JPH04253703A - 酵母グルカンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、水性動物用予防薬とし
てのグルカンの利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ワクチンおよび抗生物質は、硬骨
魚類（Ｏｓｔｅｉｃｈｔｈｙｅｓ）綱および甲殻類（Ｃ
ｒｕｓｔａｃｅａ）綱の水性動物を水産養殖環境での疾
病から守るためのただ二つの実証された手段である。し
かしながら、細菌、ウイルス、真菌および原生動物によ
る疾病によって引き起こされる若干の病原性疾患は、ワ
クチン接種によってもまたは抗生物質で処置しても有効
に予防することができない。この分野での若干の研究者
は、硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物のため
の水産養殖環境での別の予防処置を開発すること、特に
免疫刺激化合物の利用を試みている。

【０００３】魚類および甲殻類の免疫系についてはほと
んど知られていないが、ある種の化合物は魚類でのマク
ロファージの微生物死滅活性を増大させると考えられる
。死滅したミコバクテリアおよびムラミルペプチドが数
種の病原体に対するニジマス（サルモ・ゲイルドネリ・
リチャードソン（Ｓａｌｍｏ　　ｇａｉｒｄｎｅｒｉＲ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎ））の耐性を増大させたことが報告
された。更に、海生被嚢類からの抽出物がアエロモナス
・ヒドラフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒａｐｈｉ
ｌａ）による感染に対するアメリカウナギ（アンギラ・
ロストラタ・レソア（Ａｎｇｕｉｌｌａ　　ｒｏｓｔｒ
ａｔａ　　ＬｅＳｅｕｒ）の耐性を増大させると考えら
れる。しかしながら、これらの化合物は、魚類または甲
殻類を水産養殖環境での疾病から守るための適当な手段
であると実証されていない。

【０００４】更に、哺乳動物系に有効であるグルカンの
ような免疫刺激化合物も同定された。一般的には、グル
カンとは、唯一のグリコシル単位としてグルコースを含
む種々の多糖を意味する。従来の研究で、特定のβ−１
，３−グルカンが、実験用温血動物のマクロファージ／
単球細胞系および補体並びにリンパ球の強力な活性化物
質であることが実証された。ちょうど、グルカンは節足
動物および植物の宿主防御機構を活性化することができ
るというある種の徴候が示唆された。更に、酵母グルカ
ンが、水産養殖環境での硬骨魚類（例えば、サケおよび
マス）および甲殻類（例えば、ロブスターおよび小エビ
）に分類される水性動物の免疫刺激物質として実際に作
用することを立証する研究はまだ発表されていない。

【０００５】したがって、硬骨魚類および甲殻類に分類
される水性動物の疾病に対する耐性を増大させる手段を
提供することは、水産養殖産業にかなり貢献すると思わ
れる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
態様は、硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物の
水産養殖環境での疾病に対する耐性を増大させるグルカ
ンの酵母からの製法を提供することである。

【０００７】更に、本発明の態様は、水産養殖環境での
硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物への投与に
適当なグルカン製剤の製造方法を提供することである。

【０００８】更に、本発明の態様は、有効量のグルカン
製剤を投与することによって水産養殖環境での硬骨魚類
および甲殻類に分類される水性動物の疾病に対する耐性
を増大させる方法を提供することである。

【０００９】本発明の態様は、更に、有効量のグルカン
製剤を１種類または複数種類のワクチン抗原と一緒に投
与することによって水産養殖環境での硬骨魚類および甲
殻類に分類される水性動物用ワクチンの効果を増大させ
る方法を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
水産養殖環境での硬骨魚類綱および甲殻類亜門から成る
群より選択される水性動物の免疫系を刺激するための方
法であって、主としてβ−１，３−グリコシド結合によ
って結合したグルコピラノース単位から成り、そこから
β−１，６−グリコシド結合によって結合したグルコピ
ラノース単位の少なくとも１個の分枝を有する酵母グル
カンを投与して水性動物の免疫系を刺激することを含む
方法を提供する。

【００１１】本発明により、更に、水産養殖環境での硬
骨魚類綱および甲殻類亜門から成る群より選択される水
性動物に投与されたワクチンの効果を増大させるための
方法であって、酵母グルカンをワクチンの前にまたはワ
クチンと一緒に投与してその水性動物でのそのワクチン
抗原に対する特異的抗体の産生を増大させる方法を提供
する。本発明のもう一つの態様により、主としてβ−１
，３−グリコシド結合によって結合したグルコピラノー
ス単位から成り、そこからβ−１，６−グリコシド結合
によって結合したグルコピラノース単位の少なくとも１
個の分枝を有する酵母グルカンの製造方法であって、（
ａ）適当なグルカン含有酵母細胞を適当な抽出用アルカ
リ水溶液を用いて適当な条件下でアルカリ抽出して第一
の不溶性酵母残留物を与え； （ｂ）前記の第一の不溶性酵母残留物を適当な抽出用ア
ルカリ水溶液を用いて適当な抽出条件下で熱アルカリ抽
出し、その熱アルカリ抽出を少なくとも２回行なって第
二の不溶性酵母残留物を与え且つ各熱アルカリ抽出後の
不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｃ）前記の第二の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
水を用いて約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＨで洗浄する
ことによって第三の不溶性酵母残留物を与え且つ前記の
洗浄後の第三の不溶性酵母残留物を回収し；（ｄ）前記
の第三の不溶性酵母残留物を適当な加水分解性酸によっ
て適当な加水分解条件下で加水分解し、その酸加水分解
を少なくとも３回行なって第四の不溶性酵母残留物を与
え且つ各酸加水分解後の不溶性酵母残留物を回収し；次
に、 （ｅ）前記の第四の不溶性酵母残留物を適当な条件下水
中で沸騰させ、前記の第四の不溶性酵母残留物の沸騰を
少なくとも２回行なって第五の不溶性酵母残留物を与え
且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物を回収し；そして（ｆ
）前記の第五の不溶性酵母残留物を適当な条件下エタノ
ール中で沸騰させ、前記の第五の不溶性酵母残留物のエ
タノール中での沸騰を少なくとも２回行なって第六の不
溶性酵母残留物を与え且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物
を回収し；次に、 （ｇ）前記の第六の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
水で洗浄し、前記の洗浄した第六の不溶性酵母残留物の
洗浄を少なくとも２回行なって酵母グルカンを与え且つ
各洗浄後の不溶性酵母残留物を回収すること；から成る
製造方法を提供する。

【００１２】更に別の態様において、本発明は、硬骨魚
類綱および甲殻類綱の動物に、主としてβ−１，３−グ
リコシド結合によって結合したグルコピラノース単位か
ら成り、そこからβ−１，６−グリコシド結合によって
結合したグルコピラノース単位の少なくとも１個の分枝
を有する酵母グルカン化合物を投与することを含む、得
られる収量を改良するための前記の動物の改良された生
産方法を提供する。

【００１３】本出願人は、特定の種類の酵母グルカンが
硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物のための予
防薬として極めて有効であるということを発見した。

【００１４】硬骨魚類は商業的に重要な魚類であり、制
限されないが、サケ（ｓａｌｍｏｎｓ）、マス（ｔｒｏ
ｕｔｓ）、ホワイトフィッシュ（ｗｈｉｔｅｆｉｓｈｅ
ｓ）、ナマズ（ｃａｔｆｉｓｈｅｓ）、サバヒー（ｍｉ
ｌｋｆｉｓｈｅｓ）、コイ（ｃａｒｐｓ）、シクリッド
（ｃｉｃｈｌｉｄｓ）（ティラピア（ｔｉｌａｐｉａ）
など）、イルカ（ｄｏｌｐｈｉｎｓ）（マヒ・マヒ（ｍ
ａｈｉ−ｍａｈｉ）としても知られている）、チョウザ
メ（ｓｔｕｒｇｅｏｎｓ）、ヘラチョウザメ（ｐａｄｄ
ｌｅｆｉｓｈｅｓ）、スズキ（ｐｅｒｃｈｅｓ）（ウォ
ーライ（ｗａｌｌｅｙｅ）、ソーガー（ｓａｕｇｅｒ）
およびイエローパーチ（ｙｅｌｌｏｗｐｅｒｃｈ）など
）、アジ（ｊａｋｓ）およびコバンアジ（ｐｏｍｐａｎ
ｏｓ）（イエローテイル（ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌｓ）な
ど）、ハタ（ｓｅａ　　ｂａｓｓｅｓ）（マハタ（ｇｒ
ｏｕｐｅｒｓ）など）、ストライプトバス（ｓｔｒｉｐ
ｐｅｄ　　ｂａｓｓｅｓ）、タイ（ｐｏｒｇｉｅｓ）（
シーブリーム（ｓｅａ　　ｂｒｅａｍｅｓ）など）、タ
ラ（ｃｏｄｆｉｓｈｅｓ）、カレイ（ｆｌａｔｆｉｓｈ
）（ヌマガレイ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）、オヒョウ（ｈａ
ｌｉｂｕｔ）、ホシダルマガレイ（ｔｕｒｂｏｔ）およ
びマコガレイ（ｄａｂ）など）、マンボウ（ｓｕｎｆｉ
ｓｈｅｓ）、ニシン（ｈｅｒｒｉｎｇｓ）、アンチョビ
ー（ａｎｃｈｏｖｉｅｓ）、キュウリウオ（ｓｍｅｌｔ
ｓ）、カワカマス（ｐｉｋｅｓ）、フエダイ（ｓｎａｐ
ｐｅｒｓ）（レッドドラム（ｒｅｄ　　ｄｒｕｍ）また
はメバル（ｒｅｄｆｉｓｈ）など）、ニベ（ｄｒｕｍｓ
）、ボラ（ｍｕｌｌｅｔｓ）、ラビットフィッシュ（ｒ
ａｂｂｉｔｆｉｓｈｅｓ）、サバ（ｍａｃｋｅｒｅｌｓ
）、マグロ（ｔｕｎａｓ）、フグ（ｐｕｆｆｅｒ　　ｆ
ｉｓｈｅｓ）およびウナギ（ｅｅｌｓ）（アメリカウナ
ギ（Ａｍｅｒｉｃａｎ）、西洋ウナギ（Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ）およびアジアウナギ（Ａｓｉａｔｉｃ　　ｅｅｌｓ
））など）から成る群より選択される魚類がある。一般
的には、これらの魚類は、サケ科（Ｓａｌｍｏｎｉｄａ
ｅ）（ワカソ科（Ｃｏｒｅｇｏｎｉｄａｅ）の亜科など
）、イクタルリデー科（Ｉｃｔａｌｕｒｉｄａｅ）、チ
ャニデー科（Ｃｈａｎｉｄａｅ）、コイ科（Ｃｙｐｒｉ
ｎｉｄａｅ）、カワスズメ科（Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ）、
コリフェニデー科（Ｃｏｒｙｐｈａｅｎｉｄａｅ）、チ
ョウザメ科（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒｉｄａｅ）、ポリオド
ンティデー科（Ｐｏｌｙｏｄｏｎｔｉｄａｅ）、パーシ
デー科（Ｐｅｒｃｉｄａｅ）、ハタ科（Ｓｅｒｒａｎｉ
ｄａｅ）、パーシクスィイデー科（Ｐｅｒｃｉｃｈｔｈ
ｙｉｄａｅ）、アジ科（Ｃａｒａｎｇｉｄａｅ）、タイ
科（Ｓｐａｒｉｄａｅ）、タラ科（Ｇａｄｉｄａｅ）、
ボシデー科（Ｂｏｔｈｉｄａｅ）、プリュロネクチデー
科（Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｉｄａｅ）、ササウシノシタ
科（Ｓｏｌｅｉｄａｅ）、ニシン科（Ｃｌｕｐｅｉｄａ
ｅ）、カタクチイワシ科（Ｅｎｇｒａｕｌｉｄａｅ）、
キュウリウオ科（Ｏｓｍｅｒｉｄａｅ）、エソシデー科
（Ｅｓｏｃｉｄａｅ）、フエダイ科（Ｌｕｔｊａｎｉｄ
ａｅ）、ニベ科（Ｓｃｉａｅｎｉｄａｅ）、ボラ科（Ｍ
ｕｇｉｌｉｄａｅ）、アイゴ科（Ｓｉｇａｎｉｄａｅ）
、サバ科（Ｓｃｏｍｂｒｉｄａｅ）、セントラーキデー
科（Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ）、マフグ科（Ｔｅｔ
ｒａｏｄｏｎｔｉｄａｅ）、アンギリデー科（Ａｎｇｕ
ｉｌｌｉｄａｅ）、ウツボ科（Ｍｕｒａｅｎｉｄａｅ）
およびコングリデー科（Ｃｏｎｇｒｉｄａｅ）から成る
群より選択される科からの魚である。 この予防薬は、サルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ　　ｓａｌ
ａｒ）、サルモ・クラルキイ（Ｓａｌｍｏ　　ｃｌａｒ
ｋｉｉ）、サルモ・ガイルデンリ（Ｓａｌｍｏ　　ｇａ
ｉｒｄｅｎｒｉ）、サルモ・トゥルッタ（Ｓａｌｍｏ　
　ｔｒｕｔｔａ）、オンコリンクス・ケータ（Ｏｎｃｏ
ｒｈｙｎｃｈｕｓ　　ｋｅｔａ）、オンコリンクス・ゴ
ルブシャ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　　ｇｏｒｂｕｓ
ｃｈａ）、オンコリンクス・ツァヴィッチャ（Ｏｎｃｏ
ｒｈｙｎｃｈｕｓ　　ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、オン
コリンクス・キスチ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　　ｋ
ｉｓｕｔｃｈ）、オンコリンクス・ネルカ（Ｏｎｃｏｒ
ｈｙｎｃｈｕｓ　　ｎｅｒｋａ）、サルベリヌス・アル
ピヌス（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ　　ａｌｐｉｎｕｓ）、
サルベリヌス・フォンティナリス（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕ
ｓ　　ｆｏｎｔｉｎａｌｉｓ）、サルベリヌス・マルマ
（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ　　ｍａｌｍａ）およびサルベ
リヌス・ナメイクシュ（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ　　ｎａ
ｍａｙｃｕｓｈ）から成る群より選択されるサケ科の保
護膜に特に有効であると考えられる。更に、この予防薬
は他にも、愛好家による塩水または淡水の水槽中で飼養
するのに適当である水族館用魚類および／または観賞用
魚類を保護するのに適当であると考えられる。

【００１５】甲殻類は、商業的に重要な甲殻類動物の亜
門であり、制限されないが、小エビ（ｓｈｒｉｍｐ）、
エビ（ｐｒａｗｎｓ）（マクロブラキウムプローン（ｍ
ａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ　　ｐｒａｗｎｓ）など）、
ロブスター（ｌｏｂｓｔｅｒｓ）（イセエビ（ｓｐｉｎ
ｙ）およびスペインロブスター（ｓｐａｎｉｓｈ）また
はスリッパーロブスター（ｓｌｉｐｐｅｒ　　ｌｏｂｓ
ｔｅｒ）など）、ザリガニ（ｃｒａｙｆｉｓｈ）および
カニ（ｃｒａｂｓ）（タラバガニ（ｋｉｎｇ　　ｃｒａ
ｂ）、ストーンクラブ（ｓｔｏｎｅ　　ｃｒａｂ）、ロ
ッククラブ（ｒｏｃｋｃｒａｂ）、イチョウガニ（ｄｕ
ｎｇｅｎｅｓｓ　　ｃｒａｂ）、スノウクラブ（ｓｎｏ
ｗ　　ｃｒａｂ）およびブルークラブ（ｂｌｕｅ　　ｃ
ｒａｂ）から成る群より選択されるカニなど）から成る
群より選択される甲殻類動物が挙げられる。この予防薬
は、ペネウス・モノドン（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｍｏｎｏ
ｄｏｎ）、ペネウス・ヒネンシス（Ｐｅｎａｅｕｓ　　
ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ペネウス・インディクス（Ｐｅ
ｎａｅｕｓ　　ｉｎｄｉｃｕｓ）、ペネウス・スティリ
ロストリス（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｓｔｙｌｉｒｏｓｔｒ
ｉｓ）、ペネウス・マーギエンシス（Ｐｅｎａｅｕｓ　
　ｍｅｒｇｕｉｅｎｓｉｓ）、ペネウス・ヴァンナメイ
（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｖａｎｎａｍｅｉ）、メタペネウ
ス・エンシス（Ｍｅｔａｐｅｎｅｕｓｅｎｓｉｓ）、ペ
ネウス・セティフェルス（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｓｅｔｉ
ｆｅｒｕｓ）、ペネウス・ジャポニス（Ｐｅｎａｅｕｓ
　　ｊａｐｏｎｉｓ）、ペネウス・アツェクス（Ｐｅｎ
ａｅｕｓ　　ａｚｔｅｃｕｓ）、ペネウス・デュオラル
ム（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｄｕｏｒａｒｕｍ）、ペネウス
・セミスルカツス（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｓｅｍｉｓｕｌ
ｃａｔｕｓ）、ペネウス・テラオイ（Ｐｅｎａｅｕｓｔ
ｅｒａｏｉ）、ペネウス・オリエンタリス（Ｐｅｎａｅ
ｕｓ　　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ペネウス・プレベジ
ュス（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｐｌｅｂｅｊｕｓ）およびペ
ネウス・ケラツルス（Ｐｅｎａｅｕｓ　　ｋｅｒａｔｈ
ｕｒｕｓ）から成る群より選択されるペネイデー科（Ｐ
ｅｎａｅｉｄａｅ）の保護膜に特に有効であると考えら
れる。

【００１６】更に、この予防薬は、ホマルス・アメリカ
ヌス（Ｈｏｍａｒｕｓ　　ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、ホ
マルス・ガンマルス（Ｈｏｍａｒｕｓ　　ｇａｍｍａｒ
ｕｓ）、パリナルス・エレファス（Ｐａｌｉｎａｒｕｓ
　　ｅｌｅｐｈａｓ）、パリナルス・インタールプツス
（Ｐａｌｉｎａｒｕｓ　　ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ）、
パリナルス・アルグス（Ｐａｌｉｎａｒｕｓ　　ａｒｇ
ｕｓ）およびネフロプス・ノルベジクス（Ｎｅｐｈｒｏ
ｐｓ　　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）から成る群より選択さ
れるホマリデー科（Ｈｏｍａｒｉｄａｅ）およびパリヌ
リデー科（Ｐａｌｉｎｕｒｉｄａｅ）由来のロブスター
のようなロブスター類に有効であると考えられる。

【００１７】一般的には、グルカンとは種々のポリグル
カンを意味する。しかしながら、本明細書中に記載のグ
ルカンは、酵母細胞壁から得られるポリグルコースを意
味するものであり、主としてβ−１，３−およびβ−１
，６−グリコシド結合によって互いに結合したグルコピ
ラノース分子（または単位）の分枝状および非分枝状鎖
である。本発明者の酵母グルカンに関する実験から、β
−１，３−結合によって結合したグルコピラノース単位
の鎖と一緒にβ−１，６−結合によって結合したグルコ
ピラノース単位の少なくとも１個の分枝を有するグルカ
ンは、硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物のた
めの最も有効な予防薬であると考えられる。好ましいグ
ルカンは、主としてβ−１，３−グリコシド結合を有す
る約４００〜約１５００個のグルコピラノース単位の鎖
と、それに結合した主としてβ−１，６−グリコシド結
合によって結合したグルコピラノース単位の少なくとも
１個の分枝を有するものでなければならない。主として
β−１，６グリコシド結合によって結合したグルコピラ
ノース単位から成る分枝はそれぞれ、１〜約１０個の範
囲のグルコピラノース単位を有するのが好ましく、最も
好ましくは、各分枝が１〜６個の範囲のグルコピラノー
ス単位を有する。

【００１８】本発明の実施に好ましいグルカンは、本出
願人がＭ−グルカンと称した酵母グルカン製剤である。 Ｍ−グルカンは、β−１，３−グリコシド結合によって
結合したグルコピラノース単位の鎖と、それに結合した
β−１，６グリコシド結合によって結合した約１〜約６
個のグルコピラノース単位の分枝から成る高度に分枝し
たグルカンである。更に、このグルカンは、稀アルカリ
溶液および稀酸溶液に不溶性であり、その上エタノール
にも不溶性であることを特徴とする。

【００１９】適当なグルカンを種々の微生物源から調製
することができる。このような微生物源の一覧表を完全
ではないが表Ｉに示す。

【００２０】

【００２１】本発明の実施に適当なグルカンの好ましい
微生物源は、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・ウティリス
（Ｃａｎｄｉｄａ　　ｕｔｉｌｉｓ）およびピチア・パ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ）である
。

【００２２】本発明の実施で用いられるグルカンは、当
業者に周知の適当な抽出方法を利用して微生物源から調
製することができる。ビール酵母菌の細胞壁からグルカ
ンを抽出するための一つの方法では、熱アルカリおよび
酢酸による連続抽出に続く水洗を利用して細胞壁中の可
溶性成分を除去する。残留する不溶性物質が問題のグル
カン生成物である。

【００２３】好ましいＭ−グルカンを抽出するには、下
記の抽出法を用いる必要がある。最初に、乾燥酵母約５
０ｇ／リットル（アルカリ水溶液）〜乾燥酵母約３００
ｇ／リットル（アルカリ水溶液）で酵母をアルカリ水溶
液中に懸濁させることによって、酵母を少なくとも１回
アルカリ抽出する必要がある。抽出用アルカリ性水溶液
のアルカリ濃度は約２重量％／リットル〜約６重量％／
リットルでなければならない。抽出用アルカリ溶液に用
いられるアルカリ化合物は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（
ＯＨ）２およびＮａ２ＣＯ３から成る群より選択するこ
とができる。酵母を含むアルカリ水溶液中懸濁液は、約
２０℃〜約３０℃の範囲の温度で約１６時間〜約３０時
間貯蔵する必要がある。アルカリ抽出によって得られた
不溶性酵母残留物は、当業者に周知の任意の適当な分離
方法によって上澄みから回収することができ、例えば、
制限されないが、濾過、クロスフロー（ｃｒｏｓｓｆｌ
ｏｗ）濾過または遠心分離がある。分離方法によって採
取された不溶性酵母残留物は、次に、熱アルカリ水性混
合物で抽出する必要がある。

【００２４】次に、不溶性酵母残留物を、乾燥酵母約５
０ｇ／リットル（抽出用アルカリ水溶液）〜乾燥酵母約
３００ｇ／リットル（抽出用アルカリ水溶液）に相当す
る第二の抽出用アルカリ水溶液中に懸濁させることがで
きる。前記に明記したアルカリ化合物の濃度は約１重量
％／リットル〜約４重量％／リットルでなければならな
い。不溶性酵母残留物を抽出用アルカリ水溶液中に懸濁
させる温度は、約６０℃〜約１００℃の範囲で約１時間
〜約６時間の範囲でなければならない。次に、その懸濁
液を、好ましくは、懸濁を室温で一晩中保持することに
よって室温まで冷却しなければならない。

【００２５】次に、水性熱アルカリ抽出からの不溶性酵
母残留物を、当業者に周知の任意の適当な分離方法、例
えば、制限されないが、濾過、クロスフロー濾過または
遠心分離によって上澄みから分離する。不溶性酵母残留
物を採取した後、アルカリ水溶液による熱抽出を少なく
とも２回、好ましくは、約２〜約５回の範囲で行なう必
要があり、不溶性残留物は各抽出の最後に採取する。

【００２６】不溶性酵母残留物の熱アルカリ水溶液によ
る抽出に続いて、不溶性酵母残留物のｐＨを、適当な水
性酸（適当な例として、無機酸、例えば塩酸、リン酸、
硫酸または有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、
シュウ酸および他の類似の酸が挙げられる）を用いて約
ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲に上昇させ且つ水で洗浄しなけ
ればならない。洗浄は、不溶性酵母残留物を水に懸濁さ
せた後、撹拌することによって行ない、次に、任意の適
当な分離方法、例えば濾過、クロスフロー濾過または遠
心分離によって不溶性酵母残留物を水から分離する。

【００２７】アルカリ抽出および洗浄に続いて、次に、
不溶性酵母残留物に穏やかな酸加水分解を施す必要があ
る。不溶性酵母残留物を、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩
酸、リン酸および硫酸から成る群より選択される水性酸
と接触させなければならない。加水分解性酸は水中濃度
約０．０５モル／リットル〜約１モル／リットルで与え
る必要がある。不溶性酵母残留物を、不溶性酵母残留物
（乾燥重量）約１０ｇ／リットル（水性加水分解性酸）
〜不溶性酵母残留物（乾燥重量）約５０ｇ／リットル（
水性加水分解性酸）の範囲で混合する必要がある。不溶
性酵母残留物および加水分解性酸水溶液の混合物を約６
０℃〜約９０℃の温度で約３時間〜約６時間の範囲で保
持しなければならない。次に、不溶性酵母残留物を、当
業者に周知の任意の適当な分離方法、例えば、制限され
ないが、適当な条件下の濾過、クロスフロー濾過または
遠心分離によって加水分解性酸水溶液から分離する。 不溶性酵母残留物を混合物から採取した後、酸加水分解
を少なくとも３回、好ましくは、約３〜約１０回の範囲
で行なう必要があり、得られる不溶性酵母残留物を各抽
出の最後に採取する。

【００２８】最後の抽出後、続いて、得られる不溶性酵
母残留物を、不溶性酵母残留物（乾燥重量）約１０ｇ／
リットル（水）〜不溶性酵母残留物（乾燥重量）約５０
ｇ／リットル（水）の濃度で分散させ、約０．５時間〜
約２時間沸騰させなければならない。この方法を少なく
とも２回、好ましくは、約２〜約６回の範囲で行なう必
要がある。それぞれの沸騰水中での処理の間に、不溶性
酵母残留物を任意の適当な分離方法、例えば濾過、クロ
スフロー濾過または遠心分離によって液相から回収する
ことができる。

【００２９】更に、不溶性酵母残留物を、不溶性酵母残
留物（乾燥重量）約２０ｇ／リットル（エタノール）〜
不溶性酵母残留物（乾燥重量）約１００ｇ／リットル（
エタノール）で分散させ、約０．１時間〜約２時間沸騰
させる必要がある。不溶性酵母残留物は、冷却後、任意
の適当な分離方法、例えば濾過、クロスフロー濾過また
は遠心分離によって回収することができる。エタノール
中での沸騰は少なくとも２回、好ましくは、約２〜約６
回の範囲で行なう必要がある。

【００３０】最後に、不溶性酵母残留物を少なくとも２
回、好ましくは、約２〜約６回の範囲で水を用いて室温
で洗浄しなければならない。水による各洗浄後に、不溶
性酵母残留物を任意の適当な分離方法、例えば濾過、ク
ロスフロー濾過または遠心分離によって回収することが
できる。

【００３１】更に、適当なグルカンを、本明細書中で記
載したように、酵母抽出後の不溶性残留物に更にアルカ
リ抽出および酸処理を施すことによって製造された酵母
抽出物の副生成物から調製することができる。

【００３２】投与経路および方法 本発明のグルカンは多数の経路によって投与することが
でき、例えば、制限されないが、腸内（経口）、水性暴
露経由および非経口（制限されないが、皮内、腹腔内、
皮下および筋内などへの注射）が挙げられる。硬骨魚類
綱および甲殻類亜門の水性動物に投与する場合、グルカ
ンは通常の賦形剤、すなわち、グルカンと有害に反応し
ない薬学的に容認可能な適当な有機および無機担体物質
と混合した状態で用いることができる。薬学的に容認可
能な適当な担体として、制限されないが、水、塩溶液、
アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコー
ル、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例
えばラクトース、アミロースまたはデンプン、等が挙げ
られる。薬剤は滅菌することができ、所望ならば、グル
カンと有害に反応しない助剤、例えば潤滑剤、防腐剤、
安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用するための塩類
、緩衝剤等と混合することができる。それらは、所望な
らば、他の活性剤、例えばビタミンと混合することもで
きる。非経口用途に特に適当であるのは注射可能な滅菌
溶液であり、好ましくは、油状または水性の溶液並びに
懸濁液またはエマルジョンである。更に、腸内（経口）
用には、本発明のグルカンを乾燥若しくは湿潤形態で経
口によって投与することができるしまたは所望により水
中用飼料と混合して与えることもできる。更に、グルカ
ンを、少なくとも１種類の適当な抗微生物剤および／ま
たは少なくとも１種類の適当なワクチンと同時に投与し
てもよい。グルカンおよび抗微生物剤および／またはワ
クチンを投与する場合、各薬剤を順次に投与してもよい
し、またはグルカンを１種類以上の抗微生物剤若しくは
ワクチンと混合し且つ単一組成物として投与してもよい
。典型的には、等張溶液を用いる。

【００３３】与えられるグルカンの水性動物重量のｋｇ
当りの量は、それを与えられる水性動物に免疫刺激作用
を与えるのに十分な量でなければならない。注射される
グルカンの水性動物体重のｋｇ当りの有効量は、グルカ
ン約５ｍｇ／ｋｇ（生物量）〜グルカン約１００ｍｇ／
ｋｇ（生物量）の範囲でなければならない。グルカンを
乾燥形態で経口によって与える場合、体重ｋｇ当りのグ
ルカンの量は、一日の基準で与える場合、グルカン約５
ｍｇ／ｋｇ（生物量）〜グルカン約１００ｍｇ／ｋｇ（
生物量）の範囲でなければならない。水性動物用の乾燥
飼料などの乾燥形態では、飼料中のグルカンの量はグル
カン１ｇ／ｋｇ（飼料）〜グルカン約１０ｇ／ｋｇ（飼
料）であることができる。硬骨魚類綱および甲殻類亜門
の水性動物に適当な飼料は当該技術分野で周知である。

【００３４】特定の場合に実際的に好ましいグルカンの
量は、処方される特定の組成物、用途の方式および治療
される特定の部位および生物によって変化するものであ
ると理解される。所定の宿主のための投与量は、通常の
考察を用いて、例えばグルカンおよび既知の薬剤につい
ての、例えば適当な通常の薬理学的プロトコルによる示
差活性の慣例的比較によって決定することができる。グ
ルカンの投与後、免疫刺激作用が最初に観察される前に
猶予が生じることがある。したがって、疾病耐性はただ
ちに増大しなくてもよいが、しかしながら、投与して１
４日以内に免疫刺激作用が観察されると考えられる。グ
ルカンを経口飼養によって投与した場合、更に、若干の
猶予が観察されるが、しかしながら、グルカンで飼養し
て約２１日後に、増大した疾病耐性が証明される必要が
ある。グルカンを一日または半日基準の飼料で与える限
り、増大した耐性は持続しなければならない。グルカン
の供給を中止した後にも、疾病に対する増大した耐性が
持続する必要があるとしても、その期間はグルカンの投
与量／ｋｇ（生物量）および供給期間に関係する。

【００３５】下記の一連の実施例を例示の目的で示すが
、本発明の範囲を制限するためのものではない。

【００３６】

【実施例Ｉ】この実施例で、本発明の実施で利用するの
に適当な免疫刺激性グルカンを得るのに用いたプロトコ
ルを提供する。

【００３７】乾燥ビール酵母菌５００ｇを６重量％Ｎａ
ＯＨ水溶液３リットル中に懸濁させた。次に、この懸濁
液を室温で一晩中撹拌した。撹拌後、懸濁液を２０００
×ｇで２５分間遠心分離した。上澄みを捨てた後、不溶
性残留物を３％ＮａＯＨ３リッル中に再懸濁させ、７５
℃で３時間インキュベートし、続いて、懸濁液を一晩中
冷却した。次に、懸濁液を２０００×ｇで２５分間遠心
分離し且つ上澄みを傾瀉した。次に、残留物を３％Ｎａ
ＯＨ中に再懸濁させ、加熱し、そして前記に記載したよ
うに遠心分離した。

【００３８】次に、残留する不溶性残留物を酢酸でｐＨ
４．５に調整した。次に、不溶性残留物を逐次的に水２
リットルで３回洗浄し、各洗浄後に２０００×ｇで２５
分間遠心分離することによって回収した（上澄みを注ぎ
出した）。次に、残留物を０．５モル酢酸水３リットル
中に懸濁させた。懸濁液を９０℃で３時間加熱した。次
に、懸濁液を室温まで冷却した。冷却後、不溶性残留物
を２０００×ｇで２５分間遠心分離することによって採
取した。この（ｐＨ４．５に調整することから冷却した
残留物を採取することまでの）処理を７回繰り返した。

【００３９】次に、不溶性残留物を蒸留水３リットル中
に懸濁させ、１００℃で３０分間撹拌した後、冷却し、
そして２０００×ｇで２５分間遠心分離した。上澄みを
捨てた。不溶性残留物をこの方法で４回洗浄した。次に
、残留物をエタノール２リットル中に懸濁させ、７８℃
で２時間加熱した。このエタノールでの洗浄を４回繰り
返した。次に、残留物を蒸留水３リットルを用いて室温
で４回洗浄してエタノールの痕跡を全て除去した。

【００４０】

【実施例ＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（Ａｔｌａｎｔｉｃ
　　ｓａｌｍｏｎ）（サルモ・サラル；Ｓａｌｍｏｓａ
ｌａｒ）の、せつ症（ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｓｉｓ）（ア
エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｓ
ａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）亜種サルモニシダ）に対する耐
性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グルカンの有
効性を実証する。

【００４１】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保
持された）。第一群のサケ６０匹に乾燥飼料を一日当り
魚重量の１％の比率で与えた。そのサケ用飼料にはＭ−
グルカンが１ｇ／ｋｇ（乾燥物質）含まれていた。サケ
は、せつ症に暴露される前の１２週間の間この飼料で飼
養された。同様に、対照群である他の６０匹のサケに、
Ｍ−グルカンを含まないサケ用飼料を１２週間与えた。 １２週間の期間の最後に、２群のサケを同一のタンクに
一緒にプールし、魚１匹当りにアエロモナス・サルモニ
シダ亜種サルモニシダを１×１０３個含む食塩水０．１
ｍｌを腹腔内注射することによって感染した多数のサケ
を導入することによってせつ症に暴露した。導入されて
同居している感染した魚の数はタンク中の全魚数の１０
％（魚１２匹）に相当した。サケの群を混合した後の飼
料は、対照飼料から成るものであった。

【００４２】図１に、試験期間中を通しての致死率百分
率を示す。Ｍ−グルカンを与えられたサケの最終致死率
百分率は、対照のサケよりも少ない約３３％であった。 Ｍ−グルカンを与えられたサケでの減少した致死率百分
率は、Ｍ−グルカンが、せつ症（アエロモナス・サルモ
ニシダ亜種サルモニシダ）に対する硬骨魚類綱の魚用予
防薬として有効であることを実証している。更に、この
実施例により、Ｍ−グルカンが疾病に対する予防薬とし
て水中用飼料で有効に利用することができるということ
が実証される。

【００４３】

【実施例ＩＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具
体的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル
）の、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉ
ｂｒｉｏｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ））に対する耐性を増
大させる場合の予防薬としてのＭ−グルカンの有効性を
実証する。

【００４４】魚１匹当りの平均重量３０ｇのアトランテ
ィックサーモンを地元の二年子のサケの生産者から入手
した。そのサケを、空気を通した淡水が供給される２０
０リットルのフロースルータンクで飼養した（約９〜１
０℃で保持された）。７０日目に水を交換して、周囲温
度（約９〜１０℃）の空気を通した海水にした。その海
水は、当時冷水ビブリオ症が発生していた近くの商業用
サケ養殖場からポンプで給水することによって集められ
た。最初の３分の１の無作為に抽出された群のサケ５０
匹に、市販の乾燥ペレットを一日当り体重の１％の比率
で与えた。その乾燥飼料にはＭ−グルカンが１ｇ／ｋｇ
（飼料）含まれていた。同様に、次の３分の１の無作為
に抽出された対照群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカンを含
まない同じサケ用飼料を与えた。

【００４５】図２に、実験開始から７０日目に海水によ
って導入された冷水ビブリオ症の自然感染によって引き
起こされた双方の飼養方法についてのプールされた致死
率百分率を示す。それらの飼料中にＭ−グルカンが与え
られたサケの致死率百分率は、Ｍ−グルカンなしの対照
のサケと比べて有意に減少した。この実施例は、Ｍ−グ
ルカンが冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に
対する硬骨魚類綱の魚の耐性を増大させることを実証し
ている。更に、この実施例で、Ｍ−グルカンが疾病に対
する予防薬として水中用飼料で有効に利用することがで
きるということが実証される。

【００４６】

【実施例ＩＶ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、古典的ビブリオ症（ビブリオ・アンギラルム（Ｖｉ
ｂｒｉｏ　　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）血細型０１）に
対する耐性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グル
カンの有効性を実証する。

【００４７】魚１匹当りの平均重量３０ｇのアトランテ
ィックサーモンを地元の二年子のサケの生産者から入手
した。そのサケを、空気を通した淡水２００リットルが
入るフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保持さ
れた）。第一群のサケ４０匹に、Ｍ−グルカン１ｇ／ｋ
ｇ（飼料）を含む乾燥飼料を一日当り体重の１％の比率
で５週間与えた。対照群のサケ４０匹に、Ｍ−グルカン
を含まない対照飼料を同じ比率で５週間与えた。５週間
の最後に、二つの群を一つのタンクおよび槽に一緒にプ
ールし、ビブリオ・アンギラルム０１を１×１０６個／
ｍｌ含む海水中で４５分間感染させた。

【００４８】図３に、試験期間中を通しての致死率百分
率を示す。Ｍ−グルカンを与えられたサケの最終致死率
百分率は約１５％であったが、対照群での致死率は約８
５％であった。Ｍ−グルカンを与えられたサケの減少し
た致死率百分率は、Ｍ−グルカンが、ビブリオ症（ビブ
リオ・アンギラルム血細型０１）に対する硬骨魚類綱の
魚用予防薬として有効であることを実証している。更に
、この実施例により、Ｍ−グルカンが疾病に対する予防
薬として水中用飼料で有効に利用することができるとい
うことが実証される。

【００４９】

【実施例Ｖ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体的
には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）の
、ビブリオ症（ビブリオ・アンギラルム血細型０１）に
対する耐性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グル
カンの有効性を実証する。

【００５０】魚１匹当りの平均重量２０ｇのアトランテ
ィックサーモンを地元の二年子のサケの生産者から入手
した。そのサケを、空気を通した淡水２００リットルが
入るフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保持さ
れた）。第一群のサケ４０匹に、Ｍ−グルカン２ｍｇを
含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に注射した
。対照群のサケ４０匹に、等張食塩水０．２ｍｌを腹腔
内に注射した。双方の群のサケを、実験期間中を通して
市販の乾燥ペレットで飼養した。

【００５１】注射して３週間後に、双方の群のサケに、
サケ１匹当りビブリオ・アンギラルム血細型０１生菌細
胞５×１０４個を腹腔内に注射することによって感染さ
せた。図４に、対照群および（Ｍ−グルカンを与えられ
た）第一群の致死率百分率の比較を示す。４図から分か
るように、Ｍ−グルカンを腹腔内注射によって与えられ
た第一群の致死率百分率が有意に減少（約４５％）して
いる。Ｍ−グルカンで処置されたサケでの減少した致死
率百分率は、Ｍ−グルカンが、古典的ビブリオ症に対す
る有効な予防薬であることを実証している。更に、この
データにより、Ｍ−グルカンを注射によって有効に投与
することができるということが実証される。

【００５２】

【実施例ＶＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、エンテリックレッドマウス病（ｅｎｔｅｒｉｃ　　
ｒｅｄｍｏｕｔｈ　　ｄｉｓｅａｓｅ）（エルジニア・
ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　　ｒｕｃｋｅｒｉ））に
対する耐性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グル
カンの有効性を実証する。

【００５３】魚１匹当りの平均重量２０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水を２００リットルのフ
ロースルータンクで飼養した（約１２℃で保持された）
。第一群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカン２ｍｇを含む等
張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に注射した。 対照群のサケに、等張食塩水のみを含む溶液０．２ｍｌ
を注射した。双方の群のサケを、実験期間中を通して市
販の乾燥ペレットで飼養した。３週間後に、双方の群の
サケに、サケ１匹当りエルジニア・ルッケリ生菌細胞１
０４個を腹腔内に注射することによって感染させた。

【００５４】図５に、双方の群のサケの致死率百分率を
示す。累積した致死率百分率から分かるように、Ｍ−グ
ルカンを与えられた群の致死率は、等張食塩水のみを与
えられた対照群に比べて低い約２０％であった。これら
の結果は、Ｍ−グルカンがエンテリックレッドマウス病
に対する有効な予防薬であることを実証している。更に
、このデータにより、Ｍ−グルカンを注射によって有効
に投与することができるということが実証される。

【００５５】

【実施例ＶＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具
体的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル
）の、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に対
する耐性を増大させる場合のＭ−グルカンおよびＤ，Ｌ
−グルカンの予防薬としての有効性を比較する。

【００５６】魚１匹当りの平均重量２０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約９〜１０℃
で保持された）。第一群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカン
２ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に
注射した。

【００５７】第二群のサケ５０匹に、Ｄ，Ｌ−グルカン
２ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に
注射した。Ｄ，Ｌ−グルカンはディルツィオ（Ｄｉｕｚ
ｉｏ）によってＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２４：７７
３〜７７９（１９７９）に記載された方法にしたがって
ビール酵母菌細胞から調製された。対照群のサケに、等
張食塩水０．２ｍｌを注射した。三つの群をいずれも、
実験期間中を通して市販の乾燥ペレットで飼養した。３
週間後に、３群のサケ全部に、魚１匹当りビブリオ・サ
ルモニシダ生菌細胞５×１０５個を腹腔内に注射するこ
とによって感染させた。

【００５８】図６に、各群の致死率百分率を示す。対照
群の最終致死率百分率は約９６％であった。Ｄ，Ｌ−グ
ルカンで処置した群のサケの最終致死率は約７５％であ
った。Ｍ−グルカンで処置した群のサケの最終致死率は
約３０％であった。図６から分かるように、グルカンは
アトランティックサーモンの疾病に対する耐性を未処置
群と比べて増加させる。更に、Ｍ−グルカンが疾病に対
する耐性をＤ，Ｌ−グルカンに比べて有意に増加させて
いるということも明らかである。

【００５９】

【実施例ＶＩＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、
具体的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラ
ル）の、せつ症（アエロモナス・サルモニシダ亜種サル
モニシダ）に対する耐性を増大させるワクチンとの補助
薬としてのＭ−グルカンの有効性を実証する。

【００６０】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約９〜１０℃
で保持された）。第一群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカン
０．５ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔
内に注射した。第二群のサケ５０匹に、ノルウェイ、ト
ロムソにあるアポテカーネス・ラボラトリウム・エイ・
エス（Ａｐｏｔｈｅｋｅｒｎｅｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｕｍ　　Ａ．Ｓ．）から商業的に入手したせつ症ワ
クチンを腹腔内に注射した。第三群のサケ５０匹に、Ｍ
−グルカン０．５ｍｇを含む懸濁液０．２ｍｌおよびせ
つ症ワクチンを腹腔内に注射した。対照群のサケ５０匹
に等張食塩水０．２ｍｌを腹腔内に注射した。注射して
３か月後に、生育しているサケの総数の１０％に相当す
るせつ症に感染したサケの群を導入することによって、
４群全部をせつ症に感染させた。魚は実験の間中、市販
の乾燥ペレットで飼養した。サケの群はいずれも、せつ
症に感染した同居している魚に暴露された後、同じタン
クで飼養された。

【００６１】図７に、試験期間の致死率百分率を示す。 食塩水で処置された魚の最終致死率百分率は約４２％で
あった。ワクチンで処置された魚の最終致死率百分率は
約３８％であった。Ｍ−グルカンで処置された魚の最終
致死率百分率は２８％であった。Ｍ−グルカンおよびワ
クチンの組合わせで処置された魚の最終致死率は２０％
であった。データから分かるように、Ｍ−グルカンとせ
つ症ワクチンとの組合わせはせつ症に対するサケの耐性
を増大させる最も有効な手段である。これらの結果によ
り、Ｍ−グルカンは、それ以後の感染に対する耐性を増
大させるための市販のワクチンとの補助薬として有効に
用いることができると実証される。

【００６２】

【実施例ＩＸ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に対す
る耐性を増大させるワクチンとの補助薬としてのＭ−グ
ルカンの有効性を実証する。魚１匹当りの平均重量３０
ｇの二年子前のアトランティックサーモンを地元の二年
子のサケの生産者から入手し、空気を通した淡水が供給
される２００リットルのフロースルータンクて飼養した
（約８〜１０℃で保持された）。一群のサケ１５０匹に
、グルカンを強化した（１ｇ／ｋｇ（飼料））市販の乾
燥ペレットを４週間与えた。他の２群のサケ１５０匹ず
つに、グルカンを含まない市販の乾燥ペレットを与えた
。飼養して４週間後に、グルカンを与えた群およびグル
カンを与えなかった群の一方に、冷水ビブリオ症（ビブ
リオ・サルモニシダ）に対するワクチンでディップワク
チン接種した。ワクチンはノルウェイ、ベルゲンのノル
ビオ・エイ・エス（Ｎｏｒｂｉｏ　　Ａ／Ｓ）社から商
業的に提供された。第三群のサケはワクチン接種せずに
残した。更に６週間後に、３群全部の魚に、ビブリオ・
サルモニシダ細菌細胞１×１０６個を腹腔内注射するこ
とによって感染させた。

【００６３】ワクチン接種前にグルカンを４週間与えた
魚１５０匹の群の感染後の最終致死率は１０％であった
。グルカンを与えられずにワクチン接種された群の最終
致死率は４４％であった。グルカンを与えられずワクチ
ン接種されなかった群の最終致死率は８３％であった。 このデータは、水性動物、特にサケにおいて、グルカン
が飼料で投与された場合にも市販のワクチンとの補助薬
として有効であることを示している。

【００６４】

【実施例Ｘ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体的
には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）の
、古典的ビブリオ症のビブリオ・アンギラルム血細型０
１に対する耐性を増大させるワクチンとの補助薬として
のＭ−グルカンの有効性を実証する。

【００６５】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保
持された）。第一群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン１．０
ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に注
射した。第二群のサケ８匹に、ノルウェイ、ベルゲンに
あるノルビオ・エイ・エス（Ｎｏｒｂｉｏ　　Ａ．Ｓ．
）から商業的に入手した古典的ビブリオ症ワクチン（ビ
ブリオ・アンギラルム血細型０１）を腹腔内に注射した
。 第三群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン１．０ｍｇを含む懸
濁液０．２ｍｌおよびビブリオ症ワクチンを腹腔内に注
射した。対照群のサケ８匹に等張食塩水０．２ｍｌを腹
腔内に注射した。魚は実験の間中、市販の乾燥ペレット
で飼養された。サケの群はいずれも同一のタンク中で飼
養された。注射して６週間後に、全部の魚を頭部で撲殺
し、尾部の血管から脱血させた。ビブリオ・アンギラル
ム血細型０１に対する特異的血清抗体濃度をエライザ法
によって測定した。

【００６６】図８に、Ｍ−グルカン、古典的ビブリオ症
（ビブリオ・アンギラルム血細型０１）に対するワクチ
ン、Ｍ−グルカンおよびビブリオ症に対するワクチン、
または対照の食塩水で処置したアトランティックサーモ
ン血清での特異的抗体濃度を示す。そのデータは、グル
カンがワクチンに対する特異的抗体濃度を極めて有意に
（Ｐ＝０．００１５）増加させることを示している。

【００６７】これらの結果により、Ｍ−グルカンは、そ
れ以後の感染に対する魚の耐性を増大させるための市販
のワクチンとの補助薬として有効に用いることができる
ということが実証される。

【００６８】

【実施例ＸＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、冷水ビブリオ症のビブリオ・サルモニシダに対する
耐性を増大させるワクチンとの補助薬としてのＭ−グル
カンの有効性を実証する。

【００６９】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約８〜１０℃
で保持された）。第一群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン１
．０ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内
に注射した。第二群のサケ１０匹に、ノルウェイ、ベル
ゲンにあるノルビオ・エイ・エスから商業的に入手した
冷水ビブリオ症ワクチン（ビブリオ・サルモニシダ）を
腹腔内に注射した。第三群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン
１．０ｍｇを含む懸濁液０．２ｍｌおよびビブリオ症ワ
クチンを腹腔内に注射した。対照群のサケ１０匹に等張
食塩水０．２ｍｌを腹腔内に注射した。魚は実験の間中
、市販の乾燥ペレットで飼養された。

【００７０】サケの群はいずれも同一のタンク中で飼養
された。注射して１０週間後に、全部の魚を頭部で撲殺
し、尾部の血管から脱血させた。ビブリオ・サルモニシ
ダに対する特異的血清抗体濃度をエライザ法によって測
定した。

【００７１】図９に、Ｍ−グルカン、冷水ビブリオ症（
ビブリオ・サルモニシダ）に対するワクチン、Ｍ−グル
カンおよび冷水ビブリオ症に対するワクチン、または対
照の食塩水で処置したアトランティックサーモン血清で
の特異的抗体濃度を示す。そのデータは、グルカンがワ
クチンに対する特異的抗体濃度を有意に（Ｐ＝０．０４
）増加させることを示している。

【００７２】これらの結果により、Ｍ−グルカンは、そ
れ以後の感染に対する魚の耐性を増大させるための市販
のワクチンとの補助薬として有効に用いることができる
ということが実証される。

【００７３】

【実施例ＸＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具
体的には、アトランティックサーモンでのＭ−グルカン
によって得られた相対百分率防御を実証する。表２のデ
ータは、表２に示した変更と一緒に実施例ＩＩ〜ＶＩＩ
Ｉでの方法と同様の方法を用いて集められた。

【００７４】表２から分かるように、Ｍ−グルカンは、
硬骨魚類綱の魚類、具体的には、サケに、種々の疾病対
する有意の防御を提供する。

【００７５】

【００７６】

【００７７】表２の説明 （ａ）食塩水０．２ｍｌ中に懸濁した表示量のＭ−グル
カンを魚にそれぞれ腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。対照
の魚には、食塩水０．２ｍｌを腹腔内注射した。１〜８
週間後に、細菌性病原体の腹腔内注射によって魚を感染
させた。魚１匹当りの投与量を括弧で示す。各実験にお
いて、致死率が横ばいになった場合、すなわち、実験１
での接種後４０日；実験２、３、４、５、６および１２
での接種後２０日；実験７および８での接種後２５日；
および実験９、１０、１１および１２での接種後１３日
で各群の全致死率を合計した。相対百分率防御（ＲＰＰ
）を下記の式によって定義する。

【００７８】

【００７９】（ｂ）実験７および８において、グルカン
注射後４週間目に、魚にそれぞれ、ビブリオ・アンギラ
ルム血細型０１を８×１０３個および７×１０４個で感
染させた。致死が生じなかった場合、グルカン注射後８
週間目に魚を再度感染させた。

【００８０】

【実施例ＸＩＩＩ】この実施例で、甲殻類亜門の甲殻類
動物、具体的にはジャイアントタイガーシュリンプ（Ｇ
ｉａｎｔ　　ｔｉｇｅｒ　　ｓｈｒｉｍｐ）（ペネウス
・モノドン）の疾病対する耐性を増大させる場合の予防
薬としてのＭ−グルカンの有効性を実証する。

【００８１】ジュベニル（Ｊｕｖｅｎｉｌ）ジャイアン
トタイガーシュリンプ（ペネウス・モノドン）を、フロ
ースルーシステムでの滅菌した海水が供給される６個の
ガラス繊維製タンクそれぞれに、２００ＰＬ５０の密度
まで貯蔵した。小エビには、日昼の時間は自動飼養装置
によって連続的に、市販の子エビ用飼料（３個のタンク
）かまたはビール酵母菌からのグルカン５ｇ／ｋｇ（飼
料）で強化した市販の飼料を与えた。小エビを５週間飼
養した後、商業用小エビ養殖場からの瀕死の小エビの海
水中ホモゲネートを各タンクに加えることによって、そ
れらを感染させた。この種の小エビはウイルスのキャリ
アであり且つ二次感染の混合フローラであった（例えば
、ビブリオ・ハレンジイ（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｈａｒｅｎ
ｇｉｉ）およびビブリオ・パラヘモリティエンス（Ｖｉ
ｂｒｉｏ　　ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｅｎｓ））。各
タンク中の小エビの数を７週間後に記録した。そのデー
タにより、対照群での７週間の間の全致死率は８０％で
あり、グルカンを強化した飼料を与えた群では５０％で
あることが示された。

【００８２】これらのデータにより、水産養殖において
小エビの生存数を増大させる場合の予防薬として経口に
よって投与されたＭ−グルカンの有効性が実証される。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｍ−グルカンまたは対照飼料で飼養されたアト
ランティックサーモンでのせつ症（アエロモナス・サル
モニシダ亜種サルモニシダ）に感染後の累積致死率を示
すグラフである。

【図２】Ｍ−グルカンまたは対照飼料で飼養されたアト
ランティックサーモンでの冷水ビブリオ症（ビブリオ・
サルモニシダ）に感染後の累積致死率を示すグラフであ
る。

【図３】Ｍ−グルカンまたは対照飼料で飼養されたアト
ランティックサーモンでの古典的ビブリオ症（ビブリオ
・アンギラルム血細型０１）に感染後の累積致死率を示
すグラフである。

【図４】Ｍ−グルカンまたは対照の食塩水で処置された
アトランティックサーモンでの古典的ビブリオ症（ビブ
リオ・アンギラルム血細型０１）に感染後の累積致死率
を示すグラフである。

【図５】Ｍ−グルカンまたは対照の食塩水で処置された
アトランティックサーモンでのレッドマウス病（エルジ
ニア・ルッケリ）に感染後の累積致死率を示すグラフで
ある。

【図６】Ｍ−グルカン、Ｄ，Ｌ−グルカンまたは対照の
食塩水で処置されたアトランティックサーモンでの冷水
ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に感染後の累積
致死率を示すグラフである。

【図７】Ｍ−グルカン、せつ症用ワクチン、Ｍ−グルカ
ンおよびせつ症用ワクチン、または対照の食塩水で処置
されたアトランティックサーモンでのせつ症（アエロモ
ナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ）に感染後の累積
致死率を示すグラフである。

【図８】Ｍ−グルカン、古典的ビブリオ症（ビブリオ・
アンギラルム血細型０１）に対するワクチン、Ｍ−グル
カンおよびビブリオ症に対するワクチン、または対照の
食塩水で処置されたアトランティックサーモンでの特異
的抗体濃度を示すグラフである。

【図９】Ｍ−グルカン、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サ
ルモニシダ）に対するワクチン、Ｍ−グルカンおよび冷
水ビブリオ症に対するワクチン、または対照の食塩水で
処置されたアトランティックサーモンでの特異的抗体濃
度を示すグラフである。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　硬骨魚類（Ｏｓｔｅｉｃｈｔｈｙｅｓ
   ）綱および甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）亜門の水性動
   物の免疫系を刺激するための薬剤であって、主としてβ
   −１，３−グリコシド結合によって結合したグルコピラ
   ノース単位から成り、そこからβ−１，６−グリコシド
   結合によって結合したグルコピラノース単位の少なくと
   も１個の分枝を有する有効量のグルカンを含み、前記の
   水性動物の免疫系を刺激する薬剤。
2. 【請求項２】　　グルカンが、主としてβ−１，３−グ
   リコシド結合によって結合した約４００〜約１５００個
   のグルコピラノース単位から成る請求項１に記載の薬剤
   。
3. 【請求項３】　　グルカンが、β−１，６−グリコシド
   結合によって結合した約１〜約１０個のグルコピラノー
   ス単位から成るグルコピラノース単位の少なくとも１個
   の分枝を含む請求項２に記載の薬剤。
4. 【請求項４】　　硬骨魚類綱および甲殻類亜門から成る
   群より選択された水性動物に投与された少なくとも１種
   類の適当なワクチンの効果を増大させるための薬剤であ
   って、主としてβ−１，３−グリコシド結合によって結
   合したグルコピラノース単位から成り、そこからβ−１
   ，６−グリコシド結合によって結合したグルコピラノー
   ス単位の少なくとも１個の分枝を有する有効量の酵母グ
   ルカンを、少なくとも１種類の適当なワクチンの前に、
   後に、または一緒に投与して、前記の少なくとも１種類
   の適当なワクチンの効果を増大させることを特徴とする
   薬剤。
5. 【請求項５】　　主としてβ−１，３−グリコシド結合
   によって結合したグルコピラノース単位から成り、そこ
   からβ−１，６−グリコシド結合によって結合したグル
   コピラノース単位の少なくとも１個の分枝を有する酵母
   グルカンの製造方法であって、 （ａ）適当なグルカン含有酵母細胞を適当な抽出用アル
   カリ水溶液を用いて適当な条件下でアルカリ抽出して第
   一の不溶性酵母残留物を与え； （ｂ）前記の第一の不溶性酵母残留物を適当な抽出用ア
   ルカリ水溶液を用いて適当な抽出条件下で熱アルカリ抽
   出し、その熱アルカリ抽出を少なくとも２回行なって第
   二の不溶性酵母残留物を与え且つ各熱アルカリ抽出後の
   不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｃ）前記の第二の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
   水を用いて約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＨで洗浄する
   ことによって第三の不溶性酵母残留物を与え且つ前記の
   洗浄後の第三の不溶性酵母残留物を回収し；（ｄ）前記
   の第三の不溶性酵母残留物を適当な加水分解性酸によっ
   て適当な加水分解条件下で加水分解し、その酸加水分解
   を少なくとも３回行なって第四の不溶性酵母残留物を与
   え且つ各酸加水分解後の不溶性酵母残留物を回収し；次
   に、 （ｅ）前記の第四の不溶性酵母残留物を適当な条件下水
   中で沸騰させ、前記の第四の不溶性酵母残留物の沸騰を
   少なくとも２回行なって第五の不溶性酵母残留物を与え
   且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物を回収し；そして（ｆ
   ）前記の第五の不溶性酵母残留物を適当な条件下エタノ
   ール中で沸騰させ、前記の第五の不溶性酵母残留物のエ
   タノール中での沸騰を少なくとも２回行なって第六の不
   溶性酵母残留物を与え且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物
   を回収し；次に、 （ｇ）前記の第六の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
   水で洗浄し、前記の洗浄した第六の不溶性酵母残留物の
   洗浄を少なくとも２回行なって酵母グルカンを与え且つ
   各洗浄後の不溶性酵母残留物を回収すること；から成る
   製造方法。
6. 【請求項６】　　主としてβ−１，３−グリコシド結合
   によって結合したグルコピラノース単位から成り、そこ
   からβ−１，６−グリコシド結合によって結合したグル
   コピラノース単位の少なくとも１個の分枝を有する酵母
   グルカンの製造方法であって、 （ａ）ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　
   ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジタ・ウティリス（Ｃａ
   ｎｄｉｄａ　　ｕｔｉｌｉｓ）およびピキア・パストリ
   ス（Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群よ
   り選択される適当なグルカン含有酵母を適当な抽出用ア
   ルカリ水溶液を用いて適当な条件下でアルカリ抽出して
   第一の不溶性酵母残留物を与え； （ｂ）前記の第一の不溶性酵母残留物を、ＮａＯＨ、Ｋ
   ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＮａ２ＣＯ３から成る群よ
   り選択される適当な抽出用アルカリ水溶液を用いて適当
   な抽出条件下で熱アルカリ抽出し、その熱アルカリ抽出
   を約２回〜約５回の範囲で行なって第二の不溶性酵母残
   留物を与え且つ各熱アルカリ抽出後の不溶性酵母残留物
   を回収し； （ｃ）前記の第二の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
   水を用いて約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＨで洗浄する
   ことによって第三の不溶性酵母残留物を与え且つ各洗浄
   後の不溶性酵母残留物を回収し； （ｄ）前記の第三の不溶性酵母残留物を、酢酸、トリフ
   ルオロ酢酸、塩酸、リン酸および硫酸から成る群より選
   択される適当な加水分解性酸によって適当な加水分解条
   件下で加水分解し、その加水分解を約３回〜約１０回の
   範囲で行なって第四の不溶性酵母残留物を与え且つ各酸
   加水分解後の不溶性酵母残留物を回収し；次に、（ｅ）
   前記の第四の不溶性酵母残留物を適当な条件下水中で沸
   騰させ、前記の第四の不溶性酵母残留物の沸騰を約２回
   〜約６回の範囲で行なって第五の不溶性酵母残留物を与
   え且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物を回収し；そして （ｆ）前記の第五の不溶性酵母残留物を適当な条件下エ
   タノール中で沸騰させ、前記の沸騰させた第五の酵母残
   留物のエタノール中での沸騰を約２回〜約６回の範囲で
   行なって第六の不溶性酵母残留物を与え且つ各沸騰後の
   不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｇ）前記の第六の酵母残留物を適当な条件下で水で洗
   浄し、前記の第六の酵母残留物の洗浄を約２回〜約６回
   の範囲で行なって酵母グルカンを与え且つ各洗浄後の不
   溶性酵母残留物を回収すること；から成る製造方法。
7. 【請求項７】　　主としてβ−１，３−グリコシド結合
   によって結合した約４００〜約１５００個のグルコピラ
   ノース単位から成り、β−１，６−グリコシド結合によ
   って結合した約１〜約１０個のグルコピラノース単位か
   ら成るグルコピラノース単位の少なくとも１個の分枝を
   有するグルカン。
8. 【請求項８】　　硬骨魚類綱または甲殻類綱の動物に、
   主としてβ−１，３−グリコシド結合によって結合した
   グルコピラノース単位から成り、そこからβ−１，６−
   グリコシド結合によって結合したグルコピラノース単位
   の少なくとも１個の分枝を有する酵母グルカンを投与す
   る養殖方法。