물을 분무시키고 닭이 20분동안 노출되도록 방치하였다.(실험실에서, 성공적인 결과는 당해 기술을 사용한 여러 실험에서 수득되었다)
안락사 및 병리학
실험 연구 종료 시점인 28일째, 모든 그룹을 안락사켰다. 각각의 조류를 해부하고 MG와 관련된 전체 병변에 대해 스코어하였다. 기관, 좌측 및 우측 흉부 공기 주머니 및 복막내 삼출물의 존재를 기록하였다. 하기의 시스템에 따라 병변을 스코어하였다:
기관내: 0 = 삼출물 부재, 1= 약간의 붉기 및 소량의 삼출물, 2 = 점막의 붉기, 삼출물.
좌측 및 우측 공기 주머니: 0 = 병변 부재, 1 = 혈청 삼출물, 2 = 작은 피브린 조각을 갖는 혈청 삼출물, 3 = 혈청 섬유성 삼출물, 약간 비대해진 공기 주머니 벽, 4 = 다량의 섬유성 삼출물, 매우 비대해진 공기 주머니 벽.
복막: 0 = 삼출물 부재, 1 = 혈청 삼출물, 2 = 작은 피브린 조각을 갖는 혈청 삼출물, 3 = 혈청 섬유성 삼출물.
결과
당해 결과는 표 3에 나타낸다.
Figure pat00003
MG 분리
해부 검사 동안에, 기관, 흉부 공기 주머니, 간, 폐, 비장, 신장 및 심장을 면봉을 사용하여 무균적으로 샘플링하였다. 이어서 면봉의 물질을 마이코플라스마 한천(MA)상으로 플레이팅하고 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 2일, 4일 및 7일째에 이어서 최대 3주 동안 매주 마이코플라스마에 대해 플레이트를 관찰하였다. PCR에 의해 양성 콜로니를 시험하여 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애를 확인하였다.
해부 및 재분리
MG 챌린지에 이어서, 상당한 병리학적 병변이 공기 주머니 및 복막에서 인지되었다. 그러나, 병변 스코어 및 재분리율에서 상당한 감소가 처리된 정제된 항원 + TLR 그룹으로 백신 접종된 그룹에서 기록되었고 이중에서 가장 우수한 것은 비처리된 대조군 챌린지 그룹과는 대조적으로 Con A 칼럼 고갈된 항원(G9)이었다. 그러나, Con A-용출된 항원 분획물 G15를 사용하는 경우, 병원체 병변 스코어는 높았고 재분리율은 양성 대조군과 동일하였다. 이것은 엠. 갈리셉티쿰 항원 분획물을 사용한 백신 접종이 병원체를 사용한 챌린지에 대해 적당한 면역 반응을 방해하여 면역 억제를 유발하고 보다 명백한 감염을 허용한다는 결론에 이르게 하였다.
토론
이들 실험 결과는 친화성 정제된 항원 풀로부터 면역 억제 항원의 제거가 백신 조성물의 보호 효과를 현저히 개선시킴을 보여주었다. 추가로, 항원상에서 전사 후 변형을 함유하는 당의 화학적 변형 또는 효소적 분해는 또한 개선된 보호 면역을 유도하였다.
반대로, 본 발명자는 또한 미세입자에 커플링된 분리된 면역 억제 항원의 투여는 면역 억제를 유도하고 병원체에 내성이 나타나도록 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 방식으로, 본 발명자는 적당한 항원 특성이 면역 반응을 보호 또는 내성 쪽으로 전환시킬 수 있음을 입증하였다. 이들 둘다는 면역 반응을 조절하기 위한 이상적인 방법을 개발하는데 상당한 의의를 갖는다. 이어서, 본 발명자는 면역 반응의 진전에 관여하는 추가의 항원성 표면 결정인자를 모색하기로 결정하였다.
실시예 20
친화성 정제된 MG 항원은 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 제조하였다. 정제된 항원은 고정화시키기 전에 하기의 처리를 위해 3가지 그룹으로 나누었다.
1.MG 항원 탈아실화
27ml의 항원(약 0.65mg)에 8ml의 1M NaOH 및 10mg의 펜타데칸산을 첨가하고 용액을 70℃에서 45분동안 약하게 진탕시켰다. pH를 이어서 8.0으로 조정하고 침전물을 5분동안 3,000rpm에서 원심분리하여 제거하였다. 이러한 샘플을 탈아실화된 항원으로 지정하였다.
2. 과요오드산염 처리
이것은 실시예 18 보다 더 엄중한 반응이 되도록 의도된다. 25ml의 항원(약 0.6mg)에 고형 과요오드산나트륨을 최종 농도가 80mM이 되도록 첨가하고 혼합 후 실온에서 2.5시간동안 방치하였다. 2배 몰 근접량의 글리세린을 이어서 첨가하고 샘플을 또 다른 시간동안 항온처리하였다. PBS에 대한 투석은 밤새 수행하였다. 투석된 샘플을 과요오드산염 항원으로 지정하였다.
실시예 21
동물 연구 III
당해 결과는 3회 실험에 대한 평균값이다. 3일된 병아리(엠. 갈리셉티쿰(MG) 및 엠. 시노비애(MS) 부재 및 ELISA에 의해 어떠한 MG 및 MS 모 항체도 검출되지 않음)에 백신 접종하였다. 각각의 그룹은 10마리의 닭으로 구성되었다. 실험 14일째에, 닭에 엠. 갈리셉티쿰 Rlow 균주를 챌린지하였다. 당해 연구는 28일째에 종료하였다.
당해 그룹을 다음과 같이 설정하였다.
G1 = 비-챌린지 및 비-처리
G2 = 챌린지 및 비-처리
챌린지 2주 전 처리됨:
G3 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 ConA 흡착된 항원(10ug/투여량) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G4 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 탈아실화된 항원(10ug/투여량) + TLR 효능제(10ug 세균 DNA, 이. 콜리 + 2ug 이. 콜리 LPS 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)과 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G5 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 ConA 흡착된 항원(10ug) + TLR 효능제(25ug 폴리 I:C + 10ug 세균 DNA 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
G6 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 과요오드산염으로 처리되고 탈아실화된 항원(10ug) + TLR 효능제(10ug 폴리 I:C + 10ug 세균 DNA 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
챌린지 1일 후 처리:
G7 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 ConA 흡착된 항원(10ug) + TLR 효능제(25ug 폴리 I:C + 10ug 세균 DNA 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리함
G8 = 엠. 갈리셉티쿰 친화성 정제된 과요오드산염으로 처리되고 탈아실화된 항원(10ug) + TLR 효능제(25ug 폴리 I:C + 10ug 세균 DNA 및 2ug의 펩티도글리칸/투여량)와 함께 미세입자(0.2ml/닭)로 경구적으로 처리하고 챌린지시킴
기간
-1일: 그룹 G1-G9 설정. ELISA 분석, PCR 및 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애의 배양을 위해 10마리의 닭을 희생시키고 실험 닭이 모항체 및 마이코플라스마의 존재에 대해 음성인지를 확인한다.
0일: 챌린지 전 G3-G6의 백신 접종.
14일: 그룹 G2-G9의 챌린지.
15일: 챌린지에 이어서 G7-G9의 백신 접종
28일: G1-G9. 특정 기관, 기관, 공기 주머니 및 폐로부터 엠. 갈리셉티쿰(MG)의 분리를 위한 안락사, 해부 및 플레이팅. 기관 및 폐의 조직 검사를 수행하였다.
14일 및 28일: 닭에서 채혈하여 혈청 플레이트 응집(SPA) 및 블록킹 ELISA를 사용한 MG-특이적 항체에 대해 시험될 혈청을 수득한다.
-1일째에, 총 90마리의 1일된 영계 종축 닭을 9개 그룹중 하나에 할당하였다(10마리의 조류/그룹). 닭 개개의 체중을 기록하였다. 각각의 그룹에서 닭의 평균 체중이 현저하게 상이하지 않도록 닭을 할당하였다. 각각의 조류는 처리에 따른 색 및 번호로 표시된 날개 태그 및 적정한 형태로 기록된 이의 체중에 의해 확인하였다.
챌린지
14일째, 동물 G2-G9의 9개 그룹에 엠. 갈리셉티쿰의 독성 R-균주의 신선한 배양액을 사용하여 약 8.0 log10 CFU/ml의 역가로 챌린지시켰다. 당해 10ml의 신선한 배양액을 분무 기술을 사용하여 당해 그룹 각각에 투여하였다. 간략하게, 조류를 0.22 입방 미터 분리 유니트에 놓았다. 이어서 약 100초의 지속 시간동안 1기압의 압력하에 10ml의 신선한 엠. 갈리셉티쿰 R-균주 배양물을 분무시키고 닭이 20분동안 노출되도록 방치하였다.
안락사 및 병리학
실험 연구 종료 시점인 28일째, 모든 그룹을 안락사켰다. 각각의 조류를 해부하고 MG와 관련된 전체 병변에 대해 스코어하였다. 기관, 좌측 및 우측 흉부 공기 주머니 및 복막내 삼출물의 존재를 기록하였다. 하기의 시스템에 따라 병변을 스코어하였다:
기관내: 0 = 삼출물 부재, 1= 약간의 붉기 및 소량의 삼출물, 2 = 점막의 붉기, 삼출물.
좌측 및 우측 공기 주머니: 0 = 병변 부재, 1 = 혈청 삼출물, 2 = 작은 피브린 조각을 갖는 혈청 삼출물, 3 = 혈청 섬유성 삼출물, 약간 비대해진 공기 주머니 벽, 4 = 다량의 섬유성 삼출물, 매우 비대해진 공기 주머니 벽.
복막: 0 = 삼출물 부재, 1 = 혈청 삼출물, 2 = 작은 피브린 조각을 갖는 혈청 삼출물, 3 = 혈청 섬유성 삼출물.
결과
당해 결과는 표 4에 나타낸다.
Figure pat00004
MG 분리
해부 검사 동안에, 기관, 흉부 공기 주머니, 간, 폐, 비장, 신장 및 심장을 면봉을 사용하여 무균적으로 샘플링하였다. 이어서 면봉의 물질을 마이코플라스마 한천(MA)상으로 플레이팅하고 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 2일, 4일 및 7일째에 이어서 최대 3주 동안 매주 마이코플라스마에 대해 플레이트를 관찰하였다. PCR에 의해 양성 콜로니를 시험하여 엠. 갈리셉티쿰 및 엠. 시노비애를 확인하였다.
해부 및 재분리
MG 챌린지에 이어서, 상당한 병리학적 병변이 공기 주머니 및 복막에서 인지되었다. 그러나, 병변 스코어 및 재분리율에서 상당한 감소가 처리된 정제된 항원 + TLR 그룹으로 백신 접종된 그룹에서 기록되었고 모든 그룹은 유사한 결과를 나타내었고 탈아실화된 항원(G4)이 대조군 비처리된 챌린지 그룹과 비교하여 최상이다. 감염 후 백신 접종 그룹에서, ConA 처리된 항원 + TLR 3, 4, 9는 최상의 결과를 제공하였다. 당해 조성물로 심지어 감염 후에도 보호 면역을 성취할 수 있는 것으로 나타난다.
토론
이들 실험 결과는 친화성 정제된 항원 풀로부터 면역 억제 항원의 제거가 백신 조성물의 보호 효과를 현저히 개선시킴을 보여주었다. 추가로, 항원상에서 전사 후 변형을 함유하는 당의 화학적 변형(N-당화)은 또한 개선된 보호 면역을 유도하였다. 추가로, 항원상의 지질 잔기는 화학적으로 제거되거나 차단되어 이는 또한 현저한 면역 보호 효과를 유도한다.
본 발명자는 적당한 항원 변형과 함께 면역 반응을 보호하는 방향으로 전환시킬 수 있음을 다시 입증하였다. 이것은 면역 반응을 조절하기 위한 이상적인 방법을 개발하는데 상당한 의의를 갖는다. 이어서, 본 발명자는 조직 배양에서의 각각의 면역 반응을 재현하기 위해 시험관내 시스템을 설정하였다. 당해 시스템은 면역학적 활성 조성물에 의해 생성된 면역 반응에 대한 추정 값어치를 가질 수 있고 따라서 생성물 개발 주기를 단축시킬 수 있다.
실시예 22
시험관내 연구
TNF-α분비는 말초혈로부터 제조되고 펩티도글리칸(PepG)(Sigma, St Louis, MI), 세균 CpG DNA(KM Biomedicates, Auror, OH: 리물러스 아모에보사이트 용해물 분석에 의해 측정된 LPS<0.2EU/ml) 또는 이들 둘다로 처리된 PBMC에서 측정하였다.
선천성 면역계를 대표하는 단핵구내의 조직 인자(TF)는 TNF-α 분석을 위해 사용되는 상응하는 PBMC 배양물로부터 평가하였다. TF ELISA(Imubind kit, American Diagnostica, Greenwich, CT)를 위해, 제조업자에 의해 추천된 바와 같이 트리톤-X100을 사용하여 인접 세포로부터 TF를 추출하였다.
당해 결과는 도 2에 나타낸다(P 및 D 뒤의 숫자는 각각 ug/ml의 PepG 및 bactDNA의 농도를 나타내고; 좌측에서 우측으로 이들은 P3+D15, P3+D5, P3+D1.5, P1+D5, P1+D1.5, P0.3+D15, P0.3+D5 및 P0.3+D1.5이다). PepG(백색 막대) 또는 세균 CpG DNA(검은 막대) 또는 단독으로 첨가(사선 막대)되는 경우에서와 같이 동일 농도에서 동시에 둘다로 처리 후 PBMC(A) 및 조직 인자(B)에 의해 분비된 TNF-α. P 및 D 이후의 숫자는 각각 ug/ml의 PepG 및 bactDNA의 농도를 지적한다. 시험된 모든 농도에서 단독의 PepG(3 또는 1.5ug/ml) 및 CpG DNA의 효과의 합간에 비교되는 경우 및 PepG와 bactDNA가 함께 첨가된 경우 TNF-α 및 TF에 대해 P<0.05; 스튜던트 t-시험(n=4). 이것은 3개중에 대표적인 실험이다.
본 결과는 PBMC에서 PepG 및 bactDNA에 의한 TNF-α 및 TF의 동시 유도 및 2개 분자 간의 공동상승 효과를 입증한다. 이것은 공통된 다운스트림 시그날 전달 경로에 대한 직접적인 효과 또는 PepG 또는 bactDNA 작용 후 분비된 화합물에 의해 매개되는 간접 효과를 포함할 수 있다. TNF-α는 발열원에 대한 숙주 반응의 중요한 조기 매개인자이고 패혈 쇼크의 대사적, 헤모다이나믹, 조직 및 사이토킨 캐스케이드 반응 전체를 유발할 수 있는 유일한 내인성 매개인자이다. bactDNA 및 PepG의 공동상승작용 효과는 패혈증의 발병에 연루되어 있고 여기서 각각의 분자는 생체내에서 저농도로 존재하지만 이전에 가정된 바와 같이 또 다른 하나의 효과를 증폭시키는 것으로 나타난다.
상이한 입자 조성물에 의한 상이한 Th1 및 Th2의 시험관내 유도의 입증
말초혈 단핵구 세포는 건강한 지원자의 말초혈의 피콜 분리에 의해 제조하였다. 단핵구 세포를 100U/ml의 페니실린/스트렙토마이신, 2mM의 글루타민 및 3% 태아 소 혈청이 보충된 1.5ml RPMI-1640(Irvine Scientific, Irvine, CA)중에 106 세포/ml의 밀도로 분주하고 18시간동안 0.15ml의 미세입자(멸균 PBS중에)와 항온처리하였다. 미세입자는 하기 그래프에서 지적된 바와 같이, TLR 효능제 2,3,4 및 9 뿐만 아니라 Con A-스트립된 또는 나트륨 과요오드산 처리된 항원을 함유하였다. 비드의 제조는 실시예 19에 기재되어 있다.
결과는 도 3(회색 막대, TNF-α x 100, 검은 막대, IL-10)에 나타내고 도 4에는 TNF-α/IL-10의 비율이 도시되어 있다.
TNF-α 및 IL-10 비율 분석은 TLR 2,4,9와 동시 고정화된 ConA-고갈된 항원이 가장 현저한 Th1 반응을 나타냄을 입증하였고 생체내 결과와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(실시예 19 참조). 이러한 조성물은 동물에서 마이코플라스마 챌린지에 대해 가장 높은 보호 효과를 일관되게 나타낸다.
실시예 23
면역조절인자 미세입자에 대한 세포 반응의 특징을 추가로 분석하기 위해, 본 발명자는 수지상 세포를 당해 미세입자에 노출시켰다. 본 발명자는 MHCI 및 MHC II 분자 및 동시 자극 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절을 관찰하였다. PRR 효능제 배합물의 존재는 처리한지 18시간 후에 수지상 세포의 표면상에 MHC II 증가를 측정할 필요가 있다. 세포 표면에서 MHC 존재는 동적 과정이기때문에, ConA Ag 비드와의 상이한 항온처리 시간은 세포 표면에서 MHC 분자의 증가를 관찰하는데 요구될 수 있다. MHC는 항원을 T-세포에 제공하고 CD86은 T-세포상의 CD28과 상호작용한다. 수지상 세포 및 B7 동시 자극 리간드(CD80 및 CD86과 같은)의 상호작용에 의한 동시 항원 제공은 T-세포를 활성화시킨다. 이들 시험관내 데이타는 미세입자가 수지상 세포의 성숙도를 나타내고 고유 및 후천성 면역을 유도하는데 요구되는 변화를 유도함을 지적한다.
수지상 세포의 표면상에 CD80 및 CD86 발현 뿐만 아니라 MHC I 및 MHC II 발현은 상이한 미세입자 제제에 18시간 노출시킨 후 측정하였다: 항원 또는 PRR이 고정화되지 않은 대조군 미세입자(대조군) 및 하기의 PRR 효능제 배합의 존재 또는 부재와 함께 ConA 결합 항원(ConA Ag)이 고갈된 엠. 갈리셉티쿰 항원이 고정화된 미세입자: 1) PepG, LPS, 세균 DNA(bactDNA)(ConA Ag + PRR 2,4,9) 또는 2) 폴리 I:C, LPS, bactDNA(ConA Ag + PRR 3,4,9). 수지상 세포에서 MHC-II 및 CD86의 유도는 도 5에 나타낸다.
당해 결과는 DC에 의한 TNF-α 분비에 대한 미세입자의 효과를 보여준다. 대조군 미세입자는 조건화된 배지에서 TNF-α의 검출가능한 분비를 유도하지 못했다. 기타 3가지 유형의 미세입자(PepG, LPS, bactDNA 및 폴리 I:C와 함께 동시 고정화된 ConA 결합 항원 및 유사한 항원의 고갈 후 엠. 갈리셉티쿰 항원)는 대조군 미세입자와 비교하여 DC에 의해 상당한 양의 TNF-α를 유도하였다. 흥미롭게도, 면역조절제로서 세균 화합물의 존재는 항원 단독과 비교하여 TNF-α를 덜 생성시켰다. 이들 결과는 미세입자가 DC와 상호작용하고 TLR 및 NOD 수용체를 활성화시켜 면역계의 세포에 대한 당해 분자의 공지된 효과에 따라 생리학적 반응을 생성할 수 있음을 지적한다. 본 발명자는 미세입자가 DC로 표적화될 수 있음을 입증하였다.
실시예 24
MG로부터 헤파린 결합 단백질의 정제
엠. 갈리셉티쿰을 실시예 2에 기재된 바와 같이 증식시키고 농축되고 세척된 마이코플라스마를 실시예 4의 단계 1에 기재된 바와 같이 불활성화시켰다. 75ml의 조 MG-막 단백질에 0.75 Mega-10을 첨가하고 용액을 실온에서 20시간동안 혼합하였다. 이어서, 3.75ml의 트리톤 X-100을 용액에 첨가하고 실온에서 또 다른 시간동안 혼합하였다. 당해 용액을 10분동안 5,000rpm에서 회전시키고 상등액을 펠렛으로부터 분리하였다. 이어서, 75ml의 트리스 완충액(20mM 트리스, 0.1M NaCl, pH 7.2)을 상등액에 첨가하였다. 헤파린-액티겔 칼럼을 3ml/분의 유속에서 5베드 용적의 트리스 완충액으로 평형화시켰다. MG-단백질 용액을 8 내지 15ml/분의 유속에서 칼럼상에 로딩하고 통류물을 별도의 병에 수거하였다. 칼럼을 8 내지 15ml/분의 유속에서 10 베드 용적의 트리스 완충액으로 세척하고 8 내지 15ml의 유속에서 2M NaCl를 함유하는 트리스 완충액으로 용출시켰다. 10베드 용적의 트리스 완충액으로 칼럼을 세척한 후, MG-단백질 용액을 칼럼에 다시 적용하고 용물을 상기한 바와 같이 반복하였다. 용출물을 풀링하고 3,500 컷오프 투석 튜빙을 사용하여 트리스 완충액에 대해 투석하였다. 단백질 분석을 수행하여 용출된 단백질의 농도를 측정하였다.
실시예 25
중화 혈청으로부터 IgG의 정제 및 면역친화성 칼럼의 제조
백신 접종된 중화 닭 혈청으로부터의 벌크 IgG 정제 및 액티겔 ALD로의 고정화를 실시예 3에 따라 수행하였다.
실시예 26
면역친화성 칼럼에 결합된 헤파린 결합 MG 단백질의 트립신 분해
2mg의 정제된 MG 단백질을 2ml의 면역친화성 칼럼에 첨가하고 15분동안 결합하도록 방치하였다. 당해 칼럼을 10ml의 트리스 완충액 B(5mM 트리스, pH 7.5, 0.1M NaCl)으로 세척하였다. 트리스 완충액 B중의 20ug/ml의 트립신 용액을 첨가하고 슬러리를 37℃에서 1시간동안 약하게 진탕시켰다. 단편 및 유리 효소를 트리스 완충액 B로 세척 제거하고 결합된 펩타이드를 0.1M 시트레이트(pH 2.5)로 용출시켰다. 이어서 용출물을 cc. NH4OH로 중화시키고 농축시키고 C-18 역상 회전 칼럼(Pierce) 상에서 정제하고 펩타이드 조성에 대해 MALDI-TOF로 분석하였다.
실시예 27
헤파린 칼럼에 결합된 헤파린 결합 MG 단백질의 트립신 분해
2mg의 정제된 MG 단백질을 2ml의 헤파린 액티겔 칼럼에 첨가하고 1시간동안 결합하도록 방치하였다. 당해 칼럼을 10ml의 트리스 완충액 B으로 세척하였다. 트리스 완충액 B중의 20ug/ml의 트립신 용액을 첨가하고 슬러리를 37℃에서 1시간동안 약하게 진탕시켰다. 단편을 트리스 완충액 B로 세척 제거하고 결합된 펩타이드를 1M NaCl을 함유하는 트리스 완충액 B로 용출시켰다. 이어서 용출물을 농축시키고 C-18 역상 회전 칼럼(Pierce) 상에서 정제하고 펩타이드 조성에 대해 MALDI-TOF로 분석하였다.
실시예 28
C1q 단백질의 정제 및 고정화
C1q의 정제는 맥케이, 이제이의 방법(상이한 동물로부터 혈장 C1q의 정제를 위한 단순한 2단계 공정)에 따라 수행하였다[문헌참조: Immunol Letters 1981, 3:303-308]. 정제된 C1q는 미국 특허 제5,801,063호에 기재된 본 발명자의 과정을 채택하여 3mg/ml에서 아미노겔(Sterogene Bioseparations, Inc., Carlsbad CA)에 고정화시켰다.
실시예 29
IgG에 결합하는 보체의 정제 및 고정화
실시예 24에 따라 정제된 폴리클로날 중화 항체를, 트리스 완충액 B로 평형화된 10ml 칼럼의 고정화된 C1q에 적용하고 30분동안 결합하도록 방치하였다. 결합되지 않은 항체를 10베드 용적의 트리스 완충액 B로 세척함에 의해 제거하고 결합된 항체를 1M NaCl를 함유하는 동일한 완충액으로 용출시켰다. 이어서 정제된 IgG를 3mg/ml로 액티겔 ALD에 고정화시켰다.
실시예 30
면역 친화성 칼럼에 결합된 보체 활성화 MG 단백질의 트립신 분해
엠. 갈리셉티쿰을 실시예 2에 기재된 바와 같이 증식시키고 농축되고 세척된 마이코플라스마를 실시예 4의 단계 1에 기재된 바와 같이 불활성화시켰다. 항체를 활성화시키는 고정화된 보체의 10ml의 칼럼에, 30ml의 MG 용해물을 3ml/분으로 적용하였다. 칼럼을 유속 8ml/분으로 20베드 용적의 트리스 완충액 B로 세척하여 비특이적으로 흡착된 단백질을 제거하였다. 트리스 완충액 B중의 20ug/ml의 트립신 용액을 첨가하고 슬러리를 37℃에서 1시간동안 약하게 진탕시킨다. 단편을 트리스 완충액 B로 세척하여 제거하고 결합된 펩타이드를 0.1M 시트레이트(pH 2,5)로 용출시켰다. 이어서 용출물은 ccNH4OH로 중화시키고 농축시키고 C-18 역상 회전 칼럼(Pierce)상에서 정제하고 펩타이드 조성에 대해 MALDI-TOF로 분석하였다.
면역학적 활성 펩타이드의 예는 하기의 조성을 갖는 것으로 나타난다: Lys-Leu-Ala-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Thr-Glu-Glu-Ile-Tyr-Pro-Ser-Ala-Pro-Lys-Val-Ser-Arg-Lys-Gln-Arg-Gly-Val-His-Gly-Phe-Ser-Glu-Pro-Thr-Ser(서열번호 1). 중요하게 상기 펩타이드는 Arg - Lys-Gln-Arg의 GAG/헤파린 결합 도메인을 함유한다. 또 다른 유용한 서열은 Leu-Leu-Ala-Lys - Lys-Thr-Asp-Lys-Ser-Val-Ser-Pro-Gln-Ala-Ser-Leu-Thr(서열번호 2)이다. 이들 서열은 엔도프로테이나제에 대한 절단 부위를 함유하는 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 당해 링커 서열의 예는 LIKFRSN(Leu-Ile-Lys-Phe-Arg-Ser-Asn)(서열번호 3)이다. 또 다른 링커 서열은 당업계에 공지되어 있다.
실시예 31
항원성 펩타이드 에피토프 및 다중 에피토프 펩타이드의 합성
항원성 펩타이드는 FMOC 방법에 의해 합성하였다.
실시예 32
백신에 대한 보호 항원 펩타이드의 확인
항원성 펩타이드는 백신 접종된 닭의 중화 혈청과 혼합하고 고정화된 헤파린에 대한 결합 억제를 경쟁 ELISA에 의해 측정한다. 펩타이드 샘플을 ELISA 플레이트 웰에 흡수한다. 이어서, 웰을 블록킹 용액으로 차단하고 면역 및 비면역 대조군 항혈청을 이어서 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 비특이적 단백질을 세척 용액으로 제거함에 이어서 1시간동안 블록킹 완충액중에 희석된 100ug/ml의 비오틴 표지된 헤파린을 첨가하였다. 3회 10분동안 각각의 미결합된 헤파린을 세척한 후, 스트렙타비딘 퍼옥시다제를 1시간동안 블록킹 완충액중에서 1:3,000으로 희석하여 첨가한다. 과량의 접합체를 3회 10분동안 세척 완충액으로 세척하여 제거하고 3,3'-디아미노벤지딘 용액을 첨가하여 발색시킨다. 당해 시그날은 중화 항체의 존재에 역비례한다.
실시예 33
병원체의 항원 단백질의 생정보학적 분석으로 고도의 항원성 잠재력을 갖는 에피토프를 동정할 수 있다. 당해 분석은 엠. 갈리셉티쿰 MGA 단백질에 대해 수행하였다. 항원 영역은 추가로 선형 염기성 모티프 영역에서 분석하였다. 당해 예상된 고도의 항원성 선형 모티프의 예는 당해 서열이다: MHCI 에피토프 10량체는 LLAKKTDKSV(서열번호 4)이고 MHCII 15량체는 LLAKKTDKSVSPAQAS(서열번호 5)이다. 이들 모메인은 SYFPEITHI 방법으로 동정하였다(www.syfpeithi.de). 이것은 선형 염기성 모티프가 실질적으로 고도의 항원성 경향 스팟 내부에 포함됨을 입증한다. 생물정보학적 분석은 데이타 발췌 및 일치 및 당업계에 공지된 서열을 비교하기 위한 데이타베이스 및 컴퓨터 분석 기술을 사용하여, 문헌[참조: J. Pevsner "Bioinformatics and Functional Genomics"(Wiley-Liss, Hoboken, N.J., 2003)]에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
실시예 34
항-에피토프 항체의 정제
동정된 항원 펩타이드를 말단에 비오틴을 표지시켜 합성한다. 비오틴-표지된 펩타이드를 1mg/ml의 농도로 아비딘 액티겔(Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA)에 고정화시킨다. 백신 접종된 닭으로부터 중화 항혈청을 포화 농도로 첨가하고 비특이적으로 결합된 단백질을 포스페이트 완충 식염수(PBS)(pH 7.2)로 세척함에 의해 제거하였다. 특이적으로 결합된 항체는 액티셉 용출 매질로 용출시킨다[Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA].
본 발명의 이점
본 발명은 예를 들어 면역 반응을 유도하거나 보호 면역 반응을 유발하거나 내성 유발하도록 조정될 수 있는 개선된 면역 조절 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조성물은 안정하고 광범위한 면역원 및 표적 분자와 함께 제조되어 면역 반응에 대한 목적하는 효과를 유발시킬 수 있다. 이들은 당해 제제에 대한 비경구 투여를 위한 투여 경로를 제공한다. 이들은 면역원 및 표적 분자의 미성숙 분해 또는 방출을 방지한다. 당해 입자는 고유 점막 접착 성질을 갖고 점막과의 상호작용을 개선시켜 흡수를 용이하게 한다. 이들은 추가의 보조제를 요구하지 않는다.
본 발명에 따른 방법 및 조성물은 면역 회피에서 N-당화(만노실화)의 역할을 사용하여 백신용으로 의도된 조성물로부터 적절한 회피 에피토프를 제거함에 의해 면역 회피가 발생되는 것을 막는다. 이들은 또한 글리코스아미노글리칸/헤파린 선형 결합 모티프의 동정 및 당해 결합을 방해하는 방법을 사용한다. 본 발명에 따른 방법 및 조성물은 추가로 보체 활성화 에피토프를 동정하기 위해 개발된 방법을 사용한다. 추가로, 본 발명에 따른 방법 및 조성물은 여러 TLR 효능제의 사용이 면역 반응을 크게 증진시킨다는 발견을 토대로 한다. 모든 항원 및 TLR 효능제는 점막 림프계에서 단일 세포에 표적화될 수 있다. 본 발명의 또 다른 개선된 측면은 단일 입자 상에 합성 T 세포 및 B 세포 에피토프의 사용이다.
본원에 기재된 발명은 본원에 구체적으로 기재되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 적합하게 수행될 수 있다. 따라서 예를 들어, 용어 "포함하는", "함유하는", "내포되는"등은 넓게 제한 없이 해석될 것이다. 추가로, 본원에 사용되는 용어 및 표현은 기재 용어로서 사용된 것이고 제한되지 않으며 당해 용어 및 표현의 사용은 향후 나타나고 기재되거나 이의 일부의 등가물을 배제하기 위한 의도는 없고 다양한 변형이 청구된 발명의 범위내에서 가능한 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 기재되었지만, 본원에 기재된 발명의 변형 및 변화가 당업계에 의존될 수 있고 당해 변형 및 변화가 본원에 기재된 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야만 한다. 본 발명은 본원에서 광범위하게 및 개론적으로 기재되었다. 일반 기재 범위내에 속하는 보다 좁은 내용 및 하위 그룹 지정의 각각은 또한 이들 발명의 일부를 형성한다. 이것은 삭제된 자료가 구체적으로 거기에 포함되는지에 상관없이 각 발명의 일반적 기술을 포함한다.
추가로, 본 발명의 특징 또는 측면은 마쿠시 그룹 측면에서 기재되었고 당업자는 본 발명이 또한 개개의 구성원 또는 하위 그룹의 마쿠시 그룹의 구성원 측면에서 기재됨을 인지할 것이다. 이것은 또한 상기 기재가 설명을 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아닌 것으로 이해되어야만 한다. 상기 기재를 검토하는 즉시 많은 양태가 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 기재를 참조로 하지 않으면서 결정되어야만 하지만 이 대신 각 청구항이 속하는 완전한 범위의 등가물과 함께 첨부된 청구항을 참조로 결정되어야만 한다. 특허 문헌을 포함하는 모든 기사 및 참조 문헌의 기재는 본원에 참조로서 인용된다.
<110> GALENBIO, INC. <120> IMMUNOLOGICALLY ACTIVE COMPOSITIONS <130> 8172-003-WO <140> 10-2007-7019701 <141> 2007-08-28 <150> US 60/648,165 <151> 2005-01-28 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial immunologically active peptide or linker sequence <400> 1 Lys Leu Ala Leu Thr Ser Glu Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Pro Ser Ala 1 5 10 15 Pro Lys Val Ser Arg Lys Gln Arg Gly Val His Gly Phe Ser Glu Pro 20 25 30 Thr Ser <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial antigenic peptide or linker sequence <400> 2 Leu Leu Ala Lys Lys Thr Asp Lys Ser Val Ser Pro Gln Ala Ser Leu 1 5 10 15 Thr <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial antigenic sequence or linker peptide <400> 3 Leu Ile Lys Phe Arg Ser Asn 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial antigenic sequence or linker peptide <400> 4 Leu Leu Ala Lys Lys Thr Asp Lys Ser Val 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial antigenic sequence or linker peptide <400> 5 Leu Leu Ala Lys Lys Thr Asp Lys Ser Val Ser Pro Ala Gln Ala Ser 1 5 10 15

Claims (31)

  1. (a) 하나 이상의 병원체 관련 분자 패턴;
    (b) 하나 이상의 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프; 및
    (c) 보호 면역이 유도되도록 조성물을 유기체의 선천성 면역계 세포에 특이적으로 전달하는데 효과적인 하나 이상의 아가로스 미세입자 담체를 포함하는, 보호 면역을 유도하는 면역학적 활성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프가 면역계로부터의 병원체 회피에 관여하는 에피토프가 아닌 면역학적 활성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드, 단백질, 재조합 펩타이드 또는 멀티펩타이드, 재조합 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 다른 생체활성 분자 또는 이들의 임의의 조합인 면역학적 활성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고 당해 펩타이드 또는 단백질이 면역 조절 모티프를 가지며, 당해 면역 조절 모티프가 천연적으로 소수성일 수 있고 여기에 부착된 추가의 분자를 가질 수 있으며 당해 추가의 분자가 수용체와 상호작용할 수 있는 면역학적 활성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 병원체 관련 분자 패턴 및 하나 이상의 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프가 아가로스 미세입자에 공유적으로 연결되는 면역학적 활성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고, 당해 펩타이드 또는 단백질이 면역 조절 전사후 변형을 갖는 면역학적 활성 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 면역조절 전사후 변형이,
    (a) 탄수화물 잔기, 지질 잔기 또는 이둘 모두를 수반하고, 전사후 변형이 지질 잔기를 수반하는 경우, 지질 잔기가 탈지에 의해 제거될 수 있는 전사후 변형 및
    (b) 말단 만노실화를 포함하고, 면역조절 말단 만노실화된 물질이 산화적 단계, 효소 처리 및 당 특이적 친화성 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 과정에 의해 조성물로부터 제거될 수 있는 전사후 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역학적 활성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고, 당해 면역 활성 펩타이드 또는 단백질이 면역 조절 전사후 변형을 갖지 않는 면역학적 활성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고, 면역 활성 펩타이드 또는 단백질이 N-당화 또는 지질화(lipoylation)할 수 있는 아미노산 서열을 갖지 않는 면역학적 활성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프가 면역 활성 항원 펩타이드 또는 단백질이고, 당해 면역 활성 항원 펩타이드 또는 단백질이 단독으로 또는 항체와 조합되어 보체 활성화 활성을 갖는 면역학적 활성 조성물
  11. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고 면역 활성 단백질 또는 펩타이드가 세포 표면 진입 수용체 및 세포 표면 글리코사미노글리칸(GAG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 잔기와 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가지며, 당해 아미노산 서열이 천연적으로 다염기성일 수 있고 천연적으로 다염기성인 경우 XBBXBX, XBBBXXBX, BBXXBBBXXBB, BBBXXB, BXBXB, BBB, BXBXXXBXB 또는 BXBXXXXXBXB의 일반식을 가질 수 있고 이때, B가 염기성 아미노산이고 X가 다른 임의의 아미노산인 면역학적 활성 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고 면역 활성 단백질 또는 펩타이드가 세포 표면 글리코사미노글리칸(GAG)과 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가지며 당해 GAG 결합 아미노산 서열이 병원체의 세포 표면으로의 결합을 방해할 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 대한 항체를 생산하는데 사용되는 면역학적 활성 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 펩타이드 또는 단백질이고 면역 활성 단백질 또는 펩타이드가 세포 표면 글리코사미노글리칸(GAG)과 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가지며 당해 GAG 결합 아미노산 서열이 병원체의 세포 표면으로의 결합을 방해할 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 대한 항체를 생산하는데 사용되는 면역학적 활성 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 면역 활성 항원 에피토프가 GAG를 통해 세포 표면 및 진입 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 구조물로의 병원체 결합을 방해할 수 있는 에피토프에 대한 항체를 생성하는데 사용되는 면역학적 활성 조성물.
  15. 제13항 또는 14항에 있어서, 진입 수용체가 면역계로부터 병원체 회피를 유도하는 수용체인 면역학적 활성 조성물.
  16. 제13항 또는 14항에 있어서, 진입 수용체가 DC-SIGN인 면역학적 활성 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 면역 활성 항원 펩타이드 또는 단백질이 헤파린 및 이의 유사체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 GAG에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 면역학적 활성 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 병원체 관련 분자 패턴이,
    (a) TLR1 효능제;
    (b) TLR2 효능제;
    (c) TLR3 효능제;
    (d) TLR4 효능제;
    (e) TLR5 효능제;
    (f) TLR6 효능제;
    (g) TLR7 효능제;
    (h) TLR8 효능제;
    (i) TLR9 효능제;
    (j) NOD-1 효능제;
    (k) NOD-2 효능제;
    (l) DC-SIGN에 대한 효능제;
    (m) L-SIGN에 대한 효능제; 및
    (n) 만노스 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    병원체 관련 분자 패턴이 NOD-1 효능제 또는 NOD-2 효능제인 경우, 이러한 NOD-1 효능제 또는 NOD-2 효능제가 세균 펩티도글리칸 및 세균 펩티도글리칸의 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있는 면역학적 활성 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 아가로스 미세입자가
    (a) 좁은 크기분포 범위를 갖거나,
    (b) 다공성이거나,
    (c) 직경이 10㎛ 미만이거나,
    (d) T-세포 에피토프 또는 B 세포 에피토프중 하나 또는 둘다를 포함할 수 있는 하나 이상의 면역 활성 항원성 에피토프가 결합되거나,
    (e) 하나 이상의 병원체 인식 수용체 효능제와 결합되는 성질 중 하나 이상을 갖는 면역학적 활성 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 미세입자가 직경이 5㎛ 미만인 면역학적 활성 조성물.
  21. (a) 하나 이상의 병원체 관련 분자 패턴;
    (b) 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프; 및
    (c) 내성이 유도되도록 조성물을 유기체의 선천성 면역계 세포에 특이적으로 전달하는데 효과적인 하나 이상의 아가로스 미세입자 담체를 포함하는, 내성을 유도하는 면역학적 활성 조성물.
  22. 병원체와 동일한 크기 범위이거나 이보다 작은 아가로스 미세입자가 결합된 하나 이상의 면역 활성 항원성 에피토프 및 하나 이상의 병원체 관련 분자 패턴을 포함할 수 있고, 생체내 전달에 의해 피험체에 전달되어 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 병원체 관련 분자 패턴 및 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프가 아가로스 미세입자에 공유적으로 연결되는 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 조성물의 투여가,
    (a) 감염된 동물에서 병원체 수가 감소되거나 병원체가 제거되거나,
    (b) 세포로의 병원체 진입이 차단되거나,
    (c) 혼입된 에피토프가 보체를 활성화시킬 수 있는 차단(중화) 항체를 생성시킬 수 있거나,
    (d) IL-10을 유도할 수 있는 단백질 또는 수용체에 대한 병원체 또는 병원체 일부의 결합을 방해할 수 있는 에피토프의 차단이 보호 면역을 생성시키거나,
    (e) 에피토프의 차단이 IL-10 생산을 감소시키거나,
    (f) 확립된 감염을 제거시키거나,
    (g) 면역 반응이 병원성 미생물상의 진입 수용체 결합 요소를 방해하거나,
    (h) 면역 반응이 병원성 미생물상의 글리코사미노글리칸 결합 요소를 방해하거나,
    (i) 면역 반응이 병원체로 감염된 세포를 제거하는 결과 중 하나 이상을 성취하는 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 점막 경로, 비경구 경로 및 피부 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경로를 통한 생체내 전달에 의해 전달되는 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 조성물의 투여가 하나 이상의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유발하고 약물이 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여되고 면역 반응이 Th1 또는 Th2 반응 또는 이들의 조합을 포함하는 면역학적 활성 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 조성물이 보호 면역 반응을 유발하는 대상인 병원체가
    (a) 세포내 병원체이거나,
    (b) 잠복 감염을 유발할 수 있거나,
    (c) 마이코플라스마인 것 중 하나 이상을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 병원체가 마이코플라스마인 조성물.
  29. 크기가 병원체와 같거나 병원체보다 작은 아가로스 미세입자와 결합되어 있는 병원체 관련 분자 패턴과 하나 이상의 면역 활성 항원 또는 항원 에피토프를 포함하고 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있는, 분자, 단백질 또는 병원체에 대한 Th reg 반응을 포함하는 내성 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  30. 크기가 병원체와 같거나 병원체보다 작은 아가로스 미세입자에 결합되어 있는 병원체 관련 분자 패턴의 배합물과 하나 이상의 면역 활성 항원 에피토프를 포함하는 조성물로서, 유도된 내성이 (i) 면역 기능 또는 면역 회피의 조절 반응 또는 하향 조절의 유도 및 (ii) IL-10 생산을 증가시키는 면역 반응으로부터 선택된 반응을 포함하는, 면역 활성 항원 에피토프에 대한 내성을 유도하기 위한 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 조성물이 N-당화의 결과물일 수 있는 탄수화물 성분을 가질 수 있는 소수성 잔기를 갖는 면역활성 에피토프를 포함할 수 있고, 지질-함유 잔기가 면역 활성 항원성 에피토프와 무관하게 미세입자에 부착될 수 있고, 소수성 잔기가 이에 부착된 다른 분자를 갖고 면역 활성 항원성 에피토프가 아스파라긴, 트레오닌 및 세린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 모티프를 포함할 수 있고, 당해 모티프가 Asp-X-Ser 또는 Asp-X-Thr 모티프(이때, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다)로서 모티프가 항체에 의해 차단될 수 있는 조성물.
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