CN101052383B - 用于溶酶体酶缺乏症的组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含含有β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子的提取的酵母细胞壁的组合物，其中所述有效负载分子和有效负载捕获分子可溶于相同的溶剂系统，其中所述有效负载分子补充缺陷的溶酶体酶的功能。本发明还提供制备和使用所述组合物的方法。

Description

用于溶酶体酶缺乏症的组合物和其用途
发明背景 
溶酶体贮积症(LSD)是大约50种遗传代谢疾病的组群，所述疾病是由特定的溶酶体酶、受体靶、激活蛋白、膜蛋白或运载体(transporter)的细胞缺乏造成的，所述缺乏导致溶酶体中酶底物的病原性累积，从而造成细胞和组织功能的损坏。Wilcox，W.R.，Lysosomal storage disorders：the need for better pediatricrecognition and comprehensive care.J Pediatr.2004May；144(5Suppl)：S3-14。在5,000个活产儿中，大约发生1例溶酶体贮积症，且所述疾病展示相当大的临床和生物化学异质性。尽管存在X连锁的两个实例MPS II和Fabry病，但大部分溶酶体贮积症主要是作为常染色体隐性遗传病症遗传的。 
溶酶体贮积症的程度和严重度依赖于积累的底物的类型和量，但几乎所有的病症都是进行性的。尽管一些病症只影响中枢神经系统或神经系统外的组织，但大多数病症同时具有中枢神经系统表现和全身性表现。许多患有溶酶体贮积症的患者死于婴儿期或儿童期，且存活至成人期的患者通常具有减少的寿命和严重的死亡率(Wilcox，2004)。下面的表1是按受影响的溶酶体功能列出的一些溶酶体贮积症的概述。 
高歇病是最普遍的溶酶体贮积症，其由于在所有组织中缺乏葡糖脑苷脂酶(GC；EC 3.2.1.45)造成。该酶的缺乏在网状内皮系统(包括肝脏、脾脏、肺和骨髓)的富脂巨噬细胞(lipid laden macrophage)(称为Gaucher细胞)中产生葡糖神经酰胺的积累。高歇病被分为三种主要表型：I型，非神经病变型)；2型，急性神经病变型和3型，亚急性神经病变型。I型高歇病的疾病严重度是不同的，其中儿童和成人可以是无症状的或可具有严重地使人虚弱的症状，包括骨退化 (skeletal degeneration)、贫血、血小板减少和肝脾大。症状可存在于任何年龄阶段，尽管在北欧犹太教徒人群(Ashkenazi Jewishpopulation)中I型高歇病更加普遍，但其在所有种族群体中都发生。2型(急性神经病变型)高歇病是快速进行性的，其中在6个月大小时，大部分2型的婴儿具有脑干功能障碍，且在18-24个月龄时死于并发症例如呼吸停止或吸入性肺炎。3型患者在比2型患者在较大年龄时发生神经异常；大部分只发生精细的水平生扫视性眼球运动缺陷(subtle horizontal saccadic eye movement defect)。1型和3型高歇病患者中的全身性并发症对酶治疗法有反应。 
表1 
受溶酶体功能影响的溶酶体贮积症 
(Wilcox，W.R.，J Pediatr.2004 May；144(5 Suppl)：S3-14) 
Figure S05837576420070509D000021
                      皮病(A型或B型)。 
多肽的不完全降解      致密性成骨不全症 
胆固醇、胆固醇酯或其  Leroid lipofuscinosis(具有不同缺乏的 
他复合酯的不完全降解  多种类型，一些仍然未知)、胆固醇酯沉积 
或转运缺陷            病、C型尼-皮克病、沃尔曼病 
多种溶酶体酶的缺乏    多种硫酸酯酶、半乳糖唾液酸沉积症 
                      (galactosialidosis)、II、III型粘多糖 
                      症 
转运和运输缺陷        胱氨酸病、粘多糖病IV、唾液酸贮积症、 
                      具有Marinesco- 
Figure S05837576420070509D000031
综合症的乳糜微 
                      粒贮积症、海-普二氏综合症(几种形式) 
                      和Danon病 
未知的缺陷            Geleophysic dysplasia、 
                      Marinesco- 
Figure S05837576420070509D000032
综合征 
FDA于1991首先批准了高歇病的酶替代疗法(ERT)。长期的ERT确实改善了大多高歇病患者的器官巨大症和血细胞计数。然而，目前的静脉内施用的GC酶制剂不改变2型患者的神经退化或显著地逆转骨骼并发症。为克服目前的用于高歇病的ERT的限制，我们提出使用新的技术，所述技术使用口服施用的包含由编码人葡糖脑苷脂酶的序列组成的DNA的精微的酵母细胞壁颗粒，从而更有效地递送正常的或修饰的GC酶至巨噬细胞。除了提高GC酶至所有组织的递送，我们预期该创新的方法将使骨中的巨噬细胞更有效和特异地吸收递送编码正常的或修饰的GC的DNA的颗粒。该方法可导致不能被目前的ERT显著地逆转的骨并发症的更大的好转。 
提取的酵母细胞壁颗粒是可容易获得的、可生物降解的、基本上为球形的直径大约2-4μm的颗粒。提取的酵母细胞壁颗粒的制备在本领域是已知的，且描述于例如美国专利4,992,540、5,082,936、 5,028,703、5,032,401、5,322,841、5,401,727、5,504,079、5,968,811、6,444,448 B1、6,476,003 B1、公开的美国申请2003/0216346 A1、2004/0014715 A1和PCT公开申请WO 02/12348 A2中。提取的酵母细胞壁颗粒的形式，称作“完全葡聚糖颗粒”，已被建议作为递送载体，但一直限制于通过活性组分从颗粒的简单扩散进行释放或通过颗粒基质的生物降解释放化学交联至所述完整的葡聚糖颗粒的试剂。参见美国专利5,032,401和5,607,677。 
提取的酵母细胞壁颗粒，主要归因于其β-葡聚糖内容物，被靶向吞噬细胞，例如巨噬细胞和淋巴组织的细胞。粘膜相关淋巴组织(MALT)在上皮和位于身体粘膜表面下的固有层中包含所有淋巴细胞。粘膜相关淋巴组织的主要位置是肠相关淋巴组织(GALT)和支气管相关淋巴组织(BALT)。 
GI免疫系统的另一个重要组分是M或微褶细胞。M细胞是肠上皮中位于淋巴样滤泡(lymphoid follicle)上的特殊细胞类型，其内吞多种蛋白和肽抗原。M细胞将这些蛋白转运至下层组织而不是降解其，在所述下层组织中其被该处的树突细胞和巨噬细胞吸收。 
M细胞通过内吞作用或吞噬作用吸收来自肠腔的分子和颗粒。然后将该物质在小囊泡中转运穿过细胞的内部至基底膜，在该处其被释放入细胞外空间。该过程称为胞转运作用。在其基底面，M细胞的细胞膜围绕下面的淋巴细胞和抗原呈递细胞产生大量皱折，所述淋巴细胞和抗原呈递细胞吸收从M细胞释放的转运物质并加工其以用于抗原呈递。 
研究已显示，派尔斑的M细胞进行的酵母颗粒(直径为3.4±0.8微米)的胞转运作用费时少于1小时(Beier，R.，& Gebert，A.，Kinetics of particle uptake in the domes of Peyer′s patches，Am J Physiol.1998 Jul；275(1 Pt 1)：G130-7)。由于无上皮内巨噬细胞的显著吞噬作用，酵母颗粒向下迁移并在2.5-4小时内穿过基底层，在该处其被快速地吞噬并转运出派尔斑的穹顶(dome)。已显示人鼻咽淋巴样组织(扁桃体和腺样组织)中发现的M细胞参与导致呼吸道感染的病毒的采样(sampling)。体外细胞模型的研究已显示荧光 标记的小球体(Fluospheres，0.2μm)和壳聚糖微颗粒(0.2μm)的吸收van der Lubben I.M.，等人，Transport of chitosanmicroparticles for mucosal vaccine delivery in a human具有Marinesco- 
Figure S05837576420070509D000051
综合症intestinal M-cell model，J Drug Target，2002Sep；10(6)：449-56。凝集素，荆豆凝集素1(Ulex europaeusagglutinin 1)(UEA1，对于α-L-岩藻糖残基是特异性的)已被用于将聚苯乙烯小球体(0.5μm)或聚合脂质体靶向M细胞(0.2μm)(Clark，M.A.，等人，Targeting polymerised liposome vaccine carriers tointestinal M cells，Vaccine.2001 Oct 12；20(1-2)：208-17)。小鼠内的体内研究已报导了，聚-D，L-乳酸(PDLLA)小球体或明胶小球体(GM)可被巨噬细胞和M细胞有效地吸收。(Nakase，H.，等人，Biodegradable microspheres targeting mucosalimmune-regulating cells：new approach for treatment ofinflammatory bowel disease，J Gastroenterol.2003 Mar；38Suppl15：59-62). 
然而，已报导合成的颗粒递送载体(包括聚(DL-丙交酯共乙交酯)小球体和脂质体的吸收是高度可变的，且由颗粒和M细胞两者的物理性质确定。Clark，M.A.，等人，Exploiting M cells for drug andvaccine delivery，Adv Drug Deliv Rev.2001 Aug23；50(1-2)：81-106。相同的研究报导，可通过用试剂包括合适的选择性地结合M细胞表面的凝集素、微生物粘附素和免疫球蛋白包被颗粒或脂质体来增强递送。也参见，Florence，A.T.，The oral absorptionof micro-and nanoparticulates：neither exceptional nor unusual，Pharm Res.1997 Mar；14(3)：259-66。 
病原体模式识别受体(PRR)识别存在于微生物表面上的共同的结构和分子基元且促成先天性免疫应答的诱导。甘露糖受体和β-葡聚糖受体部分地参与真菌病原体的识别。甘露糖受体(MR)，在巨噬细胞的亚型上表达的糖结合受体，被认为是一种该PRR。巨噬细胞具有甘露糖和甘露糖-6-磷酸的受体，所述受体可结合和内化展示这些糖的分子。 所述分子通过内吞作用被内化入前溶酶体内体。已通过使用用甘露糖-6磷酸修饰的牛血清白蛋白并通过二硫键将其连接至寡脱氧核苷酸的修饰的3’末端，来使用该内化作用增加寡核苷酸进入巨噬细胞；参见Bonfils，E.，等人，Nucl.Acids Res.1992 20，4621-4629。参见E.Bonfils，C.Mendes，A.C.Roche，M.Monsigny和P.Midoux，Bioconj.Chem.，3，277-284(1992)。巨噬细胞也表达β-葡聚糖受体，包括CR3(Ross，G.D.，J.A.Cain，B.L.Myones，S.L.Newman，和P.J.Lachmann.1987.Specificity of membrane complementreceptor type three(CR3)for β-glucans.Complement Inflamm.4：61)、dectin-1(Brown，G.D.and S.Gordon.2001.Immunerecognition.A new receptor for β-glucans.Nature 413：36.)和乳糖苷神经酰胺(Zimmerman JW，Lindermuth J，Fish PA，PalaceGP，Stevenson TT，DeMong DE.A novelcarbohydrate-glycosphinglipid interaction between abeta-(1-3)-glucan immunomodulator，PGG-glucan，andlactosylceramide of human leukocytes.J Biol Chem.1998 Aug21：273(34)：22014-20.)。β-葡聚糖受体CR3主要在单核细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞中表达，而dectin-1主要在巨噬细胞的表面表达。在M细胞中发现高水平的乳糖苷神经酰胺。小胶质细胞也可表达β-葡聚糖受体(Muller，C.D.，等人Functional beta-glucan receptorexpression by a microglial cell line，Res  Immunol.1994May；145(4)：267-75)。 
存在结合甘露糖和β-葡聚糖受体对吞噬作用的累加效应的证据。Giaimis等人报导了观察报告，该观察报告表明鼠类巨噬细胞样细胞系和鼠类腹膜驻留型巨噬细胞对非受调理素作用加热杀死的酵母(unopsonized heat-killed yeast)(S.cerevisiae)的吞噬作用受甘露糖和β-葡聚糖受体两者的介导。为获得非受调理素作用加热杀死的酵母的最大吞噬作用，需要甘露糖和β-葡聚糖受体的共表达(Giaimis，J.，等人，Both mannose and beta-glucan receptors are involved in phagocytosis of unopsonized，heat-killedSaccharomyces cerevisiae by murine macrophages，J Leukoc Biol.1993 Dec；54(6)：564-71)。 
发明概述 
可通过口服给药，使用本发明的的组合物和方法，通过缺陷基因的靶向巨噬细胞的表达来治疗溶酶体病。在优选的实施方案中，将表达溶酶体酶的基因DNA以阳离子聚合物-DNA纳米复合物的形式整合入酵母葡聚糖颗粒(YGP)和酵母葡聚糖-甘露聚糖颗粒(YGMP)中。通过糖受体对颗粒表面葡聚糖和甘露聚糖多糖的结合，这些YGP-DNA和YGMP-DNA微颗粒通过受体介导被组织、粘膜和肠道相关淋巴组织(GALT)巨噬细胞吸收，从而具有全身性、经粘膜和口服的生物利用度。当吞噬时，颗粒被吞入内体区室，在所述区室中阳离子聚合物释放DNA并使内体膨胀，从而释放DNA至细胞质中。赋形剂至YGP-DNA和YGMP-DNA制剂的整合有助于内体DNA释放和细胞核吸收。表达缺陷的蛋白的DNA的递送导致缺陷的蛋白的活性的补充，优选地恢复，并且催化有毒的积累的贮存产物的降解。 
在优选的实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包含提取的界定内部空间的酵母细胞壁和包含β-葡聚糖，优选地少于大约90％的重量的β-葡聚糖，更优选地大约6至90％的重量的β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子，其中所述有效负载分子和有效负载捕获分子可溶于相同的溶剂系统，其中所述有效负载分子补充缺失的、缺陷的或被抑制的基因或基因产物的功能。一般地，有效负载分子选自核酸、肽、蛋白和其混合物，并以有效地补充缺陷的溶酶体酶的功能的量存在于组合物中。在某些优选的实施方案中，所述提取的酵母细胞壁还包含甘露聚糖，优选地大于约为30％的重量的甘露聚糖，更优选地为大约30至90％的重量的甘露聚糖。在其他实施方案中，和其他颗粒类型相比，YCP颗粒具有显著更高的壳多糖+壳聚糖含量，优选地超过重量的50％，更优选地在大约50和75％的重量之间。在某些 实施方案中，所述核酸选自寡核苷酸、反义构建体、siRNA和酶RNA、重组DNA构建体和其混合物。在优选的实施方案中，所述重组DNA构建体是包含有效地连接至编码蛋白的开放阅读框架的控制元件的表达载体。一般地，由开放阅读框架编码的蛋白是结构蛋白、具有酶活性的蛋白、膜蛋白、DNA结合蛋白或信号转导蛋白或其功能性等同物。优选地，所述核酸包含补充不存在的、缺陷的或被抑制的基因的功能的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了使用组合物生产用于治疗溶酶体酶缺乏的药物组合物的用途。 
在某些优选的实施方案中，由所述开放阅读框架编码的蛋白是在具有遗传病症特别是溶酶体贮积症的受试者中产生治疗效果的蛋白。在特别优选的实施方案中，由所述开放阅读框架编码的蛋白是人葡糖脑苷脂酶或其功能性等同物。 
在其他实施方案中，本发明的组合物用于生产用于治疗溶酶体贮积症的药物。合适地，溶酶体贮积症是糖胺聚糖的不完全代谢、糖蛋白的聚糖部分的不完全降解、糖原的不完全降解、鞘脂类组分的不完全降解、多肽的不完全降解、胆固醇、胆固醇酯或其他复合酯的不完全降解或转运缺陷、多种溶酶体酶的缺乏、转运缺陷或细胞内运输缺陷。在优选的实施方案中，溶酶体贮积症是胡尔勒病、Scheie病、Hunter病、Sanfilippo病、莫尔基奥病、Maroteaux-Lamy病、Sly病、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰氨基葡糖尿(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷贮积病、甘露糖苷过多症、Schindler病、唾液酸贮积症I型、蓬佩病、法布里病、法伯病、高歇病1型、高歇病2型、高歇病3型、GM1神经节苷脂沉积症、GM2神经节苷沉积病例如泰-萨病或山德霍夫病、GM2激活物病、克拉伯病、异染色性脑白质障碍症、尼-皮病A型、尼-皮病B型、致密性成骨不全症、ceroid lipofuscinosis、胆固醇酯沉积病、尼-皮病C型、沃尔曼病、多种硫酸酯酶病、半乳糖唾液酸沉积症、粘多糖症II型、粘多糖症III型、胱氨酸病、粘多糖症IV、唾液酸贮积症、具有Marinesco- 
Figure S05837576420070509D000081
综合征、海-普二氏综合征、切-东综合征和Danon病的乳糜微粒滞留病、geleophysic dysplasia或Marinesco- 
Figure DEST_PATH_G200580037576401D00011
综合征。
在特别优选的实施方案中，重组DNA构建体是包含有效地连接至编码蛋白，优选地酶，更优选地溶酶体酶或其功能性等同物的开放阅读框架的控制元件的表达载体。在其他优选的实施方案中，重组DNA构建体是包含有效地连接至编码溶酶体酶激活物或其功能性等同物的开放阅读框架的控制元件的表达载体。在某些实施方案中，所述溶酶体酶激活物选自saposin A、saposin B、saposin C、saposin D和其混合物。在其它实施方案中，溶酶体酶激活物是GM2激活物蛋白(GM2AP)、或其他溶酶体酶蛋白激活物。 
在其它实施方案中，有效负载分子是蛋白，优选地是溶酶体酶或其功能性等同物。在其他实施方案中，有效负载分子是选自saposin A、saposin B、saposin C、saposin D、GM2激活物蛋白或其混合物的蛋白。 
在其他实施方案中，本发明提供了包含所述组合物和药物可接受的赋形剂的药物组合物。在优选的实施方案中，所述组合物适合用于口服施用。在其他优选的实施方案中，配制组合物用于胃肠外施用，最优选地皮下或肌内施用。在其他优选的实施方案中，配制组合物用于粘膜施用。 
本发明也提供了在细胞中弥补酶或其他蛋白缺乏的方法，其包括提供有效量的第一组合物(所述组合物包含含有β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子的提取的酵母细胞壁，其中所述有效负载分子是包含有效地连接至编码缺乏的蛋白或其功能性等同物的开放阅读框架的控制元件的表达载体)和将缺乏这样的蛋白或酶的细胞和所述第一组合物接触的步骤。可在体外或体内进行接触所述细胞的步骤。在优选的实施方案中，细胞通常通过吞噬作用内化所述第一组合物。所述方法还可包括提供有效量的第二组合物(所述组合物包含含有β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子的提取的酵母细胞壁，其中所述有效负载分子是包含有效地连接至编码缺乏的酶的激活物或其 功能性等同物的开放阅读框架的控制元件的表达载体)和将缺乏这些蛋白或酶的细胞和所述第二组合物接触的步骤。 
可合适地被治疗的细胞可以是巨噬细胞、派尔斑的M细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗氏细胞、Kupffer细胞、肺泡吞噬细胞、腹腹巨噬细胞、乳巨噬细胞(milk macrophage)、小神经胶质细胞、嗜伊红粒细胞、粒细胞、mesengial phagocyte或滑膜A细胞。 
在另一个方面，本发明提供了在细胞中弥补蛋白或酶缺乏的方法，其包括提供有效量的第一递送系统和将缺乏这样的酶或蛋白的细胞和所述第一组合物接触的步骤，所述第一递送系统包含界定内部空间的提取的酵母细胞壁，所述内部空间包含大约6至90％的重量的β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子，其中所述有效负载分子是包含有效地连接至编码缺乏的酶或其功能性等同物的开放阅读框架的控制元件的表达载体。可在体外或体内进行接触细胞的步骤。在优选的实施方案中，所述第一组合物一般通过吞噬作用被细胞内化。所述方法还可包括提供有效量的第二组合物和将缺乏这些酶或蛋白的细胞和所述第二组合物接触的步骤，所述第二组合物包含含有β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子的提取的酵母细胞壁，其中所述有效负载分子是以有效地补充缺乏的溶酶体酶的功能的量存在的具有缺乏的蛋白或酶的激活物的活性的蛋白。 
在其他实施方案中，本发明提供了治疗具有溶酶体贮积症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的第一组合物的步骤，所述第一组合物包含含有β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子的提取的酵母细胞壁，其中所述有效负载分子是包含有效地连接至编码缺陷溶酶体酶的开放阅读框架的控制元件的表达载体，其中所述有效负载分子以有效地补充缺乏的溶酶体酶的功能的量存在。所述方法也可包括施用有效量的第二组合物的步骤，所述第二组合物包含含有β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子的提取的酵母细胞壁，其中所述有效负载分子是包含有效地连接至编码缺乏的溶酶体酶的激活 物的开放阅读框架的控制元件的表达载体。可选择地，经肠胃外途径(皮下、皮内、或肌内或粘膜(皮肤，吸入)给受试者施用组合物。在优选的实施方案中，通过口服、皮下、肌内或通过吸入给受试者施用所述第一组合物。最优选地通过口服给受试者施用组合物。一般地，所述方法包括将吞噬细胞和第一组合物接触以及将吞噬细胞和第二组合物接触的步骤。在其他实施方案中，可通过给母亲施用组合物或通过将有效量的组合物放入羊水中来给子宫内的胎儿施用本发明的组合物。 
通过下列在附图中举例说明的系统和方法的优选的实施方案的更具体的描述将容易地理解微粒药物递送系统的上述特征和其他特征以及有利方面，在所述附图中，附图标记在不同的视图中表示相同部分。 
附图概述 
图1是酵母细胞壁的横截面的示意图100，从外到内显示，外纤维层110、外甘露糖蛋白层120、β-葡聚糖层130、β-葡聚糖-壳多糖层140、内甘露糖蛋白层150、质膜160和细胞质170。 
图2A是酵母细胞壁颗粒的结构的示意图；图2B是显示用伴刀豆球蛋白-A-FITC(con-A-异硫氰酸荧光素，Sigma Chemical，St.Louis，MO)对酵母细胞壁颗粒的甘露聚糖组分进行染色的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，其显示基本上完全染色的细胞壁颗粒210；图2C是YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖颗粒的结构示意图，图2D是显示YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖颗粒220的斑状con-A-FITC染色的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像；图2E是YGPβ葡聚糖颗粒的结构示意图，图2F是显示不存在con-A-FITC染色的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像。 
图3A是暴露于YGP颗粒的细胞(标示细胞310)的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述YGP颗粒载有荧光标记的pIRES质粒和作为阳离子捕获聚合物的PEI和作为阳离子去垢剂的CTAB，图3B是显示表示通过图3B中标示的相同细胞310内化的荧光YGP颗粒 的明亮染色的细胞的相同视野的彩色显微照片的反转对比(负)灰度图像。 
图4A是暴露于荧光标记的YGP颗粒的细胞例如标示的细胞410的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，图4B是细胞例如标示的细胞420的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞暴露于包含pIRES DNA、阳离子捕获聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和阳离子去垢剂十六烷基三甲基铵溴化物(也称作溴化十六烷基三甲铵或CTAB)的YGP颗粒(表达GFP)，图4C是细胞例如标示的细胞430的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞暴露于包含pIRES DNA、阳离子捕获聚合物壳聚糖和阳离子去垢剂CTAB的YGP颗粒(表达GFP。 
图5A是细胞例如标示的细胞510的组合光照和荧光的彩色显微照片的反转对比(负)灰度图，所述细胞暴露于荧光标记的YGP颗粒；图5B是荧光激活细胞分选术(FACS)研究结果的图解说明，所述研究显示了代表来自已内化荧光标记的YGP颗粒的细胞的信号分布的主峰520和代表来自无荧光标记的YGP颗粒的细胞的信号的分布的次峰530；图5C是细胞例如标示的细胞540的光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞暴露于包含荧光标记的DNA、阳离子捕获聚合物PEI和阳离子去垢剂CTAB的YGP颗粒；图5D是显示相同标示的细胞540的细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图，图5E是FACS研究结果的图解说明，其显示代表来自已内化具有荧光DNA有效负载的YGP颗粒的细胞的信号分布的主峰610和代表来自无YGP颗粒的细胞的信号分布的肩峰620；图5F是细胞例如标示的细胞710的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞和包含荧光反义RNA有效负载的YGP颗粒一起温育；图5G是显示相同标示的细胞710的细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像；图5H是细胞例如标示的细胞810的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞和包含荧光反义siRNA、PEI和CTAB的YGP颗粒一起温育，图5I是显示相同标示的细胞810的细胞的相同 视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞包含内化的具有荧光RNAi有效负载的YGP颗粒。 
图6A-6G是显示吸收包含pMFG-GC表达载体的酵母细胞壁颗粒和表达人葡糖脑苷脂酶(hGC)的J774鼠类巨噬细胞的彩色显微照片的灰度图像。将细胞暴露于YGP制剂或不对其进行处理(对照)，培养细胞，并用福尔马林固定粘附细胞。使用第一抗人GC抗体(兔子的抗血清)、合适的可检测的第二抗体(山羊抗兔FITC缀合的抗血清)就免疫细胞化学对固定的细胞进行处理，通过荧光显微镜和照相进行检查。图6A是J774细胞例如标示的细胞510的彩色透射光显微照片的灰度图像，所述细胞来自未处理的对照培养。图6B是显示缺少荧光标记的细胞的J774细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的灰度图像。图6C是显示细胞例如细胞912(包含荧光标记的颗粒)的J774细胞(其暴露于荧光标记的酵母细胞壁颗粒(YGP-F)的制剂)的组合光照和荧光的彩色显微照片的灰度图像。图6D和6E分别是J774细胞的相同视野的彩色透射光显微照片和彩色荧光照片的灰度图像，所述细胞暴露于包含pMFG-GC表达载体(YGP:pMFG-GC:PEI:CTAB)的酵母细胞壁颗粒的制剂，通过荧光标记的细胞例如细胞914中的免疫反应性显示人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。 
图6F和6G分别是J774细胞的相同视野的彩色透射光显微照片和彩色荧光显微照片的灰度图像，所述细胞暴露于包含pMFG-GC表达载体(YGP-CN:pMFG-GC:CTAB)的酵母细胞壁颗粒的制剂，通过荧光标记的细胞例如细胞916中的免疫反应性显示人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。 
图7A是暴露于荧光标记的酵母细胞壁颗粒(YGMP-F)的制剂的J774细胞的彩色透射光和荧光显微组合照片的灰度图像，其显示细胞例如细胞925(包含荧光标记的颗粒)和其他细胞例如细胞926(缺乏荧光标记的颗粒)。 
图7B是J774细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述细胞暴露于包含pIRES表达载体(YGMP-pIRES)的酵母细胞壁颗粒的制剂，该 图显示由荧光标记的细胞例如细胞927进行的绿色荧光蛋白(GFP)的表达。 
图7C是J774细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述细胞暴露于包含pMFG-GC表达载体(YGMP-MFG-GC)的酵母细胞壁颗粒的制剂，通过荧光标记的细胞例如细胞928中的免疫反应性显示人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。 
图8是方法的优选的实施方案的示意图，所述方法是在体内口服施用180后，通过巨噬细胞游走370将酵母β-葡聚糖颗粒(YGP)递送至不同器官450、452、454、456、458。给受试者185口服施用180包含酵母β-葡聚糖颗粒(YGP)230的组合物182。酵母β-葡聚糖颗粒(YGP)230被小肠衬里中的M细胞355吸收并被转运穿过上皮350和被小肠巨噬细胞360吞噬。包含YGP的巨噬细胞游走370至器官和组织(包括骨450、肺452、肝454、大脑456和脾458)。在口服施用后大约72小时，在脾458中观察到已吞噬YGP的脾巨噬细胞364(同时以示意图和以彩色荧光显微照片的反转对照灰度图像显示)。在口服施用后大约90小时，在骨450中观察到已吞噬YGP的骨髓巨噬细胞362(同时以示意图和以彩色荧光显微照片的反转对照灰度图像显示)。 
图9A和图9B是使用包含loxP的取代载体产生更长的生命期的高歇病小鼠模型的示意图解，所述载体携带L444P、R463C和N370S点突变。 
图10A-10D是从带有荧光标记的YGP颗粒的小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(图10A和图10C)和彩色荧光显微照片(图10B和图10D)的灰度图像。通过口服强饲法或皮下注射给小鼠(C57B1/6野生型和Gaucher突变小鼠)施用YGP-F和YGMP-F的等分(0.1ml)，显示无荧光巨噬细胞920和荧光巨噬细胞922、924。 
图11A-11D是从体内处理的小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图，所述图显示包含pIRES表达载体的酵母细胞壁颗粒的吸收和绿色荧光蛋白(GFP)的表达。将所述分离的细胞培养至适当的汇合度，用福尔马林固定粘附细胞，使用荧光显微镜和照相进行 检查。 
图11A是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠在体内接受PBS(对照处理)的口服强饲法，所述图像显示缺乏荧光巨噬细胞。 
图11B是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pIRES制剂的皮下注射，所述图像显示荧光巨噬细胞930。 
图11C是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pIRES制剂的口服给药，所述图像显示荧光巨噬细胞931。 
图11D是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pIRES制剂的口服给药，所述图像显示荧光巨噬细胞932。 
图12A-12M是从体内处理的小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的显微照片图像，其显示包含pMFG-GC表达载体的酵母细胞壁颗粒的吸收和人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。将所述分离的细胞培养至合适的汇合度，用福尔马林固定粘附细胞。使用第一抗人GC抗体(兔抗血清)、合适的可检测的第二抗体(山羊抗兔FITC缀合的血清)就免疫细胞化学对固定的细胞进行处理，使用荧光显微镜和照相进行检查。 
图12A是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片图像，所述野生型小鼠在体内接受PBS(对照处理)的口服强饲法，所述图像显示缺少表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞。 
图12B和12C是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(12B)和彩色荧光显微照片(12C)的图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的皮下注射，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染 色的巨噬细胞935。 
图12D是从L444P-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片图像，所述L444P-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的皮下注射，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞936。 
图12E是从R463C-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片图像，所述R463C-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的皮下注射，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞937。 
图12F和12G是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(12F)和彩色荧光显微照片(12G)的图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的口服给药，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞938。 
图12H和12I是从L444P-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(12H)和彩色荧光显微照片(12I)的图像，所述L444P-/-突变小鼠在体内接受30天的0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的口服给药处理，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞940。 
图12J是从R463C-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述R463C-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的口服给药，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞941。 
图12K是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pMFG-GC制剂的口服给药，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞942。 
图12L是从L444P-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述L444P-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pMFG-GC制剂的口服给药，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞943。
图12M是从R463C-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述R463C-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pMFG-GC制剂的口服给药，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞944。 
图13是来自研究的数据的图解表示，所述研究显示在本发明的优选的实施方案中在葡糖脑苷脂酶表达基因治疗后，在CBE处理的R463CGaucher小鼠中看到的增加的存活率。 
根据下列本发明的优选的实施方案(如附图中所举例说明的)中的更具体的描述可使本发明的上述和其他目的、特征和有利方面变得明显，在所述附图中，相同的附图标记在所有不同视图中表示相同部分。所述附图不必标上标度，而是强调举例说明本发明的原理。 
发明详述 
本发明提供了包含提取的酵母细胞壁的组合物，所述酵母细胞壁包含β-葡聚糖、有效负载捕获分子和有效负载分子，其中所述有效负载分子和有效负载捕获分子可溶于相同的溶剂系统，其中所述有效负载分子补充缺乏的溶酶体酶的功能。本发明还提供了制备和使用所述组合物的方法。 
有利地，本发明的组合物和方法固有地直接靶向巨噬细胞和补充溶酶体蛋白例如巨噬细胞中的酶的缺乏。通过口服或粘膜或胃肠外途径施用本发明的组合物以避免静脉内的酶或蛋白置换疗法的有害效果。通过提供表达载体而不是编码的蛋白本身来补充酶或蛋白的缺乏可以使抗原反应减少至最低或避免抗原反应。本发明的方法也可用于通过补充溶酶体酶激活物例如saposin C来使内源溶酶体酶的活性正常化。 
有利地，通过靶向巨噬细胞和其他吞噬细胞，本发明提供了将治疗系统递送至许多部位例如骨、肾、肺、胃肠道和大脑的方法。尽管不受特定理论束缚，但认为巨噬细胞和其他吞噬细胞向某一位置的迁移部分地受一种或多种刺激因素例如炎症、脂质或其他生理性巨噬细胞引诱剂确定。在该模型下，据认为任何特定组织中的携带本发明的组合物的吞噬细胞群体和其他组织中的相似群体处于动态平衡之中。因此，任何特定组织中的携带所述组合物的吞噬细胞群体，以及所述缺乏的内源性酶的补充可及时地响应(至少部分地响应)生理学作用而波动，所述生理学作用起着调节巨噬细胞和其他吞噬细胞的分布和活性的作用。 
一般地，本发明的组合物和方法提供了治疗剂在体内的简单、有效和有效率的递送，优选地通过口服施用递送。所述组合物和可获得的组合物相比，具有提高的稳定性，和具有患者方便性(从而，患者的顺从性)、更低的花费和减少或降低的副作用的其他有利方面。 
定义 
“受试者”是指哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于，人、非人灵长类例如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物例如牛、马、绵羊、山羊和猪；家畜例如兔子、狗和猫；实验室动物包括啮齿类动物例如大鼠、小鼠和豚鼠；等。非哺乳动物的实例包括，但不限于，鸟类等。术语“受试者”不指明具体的年龄或性别。 
“疗效”是指症状的改善或疾病进展的减缓；在溶酶体酶缺乏的情况下，“疗效”是指缺乏的基因的功能或缺乏的基因产物的功能的可检测的补充。“治疗有效量”是指，当给患者施用以治疗疾病时，足以实现对疾病进行该治疗的化合物的量。所述“治疗有效量”依赖于化合物、被治疗的疾病的状况、被治疗的疾病的严重度、受试者的年龄和相对健康、给药途径和形式、主治医生或兽医的判断以及其他因素而变化。蛋白的“功能性等同物”是指结构和所述蛋白不同但在相同的条件下和所述蛋白行使相同功能的分子、蛋白或非蛋白。溶酶体酶的“功能性等同物”是指结构上和所述蛋白不同但在相同的条件下催化所述天然溶酶体酶的底物的相同反应的分子、蛋白或非蛋白。 
有效负载捕获分子 
所述有效负载捕获分子优选地是药物可接受的赋形剂。有效负载分子和捕获分子都可溶于溶剂系统；所述溶剂系统必须通过酵母细胞颗粒糖基质被吸收，从而允许有效负载和捕获聚合物的吸收。所述有效负载和捕获分子优选地溶于水。在优选的实施方案中，所述捕获分子是可生物降解的。 
和给定的有效负载的捕获反应的作用机制决定了有效负载捕获分子的选择。为了具有静电相互作用，需要具有和有效负载的电荷相反的电荷的有效负载捕获分子。为进行物理捕获，有效负载捕获分子适当地参与减少有效负载的扩散的基质的形成。在其它实施方案中，所述有效负载捕获分子促成疏水结合特性，从而促成所述有效负载的保留。在其他实施方案中，所述有效负载捕获分子选择性地结合至有效负载，从而提供促成有效负载的保留的亲和相互作用。 
一般地，聚电解质可以是适合的有效负载捕获分子。几种合适的聚电解质描述于美国专利6,133,229。所述聚电解质可以是阳离子聚电解质或阴离子聚电解质。也可使用两性聚电解质。阳离子聚电解质优选地是具有沿所述分子链分布的阳离子基团的聚合物。在某些实施方案中阳离子基团可包括季铵衍生的部分，可排列在悬挂于链的侧链基团中或可被整合于其中。阳离子聚电解质的实例包括：乙烯基吡咯烷酮和四价甲基丙烯酸甲酯的共聚物例如获自ISP的GAFQUAT 
Figure S05837576420070509D000191
系列(755N，734，HS-100)；取代聚丙烯酰胺；聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺和取代衍生物；聚胺同聚物(GOLCHEM CL118)；聚胺共聚物(例如，表氯醇和单或二甲胺的缩合物)；聚二烯丙基二甲基氯化铵(polyDADMAC)；取代葡聚糖；修饰的瓜尔胶(用羟丙基氯化三铵取代的)；取代蛋白(例如，大豆蛋白质和水解的胶原蛋白上的取代的quaternary基团)；聚氨基酸(例如，聚赖氨酸)；低分子量聚氨基化合物(例如，精胺和亚精胺)。可使用天然或人工聚合物。可使用具有MW为150至5,000,000、优选地5000至500,000、更优选地5000至 100,000的阳离子聚电解质。0.01至10％的量是优选的，更优选地0.1至2％w/v，特别是0.05至5％。 
阴离子聚电解质优选地是具有沿所述分子链分布的阴离子基团的聚合物。阴离子基团可包括羧酸、磺酸、硫酸或其他带负电荷的可电离种类，可排列于悬挂于链上的基团或直接结合至所述聚合物的主链。可使用天然的或人造的聚合物。 
阴离子聚电解质的实例包括：甲基乙烯基醚和马来酸酐的共聚物、甲基乙烯基醚和马来酸的共聚物，(分别为Gantrez AN-系列和S-系列，International Specialty Products，Wayne，NJ)；海藻酸和盐；羧甲基纤维素和盐；取代聚丙烯酰胺(例如用羧基取代的)；聚丙烯酸和盐；聚苯乙烯磺酸和盐；硫酸葡聚糖；取代糖类例如，蔗糖八硫酸酯；肝素。可使用具有150至5,000,000，优选地5000至500,000，更优选地5000至100,000的MW的阴离子聚电解质。0.01％至10％的量是优选的，特别是0.05至5％，更特别地是0.1至2％w/v。 
生物聚合物，例如多糖，是优选的捕获聚合物。优选地，将所述聚合物加工成平均分子量小于100,000道尔顿。优选地衍生所述聚合物以提供阳离子或阴离子特征。合适的多糖包括壳聚糖(脱乙酰基的壳多糖)、海藻酸、葡聚糖，例如2-(二乙氨基)乙基醚葡聚糖(DEAE-葡聚糖)和硫酸葡聚糖、黄原胶、豆角胶(locust bean gum)和瓜尔胶。 
两大类阳离子分子适合用作具有带负电荷的有效负载的捕获分子例如核酸：阳离子聚合物和阳离子脂质。 
已显示多种阳离子聚合物在体外介导转染，范围从蛋白[例如组蛋白(Fritz，J.D.，等人，(1996)Hum.Gene Ther.7，1395-1404)和高泳动族(HMG)蛋白(Mistry，A.R.，等人(1997)BioTechniques 22，718-729)]和多肽[例如多聚赖氨酸(Wu，G.Y.和Wu，C.H.(1987)J.Biol.Chem.262，4429-4432，Wagner，E.，等人，(1991)Bioconjugate Chem.2，226-231、短合成肽(Gottschalk，S.，等人.，(1996)Gene Ther.3，448-457；Wadhwa，M.S.，等人，(1997)Bioconjugate Chem.8，81-88)，和螺旋两亲性肽(Legendre，J.Y.， 等人，(1997)Bioconjugate Chem.8，57-63；Wyman，T.B.，等人，(1997)Biochemistry 36，3008-3017)]至合成的聚合物[例如聚乙烯亚胺(Boussif，O.，等人，(1996)Gene Ther.3，1074-1080)、阳离子树状分子(dendrimers)(Tang，M.X.，等人，(1996)BioconjugateChem.7，703-714；Haensler，J.等人，(1993)Bioconjugate Chem.4，372-379)和葡糖酰胺(glucaramide)聚合物(Goldman，C.K.，等人，(1997)Nat.Biotech.15，462-466)]。其他合适的阳离子聚合物包括N-取代甘氨酸寡聚物(类肽)(Murphy，J.E.，等人，Acombinatorial approach to the discovery of efficient cationicpeptoid reagents for gene delivery，Proc Natl Acad Sci.USA，1998 95(4)1517-1522)、聚(2-甲基-丙烯酸2-[(2-二甲基氨基)-乙基)-甲基-氨基]-乙酯)，缩写为pDAMA，和聚(2-二甲基氨基乙基)-异丁烯酸酯(pDMAEMA)(Funhoff，A.M.，等人，2004Biomacromolecules，5，32-39)。 
在本领域已知阳离子脂质也适合用于转染。Felgner，P.L1，等人，Lipofection：a highly efficient，lipid-mediatedDNA-transfection procedure.Proc Natl Acad Sci USA.198784(21)：7413-7。合适的阳离子脂质包括N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、[N，N，N’，N’-四甲基-N，N’-二(2-羟基乙基)-2，3-二(油烯基氧基)-1，4-丁烷二碘化铵](PromegaMadison，WI，USA)，双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(Promega Madison，WI，USA)，N-[1-(2，3-二油烯基氧基)]-N，N，N-三甲基丙烷甲基硫酸铵(DOTAP)，N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-二豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、二豆蔻油烯基膦酰基甲基三甲基铵(DMPTA)(see Floch等人1997.Cationicphosphonolipids as non-viral vectors for DNA transfection inhematopoietic cell lines and CD34+cells.Blood Cells，Molec.&Diseases 23：69-87)、1，2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯噁二唑-4-基)，铵盐(Avanti Polar Lipids，Inc. Alabaster，AL，US)、1，2-二油烯基-3-三甲基丙烷氯化铵(AvantiPolar Lipids，Inc.Alabaster，AL，US)，1，2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Avanti Polar Lipids，Inc.Alabaster，AL，US)和1，3-二油烯基氧基-2-(6-羧基spermyl)丙基酰胺(DOSPER). 
适合作为阳离子捕获分子的聚胺描述于美国专利6,379,965和6,372,499。 
有效负载分子 
本发明的颗粒递送系统用于体内或体外递送有效负载分子，所述分子包括，但不限于核酸例如寡核苷酸、反义构建体、siRNA、酶RNA和重组DNA构建体，包括表达载体。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒递送系统用于在体内或体外递送有效负载分子例如氨基酸、肽和蛋白。“蛋白”是指链长度足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸的序列。这是和不具有该结构的“肽”或其他小分子量药物的区别。一般地，此处的蛋白可具有至少大约15-20kD、优选地至少大约20kD的分子量。 
此处定义的范围内所包括的蛋白的实例包括哺乳动物蛋白，例如，生长激素(GH)，包括人生长激素、牛生长激素和GH超基因家族的其他成员；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX组织因子和血管性血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子例如C蛋白；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；bombazine；凝血酶；α肿瘤坏死因子、β肿瘤坏死因子；脑啡肽酶；RANTES(通常调节T细胞表达和分泌的活性)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；松弛素A链；松弛素B链；原松弛素(prorelaxin)；小鼠促性腺激素关连肽；DNA酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；A或D蛋白；类风湿 因子；神经营养因子例如骨来源的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(大脑IGF-D；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；成骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(decay accelerating factor)(DAF)；病毒抗原例如，AIDS包膜的部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；和上面列出的多肽的任一种多肽的生物活性片段或变体。 
GH超基因家族的成员包括生长激素、催乳素、胎盘催乳激素、促红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素7、白细胞介素9、白细胞介素10、白细胞介素11、白细胞介素12(p35亚基)、白细胞介素13、白细胞介素15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ-干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、心肌营养蛋白-1和被鉴定为和分类为所述家族的成员的其他蛋白。 
蛋白有效负载分子优选地是基本上纯的和想要地基本上均一的(即不含污染性蛋白等)。“基本上纯的”蛋白是指包含按重量计算(基于组合物的总重量)至少大约90％的蛋白，优选地按重量计算至少大约95％的蛋白的组合物。“基本上均一的”蛋白是指包含按重量计算(基于组合物的总重量)至少大约99％的蛋白的组合物。蛋白可来源于天然发生的来源或通过重组技术产生。蛋白包括由氨基酸置换或通过定向蛋白演化(Kurtzman，A.L.，等人，Advances in directedprotein evolution by recursive genetic recombination： applications to therapeutic proteins，Curr Opin Biotechnol.200112(4)：361-70)产生的变体以及衍生物例如PEG化的蛋白。 
在某些实施方案中，蛋白是抗体。所述抗体可结合至例如上述分子的任一种分子。本发明包括的抗体的示例性分子靶包括CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族的成员例如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体、细胞粘附分子例如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β-亚单位(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子例如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；C蛋白等。 
除了肽、多肽和核酸外，本发明的颗粒给药系统适合用于递送更小的分子，优选地用于递送药物活性剂，更优选地治疗性小分子。用于本发明的给药系统的合适的小分子有效负载包括避孕药例如二乙基己烯雌酚、17-β-雌二醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇等；黄体酮例如炔诺酮、norgestryl、双醋炔诺醇、炔雌烯醇、乙酸甲羟孕酮、地美炔酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、诺孕酯、炔诺酮、炔孕酮、甲烯雌醇、异炔诺酮等；和杀精子化合物例如壬基苯氧基聚氧乙二醇、氯化苄乙氧铵(benzethonium chloride)、氯茚醇等。优选地，对于这些甾体有效负载，使用捕获分子的混合物，所述混合物包含足够量的去垢剂以溶解有效负载和聚合物以使所述有效负载保留在酵母细胞壁颗粒内。 
可被整合入本发明的给药系统的其他活性剂包括胃肠治疗剂例如氢氧化铝、碳酸钙、碳酸镁、碳酸钠等；非类固醇类抗生育剂；拟副交感神经药；精神治疗药物；抗精神病药例如盐酸氯丙嗪、氯扎平、美索达嗪、甲哌硫氮卓、利血平、甲硫达嗪等；抗焦虑药例如甲氨二氮卓、地西泮、甲丙氨酯、羟基安定等；鼻科(rhinological)解充血药；镇静催眠药例如可待因、苯巴比妥、戊巴比妥钠、司可巴比妥钠等；其他类固醇例如睾丸酮和丙酸睾丸酮；磺胺类药物；拟交感神经药；疫苗；维生素和营养素例如必需氨基酸、必需脂肪(essentialfat)等；抗疟药例如4-氨基喹啉、8-氨基喹啉、乙胺嘧啶等；抗偏 头痛药例如氯苯咪吲哚、芬特明等；抗震颤麻痹药例如L-多巴；镇痉剂例如阿托品、甲基溴化东莨菪碱等；镇痉剂和抗胆碱能药物例如胆汁疗法、助消化剂、酶等；止咳剂例如右美沙芬、那可丁等；支气管扩张剂；心血管药物例如抗高血压化合物、萝芙木生物碱、冠状血管扩张药、硝酸甘油、有机硝酸盐、戊四硝酯等；电解质替代物例如氯化钾；麦角生物碱例如具有和不具有咖啡因的麦角胺、氢化麦角生物碱、二氢麦角克碱甲磺酸盐、二氢麦角柯宁碱甲磺酸盐、双氢麦角隐亭甲磺酸盐和其组合；生物碱类例如硫酸阿托品、颠茄、氢溴酸东莨菪碱等；镇痛药；麻醉药例如可待因、二氢可待因酮、哌替啶、吗啡等；非麻醉药例如水杨酸盐、阿斯匹林、对乙酰氨基酚、d-丙氧酚等。 
在优选的实施方案中，本发明的系统用于递送抗生素例如头孢菌素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素A、卡那霉素B、青霉素类、氨苄西林、链霉素A、抗霉素A、chloropamtheniol、甲硝唑、土霉素青霉素G、四环素类等。在优选的实施方案中，身体的巨噬细胞使病原体失活的能力受抗生素例如四环素至所述巨噬细胞的递送的增强。 
在其他优选的实施方案中，本发明提供了系统，所述系统用于递送抗癌药物；抗惊厥剂例如美芬妥英、苯巴比妥、三甲双酮；止吐药例如硫乙拉嗪；抗组胺类例如chlorophinazine、茶苯海明、苯海拉明、奋乃静、曲吡那敏等；抗炎剂例如激素药剂、氢化可的松、泼尼松龙、泼尼松，非激素药，别嘌呤醇、阿斯匹林、吲哚美辛、苯丁唑酮等；前列腺素；细胞毒药物例如塞替派、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仓、氮芥、甲氨蝶呤等。 
疫苗 
在优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统用于提供疫苗的口服递送。在优选的实施方案中，所述系统用于递送抗原，例如下列微生物的抗原，如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、疱疹病毒(人，1型和2型)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、B组链球菌属(Streptococcus sp.)、人形支原体(Microplasma hominis)、杜克雷嗜血杆菌(Hemophilus ducreyi)、股沟肉芽肿(Granuloma inguinale)、腹股沟淋巴肉芽肿(Lymphopathia venereum)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、流产布鲁氏杆菌.羊流产布氏杆菌(Brucella abortus.Brucellamelitensis)、猪流产布氏杆菌(Brucella suis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)、Campylobacter fetus intestinalis、波摩钠钩端螺旋体(Leptospirapomona)、单核细胞增多性李司特菌(Listeria monocytogenes)、羊布(鲁)氏菌(Brucella ovis)、马疱疹病毒1、马传染性动脉炎病毒、IBR-IBP病毒、BVD-MB病毒、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、牛毛滴虫(Trichomonas foetus)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、大肠杆菌、马驹放线杆菌(Actinobacillus equuli)、羊流产沙门氏菌(Salmonella abortus ovis)、马流产沙门氏菌(Salmonella abortusequi)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、马棒状杆菌(Corynebacterium equi)、化脓棒状杆菌(Corynebacteriumpyogenes)、放线杆菌病(Actinobaccilus seminis)、牛生殖器支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、分支犁头霉(Absidia ramosa)、马媾疫锥虫(Trypanosomaequiperdum)、驽巴贝虫(Babesia caballi)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)等。在其他实施方案中，所述系统可用于递送抵抗上述微生物的中和抗体。 
在其他实施方案中，所述系统可用于递送酶例如核糖核酸酶、神经氨酸酶、胰蛋白酶、糖原磷酸化酶、精子乳酸脱氢酶、精子透明质酸酶、腺苷三磷酸酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶酯酶、氨肽酶、胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶、顶体蛋白酶、二酯酶、谷氨酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、β葡糖磷酸酶、脂酶、ATP-酶α-peptateγ-谷氨酰转肽酶、固醇-3-β-醇-脱氢酶、DPN-二-aprorase。 
在优选的实施方案中，所述系统可递送生物恐怖关键生物因子(critical biological agents)的抗原，包括A类试剂例如重型天花(天花)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)毒素(肉毒杆菌中毒)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)(土拉菌病)、纤丝病毒(埃博拉出血热、马尔堡出血热)、沙粒病毒(拉沙(拉沙热)、Junin(阿根廷出血热)和相关病毒)；B类因子例如贝氏考克斯菌(Coxiella burnetti)(Q热)、布鲁氏菌种类(布鲁氏菌病)、鼻疽假单胞菌(Burkholderia mallei)(鼻疽病)、α病毒(委内瑞拉脑脊髓炎、东部和西部马脑脊髓炎)、来自蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻籽)的蓖麻毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)的ε毒素；葡萄球菌肠毒素B、沙门氏菌(Salmonella)种类、志贺氏痢疾菌(Shigella dysenteriae)、大肠杆菌株系O157:H7、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)和C类因子例如尼帕病毒、汉坦病毒、蜱传播的出血热病毒、蜱传播的脑炎病毒、黄热病和多耐药结核。 
在优选的实施方案中，所述系统可用于递送灭活的抗原毒素，例如变性毒素抗原，包括类毒素(灭活的但是抗原性毒素)和类毒素缀合物。在优选的实施方案中，所述类毒素是灭活的微生物毒素。在其他实施方案中，所述类毒素是灭活的植物毒素。在其他实施方案中，所述类毒素是灭活的动物毒素。在某些实施方案中，所述系统可用于递送类毒素例如百日咳类毒素、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b型-破伤风类毒素缀合物、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)D类毒素、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)E类毒素、由艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)的毒素A产生的类毒素、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)类毒素、C型和D型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)类毒素、肖韦(氏)梭菌(Clostridium chauvoei)类毒素、诺维(氏)梭菌(Clostridium novyi)(B型)类毒素、败血梭状芽胞杆菌(Clostridium septicum)类毒素、重组HIV tat IIIB类毒素、葡萄球菌类毒素、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)Apx I类毒素、胸膜肺炎放线杆菌Apx II类毒素、胸膜肺炎放线杆菌Apx III类毒素、胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)类毒素、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)弹性蛋白酶类毒素、蛇毒类毒素、篦麻毒素类毒素、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)类毒素、出血败血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida)类毒素、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)类毒素、出血败血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida)类毒素和支气管败血性博德特(氏)菌(Bordetella bronchiseptica)类毒素. 
从对应的毒素制备类毒素的技术，例如用甲醛或铝盐进行化学处理或γ辐照，在本领域内是已知的。将毒素转化成类毒素的重组方法也是已知的(Fromen-Romano，C.，等人，Transformation of anon-enzymatic toxin into a toxoid by genetic engineering，Protein Engineering第10卷no.10pp.1213-1220，1997)。在优选的实施方案中，本发明的系统可用于递送重组类毒素。在其他优选的实施方案中，本发明的系统可用于递送编码重组类毒素的表达载体。 
为了产生基因疫苗以保护免受病原体感染，必须在所述核酸组合物中包含编码可引发保护性免疫反应的免疫原性蛋白的遗传物质。无论病原体是细胞内感染(这对本发明特别有用)还是细胞外感染，不可能所有的病原体抗原都可引发保护性反应。因为DNA和RNA都是相对小的且可相对容易地产生，因此，本发明提供了使得能够用多种病原体抗原进行接种的其他有利方面。用于所述基因疫苗的核酸组合物可包括编码许多病原体抗原的遗传物质。例如，几种病毒基因可包含在单个构建体中，从而提供多个靶。此外，在一些情况下，可在个体中被递送至不同细胞的多个接种体可制备成在疫苗中共同包含完全的或更优选的不完全的，例如几乎完全成套的基因。例如，可使用两个构建体施用完全成套的病毒基因，所述构建体各自包含在不同部位施 用的不同的一半的基因组。因此，可激起抗各抗原的免疫反应而无感染性病毒装配的风险。这允许超过单一抗原靶的导入且可消除鉴定保护性抗原的需要。 
根据本发明，也提供了赋予抗特征在于过度增殖疾病的过度增殖的细胞的广谱保护性免疫反应的方法以及治疗遭受过度增殖疾病的个体的方法。如此处所用的，术语“过度增殖疾病”是指特征在于细胞的过度增殖的疾病和病症。过度增殖疾病的实例包括癌症和牛皮癣的所有形式。 
已发现将包含核苷酸序列(所述序列编码免疫原性“过度增殖细胞”相关蛋白)的核酸组合物导入个体的细胞导致在个体的已接种的细胞中产生所述蛋白。如此处所用的，术语“过度增殖相关蛋白”是指和过度增殖疾病相关的蛋白。为进行抗过度增殖疾病的免疫，给个体施用包含编码与过度增殖疾病相关的蛋白的核苷酸序列的核酸组合物。 
为了使过度增殖相关蛋白成为有效的免疫原性靶，其必须是专门地或以更高的水平(相对于正常细胞)在过度增殖的细胞中产生的蛋白。靶抗原包括这些蛋白、和其片段以及至少包含在这些蛋白中发现的表位的肽。在一些情况下，过度增殖相关蛋白是编码蛋白的基因的突变产物。所述突变的基因编码几乎和正常蛋白相同(除了导致未在正常蛋白中发现的不同表位的其稍微不同的氨基酸序列外)的蛋白。这些靶蛋白包括由癌基因例如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的蛋白。除了作为靶抗原的癌基因产物外，用于抗癌治疗和保护方案的靶蛋白包括在一些实施方案中也用作自身免疫疾病的靶抗原的由B细胞淋巴瘤产生的抗体可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区。其他肿瘤相关蛋白可用作靶蛋白，例如在肿瘤细胞中以更高水平被发现的蛋白，包括由单克隆抗体17-1A和叶酸结合蛋白识别的蛋白。 
尽管本发明可用于免疫个体以抗一种或几种形式的癌症，但本发明对于预防性免疫易于产生特定癌症或已患过癌症从而易于复发的个 体特别有用。遗传学和生物技术学以及流行病学的发展允许确定个体中癌症发展的可能性和对其进行风险估计。通过使用遗传筛查和/或家族健康史，可能预测特定个体发生癌症的几种类型中的任一种的概率。 
类似地，已发生癌症的个体和已被治疗以除去癌症的个体或处于好转的个体对复发和再发特别易感。作为治疗方案的部分，可对这些个体进行抗癌的免疫以抵抗该复发，所述癌症是其曾被诊断曾经患过的癌症。因此，当知道个体曾患过某种类型的癌症且处于复发的风险时，可对其进行免疫以使其免疫系统准备抵抗所述癌症的任何将来的发生。 
本发明也提供了治疗遭受过度增殖疾病的个体的方法。在该方法中，肽、蛋白、糖或核酸组合物和其组合的导入用作免疫疗法，指导和促进个体的免疫系统抵抗产生所述靶蛋白的过度增殖的细胞。 
本发明提供了通过提供抗靶的广谱保护性免疫反应治疗遭受自身免疫性疾病和病症的个体的方法，所述靶和自身免疫性相关，包括细胞受体和产生对抗“自身”的抗体的细胞。 
T细胞介导的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、斯耶格伦综合征、肉样瘤病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎(reactive arthritis)、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、牛皮癣、血管炎、韦格纳肉芽肿病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。这些疾病中的各疾病的特征在于结合内源性抗原并启动和自身免疫性疾病相关的炎症级联反应的T细胞受体。抗T细胞的可变区的疫苗接种可引发免疫反应包括CTL以消除所述T细胞。 
在RA中，参与疾病的T细胞受体(TCR)的几个特异性可变区已被表征。这些TCR包含Vβ-3、Vβ-14、Vβ-17和Vα-17。因此，使用由递送或编码这些蛋白中的至少一种蛋白的肽、蛋白、糖或核酸组合物和其组合组成的组合物的接种将引起靶向参与RA的T细胞的免疫反应。参见：Howell，M.D.，等人，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10921-10925；Paliard，X.，等人，1991 Science 253：325-329； Williams，W.V.，等人，1992 J.Clin.Invest.90：326-333；其各自在此引用作为参考。 
在MS中，已表征了参与该疾病的TCR的几个特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。因此，使用由递送或编码至少一种这些蛋白的肽、蛋白、糖或核酸组合物和其组合组成的组合物的接种将引起靶向参与MS的T细胞的免疫反应。参见：Wucherpfennig，K.W.，等人，1990 Science 248：1016-1019；Oksenberg，J.R.，等人，1990Nature 345：344-346；其各自在此引用作为参考。 
在硬皮病中，已表征了参与该疾病的TCR的几个特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14和Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，使用由递送或编码至少一种这些蛋白的肽、蛋白、糖或核酸组合物和其组合组成的组合物的接种将引起靶向参与硬皮病的T细胞的免疫反应。 
为了治疗遭受T细胞介导的自身免疫性疾病(特别是对于所述TCR的可变区仍需表征的疾病)的受试者，可进行滑膜活检。可采集存在T细胞的样品并使用标准技术鉴定这些TCR的可变区。可使用这些信息制备疫苗。 
B细胞介导的自身免疫病包括狼疮(SLE)、格雷夫斯病、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆管纤维硬化和恶性贫血。这些疾病中的各种疾病的特征在于结合内源性抗原并启动和自身免疫性疾病相关的炎症级联反应的抗体。抗这些抗体的可变区的免疫接种将引发包括CTL的免疫反应以清除产生所述抗体的B细胞。 
为了治疗遭受B细胞介导的自身免疫性疾病的受试者，必需鉴定参与自身免疫活性的抗体的可变区。可进行活组织检查，可采集存在于炎症部位的抗体样本。可使用标准技术鉴定这些抗体的可变区。可使用这些信息制备疫苗。 
在SLE的情况下，一种抗原据认为是DNA。因此，在接受抗SLE的免疫的受试者中，可就抗DNA抗体筛查其血清和可制备包含编码在 所述血清中发现的该抗DNA抗体的可变区的核酸组合物的疫苗。 
TCR和抗体的可变区中的一般结构特征都是熟知的。通常可按照熟知的方法发现编码特定TCR或抗体的DNA序列，所述方法是例如描述于Kabat，等人1987 Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest U.S.Department of Health and Human Services，BethesdaMd.中的方法，其在此引用作为参考。此外，用于从抗体克隆功能性可变区的一般方法可在Chaudhary，V.K.，等人，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066中查到，其在此引用作为参考。 
基因疗法 
在优选的实施方案中，本发明提供了用于治疗遗传病症或具有遗传成分的疾病的组合物和方法。在其他优选的实施方案中，本发明提供了用于生产用于治疗遗传病症或具有遗传成分的疾病的药物产品的组合物。 
人类基因组计划已增加了我们的关于疾病的遗传基础的知识。一般参见，http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/assist.shtml。 
环境和遗传因素都在任何疾病的发展中具有作用。遗传病是由个体的遗传物质(基因组)的异常导致的疾病。存在4种不同类型的遗传病：(1)单基因型，(2)多因子型，(3)染色体型，和(4)线粒体型。 
(1)单基因型(也称为孟德尔型或单基因型)-该类型是由一个基因的DNA序列中发生的改变或突变造成的。基因编码蛋白，而蛋白质执行大多数任务，进行大部分生命功能和甚至构成细胞结构的主体。当基因突变以致其蛋白产物不再能进行其正常功能时，可导致病症。存在超过6,000种已知的单基因病症，所述病症在每200个出生中大约发生1例。一些实例是纤维囊泡症、镰状细胞贫血、马方综合征、亨顿舞蹈病和遗传性血色病。 
(2)多因子型(也称为复杂型或多基因型)-该类型由环境因素 和多个基因的突变的组合造成。例如，已在第6、11、13、14、15、17和22号染色体上发现影响乳腺癌易感性的不同基因。其更复杂的性质使其比单基因或染色体型病症更难以分析。最常见的慢性病症的一些病症是多因子病。实例包括心脏病、高血压、阿耳茨海默病、关节炎、糖尿病、癌症和肥胖症。多因子遗传也和遗传性状例如指纹型、身高、眼睛颜色和肤色相关。 
(3)染色体型-染色体，由DNA和蛋白构成的独特结构，位于各细胞的细胞核中。因为染色体是遗传物质的载体，所以染色体结构的异常例如缺失或额外的拷贝或大的断裂和再连接(易位)，可导致病症。可通过显微镜检查来检测主要的染色体异常的一些类型。唐氏综合征或21三体是当人具有21号染色体的三个拷贝时发生的常见病症。 
(4)线粒体型-该相对罕见类型的遗传病是由线粒体的非染色体DNA的突变造成的。线粒体是小的圆形或棒状细胞器，其参与细胞的呼吸作用且发现于植物和动物细胞的细胞质中。各线粒体可包含5至10个环形DNA片段。 
在优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统用于施用至少一种包含补偿基因的核酸。在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统用于施用至少一种编码缺失的基因产物的核酸，其中所述基因产物的表达用于治疗遗传病或病症的遗传成分。在优选的实施方案中，包含想要的有效负载分子的本发明的颗粒给药系统用于药物产品的生产，所述药物产品用于治疗遗传病或病症的遗传成分。这些药物产品适合通过口服、经直肠、肠胃外(例如静脉内、肌内或皮下)、脑池内、阴道内、腹膜内、膀胱内、局部(例如粉剂、软膏剂或滴剂)施用或以口腔或鼻腔喷雾的形式施用。优选地通过口服、口腔和肠胃外途径，更优选地口服施用所述药物产品。载有不同有效负载例如核酸、核酸表达载体或小分子治疗剂的颗粒可以适当的比例在例如胶囊中混合并一起施用以进行组合治疗。 
在本发明的涉及基因疗法的方面，所述核酸组合物包含补偿基因成编码治疗性蛋白的基因。补偿基因的实例包括编码肌养蛋白的基因 或功能性片段、补偿遭受纤维囊泡症的受试者中的缺乏的基因的基因、补偿遭受ADA的受试者中的缺乏的基因的基因和编码因子VIII的基因。编码治疗蛋白的基因的实例包括编码促红细胞生成素、干扰素、LDL受体、GM-CSF、IL-2、IL-4和TNF的基因。此外，可施用编码特异性和毒性物质结合的单链抗体组分的核酸组合物。在一些优选的实施方案中，以小基因的部分的形式提供肌养蛋白基因并将其用于治疗遭受肌肉萎缩症的个体。在一些优选的实施方案中，提供包含部分肌养蛋白的编码序列的小基因。肌养蛋白异常负责轻度贝克尔肌营养不良(BMD)和重度杜兴肌营养不良(DMD)。在BMD中产生肌养蛋白，但其在大小和/或量方面是异常的。受试者是从轻度至中度虚弱。在DMD中，没有蛋白产生且受试者在13岁前坐轮椅，通常在20岁前死亡。在一些受试者中，特别是遭受BMD的受试者中，由根据本发明递送的小基因的表达产生的部分肌养蛋白可提供提高的肌肉功能。 
在优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗遗传病症和据认为具有遗传成分的疾病的组合物和方法，所述疾病是例如阿-斯二氏综合征、阿瑟综合征、软骨发育不全、肢成骨不全、癖嗜、脑白质肾上腺萎缩症、白化病、无睑-巨口综合征、Alagille综合征、尿黑酸尿、α-1型抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔波特氏综合征、阿耳茨海默氏病、哮喘、自身免疫性多腺体综合征、雄激素不敏感综合征、Angelman综合征、共济失调、共济失调-毛细血管扩张症、动脉粥样硬化、注意缺陷障碍症(ADHD)、孤独症、秃发症、巴藤病、贝-威二氏综合征、贝斯特病、双相性精神障碍、短指、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、慢性髓细胞样白血病、夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Toothdisease)、克罗恩病、兔唇、科凯恩综合征、Coffin Lowry综合征、结肠癌、先天性肾上腺增生症(CAH)、科妮莉亚德兰格综合征、Costello综合征、Cowden综合征、Craniofrontonasal Dysplasia、克-纳二氏综合征、克雅氏病(CJD)、纤维囊泡症、耳聋、抑郁症、糖尿病、骨畸形性发育不良(diastrophic dysplasia)、DiGeorge综合征、唐氏综合征、诵读困难、进行性假肥大性肌营养不良、多博维 茨综合征、外胚层发育不良、埃-范二氏综合征、Ehlers-Danlos、大疱性表皮松解症(EB)、癫痫、特发性震颤、家族性高胆固醇血症、家族性地中海热、脆性X染色体综合征、弗里德赖希氏共济失调、高歇病、青光眼、葡萄糖半乳糖吸收不良、戊二酸尿、回旋形萎缩、斯普林泽综合征(velocardiofacial syndrome)、戈兰综合征、Hailey-Hailey病、偏身肥大、血色病、血友病、遗传性运动与感觉神经病(HMSN)、遗传非息肉病结肠直肠癌(HNPCC)、亨廷顿舞蹈病、具有超IgM的免疫缺陷、青少年型糖尿病、克莱恩费尔特氏综合征、Kabuki综合征、利氏病(或综合征)、长QT综合征、肺癌、恶性黑色素瘤、躁狂忧郁、马方综合征、门克斯综合征、流产、粘多糖病、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性硬化症、肌肉萎缩症、肌萎缩侧索硬化症、肌强直性营养不良、神经纤维瘤病、尼-皮二氏病、努南综合征、肥胖症、卵巢癌、p53肿瘤抑制基因、胰腺癌、帕金森病、阵发性夜间血红蛋白尿、彭德莱综合征、腓肌萎缩、苯丙酮尿症(PKU)、多囊性肾病、帕-魏二氏综合征、原发性胆汁性肝硬变、前列腺癌、REAR综合征、雷夫叙姆病、色素性视网膜炎、视网膜成神经细胞瘤、Rett综合征、圣菲利波综合征、精神分裂症、重度联合免疫缺陷症、镰状细胞性贫血、脊柱裂、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑萎缩、SRY：性别决定、成人猝死综合征、丹吉尔病、泰-萨病、血小板减少-桡骨缺失综合征、Townes-Brocks综合征、结节性硬化症、特纳综合征、乌谢尔综合征、希-林二氏综合征、瓦尔敦堡综合征、韦弗综合征、沃纳综合征、威廉斯综合征、威尔逊病、着色性干皮病和泽韦格综合征。 
在其他优选的实施方案中，本发明的微粒递送系统提供了用于治疗遗传病症和据认为具有遗传成分的疾病的组合物和方法，所述疾病表现为代谢性疾病，例如蛋白相关性病症，包括镰状红细胞贫血和β地中海贫血、α地中海贫血、马方综合征、Ehlers-Danlos I型、Ehlers-Danlos II型、Ehlers-Danlos III型、Ehlers-Danlos IV型常染色体显性、Ehlers-Danlos IV型常染色体隐性、Ehlers-DanlosIV-D型、Ehlers-Danlos V型、Ehlers-Danlos VI型、Ehlers-Danlos VII型常染色体显性、Ehlers-Danlos VII型常染色体隐性、Ehlers-Danlos VIII型、具有血小板功能障碍的Ehlers-Danlos、皮肤松弛症、皮肤松弛症隐性I型(Cutis Laxa recessive Type I)、后头角综合征皮肤松弛症(Occipital Horn Syndrome Cutis Laxa)、X连锁的、成骨不全I型、成骨不全I-C型、成骨不全静息II/III型(Osteogenesis Imperfecta Silent Type II/III)、成骨不全IV型、成骨不全新生儿致死型(Osteogenesis Imperfecta NeonatalLethal form)和成骨不全进行性致畸形。 
在其他优选的实施方案中，本发明的微粒递送系统提供了用于治疗凝血系统的遗传病的组合物和方法，所述疾病是例如无纤维蛋白原血症，纤维蛋白素原、因子I的完全丧失；异常纤维蛋白原血症，功能障碍性纤维蛋白素原、因子I；因子II病症；组织因子V缺乏症；，不稳定因子缺乏、因子VII缺乏、因子VIII缺乏症(血友病A)、因子IX缺乏症(血友病B)、因子X缺乏症、因子XI缺乏症、Rosenthal综合征、血浆促凝血酶原激酶前体(PTA)缺乏症、因子XII缺乏症、先天性因子XII缺乏症症(Hageman factor deficiency)，因子XIII缺乏，因子V和VIII组合缺乏症、因子VIII和IX组合缺乏症、因子IX和XI组合缺乏症、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、血栓形成倾向、抗凝血酶III缺乏症、巨血小板综合征、血小板糖蛋白Ib缺乏症、冯·威利布兰德病、Fletcher因子缺乏症和前激肽释放酶缺乏症。 
在其他优选的实施方案中，本发明的微粒递送系统提供了用于治疗糖原贮积病的组合物和方法，所述疾病是例如O型、I型(冯吉尔克病)、Ib型、Ic型、II型(蓬佩病)、IIb型(Danon病)、I型II(科里病或福布斯病)、IV型(安德森病)、V型(麦卡德尔病)、VI型(埃尔病)、VII型(塔里病)、VIII型、IX型和XI型(Fanconi-Bickel综合征)。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗果糖、半乳糖和甘油代谢缺陷的组合物和方法，所述疾病是例如遗传性果糖不耐症、醛缩酶B缺乏症；果糖尿症、肝果糖激酶缺乏；经 典半乳糖血(症)、半乳糖表异构酶缺乏症；半乳糖激酶缺乏症；高甘油血症和甘油激酶缺乏症。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗胆固醇和脂蛋白代谢缺陷的组合物和方法，所述疾病是例如载脂蛋白(a)-Lp(a)，高脂蛋白血症I型；高脂蛋白血症Ib型；载脂蛋白C-II缺乏症；高脂蛋白血症Ic型、乳糜微粒血症；家族性高胆固醇血症、II型高脂蛋白血症；高脂蛋白血症II型、家族性高β-脂蛋白血症；高脂蛋白血症III型；载脂蛋白E缺乏症；高脂蛋白血症IV型；高脂蛋白血症V型；家族性LCAT缺乏症；沃尔曼病；脂蛋白脂酶缺乏症；家族性高甘油三酯血症；高脂血症V型；高脂血症VI型；家族性配体缺乏载脂蛋白B(familial ligand-defective apo-B)；家族性高α脂蛋白血症、低β脂蛋白血症、载脂蛋白B-100缺乏症；血β-脂蛋白缺乏症、Kornzweig综合征；和丹吉尔病、家族性高密度脂蛋白缺乏症。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗粘多糖类和糖脂病症的组合物和方法，所述疾病是例如I型H粘多糖贮积症(胡尔勒综合征)、I型S粘多糖贮积症(Scheie综合征)、I型H/S粘多糖贮积症(胡尔勒/Scheie综合征)、II型粘多糖贮积症(Hunter’s综合征)，III型粘多糖贮积症(Sanfilippo A型、Sanfilippo B型、Sanfilippo C型、Sanfilippo D型)、IV型粘多糖贮积症(莫尔基奥A型、莫尔基奥B型)、VI型粘多糖贮积症(马-兰二氏综合征)和VII型粘多糖贮积症(Sly综合征)。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗鞘糖脂代谢的病症的组合物和方法，所述疾病是例如GM1神经节苷脂贮积症包括全身性GM1 II型，幼态(juvenile form)；全身性GM1 III型，成人态(adult form)；GM2神经节苷脂沉积病、Sandhoff-Jatzkewitz病；GM3神经节苷脂沉积病、泰-萨病、Tay-Sachs AB变种、高歇病、尼-皮病A、B、C1、C2和D型、Schindler病、法布里病、乳糖基酰基鞘氨醇过多症、法伯病、克拉伯病、多种 硫酸脂酶缺乏症、Austin病、异染色性脑白质障碍症和硫脂沉积症(sulfatide lipodosis)。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗寡糖贮积病(oligosaccharidose)的组合物和方法，所述病症是例如岩藻糖苷贮积病、粘脂贮积病VI、sialolipidosis、α甘露糖苷过多症、β甘露糖苷过多症、唾液酸沉积症I型和II型、半乳糖唾液酸沉积症、Goldberg综合征和天冬氨酰氨基葡糖尿。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗溶酶体酶转运的病症的组合物和方法，所述病症是例如粘脂贮积病I，唾液酸沉积症；粘脂贮积病II，I-细胞病；和粘脂贮积病III，假赫尔勒多种营养不良。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗氨基酸和有机酸代谢缺陷的组合物和方法，所述病症是例如苯丙酮尿症；I型酪氨酸血症、酪氨酸病；II型酪氨酸血症、里-汉二氏综合征；III型酪氨酸血症；尿黑酸症；高胱氨酸尿症；组氨酸血症；槭糖尿病(MSUD)；MSUD Ib型，MSUD II型；甲基丙二酸尿症；非酮高甘氨酸血症I型(NKHI)和赖氨酸过多血症。 
在其他实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗尿素循环缺陷症的组合物和方法，所述疾病是例如血氨过多；氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-I)缺乏症；鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症；N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏；精氨基琥珀酸尿，精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症；高精氨酸血症，精氨酸酶缺乏症；瓜氨酸血症，精氨琥珀酸合成酶缺乏症和鸟氨酸转氨酶缺乏症。在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗氨基酸转运的缺陷的组合物和方法，所述病症是例如胱氨酸尿症I型；胱氨酸尿症III型；哈特奈扑病和血氨过多-高鸟氨酸血症-同型瓜氨酸尿(HHH)综合征。在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗卟啉症和胆红素血症的组合物和方法，所述疾病是例如先天性红细胞生成性卟啉症(CEP)；红细胞生成性原卟啉症(erythropoietic protoporphyria)(EPP)；ALA 脱水酶缺乏性卟啉症(ADP)；急性间歇性血紫质病(AIP)；遗传性粪卟啉症(HCP)；杂色斑驳卟啉症(variegate porphyria)(VP)；迟发性皮肤卟啉(PCT)；肝红细胞生成型卟啉症(HEP)；吉尔伯特综合征；克-纳二氏综合征，I和I型；杜宾-约翰逊综合征和罗托尔综合征。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗脂肪酸代谢错误的组合物和方法，所述疾病是例如特长链(very-long-chain)酰基-CoA脱氢酶缺乏症(VLCAD)；长链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(LCAD)；中链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(MCAD)；短链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(SCAD；肉毒碱移位酶缺乏症；肉毒碱棕榈酰基转移酶I(CPT I)缺乏症和肉毒碱棕榈酰基转移酶II(CPT II)缺乏症。在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗核苷酸代谢缺陷的组合物和方法，所述疾病是例如莱-萘二氏综合征；严重联合免疫缺陷病(SCID)，由于腺苷脱氨酶(ADA)的缺乏引起的；痛风；肾结石，由于腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)的缺乏引起的；黄嘌呤尿，由于黄嘌呤氧化酶的缺乏引起的；乳清酸尿症，I & I型以及鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症。 
在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗金属代谢和转运的病症的组合物和方法，所述疾病是例如威尔逊病、门克斯病、后头角综合征和hemochromatosis。在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗过氧化物酶体的病症的组合物和方法，所述病症是例如泽韦格综合征、X连锁肾上腺脑白质营养不良、新生儿脑白质肾上腺萎缩症(NALD)、肢根斑点状软骨发育异常(RCDP)和婴儿雷弗素姆氏病(IRD)。在其他优选的实施方案中，本发明的颗粒给药系统提供了用于治疗和缺损DNA修复相关的病症的组合物和方法，所述疾病是例如共济失调性毛细血管扩张症(AT)、着色性干皮病(XP)、科凯恩综合征、布卢姆综合征和范可尼贫血。 
给药途径 
给药途径包括但不限于口服；口腔(buccal)、舌下、经肺、透 皮、透粘膜以及皮下、腹膜内、静脉内和肌内注射。优选的给药途径是口服；口腔、舌下、经肺和透粘膜给药。 
以治疗有效量给受试者施用本发明的颗粒给药系统。可单独地或作为药物可接受的组合物的部分施用所述颗粒给药系统。此外，可例如通过推注一次性地施用组合物或化合物，通过例如系列片剂，多次地，或例如使用控制释放制剂在一段时间内基本上均一地递送来施用化合物或组合物。也要指出，所述化合物的剂量可随时间发生变化。可使用立即释放制剂、控制释放制剂或其组合来施用所述颗粒给药系统。术语“控制释放”包括持续释放、缓慢释放和其组合。 
可以批量、作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或出售本发明的药物组合物。如此处所用的，“单位剂量”是包含预先确定量的活性组分的药物组合物的个别量。所述活性组分的量通常等于可给受试者施用的活性组分的剂量或该剂量的合适部分，例如该剂量的一半或三分之一。 
本发明的药物组合物中的活性组分、药物可接受媒介物和任何其他组分的相对量可以变化，依赖于接受治疗的人的本体、体形大小和身体状况和还依赖于施用组合物的途径。作为例子，所述组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性组分。本发明的药物组合物的单位剂量通常包含大约100毫克至大约2克的活性组分，优选地包含大约200毫克至大约1.0克的活性组分。 
此外，可单独地、和具有不同的有效负载的微粒递送系统或与其他药物活性化合物一起施用本发明的颗粒给药系统。可选择其他药物活性化合物以治疗和使用所述颗粒给药系统治疗的病症一样的病症或不同的病症。 
如果受试者将接受或正在接受多种药物活性化合物，可同时或以任何顺序相继施用所述化合物。例如，在片剂的情况下，可在一个片剂或在分开的片剂中存在所述活性化合物，所述片剂可同时施用或以任何顺序相继施用。此外，应当认识到，所述组合物可以具有不同的形式。例如，可通过片剂递送一种或多种化合物，而通过注射或以糖 浆的形式口服施用其它化合物。 
本发明的另一方面涉及包含本发明的药物组合物和说明材料的试剂盒。说明材料包括用于告知本发明的药物组合物在人中用于此处所示的目的中的一个目的的有用性的出版物、记录、图表或表述的任何其他媒介。所述说明材料也可例如描述本发明的药物组合物的合适剂量。本发明的试剂盒的说明材料可附着至包含本发明的药物组合物的容器或和装有所述药物组合物的容器一起运输。可选择地，所述说明材料可和容器分开运输，意在使说明材料和药物组合物可被接受者共同使用。 
本发明也包括包含本发明的药物组合物和用于将所述组合物递送至人的给药装置的试剂盒。作为例子，所述给药装置可以是可挤压的喷药瓶、定量喷药瓶、气溶剂喷雾装置、喷雾器、干粉递送装置、自推进溶剂/粉末分配装置、注射器、注射针头、棉塞或测量剂量的容器。所述试剂盒还可包含此处描述的说明材料。 
例如，试剂盒可包含两种分开的药物组合物，所述组合物分别包含含有颗粒给药系统和药物可接受的媒介物的第一组合物，和含有第二药物活性化合物和药物可接受的媒介物的组合物。所述试剂盒也包含用于分开的组合物的容器，例如分开的瓶或分开的箔盒。容器的其他实例包括注射器、盒子、袋子等。一般地，试剂盒包含施用分开的组分的指导。当分开的组分优选地以不同的剂型施用(例如，口服和肠胃外)，以不同的剂量间隔施用时，或当组合物的单个组分的滴定是开处方的医生想要的时，所述试剂盒形式是特别有利的。 
试剂盒的实例是泡眼包装。泡眼包装在包装工业中是熟知的且被广泛地用于包装药物单位剂型(片剂、胶囊剂等)。泡眼包装通常由用优选地透明塑料材料的薄片覆盖的相对坚硬的材料片构成。在包装过程中，在塑料薄片中形成凹槽(recesses)。该凹槽具有被包装的片剂或胶囊的大小和形状。然后将片剂或胶囊放入凹槽并用塑料薄片在相对凹槽形成的方向的薄片的一面密封相对坚硬的材料片。结果，片剂或胶囊被封在塑料薄片和片之间的凹槽中。优选地，片的强度大至 可通过用手对凹槽施压，从而在片中凹槽形成的地方产生开口来从泡眼包装中取出片剂或胶囊。然后通过所述开口取出片剂或胶囊。 
在试剂盒上提供记忆辅助可以是想要的，例如以紧靠片剂或胶囊的数字形式提供，其中所述数字对应于如此详细说明的片剂或胶囊应当服用的方案的天数。该记忆辅助的另一个实例是将日程，例如按照“第一周，星期一、星期二、......等......第二周，星期一、星期二”等表印在卡上。记忆辅助的其他变化将非常明显。“日剂量“可以是在给定的一天服用的单一片剂或胶囊或几个丸剂或胶囊。同样，颗粒给药系统组合物的日剂量可为一个片剂或胶囊剂，而第二化合物的日剂量可为几个片剂或胶囊剂，反之亦然。所述记忆辅助应当反应这个且帮助正确的给药。 
在本发明的另一个实施方案中，提供了设计用于按其想要的使用顺序依次分配日剂量的分配器。优选地，所述分配器配备了记忆辅助器，从而进一步有助于顺从给药方案。该记忆辅助器的实例是机械计数器，其显示已分配的日剂量的次数。该记忆辅助器的另一个实例是电池供电的连接液晶读出器的微芯片记忆器，或可听见的提醒信号，所述信号读出例如已服用的最后日剂量和/或提醒人进行下一次给药的时间。 
可通过口服、直肠、肠胃外(例如，静脉内、肌内或皮下)、脑池内、阴道内、腹膜内、膀胱内、局部(例如，粉剂、软膏剂或滴剂)途径或以口腔或鼻腔喷雾的途径给受试者施用任选地包含其他药物活性化合物的颗粒给药系统组合物。 
药物组合物的肠胃外给药法包括特征在于产生人组织的物理裂口并通过组织的裂口施用药物组合物的任何给药途径。因此肠胃外给药包括通过组合物的注射、通过外科切口施用组合物、通过组织穿透非外科伤口施用组合物等进行的药物组合物的给药。特别地，肠胃外给药包括皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内或胸骨内注射和静脉内、动脉内或肾渗析输注技术。 
适合用于肠胃外注射的组合物包含活性组分和药物可接受的媒介 物，所述媒介物是例如生理可接受的无菌水或非水性溶液、分散液、混悬液或乳剂，或可包含无菌粉剂，所述粉剂可重构形成无菌注射液或分散液。合适的水性和非水性媒介物、稀释剂、溶剂或载体的实例包括水、等渗盐水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、甘油三酯，包括植物油例如橄榄油、或可注射的有机酯类例如油酸乙酯。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需颗粒的大小和/或通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以适合于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售这些制剂。可以单位剂型，例如以在安瓿中，在装有防腐剂的多剂量容器中，或在用于自动注射或由医生注射的一次性装置中的形式制备、包装或销售注射剂。 
用于肠胃外给药的制剂包括混悬剂、溶液、油或水媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。这些制剂还可包含一种或多种额外的成分，包括悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给药的制剂的一个实施方案中，以干燥(即粉末或颗粒)的形式提供所述活性组分，所述干燥形式在肠胃外施用所述重构的组合物之前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)进行重构。可以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或销售所述药物组合物。该混悬液或溶液可根据现有技术进行配制，且可包含，除所述活性组分以外，其他组分例如此处描述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂例如水或1，3-丁二醇制备该无菌注射剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油例如合成的甘油一酯或甘油二酯。其他有用的可肠胃外施用的制剂包括这样的制剂，所述制剂包含以微晶形式、存在于脂质体制剂中的活性组分或作为可生物降解的聚合物系统的组分。用于持续释放或植入的组合物可包含药物可接受的聚合物或疏水性材料例如乳剂、阳离子交换树脂、微溶的聚合物或微溶的盐。 
这些组合物也可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和/或分散剂。可通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、 苯酚、山梨酸等来预防组合物的微生物污染。包含等渗剂例如糖、氯化钠等也是想要的。可注射的药物组合物的延长的吸收可通过使用能够延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝/或明胶来产生。 
剂型可包括固体或可注射植入物或贮库(depot)。在优选的实施方案中，所述埋埴剂包含所述颗粒给药系统的等分和可生物降解的聚合物。在优选的实施方案中，合适的可生物降解的聚合物可选自聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(ε-己内酯)、聚酐、聚(β-羟丁酸)、聚(原酸酯)和聚磷嗪。 
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，任选地将所述微粒递送系统和至少一种惯用的惰性赋形剂(或媒介物)混合，所述赋形剂是例如柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)充填剂或增充剂(extender)，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或硅酸；(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或阿拉伯胶；(c)增湿剂例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐、或碳酸钠；(e)溶液阻滞剂，例如，石蜡；(f)吸收促进剂，例如，季胺类化合物；(g)湿润剂，例如，鲸蜡醇或单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土或膨润土；和/或(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。在胶囊剂和片剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。 
包含颗粒给药系统的片剂可通过例如对活性组分，任选地和一种或多种其他组分一起压制或塑型来制备。压制的片剂可通过将以自由流动的形式例如粉末或颗粒制剂的形式存在的活性组分(任选地和一种或多种粘合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂混合)在合适的设备中压制来制备。模制片可通过将活性组分、药物可接受媒介物的混合物和至少足以润湿所述混合物的液体在合适的设备中塑型来制造。用于片剂生产的药物可接受的赋形剂包括惰性稀释剂、制粒剂和崩解剂、粘合剂和润滑剂。已知的分散剂包括土豆淀粉和淀粉羟乙 酸钠。已知的表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。已知的稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的制粒剂和崩解剂包括玉米淀粉和海藻酸。已知的粘合剂包括明胶、阿拉伯胶、预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石。 
片剂可不用包被，或可使用已知的方法包被以在人的胃肠道中获得延缓的崩解，从而在例如小肠中的派尔斑区域中提供持续释放和所述颗粒给药系统的吸收。作为例子，材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可用于包被片剂。此外作为例子，可使用美国专利4,256,108、4,160,452和4,265,874中描述的方法包被片剂以形成受渗透压控制而释放的片剂。片剂还可包含甜味剂、增香剂(flavoringagent)、着色剂、防腐剂或这些添加剂的一些组合，以提供药物上雅致和适口的制剂。 
可用包衣或壳例如肠溶包衣和本领域内熟知的其他制备固体剂型例如片剂、锭剂、胶囊剂和粒剂。其也可包含遮光剂，也可是这样的组合物，即其以延迟的方式释放颗粒给药系统。可使用的埋植组合物的实例是聚合物物质和蜡。活性化合物也可以微胶囊化的形式存在，如果合适，具有一种或多种上述赋形剂。 
相似类型的固体组合物也可在使用赋形剂如乳糖或奶糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的软或硬填充胶囊中用作填充剂。可使用可生理降解的组合物，例如明胶制备包含颗粒给药系统的硬胶囊。该硬胶囊包含颗粒给药系统，且还可包含其他组分，包括例如，惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土。可使用生理可降解的组合物例如明胶制备包含所述颗粒给药系统的软胶囊。该软胶囊包含颗粒给药系统，可将所述颗粒给药系统和水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。 
可使用已知技术制备口服组合物，所述组合物在人受试者的小肠或大肠中特异性地释放口服施用的试剂。例如，用于递送至胃肠系统(包括结肠)的制剂包括基于例如异丁烯酸共聚物例如聚(甲基丙烯 酸、甲基丙烯酸甲酯)的肠溶衣包被的系统，所述肠溶衣只在pH6和以上可溶，这样所述聚合物只有在进入小肠时才开始溶解。这些聚合物制剂分解的位置依赖于肠运输的速率和存在的聚合物的量。例如，相对厚的聚合物包衣用于向近侧结肠的递送(Hardy等人，1987Aliment.Pharmacol.Therap.1：273-280)。也可使用能够提供位置特异性结肠递送的聚合物，其中所述聚合物依赖于大肠的细菌群落以提供所述聚合物包衣的酶促降解从而释放药物。例如，偶氮类聚合物(美国专利4,663,308)、苷类(Friend等人，1984，J.Med.Chem.27：261-268)和各种天然可获得的和修饰的多糖(参见PCT申请PCT/GB89/00581)可用于这些制剂。 
脉冲释放技术例如美国专利4,777,049中描述的技术也可用于施用所述颗粒给药系统至胃肠道内的特定位置。这些系统允许以预定的时间进行递送和可用于递送颗粒给药系统，任选地和其他添加剂一起递送，所述添加剂可改变局部微环境以提高稳定性和促进吸收，而不用直接依赖于除了水的存在以外的外部条件提供体内释放。 
用于口服给药的液体剂型包括药物可接受的乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含通常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、等渗盐水、增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油，特别是，杏仁油、花生油、椰子油、棉子油、花生油、玉米仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、MIGLYOLTM、甘油、分级分离的植物油、矿物油例如液体石蜡、四氢呋喃醇、聚乙二醇、去水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，所述组合物也可包含添加剂，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、粘滑剂(demulcent)、防腐剂、缓冲剂、盐、甜化剂、调味剂、着色剂和芳香剂。混悬液，除了活性化合物外，可包含悬浮剂，例如，乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇或脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢化食用脂、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶、阿拉伯胶、琼脂和纤维素衍生物例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维 素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土或这些物质的混合物等。可以液体的形式或以无水产品的形式制备、包装和销售适合于口服施用的本发明的药物组合物的液体剂型，所述无水产品在使用前用水或其他适合的媒介物进行重构。 
已知的分散剂或湿润剂包括天然发生的磷脂例如卵磷酯、氧化烯和脂肪酸、和长链脂肪醇、和来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯、和来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，分别为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七亚乙基氧鲸蜡醇、聚氧乙烯单油酸山梨醇酯、聚氧乙烯单油酸去水山梨醇酯)。已知的乳化剂包括卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括甲基、乙基或正丙基-对-羟苯甲酸、抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括，例如，甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。已知的含油悬浮液的增稠剂包括例如，蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。 
在其他实施方案中，药物组合物可制备为营养制品，即，以食物(例如，用于直接消费的加工的产品)或食料(例如，用于在摄食前整合入食物的可食用组分)的形式存在，或可加入至食物或食料中。合适的食物的实例包括糖果例如棒棒糖、烘烤的食品例如饼干、面包、饼干和点心蛋糕、完全的浓汤或果泥和蔬菜、饮料和加工的肉产品。合适的食料(foodstuff)的实例包括磨碎的米粒和糖、香料和其他调味品和糖浆剂。此处描述的颗粒给药系统优选地不长时间地暴露于高烹饪温度，以使所述化合物降解减少到最小。 
可通过将颗粒给药系统和合适的非刺激性赋形剂或媒介物例如可可脂、聚乙二醇或栓剂石蜡混合来制备用于直肠或阴道施用的化合物，所述赋形剂或媒介物在通常的室温下是固体，但在体温下是液体，从而在直肠或阴道腔中熔化并释放颗粒给药系统。这样的组合物可以例如栓剂、保留灌肠剂和用于直肠或结肠灌洗的溶液的形式存在。栓剂制剂还可包含各种额外的组分，包括抗氧化剂和防腐剂。可通过将所述活性组分和药物可接受的液体媒介物组合来制备用于直肠或结肠灌洗的保留灌肠剂或溶液。如在本领域已知的，可使用适合于人的直肠解剖学的装置施用灌肠剂，和可将其包装在所述装置内。灌肠剂还可 包含各种额外的组分，包括抗氧化剂和防腐剂。 
可以适合用于通过口腔进行的肺部给药的制剂形式制备、包装或销售本发明的药物组合物。可使用包含无水粉剂贮器(可导入推进剂流以分散所述粉剂)的装置或使用自动推进溶剂/粉剂分散容器(例如包含悬浮于密封的容器中的低沸点推进剂中的颗粒给药系统的装置)方便地以无水粉剂形式施用这些组合物。无水粉剂组合物可包含固体细粉稀释剂例如糖，且方便地以单位剂型提供。低沸点推进剂通常包括具有在大气压下具有低于65°F的沸点的液体推进剂。一般地所述推进剂可组成所述组合物的50至99.9％(w/w)，活性组分可组成组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂还可包含其他组分例如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选地具有和包含所述颗粒给药系统的微粒相同量级的微粒大小)。 
用于肺部递送的本发明的药物组合物也可以悬浮液的滴剂的形式提供活性组分。这些制剂可以含水的或稀释的醇悬浮液(任选地无菌的，包含所述颗粒给药系统)的形式制备、包装或销售，且可使用任何喷雾或雾化装置方便地施用。这些制剂还可包含一种或多种其他组分，包括调味剂例如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂或防腐剂例如甲基羟基苯甲酸酯。 
此处描述的用于肺部给药的制剂也用于本发明的药物组合物的鼻内给药。适合于鼻内给药的另一种制剂是包含所述药物给药系统的粗粉。以其中鼻吸药(snuff)被吸收，即通过鼻道从置于靠近鼻孔的粉剂的容器快速吸入而吸收的方式施用该制剂。 
可以适合于口腔给药的制剂制备、包装或销售本发明的药物组合物。这些制剂可，例如，以使用常规方法制备的片剂或锭剂的形式存在，且可，例如，包含0.1至20％(w/w)颗粒给药系统，其余部分包含口服可溶解的或可降解的组合物和，任选地，一种或多种此处描述的其他组分。可选择地，适合于口腔施用的制剂可包含粉剂或雾化的或粉化的包含所述颗粒给药系统的溶液或悬浮液。 
抗体 
如此处所用的，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)包括能够特异性地结合蛋白的完整分子和抗体片段(例如，Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，可更快速地从循环中清除，且可比完整的抗体具有更少的非特异性组织结合。因此，这些片段是优选的，Fab或其他免疫球蛋白表达文库的产物也是优选的。此外，本发明的抗体包括嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体。 
可使用许多本领域已知的技术制备抗体。下面简单地描述合适的技术。抗体可以是多克隆的或单克隆的。多克隆抗体对于初始发展可具有显著的有利方面，包括生产的快速性和对于多个表位的特异性，从而确保强免疫荧光染色和抗原捕获。单克隆抗体适合大规模生产；优选的实施方案包括至少一种对于靶抗原的表位是特异性的单克隆抗体。因为多克隆制剂不能容易地进行大规模生产重复生产，所以另一个实施方案使用至少四种单克隆抗体的混合物。 
单链Fv(“scFv”或“sFv”)多肽是共价连接的VH:VL异二聚体，其可从包含直接连接的或通过编码肽的连接体连接的VH和VL编码序列的核酸表达。Huston，等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)。许多结构用于将天然聚集但化学上分开的来自抗体V区的轻多肽链和重多肽链转化成能折叠成基本上和抗原结合位点相似的三维结构的scFv分子。参见，例如，美国专利6,512,097、5,091,513和5,132,405和4,956,778。 
在一类实施方案中，可使用重组设计方法产生用于将两个天然结合的但化学上分开的来自抗体可变区的重多肽链和轻多肽链转化成能折叠成三维结构的sFv分子的合适的化学结构(连接体)，所述三维结构基本上和天然抗体结构相似。设计标准包括确定横跨一条链的C末端和另一条链的N末端之间的距离的合适长度，其中一般从小亲水性的不易卷曲或不形成二级结构的氨基酸残基形成连接体。已在本领域中描述了这些方法。参见，例如，属于Huston等人的美国专利5,091,513和5,132,405；和属于Ladner等人的美国专利4,946,778。 
在该方面，连接体设计的第一一般步骤包括鉴定被连接的可能位置。VH和VL多肽结构域的各肽上的合适的连接位点包括导致来自多肽结构域的残基的最少丢失的位点，这使得连接体必需包含符合分子稳定性所需的最少数目的残基。成对的位置确定被连接的“缺口”。将一个结构域的C末端连接至下一个结构域的N末端的连接体通常包含亲水性氨基酸，所述氨基酸在生理溶液中呈现未组织的构型且优选地不含具有可能干扰VH和VL链正确折叠的大侧链基团的残基。因此，在本发明下的合适的连接体一般包含甘氨酸和丝氨酸残基的交替排列的多肽链，且可包含插入的谷氨酸和赖氨酸残基以增强稳定性。可使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术容易地提供编码这些连接体部分的核苷酸序列。 
可选择地，人源化抗体片段可包含鼠类单克隆抗体的抗原结合位点和来源于人抗体的可变区片段(缺少抗原结合位点)。用于产生嵌合的和进一步基因工程改造的单克隆抗体的方法包括描述于Riechmann等人(Nature 332：323，1988)，Liu等人(PNAS 84：3439，1987)，Larrick等人(Bio Technology 7：934，1989)，和Winter and Harris(TIPS 14：139，May，1993)中的方法。 
用于产生人抗体的一个方法包括用靶抗原免疫非人动物，例如转基因小鼠，由此在所述动物中产生抗所述靶抗原的抗体。已在非人动物中发展了用于产生人抗体的方法。所述抗体可以部分是人的，或优选的完全是人的。可使用已导入编码一种或多种人免疫球蛋白链的遗传物质的非人动物(例如转基因小鼠)。可以多种方法从遗传上改变该转基因小鼠。遗传操作可导致人免疫球蛋白链在至少一些(优选地几乎所有)由免疫后的动物产生的抗体中取代内源免疫球蛋白链。此处提供通过靶抗原免疫转基因动物产生的抗体。 
已产生了在其中通过各种方法失活一个或多个内源免疫球蛋白基因的小鼠。已将人免疫球蛋白基因导入小鼠以取代失活的小鼠基因。在动物中产生的抗体整合由导入该动物的人遗传物质编码的人免疫球蛋白多肽链。用于生产的技术和这些转基因动物的用途的实例描述于 美国专利5,814,318、5,569,825和5,545,806，其在此引用作为参考。 
可通过常规的方法，例如，通过使从完成免疫方案后的转基因动物收获的脾细胞永生化来产生单克隆抗体。可通过常规的方法将所述脾细胞和骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤。 
用于产生杂交瘤细胞系的方法包括用包含靶抗原的至少7个连续氨基酸残基的免疫原免疫该转基因动物；从所述免疫的动物收获脾细胞；将收获的脾细胞和骨髓瘤细胞系融合，从而产生杂交瘤细胞；和鉴定产生结合靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明包括这些杂交瘤细胞系，和从其产生的单克隆抗体。通过常规技术纯化由所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。 
在另一个实施方案中，通过在竞争抗原组存在的情况下针对一组抗原从非免疫噬茵体展示抗体库选择来产生抗体片段(Stausbol- 
Figure S05837576420070509D000511
B.，等人，De novo identification of cell-type specificantibody-antigen pairs by phage display subtraction.Isolationof a human single chain antibody fragment against human keratin14.Eur J Biochem 2001May；268(10)：3099-107)。该方法可用于产生抗靶抗原的噬茵体抗体。所述方案总地来说基于由Stausbol- 
Figure S05837576420070509D000512
B.，等人，2001描述的方案。简而言之，使用非免疫的半合成噬菌体展示抗体库。该库是通过重新克隆来自lox文库的重链和轻链区域构建的单链Fv(scFv)噬菌粒库(Griffiths，A.D.，等人(1994)Isolation of high affinity human antibodies directlyfrom large synthetic repertoires.EMBO J.13，3245-3260.)。大肠杆菌TGl(supE hsdD5Δ(lac-proAB)thi F′{traD36 proAB+lacIq lacZΔM15])是琥珀突变抑制基因株系(aupE)且用于噬茵体颗粒的繁殖。大肠杆菌HB2151(araΔ(lac-proAB)thi F′(proAB+lacIq lacZΔM15])是非抑制基因株系且用于表达可溶性scFv。在另一个实施方案中，可扩增和拯救人单链Fv(scFv)文库，如所描述的(Gao，等人.，Making chemistry selectable by linking it to infectivity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第94卷，pp.11777-11782，October 1997)。就抗悬浮在PBS(10mM磷酸盐、150mM NaCl，pH 7.4)中的靶抗原淘选文库并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)选择阳性scFv-噬菌体。 
在另一个优选的实施方案中，通过提供编码重组抗体，优选地单链Fv抗体的表达载体提供抗体。 
实施例1 
图1是酵母细胞壁的横截面的示意图100，从外向内显示，外纤维层110、外甘露糖蛋白层120、β-葡聚糖层130、β-葡聚糖层-壳多糖层140、内甘露糖蛋白层150、质膜160和细胞质170。 
WGP微粒的制备 
之前从Alpha-Beta Technology获得完整葡聚糖微粒(WGP，LotW0282)。一般地，通过从酵母细胞壁提取和纯化碱不溶性葡聚糖级分来制备完整葡聚糖微粒。用氢氧化物水溶液处理酵母细胞而不破坏酵母细胞壁，该处理降解细胞的蛋白和细胞内部分，留下没有显著蛋白污染的葡聚糖壁组分，且具有基本上未改变的β(1-6)和β(1-3)连接的葡聚糖的细胞壁结构。在分批补料发酵的条件下将酵母细胞(酿酒酵母(S.cerevisae)株系R4)在基本培养基中培养至中期对数期(midlogphase)。在2000rpm下通过分批离心10分钟收获细胞(大约90g干细胞重/L)。然后在蒸馏水中洗涤细胞一次，之后重悬浮于1升1M NaOH中并加热至90℃。在该温度下强烈地搅拌细胞悬浮液1小时。在2000rpm下离心10分钟回收包含细胞壁的不溶性材料。然后将该材料悬浮于1升1M的NaOH中并再次加热至90℃。在该温度下强烈地搅拌细胞悬浮液1小时。然后让该悬浮液冷却至室温，再持续进行提取16小时。在2000rpm下离心10分钟回收该不溶性材料。最终在75℃下在1升用HCl调节至pH4.5的水中提取该材料1小时。通过离心回收该不溶性残留物并用200毫升水洗涤3次，用200毫升异丙醇洗涤4次和用200毫升丙酮洗涤2次。将所得的浆放入玻璃托盘中并在减压条件下在55℃下进行干燥，产生7.7g精细白色粉末。 
可在美国专利4,810,646、4,992,540、5,028,703、5,607,677和5,741,495中找到完整葡聚糖微粒的更详细描述和制备其的方法，其教导在此引用作为参考。例如，美国专利5,028,703公开了可从发酵培养的酵母细胞制备酵母WGP微粒。在Sorval RC2-B离心机中，在8000rpm下通过分批离心20分钟收获细胞。然后在蒸馏水中洗涤所述细胞2次以准备将其用于完整葡聚糖的提取。第一步骤包括重悬浮细胞团于1升4％w/v NaOH中并加热至100℃。在该温度下强烈地搅拌细胞悬浮液1小时。在2000rpm下离心15分钟回收包含细胞壁的不溶性材料。然后将该材料悬浮于2升3％w/v NaOH中并加热至75℃。在该温度下强烈地搅拌细胞悬浮液3小时。然后让悬浮液冷却至室温并继续进行提取16小时。在2000rpm下离心15分钟回收不溶性材料。最后在75℃，在2升用HCl调节至pH 4.5的3％w/v的NaOH中提取该材料1小时。离心回收不溶性残留物并用200毫升水洗涤3次，用200毫升脱水乙醇洗涤1次和用200毫升脱水乙醚洗涤2次。将所得的浆放入培养皿并进行干燥。 
YGMP微粒的制备 
将酿酒酵母(100g Fleishmans Bakers酵母)悬浮于1升1M NaOH中并加热至55℃。在该温度下混合细胞悬浮液1小时。通过在2000rpm下离心10分钟回收包含细胞壁的不溶性材料。然后将该材料悬浮于1升水中并用HCl调节至pH 4-5，然后在55℃下温育1小时。离心回收不溶性残留物并用1000毫升水洗涤1次，用200毫升脱水异丙醇洗涤4次和用200毫升丙酮洗涤2次。将所得的浆放入玻璃托盘中并在室温下干燥，产生12.4g精细、淡灰白色的粉末。 
YGMP微粒的制备 
将酿酒酵母(75g SAF-Mannan)悬浮于1升水中并用1M NaOH调节至pH 12-12.5，然后加热至55℃。在该温度下混合细胞悬浮液1小时。在2000rpm下离心10分钟回收包含细胞壁的不溶性材料。然后将 该材料悬浮于1升水中并用HCl调节至pH 4-5，然后在55℃下温育1小时。通过离心回收不溶性残留物并用1000毫升水洗涤1次，用200毫升脱水异丙醇洗涤4次和用200毫升丙酮洗涤2次。将所得的浆放入玻璃托盘中并在室温下进行干燥，产生15.6g精细淡灰白色粉末。 
YCP微粒的制备 
在30℃下，在YPD中将来源于获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)的培养物的酵母细胞红酵母菌株(Rhodotorula sp.)在需氧条件下培养至静止期。可从ATCC获得的红酵母菌株培养物包括Nos.886、917、9336、18101、20254、20837和28983。在2000rpm下分批离心10分钟收获细胞(1L)。然后在蒸馏水中洗涤细胞一次，然后将其在75℃下重悬浮于用HCl调节至pH 4.5的水中，进行1小时。在2000rpm下离心10分钟回收包含细胞壁的不溶性材料。然后将该材料悬浮于1升1M NaOH中并加热至90℃，进行1小时。然后让所述悬浮液冷却至室温并继续进行提取16小时。在2000rpm下离心15分钟回收不溶性残留物并用1000毫升水洗涤2次，用200毫升异丙醇洗涤4次和用200毫升丙酮洗涤2次。将所得的浆放入玻璃托盘中并在室温下干燥，产生2.7g精细淡棕色粉末。 
图2A是酵母细胞壁颗粒的结构图解；图2B是显示酵母细胞壁颗粒的甘露聚糖组分的伴刀豆球蛋白-A-FITC(con-A-异硫氰酸荧光素，Sigma Chemical，St.Louis，MO)染色的荧光显微照片；图2C是YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖微粒的结构的图解，图2D是显示YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖微粒的点状con-A-FITC染色的荧光显微照片；图2E是YGPβ葡聚糖微粒的结构的图解，图2F是显示缺乏YGPβ葡聚糖微粒的con-A-FITC染色的荧光显微照片。 
伴刀豆球蛋白-A是选择性地结合甘露糖的凝集素。通过荧光显微镜评估伴刀豆球蛋白-A-FITC的结合以观察各种酵母细胞壁制剂的表面上的甘露聚糖的量和分布模式。以1×108个微粒/ml的密度制备面包酵母(Fleishmans Bakers yeast)、YGMP和YGP在PBS+1mM MgCl2 +1mM CaCl2中的悬浮物。Con-A-FITC母液是PBS+1mM MgCl2+1mM CaCl2 中的1mg/ml的伴刀豆球蛋白-A-FITC。在微量离心管中制备标记混合物，所述混合物由下列物质组成： 
100μl PBS+1mM MgCl2+1mM CaCl2
2.5μl酵母细胞壁颗粒悬浮物 
2.5μl con-A-FITC母液溶液。 
将装有所述标记混合物的微量离心管在黑暗处在室温下温育1小时。离心(在10,000rpm下进行10分钟)收集酵母细胞壁颗粒，然后用100μl PBS洗涤沉淀3次。将洗涤的酵母细胞壁颗粒重悬浮于100μlPBS中，然后转移至96孔板中以用荧光显微镜进行检查。示例性视野的照片显示于图2B、2D和2F。下面的表2概述了如上所述制备的WGP微粒、YGP微粒、YGMP微粒和YCP微粒的样品的化学组分分析的结果。要注意，YGP微粒和YGMP微粒，和现有技术WGP微粒相比，具有更低的β葡聚糖含量，通常在大约6至大约90的重量百分比之间和更高的蛋白含量。YGMP微粒，和其他微粒类型相比，具有显著更高的甘露聚糖含量，通常在大约6至大约90的重量百分比之间。YCP微粒，和其他微粒类型相比，具有显著更高的壳多糖+壳聚糖含量，通常大约50至大约75的重量百分比。 
Figure S05837576420070509D000561
实施例2酵母细胞壁颗粒的流体动力学体积 
酵母的流体动力学体积确定为颗粒的有效负载容量的测量。在配衡的15ml离心管中称量1g酵母细胞壁颗粒的等分以确定所述无水颗粒的重量。向管中加入水(12.5ml)，然后涡旋振荡管以混合酵母细胞壁颗粒的悬浮液。让颗粒膨胀并吸收水分，进行30分钟。在2000rpm下离心所述颗粒悬浮物10分钟。移走水，称取管重，计算吸收的水的重量。流体动力学体积计算为吸收的水的重量与无水颗粒的重量的比率。表3提供了现有技术WGP的两种制剂和本发明的YGP和YGMP的结果。 
Figure S05837576420070509D000571
WGP制剂2的更低的流体动力学体积可归因于该制剂中增加的破碎颗粒数目。至于其他颗粒，“更纯”的YGP具有比YGMP更高的流体动力学体积。 
一般地，将有效负载体积限制在＜66％的流体动力学体积以确保通过酵母细胞壁颗粒的有效负载的定量吸收。按照该规则，每mgYGP颗粒可装载≤5.5μl的有效负载，每mg YGMP颗粒可装载≤4.4μl有效负载。 
实施例3YGP和YGMP的口服生物利用度 
制备荧光标记的酵母葡聚糖微粒(YGP-F)和荧光标记的酵母葡聚糖-甘露聚糖微粒(YGMP-F)以进行吸收研究。起始材料是：5ml YGP(5mg/ml于0.1M硼酸盐缓冲液中，pH8)、5ml YGMP(5mg/ml于0.1M硼酸盐缓冲液中，pH8)、新配制的20mg/ml的DMSO中的二氯三嗪基氨基荧光素(DTAF)和0.1M硼酸盐缓冲液，pH 8。 
以25mg的规模进行标记反应。将25mg微粒等分悬浮于5ml 0.1M硼酸盐缓冲液，pH8中并进行超声处理以将微粒团块分散成单个微粒。离心所述微粒并重悬浮于5ml 0.1M硼酸盐缓冲液，pH 8中。向重悬浮的微粒中加入DTAF(0.5ml 20mg/ml)并在37℃下温育2天。在温育结束时，加入5ml 1M Tris缓冲液，pH 8.3并将混合物温育30分钟以淬灭DTAF。离心温育的微粒并在PBS中进行洗涤直至上清液不再具有荧光。将洗涤的微粒以5mg/ml重悬浮于PBS中。计数以1∶100稀释的等分中的微粒数目。结果，在每ml YGP-F 1.8×109个微粒的浓度 和每ml YGMP-F 2.1×109个微粒的浓度上产生强烈荧光的酵母细胞壁颗粒。 
研究表面糖组分对酵母葡聚糖微粒的口服利用度的影响以确定是否可通过甘露糖受体和通过CR3/dectin-1β-葡聚糖受体靶向有效负载的吞噬性微粒吸收。靶向两种受体中的任一受体或同时靶向两种受体的能力可扩大至巨噬细胞和树突细胞以外的靶细胞群体。 
在下面的表4中概述了处理组。初始材料包括：FITC-标记的酵母葡聚糖微粒(YGP-F)、FITC-标记的酵母葡聚糖-甘露聚糖微粒(YGMP-F)、7只C57黑色小鼠的组和7只C57/B16小鼠的组。制备YGP-F(1mg/ml)和YGMP-F(3.7mg/ml)的剂量以递送0.1ml PBS中的等量微粒，每天通过口服强饲法给来自各组的一只小鼠进行施用，进行5天。通过每天给来自各组的一只小鼠皮下注射0.1ml来施用相同的剂量，进行5天。在第4天更换笼子并提供新的草垫。在第5天将各组的粪粒收集入15ml圆锥形管中并冷冻以便以后进行处理。通过加入5m水和保持在4℃下进行2小时来处理粪粒。使用Polytron匀浆器均质化含水粪粒。将均质化的粪便的稀释物置于96孔微量板中并在荧光和透射白光条件下就荧光微粒的存在对其进行显微镜检查。进一步稀释具有荧光微粒的等分并用血细胞计数器计算每毫升中荧光粒的数目。 
在第7天杀死小鼠，从各动物中取出脾脏并放入置于冰上的分开的装有PBS的管中。用剪力剪碎脾脏并挤压通过70微米的筛子以产生单细胞悬浮物。获取单细胞悬浮物的等分并将其固定在1％的PBS中的福尔马林中以使用FACS定量荧光微粒标记的细胞的级分。使用藻红蛋白(PE)标记(优选地鼠类Emr-1(F4/80))的抗巨噬细胞标记的抗体对细胞悬浮物进行染色，所述抗体染脾红髓巨噬细胞、Kupffer细胞、小胶质细胞和朗氏细胞。 
以每60mm的培养皿107个细胞的密度将细胞悬浮液涂板在含有10％胎牛血清(JRH Scientific)、青霉素-链霉素和谷氨酰胺(Gibco)的DMEM中并在5％CO2下在37℃下温育24小时以使之附着。温育后，洗去任何未附着的淋巴细胞。用胰蛋白酶酶解附着的脾巨噬细胞，固 定所述细胞并使用荧光显微镜对具有荧光微粒的粘附细胞的级分评分。 
所述荧光微粒的施用能被良好地耐受。粘附的脾巨噬细胞的分析证明在所有荧光微粒处理的动物中存在荧光酵母细胞壁颗粒。这些结果证明YGP-F和YGMP-F都具有口服生物利用度且可通过巨噬细胞全身性地分配。粪便的分析证明存在荧光微粒，表明口服吸收在所用的剂量水平上是不完全的。C57/B16小鼠能够吸收口服施用的YGP-F和YGMP-F。粪便中荧光微粒的数目定量为吸收效率的估值。 
Figure S05837576420070509D000591
实施例4：装载壳聚糖的YGP微粒的制备 
制备具有阳离子捕获聚合物壳聚糖的YGP微粒。使用高分子量(HMW)的壳聚糖(～70,000Mw，Sigma Chemical St.Louis，Mo)或低分子量(HMW)的壳聚糖(～10,000Mw，Sigma Chemical St.Louis，Mo)在0.1M醋酸中制备1％w/v的壳聚糖溶液。在0.1M醋酸中制备1％w/v HMW和LMM壳聚糖溶液。向50ml尖底离心管中的2g YGP中加入4ml HMW或LMW壳聚糖溶液，混合直至光滑的糊剂形成。在室温下温育混合物1小时以使液体被吸收。向各管中加入NaOH(40ml，0.1M)， 将所述管立即涡旋以沉淀YGP中的壳聚糖。将YGP：壳聚糖悬浮液通过18号规格注射针(18 guage needle)以产生YGP：壳聚糖微粒的精细悬浮物。通过离心(在2,000rpm下进行10分钟)收集YGP：壳聚糖微粒，然后用去离子水洗涤沉淀直至上清液的pH为7-8。然后用两倍于沉淀体积的异丙醇洗涤YGP：壳聚糖微粒4次，之后用两倍于沉淀体积的丙酮洗涤2次。然后在通风厨中在室温下干燥YGP：壳聚糖微粒。该方法产生1.2g YGP:LMW壳聚糖微粒和1.4g YGP:HMW壳聚糖微粒。 
实施例5：装载CytoPureTM的YGP微粒的制备 
制备具有可生物降解的阳离子捕获聚合物CytoPureTM(其为商购可获得的专卖药品，是种水溶性的阳离子聚合物转染剂(Qbiogene，Inc.，CA))的YGP微粒。在0.5ml去离子水中稀释20μl CytoPureTM，然后加入至50ml尖底离心管中的0.5g YGP中，混合直至形成匀滑的糊剂。将所述混合物在4℃温育15分钟以使液体被吸收。向各管中加入25ml乙醇，将所述管立即涡旋以沉淀YGP内的CytoPureTM。超声处理YGP:CytoPureTM悬浮液以产生精细的YGP:CytoPureTM微粒悬浮液。通过离心(在2,000rpm下进行10分钟)收集YGP:CytoPureTM微粒，然后用两倍于沉淀体积的异丙醇洗涤沉淀4次，之后用两倍于沉淀体积的丙酮洗涤2次。然后在通风厨中在室温下干燥YGP:CytoPureTM微粒。该方法产生0.45g YGP:CytoPureTM微粒。 
实施例6：装载聚乙烯亚胺的YGP微粒的制备 
用聚乙烯亚胺(PEI)作为阳离子捕获聚合物制备YGP微粒。将0.5ml的2％w/v PEI(～50,000Mw，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)水溶液的等分加至50ml尖底离心管中的0.5g YGP中，混合直至形成匀滑的糊剂。将所述混合物在室温下温育1小时以使液体被吸收。向各管中加入25ml乙醇，将所述管立即涡旋以沉淀YGP内的PEI。将YGP:PEI悬浮液通过18号规格注射针以产生YGP:PEI微粒的精细悬浮液。通过离心(在2,000rpm下进行10分钟)收集YGP:PEI微粒，然后 用两倍于沉淀体积的异丙醇洗涤沉淀4次，之后用两倍于沉淀体积的丙酮洗涤2次。然后在通风厨中在室温下干燥YGP:PEI微粒。该方法产生0.48g YGP:PEI微粒。 
实施例7：装载藻酸盐的YGP微粒的制备 
用藻酸盐(F200或F200L，Multi-Kem Corp.，Ridgefield，NJ)作为阴离子捕获聚合物制备YGP微粒。向50ml尖底离心管中的1g YGP加入2ml的1％w/v的藻酸盐水溶液，混合以形成匀滑的糊剂。在室温下温育所述混合物1小时以使液体被吸收。用40ml 1％w/v的氯化钙水溶液稀释所述混合物。将YGP：藻酸盐悬浮液通过18号规格注射针以产生精细的YGP：藻酸盐微粒的悬浮液。通过离心(在2,000rpm下进行10分钟)收集YGP：藻酸盐微粒，然后用两倍于沉淀体积的异丙醇洗涤YGP：藻酸盐微粒4次，之后用两倍于沉淀体积的丙酮洗涤2次。然后在通风厨中在室温下干燥YGP：藻酸盐微粒。该方法产生0.95gYGP:F200藻酸盐微粒和0.86g YGP:F200L藻酸盐微粒。 
实施例8：装载聚L赖氨酸的YGP和YGMP微粒的制备 
用聚L赖氨酸(PLL)作为捕获聚合物制备YGP和YGMP微粒。向50ml尖底离心管中的1g YGP或YGMP中加入4ml 1％w/v PLL(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)水溶液。将混合物在55℃下温育30分钟以使液体被吸收。向各管中加10ml乙醇，匀浆(Polytron匀浆机)所述管以产生YGP:PLL或YGMP:PLL的精细微粒悬浮物。通过离心(在2,000rpm下进行10分钟)收集YGP:PLL或YGMP:PLL微粒，然后用两倍于沉淀体积的异丙醇洗涤YGP:PLL或YGMP:PLL4次，之后用两倍于沉淀体积的丙酮洗涤2次。然后在通风厨中在室温下干燥YGP:PLL或YGMP:PLL。该方法产生1.3g YGP:PLL微粒和1.1g YGMP:PLL微粒。显微镜评估显示没有游离的PLL凝聚体，只有YGP:PLL或YGMP:PLL微粒。 
实施例9：装载黄单胞菌多糖的YGP和YGMP的微粒的制备 
用黄单胞菌多糖作为阴离子捕获聚合物制备YGP和YGMP微粒。将4ml 1％w/v黄单胞菌多糖水溶液加热至55℃以减少粘性，将其加入至50ml尖底离心管中的1g YGP或YGMP中。在55℃下温育该混合物30分钟。向各管中加入10ml乙醇，匀浆(Polytron匀浆机)所述管以产生YGP：黄单胞菌多糖或YGMP：黄单胞菌多糖的精细微粒悬浮物。离心(在2,000rpm下进行10分钟)收集YGP：黄单胞菌多糖或YGMP：黄单胞菌多糖微粒，然后用两倍于沉淀体积的异丙醇洗涤YGP：黄单胞菌多糖或YGMP：黄单胞菌多糖微粒4次，之后用两倍于沉淀体积的丙酮洗涤2次。然后在通风厨中在室温下干燥YGP：黄单胞菌多糖或YGMP：黄单胞菌多糖。该方法产生1.2gYGP：黄单胞菌多糖微粒和1.1g YGMP：黄单胞菌多糖微粒。显微镜评估显示没有游离的黄单胞菌多糖凝聚体，只有YGP：黄单胞菌多糖或YGMP：黄单胞菌多糖微粒。 
实施例10：YGP：壳聚糖和YGP：藻酸盐结合带电荷的染料的能力的评估 
如上述的实施例7和9中所描述的，制备YGP：壳聚糖和YGP：藻酸盐微粒。制备0.1％w/v台盼蓝水溶液(Benzamine blue；CI 23850)(阴离子染料)和二甲苯腈蓝(酸性蓝，阳离子染剂)。向微量离心管中的10mg YGP、YGP：壳聚糖或YGP：藻酸盐中加入50μl 0.1％w/v的染料水溶液，然后将所述混合物在室温下温育1小时。用去离子水洗涤沉淀直至上清液不再有色。估量沉淀的颜色；结果示于下面的表5。 
Figure S05837576420070509D000621
YGP内的不溶性捕获聚合物之间的静电相互作用能够结合带相反电荷的低分子量模型染料有效负载。 
实施例11：YGP：琼脂糖通过物理俘获来捕获分子的用途 
制备YGP：琼脂糖以评估作为将有效负载捕获在YGP中的方法的物理俘获。在TE中制备2％w/v的琼脂糖溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，冷却至50℃。将1mg/ml的TE中的鲑精DNA母液在50℃下稀释成0.5mg/ml TE或1％琼脂糖中的DNA。将500mg YGP的等分和500μl TE中的DNA或500μl琼脂糖中的DNA在50℃下混合，将所述混合物在50℃下温育1小时。然后在冰箱中冷却该混合物1小时以固化琼脂糖。1小时后，加入10ml TE，然后将混合物在冰箱中温育过夜。离心该混合物，通过在260nm处的吸光率测量上清液中的DNA。和YGP:TE对照产生的＜1％的保留相比，YGP：琼脂糖保留了大约＞80％的所用的DNA。这些结果表明琼脂糖通过物理俘获有效地将DNA捕获在YGP内。 
实施例12：YGP：聚丙烯酰胺通过物理俘获来捕获分子的用途 
制备YGP：聚丙烯酰胺以评估作为将有效负载捕获在YGP中的方法的物理俘获。将1mg/ml的TE中的鲑精DNA的母液稀释成0.5mg/ml的TE或30％聚丙烯酰胺/二(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中的DNA。向各DNA混合物中加入TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙烯二胺)(1μl TEMED加至5ml DNA溶液中)，向1g YGP中加入2ml各溶液的等分。混合所得产物以形成均匀的悬浮液并在室温下温育3小时。在3小时的温育后，加入10ml TE并将所述混合物在冰箱中温育过夜。然后离心混合物，通过在260nm处的吸光率测量上清液中的DNA。相对于YGP:TE对照产生的＜1％的保留，YGP：聚丙烯酰胺保留了大约＞95％的所用的DNA。这些结果表明聚丙烯酰胺是用于通过物理俘获将DNA捕获在YGP中的有效捕获聚合物。 
实施例13：用小分子四环素装载YGP 
使用相对不溶的四环素钙盐将抗生素四环素(tet)装载入YGP。所用的酵母细胞壁颗粒是如上所述制备的YGP、YGP:F200藻酸盐和YGP:F200L藻酸盐。母液是1M CaCl2和100mg/ml HCl四环素(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。表6中概述所建立的装载混合物。在室温下温育所述混合物30分钟，然后如所示，加入去离子水或1MCaCl2。在室温下进行60分钟后，超声处理混合物并在室温下再温育至少30分钟。 
Figure S05837576420070509D000641
然后离心(在2,000rpm下进行10分钟)混合物并通过沉淀的黄色和初始上清液的黄色指示四环素的存在。根据355nm四环素吸收光谱的峰处的吸光率的损失来计算装载入酵母细胞壁颗粒中的四环素量。和去离子水空白对照相比，稀释在200μl去离子水中的4μl 100mg/ml的HCL四环素在355nm具有0.538的吸光率。也通过分光光度计测量从负载的酵母细胞壁颗粒释放入PBS或0.1M HCl的四环素。 
所述结果概述于上面的表6中。一般地，当洗涤后，YGP:F200藻酸盐和YGP:F200L藻酸盐沉淀呈黄色时，YGP沉淀不为黄色，表明 在捕获聚合物不存在的情况下少量(即便有)四环素以氢氯化物或钙盐的形式装载。相反地，四环素被有效地载入和被捕获入YGP:F200藻酸盐和YGP:F200L藻酸盐制剂中，大约25-30％的使用的四环素负载以藻酸钙盐的形式被吸收。将捕获的四环素从YGP:F200藻酸盐和YGP:F200L藻酸盐释放入0.1M HCl中。在37℃下在PBS中进行1小时，捕获的四环素部分地保留在YGP:F200藻酸盐和YGP:F200L藻酸盐中，大约为0.1M HCl可提取的26.5-51.6％。 
总之，四环素可容易地以藻酸钙盐复合物的形式被捕获在YGP-藻酸盐-钙组合物中，但不能有效地载入或保留在单独的YGP内。以藻酸钙复合物形式被捕获在YGP:F200藻酸盐或YGP:F200L藻酸盐中的四环素在37℃下缓慢地释放在PBS中且在酸性条件下基本上完全释放。 
实施例14：Tet和YGP:Tet增加J774巨噬细胞体外杀死微生物中的功效 
如上述实施例13中所描述的，制备YGP：藻酸盐-tet。每ml母液中的YGP和YGP：藻酸盐-tet的微粒的数目分别是9×107/ml和6×108/ml。 
如上面表7中所概述的，将1ml鼠类巨噬细胞J774(5×105/ml)和各种浓度的YGP、YGP：藻酸盐-tet或四环素一起温育。将所述J774细胞在培养基(含有10％胎牛血清而无抗生素或谷氨酰胺的DMEM)中培养过夜。将培养物和单独的培养基、在培养基中稀释的四环素或在培养基中稀释的微粒在37℃下旋转温育1小时以允许所述微粒的吞噬。在96孔板中建立微生物杀死测定法。将培养物在培养基中稀释并温育过夜以使tet代谢和从吞噬的YGP：藻酸盐-tet微粒中释放出来。如表6中所示，加入细菌攻击，且将所述培养物在CO2培养箱中在37℃下温育2小时以允许金黄色葡萄球菌(S.aureus)的吞噬和通过J774鼠类巨噬细胞将其杀死。在该温育后，向各培养物中加入200μl LB液体培养基(Luria-Bertani Broth：1.0％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl)以裂解巨噬细胞。在培养箱中在37℃下温育培养物以允许 存活的金黄色葡萄球菌过度生长。根据pH的改变(由苯酚红指示)监控生长。比较YGP、YGP：藻酸盐-tet或四环素。在表7的最右两栏提供了结果。 
Figure S05837576420070509D000661
大约7.5×106个YGP：藻酸盐-tet微粒对巨噬细胞产生的作用和大约2.5μg/ml四环素HCl的作用大致相等。单独的巨噬细胞比任一模式中用四环素处理的巨噬细胞效率相对较低，且和用单独的空白YGP处理的巨噬细胞的功效大致相同。巨噬细胞和溶液中的游离的四环素组合的效率不比单独的四环素高多少。用YGP：藻酸盐-tet微粒 处理的巨噬细胞显示显著的协同作用。一般地，所述结果证明四环素至J774巨噬细胞的吞噬体递送增强了J774巨噬细胞杀死金黄色葡萄球菌的能力。 
实施例15：蛋白至YGP内的装载 
使用胎牛血清的混合蛋白评估本发明的给药系统保留、转运和递送治疗性肽或蛋白、疫苗抗原或其他肽或蛋白的效用。所用的酵母细胞壁颗粒是如上所述制备的YGP、YGP-PEI和YGP-壳聚糖。母液是45ng/μl的TE中的胎牛血清(FCS)(Fetal Bovine Serum，JRHBiosciences，Lenexa，KS)、0.2％PEI(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、0.05M磷酸缓冲液，pH 7.2(P缓冲液)和0.05M磷酸缓冲液，pH 7.2、1M NaCl(P+盐缓冲液)。 
如表8中所示，向微量离心管中的1mg YGP、YGP-P或YGP-CN中加入4μl FCS，且将所得的混合物在室温下温育60分钟以使液体被微粒吸收。温育后，如表中所示加入200μl磷酸缓冲液或200μl PEI并将所得的混合物在室温下温育60分钟。温育后，加入0.5ml磷酸缓冲液，再进行5分钟温育后，超声处理管以产生单个的微粒。通过在10,000rpm下离心10分钟沉淀所述微粒并将上清液转移至新管。将0.5ml 0.05M的磷酸钠缓冲液，pH 7.2+1M NaCl加入至沉淀，在进行另外的5分钟温育后，在10,000rpm下将管离心10分钟，然后将高盐洗脱上清液转移至新管。通过280nm处的吸光率测量上清液的蛋白含量。 
蛋白装载结果显示于表9中。无捕获分子的YGP微粒只捕获5％的 提供的蛋白。首先装载FCS蛋白，然后暴露于PEI的YGP微粒保留了47％的蛋白负载。在暴露于所述蛋白负载之前用捕获聚合物例如PEI或壳聚糖预载的YGP微粒由此分别保留了68％和60％的所述蛋白负载。 
Figure S05837576420070509D000681
结果证明血清蛋白不能被有效地装载和捕获入无捕获聚合物的YGP中。使用在暴露于有效负载蛋白之前预先装载捕获聚合物的YGP导致增加的蛋白捕获。可选择地，通过首先装载蛋白，然后加入可溶性捕获聚合物以将所述蛋白螯合在微粒内来将蛋白捕获在YGP内。 
实施例16：将DNA装载入YGP内的各种方法的比较 
评估将鲑精DNA装载入YGP、包含低分子量(LMW)壳聚糖的YGP或包含高分子(HMW)壳聚糖的YGP的几种方法。 
a.毛细管装载，然后乙醇沉淀 
通过40次通过18号规格注射针来剪切鲑精DNA(Sigma，St.Louis，MO)并将其在50mM TE(Tris-HCl，pH 8，2mM EDTA)中稀释至0.1mg/ml的浓度。确定DNA溶液的装载体积并将其和100mg实施例2中的YGP、YGP:LMW壳聚糖或YGP:HMW壳聚糖在离心管中混合(重复两份实验)并温育1小时。通过向各管中加入1.5ml乙醇对所述温育的混合物进行乙醇沉淀。在2,000rpm下离心10分钟收集不溶性产物。向各管中加入10ml TE，在37℃下温育1小时，在2,000rpm下离心10分钟以沉淀不溶性YGP，且通过260nm处的吸光率确定上清液中 的DNA含量。计算保留在YGP中的DNA的量。 
b.通过吸收装载DNA 
将装载体积的DNA溶液在离心管中和100mg实施例4a中的YGP、YGP:LMW壳聚糖或YGP:HMW壳聚糖的等分混合(重复两份实验)并温育1小时。向各管加入10ml TE，在37℃下温育1小时，在2,000rpm下离心10分钟以沉淀不溶性YGP。通过260nm处的吸光率确定上清液中的DNA含量。计算保留在YGP中的DNA的量。 
c.通过CTAB捕获装载DNA 
将装载体积的DNA溶液在离心管中和100mg实施例4中的YGP、YGP:LMW壳聚糖或YGP:HMW壳聚糖混合并温育1小时。通过向各管中加入1.5ml 2％的十六烷基三甲基铵溴化物(也称作溴化十六烷基三甲铵或CTAB)溶液来沉淀温育的混合物。向各管中加入10ml TE，将所述管在37℃下温育1小时，在2,000rpm下离心10分钟以沉淀不溶性YGP。通过260nm处的吸光率确定上清液中的DNA含量。计算保留在YGP中的DNA的量。所述结果示于下面的表10中。 
Figure S05837576420070509D000691
简单的DNA装载或沉淀不能有效地将DNA装载和捕获入YGP。相反地，使用阳离子捕获聚合物壳聚糖导致可将DNA捕获入YGP的壳聚糖-DNA复合物的形成。此外，阳离子试剂CTAB可有效地用于将装载的DNA捕获入YGP中。 
实施例17：DNA的装载和捕获 
通过将1ml的0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.2中的1mg/ml鲑精DNA溶液和100μl 1mg/ml的10mM碳酸缓冲液pH 9.2中的DTAF的悬浮液 混合来制备荧光鲑精DNA。在37℃下温育过夜后，加入200μl 1MTris-HCl pH 8.3并在室温下温育15分钟。然后，加入100μl 1M NaCl和3ml乙醇以乙醇沉淀所述DNA。在-20℃下贮存过夜后，在10,000rpm下离心15分钟收集所述乙醇沉淀。用70％的乙醇洗涤乙醇沉淀直至上清液清澈，然后将其重悬浮于1ml TE中。 
在室温下温育YGP悬浮液30分钟。温育后，向一组三个管中(YGP、YGP-P、YGP-壳聚糖)加入0.45ml 95％乙醇，向二组三个管中加入0.2ml2％PEI和向另一组三个管中加入0.2ml 2％CTAB。在室温下温育30分钟后，向一组PEI管中加入0.2ml 2％CTAB并再进行30分钟的温育。加入乙醇(1ml，95％)并将所述YGP在-20℃下贮存过夜。用70％的乙醇洗涤YGP悬浮液并重悬浮于0.5ml PBS中。通过荧光显微镜评价结果，所述结果显示于表11中。 
如果只使用简单的乙醇沉淀而不用捕获聚合物，则无显著的荧光标记的DNA捕获发生，表明现有技术作为DNA递送系统是无效的。荧光标记的DNA显然被阳离子捕获聚合物PEI或壳聚糖或YGP微粒内的阳离子去垢剂CTAP捕获。当使用捕获聚合物和CTAB的组合，例如YGP:PEI:DNA:CTAB、YGP：壳聚糖：DNA:CTAB或YGP:DNA:PEI:CTAB时发生最佳的DNA捕获。 
Figure S05837576420070509D000701
实施例18：荧光标记的质粒DNA的装载和捕获 
制备包含pIRES质粒的YGP以在J774细胞(鼠类巨噬细胞来源的细胞系)中进行编码的EGFP的转染和表达。所用的阳离子捕获试剂包括阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)、CytoPureTM(商购可获得的专卖的水溶性阳离子聚合物转染试剂)(Qbiogene，Inc.，CA)、壳聚糖和阳离子去垢剂十六烷基三甲基铵溴化物(CTAB)。优选的PEI是JetPEI，即商购可获得的线性聚乙烯亚胺阳离子聚合物转染剂(Qbiogene，Inc.，CA)。 
pIRES-EGFP(Clonetech，CA)在MCS和EGFP(增强的绿色荧光蛋白)编码区之间包含脑炎心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体进入位点(IRES)。这允许目的基因(克隆入MCS的)和EGFP基因都可从单个双顺反子mRNA翻译。pIRES-EGFP用于有效地选择(通过流式细胞仪或其他方法)瞬时转染的表达EGFP和另一种目的蛋白的哺乳动物细胞。为最优化表达高水平的目的蛋白的细胞的选择，pIRES-EGFP使用部分缺陷的IRES序列(1)。该弱化的IRES导致，相对于所述克隆的基因的翻译起始率，减少了在EGFP起始密码子上的翻译起始率。这使得能够选择其中mRNA，从而靶蛋白以高水平产生，从而补偿EGFP的亚最优翻译率的细胞。该载体也可用于单独地表达EGFP或获得稳定转染的细胞系而不用费时的药物和克隆选择。EGFP是已经最优化的在哺乳动物细胞中产生更明亮的荧光和更高表达的野生型GFP的红移变体。(最大激发＝488nm；最大发射＝509nm)EGFP编码GFPmut1变体，该变体包含Phe-64至Leu和Ser-65至Thr的氨基酸置换。这些突变增加了GFP的亮度和溶解性，主要归因于提高的蛋白折叠性质和生色团形成的效率。EGFP也包含几乎完全由优选的人密码子组成的开放阅读框架。相对于野生型GFP，这导致在真核细胞中更有效的翻译，从而导致更高的表达水平。 
制备的溶液是：0.72μg/μl pIRES EGFP质粒DNA水溶液、0.2％w/v的TE中的PEI(Sigma)、2μl CytoPure(Qbiogene)+48μl 0.15MNaCl、2μl JetPEI(Qbiogene)+48μl TE、0.2％TE中的精脒、2％ (含水)CTAB和磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 
通过将1ml的0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.2中的1mg/ml pIRES DNA溶液和100μl 10mM碳酸盐缓冲液pH 9.2中的1mg/ml DTAF悬浮液混合来制备荧光pIRES质粒DNA。在37℃下温育过夜后，加入200μl 1MTris-HCl pH 8.3并在室温下温育15分钟。然后加入100μl 1M NaCl和3ml乙醇以进行乙醇沉淀DNA。在-20℃下贮存过夜后，在10,000rpm下离心15分钟收集乙醇沉淀。用70％乙醇洗涤乙醇沉淀直至上清液清澈，然后将其重悬浮于1ml TE中。 
在室温下温育YGP悬浮液30分钟。温育后，向一组三只管(YGP、YGP-P、YGP-壳聚糖)中加入0.45ml 95％的乙醇，向两组三只管中加入0.2ml 2％PEI和向另一组三只管中加入0.2ml 2％CTAB。在室温下温育30分钟后，向一组PEI管中加入0.2ml 2％CTAB并再进行温育30分钟。加入乙醇(1ml，95％)，将YGP在-20℃下贮存过夜。用70％的乙醇洗涤所述YGP悬浮液并重悬浮于0.5ml PBS中。 
如实施例14中所述，以每孔2.5×105个细胞的密度将J774鼠类巨噬细胞涂板在6孔板中并温育过夜。如表12中所概述的进行转染。以每细胞10个微粒的比例向培养物中加入微粒，然后涡旋所述板以分配微粒。将所述细胞温育4小时。在温育期结束时，移走培养基，用PBS洗涤细胞并将其固定在0.4％的PBS中的福尔马林中。 
Figure S05837576420070509D000721
通过荧光显微镜评估包含荧光DNA的微粒和用包含荧光DNA的微粒温育的J774细胞，且结果概述于表13和显示于图3A和3B。 
Figure S05837576420070509D000731
图3A是暴露于YGP微粒的细胞(标示的细胞310)的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述YGP微粒载有荧光标记的pIRES质粒和作为阳离子捕获聚合物的PEI和作为阳离子去垢剂的CTAB，图3B是显示明亮染色的细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述明亮染色代表由图3B中标示的相同细胞310内化的包含荧光质粒DNA的荧光YGP微粒。 
实施例19：和YGP:pIRES一起温育的J774鼠类巨噬细胞进行的EGFP的表达 
在该实施方案中，未对pIRES质粒DNA进行荧光标记，相反地由pIRES编码的绿色荧光蛋白(GFP)的功能性表达用作装载的酵母细胞壁颗粒的吸收、pIRES DNA的细胞内释放的证据，荧光的产生表明GFP表达。 
如下面的表14中所概述的制备YGP:pIRES制剂。从1mg/ml母液的去离子水中的稀释物中制备DNA。向YGP中加入所示量的DNA溶液并温育至少30分钟以使液体被吸收。加入标示的量的0.2％的TE中的PEI或0.2％的醋酸缓冲液中的壳聚糖，在超声产生单个微粒之前让所述混合物温育5分钟。在进一步温育至少30分钟后，加入标示量的 2％CTAB。再温育5分钟后，通过涡旋混合管并再温育至少30分钟。加入标示量的95％的乙醇。然后混合各管并在-20℃下贮存过夜。然后离心YGP:pIRES配制的微粒，在70％的乙醇中洗涤2次，在10,000rpm下离心5分钟进行收集，重悬浮于0.5ml无菌PBS，超声处理以产生单个微粒。计算每ml微粒的数目并将各制剂在-20℃下贮存。 
如实施例14中所描述的，以每孔2.5×105个细胞的密度将J774鼠类巨噬细胞涂板在6孔板中并温育过夜。如上面的表13中所概述的进行转染。以每细胞10个微粒的比率向培养基中加入微粒，旋转所述板以分配微粒。每天喂食细胞并温育2天。在温育期结束时，移走培养基，用PBS洗涤细胞并在0.4％的PBS中的福尔马林中进行固定。 
所述结果概述于表4中和显示于图4A-C中。使用荧光显微镜检查细胞。89％的J774细胞吸收YGP-F微粒(表13，孔1B，图4A)。在小孔1E(FIG.4B)和1F(FIG.4C)中EGFP表达在＞80％的J774细胞中是很明显的，如吞噬泡(vacuole)中的点状荧光所显示的。 
Figure S05837576420070509D000741
图4A是细胞例如标示的细胞410的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞暴露于荧光标记的YGP微粒，图4B是细胞例如标示的细胞420的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所 述细胞从由具有阳性捕获聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和阳离子去垢剂十六烷基三甲基铵溴化物(也称为溴化十六烷基三甲铵或CTAB)递送的pIRES DNA表达GFP，图4C是细胞例如标示的细胞430的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞从由具有阳离子捕获聚合物壳聚糖和阳离子去垢剂CTAB的YGP递送的pIRES DNA表达GFP。 
实施例20：使用YGP-阴离子捕获聚合物技术将荧光DNA、寡核苷酸和siRNA寡核苷酸递送至J774细胞 
使用下列材料：YGP：荧光鲑精DNA:PEI:CTAB微粒、YGP：荧光寡核苷酸：PEI:CTAB微粒和YGP：荧光siRNA:PEI:CTAB。所述荧光寡核苷酸是由Sigma Genosys用荧光素残基附着至5’末端合成的18聚体： 
5’荧光素-TTGGTCATCCATGGCTCT 3’SEQ ID NO：1。 
所述荧光素siRNA是用荧光素残基附着至5’末端合成的21聚体非沉默对照siRNA(Qiagen，Valencia，CA，Catalog No.1022079)： 
5’荧光素-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3’SEQ ID NO：2. 
如实施例14中所描述的，以每孔2.5×105个细胞的密度将J774鼠类巨噬细胞涂板在6孔板中并温育过夜。如表15中所概述的进行转染。向培养基中加入对照和装载有核酸的微粒并旋转所述板以分配微粒。每天喂食细胞并温育24小时。在温育期结束时，移走培养基，用PBS洗涤细胞并将其固定在0.4％的PBS中的福尔马林中。 
Figure S05837576420070509D000751
在图5A-I中举例说明结果。使用荧光显微镜和FACS检查细胞。92％的J774细胞吸收YGP-F微粒(表14，孔1B，图5A)。如点状内体 荧光和弥散的细胞质荧光所显示的，荧光寡核苷酸(SEQ ID NO：1)的递送在＞80％的J774细胞中是明显的。如点状内体荧光和弥散的细胞质荧光所显示的，荧光非沉默siRNA(SEQ ID NO：2)的递送在＞80％的J774细胞中是明显的。 
图5A是暴露于荧光标记的YGP微粒的细胞例如标示的细胞510的组合光照和荧光的彩色显微照片的反转对比(负)灰度图像；图5B是荧光激活细胞分选术(FACS)研究的结果的图解说明，该图显示代表来自已内化荧光标记的YGP微粒的细胞的信号分布的主峰520和代表来自不含荧光标记的YGP微粒的细胞的信号分布的次峰530；图5C是细胞例如标示的细胞540的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞暴露于包含荧光标记的DNA、阳离子捕获聚合物PEI和阳离子去垢剂CTAB的YGP微粒；图5D是显示相同的标示细胞540的细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，图5E是FACS研究的结果的图解说明，该图显示代表来自已内化具有荧光标记的DNA有效负载的YGP微粒的细胞的信号分布的主峰610和代表来自不含YGP微粒的细胞的信号分布的肩峰620；图5F是细胞例如标示的细胞710的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞和包含荧光标记的反义RNA、PEI和CTAB的YGP微粒一起温育；图5G显示相同的标示细胞710的细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞包含内化的具有荧光反义RNA有效负载的YGP微粒；图5H是细胞例如标示的细胞810的彩色光照显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞和包含荧光标记的siRNA、PEI和CTAB的YGP微粒一起温育，图5I是显示相同的标示的细胞810的细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的反转对比(负)灰度图像，所述细胞包含内化的具有荧光RNAi有效负载的YGP微粒。 
总之，使用阳离子捕获聚合物将荧光DNA、寡核苷酸或siRNA有效负载装载入YGP有效地将所述有效负载递送入J774细胞。在进入细胞质和细胞核区室24小时内，有效负载从内体区室释放出来。 
实施例21：YGP-DNA制剂有效地递送表达hGC的质粒DNA(pMFG-GC)至鼠类巨噬细胞系J774。 
使用上面的实施例18中所述的方法递送表达hGC的质粒DNA(pMFG-GC)至鼠类巨噬细胞系J774中且证明所述基因产物(人葡糖脑苷脂酶)的表达。如上所述制备所用的组合物并将其列于下面的表16中。此外，如上所述制备包含酵母细胞壁颗粒(包含pIRES)的制剂。 
Figure S05837576420070509D000771
所用的pMFG-GC类型已在以前进行了描述(Fabrega，S.，等人，Human glucocerebrosidase：heterologous expression of activesite mutants in murine null cells.Glycobiology.2000Nov；10(11)：1217-24)。该载体包含插入在MFG主链的Nco I和Bam HI位点之间的人GC cDNA。保留病毒的剪接供体(SD)位点和剪接受体(SA)位点的MFG载体使用莫洛尼鼠白血病病毒5’长末端重复(5’LTR)产生负责所述插入的序列的表达的剪接的mRNA。将人GC cDNA克隆入MFG载体，使起始密码子精确地位于删除的env基因的起始密码子位置。当用于转导小鼠骨髓细胞时，培养的巨噬细胞平均展示4倍于对照巨噬细胞的酶活性。 
将培养物中的粘附细胞培养在塑料多孔板中的DMEM(Gibco)+10％胎牛血清和青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco)组织培养基中。在适当的汇合度时，移走培养基，用PBS短暂地洗涤细胞，然后进行固定(用0.5-1％的福尔马林或多聚甲醛溶液)。在移走固定剂后，用PBS短暂地洗涤细胞，然后在室温下在0.1％牛血清白蛋白/0.05％Tween 20中温育1小时。在移走0.1％牛血清白蛋白/0.05％Tween 20溶液后，然后在4℃下用PBS/0.05％Tween 20中的针对人葡糖脑苷脂酶的兔抗 血清(1/1000-1/5000的工作稀释度；Ginns等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.第79卷：5607-5610，September 1982)温育细胞过夜。 
在过夜温育后，从细胞中移走抗体溶液，在温和地摇动下，用PBS/0.05％Tween 20洗涤所述细胞5次，进行3分钟。然后将所述细胞和山羊抗兔FITC缀合的抗血清(Molecular Probes F2765，荧光素山羊抗兔IgG(H+L)，2mg/mL；1/100-1/500的工作稀释度)在室温下一起温育1-2小时。 
在温和地摇动下，用PBS/0.05％Tween 20再次洗涤细胞5次，进行3分钟。在移走最后的洗涤溶液后，向各孔中加入PBS并将细胞板在黑暗处在4℃下贮存直至进行荧光显微镜分析。所述方案概述于表17。 
Figure S05837576420070509D000781
图6A-6G是显示包含pMFG-GC表达载体的酵母细胞壁颗粒的吸收和人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达的J774鼠巨噬细胞的彩色显微照片的灰度图像。将细胞暴露于YGP制剂或不对其进行处理(对照)，对其进行培养，并对粘附细胞进行福尔马林固定。使用第一抗人GC抗体(兔抗血清)、合适的可检测的第二抗体(山羊抗兔FITC缀合的抗血清)就免疫细胞化学处理固定的细胞，用荧光显微镜和照相进行检查。 
图6A是来自未处理的对照培养物的J774细胞例如标示的细胞510的彩色透射光显微照片的灰度图像。 
图6B是显示缺乏荧光标记的细胞的J774细胞的相同视野的彩色荧光显微照片的灰度图像。 
图6C是显示包含荧光标记的微粒的细胞例如细胞912的J774细胞的彩色光照和荧光的组合显微照片的灰度图像，所述细胞暴露于荧光标记的酵母细胞壁颗粒(YGP-F)的制剂。 
图6D和6E分别是J774细胞的相同视野的彩色透射光显微照片和彩色荧光显微照片的灰度图象，所述细胞暴露于包含pMFG-GC表达载体(YGP:pMFG-GC:PEI:CTAB)的酵母细胞壁颗粒的制剂，该图通过荧光标记的细胞例如细胞914中的免疫反应性显示人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。 
图6F和6G分别是J774细胞的相同视野的彩色透射光显微照片和彩色荧光显微照片的灰度图像，所述细胞暴露于包含pMFG-GC表达载体(YGP-CN:pMFG-GC:CTAB)的酵母细胞壁颗粒的制剂，该图通过荧光标记的细胞例如细胞916中的免疫反应性显示人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。 
这些研究的一般结果可概述如下。鼠巨噬细胞系J774的细胞有效地(＞90％)吞噬YGP-F微粒。所用的人抗葡糖脑苷脂酶抗体选择性地染重组人蛋白，但不和内源小鼠蛋白交叉反应。在超过50％的在体外用YGP pMFG-GC CTP制剂处理的J774细胞中可通过免疫反应性检测到人葡糖脑苷脂酶的表达。YGP:MFG-GC:PEI:CTAB和YGP-CN:pMFG-GC:CTAB制剂对递送质粒DNA和在J774细胞中诱导可检测的人葡糖脑苷脂酶的表达都是有效的。人葡糖脑苷脂酶在内体和溶酶体区室中被正常地加工且可被检测。YGP:CTP制剂在递送pMFG-GC中的人葡糖脑苷脂酶基因和在J774巨噬细胞中促进人葡糖脑苷脂酶的表达方面是有效的。 
实施例22：YGP和YGMP荧光微粒在野生型和Gaucher’s小鼠中的口服生物利用度。 
图8是在体内口服施用180后，通过巨噬细胞游走370至各种器官450、452、454、456、458来递送酵母β-葡聚糖微粒(YGP)230的方法的优选实施方案的示意图。给受试者185口服施用包含酵母β-葡聚糖微粒(YGP)230的组合物182。所述酵母β-葡聚糖微粒 (YGP)230被小肠衬里中的M细胞355吸收并被转移穿过上皮350，然后被肠巨噬细胞360吞噬。包含YGP的巨噬细胞游走370至器官和组织，包括骨450、肺452、肝454、大脑456和脾458。口服给药后大约72小时，在脾458中观察到已吞噬YGP的脾巨噬细胞364(示意性地显示和以彩色荧光显微照片的反转对比灰度图像显示)。口服给药后大约90小时，在骨450中观察到已吞噬YGP的骨髓巨噬细胞362(示意性地显示和以彩色荧光显微照片的反转对比灰度图像显示)。 
使用荧光标记的酵母细胞壁颗粒研究细胞表面糖组分对酵母葡聚糖微粒的口服生物利用度的作用，如上所述制备YGP-F(FITC-标记的酵母葡聚糖微粒)和YGMP-F(FITC-标记的酵母葡糖甘露聚糖微粒)。通过口服强饲法和皮下注射给小鼠(C57B1/6野生型和Gaucher模型小鼠)施用YGP-F和YGMP-F的等分(0.1ml)，进行5天。固定来自各动物的大脑、肝脏、骨髓、小肠和脾的切片并通过荧光显微镜检查以确定荧光酵母细胞壁颗粒被吸收的程度。将脾脏的等分置于冰上并进行加工以产生单细胞悬浮液。以每12孔板大约106个细胞将脾细胞涂板并温育24小时以使其附着。在洗去未结合的细胞后，通过荧光显微镜，根据内化的荧光微粒就粘附细胞(巨噬细胞)对小孔进行评分。 
也显示酵母细胞壁颗粒对于体内递送(口服和肠胃外途径)pMFG-GC构建体中的人葡糖脑苷脂酶基因，在脾巨噬细胞中产生人葡糖脑苷脂酶的表达方面是有用的和有效的。 
如上所述制备制剂，所述制剂将表达人GC的MFG-GC质粒DNA整合至以阳离子聚合物-DNA纳米复合物的形式存在的酵母葡聚糖微粒(YGP)和酵母葡聚糖-甘露聚糖微粒(YGMP)中。数据显示，当口服或胃肠外施用时，这些YGP-DNA和YGMP-DNA微粒通过受体介导的至组织、粘膜和肠道淋巴组织(GALT)巨噬细胞内的吸收变得具有生物利用度。当全身性施用装载DNA的微粒时，通过糖受体对微粒表面的葡聚糖和甘露聚糖多糖的结合发生直接的受体介导的至组织巨噬细胞的吸收。在被细胞吞噬后，所述微粒被吞入内体，在所述内体中阳离子聚合物释放DNA，使内体膨胀并将所述DNA释放入细胞质，在所述细胞 质中其迁移至细胞核。通过细胞机制加工所述释放的DNA以产生正常的人GC酶。 
使用两种高歇病的小鼠模型。通过每天用100mg/kg的牛菜醇β环氧化物(CBE，7-氧杂二环[4.1.0]庚烷-2，3，4，5-四醇)腹膜内注射C57/B1小鼠(进行3周)来产生第一Gaucher小鼠。用CBE处理3个月大小的C57/B1小鼠3周，分别在全身性组织和大脑中产生大约50％和500％的葡糖神经酰胺的量的增加。在CBE处理的小鼠中，β-葡糖苷酶的活性急剧降低，但其他水解酶(α-甘露糖苷酶、β-己糖胺酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶和β-葡糖醛酸酶)的水平和对照小鼠的水平没有显著差别。在3个月大小的处理的小鼠中没有发生重量或行为上的差异。相反地，每天用100mg/kg CBE腹膜内处理(进行3周)的1天大小的婴儿C57/B1小鼠和对照相比在生长方面具有显著差异。对于大脑、肝脏和肾脏，表示为总体重的百分比没有变化，但脾的重量为对照的60％。CBE处理的婴儿小鼠表现尾部弓形，可能的高幅度动作性震颤(high amplitude action tremor)和最小的惊恐反应(minimal startle response)，但正常的游泳和向右反应(rightingresponse)，所有这些暗示着CNS灰质受累。在肝组织和大脑中分别存在50％和300％的葡糖脑苷脂的增加。 
和处理的3个月大小的小鼠相似，所述处理的婴儿小鼠具有显著减少的β-葡糖苷酶活性。然而，尽管α-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶和正常接近，但己糖胺酶和甘露糖苷酶的活性提高。这些小鼠已提供了研究高歇病的发病机理的可能性，但CBE注射的短期效应使这些小鼠对于研究酶和基因替代疗法的长期作用用处不大。 
使用高歇病的转基因小鼠模型，在所述转基因小鼠中，在鼠类葡糖脑苷脂酶中产生氨基酸置换，这使内源GC表达显著地减少至低于正常同窝出生鼠中的所述酶活性的一半水平。使用4-甲基umbellerferyl-吡喃型葡糖苷(4MUGP)(荧光标记的底物)进行小鼠样品中的葡糖脑苷脂酶活性的分析。通过PCR诱变将类似于在受到更温和地影响的高歇病患者中发现的点突变的点突变导入鼠葡糖脑苷脂酶 的基因组克隆。将该修饰的克隆插入合适的载体并通过电穿孔将其转染入RW4鼠胚胎干(ES)细胞。使用标准的技术将在葡糖脑苷脂酶基因的一个等位基因中包含被正确靶向的突变的ES克隆注射入来自C57BL/6小鼠的胚泡，然后将所述胚泡转移至代孕小鼠。将来自这些注射的雄性后代和C57BL/6雌性小鼠测交(test-bred)，通过PCR和Southern分析筛选后代以分析所述突变的葡糖脑苷脂酶等位基因的遗传。 
人Gaucher表型的长寿鼠类模型可以用于发展新的治疗策略。以前，通过葡糖脑苷脂酶基因的被靶向的破坏产生作为2型高歇病的鼠类模型的基因敲除小鼠。这些纯合的受影响的小鼠不具有葡糖脑苷脂酶活性，在巨噬细胞中贮存脂质，具有鳞癣性皮肤(icthyotic skin)和在出生后24小时内死亡。溶酶体中的贮积材料的超微结构和人患者的非常相似。其他研究使用单一插入诱变方法导入和两个已知的人表型相关的突变。这些插入性RecNciI突变小鼠具有低的酶活性和积累的葡糖神经酰胺，但是L444P小鼠具有更高的酶活性。然而，该插入突变RecNciI和L444P小鼠都在48小时内死亡。 
L444P、R463C和N370S突变包含在患者中最常发现的突变中的三种突变。L444P突变在具有神经异常的患者中以更高的频率被发现。在图9A和图B中示意性地举例说明了使用置换载体产生更长寿的携带L444P、R463C和N370S点突变的高歇病小鼠模型，所述置换载体包含loxP。构建使用阳性/阴性选择的置换靶向载体，所述载体包含被插入鼠metaxin(MX)和葡糖脑苷脂酶(GC)之间的基因间区域的、侧翼连接loxP序列的新霉素抗性(NeoR)盒。通过PCR诱变将L444P突变导入鼠葡糖脑苷脂酶的基因组克隆。在该方法中，将外显子10的起始处的正常的鼠GC序列从TGACTTGGA(SEQ ID NO：3)改变成TGACCCGGA(SEQID NO：4)，从而导致脯氨酸对亮氨酸的氨基酸置换和引入NciI限制性位点。通过限制性降解和直接的序列分析确认构建体中该序列的改变。最终的构建体包含4.0kb 5’GC同源臂(homologous arm)和1.4kb3’MX同源臂。如图9A中所示，将白喉毒素A(DTA)盒作为负选择标 记置于下游。 
在线性化后，通过电穿孔将该构建体导入RW4鼠胚胎干(ES)细胞并如前面所描述的，将所述ES细胞在具有G418的培养物中接受药物选择。通过Southern印迹法和PCR分析鉴定抗G418的个体克隆中正确的基因靶向事件。将来自ES克隆的细胞注射入来自C57BL/6小鼠的胚泡，然后将其转移至代孕小鼠，所述ES克隆在葡糖脑苷脂酶基因的一个等位基因中包含被正确靶向的L444P突变。将来自这些注射的具有超过30％的斑驳毛色的雄性后代和C57BL/6雌性测交，通过PCR和Southern分析就突变的L444P葡糖脑苷脂酶等位基因的遗传对后代进行筛选。当传递L444P突变时，通过Southern分析中的外显子9探针显示的DNA片段和725bp的所述外显子9的PCR扩增片段(正向引物：5’CTACCATCTTGGCCACTTCAG (SEQ ID NO：5)；反向引物：5’GCACAGGAGCGAACTCTTTCC，SEQ ID NO：6)都用Ncil进行切割。鉴定两个包含L444P突变的等位基因的小鼠品系，通过对PCR扩增的包含被导入至外显子9中的突变的DNA直接测序确定所述DNA序列。将对于L444P突变葡糖脑苷脂酶基因是杂合的小鼠交配，并通过Southern印迹法和PCR分析鉴定纯合的突变后代。此外，将杂合L444P小鼠和携带CRE DNA重组酶的转基因的小鼠交配，导致NeoR标记的切除，只留下34bp loxP序列。如所预期的，被靶向的L444P突变以孟德尔方式遗传。使用4-甲基umbellerferyl-吡喃型葡糖苷(4MUGP)(荧光标记的底物)测定小鼠尾部样品中的葡糖脑苷脂酶的活性，证明在纯合的突变小鼠中，葡糖脑苷脂酶活性是正常同窝出生小鼠中的酶活性的大约35％。 
图10A-10D是从用荧光标记的YGP微粒喂养的小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(图10A和图10C)和彩色荧光显微照片(图10B和图10D)的灰度图像。通过口服强饲法或皮下注射给小鼠(C57B1/6野生型和Gaucher突变小鼠)施用0.1ml的YGP-F和YGMP-F等分，显示无荧光巨噬细胞920和荧光巨噬细胞922、924。 
固定来自各动物的大脑、肝脏、骨髓、小肠和脾的切片并通过荧 光显微镜检查以确定荧光酵母细胞壁颗粒被吸收的程度。将脾脏的等分置于冰上并进行加工以产生单细胞悬浮液。以每12孔板大约106个细胞将脾细胞涂板并温育24小时以使之附着。在洗去未结合的细胞后，通过荧光显微镜，根据内化的荧光微粒就粘附细胞(巨噬细胞)对小孔进行评分。 
所述处理通常可被良好地耐受。粘附的脾巨噬细胞的荧光显微镜分析证明在所有处理的动物中存在荧光酵母细胞壁颗粒。这些结果证明YGP-F和YGMP-F都具有口服生物利用度且通过巨噬细胞进行全身性分配。粪便的分析表明存在荧光微粒，这表明口服吸收不完全。野生型小鼠和Gaucher模型小鼠都能够吸收口服施用的酵母细胞壁颗粒。 
制剂的体内口服和皮下施用在鼠脾巨噬细胞中有效产生绿色荧光蛋白的表达，所述制剂包含含有pIRES表达载体的酵母细胞壁颗粒。图11A-11D是从体内处理的小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图，所述图显示包含pIRES表达载体的酵母细胞壁颗粒的吸收和绿色荧光蛋白(GFP)的表达。将所述分离的细胞培养至适当的汇合度，用福尔马林固定粘附细胞，使用荧光显微镜和照相进行检查。 
图11A是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠在体内接受PBS(对照处理)的口服强饲法，所述图像显示缺乏荧光巨噬细胞。 
图11B是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pIRES制剂的皮下注射，该图像显示表达荧光GFP的巨噬细胞930。 
图11C从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pIRES制剂的口服剂量，所述图像显示表达荧光GFP的巨噬细胞931。 
图11D是从野生型小鼠分离的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒 DNA的YGMP-pIRES制剂的口服剂量，所述图像显示表达荧光GFP的巨噬细胞932。 
包含酵母细胞壁颗粒的制剂的体内口服和皮下给药在鼠脾巨噬细胞中产生人葡糖脑苷脂酶的表达方面是有效的，所述酵母细胞壁颗粒包含如上所述制备的pMFG-GC表达载体。图12A-12M是从体内处理的小鼠中分离的免疫染色的脾巨噬细胞的显微照片的图像，该图显示包含pMFG-GC表达载体的酵母细胞壁颗粒的吸收和人葡糖脑苷脂酶(hGC)的表达。将所述分离的细胞培养至合适的汇合度，用福尔马林固定粘附细胞。使用第一抗人GC抗体(兔抗血清)、合适的可检测的第二抗体(山羊抗兔FTTC缀合的抗血清)就免疫细胞化学处理固定的细胞，使用荧光显微镜和照相进行检查。 
图12A是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的灰度图像，所述野生型小鼠接受PBS(对照处理)的体内口服强饲法，该图显示缺乏表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞。 
图12B和12C是从野生型小鼠分离的免疫染色脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(12B)和彩色荧光显微照片(12C)的图像，所述小鼠接受0.1ml的每剂量提供100ng的质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的体内皮下注射，该图显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞935。 
图12D是从L444P-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述L444P-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的皮下注射，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞936。 
图12E是从R463C-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述R463C-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的皮下注射，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞937。 
图12F和12G是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(12F)和彩色荧光显微照片(12G)的图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的 YGP-pMFG-GC制剂的口服剂量，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞938。 
图12H和12I是从L444P-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色透射光显微照片(12H)和彩色荧光显微照片(12I)的图像，所述L444P-/-突变小鼠在体内接受30天的0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的口服剂量处理，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞940。 
图12J是从R463C-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述R463C-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的口服剂量，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞941。 
图12K是从野生型小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述野生型小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pMFG-GC制剂的口服剂量，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞942。 
图12L是从L444P-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述L444P-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pMFG-GC制剂的口服剂量，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞943。 
图12M是从R463C-/-突变小鼠分离的免疫染色的脾巨噬细胞的彩色荧光显微照片的图像，所述R463C-/-突变小鼠在体内接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGMP-pMFG-GC制剂的口服剂量，所述图像显示表达hGC的荧光免疫染色的巨噬细胞例如巨噬细胞944。 
实施例23：YGP和YGMP微粒的口服给药在野生型和Gaucher’s小鼠中的全身性效应。 
这些长寿命的点突变小鼠的可获得性提供了检测口服给药的基因疗法在纠正在高歇病中观察到的全身性和中枢神经系统病症中的功效的方法，所述小鼠具有和具有相同突变的Gaucher患者相似的生 物化学和表型异常。 
可通过使用葡糖苷酶抑制剂牛菜醇β环氧化物(CBE，7-氧杂二环[4.1.0]庚烷-2，3，4，5-四醇)的短期腹膜内(IP)处理恶化和加速Gaucher小鼠中疾病的临床表现。如前面在嵌合小鼠模型中所描述的，可给Gaucher小鼠施用葡糖脑苷脂酶抑制剂例如CBE和溶血剂如苯肼以进一步减弱残留的突变酶降解脂质的能力，从而导致增加的脂质贮存和更严重的以及更早期的临床表现。 
通过口服或皮下给药的体内处理导致在野生型小鼠和Gaucher模型小鼠中的脾巨噬细胞都吸收基于YGP和YGMP两者的制剂。该处理导致重组hGC在分离的脾巨噬细胞中的表达，如通过hGC免疫交叉反应材料的可检测的增加所测量的。该处理还导致处理的Gaucher模型小鼠中的Gaucher样症状的可见的改善，表明使用本发明的制剂的全身性治疗具有想要的治疗结果。 
使用血细胞计数、器官大小和葡糖脑苷脂酶活性将L444P突变小鼠和野生型小鼠以及杂合子进行比较。测量C57/BL6(野生型)、转基因杂合子和纯合突变动物的全血细胞计数，如下面表18中所显示的，平均计数相似。测量野生型(wt)、杂合子(het)和纯合子突变动物(每组4只)大脑、肝脏和脾的大小。表19提供了平均器官重量。 
Figure S05837576420070509D000871
Figure S05837576420070509D000872
如使用4-甲基umbelliferyl-B-D-吡喃型葡糖苷(4MU-Glu)所测定的，发现在L444P突变小鼠中检测的所有组织的葡糖脑苷脂酶活性不足。未处理的L444P Gaucher小鼠的组织中的葡糖脑苷脂酶活性显著低于对照的活性：脾(10％)、肝(28％)、肺(8％)、骨髓(11％)和大脑(65％)。使用YGP制剂(2只小鼠)和YGMP制剂(3只小鼠)的处理补充肝葡糖脑苷脂酶的酶活性，其中未处理的L444P Gauche r小鼠(n＝7)、接受口服葡糖脑苷脂酶基因治疗的L444P Gaucher小鼠(n＝5)和野生型小鼠(n＝6)中的平均葡糖脑苷脂酶的酶活性分别是野生型小鼠葡糖脑苷脂酶特异性活性的12％、29％和100％。 
在比较YGP和YGMP组合物的作用的初步研究中，给L444PGaucher小鼠口服施用YGP-pMFG-GC制剂(0.1ml的每剂提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的日口服剂量进行14天，和每周5剂，进行56天)，和未处理的L444P Gaucher小鼠的组织中的活性相比，在肺和大脑中产生葡糖脑苷脂酶活性(针对野生型小鼠的对应组织中的活性进行标准化)的增加，在脾中产生更少的增加，如下面表20中所示的。 
给L444P Gaucher小鼠口服施用YGMP-pMFG-GC制剂，如表20中所示，和在用YGP-pMFG-GC制剂处理后观察到的增加相比，产生了葡糖脑苷脂酶活性的略微更大的增加。所述增加也显示葡糖脑苷脂酶活性的增加的不同组织依赖性模式。下面的表21显示，和接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的日口服剂量(进行14天和每周5剂进行56天)的L444P Gaucher小鼠的平均葡糖脑苷脂酶活性相比，在未处理的L444P小鼠和野生型小鼠(C57B1/6)的 脾、肝、肺和脑组织中确定的平均葡糖脑苷脂酶活性的结果，将所述结果对野生型小鼠的对应组织中的活性进行标准化。 
Figure S05837576420070509D000891
给R463C突变小鼠口服施用YGMP-pMFG-GC制剂也产生如下面表22中所示的葡糖脑苷脂酶活性的增加的组织依赖性模式。处理在脾的葡糖脑苷脂酶活性中产生很小的变化，在肺中产生葡糖脑苷脂酶活性的显著增加，在肝中产生中等的增加。表21显示，和接受0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的日口服剂量(进行14天和每周5剂进行56天)的R463C Gaucher小鼠的平均葡糖脑苷脂酶活性相比，在未处理的R463C小鼠和野生型小鼠(C57B1/6)的脾、肝和肺组织中确定的平均葡糖脑苷脂酶活性的结果，将所述结果对野生型小鼠的对应组织中的活性进行标准化。 
Figure S05837576420070509D000892
在接受一段时间的牛菜醇β环氧化物(100mg/kg/天腹膜内施用，进行14天)后，一些小鼠变成了具有严重症状的R463C Gaucher小鼠。在接受牛菜醇β环氧化物(100mg/kg/天腹膜内施用，进行14天)后，野生型(wt)小鼠和R463C Gaucher小鼠之间在表型和临床进程中产生较大差异。在Gaucher小鼠中，在用牛菜醇β环氧化物处理14天后，在7天的恢复后，仍保持严重的临床表现和病状。在接受一段时间的 牛菜醇β环氧化物(100mg/kg/天腹膜内施用，进行2周)后，L444PGaucher小鼠产生严重的症状。已接受牛菜醇β环氧化物(100mg/kg/天腹膜内施用，进行14天)，然后进行至少70天的口服施用0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的L444P Gaucher小鼠，病情没有未接受所述YGP-pMFG-GC制剂处理的小鼠严重。 
R463C Gaucher小鼠在接受一段时间的牛菜醇β环氧化物(100mg/kg/天腹膜内施用，进行16天)后，症状变得更严重。已接受牛菜醇β环氧化物(100mg/kg/天腹膜内施用，进行16天)，然后进行至少70天的口服施用0.1ml的每剂量提供100ng质粒DNA的YGP-pMFG-GC制剂的R463C Gaucher小鼠，在临床上比不接受所述YGP-pMFG-GC制剂处理的所述小鼠更健康。 
处理增加了R463C Gaucher小鼠的存活率。图13是来自研究的数据的图形表示法，该图显示在本发明的优选的实施方案中，在葡糖脑苷脂酶基因疗法后，在CBE处理的R463C Gaucher小鼠中看到增加的存活率。 
除非另有说明，权利要求不应当被理解为限制于描述的顺序或因素。因此，落在下列权利要求和与其等价的声明的范围和精神之内的所有实施方案都声明为本发明。 
序列表
<110>University of Massachusetts
     Ginns，Edward I.
     Os troff，Gary R.
<120>用于溶酶体酶缺乏症的组合物和其用途
<130>080035-0009
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>荧光素
<222>(1)..(1)
<400>1
ttggtcatcc atggctct                                                  18
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>荧光素
<222>(1)..(1)
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>脱氧胸苷
<400>2
uucuccgaac gugucacgut t                                              21
<210>3
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>3
tgacttgga                                                            9
<210>4
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
tgacccgga                                                            9
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>5
ctaccatctt ggccacttca g                                              21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>6
gcacaggagc gaactctttc c                                              21
<210>7
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>7
gaacctcctt tac                                                       13
<210>8
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>8
gagcctcctg tac                                                       13
<210>9
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
tgacttgga                                                            9
<210>10
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>10
tgacccgga                                                            9
<210>11
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>11
aaccggtaa                                                            9
<210>12
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>12
aactggtaa                                                            9
<210>13
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>13
ccagatcttc g                                                         11
<210>14
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>14
ccagctcttc g                                                         11

Claims (35)

1.一种组合物，其包含：
提取的界定内部空间和包含6％至90％的重量的β-葡聚糖的酵母细胞壁；
选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚L-赖氨酸、藻酸盐、黄单胞菌多糖、十六烷基三甲基铵溴化物和其混合物的有效负载捕获分子和
以有效地补充缺陷的溶酶体酶功能的量存在的选自核酸、肽、蛋白和其混合物的有效负载分子；
其中所述有效负载分子和有效负载捕获分子可溶于相同的溶剂系统，且其中所述有效负载捕获分子包含在所述提取的酵母细胞壁界定的内部空间内并稳定所述有效负载分子和所述提取的酵母细胞壁的结合，且其中所述有效负载捕获分子的存在有助于所述有效负载分子在所述提取的酵母细胞壁中的保留。
2.权利要求1的组合物，其中所述负载分子是核酸，所述核酸为重组DNA构建体。
3.权利要求2的组合物，其中所述重组DNA构建体是包含有效地连接至编码蛋白的开放阅读框的控制元件的表达载体。
4.权利要求3的组合物，其中所述由开放阅读框编码的蛋白是结构蛋白、具有酶活性的蛋白、膜蛋白、DNA结合蛋白、信号转导蛋白或其功能性等同物。
5.权利要求1的组合物，其中所述核酸包括补充不存在的、缺陷的或被抑制的基因的功能的核苷酸序列。
6.权利要求3的组合物，其中所述蛋白是人葡糖脑苷脂酶或其功能性等同物。
7.权利要求2的组合物，其中所述重组DNA构建体是表达载体，所述表达载体包含有效地连接至编码溶酶体酶、溶酶体酶的功能性等同物、溶酶体酶激活蛋白或溶酶体酶激活蛋白的功能性等同物的开放阅读框的控制元件。
8.权利要求7的组合物，其中所述溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶或其功能性等同物。
9.权利要求7的组合物，其中所述溶酶体酶激活蛋白选自saposinA、saposin B、saposin C、saposin D和其混合物。
10.权利要求1的组合物，其中所述蛋白是溶酶体酶或其功能性等同物。
11.权利要求1的组合物，其中所述蛋白选自saposin A、saposinB、saposin C、saposin D、GM2激活蛋白和其混合物。
12.包含权利要求1的组合物和药物可接受的赋形剂的药物组合物。
13.权利要求1-12中任一项的组合物在生产用于治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述溶酶体贮积症是糖胺聚糖的不完全代谢、糖蛋白的聚糖部分的不完全降解、糖原的不完全降解、鞘脂组分的不完全降解、多肽的不完全降解、胆固醇、胆固醇酯或其他复合脂的不完全降解或转运缺陷、多种溶酶体酶的缺陷、转运缺陷或细胞内运输缺陷。
15.权利要求13的用途，其中所述溶酶体贮积症是胡尔勒病、Scheie病、Hunter病、Sanfilippo病、莫尔基奥病、Maroteaux-Lamy病、Sly病、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿、岩藻糖苷贮积病、甘露糖苷过多症、Schindler病、唾液酸贮积症I型、蓬佩病、法布里病、法伯病、高歇病1型、高歇病2型、高歇病3型、GM1神经节苷脂沉积症、GM2神经节苷脂沉积症、克拉伯病、异染色性脑白质障碍症、尼-皮病-A型、尼-皮病B型、致密性成骨不全症、ceroid lipofuscinosis、胆固醇酯沉积病、尼-皮病C型、沃尔曼病、多种硫酸酯酶病、半乳糖唾液酸沉积症、粘多糖症II型、粘多糖症III型、胱氨酸病、粘多糖症IV型、唾液酸贮积症、具有
Figure FSB00000854143000021
综合征、赫-普综合征、切-东综合征和Danon病的乳糜微粒滞留病、geleophysic dysplasia或
Figure FSB00000854143000022
综合征。
16.制备权利要求1所述的组合物的方法，其包括步骤：
提供界定所述内部空间并包含6％至90％重量的β-葡聚糖的提取的所述酵母细胞壁；
将所述提取的酵母细胞壁和有效地补充缺陷的溶酶体酶的功能的量的选自核酸、肽、蛋白和其混合物的所述有效负载分子接触；
将所述提取的酵母细胞壁和选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚L-赖氨酸、藻酸盐、黄单胞菌多糖、十六烷基三甲基铵溴化物和其混合物的所述有效负载捕获分子接触，其中所述有效负载分子和有效负载捕获分子可溶于相同的溶剂系统且其中所述有效负载捕获分子包含在所述提取的酵母细胞壁界定的内部空间内并稳定所述有效负载分子和所述提取的酵母细胞壁的结合，且其中所述有效负载捕获分子的存在有助于所述有效负载分子在所述提取的酵母细胞壁中的保留。
17.权利要求16的方法，其中所述负载分子是核酸，所述核酸是重组DNA构建体。
18.权利要求17的方法，其中所述重组DNA构建体是包含有效地连接至编码蛋白的开放阅读框的控制元件的表达载体。
19.权利要求18的方法，其中所述由开放阅读框编码的蛋白是结构蛋白、具有酶活性的蛋白、膜蛋白、DNA结合蛋白、信号转导蛋白或其功能性等同物。
20.权利要求16的方法，其中所述核酸包含补充不存在的、缺陷的或被抑制的基因的功能的核苷酸序列。
21.第一递送系统在制备用于在细胞中补充溶酶体酶缺陷的药物中的用途，其中所述系统包含权利要求1-12中任一项所述的组合物。
22.包含权利要求1-12中任一项所述的组合物的第一递送系统用于制备在细胞中补充溶酶体酶缺陷中的药物中的用途，其包括将所述细胞与所述第一递送系统接触的步骤，其中所述接触的步骤在体外进行。
23.权利要求21的用途，还包括通过细胞吞噬所述第一组合物的步骤。
24.权利要求21的用途，还包括步骤：
提供有效量的第二递送系统，所述系统包含含有β-葡聚糖的提取的酵母细胞壁、有效负载捕获分子和有效负载分子，其中所述有效负载分子是包含有效地连接至编码缺陷的酶的激活物或其功能性等同物的开放阅读框的控制元件的表达载体；和
将具有该酶缺陷的细胞和所述第二递送系统接触。
25.权利要求24的用途，还包括通过所述细胞吞噬所述第二递送系统的步骤。
26.权利要求21或24的用途，其中所述细胞是巨噬细胞、派尔斑的M细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗氏细胞、Kupffer细胞、肺泡吞噬细胞、腹膜巨噬细胞、乳巨噬细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、mesengial吞噬细胞或滑膜A细胞。
27.根据权利要求1-12中任一项的第一组合物在制备用于治疗受试者的药物中的用途，所述受试者具有由于蛋白的缺陷引起的溶酶体贮积症。
28.权利要求27的方法，其中将给所述受试者口服、皮下、肌内或通过吸入施用所述第一组合物。
29.权利要求27的用途，其中所述受试者是胎儿，且将通过给母亲施用所述组合物或通过将有效量的所述组合物置于羊水中来在子宫内给胎儿施用所述组合物。
30.权利要求16的用途，其中所述蛋白是溶酶体酶或其功能性等同物
31.权利要求16的用途，其中所述蛋白是人葡糖脑苷脂酶或其功能性等同物。
32.权利要求16的用途，其中所述蛋白选自：saposin A、saposinB、saposin C、saposin D、GM2激活蛋白和其混合物。
33.权利要求18的用途，其中所述溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶或其功能性等同物。
34.权利要求18的用途，其中所述溶酶体酶激活蛋白选自：saposinA、saposin B、saposin C、saposin D和其混合物。
35.权利要求13的用途，其中所述溶酶体贮积症是泰-萨病或山德霍夫病、或GM2激活物疾病。
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CN2005800375764A Expired - Fee Related CN101052383B (zh) 2004-09-17 2005-09-19 用于溶酶体酶缺乏症的组合物和其用途

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WO (1) WO2006032039A2 (zh)
ZA (1) ZA200701943B (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7906492B2 (en) 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7878978B2 (en) * 2004-03-18 2011-02-01 University Of Pittsburgh- Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of relaxin to increase arterial compliance
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
WO2006032039A2 (en) 2004-09-17 2006-03-23 University Of Massachusetts Compositions and their uses for lysosomal enzyme deficiencies
EP1948245B1 (en) * 2005-10-24 2011-10-05 University of Massachusetts Compositions and their uses for gene therapy of bone conditions
EP2468296A3 (en) * 2006-02-02 2013-12-04 Globeimmune, Inc. Yeast-based vaccine for inducing an immune response
US20080044438A1 (en) * 2006-03-17 2008-02-21 Ostroff Gary R Yeast Cell Particles As Oral Delivery Vehicles For Antigens
US20090022799A1 (en) * 2006-10-06 2009-01-22 Shikha Pramanik Barman Compositions that contain beta-glucan to be used for the prevention and treatment of disease and methods for their use
US20100111985A1 (en) * 2007-04-25 2010-05-06 Orbis Health Solutions, Llc Vaccine compositions and methods of use
EP2222283A2 (en) * 2007-10-29 2010-09-01 University of Massachusetts Yeast cell wall protein (ycwp) encapsulated multilayered nanoparticles for nucleic acid delivery (sirna)
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
JP5292118B2 (ja) * 2009-01-30 2013-09-18 富士フイルム株式会社 蛍光内視鏡システム及び蛍光内視鏡システムの作動方法
WO2012024229A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 University Of Massachusetts Yeast cell wall particle for receptor-targeted nanoparticle delivery
KR101619815B1 (ko) 2011-04-04 2016-05-12 주식회사 메디진바이오 리소좀 효소를 유효성분으로 포함하는 뮤코지방증 ii의 예방 또는 치료용 약학 조성물
EP2739304A4 (en) * 2011-08-04 2015-06-03 Univ Ramot PARTICLES FOR THE TREATMENT OF NEURODEEGENERATIVE DISEASES
AU2013283187B2 (en) * 2012-06-25 2016-04-21 S.A. Damm Fat binder obtained from biomass resulting from beer production
US9744193B2 (en) 2012-09-06 2017-08-29 Orbis Health Solutions Llc Tumor lysate loaded particles
JP6121561B2 (ja) 2012-12-12 2017-04-26 オービス ヘルス ソリューションズ エルエルシー 組織再生のための組成物および方法
US10335433B2 (en) 2013-04-10 2019-07-02 Mimedx Group, Inc. NDGA polymers and metal complexes thereof
CN106102464A (zh) * 2013-05-02 2016-11-09 牛津大学之校长及学者 采用亚氨基糖的糖脂抑制
US10166195B2 (en) 2014-03-05 2019-01-01 Orbis Health Solutions, Llc Vaccine delivery systems using yeast cell wall particles
US9981021B1 (en) 2015-04-09 2018-05-29 Kinetiq, Inc. Subcutaneous therapeutic enzyme formulations, uses, and methods for generating thereof
US11612619B2 (en) 2018-11-01 2023-03-28 National Institute Of Health (Nih), U.S. Dept. Of Health And Human Services (Dhhs), U.S. Government Compostions and methods for enabling cholesterol catabolism in human cells
CN112315944B (zh) * 2020-12-08 2022-09-02 黄山中皇制药有限公司 一种穿琥宁肠溶干混悬剂的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032401A (en) * 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
US6133229A (en) * 1993-10-08 2000-10-17 The University Of Leeds Innovations, Ltd. Stabilization of proteins in solution
WO2004012657A2 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Immusonic, Inc. Beta-glucan containing composites, methods for manufacturing and for using such composites
CN101001615A (zh) * 2004-06-16 2007-07-18 加里·R·奥斯特罗夫 药物输送产品和方法

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2010115A1 (de) * 1970-03-04 1971-09-16 Farbenfabriken Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur Herstellung von Mikrogranulaten
JPS523342B2 (zh) * 1972-01-26 1977-01-27
US4256108A (en) * 1977-04-07 1981-03-17 Alza Corporation Microporous-semipermeable laminated osmotic system
US4160452A (en) 1977-04-07 1979-07-10 Alza Corporation Osmotic system having laminated wall comprising semipermeable lamina and microporous lamina
US4160542A (en) * 1978-06-02 1979-07-10 Winters Donald R Post and rail interconnection
US4265874A (en) * 1980-04-25 1981-05-05 Alza Corporation Method of delivering drug with aid of effervescent activity generated in environment of use
US4384975A (en) * 1980-06-13 1983-05-24 Sandoz, Inc. Process for preparation of microspheres
US4389330A (en) * 1980-10-06 1983-06-21 Stolle Research And Development Corporation Microencapsulation process
US4595660A (en) 1983-03-02 1986-06-17 University Of Delaware Molecular cloning with bifunctional plasmid vectors in Bacillus subtilis, mutants and substantially stably transformed mutants of Bacillus subtilis, and methods for utilizing the transformed mutants
JPS60100516A (ja) * 1983-11-04 1985-06-04 Takeda Chem Ind Ltd 徐放型マイクロカプセルの製造法
US4777049A (en) * 1983-12-01 1988-10-11 Alza Corporation Constant release system with pulsed release
US4663308A (en) * 1984-07-18 1987-05-05 Medical College Of Ohio Method of use of polymers containing cross-linked azo bonds for releasing therapeutic agents into the lower gastrointestinal tract
US5028703A (en) * 1988-03-11 1991-07-02 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US4992540A (en) * 1984-11-28 1991-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US5082936A (en) * 1984-11-28 1992-01-21 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US4810646A (en) * 1984-11-28 1989-03-07 Massachusetts Institute Of Technology Glucan compositions and process for preparation thereof
GB8608964D0 (en) 1986-04-12 1986-05-14 Pannell N A Producing microbially encapsulated materials
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5132405A (en) * 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPS6412935A (en) * 1987-07-02 1989-01-17 Mitsubishi Electric Corp Constant-speed travel device for vehicle
AU2946289A (en) * 1987-12-23 1989-07-19 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Cloned dna for synthesizing unique glucocerebrosidase
US5879680A (en) * 1987-12-23 1999-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cloned DNA for synthesizing unique glucocerebrosidase
CA2002890C (en) 1988-11-14 1999-12-14 Susan Long Expression of dna sequences derived from nocardioform microorganisms
DE69024953T3 (de) * 1989-05-04 2005-01-27 Southern Research Institute, Birmingham Einkapselungsverfahren
JPH05503952A (ja) * 1989-09-08 1993-06-24 アルファ　ベータ　テクノロジー，インコーポレイティッド 可溶性グルカン類の製造方法
US5622939A (en) * 1992-08-21 1997-04-22 Alpha-Beta Technology, Inc. Glucan preparation
ATE153856T1 (de) * 1989-09-08 1997-06-15 Alpha Beta Technology Zusammensetzung zur stimulierung des immunsystems
US5811542A (en) * 1989-09-08 1998-09-22 Alpha-Beta Technology, Inc. Method for producing soluble glucans
US5488040A (en) * 1989-09-08 1996-01-30 Alpha-Beta Technology, Inc. Use of neutral soluble glucan preparations to stimulate platelet production
JPH0832225B2 (ja) 1990-09-07 1996-03-29 三菱製紙株式会社 マイクロカプセルの製造方法
CA2040374C (en) * 1990-07-06 1998-06-16 Gunnar Rorstad Process for enhancing the resistance of aquatic animals to disease
DK0814159T3 (da) * 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9022560D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 G B Biotechnology Limited Processing of waste
US5911983A (en) * 1992-06-26 1999-06-15 University Of Pittsburgh Gene therapy for Gaucher disease using retroviral vectors
JPH08507677A (ja) * 1992-12-10 1996-08-20 エンゾン，インコーポレーテッド 糖脂質酵素−ポリマー結合体
US5622940A (en) * 1994-07-14 1997-04-22 Alpha-Beta Technology Inhibition of infection-stimulated oral tissue destruction by β(1,3)-glucan
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
IL117175A (en) 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
WO1997000271A1 (en) * 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
AUPN398295A0 (en) * 1995-07-05 1995-07-27 Carlton And United Breweries Limited Chemical compounds and processes for their production
US6118045A (en) * 1995-08-02 2000-09-12 Pharming B.V. Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
JPH0967205A (ja) 1995-08-31 1997-03-11 Sumitomo Chem Co Ltd 粒状農薬組成物およびその製造方法
FR2755976B1 (fr) * 1996-11-15 1999-01-15 Idm Immuno Designed Molecules Nouveaux complexes d'acides nucleiques et de polymere substitue par des residus entrainant la destabilisation des membranes cellulaires
ATE347911T1 (de) * 1997-09-15 2007-01-15 Genetic Immunity Llc Zusammensetzungen für die zufuhr von genen an antigen-präsentierende zellen der haut
US7220427B2 (en) * 1998-07-08 2007-05-22 Oryxe Mixture for transdermal delivery of low and high molecular weight compounds
US6369216B1 (en) 1998-09-25 2002-04-09 Biopolymer Engineering Pharmaceutical, Inc. Very high molecular weight β-glucans
AU6261999A (en) * 1998-09-25 2000-04-17 Collaborative Group, Ltd., The Very high molecular weight beta-glucans
US6696272B1 (en) * 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
EP1196190B1 (en) * 1999-07-26 2003-03-19 G.D. SEARLE &amp; CO. Use of long-chain n-alkyl derivatives of deoxynojirimycin and a glucocerebrosidase enzyme for the manufacture of a medicament for the treatment of glycolipid storage diseases
US8017742B2 (en) * 1999-11-10 2011-09-13 Japan Science And Technology Agency Gene carrier
AU2001279796A1 (en) 2000-08-03 2002-02-18 Abac R & D Gmbh Isolation of glucan particles and uses thereof
US7229623B1 (en) * 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
EP1322337A2 (en) 2000-09-25 2003-07-02 Board of Regents, The University of Texas System Pei : dna vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
US6476003B1 (en) * 2000-11-06 2002-11-05 Immusonic, Inc. Method for preparing small particle size glucan in a dry material
US6710058B2 (en) * 2000-11-06 2004-03-23 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Monocyclic or bicyclic carbocycles and heterocycles as factor Xa inhibitors
US7507724B2 (en) 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US6973623B2 (en) 2001-06-14 2005-12-06 International Business Machines Corporation System and method for client refresh mode selection
TWI331526B (en) * 2001-09-21 2010-10-11 Bristol Myers Squibb Pharma Co Lactam-containing compounds and derivatives thereof as factor xa inhibitors
US7786094B2 (en) 2001-10-09 2010-08-31 Biopolymer Engineering, Inc. Use of beta-glucans against biological warfare weapons and pathogens including anthrax
CN100334962C (zh) 2001-11-15 2007-09-05 三荣源有限公司 微囊及含微囊的经口组合物
TW200302225A (en) * 2001-12-04 2003-08-01 Bristol Myers Squibb Co Substituted amino methyl factor Xa inhibitors
AU2003273179A1 (en) * 2002-05-10 2003-12-12 Bristol-Myers Squibb Company 1,1-disubstituted cycloalkyl derivatives as factor xa inhibitors
GB0212302D0 (en) 2002-05-28 2002-07-10 Isis Innovation Method of selecting targets for gene silencing by RNA interference
AU2003258181A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-25 University Of Louisville Research Foundation Inc. Methods of using beta glucan as a radioprotective agent
US20060165700A1 (en) * 2002-09-04 2006-07-27 Ostroff Gary R Cancer therapy using whole glucan particles and antibodies
JP2006502167A (ja) 2002-09-04 2006-01-19 バイオポリマー エンジニアリング，インコーポレイテッド 全グルカン粒子および抗体を用いた癌治療
US7018986B2 (en) 2002-09-20 2006-03-28 Immudyne Use of beta glucans for the treatment of osteoporosis and other diseases of bone resorption
US6740336B2 (en) 2002-10-04 2004-05-25 Mirus Corporation Process for generating multilayered particles
US20060127489A1 (en) 2002-10-24 2006-06-15 Michael Crothers Targeted delivery
JP2006507841A (ja) 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
AU2003297062A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 University Of Massachusetts METHOD OF INTRODUCING siRNA INTO ADIPOCYTES
US20040162235A1 (en) 2003-02-18 2004-08-19 Trubetskoy Vladimir S. Delivery of siRNA to cells using polyampholytes
US7122557B2 (en) * 2003-03-18 2006-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Sulfonyl-amidino-containing and tetrahydropyrimidino-containing compounds as factor Xa inhibitors
US7205318B2 (en) * 2003-03-18 2007-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Lactam-containing cyclic diamines and derivatives as a factor Xa inhibitors
US7091672B2 (en) 2003-06-10 2006-08-15 Lutron Electronics Co., Inc. High efficiency off-line linear power supply
EP1670739A4 (en) * 2003-10-08 2007-08-08 Bristol Myers Squibb Co CYCLIC DIAMINES AND DERIVATIVES AS FACTOR XA INHIBITORS
SI1711058T1 (sl) * 2004-01-23 2022-02-28 Eden Research Plc, Postopki za uničevanje nematod, ki obsega uporabo terpenske komponente
WO2006032039A2 (en) 2004-09-17 2006-03-23 University Of Massachusetts Compositions and their uses for lysosomal enzyme deficiencies
NZ554895A (en) 2004-11-03 2009-06-26 Almac Diagnostics Ltd Transcriptome microarray technology and methods of using the same
EP1817583A4 (en) 2004-12-02 2009-06-03 Univ Massachusetts GENES RELATED TO GLUCOSE TRANSPORT, POLYPEPTIDES AND METHOD OF USE THEREOF
EP1948245B1 (en) 2005-10-24 2011-10-05 University of Massachusetts Compositions and their uses for gene therapy of bone conditions
WO2007099387A1 (en) 2006-03-03 2007-09-07 Mymetics Corporation Virosome-like vesicles comprising gp41-derived antigens
US20080044438A1 (en) * 2006-03-17 2008-02-21 Ostroff Gary R Yeast Cell Particles As Oral Delivery Vehicles For Antigens
EP2222283A2 (en) 2007-10-29 2010-09-01 University of Massachusetts Yeast cell wall protein (ycwp) encapsulated multilayered nanoparticles for nucleic acid delivery (sirna)
WO2012024229A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 University Of Massachusetts Yeast cell wall particle for receptor-targeted nanoparticle delivery

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032401A (en) * 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
US6133229A (en) * 1993-10-08 2000-10-17 The University Of Leeds Innovations, Ltd. Stabilization of proteins in solution
WO2004012657A2 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Immusonic, Inc. Beta-glucan containing composites, methods for manufacturing and for using such composites
CN101001615A (zh) * 2004-06-16 2007-07-18 加里·R·奥斯特罗夫 药物输送产品和方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Marie-Josee Champagne,etc..Binding of GM1-ganglioside to a synthetic peptide derivedfrom the lysosomal sphingolipid-activator-protein saposin B.M.-J. Champagne et al.|FEBS Letters347.1994,347265-267. *
Paula Magnelli,etc..A Refined Method for the Determination of Saccharomycescerevisiae Cell Wall Composition and b-1,6-Glucan FineStructure.Analytical Biochemistry301.2002,301136-150. *
PaulaMagnelli etc..A Refined Method for the Determination of Saccharomycescerevisiae Cell Wall Composition and b-1
赵洪亮,刘志敏.蛋白质糖基化工程.中国生物工程杂志23 9.2003,23(9),18-20.
赵洪亮,刘志敏.蛋白质糖基化工程.中国生物工程杂志23 9.2003,23(9),18-20. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1802289A2 (en) 2007-07-04
AU2005284727A1 (en) 2006-03-23
IL181748A0 (en) 2008-04-13
EP1802289B1 (en) 2011-12-07
ZA200701943B (en) 2008-07-30
ES2375995T3 (es) 2012-03-08
KR20070054246A (ko) 2007-05-28
BRPI0515332A (pt) 2008-07-22
WO2006032039A2 (en) 2006-03-23
US20120039929A1 (en) 2012-02-16
CA2580537A1 (en) 2006-03-23
US20060083718A1 (en) 2006-04-20
ATE536175T1 (de) 2011-12-15
CN101052383A (zh) 2007-10-10
US8007814B2 (en) 2011-08-30
US8637045B2 (en) 2014-01-28
JP2008513484A (ja) 2008-05-01
CA2580537C (en) 2015-04-21
WO2006032039A3 (en) 2007-04-05
JP5302537B2 (ja) 2013-10-02
IL181748A (en) 2013-12-31
HK1105587A1 (en) 2008-02-22

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Publication Publication Date Title
CN101052383B (zh) 用于溶酶体酶缺乏症的组合物和其用途
CN101001615B (zh) 药物输送产品和方法
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