ES2575395T3 - Composiciones para la transfección de células - Google Patents

Abstract

Compuesto que comprende un péptido ramificado cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, en donde el péptido está unido a al menos un ligando del receptor tipo Toll (TLR) que se une a TLR-2 y en donde dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con ADN.

Description

DESCRIPCION

Composiciones para la transfeccion de celulas 5 Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere, en conjunto, al campo de biologfa celular. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo de transfeccion de celulas, en particular celulas dendnticas, y a un metodo de provocacion de una respuesta inmunitaria. Para este fin, la presente invencion proporciona compuestos

10 que comprenden al menos un grupo cargado positivamente como se define por las reivindicaciones, capaz de unirse a acidos nucleicos, unido a un residuo capaz de interaccionar con uno o mas miembros de la familia del receptor tipo toll (TLR).

Antecedentes de la invencion

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[0002] Como se usa en la presente memoria, la expresion "derivado de" debe adoptarse que indicando un entero especificado puede obtenerse de una fuente particular, aunque no necesariamente de forma directa de esa fuente.

[0003] Durante toda la memoria, salvo que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende", o variaciones 20 tales como "comprenden" o "que comprende", se entendera que implican la inclusion de una etapa o elemento

indicado o entero o grupo de etapas o elementos o enteros, pero no la exclusion de ninguna otra etapa o elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

[0004] Los expertos en la materia apreciaran que la invencion descrita en la presente memoria es susceptible a 25 variaciones y modificaciones diferentes a las descritas espedficamente.

[0005] La presente invencion no debe limitarse en su alcance por los ejemplos especificados descritos en la presente memoria. Se describen en la presente memoria productos, composiciones y metodos funcionalmente equivalentes.

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[0006] La presente invencion se realiza sin experimentacion excesiva usando, salvo que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, virologfa, tecnologfa de ADN recombinante, smtesis de peptidos en solucion, smtesis de peptidos en fase solida, e inmunologfa. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en los siguientes textos:

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1. Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Segunda Edicion (1989), Volumenes I, II, y III al completo;

2. DNA Cloning: A6 Practical Approach, Vol. I y II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, todo el texto;

3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, todo el texto, y 40 particularmente los artmulos en el mismo por Gait, pag. 1-22; Atkinson et al., pag. 35-81; Sproat et al., pag. 83115; y Wu et al., pag. 135-151;

[0007] Referencias a cualquier tecnica anterior en esta memoria no se adopta, y no debe adoptarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta tecnica anterior forme parte del conocimiento general

45 comun en Australia.

[0008] El suministro de moleculas tales como lfpidos, protemas, peptidos, ADN, polisacaridos y/o combinaciones de los mismos (por ejemplo, lipopolisacaridos, lipoprotemas), en celulas es util para una multitud de propositos de investigacion y clmicos. Por ejemplo, para que los investigadores estudien procesos intracelulares tales como la

50 regulacion y expresion genica, las interacciones ADN-protema o interacciones protema-protema, y similares, a menudo es esencial introducir moleculas en celulas, y es deseable hacerlo con una eficacia lo mas alta posible. Actualmente los investigadores suministran moleculas a las celulas, es decir, transfectan celulas, mediante una diversidad de medios con eficacia variable. La eficacia de transfeccion de celulas depende de varios factores incluyendo el tipo de celula, la tasa y fase de division celular, y las propiedades individuales de las moleculas a 55 transfectarse, asf como el uno o mas reactivos de transfeccion.

[0009] Se cree que las vacunas de ADN provocan una respuesta inmunitaria mediante la captacion de ADN por celulas presentadoras de antfgeno tales como celulas dendnticas (DC), que posteriormente expresan el antfgeno codificado por el ADN internalizado y presentan el antfgeno al sistema inmunitario como peptidos en el contexto de

60 moleculas MHC. En modelos de animales pequenos, la administracion de ADN ha sido satisfactoria en la induccion de respuestas inmunitarias protectoras, pero se ha informado de eficacias solamente bajas en ensayos clmicos humanos, requiriendo a menudo altas dosis de ADN para inducir respuestas inmunitarias responses (Kutzler, M.A. y Weiner, D.B. 2004 J Clin Invest, 114(9), 1241-1244). Se han usado adenovirus y retrovirus como vectores para suministro genico, sin embargo, existen cuestiones en relacion a la seguridad de estos vectores para uso en seres 65 humanos use (Buckley, R.H. 2002 Lancet, 360(9341), 1185-1186). Hasta la fecha, la transfeccion de DC con

vectores relativamente seguros, no vfticos, ha demostrado ser diffcil.

[0010] Lau Y. et al. (Lipid-containing mimetics of natural triggers of innate immunity as CTL-inducing influenza vaccines. International Immunity (2006) Vol. 18, N.° 12, 1801-1813) examinaron diferentes estructuras lipfdicas de

5 fuentes bacterianas o no bacterianas acopladas a peptidos que representan epftopos vmcos de influenza reconocidos por celulas T CD8+ y CD4+.

[0011] RiedI P. et al. (Peptides containing antigenic and cationic domains have enhanced, multivalent immunogenicity when bound to DNA vaccines. J. MoL Med (2004), Vol. 82, N.° 2, 144-152) describen estrategias

10 para co-suministrar ADN y vacunas basadas en peptidos de un modo que potencie la inmunogenicidad de ambos componentes de la vacuna de combinacion para celulas T.

[0012] El ADN es una molecula cargada negativamente. Mas espedficamente, los grupos fosfato dentro de la estructura del ADN estan cargados negativamente. Por lo tanto, moleculas cationicas, que tienen una carga positiva

15 neta, pueden adsorber ADN mediante interaccion electrostatica, y son vetftculos potenciales para el ADN. Dichas moleculas cationicas incluyen micropartfculas (Minigo, G. et al. 2007 Vaccine, 25(7), 1316-1327; Mollenkopf, H.J. et al. 2004 Vaccine, 22(21-22), 2690-2695), peptidos (Gratton, J.P. et al. 2003 Nat Med, 9(3), 357-362; Riedl, P. et al. 2006 Methods Mol Med, 127, 159-169), o liposomas (Jiao, X. et al. 2003 Hepatology, 37(2), 452-460; Ewert, K. et al. 2002 J Med Chem, 45(23), 5023-5029). Kawamura et al., 2006, Biochemistry 45, 1116-1127, describen el uso de 20 ciertos peptidos tetramericos para condensar y suministrar ADN plasirftdico a celulas CHO.

[0013] Simplemente transportar ADN a celulas presentadoras de antfgeno, sin embargo, no es suficiente para provocar la transfeccion, y, para dirigir una respuesta espedfica de antfgeno, tambien debe haber captacion del ADN en las celulas del sistema inmunitario. Las celulas presentadoras de antfgeno del sistema inmunitario receptores tipo

25 toll (TLR) sobre su superficie celular, que se unen a una diversidad de ligandos, derivados en gran medida de microorganismos. Por ejemplo, se sabe que TLR-2 se une a lipoprotemas bacterianas, se sabe que TLR-4 se une a lipopolisacaridos bacterianos, se sabe que TLR-6, en asociacion con TLR-1, se une a ftpidos bacterianos diacilados, y TLR-9 se une a ADN CpG. Se ha demostrado que subconjuntos de celulas dendrfticas expresan no menos de nueve de dichos TLR. El acoplamiento de uno o mas TLR sobre la superficie de DC induce rutas de senalizacion 30 celular, que pueden conducir a la maduracion y activacion de DC, que es necesario para la induccion de inmunidad protectora.

[0014] El residuo lipfdico, dipalmitoil-S-gliceril cistema (Pam2Cys), es un analogo sintetico de una lipoprotema bacteriana conocida como MALP-2, derivada de la membrana citoplasmatica de Mycoplasma fermentans. Pam2Cys

35 es un ligando tanto para TLR-2 como para TLR-6 (Okusawa, T. et al., Infect Immun 2004, 72(3), 1657-1665). Vacunas que comprenden Pam2Cys acoplado a epftopos peptfdicos pueden inducir fuertes respuestas humorales y celulares. El acoplamiento de TLR-2 por Pam2Cys acoplado a epftopos peptfdicos provoca la maduracion de DC, la activacion de factores de transcripcion tales como NF-kB, la secrecion de citoquinas proinflamatorias y la migracion final de DC a los ganglios linfaticos de drenaje para activar celulas T vftgenes espedficas de epftopo (Jackson, D.C. 40 et al. 2004 Proc Natl Acad Sci USA, 101(43), 15440-15445; Zeng, W. et al. 2002 J Immunol, 169(9), 4905-4912; Chua, B.Y. et al. 2007 Vaccine, 25(1), 92-101).

Descripcion resumida de la invencion

45 [0015] En el trabajo que ha conducido a la presente invencion, los inventores buscaron producir un medio eficaz de transfeccion de celulas con acidos nucleicos. Tambien se ha buscado producir una vacuna de ADN candidata que aborde celulas presentadoras de antfgeno, en particular celulas dendrfticas, para provocar respuestas inmunitarias tanto humores como celulares en un sujeto.

50 [0016] En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que comprende un peptido ramificado cargado positivamente, que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2 y en el cual dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con otro ADN.

55 [0017] En un segundo aspecto, la descripcion proporciona un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un peptido ramificado cargado positivamente, que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente. En un tercer aspecto, se proporciona el uso de un compuesto o un complejo como se ha 60 descrito anteriormente en la fabricacion de un reactivo para la transfeccion de celulas.

[0018] Se describe adicionalmente un metodo de transfeccion que comprende poner en contacto una celula que expresa un TLR con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con 65 el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.

[0019] Se describe en la presente memoria tambien un metodo para generar una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado

5 positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antigeno o un epttopo del mismo.

[0020] Se describe adicionalmente un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto celulas transfectadas con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en

10 el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.

[0021] Tambien se describe un metodo de represion de la expresion de un gen en una celula que expresa un TLR, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende

15 dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, en el cual el acido nucleico se selecciona entre el grupo que consiste en: ARNip; ARNhc; ADN que codifica ARNip; y ADN que codifica ARNhc; y esta dirigido contra el gen.

20 [0022] Se describe adicionalmente usos de un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR en: la fabricacion de una vacuna para la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con una anormalidad o deficiencia genetica; y la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece expresion aberrante o indeseada de otro modo de un gen.

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Breve descripcion de los dibujos

[0023]

30 La Figura 1 es una representacion diagramatica de las diversas construcciones peptfdicas fluorescentes sintetizadas. Abreviaturas; R, arginina; K, lisina; L, lineal; FL, fluorescema o carboxilfluorescema.

La Figura 2 es una representacion fotografica de un analisis en gel de agarosa de interacciones de R4 y ADN. Se incubaron cantidades variables (10, 1, 0,5 o 0,1 |jg) de R4 con 1 |jg de (A) plasmido pEGFP-N1 o (B) plasmido

35 pCI-HA durante 30 minutos a 37 °C. Las muestras despues se ejecutaron en un gel de agarosa al 1 % que contema tincion de gel de ADN SYBR-Safe de modo que el ADN pudiera visualizarse en luz UV.

La Figura 3 muestra lecturas de absorbancia a 260 nm de soluciones que contienen R4 y ADN.

40 Se incubaron cantidades crecientes de R4 con 10 jg de plasmido pCI-HA durante 30 minutos a 37 °C en un volumen total de 100 jl de agua. (A) Se centrifugaron las muestras a 9300 g para sedimentar cualquier complejo insoluble y se midieron las lecturas de absorbancia de los sobrenadantes recogidos a 260 nm (barras grises claras). Tambien se midieron las lecturas de absorbancia de sobrenadantes de lavado despues de resuspender las muestras sedimentadas con 100 jl de agua (barras grises oscuras). (B) Los sobrenadantes y sobrenadantes

45 de lavado tambien se ejecutaron en un gel de agarosa al 1 % que contema tincion de gel de ADN SYBR-Safe para detectar la presencia de ADN en estas muestras.

La Figura 4 es una representacion grafica de la transfeccion de celulas D1 con plasmido pEGFP-N1 y regulacion positiva de la expresion de MHC Clase II en celulas D1. Se cultivaron celulas D1 (4x105), derivadas de

50 esplenocitos BALB/c, a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % con 1 jg de plasmido pEGFP-N1 pre-incubado con 3 jg de R4 o R4(S2Pam2Cys) durante 30 minutos a 37 °C, o con una relacion 3:1 de FUGENE® a ADN plasmfdico durante 45 minutos a temperatura ambiente. Despues de 2 dfas, se recogieron las celulas y se determino la fluorescencia verde por citometna de flujo (A). Las celulas tambien se tineron con anticuerpo anti- MHC Clase II murino (IA/E) conjugado con fluorocromo antes del analisis por citometna de flujo (B). Se considero

55 que las celulas que expresaban altos niveles de NHC Clase II eran maduras (partes sombreadas del histograma) mientras que expresan niveles bajos se consideraron inmaduras (no sombreadas). El porcentaje de celulas en esta categona tambien se indica con cada panel como un promedio y desviacion tfpica obtenida por analisis de muestras por triplicado.

60 La Figura 5 es una representacion grafica de la transfeccion de celulas D1 usando mezclas de diferente relacion de reactivo de transfeccion a ADN. Se cultivaron celulas D1 (4x105) derivadas de esplenocitos BALB/c durante 48 horas, a 37 °C en CO2 al 5 %, con 1 jg de plasmido pCI-HA pre-incubado con relaciones diferentes de R4 o R4(S2Pam2Cys) durante 30 minutos a 37 °C, o con diferentes relaciones de FUGENE® durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las celulas despues se recogieron y se tineron con un anticuerpo anti-HA (clon E2.6) que

65 se detecto con un anticuerpo de cabra anti-Ig murina conjugado con FITC antes del analisis por citometna de

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flujo.

La Figura 6 es una representacion grafica de la transfeccion de celulas dendnticas derivadas de monocitos (MoDC) humanos con plasmidos, pEGFP-N1 y pCI-HA. Se cultivaron celulas dendnticas derivadas de monocitos (2x105) a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % con 1 |jg de plasmido pEGFP-N1 pre-incubado con 3 |jg de R4 o R4(S2Pam2Cys) durante 30 minutos a 37 °C, o con una relacion 3:1 de FUGENE® a ADN plasirndico durante 45 minutos a temperatura ambiente. Despues de 2 d^as, las celulas se recogieron y se determino la protema fluorescente verde en celulas transfectadas con el plasmido pEGFP-N1 por citometna de flujo (A). Para celulas transfectadas con el plasmido pCI-HA, se uso un anticuerpo anti-HA conjugado con fluorocromo para detectar la expresion superficial de protema HA (B).

La Figura 7 es una representacion grafica de niveles de transfeccion de protema fluorescente verde en dos lmeas celulares diferentes usando mezclas de diferente relacion de reactivo de transfeccion a ADN. Se sub- cultivo la lmea de celulas epiteliales de pulmon humano A549 (A) o la lmea celular de macrofagos alveolares pulmonares murinos MH-S (B) a una concentracion de 2x105 celulas/ml en ausencia o presencia de plasmido que codifica protema fluorescente verde en complejo con diferentes diluciones de R4, R4Pam2Cys o FUGENE durante 48 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Se determino la eficacia de transfeccion midiendo la fluorescencia de celulas en un citometro de flujo.

La Figura 8 es una representacion grafica de los niveles de anticuerpo espedfico de HA en ratones no inmunizados, y en ratones inmunizados con complejos de R4Pam2Cys y aDn, o virus de la influenza. Se inoculo a ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por via subcutanea en la base de la cola en el dfa 0 y 28 con 50 jg de plasmfdico de ADN que comprendfa ADN que codifica hemaglutinina de la influenza, solo en complejo con R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares de 1:3 o 1:5. Como control positivo, los ratones tambien se inmunizaron por via intranasal con virus PR8 dividido (3 jg/raton). Los ratones no inmunizados sirvieron como controles negativos. Se obtuvieron sueros de ratones 14 dfas despues de la ultima inoculacion y se realizo ELISA para detectar la presencia de anticuerpos espedficos para el virus PR8 de la influenza.

La Figura 9 es una representacion grafica de las cantidades de celulas T CD8+ productoras de IFN-y, espedficas de antfgeno inducidas en el bazo (A) y los ganglios linfaticos inguinales (B) de ratones inmunizados con complejos R4Pam2Cys y ADN. Se inoculo a ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por via subcutanea en la base de la cola con 20 jg de plasmido de ADN que codificaba nucleoprotema de la influenza sola o en complejo con R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares 1:1, 1:2 o 1:5 de NH3+:PO4". La formacion de complejos se consiguio anadiendo lentamente almuotas de 10 jl de una solucion que contema R4(S2Pam2Cys) a una solucion de ADN cada 2 minutos durante un periodo total de 1 hora. Todos los inoculantes se disolvieron en NaCl 0,7 M. Se retiraron los bazos y los ganglios linfaticos inguinales de los ratones 7 o 10 dfas despues de las inmunizaciones y se realizo tincion de citoquinas intracelulares para detectar la presencia de celulas T CD8+ que secretaban IFN-y espedficas para nucleoprotema-147-155. Cada barra representa la media y error tfpico de dos ratones.

Descripcion detallada de la invencion

[0024] Sorprendentemente, los inventores han encontrado que los compuestos de la presente invencion forman un complejo estable con ADN. El ADN se une a la parte cationica del compuesto y este complejo se dirige, mediante la parte de ligando de TLR del compuesto, a celulas que expresan receptores que reconocen el ligando, por ejemplo, celulas presentadoras de antfgeno tales como DC.

[0025] Una ventaja proporcionada por los compuestos de la presente invencion es que son capaces de abordar celulas que expresan tLr. Como resultado de la union a TLR, los compuestos de la presente invencion se internalizan y tambien inducen rutas de senalizacion mediadas por TLR. En particular, la union de TLR-2 por la parte Pam2Cys de los compuestos de la presente invencion, causa maduracion de DC, provocando la migracion de las DC a ganglios linfaticos y presentacion eficaz de antfgeno a linfocitos T.

[0026] En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina y al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2 y en el cual dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con otro ADN. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invencion comprenden dicho grupo cargado positivamente unido covalentemente a al menos uno de dichos ligandos de TLR.

[0027] En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina y al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2 en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.

[0028] En un tercer aspecto, se proporciona el uso de un compuesto o un complejo como se ha descrito

5

anteriormente en la fabricacion de un reactivo para transfeccion de celulas.

[0029] Se describe adicionalmente un metodo de transfeccion que comprende poner en contacto una celula que expresa un TLR con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con

5 el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.

[0030] Se describe en la presente memoria tambien un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de tLr, en el cual el

10 acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.

[0031] Se describe adicionalmente un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto celulas transfectadas con un complejo que comprende acido nucleico y un

15 compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.

[0032] Tambien se describe un metodo de represion de la expresion de un gen en una celula que expresa un TLR, 20 que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende

dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, en el cual el acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: ARNip; ARNhc; ADN que codifica ARNip; y ADN que codifica ARNhc; y esta dirigido contra el gen.

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[0033] Se describen adicionalmente usos de un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR en: la fabricacion de una vacuna para la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con una anormalidad o deficiencia genetica; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece

30 expresion aberrante o indeseada de otro modo de un gen.

[0034] La presente invencion proporciona compuestos como se define por las reivindicaciones que comprenden dicho grupo cargado positivamente unido a al menos un ligando de TLR que se une a TLR-2. La union del ligando de TLR al TLR provoca la captacion del compuesto por una celula que expresa el TLR; y/o senalizacion mediante la

35 ruta de senalizacion mediada por TLR.

[0035] El termino "TLR" como se usa en la presente memoria hace referencia a uno o mas receptores tipo toll, que pueden definirse como una clase de receptores unidos a membrana que se unen a moleculas estructuralmente conservadas derivadas de microbios. Hasta ahora se han identificado trece TLR, de TLR-1 a TLR-13, y se estima

40 que la mayona de las especies de mairnfero tienen entre 10 y 15 tipos de receptores tipo toll. (Du, X. et al. 2000. Eur. Cytokine Netw. 11:362-371; Chuang, T.H., y Ulevitch, R.J. 2000. Eur. Cytokine Netw. 11:372-378; Tabeta, K. et al. 2004 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101:3516-3521). Los TLR son un tipo de receptor de reconocimiento de patron (PRR) y sus ligandos se conocen colectivamente como patrones moleculares asociados a patogeno (PAMP).

45 [0036] Un "ligando de TLR" como se usa en la presente memoria significa una molecula que se une selectiva o preferentemente a un TLR. Ejemplos de ligandos de TLR incluyen elementos conservados en patogenos e incluyen: lipopolisacaridos de superficie celular bacteriana (LPS), lipoprotemas, lipopeptidos y lipoarabinomanano; protemas tales como flagelina de flagelos bacterianos; ARN bicatenario de virus o los motivos CpG no metilados de ADN bacteriano y vmco; y otros ciertos ARN y ADN. Tambien se han identificado ligandos endogenos de TLR, incluyendo 50 fibrinogeno, protemas de choque termico (HSP), y ADN.

[0037] La Tabla 1 enumera los TLR actualmente conocidos por expresarse en celulas dendnticas, junto con sus ligandos correspondientes.

Tabla 1. Receptores tipo toll expresados por DC

Familia

Receptor Ligando Referencias

Receptores tipo toll

TLR-1 lfpidos bacterianos triacilados (TLR-1 y 2) (Takeuchi 2002)

TLR-2 peptidoglucano, zimosano de levadura, lipoprotemas bacterianas (Schwandner 1999, Ozinsky 2000, Takeuchi 2000, Schjetne 2003)

TLR-3 ARN bicatenario (Alexopoulou 2001)

TLR-4 LPS, hsp60 y hsp70 (Poltorak 1998, Chow 1999, Asea 2002, Bulut 2002, Flusebye 2006)

Familia Receptor TLR-5

Ligando flagelina Referencias (Hayashi 2001)

TLR-6

L^pidos bacterianos diacilados (TLR-2 y 6) (Morr 2002, Okusawa 2004)

TLR-7

compuestos de imidazoquinolina (Hemmi2 002)

TLR-8

ARN monocatenario (Heil 2004)

TLR-9

ADN CpG (Flemmi 2000, Takeshita 2001)

TLR-10

aun a descubrir (Flacher 2006)

TLR-11

aun a descubrir (Pepper 2008)

Abreviaturas: CpG, citosina fosfato guanina; hsp, protema de choque termico; LPS, lipopolisacarido; ARN, acido ribonucleico

[0038] Un compuesto ejemplar de la presente invencion es un peptido cationico unido al lipopeptido "Pam2Cys". Un experto en la materia entendena que el termino "lipopeptido" significa cualquier composicion de materia que comprenda uno o mas residuos lipfdicos y una o mas secuencias de aminoacido que estan conjugadas. "Pam2Cys"

5 (tambien conocido como dipalmitoil-S-gliceril-cistema o S-[2,3 bis(palmitoiloxi) propil] cistema se ha sintetizado (Metzger, J. W. et al. 1995. J Pept Sci 1:184) y corresponde al residuo lfpido de mAlP-2, un lipopeptido activador de macrofagos aislado de Mycoplasma fermentans (Sacht, G. et al. 1998. Eur J immunol 28:4207; Muhiradt, P. F. et al. 1998. infect immun 66:4804; Muhiradt, P. F. et al. 1997. J Exp Med 185: 1951). Pam2Cys es conocido por ser un ligando de TLR-2.

10

[0039] Pam2Cys tiene la estructura de Formula (I):

imagen1

15 [0040] Otros residuos lipfdicos que pueden usarse para abordar TLR de superficie celular incluyen palmitoilo, miristoilo, estearoilo, lauroilo, octanoilo, o decanoilo. Grupos preferidos incluyen Pam2Cys, PamaCys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys.

[0041] Los grupos cargados positivamente de la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, los 20 compuestos cationicos enumerados en la Tabla 2 y los compuestos policationicos descritos en el documento US 6.689.478 y el documento US 4.035.558.

_______Tabla 2. Compuestos cationicos________________

Compuestos cationicos Referencias

Penetratina Tat 48-60 de VIH Rev 34-50 de VIH Transportano

Peptidos de oligoarginina (lineales y ramificados) Peptidos de oligolisina (lineales y ramificados)

Pirrocoricina

Peptido modelo anfipatico de alfa-helice Polilisina

Protamina (por ejemplo, protamina de salmon)

(Christiaens 2004) (Fawell 1994)

(Futaki 2001)

(Pooga 1998)

(Buschle 1997, Mitchell 2000)

(Otvos 2004)

(Oehike 1998)

(Wagner 1990) (Wagner 1990)

Compuestos cationicos

Referencias

FL17 ([(Me2NCH2CHOHCH2)n]n+Cln)

(Billingham 1997)

Magnafloc 1697 ([(CH2CHCH2N(Me)2CH2CHCH2)n]n+Cln)

(Billingham 1997)

[0042] Como los acidos nucleicos, debido a los grupos fosfato dentro de la estructura de los acidos nucleicos, son moleculas con carga negativa neta, se unen por los grupos cargados positivamente de los compuestos de la presente invencion, mediante interaccion electroestatica, para formar un complejo estable.

5

[0043] Segun la invencion, el grupo cargado positivamente es un peptido ramificado que comprende al menos cuatro residuos de arginina o lisina.

[0044] Debe entenderse que referencias a un "acido nucleico" deben entenderse como una referencia tanto a 10 acido desoxirribonucleico (ADN) como a acido ribonucleico (ARN), incluyendo ADN bicatenario, ARN bicatenario,

ADN monocatenario, ARN monocatenario, moleculas de ARN interferente pequeno (ARNip), triplex, cuadruplex y cualquier molecula de acido nucleico de multiples hebras (multiplex), tubridos de acido nucleico tales como acidos peptidonucleicos (PNA), una molecula que comprende tanto bases de acido desoxirribonucleico como bases de acido ribonucleico, y cualquier variante nucleotfdica.

15

[0045] En un aspecto, las moleculas de acido nucleico se proporcionan como "plasmidos". Referencias a "plasmidos" deben entenderse como una referencia a una molecula de acido nucleico que se puede transmitir a una celula hospedadora y puede experimentar replicacion en la celula hospedadora. La molecula de acido nucleico no debe limitarse, sin embargo, a plasmidos, sino que puede ser cualquier molecula de acido nucleico, incluyendo ADN

20 o ARN vmco.

[0046] Un experto en la materia apreciana que la transfeccion de celulas con acidos nucleicos es util para muchas aplicaciones de investigacion y clmicas. Referencias a "transfeccion" deben entenderse como referencia a un procedimiento por el cual se introducen moleculas exogenas, incluyendo acidos nucleicos, en celulas.

25

[0047] Muchas aplicaciones de investigacion requieren transfeccion de celulas. Actualmente, los investigadores introducen moleculas en celulas, es decir, transfectan celulas, por una diversidad de medios con eficacia variable. Estan actualmente disponibles varios reactivos de transfeccion para los investigadores, incluyendo FUGENE. Sin embargo, la eficacia de transfeccion de celulas depende de, por ejemplo, el tipo de celula, la tasa y fase de division

30 celular, y las propiedades individuales tanto de las moleculas a transfectar como del uno o mas reactivos de transfeccion.

[0048] Los compuestos de la presente invencion son particularmente utiles para la transfeccion de celulas que expresan TLR. Por lo tanto, celulas que expresan de forma natural TLR o celulas que se han transfectado de forma

35 estable para expresar un TLR, sea el receptor completo o un receptor modificado que carece del dominio de senalizacion intracelular, pueden transfectarse con acidos nucleicos en complejo con los compuestos de la presente invencion.

[0049] Una "celula" debe entenderse como cualquier celula en la cual se suministra una molecula de acido 40 nucleico mediante los compuestos de la presente invencion. La celula puede ser una celula in vitro, in vivo o ex vivo.

La celula puede aislarse o formar parte de los organismos o tejidos de un animal vivo. Una celula tambien puede ser un microorganismo tal como bacterias, levaduras, hongos, mohos, parasitos, algas y similares. Una celula tambien puede ser una celula animal cultivada o lmea celular, o una celula artificial.

45 [0050] Referencias a "aislado", en terminos de las celulas de ciertas realizaciones de la presente invencion, deben entenderse como una referencia a material que se ha retirado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si fuera de origen natural). Por ejemplo, una celula presente en el tejido de un organismo vivo no esta aislada, pero la misma celula, cuando se separa de algunas o todas las celulas coexistentes en el sistema natural, esta aislada.

50 [0051] Un aspecto de la descripcion proporciona compuestos, que pueden formar un complejo estable con acidos nucleicos mediante interaccion electrostatica entre el grupo cargado positivamente y el acido nucleico cargado negativamente. Los compuestos de la presente invencion proporcionan un medio para dirigir acidos nucleicos a celulas que expresan TLR-2.

55 [0052] La presente invencion proporciona compuestos como se define por las reivindicaciones, que pueden formar un complejo estable con ADN mediante interaccion electrostatica entre el peptido cationico y el ADN cargado negativamente. Dichos compuestos proporcionan un medio de direccionamiento del ADN a celulas que expresan TLR, por ejemplo, celulas presentadoras de antfgeno, y mas particularmente DC.

60 [0053] Se describe adicionalmente un metodo de transfeccion que comprende poner en contacto una celula que

expresa un TLR con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente unido a al menos un residuo que se une a un TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.

5 [0054] Tambien se describe un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente unido a al menos un residuo que se une a un tLr, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.

10

[0055] Se describe en el contexto de la presente invencion un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto celulas transfectadas con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente unido a al menos un residuo que se une a un TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido

15 nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epftopo del mismo.

[0056] El contacto de las DC con compuestos de la presente invencion puede provocar la maduracion o activacion de DC, que se indica por un aumento en la expresion de MHC Clase II de superficie celular. Por lo tanto, compuestos que comprenden un ligando de TLR pueden ser utiles no solamente para abordar DC, sino tambien

20 para su activacion mediante TLR y moleculas de senalizacion cadena abajo tales como MyD88.

[0057] Por consiguiente, los compuestos de la presente invencion son utiles para activar DC. Para que las celulas dendnticas induzcan una respuesta inmunitaria, primero deben activarse de modo que expresen las moleculas necesarias de adhesion y co-estimuladoras para migrar a los ganglios linfaticos y activar linfocitos T. Compuestos

25 que comprenden ligandos de TLR en complejo con ADN son particularmente utiles para activar DC, y cuando el ADN codifica una protema, las DC transfectadas presentan fragmentos peptfdicos de la protema codificada por el ADN traducido a celulas inmunitarias, invocando de ese modo una respuesta inmunitaria celular y humoral. En otras palabras, los compuestos de realizaciones particulares de la presente invencion cuando estan en complejo con ADN, son utiles para enfoques de vacunacion con ADN.

30

[0058] Referencias a "vacunacion con ADN" como se usa en la presente memoria significan referencias a la administracion de ADN a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria contra la protema codificada por el mismo. Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse directamente a un sujeto por cualquier via, incluyendo, aunque sin limitacion: intravenosa; intranasal; intramuscular; oral; rectal y similares.

35

[0059] Referencias a "respuesta inmunitaria" como se usa en la presente memoria significan una referencia a la accion concertada de linfocitos, celulas presentadoras de antfgeno, celulas fagocfticas, granulocitos, y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el hugado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que provoca dano selectivo en, destruccion de, o eliminacion desde el organismo humano de

40 patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.

[0060] Referencias a "respuesta de linfocitos T" como se usa en la presente memoria significan una referencia al componente de la respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T (es decir, la proliferacion y/o diferenciacion de

45 linfocitos T en linfocitos T auxiliares, citolfticos citotoxicos, o supresores, la provision de senales por linfocitos T auxiliares a linfocitos B que causan o evitan la produccion de anticuerpos, la eliminacion de celulas diana espedficas pro linfocitos T citotoxicos, y la liberacion de factores solubles tales como citoquinas que modulan la funcion de otras celulas inmunitarias).

50 [0061] "Paciente", "sujeto", o "mairnfero" se usan de forma intercambiable y hacen referencia a marnfferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, asf como animales experimentales tales como conejos, ratas y ratones, y otros animales. Los animales incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamfferos y no mamfferos, tales como ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, y reptiles.

55 [0062] Ademas de su uso en vacunacion con ADN, los compuestos de la presente invencion son utiles para otras varias aplicaciones clmicas. Por ejemplo, tratamientos para enfermedades autoinmunitarias o cancer pueden requerir transfeccion de celulas autologas, tales como celulas madre hematopoyeticas (HSC) o celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). Dichas celulas pueden recogerse de un sujeto, cultivarse in vitro, diferenciarse opcionalmente en DC por metodos bien conocidos en la tecnica, y/o transfectarse con acido nucleico, y

60 posteriormente infundirse de nuevo en el sujeto. En algunos casos, el acido nucleico codifica un antfgeno de vacuna y las celulas transfectadas pueden estar pretendidas para invocar una respuesta inmunitaria. En otros aspectos, el acido nucleico puede codificar una citoquina o un tolerogeno antigenico.

[0063] En otro aspecto, se describe un metodo de represion de la expresion de un gen en una celula que expresa

65 un TLR, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que

comprende un grupo cargado positivamente unido a un ligando de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: ARNip; ARNhc; ADN que codifica ARNip; y ADN que codifica ARNhc; y en el cual el ARNip o ARNhc esta dirigido contra el gen.

5

[0064] "Tratar" o "tratamiento" incluyen la administracion de las composiciones, compuestos o agentes descritos en la presente memoria para prevenir o retardar la aparicion de los smtomas, complicaciones, o indicios bioqmmicos de una enfermedad, aliviar o mejorar los smtomas o detener o inhibir el desarrollo adicional de la enfermedad, afeccion, o trastorno (por ejemplo, una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria).

10 "Tratar" se refiere adicionalmente a cualquier indicio de exito en el tratamiento o mejora o prevencion de la enfermedad, afeccion, o trastorno (por ejemplo, una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria), incluyendo cualquier parametro objetivo o subjetivo tal como mitigacion; remision; disminucion de los smtomas o hacer que la afeccion patologica sea mas tolerable al paciente; ralentizacion en la tasa de degeneracion o deterioro; o hacer que el punto final de degeneracion sea menos debilitante. El tratamiento o mejora 15 de los smtomas puede basarse en parametros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen por un medico. Por consiguiente, el termino "tratar" incluye la administracion de los compuestos o agentes descritos en la presente memoria para prevenir o retardar, aliviar, o detener o inhibir el desarrollo de los smtomas o afecciones asociados con una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria. La expresion "efecto terapeutico" se refiere a la reduccion, eliminacion, o prevencion de la enfermedad, smtomas de la enfermedad, o 20 efectos secundarios de la enfermedad en el sujeto. "Tratar" o "tratamiento" usando los metodos que incluyen prevenir la aparicion de los smtomas en un sujeto que puede estar en riesgo aumentado de una enfermedad infecciosa, inflacion, o una enfermedad autoinmunitaria pero que no experimenta o muestra smtomas, inhibir los smtomas de una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria (ralentizacion o detencion de su desarrollo), proporcionar alivio de los smtomas o efectos secundarios de una enfermedad infecciosa, inflacion 25 o una enfermedad autoinmunitaria (incluyendo tratamiento paliativo), y aliviar los smtomas de una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria (causar regresion). El tratamiento puede ser profilactico (para prevenir o retardar la aparicion de la enfermedad, o para prevenir la manifestacion de smtomas clmicos o subclmicos de la misma) o supresion terapeutica o alivio de los smtomas despues de la manifestacion de la enfermedad o afeccion.

30

[0065] Tambien se describen en la presente usos de compuestos que comprenden un grupo cargado positivamente unido a un ligando de TLR en: la fabricacion de una vacuna para la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con una anormalidad o deficiencia genetica; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece una expresion

35 aberrante o indeseada de otro modo de un gen; y en la fabricacion de un reactivo para la transfeccion de celulas.

[0066] Los compuestos y los metodos expuestos en la presente memoria pueden usarse tanto para aplicaciones medicas como para aplicaciones veterinarias. Tfpicamente, el producto se usa en seres humanos, pero tambien puede usarse en otros mairnferos. Los terminos "paciente" y "sujeto" pretenden indicar un individuo mamffero, y asf

40 se usan durante toda la memoria y en las reivindicaciones. Las aplicaciones principales de la invencion implican pacientes o sujetos humanos, pero la invencion puede aplicarse a animales de laboratorio, de granja, de zoologico, salvajes, mascotas o de competicion.

[0067] Debena apreciarse que los expertos en la materia pueden introducir cualquier combinacion de grupo 45 cargado positivamente y ligando de TLR que beneficie a la aplicacion deseada.

[0068] La presente invencion se describira ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1

50

Sintesis de peptidos cationicos

[0069] Se sintetizaron construcciones de peptido ramificado usando residuos de lisina para proporcionar los puntos de ramificacion de un molde estructural. Dependiendo de la cantidad de puntos de ramificacion presentes en

55 la estructura, se produjeron estructuras di o tetracationicas (Figura 1). Estas construcciones ramificadas se sintetizaron sobre resina de PEG-S RAM (Rapp Polymere, Tubingen, Alemania; factor de sustitucion 0,27 mmol/g). Primero se acoplo Fmoc-lisina(Mtt)-OH (Novabiochem, Laufelfingen, Suiza) a la resina en un exceso de 4 veces con cantidades equimolares de O-benzotriazol-N,N,N,N',N'-tetrametil-uronio-hexafluorofosfato (HBTU; Novabiochem, Darmstadt, Alemania), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y un exceso molar de 1,5 veces de diisopropiletilamina (DIPEA; 60 Sigma, Castle Hill, Australia). Se realizo acilacion durante 40 minutos y se confirmo la reaccion completa por el ensayo de acido trinitrobencilsulfonico (TNBSA) (21). La retirada del grupo protector Fmoc sobre el grupo a-amino se consiguio con diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (Sigma, Steinheim, Alemania) al 2,5 % y Fmoc-lisina (Fmoc)-OH (Auspep, Melbourne, Australia) acoplado de modo que despues de la retirada de los grupos Fmoc, se expusieran dos grupos amino primarios para actuar como puntos de ramificacion. Se uso dimetilformamida (DMF; Auspep, 65 Melbourne, Australia) para lavar la resina entre cada etapa de acilacion y desproteccion. Posteriormente se

acoplaron aminoacidos a un exceso molar de 4 veces y se realizo acilacion durante 60 minutes. Para el ensamblaje de construcciones tetravalentes, se realizo una ronda adicional de acilacion durante 60 minutes usando Fmoc- lisina(Fmoc)-OH para producir cuatro puntos de ramificacion. Para posibilitar el ligamiento quimioselectivo de un grupo que contema un aminoacido a una construccion tetravalente de arginina (R4), se inserto cistema en el 5 extremo C-terminal de la construccion para producir R4-Cys. Para la conjugacion de carboxifluorescema en construcciones de peptido ramificado, no se retiraron los grupos Fmoc N-terminales despues de la ultima reaccion de acilacion. En su lugar, el grupo protector Mtt presente en el grupo £-amino en la lisina C-terminal se retiro por tratamiento con TFA al 1 % en diclorometano (Ajax Finechem, Seven Hills, Australia). Despues se acoplo 5(6)- carboxifluorescema (Fluka BioChemika, Suiza) al grupo £-amino expuesto usando un exceso de 4 veces en la 10 presencia de cantidades equimolares de HOBt, HBTU y un exceso molar de 1,5 veces de DIPEA durante 18 horas en la oscuridad. Despues de la acilacion, la resina se lavo con DMF y se retiraron los grupos Fmoc N-terminales. Todos los peptidos se escindieron del soporte en fase solida y los grupos protectores de cadena lateral simultaneamente. La pureza de los peptidos se evaluo por cromatograffa analttica en fase inversa usando una columna Vydac C4 (4,6 mm x 250 mm) o una columna C8 (4,6 mm x 250 mm) instalada en un sistema de 15 cromatograffa de HPLC Waters 3. Se uso un caudal de 1 ml/min usando TFA al 0,1 % en H2O y TFA al 0,1 % en acetonitrilo como disolvente limitante para revelar los cromatogramas. Cuando fue necesario, los peptidos se purificaron usando un sistema de HPLC Waters o GBC semi-preparativo y una columna Vydac C4 semi-preparativa (10 mm x 300 mm) a un caudal de 2,5 ml/min. La estimacion del contenido de peptido se determino por espectrofotometna UV en el cual se determino la absorbancia de peptidos fluoresceinados a 496 nm y la 20 concentracion se calculo usando un coeficiente de extincion molar de 83.000 M'1cm'1. Se muestran en la Figura 1 esquemas de las construcciones de peptido ramificado fluoresceinado sintetizadas.

[0070] Para la lipidacion de peptidos, se ensamblaron residuos lipfdicos acoplando N-fluorenilmetoxicarbonil-S- (2,3-dihidroxipropil)-cistema (Fmoc-Dhc-OH) a un exceso de 4 veces en presencia de cantidades equivalentes de 25 HOBt y DICI en DCM al 50 % en DMF sobre el grupo £-amino de la lisina C-terminal. La acilacion se realizo durante 40 minutos y se repitio hasta que se confirmo el acoplamiento satisfactorio usando el ensayo de acido trinitrobencenosulfonico. La lipidacion de los dos grupos hidroxi del peptido-Fmoc-Dhc unido a resina se realizo durante una noche usando una solucion que contema una cantidad equimolar de DMAP, un exceso de 10 veces de acido graso y un exceso de 12 veces de DICI.

30

Ejemplo 2

Retardo de la migracion de ADN por R4

35 [0071] Para investigar la asociacion entre el peptido R4 ramificado y ADN, se incubo una cantidad constante de plasmido de ADN pEGFP-N1 o pCI-HA, que codifica protema fluorescente verde y protema HA de influenza respectivamente, con cantidades variables de R4 y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (Figura 2).

[0072] Aumentando la cantidad de R4 en cada muestra, puedo afectarse a la migracion del ADN. Fue evidente 40 retardo parcial de la migracion del plasmido de ADN hacia el anodo, visualizado por fluorescencia con bromuro de

etidio, cuando se usaron 0,1-0,5 |jg de R4 mientras que las muestras de ADN incubadas con cantidades mayores de R4 se movieron a una velocidad mas lenta. El retardo total de la migracion del ADN se consiguio cuando estaban presentes 10 jg de R4, evidenciado por la aparicion de una banda de ADN en el origen. Esta banda, sin embargo, apareda bastante debil, lo que sugiere que habfa poco ADN en esta muestra. Esto puede deberse a: R4 inhibe la 45 union de bromuro de etidio al ADN; y/o la interaccion entre R4 y ADN provoca la formacion de un complejo insoluble que difunde en el tampon de electroforesis en lugar de migrar a traves del gel de agarosa. Estos resultados sugieren que los grupos amino y guanidina de R4 cargados positivamente son capaces de neutralizar los grupos fosfato cargados negativamente dentro de la estructura de ADN para retardar su capacidad de migrar hacia el anodo.

50 Ejemplo 3

Formacion de complejos R4-ADN

[0073] Para confirmar la union de R4 a ADN, se determino la cantidad de ADN en el sobrenadante de mezclas 55 centrifugadas que conteman cantidades crecientes de R4 y ADN midiendo la absorbancia a 260 nm (Figura 3). La

capacidad de R4 para precipitar ADN en la solucion por neutralizacion de su carga resultana en menos ADN en la solucion y por lo tanto indicana una asociacion entre los dos. Se descubrio que la cantidad de ADN en el sobrenadante centrifugado no variaba drasticamente cuando se incubaba con 0,1 jg a 5 jg de R4. Sin embargo, se produjo una ligera disminucion cuando se usaban 7,5 jg de R4 y no se detecto ADN en soluciones que conteman 60 mas que esta cantidad. Este resultado indica que la cantidad de R4 presente es proporcional a la precipitacion de ADN en la solucion. Tambien se tomaron lecturas de absorbancia en el sobrenadante de lavado usado para resuspender cualquier material insoluble centrifugado. La presencia de poco ADN en estas muestras sugiere que los precipitados de R4-ADN son estables y que el ADN no es probable que se disocie de este complejo.

65 [0074] El analisis de gel de agarosa (Figura 3B) demuestra que las bandas de ADN eran evidentes en muestras de

11

sobrenadante que conteman 1-7,5 |jg de R4 pero no en muestras que conteman 10 o 15 |jg de R4. El retardo de la migracion del ADN tambien es evidente en muestras que contienen 1 jg o mas de R4.

Ejemplo 4

5 Transfeccion de DC con R4(S2Pam2Cys)-ADN

[0075] Para determinar si las construcciones R4 o R4(S2Pam2Cys) eran capaces de inducir la expresion de ADN transfectado, se transfecto una lmea DC murina, D1, con el plasmido pEGFp usando R4 o R4(S2Pam2Cys) (Figura 4A). Los niveles de expresion de protema fluorescente verde (GFP) en estas celulas se compararon con los niveles

10 en celulas D1 que se transfectaron usando el reactivo de transfeccion disponible en el mercado FUGENE®.

[0076] No se observo fluorescencia en celulas no tratadas, en celulas tratadas con ADN solamente y en celulas tratadas con R4 junto con ADN. Sin embargo, las celulas transfectadas con R4(S2Pam2Cys) y ADN expresaron GFP a un nivel comparable con el nivel de expresion observado en celulas transfectadas con pEGFP y el reactivo

15 FUGENE®.

[0077] Tambien se descubrio que los cultivos celulares D1 comprendfan dos poblaciones celulares distintas que eran MHC Clase IIlow o MHC Clase IIhigh, correspondientes a celulas inmaduras y maduras, respectivamente (Figura 4B). Aproximadamente el 4 % de las celulas D1 no tratadas eran MHC Clase IIhigh. El tratamiento con ADN solo o

20 junto con R4 no altero apreciablemente la expresion de MHC Clase II en celulas D1. Las celulas D1 tratadas con ADN y FUGENE® comprendfan aproximadamente el 36 % de celulas MHC Clase IIhigh, y celulas D1 tratadas con R4(S2Pam2Cys) y ADN comprendfan aproximadamente un 82 % de celulas MHC Clase IIhig .

[0078] Tambien se investigo la eficacia de transfeccion usando mezclas de diferentes relaciones de reactivo de 25 transfeccion a ADN incubando celulas D1 con cantidades crecientes (0,1, 1 o 3 jg) de R4, R4(S2Pam2Cys) o

FUGENE® pre-incubadas con una cantidad constante (1 jg) de plasmido pCI-HA (Figura 5). Se determino la expresion de protema HA de influenza en la superficie celular usando un anticuerpo espedfico para HA. En el caso en que se uso R4(S2Pam2Cys) o FUGENE®, la eficacia de transfeccion, indicada por el porcentaje de celulas que expresaban protema HA en superficie, fue proporcional a la cantidad de agente de transfeccion usando. La 30 excepcion a esto fue cuando se empleo R4. Aqrn, aunque los niveles de expresion de HA eran inferiores a aquellos inducidos por mezclas de ADN que conteman R4(S2Pam2Cys) o FUGENE®, la transfeccion parecio ser optima cuando habfa una relacion igual peso a peso de R4 a ADN. Se descubrio que una relacion mayor, sin embargo, era perjudicial para la eficacia de transfeccion.

35 [0079] A todas las relaciones examinadas, se descubrio que R4(S2Pam2Cys) era superior a FUGENE® en la induccion de la expresion de antfgeno. El porcentaje maximo de celulas que se transfectaban usando R4(S2Pam2Cys) y ADN fue del 60 % a una relacion 3:1. En comparacion, solo aproximadamente el 30 % de las celulas HA positivas se detecto cuando se usaba una relacion equivalente de FUGENE® a ADN.

40 Ejemplo 5

Transfeccion de celulas dendnticas derivadas de monocitos humanos (MoDC)

[0080] Se investigo la capacidad de R4(S2Pam2Cys) de potenciar la transfeccion de celulas dendnticas derivadas 45 de monocitos humanos (MoDC). En un experimento en el cual se transfectaron MoDC con el plasmido pEGFP (Figura 6A), solamente R4(S2Pam2Cys) fue eficaz en inducir la expresion de GFP. La transfeccion de celulas con pEGFP mas FUGENE® o R4 fue relativamente ineficaz, con niveles de transfeccion en estas celulas similares a los de tratadas con el plasmido solamente. Este resultado se repitio en experimentos en el cual se transfectaron MoDC con el plasmido pCI-HA junto con cada uno de los reactivos de transfeccion (Figura 6B).

50

Ejemplo 6

Transfeccion de lmeas celulares no DC con R4(S2Pam2Cys)-ADN

55 [0081] Para investigar si construcciones de R4 o R4(S2Pam2Cys) en complejo con ADN eran capaces de transfectar lmeas celulares no DC, se transfecto la lmea celular de epitelio pulmonar humano A549 y la lmea celular de macrofagos alveolares pulmonares murinos MH-S con el plasmido pEGFP usando R4 o R4(S2Pam2Cys) (Figura 7A y 7B). La lmea celular de epitelio pulmonar humano A549 (A) o la lmea celular de macrofagos alveolares pulmonares murinos MH-S (B) se cultivaron a una concentracion de 2 x 105 celulas/ml en ausencia o presencia de 60 plasmido que codificaba protema fluorescente verde en complejo con diferentes diluciones de R4, R4(S2Pam2Cys) o FUGENE® durante 48 horas a 37 °C y CO2 al 5%. Se determino la eficacia de transfeccion midiendo la fluorescencia de las celulas en un citometro de flujo. Se ha informado de que estas dos lmeas celulares, en otros estudios, expresan TLR-2 (Oshilcawa 2003, Slevogt 2007). Se observo poca o ninguna fluorescencia en celulas A549 o MH-S no tratadas y en celulas tratadas con R4 junto con ADN. Sin embargo, las celulas A549 o MH-S transfectadas con o 65 R4(S2Pam2Cys) y ADN expresaron GFP a un nivel comparable, sino mayor, al nivel de expresion observado en

celulas transfectadas con el plasmido pEGFP y el reactivo FUGENE®.

Ejemplo 7

5 Produccion de anticuerpos especificos en ratones inmunizados con R4(S2Pam2Cys)-ADN

[0082] Se evaluo la capacidad de R4(S2Pam2Cys) en complejo con ADN de inducir anticuerpos. Se inocularon ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por v^a subcutanea en la base de la cola en el dfa 0 y 28 con 50 |jg de plasmido de ADN que comprendfa ADN que codifica hemaglutinina de influenza, solo o en complejo con

10 R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares de 1:3 o 1:5. Como control positivo, los ratones tambien se inmunizaron por via intranasal con virus PR8 dividido (3 jg/raton). Ratones no inmunizados sirvieron como controles negativos. Se obtuvieron sueros de los ratones 14 dfas despues de la ultima inoculacion y se realizo ELISA para detectar la presencia de anticuerpos espedficos para el virus PR8 de influenza. Se midieron los anticuerpos anti-HA en suero por ELISA. No se detectaron anticuerpos espedficos de HA en ratones no inmunizados o "vfrgenes" pero se 15 detectaron niveles sustanciales de anticuerpos que podfan unirse al virus de la influenza en ratones inmunizados con dos dosis de R4(S2Pam2Cys) y ADN mezclados a relaciones molares de 1:3 y 1:5 (Figura 8).

Ejemplo 8

20 Induccion de celulas T CD8+ IFN-Y-positivas, especificas de nucleoprotema de influenza en ratones inmunizados con R4(S2Pam2Cys) ADN

[0083] Se evaluo la capacidad de R4(S2Pam2Cys) en complejo con ADN de inducir respuestas inmunitarias mediadas por celulas. Se inocularon ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por via subcutanea en la base de la

25 cola con 20 jg de plasmido de ADN que codifica nucleoprotema de influenza solo o en complejo con R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares NH3+:PO4" de 1:1, 1:2 o 1:5. Se consiguio la formacion de complejos anadiendo lentamente almuotas de 10 jl a una solucion que contema R4(S2Pam2Cys) a una solucion de ADN cada 2 minutos durante un periodo total de 1 horas. Todos los inoculantes se disolvieron en NaCl 0,7 M. Se retiraron los bazos y ganglios linfaticos inguinales de los ratones 7 o 10 dfas despues de las inmunizaciones y se realizo tincion de citoquinas 30 intracelulares para detectar la presencia de celulas T CD8+ secretoras de IFN-y espedficas para nucleoprotemaw- 155. Cada barra representa la media y el error tfpico de dos ratones.

[0084] Se detectaron niveles solamente muy bajos de celulas T CD8+ activadas en los bazos y ganglios linfaticos inguinales de ratones inoculados con ADN en solitario (Figuras 9A y 9B respectivamente) y no se detectaron en

35 ratones vfrgenes. La administracion de complejos que conteman relaciones diferentes de R4(S2Pam2Cys) a ADN, sin embargo, indujo celulas T CD8+ productoras de IFN-y espedficas de NP detectables en el bazo 7 dfas despues de la inmunizacion (Figura 9A). Se detectaron niveles particularmente altos de celulas T CD8+ activadas tanto en ganglios linfaticos como en bazos de ratones inoculados con una relacion 1:1 de R4(S2Pam2Cys) a ADN (Figuras 9A y 9B).

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto que comprende un peptido ramificado cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, en donde el peptido esta unido a al menos un ligando del 5 receptor tipo Toll (TLR) que se une a TLR-2 y en donde dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con ADN.
2. 2. Compuesto segun la reivindicacion 1, en donde el ligando de TLR se selecciona del grupo que consiste en: Pam2Cys, Pam3Cys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys.

   10
3. 3. Complejo que comprende un acido nucleico y un compuesto segun la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica.
4. 4. Uso de un compuesto o complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la fabricacion de un reactivo 15 para la transfeccion de celulas.
5. 5. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un peptido ramificado cationico unido a la lipoprotema Pam2Cys, en el cual Pam2Cys tiene la estructura (I):

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   H------NH------CH—-COOH

   ch2

   s

   ch2

   H3C —(CH2}14-----CO-------O------CH

   HjC—{CH2)14——CO—O-----CH2
6. 6. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 o la reivindicacion 5, en donde el peptido ramificado es R4, representado por la estructura:

   25

   imagen1
7. 7. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 o la reivindicacion 5, en donde el peptido ramificado es K4, representado por la estructura:

   30

   imagen2
8. 8. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el ligando de TLR-2 es Pam2Cys y el peptido ramificado es R4, representado por la estructura:

   imagen3
9. 9. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el ligando de TLR-2 es Pam2Cys y el peptido ramificado es K4, representado por la estructura:

   imagen4
10. 10. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un compuesto de formula I:

    imagen5

    10 11. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un compuesto de formula II:

    imagen6

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