WO2022244580A1 - 免疫賦活剤及びグルカン組成物の製造方法 - Google Patents

免疫賦活剤及びグルカン組成物の製造方法 Download PDF

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侑 島田
淳平 吉田
太一 南
哲也 石田
建史 白井
悠 今井
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    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an immunostimulant and a glucan composition.
  • JP-A-2010-533479 proposes a method for preparing a glucan preparation by combining enzymatic treatment and acid/alkali hydrolysis treatment, which has a high glucan content and is said to be suitable for industrial use.
  • An object of one aspect of the present invention is to provide an immunostimulatory agent that contains ⁇ -glucan derived from the yeast cell wall and has a high immunostimulatory effect.
  • the first aspect is an immunostimulant containing ⁇ -glucan derived from the yeast cell wall and having a ⁇ -glucan content of 25% by mass or more and 45% by mass or less.
  • the immunostimulant further contains mannan, the content of mannan in the immunostimulator may be 5% by mass or more and 20% by mass or less, and the content ratio of the mannan to ⁇ -glucan is 0.1 or more. may be less than one.
  • the immunostimulant further comprises ⁇ -glucan, the content of ⁇ -glucan in the immunostimulator may be 7% by mass or more and 12% by mass or less, and the content ratio of ⁇ -glucan to ⁇ -glucan may be 0.15 or more and 0.55 or less.
  • the ⁇ -glucan contains glycogen
  • the content of glycogen in the immunostimulant may be 4% by mass or more and 10% by mass or less
  • the content ratio of glycogen to ⁇ -glucan is 0.16 or more and 0.16 or more. It may be 5 or less.
  • a second aspect is an interleukin-8 production promoter containing ⁇ -glucan derived from the yeast cell wall and having a ⁇ -glucan content of 25% by mass or more and 45% by mass or less.
  • mannan is further included, the content of mannan in the interleukin-8 production promoter may be 5% by mass or more and 20% by mass or less, and the content ratio of mannan to ⁇ -glucan is 0.1 or more and 1 may be less than
  • ⁇ -glucan may be further included, the content of ⁇ -glucan in the interleukin-8 production promoter may be 7% by mass or more and 12% by mass or less, and the content ratio of ⁇ -glucan to ⁇ -glucan may be It may be 0.15 or more and 0.55 or less.
  • the ⁇ -glucan contains glycogen
  • the content of glycogen in the interleukin-8 production promoter may be 4% by mass or more and 10% by mass or less
  • the content ratio of glycogen to ⁇ -glucan is 0.16. It may be greater than or equal to 0.5 or less.
  • a third aspect includes washing the yeast cell wall under alkaline conditions to obtain a first processed product, heat-treating the first processed product under alkaline conditions to obtain a second processed product, and and recovering a third processed product as a solid content, wherein the third processed product has a ⁇ -glucan content of 25% by mass or more and 45% by mass or less.
  • the heat treatment under alkaline conditions may be performed under conditions of pH 8 or higher and pH 14 or lower and 70° C. or higher and 110° C. or lower.
  • yeast cell walls may include cell walls derived from brewer's yeast or baker's yeast.
  • washing under alkaline conditions may include adjusting the pH of the yeast cell wall-containing washing solution to pH 8 or higher and pH 14 or lower, and performing solid-liquid separation with a centrifugal separator while adding water.
  • the third processed material may be recovered by subjecting the second processed material to solid-liquid separation by centrifugation.
  • the glucan composition to be produced may be an immunostimulator or an interleukin-8 production promoter.
  • an immunostimulatory agent that contains ⁇ -glucan derived from the yeast cell wall and has a high immunostimulatory effect.
  • FIG. 1 is a diagram showing interleukin-8 production promoting effects of glucan compositions according to Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing interleukin-8 production promoting effects of glucan compositions according to Example 1, Comparative Examples 2 and 3.
  • FIG. 1 is a diagram showing interleukin-8 production promoting effects of glucan compositions according to Example 1, Comparative Examples 2 and 3.
  • the term "process” is not only an independent process, but even if it cannot be clearly distinguished from other processes, it is included in this term as long as the intended purpose of the process is achieved.
  • the content of each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition unless otherwise specified when there are multiple substances corresponding to each component in the composition.
  • the upper and lower limits of the numerical ranges described herein can be combined by arbitrarily selecting the numerical values exemplified as the numerical ranges.
  • embodiments of the present invention will be described in detail. However, the embodiments shown below exemplify methods for producing an immunostimulant and a glucan composition for embodying the technical idea of the present invention. It is not limited to the method of producing the glucan composition.
  • the immunostimulant is a glucan composition containing ⁇ -glucan derived from the yeast cell wall and having a ⁇ -glucan content of, for example, 25% by mass or more and 45% by mass or less.
  • the immunostimulant according to the present embodiment has an excellent immunostimulatory effect by containing a predetermined content of ⁇ -glucan derived from the yeast cell wall. As a result, not only is it expected to suppress the onset and progression of infectious diseases in livestock, humans, farmed fish, etc., but it may also provide means for reducing the threat of the emergence of drug-resistant bacteria.
  • the immunostimulatory effect of an immunostimulant can be evaluated, for example, by the effect of promoting the production of cytokines involved in immunity such as interleukin. That is, the immunostimulant may be an interleukin production promoter, preferably an interleukin 8 production promoter.
  • ⁇ -Glucan which constitutes an immunostimulant, is a polymer in which D-glucose is linked by glycosidic bonds, and has a linear main chain skeleton of ⁇ -1,3 bonds and side chains branched by ⁇ -1,6 bonds.
  • the ⁇ -glucan that constitutes the immunostimulant is, for example, derived from the yeast cell wall, preferably obtained by hydrolyzing the yeast cell wall, and is produced by the method for producing a ⁇ -glucan composition described below. It may be included in the glucan composition.
  • the content of ⁇ -glucan in the immunostimulant may be preferably 28% by mass or more, 30% by mass or more, 34% by mass or more, or 35% by mass or more.
  • the content of ⁇ -glucan in the immunostimulant may preferably be 42% by mass or less, 40% by mass or less, 38% by mass or less, or 35% by mass or less.
  • the content of ⁇ -glucan in this specification is a value converted to dry matter, and the content of mannan, ⁇ -glucan, glycogen, etc. below is also a value converted to dry matter.
  • the immunostimulant may further contain mannan in addition to ⁇ -glucan.
  • the content of mannan in the immunostimulator may be, for example, 5% by mass or more and 20% by mass or less.
  • the content of mannan in the immunostimulant is preferably 7% by mass or more, 9% by mass or more, or 10% by mass or more, and is preferably 18% by mass or less, 16% by mass or less, 14% by mass or less, Or it may be 12% by mass or less.
  • the content of mannan is within the above range, there is a tendency that a higher immunostimulatory effect is obtained.
  • the content ratio of mannan to ⁇ -glucan in the immunostimulant may be, for example, 0.1 or more and less than 1 from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production.
  • the content ratio of mannan to ⁇ -glucan in the immunostimulant is preferably 0.2 or more, 0.25 or more, 0.28 or more, or 0.3 or more, and preferably 0.8 or less, It may be 0.6 or less, 0.4 or less, or 0.35 or less.
  • the immunostimulant may further contain ⁇ -glucan in addition to ⁇ -glucan.
  • the content of ⁇ -glucan in the immunostimulator may be, for example, 7% by mass or more and 12% by mass or less.
  • the content of ⁇ -glucan in the immunostimulant is preferably 8% by mass or more, 9% by mass or more, or 9.5% by mass or more, and is preferably 18% by mass or less, 11% by mass or less, 10% by mass or less. .5% by mass or less, or 10% by mass or less.
  • the content ratio of ⁇ -glucan to ⁇ -glucan in the immunostimulant may be, for example, 0.15 or more and 0.55 or less from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production.
  • the content ratio of ⁇ -glucan to ⁇ -glucan in the immunopotentiator is preferably 0.18 or more, 0.2 or more, 0.24 or more, or 0.26 or more, and preferably 0.5. 0.4 or less, 0.3 or less, or 0.28 or less.
  • the immunostimulant may contain glycogen as part of ⁇ -glucan.
  • the content of glycogen in the immunostimulator may be, for example, 4% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the content of glycogen in the immunostimulant is preferably 5% by mass or more, 6% by mass or more, or 6.4% by mass or more, and is preferably 9% by mass or less, 8% by mass or less, or 7% by mass. or less, or 6.8% by mass or less.
  • the content of glycogen is within the above range, there is a tendency that a higher immunostimulatory effect is obtained.
  • the content ratio of glycogen to ⁇ -glucan in the immunostimulant may be, for example, 0.16 or more and 0.3 or less from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production.
  • the content ratio of glycogen to ⁇ -glucan in the immunostimulant is preferably 0.17 or more, 0.18 or more, or 0.182 or more, and preferably 0.25 or less, 0.22 or less, It may be 0.2 or less, or 0.19 or less.
  • the total content of ⁇ -glucan and ⁇ -glucan in the immunostimulant may be, for example, 35% by mass or more and 52% by mass or less.
  • the total content of ⁇ -glucan and ⁇ -glucan in the immunopotentiator is preferably 38% by mass or more, 40% by mass or more, 42% by mass or more, or 44% by mass or more, and preferably 50% by mass. 48% by mass or less, or 46% by mass or less.
  • the ratio of the content of ⁇ -glucan to the total content of ⁇ -glucan and ⁇ -glucan (hereinafter also referred to as total glucan content) in the immunostimulant is, for example, 0.65 or more from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production. It may be 0.85 or less.
  • the ratio of the ⁇ -glucan content to the total glucan content in the immunostimulant is preferably 0.68 or more, 0.7 or more, 0.72 or more, 0.74 or more, 0.76 or more, or 0.78 or more, and preferably 0.82 or less, 0.8 or less, or 0.79 or less.
  • the ratio of the ⁇ -glucan content to the total glucan content in the immunostimulant may be, for example, 0.14 or more and 0.35 or less from the viewpoint of the interleukin production promoting effect.
  • the ratio of the ⁇ -glucan content to the total glucan content in the immunostimulant is preferably 0.16 or more, 0.18 or more, or 0.2 or more, and preferably 0.3 or less, 0 0.28 or less, 0.26 or less, 0.24 or less, or 0.22 or less.
  • the ratio of the mannan content to the total glucan content in the immunostimulant may be, for example, 0.1 or more and 0.6 or less from the viewpoint of the interleukin production promoting effect.
  • the ratio of the mannan content to the total glucan content in the immunostimulant may be preferably 0.14 or more, 0.18 or more, 0.2 or more, or 0.22 or more, and preferably 0.5 0.4 or less, 0.3 or less, 0.28 or less, or 0.26 or less.
  • the ratio of the glycogen content to the total glucan content in the immunostimulant may be, for example, 0.11 or more and 0.3 or less from the viewpoint of the interleukin production promoting effect.
  • the ratio of the glycogen content to the total glucan content in the immunostimulant may be preferably 0.11 or more, 0.12 or more, 0.13 or more, or 0.14 or more, and preferably 0.2. 0.18% or less, 0.16 or less, or 0.15 or less.
  • Immunostimulants can exhibit high immunostimulatory activity despite the relatively low degree of purification of ⁇ -glucan. For example, by going through only a low-intensity extraction process under weak alkaline conditions, the active ingredient is effectively concentrated without excessive destruction of the three-dimensional structure of the yeast cell wall, and the form necessary and sufficient for immune response is obtained. This is probably because it has been retained. Alternatively, it can be considered that the immunostimulant contains a glucan composition produced by the method for producing a glucan composition described below.
  • the immunostimulant may have a total carbohydrate content of, for example, 60% by mass or more and 70% by mass, preferably 62% by mass or more and 66% by mass or less.
  • Carbohydrates include ⁇ -glucan, ⁇ -glucan, mannan, etc., as described above.
  • the ⁇ -glucan content relative to the total carbohydrate content may be, for example, 35% by mass or more and 70% by mass or less, preferably 45% by mass or more, or 50% by mass or more, from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production. and preferably 65% by mass or less, or 60% by mass or less.
  • the immunostimulant may contain protein.
  • the protein content in the immunostimulant may be, for example, 15% by mass or more and 25% by mass or less, preferably 18% by mass or more and 22% by mass or less.
  • the ratio of the protein content to the ⁇ -glucan content in the immunostimulant may be, for example, 0.38 or more and 0.1 or less, preferably 0.45 or more, or It may be 0.5 or more, and preferably 0.8 or less, or 0.6 or less.
  • the immunostimulant may contain lipids.
  • the lipid content in the immunostimulant may be, for example, 10% by mass or more and 18% by mass or less, preferably 12% by mass or more and 16% by mass or less.
  • the ratio of the lipid content to the ⁇ -glucan content in the immunostimulant may be, for example, 0.38 or more and 0.4 or less, preferably 0.39 or more, from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production. and preferably 0.4 or less.
  • the immunostimulant may contain ash.
  • the content of ash in the immunostimulant may be, for example, 1.8% by mass or more and 3% by mass or less, preferably 1.9% by mass or more, and may be 2.2% by mass or less.
  • the ratio of the ash content to the ⁇ -glucan content in the immunostimulant may be, for example, 0.04 or more and 0.065 or less, preferably 0.05 or more, from the viewpoint of the effect of promoting interleukin production. and preferably 0.06 or less.
  • the immunostimulant may contain a water-insoluble component, and the water-insoluble component may contain an active ingredient.
  • the immunostimulant may consist essentially of water-insoluble components.
  • substantially means not excluding water-soluble components that are inevitably mixed, and means that the content of water-soluble components is, for example, less than 5% by mass, or less than 1% by mass. .
  • the immunostimulant may contain a water-insoluble component and a water-soluble component.
  • the content may be, for example, 1% by mass or more and less than 50% by mass, preferably 40% by mass or less or 20% by mass or less, and preferably 5% by mass. % or more.
  • water-insoluble means that the solubility in 100 g of water at 25°C is less than 1 g, and water-soluble means that the solubility in 100 g of water at 25°C is 1 g or more. do.
  • the immunostimulant may contain, for example, a third processed product obtained by the method for producing a glucan composition described later, or may consist of the third processed product.
  • the immunostimulant may further contain known components having immunoregulatory action in addition to ⁇ -glucan, which is the main component.
  • components having immunoregulatory action include beet tea extract, fucoidan, arabinoxylan, lactoferrin, catechin, chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin oligosaccharide, L-ascorbic acid, coenzyme Q10 (including reduced form), and the like. can be done.
  • Immunostimulants include, if necessary, any ingredient known to be commonly used in pharmaceuticals, foods, feeds, etc., such as water, fats and oils, sugars, vitamins, sweeteners, seasonings, Acidulants, preservatives, fragrances, coloring agents, excipients, bulking agents, binders, thickeners, stabilizers, emulsifiers, pH adjusters and the like can be blended.
  • any ingredient known to be commonly used in pharmaceuticals, foods, feeds, etc. such as water, fats and oils, sugars, vitamins, sweeteners, seasonings, Acidulants, preservatives, fragrances, coloring agents, excipients, bulking agents, binders, thickeners, stabilizers, emulsifiers, pH adjusters and the like can be blended.
  • the form of the immunostimulant may be solid such as powder or granules, liquid, paste, or the like.
  • the dosage form of the immunopotentiating agent can be appropriately selected according to the administration method, administration subject, and the like.
  • Dosage forms include, for example, formulations for oral administration such as tablets, capsules, granules, lozenges, powders, and liquids. These formulations can be produced according to known methods using additives such as excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents and diluents.
  • it is also possible to incorporate an immunostimulant into food compositions such as health foods and health supplements, beverage compositions, feeds, and the like.
  • an immunostimulator When an immunostimulator is administered to a subject such as a vertebrate or invertebrate, it exhibits an immunostimulatory effect in the subject. This can suppress the onset of infectious diseases in the subject. That is, the immunostimulatory agent can be applied in a method of preventing infectious disease in a subject.
  • Vertebrates to be administered include mammals, birds, fish and the like. Mammals may include humans and may be mammals other than humans. Mammals other than humans include pigs, cows, horses, sheep and monkeys, as well as pets such as dogs and cats. Examples of birds include meat chickens, laying hens, turkeys, ducks, and pigeons.
  • Examples of fish include salmonids such as salmon, trout, trout, char, taimen, carp, crucian carp, tilapia, catfish, sea bass, yellowtail, amberjack, yellowtail, flounder, sea bream, tuna, and eel.
  • Examples of invertebrates to be administered include arthropods such as crabs and shrimps, echinoderms such as sea urchins and sea cucumbers, mollusks such as octopus, squid and shellfish, and prochordates such as sea squirts.
  • the immunostimulant When administered as a drug or food or drink, for example, it can be orally administered in an amount of 1 mg to 500 mg (dry weight)/kg body weight once to several times a day. Moreover, when it is used as food, drink, feed, or the like, 0.001 g to 1 g can be added per 100 g of food, drink, feed, or the like.
  • an immunostimulant as a feed for example, for mammals, birds, and fish
  • a mixture of 0.001% by mass or more and 1% by mass or less with respect to the feed to be administered is administered once to several times a day. can be administered once.
  • a method for producing a glucan composition includes a washing step of washing yeast cell walls under alkaline conditions to obtain a first processed product, and a second processed product by heat-treating the first processed product under alkaline conditions. and a recovery step of recovering the third processed material as a solid content from the second processed material.
  • the resulting third processed product has a ⁇ -glucan content of 25% by mass or more and 45% by mass or less, and has an excellent immunostimulatory effect.
  • the third processed product has an excellent effect of promoting interleukin production, and is particularly excellent in promoting effect of interleukin-8 production.
  • a glucan composition with excellent immunostimulatory effects can be efficiently produced. This can be attributed, for example, to the fact that the washing step efficiently concentrates the components that contribute to the immunostimulatory effect.
  • the yeast cell wall used in the method for producing the glucan composition may be a commercially available product, or may be obtained, for example, by pretreating the raw material yeast.
  • the pretreatment step of pretreating yeast as a raw material includes, for example, a self-digestion step of autolyzing yeast to obtain an autolysate, a hot water extraction step of extracting yeast with hot water to obtain a hot water extract, and a hot water extraction step of extracting yeast from yeast. Even if it includes a pre-decomposition step, which is alone or in combination such as an enzyme treatment step to obtain an enzyme-treated product by treatment, and a separation step to obtain yeast cell walls by centrifuging the pre-decomposed product that has undergone the pre-decomposition step. good.
  • yeasts of the genus Saccharomyces include yeasts of the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Torulopsis, etc. At least one selected from the group consisting of these can be used. It preferably contains, and more preferably contains at least Saccharomyces yeast.
  • Yeast belonging to the genus Saccharomyces includes food yeast such as brewer's yeast and baker's yeast.
  • food yeast include brewing yeast such as beer yeast, low-malt beer yeast, miscellaneous sake yeast, sake yeast, wine yeast, and whiskey yeast, baker's yeast, and torula yeast.
  • yeast proteins are decomposed by the protease of the yeast itself to obtain autolysates.
  • the self-digestion step is carried out, for example, by adjusting the pH to 2 to 7 and the temperature to 40° C. or higher and 65° C. or lower for 1 hour or longer and 48 hours or shorter.
  • the autolysate is centrifuged to obtain a fraction containing yeast cell walls as a heavy liquid.
  • a nozzle type centrifuge, an intermittent discharge type centrifuge, a sharpless type centrifuge, etc. can be used. can be adjusted accordingly.
  • the washing step the yeast cell walls are washed under alkaline conditions to obtain the first processed product.
  • Any washing method may be used as long as it can remove at least part of proteins, amino acids, etc. remaining in the yeast cell wall.
  • the washing method may include, for example, mixing the yeast cell walls and a liquid medium to form a washing liquid comprising the yeast cell walls, and removing at least a portion of the liquid medium from the washing liquid.
  • the liquid medium may contain at least water and an alkaline substance.
  • the method for removing the liquid medium from the washing liquid may be appropriately selected from commonly used solid-liquid separation methods.
  • the solid-liquid separation method includes, for example, a centrifugal method using a yeast separator or the like, a method using a filter, an ultrafiltration membrane, or the like.
  • Washing of the yeast cell walls is carried out by adjusting the washing liquid containing the yeast cell walls to pH 8 or more and pH 14 or less, preferably pH 9.5 or more and pH 12 or less, and performing solid-liquid separation with a centrifuge (e.g., yeast separator) while adding water.
  • the cleaning liquid may contain at least water as a liquid medium.
  • a wash solution containing yeast cell walls can be adjusted to a desired pH by adding an alkaline substance to the wash solution.
  • alkaline substances include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, alkaline earth metal hydroxides such as calcium hydroxide, and alkali metal carbonates such as sodium carbonate.
  • An alkaline substance may be used as an aqueous solution to adjust the pH.
  • Solid-liquid separation in washing the yeast cell walls may include centrifugation while adding water.
  • water For adding water, only water may be used, or an alkaline aqueous solution containing an alkaline substance may be used.
  • the alkaline aqueous solution may have, for example, pH 8 or more and pH 14 or less, preferably pH 9.5 or more and pH 12 or less.
  • the washing temperature in the washing step may be, for example, 4°C or higher and 95°C or lower, preferably 20°C or higher and 50°C or lower. Washing may also be carried out, for example, until the liquid, which is solid-liquid separated by centrifugation, turns from colorless to pale or transparent.
  • the first processed material obtained in the washing step may be water-insoluble, or may be a water-insoluble solid. Moreover, the first processed material may be in the form of a slurry containing yeast cell walls, which are water-insoluble solids.
  • the first treated material is heat treated under alkaline conditions to obtain the second treated material.
  • the heat treatment under alkaline conditions may be an alkaline hydrolysis treatment of the first processed material.
  • the heat treatment step may include obtaining a mixture containing the first processed product, the alkaline substance, and the liquid medium, heating the mixture to a predetermined temperature, and maintaining the mixture at the predetermined temperature for a predetermined time.
  • the mixture may be stirred or left standing. Further, when the mixture is maintained at a predetermined temperature, a temperature variation of, for example, ⁇ 10°C, preferably ⁇ 5°C is allowed.
  • the alkaline conditions for heat-treating the first processed material may be, for example, pH 8 or more and 14 or less, preferably pH 9 or more, and preferably pH 12 or less.
  • the alkaline conditions for heat-treating under alkaline conditions with a relatively low pH there is a tendency to obtain a glucan composition with a more excellent immunostimulatory effect.
  • the pH of the first processed product can be adjusted to a desired pH by adding the alkaline substance described above to the slurry.
  • the addition method may be a batch system or a continuous system.
  • the amount of the alkaline substance added for adjusting the above pH may be, for example, 0.01% by mass or more and 1% by mass or less, preferably 0.05% by mass or more, relative to the mixture, Moreover, it may preferably be 0.5% by mass or less.
  • the temperature of the heat treatment may be, for example, 60°C or higher and 120°C or lower, preferably 70°C or higher or 75°C or higher, and preferably 110°C or lower or 95°C or lower.
  • the heat treatment time may be, for example, 3 hours or more and 24 hours or less, preferably 12 hours or more, and preferably 20 hours or less.
  • the heat treatment atmosphere may be, for example, an air atmosphere.
  • the second processed material obtained in the heat treatment step may be, for example, in the form of a slurry containing water-insoluble solids, and may have a solid content of 10% by mass or more and 20% by mass or less.
  • the third processed material containing the solid content is recovered from the second processed material obtained in the heat treatment step.
  • the second processed material to be subjected to the recovery step may be neutralized or in an alkaline state.
  • the recovery of the solid content from the second processed material can be carried out by solid-liquid separation of the second processed material.
  • solid-liquid separation for example, a centrifugal separation method, a method using a filter, an ultrafiltration membrane, or the like can be used.
  • the third processed material may be recovered as a wet cake containing water, or may be recovered as a slurry containing solids.
  • the content of solids in the third processed material may be, for example, 5% by mass or more, preferably 10% by mass or more, or higher than 20% by mass.
  • the method for producing a glucan composition may further include a drying step of drying the third processed product.
  • a spray dryer, a freeze dryer, a drum dryer, or the like can be used for the drying step.
  • a sterilization step of sterilizing the third processed material may be provided before the drying step.
  • the sterilization step can be carried out by heat treatment at 120° C. or higher for 10 to 60 seconds using a UHT sterilizer, for example, but can be adjusted as appropriate so as to meet the desired quality.
  • a glucan composition obtained by a method for producing a glucan composition may be an immunostimulator because it has an excellent immunostimulatory effect.
  • the glucan composition since it has an excellent effect of promoting interleukin production, it may be an interleukin production promoter, preferably an interleukin-8 production promoter.
  • the method for producing a glucan composition may include obtaining a yeast-derived water-soluble polysaccharide in addition to obtaining the glucan composition.
  • the yeast-derived water-soluble polysaccharide can be recovered from the supernatant solution separated from the second processed product. Specifically, yeast-derived of water-soluble polysaccharides can be obtained.
  • the resulting yeast-derived water-soluble polysaccharide has excellent water solubility, low viscosity in an aqueous solution, and a high mannan content. That is, the method for producing a glucan composition may include a method for producing a mannan composition.
  • the content of mannan in the yeast-derived water-soluble polysaccharide may be, for example, 40% by mass or more and 80% by mass or less.
  • the heat treatment of the supernatant solution under acidic conditions may be performed, for example, under acidic conditions of pH 2.5 or higher and pH 5 or lower, preferably pH 3.5 or higher and pH 4.5 or lower.
  • the heat treatment temperature may be, for example, 90° C. or higher and 120° C. or lower, preferably 95° C. or higher and 115° C. or lower.
  • the heat treatment time may be, for example, 15 seconds or more and 120 seconds or less, preferably 30 seconds or more and 90 seconds or less.
  • centrifugation diatomaceous earth filtration, and ultrafiltration membranes can be used to remove the coagulum generated by heat treatment.
  • a spray dryer, a freeze dryer, a drum dryer, or the like can be used for the drying treatment of the solution from which the coagulum has been removed.
  • Immunostimulatory methods may comprise administering to a subject an immunostimulatory agent comprising the glucan composition described above.
  • the subject may be a vertebrate, invertebrate, or the like. Details of subjects and doses are as described above.
  • Another aspect of the present invention includes the use of a glucan composition in the production of an immunostimulator used in an immunostimulatory method, the use of a glucan composition in an immunostimulatory method, and the glucan composition used in an immunostimulatory method. .
  • Example 1 Prepare a yeast cell wall (15% solid content, derived from yeast autolysate) derived from brewer's yeast belonging to the genus Saccharomyces manufactured at Tochigi Koganei Factory of Asahi Group Foods Co., Ltd. Yeast glucan according to the following method. A composition was obtained.
  • yeast cell walls were washed under alkaline conditions while water and sodium hydroxide were added to obtain a first processed product with a pH adjusted to 10 or more and 11 or less.
  • the mixture was heat-treated at a temperature of 80° C. or higher and 90° C. or lower for 17 hours to obtain a second processed product.
  • the obtained second processed product was centrifuged to obtain a third processed product as a heavy liquid.
  • the resulting third processed product was dried using a drum dryer to obtain the glucan composition of Example 1 (YG35).
  • Comparative example 1 The yeast cell wall prepared in Example 1 was dried to obtain the glucan composition (YCW) of Comparative Example 1.
  • Comparative example 2 The glucan composition (YG35) of Example 1 was purified with protease and then freeze-dried to obtain the glucan composition (YG45) of Comparative Example 2.
  • Comparative example 3 The glucan composition of Comparative Example 2 (YG45) was purified by removing lipids using an organic solvent, and then freeze-dried to obtain the glucan composition of Comparative Example 3 (YG55).
  • Table 1 shows the results.
  • the contents of ⁇ -glucan, ⁇ -glucan and mannan are the contents of the entire glucan composition as part of carbohydrates, and the content of glycogen is the glucan composition as part of ⁇ -glucan. It is the content rate for the whole product.
  • ⁇ -Glucan Sample Each of the glucan compositions obtained above was sonicated for 3 minutes while cooling on ice to obtain a dispersion. Pig-derived pepsin was added to each of the obtained dispersions, and pepsin treatment was performed at 39° C. for 2 hours. Next, porcine-derived pancreatin was added and pancreatin treatment was performed at 39° C. for 4 hours to prepare each ⁇ -glucan sample.
  • the isolated neutrophils were suspended in RPMI1640 medium and seeded in a 24-well multiwell plate at 2 ⁇ 10 5 cells/well. Similarly, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were seeded at 2 ⁇ 10 7 cells/well. Thereafter, the cells were cultured under conditions of 5% CO 2 and 37° C. for 2 hours, neutrophils or monocytes in the PBMC were adhered, and the supernatant was removed. Each ⁇ -glucan sample was added to a concentration of 20 ⁇ g/ml and cultured for 24 hours, after which the supernatant was collected and IL-8 production was measured using a commercially available ELISA kit.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 1 shows the results of using the glucan compositions of Example 1 and Comparative Example 1. Significant difference (p ⁇ 0.01) was observed by t-test.
  • FIG. 2 shows the results of using the glucan compositions of Example 1 and Comparative Examples 2 and 3. A one-way ANOVA was performed, and a significant difference was observed overall (p ⁇ 0.05). Therefore, when all group multiple comparisons were performed by the Bonferroni method, Example 1 had a significant difference (p ⁇ 0.01) with respect to Comparative Example 2, and a significant difference (p ⁇ 0.05) with respect to Comparative Example 3. was accepted.
  • the glucan composition (YG35) containing about 35% by mass of ⁇ -glucan exhibits a high immunostimulatory effect. Also, it can be seen that the glucan composition (YG35) exhibits a significantly higher immunostimulatory effect than the more purified glucan composition (YG45) and the glucan composition (YG55).

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Abstract

酵母細胞壁に由来するβーグルカンを含み、高い免疫賦活効果を有する免疫賦活剤が提供される。免疫賦活剤は、酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下である。免疫賦活剤は、マンナンを更に含んでいてよく、その含有率が５質量％以上２０質量％以下であってよい。

Description

免疫賦活剤及びグルカン組成物の製造方法
　本発明は、免疫賦活剤及びグルカン組成物の製造方法に関する。
　近年、薬剤耐性菌の世界的な広まりが懸念されている。世界保健機関（ＷＨＯ）は、原因の１つとして家畜用抗生物質の乱用を指摘しており、畜産業界からは抗生物質の代替、すなわち感染症に対する解決策が求められている。生体がもともと持つ免疫機能の向上は感染症対策として有効であり、免疫賦活効果を持つ資材として認知度の高いβ－グルカンが期待されている。
　免疫賦活剤として活用される酵母由来のグルカン資材は、一般に精製度が高いほど免疫賦活効果が高いと考えられている（例えば、Jung-Nam Lee et.al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(4),837-841, 2001.参照）。また例えば、特表２０１０－５３３４７９号公報には、酵素処理と酸・アルカリ加水分解処理を組み合わせたグルカン調製物の調製方法が提案され、グルカン含有量が高く、工業的な使用に適するとされている。
　酵母由来のβ－グルカンを含む資材には、より高い免疫賦活効果が求められている。本発明の一態様は、酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、高い免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することを目的とする。
　第１態様は、酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下の免疫賦活剤である。ある一形態において、免疫賦活剤はマンナンを更に含み、免疫賦活剤におけるマンナンの含有率が５質量％以上２０質量％以下であってよく、β－グルカンに対する前記マンナンの含有比が０．１以上１未満であってよい。ある一形態において、免疫賦活剤はα－グルカンを更に含み、免疫賦活剤におけるα－グルカンの含有率が７質量％以上１２質量％以下であってよく、β－グルカンに対するα－グルカンの含有比が０．１５以上０．５５以下であってよい。ある一形態において、α－グルカンはグリコーゲンを含み、免疫賦活剤におけるグリコーゲンの含有率が４質量％以上１０質量％以下であってよく、β－グルカンに対するグリコーゲンの含有比が０．１６以上０．５以下であってよい。
　第２態様は、酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下であるインターロイキン８産生促進剤である。ある一形態において、マンナンを更に含み、インターロイキン８産生促進剤におけるマンナンの含有率が５質量％以上２０質量％以下であってよく、β－グルカンに対する前記マンナンの含有比が０．１以上１未満であってよい。ある一形態において、α－グルカンを更に含み、インターロイキン８産生促進剤におけるα－グルカンの含有率が７質量％以上１２質量％以下であってよく、β－グルカンに対するα－グルカンの含有比が０．１５以上０．５５以下であってよい。ある一形態において、α－グルカンはグリコーゲンを含み、インターロイキン８産生促進剤におけるグリコーゲンの含有率が４質量％以上１０質量％以下であってよく、β－グルカンに対するグリコーゲンの含有比が０．１６以上０．５以下であってよい。
　第３態様は、酵母細胞壁をアルカリ性条件下で洗浄して第１処理物を得ることと、第１処理物をアルカリ条件下で熱処理して第２処理物を得ることと、第２処理物から固形分として第３処理物を回収することと、を含み、第３処理物は、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下である、グルカン組成物の製造方法である。ある一形態において、アルカリ条件下での熱処理は、ｐＨ８以上ｐＨ１４以下、７０℃以上１１０℃以下の条件で行われてよい。ある一形態において、酵母細胞壁は、醸造用酵母又はパン酵母に由来する細胞壁を含んでいてよい。ある一形態において、アルカリ条件下での洗浄は、酵母細胞壁を含む洗浄液をｐＨ８以上ｐＨ１４以下に調整することと、加水しながら遠心分離機で固液分離することとを含んでいてよい。ある一形態において、第３処理物は、第２処理物を遠心分離により固液分離して回収されてよい。ある一形態において、製造されるグルカン組成物は、免疫賦活剤であってもよく、インターロイキン８産生促進剤であってもよい。
　本発明の一態様によれば、酵母細胞壁に由来するβーグルカンを含み、高い免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することができる。
実施例１及び比較例１に係るグルカン組成物のインターロイキン８産生促進効果を示す図である。 実施例１、比較例２及び比較例３に係るグルカン組成物のインターロイキン８産生促進効果を示す図である。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。さらに本明細書に記載される数値範囲の上限及び下限は、数値範囲として例示された数値を任意に選択して組み合わせることが可能である。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、免疫賦活剤及びグルカン組成物の製造方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す免疫賦活剤及びグルカン組成物の製造方法に限定されない。
免疫賦活剤
　免疫賦活剤は、酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、免疫賦活剤中のβ－グルカンの含有率が、例えば、２５質量％以上４５質量％以下であるグルカン組成物である。本実施形態に係る免疫賦活剤は、所定の含有率で酵母細胞壁由来のβ－グルカンを含むことで優れた免疫賦活効果を有する。これにより、家畜、ヒト、養殖魚等における感染症の罹患、進行を抑制することが期待されるだけでなく、薬剤耐性菌発生の脅威を軽減する手段を提供しうる。
　免疫賦活剤の免疫賦活効果は、例えば、インターロイキン等の免疫に関与するサイトカインの産生促進効果で評価することができる。すなわち、免疫賦活剤はインターロイキン産生促進剤であってよく、好ましくはインターロイキン８産生促進剤であってもよい。
　免疫賦活剤を構成するβ－グルカンは、Ｄ－グルコースがグリコシド結合で連結したポリマーであり、β－１，３結合の直鎖の主鎖骨格及びβ－１，６結合して分岐する側鎖を有する。免疫賦活剤を構成するβ－グルカンは、例えば、酵母細胞壁に由来し、酵母細胞壁を加水分解処理して得られるものであることが好ましく、後述するβ－グルカン組成物の製造方法によって製造されるグルカン組成物に含まれるものであってよい。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンの含有率は、好ましくは２８質量％以上、３０質量％以上、３４質量％以上、又は３５質量％以上であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンの含有率は、好ましくは４２質量％以下、４０質量％以下、３８質量％以下、又は３５質量％以下であってよい。β－グルカンの含有率が上記範囲内であると、より高い免疫賦活効果が得られる傾向がある。なお、本明細書におけるβ－グルカンの含有率は、乾物換算した値であり、以下のマンナン、α－グルカン、グリコーゲン等の含有率についても同様に乾物換算した値である。
　免疫賦活剤は、β－グルカンに加えて、マンナンを更に含んでいてもよい。免疫賦活剤がマンナンを含む場合、免疫賦活剤におけるマンナンの含有率は、例えば、５質量％以上２０質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるマンナンの含有率は、好ましくは７質量％以上、９質量％以上、又は１０質量％以上であってよく、また好ましくは１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、又は１２質量％以下であってよい。マンナンの含有率が上記範囲内であると、より高い免疫賦活効果が得られる傾向がある。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンに対するマンナンの含有比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．１以上１未満であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンに対するマンナンの含有比は、好ましくは、０．２以上、０．２５以上、０．２８以上、又は０．３以上であってよく、また好ましくは０．８以下、０．６以下、０．４以下、又は０．３５以下であってよい。
　免疫賦活剤は、β－グルカンに加えて、α－グルカンを更に含んでいてもよい。免疫賦活剤がα－グルカンを含む場合、免疫賦活剤におけるα－グルカンの含有率は、例えば、７質量％以上１２質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるα－グルカンの含有率は、好ましくは８質量％以上、９質量％以上、又は９．５質量％以上であってよく、また好ましくは１８質量％以下、１１質量％以下、１０．５質量％以下、又は１０質量％以下であってよい。α－グルカンの含有率が上記範囲内であると、より高い免疫賦活効果が得られる傾向がある。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンに対するα－グルカンの含有比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．１５以上０．５５以下であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンに対するα－グルカンの含有比は、好ましくは、０．１８以上、０．２以上、０．２４以上、又は０．２６以上であってよく、また好ましくは０．５以下、０．４以下、０．３以下、又は０．２８以下であってよい。
　免疫賦活剤は、α－グルカンの一部として、グリコーゲンを含んでいてもよい。免疫賦活剤がグリコーゲンを含む場合、免疫賦活剤におけるグリコーゲンの含有率は、例えば、４質量％以上１０質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるグリコーゲンの含有率は、好ましくは５質量％以上、６質量％以上、又は６．４質量％以上であってよく、また好ましくは９質量％以下、８質量％以下、７質量％以下、又は６．８質量％以下であってよい。グリコーゲンの含有率が上記範囲内であると、より高い免疫賦活効果が得られる傾向がある。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンに対するグリコーゲンの含有比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．１６以上０．３以下であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンに対するグリコーゲンの含有比は、好ましくは、０．１７以上、０．１８以上、又は０．１８２以上であってよく、また好ましくは０．２５以下、０．２２以下、０．２以下、又は０．１９以下であってよい。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンとα－グルカンの総含有率は、例えば３５質量％以上５２質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンとα－グルカンの総含有率は、好ましくは３８質量％以上、４０質量％以上、４２質量％以上、又は４４質量％以上であってよく、また好ましくは５０質量％以下、４８質量％以下、又は４６質量％以下であってよい。β－グルカンとα－グルカンの総含有率が上記範囲内であると、より高い免疫賦活効果が得られる傾向がある。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンとα－グルカンの総含有量（以下、グルカン総含有量ともいう）に対するβ－グルカンの含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．６５以上０．８５以下であってよい。免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するβ－グルカンの含有量の比は、好ましくは０．６８以上、０．７以上、０．７２以上、０．７４以上、０．７６以上、又は０．７８以上であってよく、また好ましくは０．８２以下、０．８以下、又は０．７９以下であってよい。
　免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するα－グルカンの含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．１４以上０．３５以下であってよい。免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するα－グルカンの含有量の比は、好ましくは０．１６以上、０．１８以上、又は０．２以上であってよく、また好ましくは０．３以下、０．２８以下、０．２６以下、０．２４以下、又は０．２２以下であってよい。
　免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するマンナンの含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．１以上０．６以下であってよい。免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するマンナンの含有量の比は、好ましくは０．１４以上、０．１８以上、０．２以上、又は０．２２以上であってよく、また好ましくは０．５以下、０．４以下、０．３以下、０．２８以下、又は０．２６以下であってよい。
　免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するグリコーゲンの含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．１１以上０．３以下であってよい。免疫賦活剤におけるグルカン総含有量に対するグリコーゲンの含有量の比は、好ましくは０．１１以上、０．１２以上、０．１３以上、又は０．１４以上であってよく、また好ましくは０．２以下、０．１８％以下、０．１６以下、又は０．１５以下であってよい。
　免疫賦活剤は、β－グルカンの精製度が比較的低いにもかかわらず、高い免疫賦活活性を示すことができる。これは例えば、弱アルカリ条件での低強度な抽出処理のみを経ることで、酵母細胞壁の立体的構造を過剰に破壊することなく効果的に有効成分が濃縮され、免疫応答に必要十分な形態を保持できているからと考えられる。また、あるいは免疫賦活剤が、後述するグルカン組成物の製造方法によって製造されるグルカン組成物を含むからと考えることもできる。
　免疫賦活剤は、炭水化物の総含有率が、例えば６０質量％以上７０質量％であってよく、好ましくは６２質量％以上６６質量％以下であってよい。炭水化物には上述したβ－グルカン、α－グルカン、マンナン等が含まれる。炭水化物の総含有量に対するβ－グルカンの含有率は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば、３５質量％以上７０質量％以下であってよく、好ましくは４５質量％以上、又は５０質量％以上であってよく、また好ましくは６５質量％以下、又は６０質量％以下であってよい。
　免疫賦活剤は、タンパク質を含んでいてもよい。免疫賦活剤におけるタンパク質の含有率は、例えば１５質量％以上２５質量％以下であってよく、好ましくは１８質量％以上２２質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンの含有量に対するタンパク質の含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．３８以上０．１以下であってよく、好ましくは０．４５以上、又は０．５以上であってよく、また好ましくは０．８以下、又は０．６以下であってよい。
　免疫賦活剤は、脂質を含んでいてもよい。免疫賦活剤における脂質の含有率は、例えば１０質量％以上１８質量％以下であってよく、好ましくは１２質量％以上１６質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンの含有量に対する脂質の含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．３８以上０．４以下であってよく、好ましくは０．３９以上であってよく、また好ましくは０．４以下であってよい。
　免疫賦活剤は、灰分を含んでいてもよい。免疫賦活剤における灰分の含有率は、例えば１．８質量％以上３質量％以下であってよく、好ましくは１．９質量％以上であってよく、また２．２質量％以下であってよい。免疫賦活剤におけるβ－グルカンの含有量に対する灰分の含有量の比は、インターロイキン産生促進効果の観点から、例えば０．０４以上０．０６５以下であってよく、好ましくは０．０５以上であってよく、また好ましくは０．０６以下であってよい。
　免疫賦活剤は、水不溶性成分を含んでいてよく、水不溶性成分は活性成分を含んでいてよい。免疫賦活剤は実質的に水不溶性成分からなるものであってもよい。ここで「実質的に」とは、不可避的に混入する水可溶性成分を排除しないことを意味し、水可溶性成分の含有率が例えば５質量％未満、又は１質量％未満であることを意味する。また、免疫賦活剤は、水不溶性成分と水可溶性成分を含むものであってもよい。免疫賦活剤が水可溶性成分を含む場合、その含有率は例えば１質量％以上５０質量％未満であってよく、好ましくは４０質量％以下又は２０質量％以下であってよく、また好ましくは５質量％以上であってよい。なお、本明細書において水不溶性とは、２５℃において１００ｇの水に対する溶解度が１ｇ未満であることを意味し、水可溶性とは、２５℃において１００ｇの水に対する溶解度が１ｇ以上であることを意味する。免疫賦活剤は、例えば、後述するグルカン組成物の製造方法によって得られる第３処理物を含んでいてよく、第３処理物からなるものであってよい。
　免疫賦活剤は、主要成分であるβ－グルカンに加えて、免疫調整作用を有する公知の成分を更に含んでいてもよい。免疫調整作用を有する成分としては、例えば、甜茶抽出物、フコイダン、アラビノキシラン、ラクトフェリン、カテキン、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチンオリゴ糖、Ｌ－アスコルビン酸、コエンザイムＱ１０（還元型を含む）等を挙げることができる。
　免疫賦活剤には、必要に応じて、通常、医薬品、食品、飼料等に用いられ得ることが知られている任意の成分、例えば、水、油脂、糖類、ビタミン類、甘味料、調味料、酸味料、保存料、香料、着色料、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、ｐＨ調整剤等を配合することができる。
　免疫賦活剤の形態は、粉末、顆粒等の固体、液体、ペースト等のいずれであってもよい。また、免疫賦活剤の剤型は、投与方法、投与対象等に応じて適宜選択することができる。剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ剤、散剤、液剤等の経口投与用製剤が挙げられる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の添加剤を用いて公知の方法に従って製造することができる。また、免疫賦活剤を含有させて、健康食品、健康補助食品等の食品組成物、飲料組成物、飼料等を構成することもできる。
　免疫賦活剤は、脊椎動物、無脊椎動物等の投与対象に投与されると、対象において免疫賦活効果を発現する。これにより、対象における感染症の発症を抑制することができる。すなわち、免疫賦活剤は対象の感染症の予防方法に適用することができる。投与の対象となる脊椎動物としては、哺乳動物、鳥類、魚類等が挙げられる。哺乳動物は、ヒトを含んでいてもよく、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルの他、イヌ、ネコ等の愛玩動物等が挙げられる。鳥類としては、肉鶏、産卵鶏、七面鳥、アヒル、ハト等が挙げられる。また、魚類としては、サケ、マス、ヤマメ、イワナ、イトウ等のサケ科魚類、コイ、フナ、ティラピア、ナマズ、スズキ、ブリ、カンパチ、ハマチ、ヒラメ、タイ、マグロ、ウナギ等が挙げられる。投与の対象となる無脊椎動物としては例えば、カニ、エビ等の節足動物、ウニ、ナマコ等の棘皮動物、タコ、イカ、貝類等の軟体動物、ホヤ等の原索動物などが挙げられる。
　免疫賦活剤を医薬品又は飲食品として投与する場合、例えば、１回あたり１ｍｇから５００ｍｇ（乾燥重量）／ｋｇ体重の量を、１日に１回から数回の経口投与とすることができる。また、飲食品、飼料等として使用する場合、飲食品、飼料等の１００ｇあたり０．００１ｇから１ｇを添加することができる。
　免疫賦活剤を飼料として投与する場合、例えば、哺乳動物、鳥類、魚類に対しては投与する餌に対して０．００１質量％以上１質量％以下で混合したものを一日に１回から数回投与することができる。
グルカン組成物の製造方法
　グルカン組成物の製造方法は、酵母細胞壁をアルカリ性条件下で洗浄して第１処理物を得る洗浄工程と、第１処理物をアルカリ条件下で熱処理して第２処理物を得る熱処理工程と、第２処理物から固形分として第３処理物を回収する回収工程と、を含む。得られる第３処理物は、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下であり、優れた免疫賦活効果を有する。また第３処理物は、優れたインターロイキン産生促進効果を有し、特にインターロイキン８産生促進効果に優れる。
　酵母細胞壁をアルカリ性条件下で洗浄してから、アルカリ性条件で加水分解することで、優れた免疫賦活効果を有するグルカン組成物を、効率的に製造することができる。これは例えば、洗浄工程によって免疫賦活効果に寄与する成分が効率的に濃縮されるためと考えることができる。
　グルカン組成物の製造方法に用いられる酵母細胞壁は、市販品であってもよく、例えば、原料となる酵母を前処理して得られるものであってもよい。原料となる酵母を前処理する前処理工程は、例えば、酵母を自己消化して自己消化物を得る自己消化工程、酵母を熱水抽出して熱水抽出物得る熱水抽出工程、酵母を酵素処理して酵素処理物を得る酵素処理工程等の単独もしくはそれらの組み合わせである予備分解工程と、予備分解工程を経た予備分解物を遠心分離して酵母細胞壁を得る分離工程とを含んでいてもよい。
　原料となる酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、カンジダ属、ピキア属、トルロプシス属等の酵母が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、少なくともサッカロマイセス属の酵母を含むことがより好ましい。サッカロマイセス属の酵母には、ビール酵母、パン酵母等の食品用酵母が含まれる。また、食品用酵母としては例えば、ビール酵母、発泡酒酵母、雑酒酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母等の醸造用酵母、パン酵母、トルラ酵母等を挙げることができる。
　自己消化工程では、酵母自体のプロテアーゼ等により酵母のタンパク質等を分解して自己消化物を得る。自己消化工程は、例えば、ｐＨを２から７に、温度を４０℃以上６５℃以下に調整して、１時間以上４８時間以下で行われる。分離工程では、自己消化物を遠心分離して重液として酵母細胞壁を含む画分を得る。遠心分離には、例えば、工業生産においてはノズル型遠心機、間欠排出型遠心機、シャープレス型遠心機等を用いることができ、自己消化物中の不溶性成分を回収できる限り、遠心分離の条件は適宜調整することができる。
洗浄工程
　洗浄工程では、酵母細胞壁をアルカリ条件下で洗浄して第１処理物を得る。洗浄方法は、酵母細胞壁に残留するタンパク質、アミノ酸等の少なくとも一部を除去できる方法であればよい。洗浄方法は、例えば酵母細胞壁と液媒体とを混合して酵母細胞壁を含む洗浄液を調製し、洗浄液から液媒体の少なくとも一部を除去することを含んでいてよい。液媒体は少なくとも水とアルカリ性物質を含んでいてよい。洗浄液からの液媒体の除去方法は、通常用いられる固液分離方法から適宜選択すればよい。固液分離方法としては、例えばイーストセパレーター等による遠心分離法、濾過器、限外濾過膜等を用いる方法等が挙げられる。
　酵母細胞壁の洗浄は、酵母細胞壁を含む洗浄液をｐＨ８以上ｐＨ１４以下、好ましくはｐＨ９．５以上ｐＨ１２以下に調整することと、加水しながら遠心分離機（例えば、イーストセパレーター）で固液分離することとを含んでいてよい。洗浄液は液媒体として少なくとも水を含んでいてよい。酵母細胞壁を含む洗浄液は、洗浄液にアルカリ性物質を添加することで所望のｐＨに調整することができる。アルカリ性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩等を挙げることができる。アルカリ性物質は、水溶液としてｐＨの調整に用いられてもよい。
　酵母細胞壁の洗浄における固液分離は、加水しながら遠心分離することを含んでいてよい。加水には、水のみを用いてもよいし、アルカリ性物質を含むアルカリ水溶液を用いてもよい。アルカリ水溶液は、例えばｐＨ８以上ｐＨ１４以下であってよく、好ましくはｐＨ９．５以上ｐＨ１２以下であってよい。
　洗浄工程における洗浄温度は例えば、４℃以上９５℃以下であってよく、好ましくは２０℃以上５０℃以下の温度範囲内であってよい。また、洗浄は例えば、遠心分離によって固液分離される液体が、無色から淡色、又は透明になるまで実施してもよい。
　洗浄工程で得られる第１処理物は水不溶性であってよく、水不溶性の固形物であってよい。また、第１処理物は、水不溶性の固形物である酵母細胞壁を含むスラリーの形態であってもよい。
熱処理工程
　熱処理工程では、第１処理物をアルカリ条件下で熱処理して第２処理物を得る。アルカリ条件での熱処理は、第１処理物のアルカリ加水分解処理であってよい。熱処理工程は、第１処理物とアルカリ性物質と液媒体とを含む混合物を得ることと、混合物を所定温度まで昇温することと、混合物を所定温度で所定時間維持することとを含んでいてよい。熱処理工程では、混合物を撹拌してもよいし、静置したままであってもよい。また、混合物を所定温度に維持する際には、例えば±１０℃、好ましくは±５℃程度の温度変動が許容される。
　第１処理物を熱処理するアルカリ条件は、例えばｐＨ８以上１４以下であってよく、好ましくはｐＨ９以上であってよく、また好ましくは１２以下であってよい。比較的低いｐＨのアルカリ条件で熱処理することにより、免疫賦活効果により優れるグルカン組成物が得られる傾向がある。第１処理物のｐＨは例えば、第１処理物が酵母細胞壁を含むスラリーである場合、スラリーに上述したアルカリ性物質を添加することで所望のｐＨに調整することができる。添加方法はバッチ式でも連続式でもよい。上記ｐＨに調整するためのアルカリ性物質の添加量は、例えば、混合物に対して、例えば０．０１質量％以上１質量％以下であってよく、好ましくは０．０５質量％以上であってよく、また好ましくは０．５質量％以下であってよい。
　熱処理の温度は、例えば６０℃以上１２０℃以下であってよく、好ましくは７０℃以上、又は７５℃以上であってよく、また好ましくは１１０℃以下、又は９５℃以下であってよい。熱処理の時間は、例えば３時間以上２４時間以下であってよく、好ましくは１２時間以上であってよく、また好ましくは２０時間以下であってよい。熱処理の雰囲気は、例えば大気雰囲気であってよい。
　熱処理工程で得られる第２処理物は、例えば水不溶性の固形物を含むスラリーの形態であってよく、固形分が１０質量％以上２０質量％以下であってよい。
回収工程
　回収工程では、熱処理工程で得られた第２処理物から固形分を含む第３処理物を回収する。回収工程に供される第２処理物は、中和されていてもよいし、アルカリ性の状態であってもよい。第２処理物からの固形分の回収は、第２処理物を固液分離することで実施することができる。固液分離には、例えば、遠心分離法、濾過器、限外濾過膜等を用いる方法等を用いることができる。遠心分離にはイーストセパレーター、ノズル型遠心機、間欠排出型遠心機、シャープレス遠心機等を用いることができる。
　第３処理物は、水分を含むウエットケーキとして回収されてもよく、固形分を含むスラリーとして回収されてもよい。第３処理物における固形分の含有率は、例えば５質量％以上であってよく、好ましくは１０質量％以上、又は２０質量％より高くてよい。
　グルカン組成物の製造方法は、第３処理物を乾燥する乾燥工程を更に含んでいてもよい。乾燥工程には、噴霧乾燥機、凍結乾燥機、ドラム乾燥機等を用いることができる。グルカン組成物の製造方法では、乾燥工程の前に第３処理物を殺菌処理する殺菌工程を設けてもよい。殺菌工程は、例えば、ＵＨＴ殺菌機を用いて１２０℃以上で１０秒から６０秒間熱処理して行うことができるが、目的の品質に合致するよう適宜調整することができる。
　グルカン組成物の製造方法によって得られるグルカン組成物は、優れた免疫賦活効果を有することから、免疫賦活剤であってよい。また、グルカン組成物は、優れたインターロイキン産生促進効果を有することから、インターロイキン産生促進剤であってよく、好ましくはインターロイキン８産生促進剤であってよい。
　なお、グルカン組成物の製造方法は、グルカン組成物を得ることに加えて、酵母由来の水溶性多糖類を得ることを含んでいてもよい。酵母由来の水溶性多糖類は、第２処理物から分離される上清溶液から回収することができる。具体的には、上清溶液を酸性条件下で熱処理することと、熱処理で生成する凝固物を除去することと、凝固物が除去された溶液を乾燥処理することとを含む方法によって、酵母由来の水溶性多糖類を得ることができる。
　得られる酵母由来の水溶性多糖類は、水溶性に優れ、水溶液状態において低粘度であり、マンナン含有率が高い。すなわち、グルカン組成物の製造方法は、マンナン組成物の製造方法を含んでいてもよい。酵母由来の水溶性多糖類におけるマンナンの含有率は、例えば４０質量％以上８０質量％以下であってよい。
　上清溶液の酸性条件下での熱処理は、例えばｐＨ２．５以上ｐＨ５以下、好ましくはｐＨ３．５以上ｐＨ４．５以下の酸性条件下で行われてよい。熱処理の温度は、例えば９０℃以上１２０℃以下、好ましくは９５℃以上１１５℃以下であってよい。熱処理時間は、例えば１５秒以上１２０秒以下、好ましくは３０秒以上９０秒以下であってよい。
　熱処理で生成する凝固物の除去には、例えば、遠心分離、珪藻土濾過、限外濾過膜を用いることができる。また、凝固物が除去された溶液の乾燥処理には、噴霧乾燥機、凍結乾燥機、ドラム乾燥機等を用いることができる。
免疫賦活方法
　免疫賦活方法は、上述したグルカン組成物を含む免疫賦活剤を対象に投与することを含んでいてよい。対象は脊椎動物、無脊椎動物等であってよい。対象の詳細、投与量については既述の通りである。
　本発明は、別の態様として、免疫賦活方法に用いられる免疫賦活剤の製造におけるグルカン組成物の使用、免疫賦活方法におけるグルカン組成物の使用、免疫賦活方法に使用されるグルカン組成物を包含する。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１５％、酵母の自己消化物由来）を準備し、以下の方法に従って酵母グルカン組成物を取得した。
　イーストセパレーターを用いて、水及び水酸化ナトリウムを添加しながら、酵母細胞壁をアルカリ条件下で洗浄し、ｐＨが１０以上１１以下に調整された第１処理物を得た。混合物を８０℃以上９０℃以下の温度で１７時間熱処理して第２処理物を得た。得られた第２処理物を遠心分離して、重液として第３処理物を得た。得られた第３処理物をドラム乾燥機で乾燥処理して実施例１のグルカン組成物（ＹＧ３５）を得た。
比較例１
　実施例１で準備した酵母細胞壁を乾燥処理して、比較例１のグルカン組成物（ＹＣＷ）とした。
比較例２
　実施例１のグルカン組成物（ＹＧ３５）を、プロテアーゼによって精製処理したのち、凍結乾燥処理して比較例２のグルカン組成物（ＹＧ４５）とした。
比較例３
　比較例２のグルカン組成物（ＹＧ４５）を、有機溶媒を用いて脂質を除去する精製処理を行ったのち、凍結乾燥処理して比較例３のグルカン組成物（ＹＧ５５）とした。
　上記で得られたグルカン組成物の成分分析を行った。結果を表１に示す。表１中、β－グルカン、α－グルカン及びマンナンの含有率は、炭水化物の一部としてのグルカン組成物全体に対する含有率であり、グリコーゲンの含有率は、α－グルカンの一部としてのグルカン組成物全体に対する含有率である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
β－グルカンサンプルの調製
　上記で得られたグルカン組成物をそれぞれ、氷冷しながら３分間超音波処理して分散物を得た。得られた分散物にそれぞれ、ブタ由来ペプシンを添加して３９℃、２時間のペプシン処理を行った。次いでブタ由来パンクレアチンを添加して３９℃、４時間のパンクレアチン処理を行って、β－グルカンサンプルをそれぞれ調製した。
（１）好中球の単離
　１０週齢の離乳子豚６頭の頸静脈から、ヘパリン管に末梢血を採血した。その後６８％と７５％のパーコール溶液を用いた不連続密度勾配遠心法により、リンパ球・単球・血小板などから好中球を分離した。７４．７％塩化アンモニウムで赤血球を溶血し、３５０×ｇ・１８℃・１０分間の遠心分離後、沈殿をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。
（２）ＩＬ－８産生量の測定
　単離した好中球をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４穴マルチウェルプレートに播種した。同様に末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。その後、５％ＣＯ２・３７℃の条件下で２時間培養し、好中球もしくはＰＢＭＣ中の単球を付着させ上清を除去した。各β－グルカンサンプルを２０μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加して２４時間培養した後、上清を回収し市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、ＩＬ－８産生量を測定した。
　図１には、実施例１と比較例１のグルカン組成物を用いた結果を示す。ｔ検定によって有意差（ｐ＜０．０１）が認められた。また、図２には、実施例１と比較例２及び比較例３のグルカン組成物を用いた結果を示す。一元配置分散分析を実施した結果、全体に有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。そこでＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による全群多重比較を実施したところ、実施例１は比較例２に対して有意差（ｐ＜０．０１）が、比較例３に対しては有意差（ｐ＜０．０５）が認められた。
　以上から、β－グルカンを約３５質量％含むグルカン組成物（ＹＧ３５）が高い免疫賦活効果を示すことが分かる。また、グルカン組成物（ＹＧ３５）が、より精製されたグルカン組成物（ＹＧ４５）、グルカン組成物（ＹＧ５５）よりも有意に高い免疫賦活効果を示すことが分かる。
　日本国特許出願２０２１－０８６３９４号（出願日：２０２１年５月２１日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (15)

  1. 　酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下である免疫賦活剤。
  2. 　マンナンを更に含み、前記免疫賦活剤における前記マンナンの含有率が５質量％以上２０質量％以下である請求項１に記載の免疫賦活剤。
  3. 　前記β－グルカンに対する前記マンナンの含有比が０．１以上１未満である請求項２に記載の免疫賦活剤。
  4. 　α－グルカンを更に含み、前記免疫賦活剤における前記α－グルカンの含有率が７質量％以上１２質量％以下である請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
  5. 　前記β－グルカンに対する前記α－グルカンの含有比が０．１５以上０．５５以下である請求項４に記載の免疫賦活剤。
  6. 　前記α－グルカンはグリコーゲンを含み、前記免疫賦活剤における前記グリコーゲンの含有率が４質量％以上１０質量％以下である請求項４又は５に記載の免疫賦活剤。
  7. 　前記β－グルカンに対する前記グリコーゲンの含有比が０．１６以上０．５以下である請求項６に記載の免疫賦活剤。
  8. 　酵母細胞壁に由来するβ－グルカンを含み、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下であるインターロイキン８産生促進剤。
  9. 　酵母細胞壁をアルカリ性条件下で洗浄して第１処理物を得ることと、前記第１処理物をアルカリ条件下で熱処理して第２処理物を得ることと、前記第２処理物から固形分として第３処理物を回収することと、を含み、
    　前記第３処理物は、β－グルカンの含有率が２５質量％以上４５質量％以下である、グルカン組成物の製造方法。
  10. 　前記アルカリ条件下での熱処理は、ｐＨ８以上ｐＨ１４以下、７０℃以上１１０℃以下の条件で行われる請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記酵母細胞壁は、醸造用酵母又はパン酵母に由来する細胞壁を含む請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. 　前記アルカリ条件下での洗浄は、前記酵母細胞壁を含む洗浄液をｐＨ８以上ｐＨ１４以下に調整することと、加水しながら遠心分離機で固液分離することとを含む請求項９から１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　前記第３処理物は、前記第２処理物を遠心分離により固液分離して回収される請求項９から１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記グルカン組成物は、免疫賦活剤である請求項９から１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　前記グルカン組成物は、インターロイキン８産生促進剤である請求項９から１４のいずれか１項に記載の製造方法。
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