JP2828799B2 - 酵母グルカンの製造方法 - Google Patents

酵母グルカンの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、水性動物用予防薬とし
てのグルカンの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、ワクチンおよび抗生物質は、硬骨
魚類（Ｏｓｔｅｉｃｈｔｈｙｅｓ）綱および甲殻類（Ｃ
ｒｕｓｔａｃｅａ）綱の水性動物を水産養殖環境での疾
病から守るためのただ二つの実証された手段である。し
かしながら、細菌、ウイルス、真菌および原生動物によ
る疾病によって引き起こされる若干の病原性疾患は、ワ
クチン接種によってもまたは抗生物質で処置しても有効
に予防することができない。この分野での若干の研究者
は、硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物のため
の水産養殖環境での別の予防処置を開発すること、特に
免疫刺激化合物の利用を試みている。
【０００３】魚類および甲殻類の免疫系についてはほと
んど知られていないが、ある種の化合物は魚類でのマク
ロファージの微生物死滅活性を増大させると考えられ
る。死滅したミコバクテリアおよびムラミルペプチドが
数種の病原体に対するニジマス（サルモ・ゲイルドネリ
・リチャードソン（Ｓａｌｍｏ ｇａｉｒｄｎｅｒｉＲ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎ））の耐性を増大させたことが報告
された。更に、海生被嚢類からの抽出物がアエロモナス
・ヒドラフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒａｐｈｉ
ｌａ）による感染に対するアメリカウナギ（アンギラ・
ロストラタ・レソア（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｒｏｓｔｒａ
ｔａ ＬｅＳｅｕｒ）の耐性を増大させると考えられ
る。しかしながら、これらの化合物は、魚類または甲殻
類を水産養殖環境での疾病から守るための適当な手段で
あると実証されていない。
【０００４】更に、哺乳動物系に有効であるグルカンの
ような免疫刺激化合物も同定された。一般的には、グル
カンとは、唯一のグリコシル単位としてグルコースを含
む種々の多糖を意味する。従来の研究で、特定のβ−
１，３−グルカンが、実験用温血動物のマクロファージ
／単球細胞系および補体並びにリンパ球の強力な活性化
物質であることが実証された。ちょうど、グルカンは節
足動物および植物の宿主防御機構を活性化することがで
きるというある種の徴候が示唆された。更に、酵母グル
カンが、水産養殖環境での硬骨魚類（例えば、サケおよ
びマス）および甲殻類（例えば、ロブスターおよび小エ
ビ）に分類される水性動物の免疫刺激物質として実際に
作用することを立証する研究はまだ発表されていない。
【０００５】したがって、硬骨魚類および甲殻類に分類
される水性動物の疾病に対する耐性を増大させる手段を
提供することは、水産養殖産業にかなり貢献すると思わ
れる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
態様は、硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物の
水産養殖環境での疾病に対する耐性を増大させるグルカ
ンの酵母からの製法を提供することである。
【０００７】更に、本発明の態様は、水産養殖環境での
硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物への投与に
適当なグルカン製剤の製造方法を提供することである。
【０００８】更に、本発明の態様は、有効量のグルカン
製剤を投与することによって水産養殖環境での硬骨魚類
および甲殻類に分類される水性動物の疾病に対する耐性
を増大させる方法を提供することである。
【０００９】本発明の態様は、更に、有効量のグルカン
製剤を１種類または複数種類のワクチン抗原と一緒に投
与することによって水産養殖環境での硬骨魚類および甲
殻類に分類される水性動物用ワクチンの効果を増大させ
る方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
水産養殖環境での硬骨魚類綱および甲殻類亜門から成る
群より選択される水性動物の免疫系を刺激するための方
法であって、主としてβ−１，３−グリコシド結合によ
って結合したグルコピラノース単位から成り、そこから
β−１，６−グリコシド結合によって結合したグルコピ
ラノース単位の少なくとも１個の分枝を有する酵母グル
カンを投与して水性動物の免疫系を刺激することを含む
方法を提供する。
【００１１】本発明により、更に、水産養殖環境での硬
骨魚類綱および甲殻類亜門から成る群より選択される水
性動物に投与されたワクチンの効果を増大させるための
方法であって、酵母グルカンをワクチンの前にまたはワ
クチンと一緒に投与してその水性動物でのそのワクチン
抗原に対する特異的抗体の産生を増大させる方法を提供
する。本発明のもう一つの態様により、主としてβ−
１，３−グリコシド結合によって結合したグルコピラノ
ース単位から成り、そこからβ−１，６−グリコシド結
合によって結合したグルコピラノース単位の少なくとも
１個の分枝を有する酵母グルカンの製造方法であって、 （ａ）適当なグルカン含有酵母細胞を適当な抽出用アル
カリ水溶液を用いて適当な条件下でアルカリ抽出して第
一の不溶性酵母残留物を与え； （ｂ）前記の第一の不溶性酵母残留物を適当な抽出用ア
ルカリ水溶液を用いて適当な抽出条件下で熱アルカリ抽
出し、その熱アルカリ抽出を少なくとも２回行なって第
二の不溶性酵母残留物を与え且つ各熱アルカリ抽出後の
不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｃ）前記の第二の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
水を用いて約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＨで洗浄する
ことによって第三の不溶性酵母残留物を与え且つ前記の
洗浄後の第三の不溶性酵母残留物を回収し； （ｄ）前記の第三の不溶性酵母残留物を適当な加水分解
性酸によって適当な加水分解条件下で加水分解し、その
酸加水分解を少なくとも３回行なって第四の不溶性酵母
残留物を与え且つ各酸加水分解後の不溶性酵母残留物を
回収し；次に、 （ｅ）前記の第四の不溶性酵母残留物を適当な条件下水
中で沸騰させ、前記の第四の不溶性酵母残留物の沸騰を
少なくとも２回行なって第五の不溶性酵母残留物を与え
且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物を回収し；そして （ｆ）前記の第五の不溶性酵母残留物を適当な条件下エ
タノール中で沸騰させ、前記の第五の不溶性酵母残留物
のエタノール中での沸騰を少なくとも２回行なって第六
の不溶性酵母残留物を与え且つ各沸騰後の不溶性酵母残
留物を回収し；次に、 （ｇ）前記の第六の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
水で洗浄し、前記の洗浄した第六の不溶性酵母残留物の
洗浄を少なくとも２回行なって酵母グルカンを与え且つ
各洗浄後の不溶性酵母残留物を回収すること；から成る
製造方法を提供する。
【００１２】更に別の態様において、本発明は、硬骨魚
類綱および甲殻類綱の動物に、主としてβ−１，３−グ
リコシド結合によって結合したグルコピラノース単位か
ら成り、そこからβ−１，６−グリコシド結合によって
結合したグルコピラノース単位の少なくとも１個の分枝
を有する酵母グルカン化合物を投与することを含む、得
られる収量を改良するための前記の動物の改良された生
産方法を提供する。
【００１３】本出願人は、特定の種類の酵母グルカンが
硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物のための予
防薬として極めて有効であるということを発見した。
【００１４】硬骨魚類は商業的に重要な魚類であり、制
限されないが、サケ（ｓａｌｍｏｎｓ）、マス（ｔｒｏ
ｕｔｓ）、ホワイトフィッシュ（ｗｈｉｔｅｆｉｓｈｅ
ｓ）、ナマズ（ｃａｔｆｉｓｈｅｓ）、サバヒー（ｍｉ
ｌｋｆｉｓｈｅｓ）、コイ（ｃａｒｐｓ）、シクリッド
（ｃｉｃｈｌｉｄｓ）（ティラピア（ｔｉｌａｐｉａ）
など）、イルカ（ｄｏｌｐｈｉｎｓ）（マヒ・マヒ（ｍ
ａｈｉ−ｍａｈｉ）としても知られている）、チョウザ
メ（ｓｔｕｒｇｅｏｎｓ）、ヘラチョウザメ（ｐａｄｄ
ｌｅｆｉｓｈｅｓ）、スズキ（ｐｅｒｃｈｅｓ）（ウォ
ーライ（ｗａｌｌｅｙｅ）、ソーガー（ｓａｕｇｅｒ）
およびイエローパーチ（ｙｅｌｌｏｗｐｅｒｃｈ）な
ど）、アジ（ｊａｋｓ）およびコバンアジ（ｐｏｍｐａ
ｎｏｓ）（イエローテイル（ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌｓ）
など）、ハタ（ｓｅａ ｂａｓｓｅｓ）（マハタ（ｇｒ
ｏｕｐｅｒｓ）など）、ストライプトバス（ｓｔｒｉｐ
ｐｅｄ ｂａｓｓｅｓ）、タイ（ｐｏｒｇｉｅｓ）（シ
ーブリーム（ｓｅａ ｂｒｅａｍｅｓ）など）、タラ
（ｃｏｄｆｉｓｈｅｓ）、カレイ（ｆｌａｔｆｉｓｈ）
（ヌマガレイ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）、オヒョウ（ｈａｌ
ｉｂｕｔ）、ホシダルマガレイ（ｔｕｒｂｏｔ）および
マコガレイ（ｄａｂ）など）、マンボウ（ｓｕｎｆｉｓ
ｈｅｓ）、ニシン（ｈｅｒｒｉｎｇｓ）、アンチョビー
（ａｎｃｈｏｖｉｅｓ）、キュウリウオ（ｓｍｅｌｔ
ｓ）、カワカマス（ｐｉｋｅｓ）、フエダイ（ｓｎａｐ
ｐｅｒｓ）（レッドドラム（ｒｅｄ ｄｒｕｍ）または
メバル（ｒｅｄｆｉｓｈ）など）、ニベ（ｄｒｕｍ
ｓ）、ボラ（ｍｕｌｌｅｔｓ）、ラビットフィッシュ
（ｒａｂｂｉｔｆｉｓｈｅｓ）、サバ（ｍａｃｋｅｒｅ
ｌｓ）、マグロ（ｔｕｎａｓ）、フグ（ｐｕｆｆｅｒ
ｆｉｓｈｅｓ）およびウナギ（ｅｅｌｓ）（アメリカウ
ナギ（Ａｍｅｒｉｃａｎ）、西洋ウナギ（Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ）およびアジアウナギ（Ａｓｉａｔｉｃ ｅｅｌ
ｓ））など）から成る群より選択される魚類がある。一
般的には、これらの魚類は、サケ科（Ｓａｌｍｏｎｉｄ
ａｅ）（ワカソ科（Ｃｏｒｅｇｏｎｉｄａｅ）の亜科な
ど）、イクタルリデー科（Ｉｃｔａｌｕｒｉｄａｅ）、
チャニデー科（Ｃｈａｎｉｄａｅ）、コイ科（Ｃｙｐｒ
ｉｎｉｄａｅ）、カワスズメ科（Ｃｉｃｈｌｉｄａ
ｅ）、コリフェニデー科（Ｃｏｒｙｐｈａｅｎｉｄａ
ｅ）、チョウザメ科（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒｉｄａｅ）、
ポリオドンティデー科（Ｐｏｌｙｏｄｏｎｔｉｄａ
ｅ）、パーシデー科（Ｐｅｒｃｉｄａｅ）、ハタ科（Ｓ
ｅｒｒａｎｉｄａｅ）、パーシクスィイデー科（Ｐｅｒ
ｃｉｃｈｔｈｙｉｄａｅ）、アジ科（Ｃａｒａｎｇｉｄ
ａｅ）、タイ科（Ｓｐａｒｉｄａｅ）、タラ科（Ｇａｄ
ｉｄａｅ）、ボシデー科（Ｂｏｔｈｉｄａｅ）、プリュ
ロネクチデー科（Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｉｄａｅ）、サ
サウシノシタ科（Ｓｏｌｅｉｄａｅ）、ニシン科（Ｃｌ
ｕｐｅｉｄａｅ）、カタクチイワシ科（Ｅｎｇｒａｕｌ
ｉｄａｅ）、キュウリウオ科（Ｏｓｍｅｒｉｄａｅ）、
エソシデー科（Ｅｓｏｃｉｄａｅ）、フエダイ科（Ｌｕ
ｔｊａｎｉｄａｅ）、ニベ科（Ｓｃｉａｅｎｉｄａ
ｅ）、ボラ科（Ｍｕｇｉｌｉｄａｅ）、アイゴ科（Ｓｉ
ｇａｎｉｄａｅ）、サバ科（Ｓｃｏｍｂｒｉｄａｅ）、
セントラーキデー科（Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ）、
マフグ科（Ｔｅｔｒａｏｄｏｎｔｉｄａｅ）、アンギリ
デー科（Ａｎｇｕｉｌｌｉｄａｅ）、ウツボ科（Ｍｕｒ
ａｅｎｉｄａｅ）およびコングリデー科（Ｃｏｎｇｒｉ
ｄａｅ）から成る群より選択される科からの魚である。
この予防薬は、サルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａ
ｒ）、サルモ・クラルキイ（Ｓａｌｍｏ ｃｌａｒｋｉ
ｉ）、サルモ・ガイルデンリ（Ｓａｌｍｏ ｇａｉｒｄ
ｅｎｒｉ）、サルモ・トゥルッタ（Ｓａｌｍｏ ｔｒｕ
ｔｔａ）、オンコリンクス・ケータ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎ
ｃｈｕｓ ｋｅｔａ）、オンコリンクス・ゴルブシャ
（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｇｏｒｂｕｓｃｈａ）、
オンコリンクス・ツァヴィッチャ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃ
ｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、オンコリンクス・
キスチ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃ
ｈ）、オンコリンクス・ネルカ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈ
ｕｓ ｎｅｒｋａ）、サルベリヌス・アルピヌス（Ｓａ
ｌｖｅｌｉｎｕｓ ａｌｐｉｎｕｓ）、サルベリヌス・
フォンティナリス（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ ｆｏｎｔｉ
ｎａｌｉｓ）、サルベリヌス・マルマ（Ｓａｌｖｅｌｉ
ｎｕｓ ｍａｌｍａ）およびサルベリヌス・ナメイクシ
ュ（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ ｎａｍａｙｃｕｓｈ）から
成る群より選択されるサケ科の保護膜に特に有効である
と考えられる。更に、この予防薬は他にも、愛好家によ
る塩水または淡水の水槽中で飼養するのに適当である水
族館用魚類および／または観賞用魚類を保護するのに適
当であると考えられる。
【００１５】甲殻類は、商業的に重要な甲殻類動物の亜
門であり、制限されないが、小エビ（ｓｈｒｉｍｐ）、
エビ（ｐｒａｗｎｓ）（マクロブラキウムプローン（ｍ
ａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｐｒａｗｎｓ）など）、ロ
ブスター（ｌｏｂｓｔｅｒｓ）（イセエビ（ｓｐｉｎ
ｙ）およびスペインロブスター（ｓｐａｎｉｓｈ）また
はスリッパーロブスター（ｓｌｉｐｐｅｒ ｌｏｂｓｔ
ｅｒ）など）、ザリガニ（ｃｒａｙｆｉｓｈ）およびカ
ニ（ｃｒａｂｓ）（タラバガニ（ｋｉｎｇ ｃｒａ
ｂ）、ストーンクラブ（ｓｔｏｎｅ ｃｒａｂ）、ロッ
ククラブ（ｒｏｃｋｃｒａｂ）、イチョウガニ（ｄｕｎ
ｇｅｎｅｓｓ ｃｒａｂ）、スノウクラブ（ｓｎｏｗ
ｃｒａｂ）およびブルークラブ（ｂｌｕｅ ｃｒａｂ）
から成る群より選択されるカニなど）から成る群より選
択される甲殻類動物が挙げられる。この予防薬は、ペネ
ウス・モノドン（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）、
ペネウス・ヒネンシス（Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎ
ｓｉｓ）、ペネウス・インディクス（Ｐｅｎａｅｕｓ
ｉｎｄｉｃｕｓ）、ペネウス・スティリロストリス（Ｐ
ｅｎａｅｕｓ ｓｔｙｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）、ペネウス
・マーギエンシス（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｅｒｇｕｉｅｎ
ｓｉｓ）、ペネウス・ヴァンナメイ（Ｐｅｎａｅｕｓ
ｖａｎｎａｍｅｉ）、メタペネウス・エンシス（Ｍｅｔ
ａｐｅｎｅｕｓｅｎｓｉｓ）、ペネウス・セティフェル
ス（Ｐｅｎａｅｕｓ ｓｅｔｉｆｅｒｕｓ）、ペネウス
・ジャポニス（Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｓ）、ペ
ネウス・アツェクス（Ｐｅｎａｅｕｓ ａｚｔｅｃｕ
ｓ）、ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕ
ｏｒａｒｕｍ）、ペネウス・セミスルカツス（Ｐｅｎａ
ｅｕｓ ｓｅｍｉｓｕｌｃａｔｕｓ）、ペネウス・テラ
オイ（Ｐｅｎａｅｕｓｔｅｒａｏｉ）、ペネウス・オリ
エンタリス（Ｐｅｎａｅｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉ
ｓ）、ペネウス・プレベジュス（Ｐｅｎａｅｕｓ ｐｌ
ｅｂｅｊｕｓ）およびペネウス・ケラツルス（Ｐｅｎａ
ｅｕｓ ｋｅｒａｔｈｕｒｕｓ）から成る群より選択さ
れるペネイデー科（Ｐｅｎａｅｉｄａｅ）の保護膜に特
に有効であると考えられる。
【００１６】更に、この予防薬は、ホマルス・アメリカ
ヌス（Ｈｏｍａｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、ホマ
ルス・ガンマルス（Ｈｏｍａｒｕｓ ｇａｍｍａｒｕ
ｓ）、パリナルス・エレファス（Ｐａｌｉｎａｒｕｓ
ｅｌｅｐｈａｓ）、パリナルス・インタールプツス（Ｐ
ａｌｉｎａｒｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ）、パリナ
ルス・アルグス（Ｐａｌｉｎａｒｕｓ ａｒｇｕｓ）お
よびネフロプス・ノルベジクス（Ｎｅｐｈｒｏｐｓ ｎ
ｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）から成る群より選択されるホマリ
デー科（Ｈｏｍａｒｉｄａｅ）およびパリヌリデー科
（Ｐａｌｉｎｕｒｉｄａｅ）由来のロブスターのような
ロブスター類に有効であると考えられる。
【００１７】一般的には、グルカンとは種々のポリグル
カンを意味する。しかしながら、本明細書中に記載のグ
ルカンは、酵母細胞壁から得られるポリグルコースを意
味するものであり、主としてβ−１，３−およびβ−
１，６−グリコシド結合によって互いに結合したグルコ
ピラノース分子（または単位）の分枝状および非分枝状
鎖である。本発明者の酵母グルカンに関する実験から、
β−１，３−結合によって結合したグルコピラノース単
位の鎖と一緒にβ−１，６−結合によって結合したグル
コピラノース単位の少なくとも１個の分枝を有するグル
カンは、硬骨魚類および甲殻類に分類される水性動物の
ための最も有効な予防薬であると考えられる。好ましい
グルカンは、主としてβ−１，３−グリコシド結合を有
する約４００〜約１５００個のグルコピラノース単位の
鎖と、それに結合した主としてβ−１，６−グリコシド
結合によって結合したグルコピラノース単位の少なくと
も１個の分枝を有するものでなければならない。主とし
てβ−１，６グリコシド結合によって結合したグルコピ
ラノース単位から成る分枝はそれぞれ、１〜約１０個の
範囲のグルコピラノース単位を有するのが好ましく、最
も好ましくは、各分枝が１〜６個の範囲のグルコピラノ
ース単位を有する。
【００１８】本発明の実施に好ましいグルカンは、本出
願人がＭ−グルカンと称した酵母グルカン製剤である。
Ｍ−グルカンは、β−１，３−グリコシド結合によって
結合したグルコピラノース単位の鎖と、それに結合した
β−１，６グリコシド結合によって結合した約１〜約６
個のグルコピラノース単位の分枝から成る高度に分枝し
たグルカンである。更に、このグルカンは、稀アルカリ
溶液および稀酸溶液に不溶性であり、その上エタノール
にも不溶性であることを特徴とする。
【００１９】適当なグルカンを種々の微生物源から調製
することができる。このような微生物源の一覧表を完全
ではないが表Ｉに示す。
【００２０】
【００２１】本発明の実施に適当なグルカンの好ましい
微生物源は、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・ウティリス
（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）およびピチア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００２２】本発明の実施で用いられるグルカンは、当
業者に周知の適当な抽出方法を利用して微生物源から調
製することができる。ビール酵母菌の細胞壁からグルカ
ンを抽出するための一つの方法では、熱アルカリおよび
酢酸による連続抽出に続く水洗を利用して細胞壁中の可
溶性成分を除去する。残留する不溶性物質が問題のグル
カン生成物である。
【００２３】好ましいＭ−グルカンを抽出するには、下
記の抽出法を用いる必要がある。最初に、乾燥酵母約５
０ｇ／リットル（アルカリ水溶液）〜乾燥酵母約３００
ｇ／リットル（アルカリ水溶液）で酵母をアルカリ水溶
液中に懸濁させることによって、酵母を少なくとも１回
アルカリ抽出する必要がある。抽出用アルカリ性水溶液
のアルカリ濃度は約２重量％／リットル〜約６重量％／
リットルでなければならない。抽出用アルカリ溶液に用
いられるアルカリ化合物は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ
（ＯＨ）２およびＮａ２ＣＯ３から成る群より選択する
ことができる。酵母を含むアルカリ水溶液中懸濁液は、
約２０℃〜約３０℃の範囲の温度で約１６時間〜約３０
時間貯蔵する必要がある。アルカリ抽出によって得られ
た不溶性酵母残留物は、当業者に周知の任意の適当な分
離方法によって上澄みから回収することができ、例え
ば、制限されないが、濾過、クロスフロー（ｃｒｏｓｓ
ｆｌｏｗ）濾過または遠心分離がある。分離方法によっ
て採取された不溶性酵母残留物は、次に、熱アルカリ水
性混合物で抽出する必要がある。
【００２４】次に、不溶性酵母残留物を、乾燥酵母約５
０ｇ／リットル（抽出用アルカリ水溶液）〜乾燥酵母約
３００ｇ／リットル（抽出用アルカリ水溶液）に相当す
る第二の抽出用アルカリ水溶液中に懸濁させることがで
きる。前記に明記したアルカリ化合物の濃度は約１重量
％／リットル〜約４重量％／リットルでなければならな
い。不溶性酵母残留物を抽出用アルカリ水溶液中に懸濁
させる温度は、約６０℃〜約１００℃の範囲で約１時間
〜約６時間の範囲でなければならない。次に、その懸濁
液を、好ましくは、懸濁を室温で一晩中保持することに
よって室温まで冷却しなければならない。
【００２５】次に、水性熱アルカリ抽出からの不溶性酵
母残留物を、当業者に周知の任意の適当な分離方法、例
えば、制限されないが、濾過、クロスフロー濾過または
遠心分離によって上澄みから分離する。不溶性酵母残留
物を採取した後、アルカリ水溶液による熱抽出を少なく
とも２回、好ましくは、約２〜約５回の範囲で行なう必
要があり、不溶性残留物は各抽出の最後に採取する。
【００２６】不溶性酵母残留物の熱アルカリ水溶液によ
る抽出に続いて、不溶性酵母残留物のｐＨを、適当な水
性酸（適当な例として、無機酸、例えば塩酸、リン酸、
硫酸または有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、
シュウ酸および他の類似の酸が挙げられる）を用いて約
ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲に上昇させ且つ水で洗浄しなけ
ればならない。洗浄は、不溶性酵母残留物を水に懸濁さ
せた後、撹拌することによって行ない、次に、任意の適
当な分離方法、例えば濾過、クロスフロー濾過または遠
心分離によって不溶性酵母残留物を水から分離する。
【００２７】アルカリ抽出および洗浄に続いて、次に、
不溶性酵母残留物に穏やかな酸加水分解を施す必要があ
る。不溶性酵母残留物を、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩
酸、リン酸および硫酸から成る群より選択される水性酸
と接触させなければならない。加水分解性酸は水中濃度
約０．０５モル／リットル〜約１モル／リットルで与え
る必要がある。不溶性酵母残留物を、不溶性酵母残留物
（乾燥重量）約１０ｇ／リットル（水性加水分解性酸）
〜不溶性酵母残留物（乾燥重量）約５０ｇ／リットル
（水性加水分解性酸）の範囲で混合する必要がある。不
溶性酵母残留物および加水分解性酸水溶液の混合物を約
６０℃〜約９０℃の温度で約３時間〜約６時間の範囲で
保持しなければならない。次に、不溶性酵母残留物を、
当業者に周知の任意の適当な分離方法、例えば、制限さ
れないが、適当な条件下の濾過、クロスフロー濾過また
は遠心分離によって加水分解性酸水溶液から分離する。
不溶性酵母残留物を混合物から採取した後、酸加水分解
を少なくとも３回、好ましくは、約３〜約１０回の範囲
で行なう必要があり、得られる不溶性酵母残留物を各抽
出の最後に採取する。
【００２８】最後の抽出後、続いて、得られる不溶性酵
母残留物を、不溶性酵母残留物（乾燥重量）約１０ｇ／
リットル（水）〜不溶性酵母残留物（乾燥重量）約５０
ｇ／リットル（水）の濃度で分散させ、約０．５時間〜
約２時間沸騰させなければならない。この方法を少なく
とも２回、好ましくは、約２〜約６回の範囲で行なう必
要がある。それぞれの沸騰水中での処理の間に、不溶性
酵母残留物を任意の適当な分離方法、例えば濾過、クロ
スフロー濾過または遠心分離によって液相から回収する
ことができる。
【００２９】更に、不溶性酵母残留物を、不溶性酵母残
留物（乾燥重量）約２０ｇ／リットル（エタノール）〜
不溶性酵母残留物（乾燥重量）約１００ｇ／リットル
（エタノール）で分散させ、約０．１時間〜約２時間沸
騰させる必要がある。不溶性酵母残留物は、冷却後、任
意の適当な分離方法、例えば濾過、クロスフロー濾過ま
たは遠心分離によって回収することができる。エタノー
ル中での沸騰は少なくとも２回、好ましくは、約２〜約
６回の範囲で行なう必要がある。
【００３０】最後に、不溶性酵母残留物を少なくとも２
回、好ましくは、約２〜約６回の範囲で水を用いて室温
で洗浄しなければならない。水による各洗浄後に、不溶
性酵母残留物を任意の適当な分離方法、例えば濾過、ク
ロスフロー濾過または遠心分離によって回収することが
できる。
【００３１】更に、適当なグルカンを、本明細書中で記
載したように、酵母抽出後の不溶性残留物に更にアルカ
リ抽出および酸処理を施すことによって製造された酵母
抽出物の副生成物から調製することができる。
【００３２】投与経路および方法 本発明のグルカンは多数の経路によって投与することが
でき、例えば、制限されないが、腸内（経口）、水性暴
露経由および非経口（制限されないが、皮内、腹腔内、
皮下および筋内などへの注射）が挙げられる。硬骨魚類
綱および甲殻類亜門の水性動物に投与する場合、グルカ
ンは通常の賦形剤、すなわち、グルカンと有害に反応し
ない薬学的に容認可能な適当な有機および無機担体物質
と混合した状態で用いることができる。薬学的に容認可
能な適当な担体として、制限されないが、水、塩溶液、
アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコー
ル、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例
えばラクトース、アミロースまたはデンプン、等が挙げ
られる。薬剤は滅菌することができ、所望ならば、グル
カンと有害に反応しない助剤、例えば潤滑剤、防腐剤、
安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用するための塩
類、緩衝剤等と混合することができる。それらは、所望
ならば、他の活性剤、例えばビタミンと混合することも
できる。非経口用途に特に適当であるのは注射可能な滅
菌溶液であり、好ましくは、油状または水性の溶液並び
に懸濁液またはエマルジョンである。更に、腸内（経
口）用には、本発明のグルカンを乾燥若しくは湿潤形態
で経口によって投与することができるしまたは所望によ
り水中用飼料と混合して与えることもできる。更に、グ
ルカンを、少なくとも１種類の適当な抗微生物剤および
／または少なくとも１種類の適当なワクチンと同時に投
与してもよい。グルカンおよび抗微生物剤および／また
はワクチンを投与する場合、各薬剤を順次に投与しても
よいし、またはグルカンを１種類以上の抗微生物剤若し
くはワクチンと混合し且つ単一組成物として投与しても
よい。典型的には、等張溶液を用いる。
【００３３】与えられるグルカンの水性動物重量のｋｇ
当りの量は、それを与えられる水性動物に免疫刺激作用
を与えるのに十分な量でなければならない。注射される
グルカンの水性動物体重のｋｇ当りの有効量は、グルカ
ン約５ｍｇ／ｋｇ（生物量）〜グルカン約１００ｍｇ／
ｋｇ（生物量）の範囲でなければならない。グルカンを
乾燥形態で経口によって与える場合、体重ｋｇ当りのグ
ルカンの量は、一日の基準で与える場合、グルカン約５
ｍｇ／ｋｇ（生物量）〜グルカン約１００ｍｇ／ｋｇ
（生物量）の範囲でなければならない。水性動物用の乾
燥飼料などの乾燥形態では、飼料中のグルカンの量はグ
ルカン１ｇ／ｋｇ（飼料）〜グルカン約１０ｇ／ｋｇ
（飼料）であることができる。硬骨魚類綱および甲殻類
亜門の水性動物に適当な飼料は当該技術分野で周知であ
る。
【００３４】特定の場合に実際的に好ましいグルカンの
量は、処方される特定の組成物、用途の方式および治療
される特定の部位および生物によって変化するものであ
ると理解される。所定の宿主のための投与量は、通常の
考察を用いて、例えばグルカンおよび既知の薬剤につい
ての、例えば適当な通常の薬理学的プロトコルによる示
差活性の慣例的比較によって決定することができる。グ
ルカンの投与後、免疫刺激作用が最初に観察される前に
猶予が生じることがある。したがって、疾病耐性はただ
ちに増大しなくてもよいが、しかしながら、投与して１
４日以内に免疫刺激作用が観察されると考えられる。グ
ルカンを経口飼養によって投与した場合、更に、若干の
猶予が観察されるが、しかしながら、グルカンで飼養し
て約２１日後に、増大した疾病耐性が証明される必要が
ある。グルカンを一日または半日基準の飼料で与える限
り、増大した耐性は持続しなければならない。グルカン
の供給を中止した後にも、疾病に対する増大した耐性が
持続する必要があるとしても、その期間はグルカンの投
与量／ｋｇ（生物量）および供給期間に関係する。
【００３５】下記の一連の実施例を例示の目的で示す
が、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【００３６】
【実施例Ｉ】この実施例で、本発明の実施で利用するの
に適当な免疫刺激性グルカンを得るのに用いたプロトコ
ルを提供する。
【００３７】乾燥ビール酵母菌５００ｇを６重量％Ｎａ
ＯＨ水溶液３リットル中に懸濁させた。次に、この懸濁
液を室温で一晩中撹拌した。撹拌後、懸濁液を２０００
×ｇで２５分間遠心分離した。上澄みを捨てた後、不溶
性残留物を３％ＮａＯＨ３リッル中に再懸濁させ、７５
℃で３時間インキュベートし、続いて、懸濁液を一晩中
冷却した。次に、懸濁液を２０００×ｇで２５分間遠心
分離し且つ上澄みを傾瀉した。次に、残留物を３％Ｎａ
ＯＨ中に再懸濁させ、加熱し、そして前記に記載したよ
うに遠心分離した。
【００３８】次に、残留する不溶性残留物を酢酸でｐＨ
４．５に調整した。次に、不溶性残留物を逐次的に水２
リットルで３回洗浄し、各洗浄後に２０００×ｇで２５
分間遠心分離することによって回収した（上澄みを注ぎ
出した）。次に、残留物を０．５モル酢酸水３リットル
中に懸濁させた。懸濁液を９０℃で３時間加熱した。次
に、懸濁液を室温まで冷却した。冷却後、不溶性残留物
を２０００×ｇで２５分間遠心分離することによって採
取した。この（ｐＨ４．５に調整することから冷却した
残留物を採取することまでの）処理を７回繰り返した。
【００３９】次に、不溶性残留物を蒸留水３リットル中
に懸濁させ、１００℃で３０分間撹拌した後、冷却し、
そして２０００×ｇで２５分間遠心分離した。上澄みを
捨てた。不溶性残留物をこの方法で４回洗浄した。次
に、残留物をエタノール２リットル中に懸濁させ、７８
℃で２時間加熱した。このエタノールでの洗浄を４回繰
り返した。次に、残留物を蒸留水３リットルを用いて室
温で４回洗浄してエタノールの痕跡を全て除去した。
【００４０】
【実施例ＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（Ａｔｌａｎｔｉｃ
ｓａｌｍｏｎ）（サルモ・サラル；Ｓａｌｍｏｓａｌ
ａｒ）の、せつ症（ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｓｉｓ）（アエ
ロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌ
ｍｏｎｉｃｉｄａ）亜種サルモニシダ）に対する耐性を
増大させる場合の予防薬としてのＭ−グルカンの有効性
を実証する。
【００４１】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保
持された）。第一群のサケ６０匹に乾燥飼料を一日当り
魚重量の１％の比率で与えた。そのサケ用飼料にはＭ−
グルカンが１ｇ／ｋｇ（乾燥物質）含まれていた。サケ
は、せつ症に暴露される前の１２週間の間この飼料で飼
養された。同様に、対照群である他の６０匹のサケに、
Ｍ−グルカンを含まないサケ用飼料を１２週間与えた。
１２週間の期間の最後に、２群のサケを同一のタンクに
一緒にプールし、魚１匹当りにアエロモナス・サルモニ
シダ亜種サルモニシダを１×１０３個含む食塩水０．１
ｍｌを腹腔内注射することによって感染した多数のサケ
を導入することによってせつ症に暴露した。導入されて
同居している感染した魚の数はタンク中の全魚数の１０
％（魚１２匹）に相当した。サケの群を混合した後の飼
料は、対照飼料から成るものであった。
【００４２】図１に、試験期間中を通しての致死率百分
率を示す。Ｍ−グルカンを与えられたサケの最終致死率
百分率は、対照のサケよりも少ない約３３％であった。
Ｍ−グルカンを与えられたサケでの減少した致死率百分
率は、Ｍ−グルカンが、せつ症（アエロモナス・サルモ
ニシダ亜種サルモニシダ）に対する硬骨魚類綱の魚用予
防薬として有効であることを実証している。更に、この
実施例により、Ｍ−グルカンが疾病に対する予防薬とし
て水中用飼料で有効に利用することができるということ
が実証される。
【００４３】
【実施例ＩＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具
体的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラ
ル）の、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ（Ｖ
ｉｂｒｉｏｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ））に対する耐性を
増大させる場合の予防薬としてのＭ−グルカンの有効性
を実証する。
【００４４】魚１匹当りの平均重量３０ｇのアトランテ
ィックサーモンを地元の二年子のサケの生産者から入手
した。そのサケを、空気を通した淡水が供給される２０
０リットルのフロースルータンクで飼養した（約９〜１
０℃で保持された）。７０日目に水を交換して、周囲温
度（約９〜１０℃）の空気を通した海水にした。その海
水は、当時冷水ビブリオ症が発生していた近くの商業用
サケ養殖場からポンプで給水することによって集められ
た。最初の３分の１の無作為に抽出された群のサケ５０
匹に、市販の乾燥ペレットを一日当り体重の１％の比率
で与えた。その乾燥飼料にはＭ−グルカンが１ｇ／ｋｇ
（飼料）含まれていた。同様に、次の３分の１の無作為
に抽出された対照群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカンを含
まない同じサケ用飼料を与えた。
【００４５】図２に、実験開始から７０日目に海水によ
って導入された冷水ビブリオ症の自然感染によって引き
起こされた双方の飼養方法についてのプールされた致死
率百分率を示す。それらの飼料中にＭ−グルカンが与え
られたサケの致死率百分率は、Ｍ−グルカンなしの対照
のサケと比べて有意に減少した。この実施例は、Ｍ−グ
ルカンが冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に
対する硬骨魚類綱の魚の耐性を増大させることを実証し
ている。更に、この実施例で、Ｍ−グルカンが疾病に対
する予防薬として水中用飼料で有効に利用することがで
きるということが実証される。
【００４６】
【実施例ＩＶ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、古典的ビブリオ症（ビブリオ・アンギラルム（Ｖｉ
ｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）血細型０１）に対
する耐性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グルカ
ンの有効性を実証する。
【００４７】魚１匹当りの平均重量３０ｇのアトランテ
ィックサーモンを地元の二年子のサケの生産者から入手
した。そのサケを、空気を通した淡水２００リットルが
入るフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保持さ
れた）。第一群のサケ４０匹に、Ｍ−グルカン１ｇ／ｋ
ｇ（飼料）を含む乾燥飼料を一日当り体重の１％の比率
で５週間与えた。対照群のサケ４０匹に、Ｍ−グルカン
を含まない対照飼料を同じ比率で５週間与えた。５週間
の最後に、二つの群を一つのタンクおよび槽に一緒にプ
ールし、ビブリオ・アンギラルム０１を１×１０６個／
ｍｌ含む海水中で４５分間感染させた。
【００４８】図３に、試験期間中を通しての致死率百分
率を示す。Ｍ−グルカンを与えられたサケの最終致死率
百分率は約１５％であったが、対照群での致死率は約８
５％であった。Ｍ−グルカンを与えられたサケの減少し
た致死率百分率は、Ｍ−グルカンが、ビブリオ症（ビブ
リオ・アンギラルム血細型０１）に対する硬骨魚類綱の
魚用予防薬として有効であることを実証している。更
に、この実施例により、Ｍ−グルカンが疾病に対する予
防薬として水中用飼料で有効に利用することができると
いうことが実証される。
【００４９】
【実施例Ｖ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体的
には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、ビブリオ症（ビブリオ・アンギラルム血細型０１）
に対する耐性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グ
ルカンの有効性を実証する。
【００５０】魚１匹当りの平均重量２０ｇのアトランテ
ィックサーモンを地元の二年子のサケの生産者から入手
した。そのサケを、空気を通した淡水２００リットルが
入るフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保持さ
れた）。第一群のサケ４０匹に、Ｍ−グルカン２ｍｇを
含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に注射し
た。対照群のサケ４０匹に、等張食塩水０．２ｍｌを腹
腔内に注射した。双方の群のサケを、実験期間中を通し
て市販の乾燥ペレットで飼養した。
【００５１】注射して３週間後に、双方の群のサケに、
サケ１匹当りビブリオ・アンギラルム血細型０１生菌細
胞５×１０４個を腹腔内に注射することによって感染さ
せた。図４に、対照群および（Ｍ−グルカンを与えられ
た）第一群の致死率百分率の比較を示す。４図から分か
るように、Ｍ−グルカンを腹腔内注射によって与えられ
た第一群の致死率百分率が有意に減少（約４５％）して
いる。Ｍ−グルカンで処置されたサケでの減少した致死
率百分率は、Ｍ−グルカンが、古典的ビブリオ症に対す
る有効な予防薬であることを実証している。更に、この
データにより、Ｍ−グルカンを注射によって有効に投与
することができるということが実証される。
【００５２】
【実施例ＶＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、エンテリックレッドマウス病（ｅｎｔｅｒｉｃ ｒ
ｅｄｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ）（エルジニア・ルッ
ケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ））に対する
耐性を増大させる場合の予防薬としてのＭ−グルカンの
有効性を実証する。
【００５３】魚１匹当りの平均重量２０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水を２００リットルのフ
ロースルータンクで飼養した（約１２℃で保持され
た）。第一群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカン２ｍｇを含
む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に注射した。
対照群のサケに、等張食塩水のみを含む溶液０．２ｍｌ
を注射した。双方の群のサケを、実験期間中を通して市
販の乾燥ペレットで飼養した。３週間後に、双方の群の
サケに、サケ１匹当りエルジニア・ルッケリ生菌細胞１
０４個を腹腔内に注射することによって感染させた。
【００５４】図５に、双方の群のサケの致死率百分率を
示す。累積した致死率百分率から分かるように、Ｍ−グ
ルカンを与えられた群の致死率は、等張食塩水のみを与
えられた対照群に比べて低い約２０％であった。これら
の結果は、Ｍ−グルカンがエンテリックレッドマウス病
に対する有効な予防薬であることを実証している。更
に、このデータにより、Ｍ−グルカンを注射によって有
効に投与することができるということが実証される。
【００５５】
【実施例ＶＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具
体的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラ
ル）の、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に
対する耐性を増大させる場合のＭ−グルカンおよびＤ，
Ｌ−グルカンの予防薬としての有効性を比較する。
【００５６】魚１匹当りの平均重量２０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約９〜１０℃
で保持された）。第一群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカン
２ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に
注射した。
【００５７】第二群のサケ５０匹に、Ｄ，Ｌ−グルカン
２ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に
注射した。Ｄ，Ｌ−グルカンはディルツィオ（Ｄｉｕｚ
ｉｏ）によってＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２４：７７
３〜７７９（１９７９）に記載された方法にしたがって
ビール酵母菌細胞から調製された。対照群のサケに、等
張食塩水０．２ｍｌを注射した。三つの群をいずれも、
実験期間中を通して市販の乾燥ペレットで飼養した。３
週間後に、３群のサケ全部に、魚１匹当りビブリオ・サ
ルモニシダ生菌細胞５×１０５個を腹腔内に注射するこ
とによって感染させた。
【００５８】図６に、各群の致死率百分率を示す。対照
群の最終致死率百分率は約９６％であった。Ｄ，Ｌ−グ
ルカンで処置した群のサケの最終致死率は約７５％であ
った。Ｍ−グルカンで処置した群のサケの最終致死率は
約３０％であった。図６から分かるように、グルカンは
アトランティックサーモンの疾病に対する耐性を未処置
群と比べて増加させる。更に、Ｍ−グルカンが疾病に対
する耐性をＤ，Ｌ−グルカンに比べて有意に増加させて
いるということも明らかである。
【００５９】
【実施例ＶＩＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、
具体的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラ
ル）の、せつ症（アエロモナス・サルモニシダ亜種サル
モニシダ）に対する耐性を増大させるワクチンとの補助
薬としてのＭ−グルカンの有効性を実証する。
【００６０】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約９〜１０℃
で保持された）。第一群のサケ５０匹に、Ｍ−グルカン
０．５ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔
内に注射した。第二群のサケ５０匹に、ノルウェイ、ト
ロムソにあるアポテカーネス・ラボラトリウム・エイ・
エス（Ａｐｏｔｈｅｋｅｒｎｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｕｍ Ａ．Ｓ．）から商業的に入手したせつ症ワクチ
ンを腹腔内に注射した。第三群のサケ５０匹に、Ｍ−グ
ルカン０．５ｍｇを含む懸濁液０．２ｍｌおよびせつ症
ワクチンを腹腔内に注射した。対照群のサケ５０匹に等
張食塩水０．２ｍｌを腹腔内に注射した。注射して３か
月後に、生育しているサケの総数の１０％に相当するせ
つ症に感染したサケの群を導入することによって、４群
全部をせつ症に感染させた。魚は実験の間中、市販の乾
燥ペレットで飼養した。サケの群はいずれも、せつ症に
感染した同居している魚に暴露された後、同じタンクで
飼養された。
【００６１】図７に、試験期間の致死率百分率を示す。
食塩水で処置された魚の最終致死率百分率は約４２％で
あった。ワクチンで処置された魚の最終致死率百分率は
約３８％であった。Ｍ−グルカンで処置された魚の最終
致死率百分率は２８％であった。Ｍ−グルカンおよびワ
クチンの組合わせで処置された魚の最終致死率は２０％
であった。データから分かるように、Ｍ−グルカンとせ
つ症ワクチンとの組合わせはせつ症に対するサケの耐性
を増大させる最も有効な手段である。これらの結果によ
り、Ｍ−グルカンは、それ以後の感染に対する耐性を増
大させるための市販のワクチンとの補助薬として有効に
用いることができると実証される。
【００６２】
【実施例ＩＸ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に対す
る耐性を増大させるワクチンとの補助薬としてのＭ−グ
ルカンの有効性を実証する。魚１匹当りの平均重量３０
ｇの二年子前のアトランティックサーモンを地元の二年
子のサケの生産者から入手し、空気を通した淡水が供給
される２００リットルのフロースルータンクて飼養した
（約８〜１０℃で保持された）。一群のサケ１５０匹
に、グルカンを強化した（１ｇ／ｋｇ（飼料））市販の
乾燥ペレットを４週間与えた。他の２群のサケ１５０匹
ずつに、グルカンを含まない市販の乾燥ペレットを与え
た。飼養して４週間後に、グルカンを与えた群およびグ
ルカンを与えなかった群の一方に、冷水ビブリオ症（ビ
ブリオ・サルモニシダ）に対するワクチンでディップワ
クチン接種した。ワクチンはノルウェイ、ベルゲンのノ
ルビオ・エイ・エス（Ｎｏｒｂｉｏ Ａ／Ｓ）社から商
業的に提供された。第三群のサケはワクチン接種せずに
残した。更に６週間後に、３群全部の魚に、ビブリオ・
サルモニシダ細菌細胞１×１０６個を腹腔内注射するこ
とによって感染させた。
【００６３】ワクチン接種前にグルカンを４週間与えた
魚１５０匹の群の感染後の最終致死率は１０％であっ
た。グルカンを与えられずにワクチン接種された群の最
終致死率は４４％であった。グルカンを与えられずワク
チン接種されなかった群の最終致死率は８３％であっ
た。このデータは、水性動物、特にサケにおいて、グル
カンが飼料で投与された場合にも市販のワクチンとの補
助薬として有効であることを示している。
【００６４】
【実施例Ｘ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体的
には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、古典的ビブリオ症のビブリオ・アンギラルム血細型
０１に対する耐性を増大させるワクチンとの補助薬とし
てのＭ−グルカンの有効性を実証する。
【００６５】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約１２℃で保
持された）。第一群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン１．０
ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔内に注
射した。第二群のサケ８匹に、ノルウェイ、ベルゲンに
あるノルビオ・エイ・エス（Ｎｏｒｂｉｏ Ａ．Ｓ．）
から商業的に入手した古典的ビブリオ症ワクチン（ビブ
リオ・アンギラルム血細型０１）を腹腔内に注射した。
第三群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン１．０ｍｇを含む懸
濁液０．２ｍｌおよびビブリオ症ワクチンを腹腔内に注
射した。対照群のサケ８匹に等張食塩水０．２ｍｌを腹
腔内に注射した。魚は実験の間中、市販の乾燥ペレット
で飼養された。サケの群はいずれも同一のタンク中で飼
養された。注射して６週間後に、全部の魚を頭部で撲殺
し、尾部の血管から脱血させた。ビブリオ・アンギラル
ム血細型０１に対する特異的血清抗体濃度をエライザ法
によって測定した。
【００６６】図８に、Ｍ−グルカン、古典的ビブリオ症
（ビブリオ・アンギラルム血細型０１）に対するワクチ
ン、Ｍ−グルカンおよびビブリオ症に対するワクチン、
または対照の食塩水で処置したアトランティックサーモ
ン血清での特異的抗体濃度を示す。そのデータは、グル
カンがワクチンに対する特異的抗体濃度を極めて有意に
（Ｐ＝０．００１５）増加させることを示している。
【００６７】これらの結果により、Ｍ−グルカンは、そ
れ以後の感染に対する魚の耐性を増大させるための市販
のワクチンとの補助薬として有効に用いることができる
ということが実証される。
【００６８】
【実施例ＸＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具体
的には、アトランティックサーモン（サルモ・サラル）
の、冷水ビブリオ症のビブリオ・サルモニシダに対する
耐性を増大させるワクチンとの補助薬としてのＭ−グル
カンの有効性を実証する。
【００６９】魚１匹当りの平均重量３０ｇの二年子前の
アトランティックサーモンを地元の二年子のサケの生産
者から入手し、空気を通した淡水が供給される２００リ
ットルのフロースルータンクで飼養した（約８〜１０℃
で保持された）。第一群のサケ８匹に、Ｍ−グルカン
１．０ｍｇを含む等張食塩水中懸濁液０．２ｍｌを腹腔
内に注射した。第二群のサケ１０匹に、ノルウェイ、ベ
ルゲンにあるノルビオ・エイ・エスから商業的に入手し
た冷水ビブリオ症ワクチン（ビブリオ・サルモニシダ）
を腹腔内に注射した。第三群のサケ８匹に、Ｍ−グルカ
ン１．０ｍｇを含む懸濁液０．２ｍｌおよびビブリオ症
ワクチンを腹腔内に注射した。対照群のサケ１０匹に等
張食塩水０．２ｍｌを腹腔内に注射した。魚は実験の間
中、市販の乾燥ペレットで飼養された。
【００７０】サケの群はいずれも同一のタンク中で飼養
された。注射して１０週間後に、全部の魚を頭部で撲殺
し、尾部の血管から脱血させた。ビブリオ・サルモニシ
ダに対する特異的血清抗体濃度をエライザ法によって測
定した。
【００７１】図９に、Ｍ−グルカン、冷水ビブリオ症
（ビブリオ・サルモニシダ）に対するワクチン、Ｍ−グ
ルカンおよび冷水ビブリオ症に対するワクチン、または
対照の食塩水で処置したアトランティックサーモン血清
での特異的抗体濃度を示す。そのデータは、グルカンが
ワクチンに対する特異的抗体濃度を有意に（Ｐ＝０．０
４）増加させることを示している。
【００７２】これらの結果により、Ｍ−グルカンは、そ
れ以後の感染に対する魚の耐性を増大させるための市販
のワクチンとの補助薬として有効に用いることができる
ということが実証される。
【００７３】
【実施例ＸＩＩ】この実施例で、硬骨魚類綱の魚類、具
体的には、アトランティックサーモンでのＭ−グルカン
によって得られた相対百分率防御を実証する。表２のデ
ータは、表２に示した変更と一緒に実施例ＩＩ〜ＶＩＩ
Ｉでの方法と同様の方法を用いて集められた。
【００７４】表２から分かるように、Ｍ−グルカンは、
硬骨魚類綱の魚類、具体的には、サケに、種々の疾病対
する有意の防御を提供する。
【００７５】
【００７６】
【００７７】表２の説明 （ａ）食塩水０．２ｍｌ中に懸濁した表示量のＭ−グル
カンを魚にそれぞれ腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。対照
の魚には、食塩水０．２ｍｌを腹腔内注射した。１〜８
週間後に、細菌性病原体の腹腔内注射によって魚を感染
させた。魚１匹当りの投与量を括弧で示す。各実験にお
いて、致死率が横ばいになった場合、すなわち、実験１
での接種後４０日；実験２、３、４、５、６および１２
での接種後２０日；実験７および８での接種後２５日；
および実験９、１０、１１および１２での接種後１３日
で各群の全致死率を合計した。相対百分率防御（ＲＰ
Ｐ）を下記の式によって定義する。
【００７８】
【００７９】（ｂ）実験７および８において、グルカン
注射後４週間目に、魚にそれぞれ、ビブリオ・アンギラ
ルム血細型０１を８×１０３個および７×１０４個で感
染させた。致死が生じなかった場合、グルカン注射後８
週間目に魚を再度感染させた。
【００８０】
【実施例ＸＩＩＩ】この実施例で、甲殻類亜門の甲殻類
動物、具体的にはジャイアントタイガーシュリンプ（Ｇ
ｉａｎｔ ｔｉｇｅｒ ｓｈｒｉｍｐ）（ペネウス・モ
ノドン）の疾病対する耐性を増大させる場合の予防薬と
してのＭ−グルカンの有効性を実証する。
【００８１】ジュベニル（Ｊｕｖｅｎｉｌ）ジャイアン
トタイガーシュリンプ（ペネウス・モノドン）を、フロ
ースルーシステムでの滅菌した海水が供給される６個の
ガラス繊維製タンクそれぞれに、２００ＰＬ５０の密度
まで貯蔵した。小エビには、日昼の時間は自動飼養装置
によって連続的に、市販の子エビ用飼料（３個のタン
ク）かまたはビール酵母菌からのグルカン５ｇ／ｋｇ
（飼料）で強化した市販の飼料を与えた。小エビを５週
間飼養した後、商業用小エビ養殖場からの瀕死の小エビ
の海水中ホモゲネートを各タンクに加えることによっ
て、それらを感染させた。この種の小エビはウイルスの
キャリアであり且つ二次感染の混合フローラであった
（例えば、ビブリオ・ハレンジイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａ
ｒｅｎｇｉｉ）およびビブリオ・パラヘモリティエンス
（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｅｎ
ｓ））。各タンク中の小エビの数を７週間後に記録し
た。そのデータにより、対照群での７週間の間の全致死
率は８０％であり、グルカンを強化した飼料を与えた群
では５０％であることが示された。
【００８２】これらのデータにより、水産養殖において
小エビの生存数を増大させる場合の予防薬として経口に
よって投与されたＭ−グルカンの有効性が実証される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍ−グルカンまたは対照飼料で飼養されたアト
ランティックサーモンでのせつ症（アエロモナス・サル
モニシダ亜種サルモニシダ）に感染後の累積致死率を示
すグラフである。
【図２】Ｍ−グルカンまたは対照飼料で飼養されたアト
ランティックサーモンでの冷水ビブリオ症（ビブリオ・
サルモニシダ）に感染後の累積致死率を示すグラフであ
る。
【図３】Ｍ−グルカンまたは対照飼料で飼養されたアト
ランティックサーモンでの古典的ビブリオ症（ビブリオ
・アンギラルム血細型０１）に感染後の累積致死率を示
すグラフである。
【図４】Ｍ−グルカンまたは対照の食塩水で処置された
アトランティックサーモンでの古典的ビブリオ症（ビブ
リオ・アンギラルム血細型０１）に感染後の累積致死率
を示すグラフである。
【図５】Ｍ−グルカンまたは対照の食塩水で処置された
アトランティックサーモンでのレッドマウス病（エルジ
ニア・ルッケリ）に感染後の累積致死率を示すグラフで
ある。
【図６】Ｍ−グルカン、Ｄ，Ｌ−グルカンまたは対照の
食塩水で処置されたアトランティックサーモンでの冷水
ビブリオ症（ビブリオ・サルモニシダ）に感染後の累積
致死率を示すグラフである。
【図７】Ｍ−グルカン、せつ症用ワクチン、Ｍ−グルカ
ンおよびせつ症用ワクチン、または対照の食塩水で処置
されたアトランティックサーモンでのせつ症（アエロモ
ナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ）に感染後の累積
致死率を示すグラフである。
【図８】Ｍ−グルカン、古典的ビブリオ症（ビブリオ・
アンギラルム血細型０１）に対するワクチン、Ｍ−グル
カンおよびビブリオ症に対するワクチン、または対照の
食塩水で処置されたアトランティックサーモンでの特異
的抗体濃度を示すグラフである。
【図９】Ｍ−グルカン、冷水ビブリオ症（ビブリオ・サ
ルモニシダ）に対するワクチン、Ｍ−グルカンおよび冷
水ビブリオ症に対するワクチン、または対照の食塩水で
処置されたアトランティックサーモンでの特異的抗体濃
度を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/715 ＡＥＲ Ａ６１Ｋ 31/715 ＡＥＲ ＡＦＤ ＡＦＤ 39/39 39/39 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:84） (73)特許権者 595009475 Ｓｔｒａｎｄｇｔ ３，9008 Ｔｒｏｍ ｓｏ，Ｎｏｒｗａｙ (72)発明者 ヤン・ラー ノルウェー王国 エヌ−9000 トロム, バンセスティーエン ７ (56)参考文献 特開 平２−256620（ＪＰ，Ａ) 特公 昭61−20561（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭63−37801（ＪＰ，Ｂ２) 1989年８月28日から９月１日の間、鳥 羽市で開催された「魚の養殖と栄養摂取 に関する第３回国際シンポジュウムの予 稿集、「024ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＮＯＮ−ＳＰＥＣＩＦＩ Ｃ ＤＩＳＥＡＳＥ ＲＥＳＩＳＴＡＮ ＣＥ ＩＮ ＳＡＬＭＯＮ ＢＹ Ｍ− ＧＬＵＣＡＮ」 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 19/04 C08B 37/00

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 主としてβ−１，３−グリコシド結合に
    よって結合したグルコピラノース単位から成り、そこか
    らβ−１，６−グリコシド結合によって結合したグルコ
    ピラノース単位の少なくとも１個の分枝を有する酵母グ
    ルカンの製造方法であって、 （ａ）適当なグルカン含有酵母細胞を適当な抽出用アル
    カリ水溶液を用いて適当な条件下でアルカリ抽出して第
    一の不溶性酵母残留物を与え； （ｂ）前記の第一の不溶性酵母残留物を適当な抽出用ア
    ルカリ水溶液を用いて適当な抽出条件下で熱アルカリ抽
    出し、その熱アルカリ抽出を少なくとも２回行なって第
    二の不溶性酵母残留物を与え且つ各熱アルカリ抽出後の
    不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｃ）前記の第二の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
    水を用いて約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＨで洗浄する
    ことによって第三の不溶性酵母残留物を与え且つ前記の
    洗浄後の第三の不溶性酵母残留物を回収し； （ｄ）前記の第三の不溶性酵母残留物を適当な加水分解
    性酸によって適当な加水分解条件下で加水分解し、その
    酸加水分解を少なくとも３回行なって第四の不溶性酵母
    残留物を与え且つ各酸加水分解後の不溶性酵母残留物を
    回収し；次に、 （ｅ）前記の第四の不溶性酵母残留物を適当な条件下水
    中で沸騰させ、前記の第四の不溶性酵母残留物の沸騰を
    少なくとも２回行なって第五の不溶性酵母残留物を与え
    且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物を回収し；そして （ｆ）前記の第五の不溶性酵母残留物を適当な条件下エ
    タノール中で沸騰させ、前記の第五の不溶性酵母残留物
    のエタノール中での沸騰を少なくとも２回行なって第六
    の不溶性酵母残留物を与え且つ各沸騰後の不溶性酵母残
    留物を回収し；次に、 （ｇ）前記の第六の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
    水で洗浄し、前記の洗浄した第六の不溶性酵母残留物の
    洗浄を少なくとも２回行なって酵母グルカンを与え且つ
    各洗浄後の不溶性酵母残留物を回収すること； から成る製造方法。
  2. 【請求項２】 主としてβ−１，３−グリコシド結合に
    よって結合したグルコピラノース単位から成り、そこか
    らβ−１，６−グリコシド結合によって結合したグルコ
    ピラノース単位の少なくとも１個の分枝を有する酵母グ
    ルカンの製造方法であって、 （ａ）ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
    ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジタ・ウティリス（Ｃａｎ
    ｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）およびピキア・パストリス
    （Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選
    択される適当なグルカン含有酵母を適当な抽出用アルカ
    リ水溶液を用いて適当な条件下でアルカリ抽出して第一
    の不溶性酵母残留物を与え； （ｂ）前記の第一の不溶性酵母残留物を、ＮａＯＨ、Ｋ
    ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＮａ２ＣＯ３から成る群よ
    り選択される適当な抽出用アルカリ水溶液を用いて適当
    な抽出条件下で熱アルカリ抽出し、その熱アルカリ抽出
    を約２回〜約５回の範囲で行なって第二の不溶性酵母残
    留物を与え且つ各熱アルカリ抽出後の不溶性酵母残留物
    を回収し； （ｃ）前記の第二の不溶性酵母残留物を適当な条件下で
    水を用いて約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＨで洗浄する
    ことによって第三の不溶性酵母残留物を与え且つ各洗浄
    後の不溶性酵母残留物を回収し； （ｄ）前記の第三の不溶性酵母残留物を、酢酸、トリフ
    ルオロ酢酸、塩酸、リン酸および硫酸から成る群より選
    択される適当な加水分解性酸によって適当な加水分解条
    件下で加水分解し、その加水分解を約３回〜約１０回の
    範囲で行なって第四の不溶性酵母残留物を与え且つ各酸
    加水分解後の不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｅ）前記の第四の不溶性酵母残留物を適当な条件下水
    中で沸騰させ、前記の第四の不溶性酵母残留物の沸騰を
    約２回〜約６回の範囲で行なって第五の不溶性酵母残留
    物を与え且つ各沸騰後の不溶性酵母残留物を回収し；そ
    して （ｆ）前記の第五の不溶性酵母残留物を適当な条件下エ
    タノール中で沸騰させ、前記の沸騰させた第五の酵母残
    留物のエタノール中での沸騰を約２回〜約６回の範囲で
    行なって第六の不溶性酵母残留物を与え且つ各沸騰後の
    不溶性酵母残留物を回収し；次に、 （ｇ）前記の第六の酵母残留物を適当な条件下で水で洗
    浄し、前記の第六の酵母残留物の洗浄を約２回〜約６回
    の範囲で行なって酵母グルカンを与え且つ各洗浄後の不
    溶性酵母残留物を回収すること； から成る製造方法。
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