JPS637530B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原性のない成分からなる培地で培
養して得たビフイドバクテリウム属に属する公知
の菌（以下ビフイズス菌と略記する）の菌体より
分離精製して得られる細胞壁（Purified Cell
Wall.以下PCWと略記する）を主成分とする抗原
性の少ない抗腫瘍剤及びその製造法に関する。 本発明の抗腫瘍剤は腫瘍（癌）の予防及び治療
に利用することができる。 〔技術の背景および従来技術の説明〕 近年、ビフイズス菌に含まれる抗腫瘍性物質に
ついて、いくつかの発明がなされている。特開昭
53−107415号公報には、ビフイズス菌に属する生
菌体又は死菌体そのもの（以下全菌と記載する）
を有効成分とする抗腫瘍剤について開示され、特
開昭55−7205号公報にはビフイズス菌の菌体を破
壊し、破壊物を遠心して得た水溶性画分を水又は
塩類溶液に対して透析したのち、凍結乾燥するこ
とを特徴とする新規な抗腫瘍性物質及びその製造
法について開示されている。さらに、特開昭55−
76893号公報はビフイズス菌の菌体を破壊し、遠
心分離して水溶性画分を得、これに硫酸アンモニ
ウムを70％飽和になるように加え、析出する沈澱
物を除去したのち、上清画分を水に対して透析
し、凍結乾燥することを特徴とする新規な抗腫瘍
性物質及びその製造法が開示されている。一方、
これらの発明とは別に、本発明者の１人はビフイ
ズス菌菌体の粗細胞壁画分に抗腫瘍性を示す物質
が存在することを発見し、既に特許出願した。
（特願昭51−33107。以下先願と記載する）先願は
ビフイズス菌の菌体を破壊し、遠心して不溶性の
細胞壁画分を分離し、これを水に対して透析し、
得られた透析内液を殺菌し、無菌的にこれを凍結
乾燥し、製造することを特徴とする制がん性物質
の製造法である。ここで得られた粗細胞壁画分に
はまだ多量のたん白質、リン脂質等が混在してお
り、制がん剤として医薬品に利用するためには、
抗原性，毒性，あるいは化学的均一性の面から同
細胞壁画分をさらに精製する必要がある。 しかし、BCGやNocardia rubraの精製細胞壁
は、油を加えて乳化した後エマルジヨンの型で投
与した場合に、抗腫瘍効果を現わすが、生理食塩
水に分解させると、その効果が失われたり、また
コリネバクテリウムパーヴアム
（Corynebacteriumparvum）の細胞壁は、全菌
体と比べ著しく効果が減少するという報告（J.L.
Cantrell及びR.W.Wheat：Cancer Research，
39巻，3554ページ，1979年）がある。これらの報
告にみられるとおり、従来菌体から細胞壁を分離
し、さらにそれを精製したものについて菌体その
ものと同等の効果が得られるという知見は存在し
なかつたのである。一方、細菌の精製細胞壁の分
離法についてはすでにいくつかの方法が知られて
おり、例えば、超音波により菌体を破壊し、得ら
れた粗細胞壁をたん白分解酵素で処理する方法
（S.Kotani等：Biken′s Journal，２巻，129ペー
ジ，1959年）、ガラスビーズと共にホモゲナイズ
し、ついでたん白分解酵素処理する方法（N.
Sharon及びR.W.Jeanloz：Experientia，20巻，
１ページ，1964年）、ボールミルで破壊し、つい
でたん白分解酵素で処理する方法（M.
McCarty：Journal of Experimental
Medicine，96巻，567ページ，1952年）がある。
またRibi等は細胞浮遊液に高圧をかけ、小孔から
噴出させて得られた菌体破壊物に対し、たん白分
解処理後、細胞壁に含まれる脂質を除くため、さ
らに有機溶媒による抽出を行なつて精製する方法
を報告している（National Cancer Institute
Monograph，39巻，115ページ，1973年）。一方、
これらの方法をビフイズス菌に応用し、精製細胞
壁を分離した例としてはKojima等（Journal of
Bacteriology，102巻，217ページ，1970年）、
Veerkamp等（Archives of Biochemistry and
Biophysics，112巻，120ページ，1965年）など
の報告がある。 更に精製されたビフイズス菌細胞壁の化学的組
成についてもすでに詳細に検討されている。すな
わち、中性糖としてグルコース、ガラクトース及
びラムノースを含み（前記Kojima等）、アミノ糖
としてＮ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチ
ルムラミン酸、さらにアミノ酸としてビフイツド
バクテリウムインフアンチス〔Bifidobacterium
（以下B.と略記する）infantis〕及びビフイドバ
クテリウムブレベ（B.breve）ではアラニン、グ
ルタミン、リジン及びグリシンを含み、ビフイド
バクテリウムロングム（B.longum）ではアラニ
ン、グルタミン、オルニチン、セリン及びスレオ
ニンを含む（K.H.Schleifer及びO.Kandler：
Bacteriological Reviews，36巻，407ページ，
1972年）ことが知られており、ビフイズス菌の精
製細胞壁が化学的に均一な物質であることが示さ
れている。しかしながら、ビフイズス菌精製細胞
壁に抗腫瘍活性があるという報告は皆無である。 本発明者等は、先願出願後、ビフイズス菌から
のPCWの製造法及びビフイズス菌PCWの抗腫瘍
性について詳細に検討した結果、従来公知の知見
と異なり、ビフイズス菌のPCWを生理食塩水に
分散させても、全菌と同等又はそれ以上の強い抗
腫瘍性が認められること及び抗原性のない成分か
らなる培地で培養したビフイズス菌から得た
RCWは従来法で培養したビフイズス菌から得た
粗細胞壁に比べ抗原性を有するたん白質の含量が
著しく少ないことなど、ビフイズス菌PCWが優
れた特性を有することを初めて見出した。 更に、ビフイズス菌を培養するにあたり、抗原
性のない成分のみからなる培地を用いることによ
り、抗腫瘍性のより強いビフイズス菌をPCW分
離の際の出発原料として用いることが出来、かつ
得られたPCWも顕著な抗腫瘍性を示すこと、ま
たPCWの分離精製が容易で、培地由来の抗原性
物質の混入が完全に防止出来ることをも見出し、
本発明を完成した。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、ビフイズス菌の菌体から全菌
と同等又はそれ以上の抗腫瘍性を有し、抗原性が
少なく、かつ生理食塩水に懸濁させて投与しても
効果を示す精製細胞壁を製造し、それを抗腫瘍剤
として提供することにある。 〔発明の具体的な説明〕 次に本発明について詳述する。 (1) ビフイズス菌について 本発明に使用するビフイズス菌は公知の菌株で
あり、例えばATCCのカタログ等に記載されてい
て容易に入手できる菌株であり、ビフイズス菌の
細菌学的性質については、R.E.Buchanan及びN.
E.Gibbons著“Bergey′s Mannual of
Determinative Bacteriology”，第８版，669〜
676ページ，Williams＆Willkins Company，
1974年に記載されている。 (2) ビフイズス菌の培地について ビフイズス菌は、他の乳酸菌と異なり栄養要求
が厳しく、かつ嫌気性菌であるため好気的状態で
の培養が困難な細菌の一つである（J.A.Paupard
等：Bacteriological Reviews，37巻，136−165
ページ，1973年）。本発明者らは、ビフイズス菌
を抗原性の無い成分からなる培地で、工業的かつ
好気的に培養するにあたり、培地成分について
種々の検討を行なつた。そして次の組成の培地
（以下SE培地と略記する）が、ビフイズス菌を好
気的かつ大量に、しかも従来公知のビフイズス菌
培養のための培地を使用したときとほぼ同程度に
培養し得ることを見出した。 “SE培地” カゼイン酵素分解物（分子量約1000以下）
25ｇ／ KH₂PO₄ ５ｇ／ Na₂HPO₄（無水物） ５ｇ／ 酢酸ナトリウム（無水物） １ｇ／ 塩化ナトリウム １ｇ／ ラクトース 25ｇ／ Ｌ−システイン塩酸塩（１水和物）
0.04ｇ／ ピルビン酸ナトリウム 0.1ｇ／ アラニン 10mg／ アスパラギン 10mg／ グルタミン 10mg／ トリプトフアン 10mg／ セリン 10mg／ パントテン酸カルシウム 0.2mg／ ビチオン 0.1mg／ SE培地で窒素源として使用する分子量約1000
以下のカゼイン酵素分解物は、望ましくは特許第
1003417号の方法により製造される。この特許の
方法により製造されるカゼイン酵素分解物は、分
子量が約1000以下であり、ラツト及びモルモツト
の皮内注射によるPassive Cutaneous
Anaphylaxis（以下PCAと略記する）反応を示さ
ない。尚市販されているカゼイン酵素分解物は、
いずれも抗原性（PCA反応陽性）を有していて
本発明に使用できない。SE培地のその他の成分
には、市販の試薬を使用する。 前記各成分を所定量秤量して蒸留水に溶解し、
１規定のNaOH溶液を加えてPHを6.6±0.1の範囲
に調整し、次いで、常法により、115℃で15分間
加圧滅菌する。以上のようにしてSE培地が調製
される。 従来ビフイズス菌の培養に最も適した培地とし
てBriggs Liver brothが知られている。この培
地は、多数の異種たん白質を含むため、例え極微
量の異種たん白質が菌体へ混入しても、その製品
は充分生体の免疫系に影響を及ぼすものとなる。
又ビフイズス菌の生育に必要な最小の成分を含有
する培地についてもHassien等（Journal of
Bacteriology，６巻，771−777ページ，1951年）
及びNorris等（Journal of Bacteriology，60
巻，681−696ページ，1950年）らの報告がある
が、これらの培地は、窒素源としてカゼインのパ
ンクレアチン分解物を含み、これに抗原性が無い
ことの証明はなされていない。従つて、従来ビフ
イズス菌について知られている培地で培養した菌
体を用いてPCWを分離することは、医薬品開発
上望ましいものではない。 (3) ビフイズス菌の培養について 一般に細菌の細胞壁組成は、菌体の生育に伴
い、対数期（logarithm phase）では一定せず死
滅期（death phase）では自己分解（autolysis）
の問題が生ずる。そこで細胞壁組成が比較的安定
な状態にある定常期（stationary phase）での集
菌が望ましい。本発明においては、常法によりビ
フイズス菌を培養し、初期定常期（early
stationary phase）における菌体を集菌するのが
望ましい。 (4) 菌体の分離及び死菌処理 培養液を連続遠心して菌体を集め、生理食塩水
で遠心洗浄し、生理食塩水に分散し、60℃で60分
間加熱してビフイズス菌を死滅させる。この加熱
処理は、自己分解（autolysis）を防止するため
に行なう。次いで死滅処理した菌体を繰り返し洗
浄する。 その他の死滅処理法として、0.2％ホルマリン
含有生理食塩水に菌体を懸濁し、120分間放置し、
ホルマリン臭の消えるまで洗浄するホルマリン処
理法、２％フエノール含有生理食塩水に菌体を懸
濁し、60分間放置し、フエノール臭の消えるまで
洗浄するフエノール処理法なども本発明において
採用しうる。 (5) 粗細胞壁の分離 死滅処理した菌体を生理食塩水に懸濁させ、物
理的処理、例えば超音波破壊装置、ボール−ミ
ル、ホモゲナイザーあるいはフレンチプレスなど
で破壊し、得られた菌体破壊物を低速で遠心する
ことにより未破壊菌体を沈渣として除き、上清を
冷却下に高速で遠心し、細胞壁画分を沈渣として
分離する。のち、数回遠心洗浄を繰り返して粗細
胞壁画分を得る。 (6) 粗細胞壁の精製法 粗細胞壁をトリプシン、キモトリプシン及びプ
ロナーゼを作用させてたん白分解を行なう。この
際、トリプシン及びキモトリプシンは、他のたん
白分解酵素、例えばペプシンあるいはパパインな
どでも代用できるが、プロナーゼ処理は必ず行な
わなければならない。たん白分解後、細胞壁を蒸
留水に対し透析し、透析内液を凍結乾燥する。凍
結乾燥物を有機溶媒、例えばエーテル−エタノー
ル混液、クロロホルム、クロロホルム−メタノー
ル混液などで順次処理して脱脂し、PCWを得る。
この粉末状のPCWを無菌的にバイアル等に充填
し、密封し、製剤とする。 以上のようにして得られたPCWは次の理化学
的性状を有する。尚、この理化学的性状の試験に
は実施例１により得られたビフイドバクテリウム
インフアンチス（B.infantis）のPCWを用いた。 (i) 色調：白色 (ii) 形状：不定形 (iii) 溶解度：水及び有機溶媒に不溶 (iv) 化学組成： 中性糖：２規定HCIをPCWに加えて100℃
で３時間加水分解することにより、グ
ルコース、ガラクトース及びラムノー
スが検出される。 アミノ糖：４規定HCIをPCWに加えて105
℃で10時間加水分解することにより、
グルコサミンとムラミン酸が検出され
る。 アミノ酸：６規定HCIをRCWに加えて105
℃で10時間加水分解することにより、
アラニン、グルタミン酸、グリシン及
びリジンが検出され、フエニルアラニ
ン、バリン及びロイシンはほとんど検
出されない。尚、実施例２により得ら
れたビフイドバクテリウムロングム
（B.longum）のPCWでは、リジン及
びグリシンが検出されず、かわりにオ
ルニチン、セリン及びスレオニンが検
出される。 化学組成比：グルコサミン、ムラミン酸及
びリジンを約１：１：１の割合に含
む。 上記の理化学的性状は、前記K.H.Schleifer等
の報告と完全に一致し、PCWが化学的に均一な
精製細胞壁であることが判明した。 次に本発明のPCWの抗腫瘍効果について試験
例を示して詳述する。 一般に抗腫瘍試験は、大別してin vivo及びin
vitroの２つに分けられるが、抗腫瘍物質の検索
法ではin vivoの方法が望ましい。現在、in vivo
の抗腫瘍試験には、Sarcoma180腹水癌、Ehrlich
腹水癌の２種の同種異系移植癌が広く用いられて
いるが、これらの腫瘍は強い移植抗原性を有する
ために問題も多い（千原呉郎著“癌と免疫増強”
３ページ，1980年，講談社）。そこで本発明者ら
は、BALB／ｃマウスに３−メチルコランスレ
ンで発癌させたfibrosarcoma Meth−Ａ（Sloan
−Kettering Institute of Cancer Research，
New York）をBALB／ｃマウスの腹腔内で継
代培養する同種同系腫瘍による抗腫瘍試験により
本発明のPCWの効果を判定した。この抗腫瘍試
験は、RibiらのTumor Suppression Test（E.E.
Ribi等、前出）により行なつた。 〔試験 １〕 試験動物としてBALB／ｃ雄マウス（７−９
週令、体重22±２ｇ）を、それぞれ８−11匹を１
群として用いた。腫瘍は、同系腫瘍Meth−Ａを、
1.0×10⁵生細胞／0.1c.c.になるように常法により調
整した。トリパンブル−染色でのMeth−Ａ細胞
の生存率は95％以上であつた。 PCWは実施例１と同一の方法で製造したもの
を用いた。又比較のため実施例１と同一の方法で
製造した全菌（実施例 １においてPCW製造の
原料とした全菌）及び実施例１において用いた
SE培地の成分中抗原性のない窒素源であるカゼ
イン分解物の代りに市販のBactocasiton（Difco
Laboratories社製）を用いた培地で培養したビフ
イズス菌から実施例１と同様の方法で製造した
PCWを用いた。 これら３種の試料〔以下それぞれPCW（SE培
地）、全菌（SE培地）及びPCW（半合成培地）と
記載する〕を0.1mg／0.1c.c.の割合で生理食塩水に
懸濁し、無菌処理下で、等容量腫瘍細胞に混合
し、マウス腹部皮下に１匹当り0.2c.c.移植する。
コントロールには、等容の生理食塩水を腫瘍細胞
と懸濁したものを用いる。本試験は２度にわたつ
て行なつた。 そして前記Ribi等の方法により腫瘍発現率、平
均生存日数及び移植後日数と平均腫瘍直径を測定
して抗腫瘍活性を試験した。その結果は表１に示
すとおりであつた。

〔試験 ２〕

試験１と同様の試験を反復して行なつた。ただ
し移植する腫瘍数を5.0×10⁵，1.0×10⁵生細胞／
0.1c.c.の２種類とし、実施例１で得たPCW（SE培
地）の投与量を0.1，0.05，0.01mg／0.1c.c.の３点
とした。その結果は表２に示すとおりであつた。

【表】

〔試験 ３〕

次に本発明者等は本発明の方法によつて得られ
た粉末の急性毒性試験を行なつた。実施例１及び
２と同一の方法により得た２種の粉末PCWを平
均体重20ｇのBALB／ｃのマウス雌雄各10匹を
一群とする群にLichfield＆Willcoxcenの方法
（Journal of Pharmacology and
Exeperimental Therapeutics，90巻，99頁，
1949年）により皮下及び腹腔内に投与し、急性毒
性値（LD₅₀）を測定した。

〔発明の効果〕

抗腫瘍性のより強いビフイズス菌を細胞壁精製
物（PCW）分離の際の出発原料として用いるこ
とができる。 細胞壁精製物（PCW）が顕著な抗腫瘍性を有
する。 細胞壁精製物（PCW）の分離精製が容易であ
る。 細胞壁精製物（PCW）は抗原性を示さない。 細胞壁精製物（PCW）は、生理食塩水に懸濁
しても、抗腫瘍効果を示す。

【図面の簡単な説明】

図１はマウスにおける腫瘍細胞移植後日数と平
均腫瘍直径との関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗原性のない培地から得られたビフイドバク
   テリウム属に属する微生物の菌体の細胞壁画分で
   あつて、タン白質を含まない精製物からなる抗腫
   瘍剤。 ２ 抗原性のない培地から得られたビフイドバク
   テリウム属に属する微生物の菌体の細胞壁画分で
   あつて、タン白質を含まない精製物が、生理食塩
   水に分散された分散液であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍剤。 ３ ビフイドバクテリウム属に属する微生物の培
   養物から菌体を取り出すこと、得られた菌体を可
   及的速やかに死滅させること、得られた死菌体を
   破壊して、水不溶性の細胞壁画分を取り出すこ
   と、及び得られた細胞壁画分をプロナーゼを含む
   タン白分解酵素で処理して、タン白質を除去する
   ことからなる抗腫瘍剤の製造において、ビフイド
   バクテリウム属に属する微生物が、抗原性のない
   培地によつて得られたものであることを特徴とす
   る抗腫瘍剤の製造法。 ４ ビフイドバクテリウム属に属する微生物の培
   養物から菌体を取り出す場合、定常期にある培地
   から取り出すことを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項に記載の抗腫瘍剤の製造法。 ５ 抗原性のない培地が、パツシブキユタネアス
   アナフイラキシー反応を示さないカゼイン酵素分
   解物を主要な窒素源とする培地であることを特徴
   とする特許請求の範囲第３項または第４項に記載
   の抗腫瘍剤の製造法。 ６ 抗原性のない培地が、培地のPHが6.6±0.1で
   あり、１当り次の成分を含む培地であることを
   特徴とする特許請求の範囲第３項ないし第５項の
   いずれかに記載の抗腫瘍剤の製造法。 カゼイン酵素分解物 （分子量 約1000以下） 25ｇ KH₂PO₄ ５ｇ Na₂HPO₄（無水物） ５ｇ 酢酸ナトリウム（無水物） １ｇ 塩化ナトリウム １ｇ 乳糖 25ｇ Ｌ−システイン・塩酸塩 （１水和物） 0.04ｇ ピルビン酸ナトリウム 0.1ｇ アラニン 10mg アスパラギン 10mg グルタミン 10mg トリプトフアン 10mg セリン 10mg パントテン酸カルシウム 0.2mg ビオチン 0.1mg