JPH11255664A - 経口投与用免疫増強剤 - Google Patents
経口投与用免疫増強剤Info
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- JPH11255664A JPH11255664A JP10057936A JP5793698A JPH11255664A JP H11255664 A JPH11255664 A JP H11255664A JP 10057936 A JP10057936 A JP 10057936A JP 5793698 A JP5793698 A JP 5793698A JP H11255664 A JPH11255664 A JP H11255664A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 経口投与により哺乳動物の免疫を増強するこ
とができる免疫増強剤を提供すること。 【解決手段】 ムラミルジペプチドを実質的に含有しな
い分子量１0,０００以下のペプチドグリカン（ＰＧ）を
有効成分とする経口投与用免疫増強剤。
とができる免疫増強剤を提供すること。 【解決手段】 ムラミルジペプチドを実質的に含有しな
い分子量１0,０００以下のペプチドグリカン（ＰＧ）を
有効成分とする経口投与用免疫増強剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物（人以外
の動物が好ましい）、魚類及び甲殻類などの免疫を増強
することができる経口投与用免疫増強剤に関するもので
ある。
の動物が好ましい）、魚類及び甲殻類などの免疫を増強
することができる経口投与用免疫増強剤に関するもので
ある。
【従来の技術】微生物を形成する細胞壁の主要構成物で
あるペプチドグリカンが下等動物から高等動物に至る広
い範囲において免疫賦活能を有することは既に周知とな
っており、水産養殖の分野においても種々の特許出願が
なされている。例えば、特公平６−２５０６７号公報に
は、３週令の子豚に、ペプチドグリカン（ムラミルジペ
プチド集合体）を反復して経口投与することを特徴とす
る子豚の離乳後下痢の感染防止方法が開示されている。
しかしながら、実際に魚類などにムラミルジペプチド集
合体を経口投与した場合に、その免疫賦活活性の発現が
はっきりしないとの問題が指摘されている。このうち、
ムラミルジペプチド集合体の１員であり、免疫賦活活性
を有することが公知である物質Ｎ−アセチルムラミル−
Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ムラミルジペプチ
ド、ＭＤＰ：分子量４９２）は、経口投与によりマクロ
ファージを活性化するPriming 効果を有するものの、高
価であり畜産用途への応用は期待できないとの問題があ
る。
あるペプチドグリカンが下等動物から高等動物に至る広
い範囲において免疫賦活能を有することは既に周知とな
っており、水産養殖の分野においても種々の特許出願が
なされている。例えば、特公平６−２５０６７号公報に
は、３週令の子豚に、ペプチドグリカン（ムラミルジペ
プチド集合体）を反復して経口投与することを特徴とす
る子豚の離乳後下痢の感染防止方法が開示されている。
しかしながら、実際に魚類などにムラミルジペプチド集
合体を経口投与した場合に、その免疫賦活活性の発現が
はっきりしないとの問題が指摘されている。このうち、
ムラミルジペプチド集合体の１員であり、免疫賦活活性
を有することが公知である物質Ｎ−アセチルムラミル−
Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ムラミルジペプチ
ド、ＭＤＰ：分子量４９２）は、経口投与によりマクロ
ファージを活性化するPriming 効果を有するものの、高
価であり畜産用途への応用は期待できないとの問題があ
る。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、経口投与に
より哺乳動物の免疫を増強することができる免疫増強剤
を提供することを目的とする。
より哺乳動物の免疫を増強することができる免疫増強剤
を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】本発明は、ペプチドグリ
カン、つまり、ムラミルジペプチド集合体を構成する各
分子についてその分子量の違いが生物活性の発現に影響
を及ぼすこと、すなわち、微生物細胞壁をリゾチームや
プロテアーゼなどで酵素処理することにより得られたペ
プチドグリカンで分子量が１0,０００以下の画分のもの
が経口投与により優れた免疫増強作用を有するとの知見
に基づいてなされたのである。すなわち、本発明は、ム
ラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量１0,００
０以下のペプチドグリカン（ＰＧ）を有効成分とする経
口投与用免疫増強剤を提供する。
カン、つまり、ムラミルジペプチド集合体を構成する各
分子についてその分子量の違いが生物活性の発現に影響
を及ぼすこと、すなわち、微生物細胞壁をリゾチームや
プロテアーゼなどで酵素処理することにより得られたペ
プチドグリカンで分子量が１0,０００以下の画分のもの
が経口投与により優れた免疫増強作用を有するとの知見
に基づいてなされたのである。すなわち、本発明は、ム
ラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量１0,００
０以下のペプチドグリカン（ＰＧ）を有効成分とする経
口投与用免疫増強剤を提供する。
【０００３】
【発明の実施の形態】本発明で用いるムラミルジペプチ
ドを実質的に含有しない分子量１0,０００以下のペプチ
ドグリカン（ＰＧ）は、バチラス属、ブレビバクテリウ
ム属、コリネバクテリウム属、エセリシア属、ラクトバ
チラス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス
属又はビフィドバクテリウム属に属する微生物の細胞壁
をリゾチームやプロテアーゼなどで酵素処理し、常法に
より分子量が１0,０００よりも大きい画分を除去するこ
とにより得ることができる。本発明においては、特許第
２５２６７３３号公報の第３欄３４行〜第４欄３７行に
記載の微生物、培養方法及び細胞壁の粉砕方法などを用
いることができる。従って、上記特許の該記載内容は、
本明細書の記載に含まれるものとする。本発明では、上
記微生物のうち、バチラス属、ブレビバクテリウム属及
びコリネバクテリウム属に属する微生物を用いるのが好
ましい。
ドを実質的に含有しない分子量１0,０００以下のペプチ
ドグリカン（ＰＧ）は、バチラス属、ブレビバクテリウ
ム属、コリネバクテリウム属、エセリシア属、ラクトバ
チラス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス
属又はビフィドバクテリウム属に属する微生物の細胞壁
をリゾチームやプロテアーゼなどで酵素処理し、常法に
より分子量が１0,０００よりも大きい画分を除去するこ
とにより得ることができる。本発明においては、特許第
２５２６７３３号公報の第３欄３４行〜第４欄３７行に
記載の微生物、培養方法及び細胞壁の粉砕方法などを用
いることができる。従って、上記特許の該記載内容は、
本明細書の記載に含まれるものとする。本発明では、上
記微生物のうち、バチラス属、ブレビバクテリウム属及
びコリネバクテリウム属に属する微生物を用いるのが好
ましい。
【０００４】微生物の細胞壁に存在するペプチドグリカ
ンの一般構造はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）とＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）の２糖
のβ−１．４−グリコシド結合の繰り返し構造に４個の
アミノ酸からなるペプチド鎖が結合した糖ペプチドのポ
リマーである。処理酵素に（卵白）リゾチームを使用す
ると、リゾチームはＭｕｒＮＡｃとＧｌｃＮＡｃの結合
を分解し、ＧｌｃＮＡｃとＭｕｒＮＡｃの結合は切断で
きないため、この処理で得られた糖の最小単位は２糖と
なり、免疫賦活活性を有するペプチドグリカンの最小有
効構造と一般的に知られているＮ−アセチルムラミル−
Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ムラミルジペプチ
ド、ＭＤＰ：分子量４９２）は生成しないので、酵素処
理にリゾチームを用いるのが好ましい。酵素処理された
微生物細胞壁の分子量１0,０００以下の画分は蛋白質な
どを分子量分画する公知の方法により精製しても良い
し、精製しないでその画分を含む酵素処理物のままで用
いてもよい。
ンの一般構造はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）とＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）の２糖
のβ−１．４−グリコシド結合の繰り返し構造に４個の
アミノ酸からなるペプチド鎖が結合した糖ペプチドのポ
リマーである。処理酵素に（卵白）リゾチームを使用す
ると、リゾチームはＭｕｒＮＡｃとＧｌｃＮＡｃの結合
を分解し、ＧｌｃＮＡｃとＭｕｒＮＡｃの結合は切断で
きないため、この処理で得られた糖の最小単位は２糖と
なり、免疫賦活活性を有するペプチドグリカンの最小有
効構造と一般的に知られているＮ−アセチルムラミル−
Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ムラミルジペプチ
ド、ＭＤＰ：分子量４９２）は生成しないので、酵素処
理にリゾチームを用いるのが好ましい。酵素処理された
微生物細胞壁の分子量１0,０００以下の画分は蛋白質な
どを分子量分画する公知の方法により精製しても良い
し、精製しないでその画分を含む酵素処理物のままで用
いてもよい。
【０００５】本発明の経口投与用免疫増強剤は、ペプチ
ドグリカン（ＰＧ）として、ムラミルジペプチドを実質
的に含有しない分子量１0,０００以下のペプチドグリカ
ン（ＰＧ）のみを含有するのが好ましいが、分子量が１
0,０００よりも大きいペプチドグリカンを含むこともで
きる。しかしながら、分子量が１0,０００よりも大きい
ペプチドグリカンを多量に含むと、たとえ投与量を多く
しても十分な免疫賦活効果が得られないので、分子量１
0,０００以下のペプチドグリカンの全ペプチドグリカン
中の含有量は１０重量％（以下、％と略称する）以上と
するのが好ましく、４０％以上とするのがより好まし
い。実際、実施例に示されるように、分子量１0,０００
以下のペプチドグリカンを約１％含有するペプチドグリ
カンをマウスに２０ｍｇ投与しても免疫賦活効果が得ら
れないのに、分子量１0,０００以下のペプチドグリカン
を約１５％含有するペプチドグリカンをマウスに１ｍｇ
投与するだけで、優れた免疫賦活効果が得られることは
驚くべきことである。又、本発明で用いるペプチドグリ
カンの分子量は１0,０００以下であるが、好ましくは５
００〜１0,０００、より好ましくは５００〜4,０００で
ある。分子量はゲル濾過法や光散乱法等の方法により測
定することができる。
ドグリカン（ＰＧ）として、ムラミルジペプチドを実質
的に含有しない分子量１0,０００以下のペプチドグリカ
ン（ＰＧ）のみを含有するのが好ましいが、分子量が１
0,０００よりも大きいペプチドグリカンを含むこともで
きる。しかしながら、分子量が１0,０００よりも大きい
ペプチドグリカンを多量に含むと、たとえ投与量を多く
しても十分な免疫賦活効果が得られないので、分子量１
0,０００以下のペプチドグリカンの全ペプチドグリカン
中の含有量は１０重量％（以下、％と略称する）以上と
するのが好ましく、４０％以上とするのがより好まし
い。実際、実施例に示されるように、分子量１0,０００
以下のペプチドグリカンを約１％含有するペプチドグリ
カンをマウスに２０ｍｇ投与しても免疫賦活効果が得ら
れないのに、分子量１0,０００以下のペプチドグリカン
を約１５％含有するペプチドグリカンをマウスに１ｍｇ
投与するだけで、優れた免疫賦活効果が得られることは
驚くべきことである。又、本発明で用いるペプチドグリ
カンの分子量は１0,０００以下であるが、好ましくは５
００〜１0,０００、より好ましくは５００〜4,０００で
ある。分子量はゲル濾過法や光散乱法等の方法により測
定することができる。
【０００６】本発明においては、免疫賦活することが公
知である物質ＭＤＰを実質的に含まない分子量１0,００
０以下のペプチドグリカンが投与量として体重１ｋｇあ
たり0.５ｍｇ以上とするのが好ましく、より好ましくは
１ｍｇ以上となるように経口投与されるのがよい。投与
の対象となる動物は、哺乳動物（人以外の動物が好まし
い）、魚類及び甲殻類などである。本発明の免疫増強剤
は、対象動物に直接経口投与するか、又は餌に添加し、
これを動物に給餌することにより与えることができる。
投与時期は特に限定されないが、魚類や甲殻類の場合、
仔稚魚期より与えておくと予防効果がある。本発明の免
疫増強剤を飼料に添加する場合、飼料としては、家畜の
通常飼育用や魚などの通常養殖用に用いられている飼料
原料に、対象に応じて適当な量で配合すればよい。
知である物質ＭＤＰを実質的に含まない分子量１0,００
０以下のペプチドグリカンが投与量として体重１ｋｇあ
たり0.５ｍｇ以上とするのが好ましく、より好ましくは
１ｍｇ以上となるように経口投与されるのがよい。投与
の対象となる動物は、哺乳動物（人以外の動物が好まし
い）、魚類及び甲殻類などである。本発明の免疫増強剤
は、対象動物に直接経口投与するか、又は餌に添加し、
これを動物に給餌することにより与えることができる。
投与時期は特に限定されないが、魚類や甲殻類の場合、
仔稚魚期より与えておくと予防効果がある。本発明の免
疫増強剤を飼料に添加する場合、飼料としては、家畜の
通常飼育用や魚などの通常養殖用に用いられている飼料
原料に、対象に応じて適当な量で配合すればよい。
【０００７】
【発明の効果】本発明によれば、高価なＭＤＰを用いる
ことなく、経口投与により哺乳動物の免疫を増強するこ
とができる免疫増強剤を提供することができる。次に実
施例により本発明を説明する。
ことなく、経口投与により哺乳動物の免疫を増強するこ
とができる免疫増強剤を提供することができる。次に実
施例により本発明を説明する。
【実施例】実施例１ （１−１）菌体の培養方法及び菌体獲得方法 下記の組成の液体培地をオートクレーブで殺菌（１２１
℃で１５分間）した後、Brevibacterium lactofermentu
m ATCC13869 を植菌し、３０℃で２４時間振とう培養し
た。菌体の培養液を７０００rpm で１０分間遠心分離し
て培地を除去した。集めた菌体をさらに0.９％ＮａＣｌ
水溶液に懸濁し、再び７０００rpm で１０分間遠心分離
して菌体を洗浄して菌体を得た。 1.０ｇ／cc グルコース 1.０ｇ／cc 酵母抽出物(yeast extract) 1.０ｇ／cc ペプトン 0.５ｇ／cc （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.３ｇ／cc Ｋ2 ＨＰＯ4 0.１ｇ／cc ＫＨ2 ＰＯ4 0.０５ｇ／cc ＭｇＳＯ4 残部 蒸留水 ｐＨ ７（ＫＯＨにて調整）
℃で１５分間）した後、Brevibacterium lactofermentu
m ATCC13869 を植菌し、３０℃で２４時間振とう培養し
た。菌体の培養液を７０００rpm で１０分間遠心分離し
て培地を除去した。集めた菌体をさらに0.９％ＮａＣｌ
水溶液に懸濁し、再び７０００rpm で１０分間遠心分離
して菌体を洗浄して菌体を得た。 1.０ｇ／cc グルコース 1.０ｇ／cc 酵母抽出物(yeast extract) 1.０ｇ／cc ペプトン 0.５ｇ／cc （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.３ｇ／cc Ｋ2 ＨＰＯ4 0.１ｇ／cc ＫＨ2 ＰＯ4 0.０５ｇ／cc ＭｇＳＯ4 残部 蒸留水 ｐＨ ７（ＫＯＨにて調整）
【０００８】（１−２）菌体細胞壁成分の酵素処理 上記（１−１）の方法により得た菌体を蒸留水に懸濁
し、超音波処理を行った（超音波破砕機：ＵＲ−２００
Ｐ型、トミー精工（株）製；発振周波数２０ｋＨｚ、２
００Ｗで３０分）。この懸濁液を３０００ｇで３０分の
条件で遠心分離し、未破砕細胞を除去後、上清を１8,０
００ｒｐｍ、３０分の条件で遠心分離を行った。得られ
た沈殿は４％ＳＤＳ水溶液に懸濁後、１００℃で４０分
の加熱処理を行った。室温まで冷却した後に再び１8,０
００ｒｐｍ、３０分、２５℃の条件で遠心分離を行っ
た。この遠心分離の操作を更にもう一度繰り返して得ら
れた沈殿物を凍結乾燥後、卵白リゾチーム0.０１％（シ
グマ社製）及びアクロモペプチターゼ0.０１％（シグマ
社製）で７２時間処理後、遠心上清を回収し、ペプチド
グリカンを主成分とする細胞壁可溶画分を得た。 （２−１）分子量１０、０００以下画分の分離 （１−２）で得た細胞壁可溶画分を適量の蒸留水に溶解
しポリスルホン膜よりできた分子量１0,０００の限外濾
過フィルターに通して分画した。
し、超音波処理を行った（超音波破砕機：ＵＲ−２００
Ｐ型、トミー精工（株）製；発振周波数２０ｋＨｚ、２
００Ｗで３０分）。この懸濁液を３０００ｇで３０分の
条件で遠心分離し、未破砕細胞を除去後、上清を１8,０
００ｒｐｍ、３０分の条件で遠心分離を行った。得られ
た沈殿は４％ＳＤＳ水溶液に懸濁後、１００℃で４０分
の加熱処理を行った。室温まで冷却した後に再び１8,０
００ｒｐｍ、３０分、２５℃の条件で遠心分離を行っ
た。この遠心分離の操作を更にもう一度繰り返して得ら
れた沈殿物を凍結乾燥後、卵白リゾチーム0.０１％（シ
グマ社製）及びアクロモペプチターゼ0.０１％（シグマ
社製）で７２時間処理後、遠心上清を回収し、ペプチド
グリカンを主成分とする細胞壁可溶画分を得た。 （２−１）分子量１０、０００以下画分の分離 （１−２）で得た細胞壁可溶画分を適量の蒸留水に溶解
しポリスルホン膜よりできた分子量１0,０００の限外濾
過フィルターに通して分画した。
【０００９】（２−２）マウス経口投与によるＴＮＦ−
α誘導作用の評価 ＩＣＲマウス（平均体重２０ｇ）に（１−２）で得た分
子量１0,０００以上と分子量１0,０００以下の菌体細胞
壁可溶画分を経口投与した３時間後に市販の免疫賦活剤
であるＯＫ−４３２（中外製薬）を静脈内投与し、２時
間後の血清中のＴＮＦ−α活性を測定した。対照サンプ
ルとして蒸留水、免疫賦活作用効果を検定するための標
準物質としてムラミルジペプチド（シグマ；ＭＤＰ）を
用いた。ペプチドグリカンに特有であるアミノ酸である
ジアミノピペリン酸を指標に定量し、分子量１0,０００
以上の画分と分子量１0,０００以下の画分に存在するペ
プチドグリカン量を等しくし、血中におけるＴＮＦ産生
のPriming 効果の大きさを表−１に示す方法で評価し
た。結果を表−２に示す。
α誘導作用の評価 ＩＣＲマウス（平均体重２０ｇ）に（１−２）で得た分
子量１0,０００以上と分子量１0,０００以下の菌体細胞
壁可溶画分を経口投与した３時間後に市販の免疫賦活剤
であるＯＫ−４３２（中外製薬）を静脈内投与し、２時
間後の血清中のＴＮＦ−α活性を測定した。対照サンプ
ルとして蒸留水、免疫賦活作用効果を検定するための標
準物質としてムラミルジペプチド（シグマ；ＭＤＰ）を
用いた。ペプチドグリカンに特有であるアミノ酸である
ジアミノピペリン酸を指標に定量し、分子量１0,０００
以上の画分と分子量１0,０００以下の画分に存在するペ
プチドグリカン量を等しくし、血中におけるＴＮＦ産生
のPriming 効果の大きさを表−１に示す方法で評価し
た。結果を表−２に示す。
【００１０】
【表１】 表−１（投与サンプルと投与量） 評価サンプル 投与量 蒸留水 1.０ｍｇ／頭 分子量１0,０００以上の画分 1.０ｍｇ／頭 分子量１0,０００以上の画分 2.０ｍｇ／頭 分子量１0,０００以下の画分 0.５ｍｇ／頭 分子量１0,０００以下の画分 1.０ｍｇ／頭 ＭＤＰ 0.１ｍｇ／頭
【００１１】
【表２】 表−２（結果） ＴＮＦ産生のPriming 蒸留水（1.０ｍｇ／頭） − 分子量１0,０００以上の画分（1.０ｍｇ／頭） − 分子量１0,０００以上の画分（2.０ｍｇ／頭） − 分子量１0,０００以下の画分（0.５ｍｇ／頭） ＋ 分子量１0,０００以下の画分（1.０ｍｇ／頭） ＋＋ ＭＤＰ（0.１ｍｇ／頭） ＋＋
【００１２】血中におけるＴＮＦ産生のPriming 効果の
大きさは0.１ｍｇ／頭のＭＤＰを経口投与した際の効果
の大きさを「＋＋」として相対評価を行った。表−２の
結果より分子量１0,０００以下の画分はＭＤＰと同等の
ＴＮＦ産生のPriming 効果を認め、経口投与での優れた
免疫賦活作用を有していることが示された。しかし、分
子量１0,０００以上の画分ではＴＮＦ産生のPriming 効
果を認めなかった。本実施例では処理酵素に卵白リゾチ
ームを使用している。リゾチームはＭｕｒＮＡｃとＧｌ
ｃＮＡｃの結合を分解し、ＧｌｃＮＡｃとＭｕｒＮＡｃ
の結合は切断できないため、この処理で得られた糖の最
小単位は２糖となり、免疫賦活活性を有するペプチドグ
リカンの最小有効構造と一般的に知られているＭＤＰは
生成しない。従って本試験で示された免疫賦活活性はＭ
ＤＰに由来するのものではないことが明らかである。
大きさは0.１ｍｇ／頭のＭＤＰを経口投与した際の効果
の大きさを「＋＋」として相対評価を行った。表−２の
結果より分子量１0,０００以下の画分はＭＤＰと同等の
ＴＮＦ産生のPriming 効果を認め、経口投与での優れた
免疫賦活作用を有していることが示された。しかし、分
子量１0,０００以上の画分ではＴＮＦ産生のPriming 効
果を認めなかった。本実施例では処理酵素に卵白リゾチ
ームを使用している。リゾチームはＭｕｒＮＡｃとＧｌ
ｃＮＡｃの結合を分解し、ＧｌｃＮＡｃとＭｕｒＮＡｃ
の結合は切断できないため、この処理で得られた糖の最
小単位は２糖となり、免疫賦活活性を有するペプチドグ
リカンの最小有効構造と一般的に知られているＭＤＰは
生成しない。従って本試験で示された免疫賦活活性はＭ
ＤＰに由来するのものではないことが明らかである。
【００１３】実施例２ 免疫賦活能を有する低分子画分を含む微生物菌体酵素処
理物の最適投与量の検討 実施例１の（１−１）の方法に従いバチルス属のバチラ
ス・サチラス（Bacillus subtilis:ATCC 13952）及びブ
レビバクテリウム属のブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（Brevibacterium lactofermentum ATCC1386
9 ）の菌体を調製した。得られた菌体を蒸留水に懸濁
し、超音波処理を行った（超音波破砕機：ＵＲ−２００
Ｐ型、トミー精工（株）製；発振周波数２０ｋＨｚ、２
００Ｗで３０分）。この懸濁液の遠心沈殿を回収し、未
破砕細胞を除去後、更に上清を１8,０００ｒｐｍ、３０
分の条件で遠心分離を行った。得られた沈殿は４％ＳＤ
Ｓ水溶液に懸濁後、１００℃、４０分の加熱処理を行っ
た。室温まで冷却した後に再び１8,０００ｒｐｍ、３０
分、２５℃の条件で遠心分離を行った。この遠心分離の
操作を更にもう一度繰り返して得られた沈殿物を凍結乾
燥後、リゾチーム0.０１％及びアクロモペプチターゼ0.
０１％で酵素処理を行った。反応時間はブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムについては８時間と７２時
間、バチラス・サチラスについては４８時間とした。酵
素処理後、遠心上清を回収し、それぞれの細胞壁可溶画
分を得た。
理物の最適投与量の検討 実施例１の（１−１）の方法に従いバチルス属のバチラ
ス・サチラス（Bacillus subtilis:ATCC 13952）及びブ
レビバクテリウム属のブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（Brevibacterium lactofermentum ATCC1386
9 ）の菌体を調製した。得られた菌体を蒸留水に懸濁
し、超音波処理を行った（超音波破砕機：ＵＲ−２００
Ｐ型、トミー精工（株）製；発振周波数２０ｋＨｚ、２
００Ｗで３０分）。この懸濁液の遠心沈殿を回収し、未
破砕細胞を除去後、更に上清を１8,０００ｒｐｍ、３０
分の条件で遠心分離を行った。得られた沈殿は４％ＳＤ
Ｓ水溶液に懸濁後、１００℃、４０分の加熱処理を行っ
た。室温まで冷却した後に再び１8,０００ｒｐｍ、３０
分、２５℃の条件で遠心分離を行った。この遠心分離の
操作を更にもう一度繰り返して得られた沈殿物を凍結乾
燥後、リゾチーム0.０１％及びアクロモペプチターゼ0.
０１％で酵素処理を行った。反応時間はブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムについては８時間と７２時
間、バチラス・サチラスについては４８時間とした。酵
素処理後、遠心上清を回収し、それぞれの細胞壁可溶画
分を得た。
【００１４】免疫賦活能を発揮するための最適投与量を
検討するため各評価サンプルをＩＣＲマウス（平均体重
２0.０ｇ）１頭あたり、０．５、１、５、１０、２０ｍ
ｇづつ投与し、実施例１の（２−２）の方法に従いＴＮ
Ｆ−α誘導作用を比較検討した。また、それぞれの処理
条件の細胞壁可溶画分を含まれるペプチドグリカン量を
求めるためペプチドグリカンに特有であるアミノ酸であ
るジアミノピメリン酸を指標に定量した。そして、ペプ
チドグリカン中に含まれる分子量１0,０００以下の画分
の割合を確認するためゲル濾過により分離同定を行っ
た。結果を表−３に示す。
検討するため各評価サンプルをＩＣＲマウス（平均体重
２0.０ｇ）１頭あたり、０．５、１、５、１０、２０ｍ
ｇづつ投与し、実施例１の（２−２）の方法に従いＴＮ
Ｆ−α誘導作用を比較検討した。また、それぞれの処理
条件の細胞壁可溶画分を含まれるペプチドグリカン量を
求めるためペプチドグリカンに特有であるアミノ酸であ
るジアミノピメリン酸を指標に定量した。そして、ペプ
チドグリカン中に含まれる分子量１0,０００以下の画分
の割合を確認するためゲル濾過により分離同定を行っ
た。結果を表−３に示す。
【００１５】
【表３】 表−３ （結果） サンプル 処理 ＰＧ含量 ＰＧ中分子量 PO Priming( 血中） 時間 （％） 10,000以下画 投与量（ｍｇ／mouse) (Hr) 分の含有率 １ ５ １０ ２０ ブレビ菌 ８ ２0.３ 1.１％ − − − − (0.002) (0.01) (0.02) (0.04) ブレビ菌 72 ２0.５ １5.１％ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ (0.03) (0.15) (0.31) (0.62) バチルス菌 48 ２5.５ ４0.７％ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ (0.10) (0.52) (1.04) (2.08)
【００１６】表中、（）にＰＧ中に含まれる分子量１0,
０００以下画分の一匹あたりの投与量を示した。血中に
おけるＴＮＦ産生のPriming 効果の大きさは0.１ｍｇ／
頭のＭＤＰを経口投与した際の効果の大きさを「＋＋」
として相対評価を行った。尚、表−３に示すように、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のサンプ
ルにおいて免疫賦活能を有する分子量１0,０００以下の
画分の割合は酵素処理時間を８時間より７２時間とする
ことにより、1.１％から１5.１％に増加した。バチラス
・サチラスにおいては４８時間の酵素処理時間で分子量
１0,０００以下の画分はペプチドグリカン中４0.７％で
ある。
０００以下画分の一匹あたりの投与量を示した。血中に
おけるＴＮＦ産生のPriming 効果の大きさは0.１ｍｇ／
頭のＭＤＰを経口投与した際の効果の大きさを「＋＋」
として相対評価を行った。尚、表−３に示すように、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のサンプ
ルにおいて免疫賦活能を有する分子量１0,０００以下の
画分の割合は酵素処理時間を８時間より７２時間とする
ことにより、1.１％から１5.１％に増加した。バチラス
・サチラスにおいては４８時間の酵素処理時間で分子量
１0,０００以下の画分はペプチドグリカン中４0.７％で
ある。
【００１７】実施例３ エビ（ブラックタイガー）における経口投与時の酵素処
理微生物細胞壁の低分子画分の免疫賦活効果の検討 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum ATCC13869 ）を実施例１と同様
にして培養し、次いで菌体細胞壁成分を酵素処理した。
得られた酵素処理菌体物について、実施例２の手法に従
って８時間と７２時間酵素処理を行い、それぞれの細胞
壁可溶画分を得た。下記の組成の基礎飼料に分子量１0,
０００以上の画分を多く含むと予想される８時間処理サ
ンプルと分子量１0,０００以下の画分を多く含むと予想
される７２時間処理サンプルをそれぞれ０％、0.００５
％、0.０１％、0.１％の割合で添加し試験飼料とした。
理微生物細胞壁の低分子画分の免疫賦活効果の検討 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum ATCC13869 ）を実施例１と同様
にして培養し、次いで菌体細胞壁成分を酵素処理した。
得られた酵素処理菌体物について、実施例２の手法に従
って８時間と７２時間酵素処理を行い、それぞれの細胞
壁可溶画分を得た。下記の組成の基礎飼料に分子量１0,
０００以上の画分を多く含むと予想される８時間処理サ
ンプルと分子量１0,０００以下の画分を多く含むと予想
される７２時間処理サンプルをそれぞれ０％、0.００５
％、0.０１％、0.１％の割合で添加し試験飼料とした。
【００１８】基礎飼料 飼料原料 組成比率 魚粕 ２８％ エビ粉 １０ イカミール ２ イカ肝粉 ３ 小麦グルテン ６ 小麦粉 ２０ 大豆粕 １０ 次粉 １０．７７ 魚油 ２ レシチン ２ ゼオライト １．５ コレステロール ０．５ ビタミン類 ０．８８ ミネラル類 ４．０２ セルロース ０．０２
【００１９】暴気と環流装置が施された２００Ｌの各水
槽に0.７０−0.７５ｇのエビを２０匹づつ飼育した。飼
育中の海水は6.０−7.０ｐｐｍＤＯでsalinityは２８−
３０ｐｐｔ、ＮＨ３濃度を0.００１ｐｐｍに維持した。
表に示した配合飼料を１日に４回給餌し８週間飼育し、
８週後に採血を行い血球画分（主にマクロファージ）の
貪食能を測定し各試験区で比較検討を行った。採血した
血液は抗凝固剤（0.４５ｍｇシステイン／Lobster haem
olymph medium （ＬＨＭ）;Paterson and Stewart(１９
７４年）の方法に従って）と１：１（ｖ／ｖ）となるよ
うにを施した１ｍｌのプラスティックシリンジに採取
し、よく撹拌後、４℃の条件で１０分間1,０００ｒｐｍ
で遠心分離を行った。得られた血球画分はＬＨＭを再度
加え撹拌後、４℃で１０分間1,０００ｒｐｍで遠心分離
を行い、この操作を３回繰り返した。血液画分の細胞数
を１ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように調整したＬＨ
Ｍメディウムと、１ｘ１０６ｂｅａｄｓ／ｍＬの濃度に
調整されたラテックスビーズを含むＬＨＭメディウムを
等量混合し、スライドグラス上に分け、加湿チャンバー
で４５分間培養した。培養後、スライドグラス中の細胞
は0.１２５％ glutaraldehyde を含むＬＨＭ溶液で固定
し、ギムザ染色を施した。染色後直ちに位相差顕微鏡に
て全細胞数とビーズを貧食した細胞数を計測し、全細胞
数に対するビーズを貧食した細胞数の比率で貧食能を比
較検討した。また、それぞれの処理条件の細胞壁可溶画
分を含まれるペプチドグリカン量を求めるためペプチド
グリカンに特有であるアミノ酸であるジアミノピペリン
酸を指標に定量した。そして、ペプチドグリカン中に含
まれる分子量１0,０００以下の画分の割合を確認するた
めゲル濾過により分離定量を行った。結果を表−４に示
す。
槽に0.７０−0.７５ｇのエビを２０匹づつ飼育した。飼
育中の海水は6.０−7.０ｐｐｍＤＯでsalinityは２８−
３０ｐｐｔ、ＮＨ３濃度を0.００１ｐｐｍに維持した。
表に示した配合飼料を１日に４回給餌し８週間飼育し、
８週後に採血を行い血球画分（主にマクロファージ）の
貪食能を測定し各試験区で比較検討を行った。採血した
血液は抗凝固剤（0.４５ｍｇシステイン／Lobster haem
olymph medium （ＬＨＭ）;Paterson and Stewart(１９
７４年）の方法に従って）と１：１（ｖ／ｖ）となるよ
うにを施した１ｍｌのプラスティックシリンジに採取
し、よく撹拌後、４℃の条件で１０分間1,０００ｒｐｍ
で遠心分離を行った。得られた血球画分はＬＨＭを再度
加え撹拌後、４℃で１０分間1,０００ｒｐｍで遠心分離
を行い、この操作を３回繰り返した。血液画分の細胞数
を１ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように調整したＬＨ
Ｍメディウムと、１ｘ１０６ｂｅａｄｓ／ｍＬの濃度に
調整されたラテックスビーズを含むＬＨＭメディウムを
等量混合し、スライドグラス上に分け、加湿チャンバー
で４５分間培養した。培養後、スライドグラス中の細胞
は0.１２５％ glutaraldehyde を含むＬＨＭ溶液で固定
し、ギムザ染色を施した。染色後直ちに位相差顕微鏡に
て全細胞数とビーズを貧食した細胞数を計測し、全細胞
数に対するビーズを貧食した細胞数の比率で貧食能を比
較検討した。また、それぞれの処理条件の細胞壁可溶画
分を含まれるペプチドグリカン量を求めるためペプチド
グリカンに特有であるアミノ酸であるジアミノピペリン
酸を指標に定量した。そして、ペプチドグリカン中に含
まれる分子量１0,０００以下の画分の割合を確認するた
めゲル濾過により分離定量を行った。結果を表−４に示
す。
【００２０】
【表４】 表−４（貧食能の比較結果） 添加率（％） ０ 0.００５ 0.０１ 0.１ ８時間処理物 １6.９ ３0.９ ３9.４ ２8.０ （０） （0.１１） （0.２２） （2.２） 72時間処理物 １6.５ ５3.５ ６8.３ ７0.０ （０） （1.５５） （3.１） (３1.０） （）：飼料１ｔあたりのＰＧ中の分子量１0,０００以下画分の添加量（ｇ）を示 した。
【００２１】両サンプル、つまり８時間処理物と７２時
間処理物におけるペプチドグリカン含有率はほぼ同等で
ペプチドグリカン含有率は酵素処理時間の長さが異なる
ので（８時間と７２時間）、ペプチドグリカンに含まれ
る分子量１0,０００以下の画分の含有率は８時間処理物
で1.１％、７２時間処理物で１5.１％である（表−３参
照） このようなサンプルを用いた結果、表−４に示されるよ
うに、７２時間処理サンプルにおいては添加率の増加に
従い血球の貧食能は上昇し、同一添加率での比較により
８時間処理サンプルより高い貧食能を示した。一方、８
時間処理サンプルは添加率0.０１％までは容量依存性を
示したが、投与量を0.０１％より0.１％に増加させても
貧食能は改善されず、0.０１％添加のときが最も高い貧
食能を示した。以上の結果より、経口投与時の貧食能の
比較により分子量１0,０００以下画分を多く含む７２時
間処理サンプルは分子量１0,０００以上の画分を多く含
む８時間処理サンプルより高い活性を有した。また、７
２時間処理サンプルによる投与効果は容量依存である
が、８時間サンプルは投与量を0.０１％以上に増加させ
ても効果が改善されず、むしろ低下することが示唆され
た。
間処理物におけるペプチドグリカン含有率はほぼ同等で
ペプチドグリカン含有率は酵素処理時間の長さが異なる
ので（８時間と７２時間）、ペプチドグリカンに含まれ
る分子量１0,０００以下の画分の含有率は８時間処理物
で1.１％、７２時間処理物で１5.１％である（表−３参
照） このようなサンプルを用いた結果、表−４に示されるよ
うに、７２時間処理サンプルにおいては添加率の増加に
従い血球の貧食能は上昇し、同一添加率での比較により
８時間処理サンプルより高い貧食能を示した。一方、８
時間処理サンプルは添加率0.０１％までは容量依存性を
示したが、投与量を0.０１％より0.１％に増加させても
貧食能は改善されず、0.０１％添加のときが最も高い貧
食能を示した。以上の結果より、経口投与時の貧食能の
比較により分子量１0,０００以下画分を多く含む７２時
間処理サンプルは分子量１0,０００以上の画分を多く含
む８時間処理サンプルより高い活性を有した。また、７
２時間処理サンプルによる投与効果は容量依存である
が、８時間サンプルは投与量を0.０１％以上に増加させ
ても効果が改善されず、むしろ低下することが示唆され
た。
Claims (2)
- 【請求項１】 ムラミルジペプチドを実質的に含有しな
い分子量１0,０００以下のペプチドグリカン（ＰＧ）を
有効成分とする経口投与用免疫増強剤。 - 【請求項２】 分子量１0,０００以下のペプチドグリカ
ン（ＰＧ）を１０重量％以上含有する請求項１記載の免
疫増強剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10057936A JPH11255664A (ja) | 1998-03-10 | 1998-03-10 | 経口投与用免疫増強剤 |
| EP99104209A EP0941736A1 (en) | 1998-03-10 | 1999-03-02 | Oral immunity enhancing agent containing peptidoglycans |
| CA002265069A CA2265069A1 (en) | 1998-03-10 | 1999-03-08 | Oral immunity enhancing agent |
| CN99103993A CN1238216A (zh) | 1998-03-10 | 1999-03-10 | 口服免疫增强剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10057936A JPH11255664A (ja) | 1998-03-10 | 1998-03-10 | 経口投与用免疫増強剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11255664A true JPH11255664A (ja) | 1999-09-21 |
Family
ID=13069920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10057936A Pending JPH11255664A (ja) | 1998-03-10 | 1998-03-10 | 経口投与用免疫増強剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0941736A1 (ja) |
| JP (1) | JPH11255664A (ja) |
| CN (1) | CN1238216A (ja) |
| CA (1) | CA2265069A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008529976A (ja) * | 2005-01-28 | 2008-08-07 | ガレンバイオ、インコーポレイテッド | 免疫学的に活性な組成物 |
| JP2011518559A (ja) * | 2008-04-24 | 2011-06-30 | エウォス、イノベーション、アクティーゼルスカブ | 機能性飼料組成物 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060134141A1 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Nabi Biopharmaceuticals | Glycoconjugate vaccines containing peptidoglycan |
| WO2012157699A1 (ja) * | 2011-05-18 | 2012-11-22 | 味の素株式会社 | 動物用免疫賦活剤、それを含む飼料及びその製造方法 |
| JP5511112B2 (ja) * | 2011-06-14 | 2014-06-04 | 有限会社バイオメディカルリサーチグループ | 菌体破砕物及びその配合物 |
| CN105132372B (zh) * | 2015-08-28 | 2019-04-30 | 淄博金砖生物科技有限公司 | 一种诱导dc-cik细胞的化合物在肿瘤细胞免疫治疗中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655107B2 (ja) * | 1991-03-13 | 1994-07-27 | 全国農業協同組合連合会 | 家畜，家禽，および魚介類用の抗仮性狂犬病ならびに抗病性飼料および飼料用添加物 |
-
1998
- 1998-03-10 JP JP10057936A patent/JPH11255664A/ja active Pending
-
1999
- 1999-03-02 EP EP99104209A patent/EP0941736A1/en not_active Withdrawn
- 1999-03-08 CA CA002265069A patent/CA2265069A1/en not_active Abandoned
- 1999-03-10 CN CN99103993A patent/CN1238216A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008529976A (ja) * | 2005-01-28 | 2008-08-07 | ガレンバイオ、インコーポレイテッド | 免疫学的に活性な組成物 |
| US9138467B2 (en) | 2005-01-28 | 2015-09-22 | Stipkovits, Laszlo, Dr. | Immunologically active compositions |
| US9603917B2 (en) | 2005-01-28 | 2017-03-28 | Galenbio, Inc. | Immunologically active compositions |
| JP2011518559A (ja) * | 2008-04-24 | 2011-06-30 | エウォス、イノベーション、アクティーゼルスカブ | 機能性飼料組成物 |
| JP2015027299A (ja) * | 2008-04-24 | 2015-02-12 | エウォス、イノベーション、アクティーゼルスカブＥｗｏｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ａｓ | 機能性飼料組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2265069A1 (en) | 1999-09-10 |
| EP0941736A1 (en) | 1999-09-15 |
| CN1238216A (zh) | 1999-12-15 |
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