CN106102464A - 采用亚氨基糖的糖脂抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶方面具有高活性和特异性的亚氨基糖。

Description

采用亚氨基糖的糖脂抑制
相关申请的交叉参考
本申请请求2013年5月2日提交的美国临时申请号61/818,621，和2014年1月21日提交的美国临时申请号61/929,704的权益，所述文献内容通过引用其全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及亚氨基糖及其作为糖脂抑制剂的应用，以及治疗病症和疾病的方法，糖脂抑制对于所述病症和疾病而言是有益的。
发明内容
一个实施方式是一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素或其药学上可接受的盐。
另一个实施方式是一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐：其中R是：R1是取代或未取代的烷基基团；W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；X1-5独立地选自H、NO2、N3或NH2；Y不存在或者是除羰基以外的的取代或未取代的C1-烷基基团；并且Z选自键或NH，
限制条件是当Z是键时，Y不存在，并且
限制条件是当Z是NH时，Y是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团。
而另一个实施方式是一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐：其中R是：R’是取代或未取代的烷基基团；W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。
而另一个实施方式是一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的下式化合物
或其药学上可接受的盐。
而另一个实施方式是抑制具有生成糖脂的能力的细胞中的糖脂生物合成的方法，所述方法包括使所述细胞经受糖脂抑制有效量的N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素或其药学上可接受的盐。
而另一个实施方式是抑制具有生成糖脂的能力的细胞中的糖脂生物合成的方法，所述方法包括使所述细胞经受糖脂抑制有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐：其中R是：R1是取代或未取代的烷基基团；W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；X1-5独立地选自H、NO2、N3或NH2；Y不存在或者是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团；并且Z选自键或NH，
限制条件是当Z是键时，Y不存在，并且
限制条件是当Z是NH时，Y是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团。
而另一个实施方式是抑制具有生成糖脂的能力的细胞中的糖脂生物合成的方法，所述方法包括使所述细胞经受糖脂抑制有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐：其中R是：R’是取代或未取代的烷基基团；W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。
而另一个实施方式是式I化合物：其中R是：R’是取代或未取代的烷基基团；W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。
附图
图1A-B显示NB-DNJ(图1A)和UV-4(图1B)对于HL60细胞中的GM3合成的剂量响应抑制的希尔图(Hill plot)。在向细胞给予化合物之后，提取GSL，寡糖经切割并用2-AA标记，然后通过NP-HPLC分离。对源自GM3的寡糖的峰面积定量，并相对于未处理的细胞表示。采用四参数Logistic模型来计算IC50值。
图2说明底物减少治疗(SRT)的细胞靶标。
通过葡萄糖-和半乳糖-立体化学的N-烷基化的亚氨基糖进行神经酰胺葡萄糖基转移酶(CGT)抑制，作为对溶酶体贮积症(LSD)的治疗。二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-葡萄糖)神经酰胺葡萄糖基转移酶催化鞘糖脂生物合成中糖基化的第一步。所得产物，葡糖神经酰胺，是多于300 GSL的核结构。尽管图2提及了N-烷基亚氨基糖，应理解该图中所示的机制不仅可应用于N-烷基亚氨基糖，还能应用于其它N-取代的亚氨基糖，例如图3和12中所示的亚氨基糖。
图3提供该研究中所用的亚氨基糖的化学式。
图4显示HL60细胞的GSL特征。HL60细胞用不同浓度的亚氨基糖处理72小时。从HL60细胞团块提取脂质，并通过用2AA标记和NP-HPLC分析来表征。GSL标准释放是酶释放和荧光标记的阳性对照。检测GM3水平供于IC50计算。
图5显示来自GM3细胞减少试验的代表性的希尔图。
利用对GM3峰面积的测量来确定GSL生物合成的抑制。实验以三个重复进行，且误差线显示标准偏差。
图6A-B显示来自体外β-葡糖脑苷脂酶试验的代表性希尔图。
对于人胎盘β-葡糖脑苷脂酶的抑制的检测。实验以三个重复进行，且误差线显示标准偏差。
图7A-B提供的数据显示侣伴处理后的酶增强。
戈谢(Gaucher)N370S成纤维细胞用至多10μM的无细胞毒性水平的亚氨基糖处理3天，然后经收获并检测酶水平，与未处理的突变成纤维细胞做比较。
图8提供制备UV 6.2的合成方案。
图9提供制备UV 6.4的合成方案。
图10提供制备UV 6.8的合成方案。
图11显示ToP-DNJ的HL60细胞中的GM3合成的剂量响应抑制的希尔图。获得图11中数据的方法与图1和5相同。
图12提供ToP-DNJ的化学式。
图13提供UV-4和ToP-DNJ的游离寡糖分析(对ERα葡萄糖苷酶抑制的检测)的结果，显示Top-DNJ实际上缺乏ER葡萄糖苷酶抑制活性。游离葡糖基寡糖根据Alonzi等Biochem.J.(2008)409，571-580来检测。
图14显示Top-DNJ对细胞葡糖神经酰胺的作用，及其在人肝癌细胞中的下游产物乳糖神经酰胺(神经节苷脂生物合成中的中间体)，显示10μM浓度的Top-DNJ几乎完全抑制该通路。鞘糖脂(包括GlcCer和LacCer)按照Wolf,C.和Quinn，P.J.Progress in lipidresearch(2008)47，15-36所述来检测。简言之，对细胞脂质的氯仿-甲醇提取物进行HPLC以从其它细胞脂质分离鞘糖脂物质，然后采用内标进行双向质谱以对具体鞘糖脂物质定量。
发明详述
除非另有说明，“一个”或“一种”表示“一个(种)或多个(种)”。
本文中所用的术语“GCS”指的是神经酰胺葡萄糖基转移酶，也称为神经酰胺葡萄糖基转移酶EC 2.4.1.80或称为UDP-葡萄糖-神经酰胺葡萄糖基转移酶或葡糖神经酰胺合酶。
术语“疾病”或“病症”指通常被认为是病理状态或功能的扰乱和/或异常，并且可以特定迹象、症状和/或功能失调的形式来表现。
本文中，术语“治疗”、“处理”等表示消除、降低或缓解疾病或病症和/或其相关症状。虽然不是排除性的，但治疗疾病或病症不需要完全消除该疾病或病症或其相关症状。本文中，术语“治疗”、“处理”等可包括“预防性处理”，指降低对象中疾病或病症再发展的可能性或先前已得到控制的疾病或病症的复发，所述对象中不存在疾病或病症的再发展或复发，但其处于风险中或可能再发展或复发。术语“治疗”和同义词涵盖向需要这类治疗的对象给予治疗有效量的本发明的化合物。所述对象可以是恒温动物，例如哺乳动物。在许多实施方式中，所述对象可以是人类。
本文中，术语“治疗有效量”或“有效剂量”指活性成分的含量，其通过本发明的方法给予时足以向有此需要的个体有效递送用于治疗感兴趣的疾病或病症的活性成分。在溶酶体贮积症的情况中，治疗有效量的所述试剂能够减少(即，减缓至一定程度，且优选地阻止)不希望的糖脂累积和/或减轻(至一定程度)与该病症相关联的一种或多种症状。优选地，所述有效量在医学上是有利的，但伴随其应用不存在超过优势的毒性作用。
IC50或IC90(抑制浓度50或90)可以是用于使具体鞘糖脂发生50％或90％减少的鞘糖脂生物合成抑制剂(例如亚氨基糖)的浓度。
本发明的发明人发现，某些亚氨基糖可以是神经酰胺葡萄糖基转移酶的有力抑制剂，并且/或者在降低葡糖神经酰胺、乳糖神经酰胺、和源自乳糖神经酰胺的神经节甘脂的细胞浓度方面具有高活性。具体而言，这些亚氨基糖具有神经酰胺葡萄糖基转移酶抑制活性和/或降低葡糖神经酰胺、乳糖神经酰胺、和源自乳糖神经酰胺的神经节甘脂的细胞浓度方面的活性，所述活性惊人地高于N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)，其为已知具有相应活性的化合物，参见例如美国专利号5,472,969和5,525,616。已经公开了多种GCS和鞘糖脂抑制剂，例如，参见美国专利号5,302,609；5,472,969；5.525,616；5,916,911；5,945,442；5,952,370；6,030,995；6,051,598；6,255,336；6,569,889；6,610,703；6,660,794；6,855,830；6,916,802；7,253,185；7,196,205；和7,615,573。其它GCS抑制剂和治疗公开于WO2008/150486；WO 2009/117150；和WO 2010/014554。
在一些实施方式中，亚氨基糖可以是N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素(UV-4)或其药学上可接受的盐。N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素及其制备方法公开于，例如，美国专利号8,450,345和8,426,445，以及美国专利申请公开号2010/0222384，2011/0065754，2011/0065753和2011/065752。
在一些实施方式中，亚氨基糖可以是美国专利申请公开号2007/0275998中公开的化合物。例如，亚氨基糖可以是式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中R是：
R1是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；
X1-5独立地选自H、NO2、N3或NH2；
Y不存在或者是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团；且
Z选自键或NH，
限制条件是当Z是键时，Y不存在，并且
限制条件是当Z是NH时，Y是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团。化学基团的定义可以与US 2007/0275998相同。
在一些实施方式中，R1可以是取代或未取代的C1-C12烷基基团，即具有1-12个碳原子的取代或未取代的烷基基团。例如，R1可以是取代或未取代的C1-C10烷基基团或取代或未取代的C3-C9烷基基团或取代的或未取代的C5-C8烷基基团。在一些实施方式中，D1可以是取代或未取代的丁基、戊基、己基、庚基或辛基基团。
在许多实施方式中，可优选Z为NH。在该情况中，Y是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团。
在一些实施方式中，X1-5中至少一个或至少两个可选自NO2、N3和NH2。在一些实施方式中，X1-5中至少一个或至少两个可选自NO2和N3。在一些实施方式中，X1-5中至少一个或至少两个可选自NO2和NH2。在一些实施方式中，X1-5中至少一个或至少两个可选自NH2和N3。
在一些实施方式中，式I化合物可以是脱氧野尻霉素衍生物，即，式Ia的化合物：
DNJ衍生物的示例包括：N-(N’-{4’-叠氮-2’-硝基苯基)-6-氨基己基)-脱氧野尻霉素(NAP-DNJ或UV-5)和N-(N’-{2,4-二硝基苯基)-6-氨基己基)-脱氧野尻霉素(NDP-DNJ)。
在一些实施方式中，亚氨基糖可以是式II化合物或其药学上可接受的盐：
其中R是：
R’是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。术语取代的可与US 2007/0275998中具有相同含义。可优选式II化合物，例如，采用与图8-10所示那些相似的合成方案。
在一些实施方式中，R’可以是取代或未取代的C1-C12烷基基团，或者取代或未取代的C2-C10烷基基团或取代或未取代的C3-C9烷基基团或取代或未取代的C5-C8烷基基团。在一些实施方式中，R’可以是未取代的C1-C12烷基基团，或者C2-C10烷基基团或C3-C9烷基基团或C5-C8烷基基团。而在一些实施方式中，R’可以是烷基基团，例如C1-C12或C2-C10或C3-C9或C5-C8烷基基团，其被1-3个氧原子取代。例如，在一些实施方式中，R’可以是(CH2)n-O-(CH2)m，其中n是3-10或5-8且m是0-4。在一些实施方式中，R’可以是氨基取代的烷基基团，即烷基基团，例如C1-C12或C2-C10或C3-C9或C5-C8烷基基团，其被氨基基团取代。例如，R’可以是(CH2)p-NH-(CH2)q，其中n是3-10或5-8且q是0-2或0-4。
在一些实施方式中，式II化合物中至少一个或至少两个X1-5可以是卤素，例如F、Cl或Br，或者卤代的烷基。卤代的烷基可以是C1卤代的烷基，例如CHCl2、CHF2、CH2Cl、CH2F、CF3或CCl3。
在一些实施方式中，X3和X5中至少一个是卤素、NO2或卤代的烷基，并且X1、X2和X4是H。
在一些实施方式中，X3和X5中至少一个是F或Cl。
在许多实施方式中，W1、W2、W3和W4可以各自为氢。
在一些实施方式中，式II化合物可以是脱氧野尻霉素衍生物，即式IIa化合物：此类化合物的示例包括：UV-6.2、UV 6.4、UV 6.5和UV6.8，示于图3。
在一些实施方式中，式II或IIa化合物可具有R，该R为如下一种：
在一些实施方式中，亚氨基糖可以是美国专利申请公开号2013/0331578中公开的化合物，该文献通过引用其全文纳入本文。例如，在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是具有式I’的化合物：
其中：
R1是C2-C6烷基或氧杂烷基基团(oxaalkyl)；
Y是O或CH2；
Z选自(CH2)3-O-CH2；(CH2)5；和R2：a)当Z是时，R2是直链或支化的C10-C16烷基或亚烷基基团和H，和b)当Z是(CH2)3-O-CH2、(CH2)5或时，R2是直链或支化的C10-C20烷基或亚烷基基团；
W1-4各自独立地选自H或醇保护基团；并且X1-4各自独立地选自H或C1-2烷基。在一些实施方式中，式I化合物’可具有式II’
在一些实施方式中，R1可以是C5烷基。
在一些实施方式中，-Z-Y-是并且其中X1-4各自可独立地选自H或甲基。在一些实施方式中，X4是甲基，并且其中R2-Z-Y-是
在一些实施方式中，X1-4各自是甲基，并且
R1是C5烷基。在一些实施方式中，W1-4各自是H。在一些实施方式中，R2是
在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是具有下式的化合物：
(生育酚-戊基脱氧野尻霉素，TOP-DNJ)或其药学上可接受的盐。
作为神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或GSL抑制剂，上述亚氨基糖可以用于治疗多种疾病或病症，对于所述疾病或病症而言，抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可以是有益的。此类疾病或病症的示例包括戈谢病(包括I型、II型和III型戈谢病)、法布瑞氏症、山霍夫氏病、泰-萨二氏病、帕金森病、II型糖尿病、与糖尿病性肾病相关联的肥大或增生、血液葡萄糖水平升高、糖化血红蛋白水平升高、肾小球疾病和狼疮，包括系统性红斑狼疮。肾小球疾病的示例包括：系膜增生性肾小球肾炎、塌陷性肾小球病、增生性狼疮肾炎、新月体性肾小球肾炎和膜性肾病。
在一些实施方式中，对于其而言抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可能有益的疾病或病症可以是：溶酶体鞘糖脂贮积症(LSD)，例如戈谢(I、II和III型)疾病、法布瑞氏症、山霍夫氏病、泰-萨二氏病、GMI神经节苷脂沉积病和C型尼曼-皮克病。
在一些实施方式中，对于其而言抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可能有益的疾病或病症可以是：多发性骨髓瘤。上文公开的亚氨基糖中的许多除了是神经酰胺葡萄糖基转移酶抑制剂以外还是葡萄糖苷酶抑制剂。US 2011/0136868公开了采用试剂，例如亚氨基糖(其为神经酰胺葡萄糖基转移酶抑制剂和葡萄糖苷酶抑制剂)来抑制破骨细胞生成和/或减少与多重骨髓瘤相关的破骨细胞活化。US 2011/0136868还公开了采用试剂，例如亚氨基糖(其为神经酰胺葡萄糖基转移酶抑制剂和葡萄糖苷酶抑制剂)来减少或预防溶骨活性和/或骨损失。
在一些实施方式中，对于其而言抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可能有益的疾病或病症可以是：骨质疏松症或骨关节炎。抑制破骨细胞生成和/或减少与这些紊乱相关联的破骨细胞活化将阻碍骨吸收。
在一些实施方式中，抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可能对其有益的疾病或病症可以是：多囊肾疾病，包括多囊审疾病的常染色体显性或隐性形式。
在一些实施方式中，抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可能对其有益的疾病或病症可以是：糖尿病患者中的动脉粥样硬化或肾部肥大症。
在一些实施方式中，抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低鞘糖脂浓度可能对其有益的疾病或病症可以是II型糖尿病和/或其相关疾病或病症。在一些实施方式中，此类疾病或病症可以是非酒精性脂肪肝疾病，其为代谢综合症和II型糖尿病所致。在一些实施方式中，相关的疾病或病症可以是代谢综合症和/或相关的血脂异常，其可以是II型糖尿病和/或动脉粥样硬化的前期。在一些实施方式中，上述亚氨基糖可预防性地用于预防II型糖尿病和/或其相关疾病或病症。尽管本发明不限于任何理论，发明人假定对于II型糖尿病和/或其相关疾病或病症进行治疗和/或预防的原理可以是：能够降低葡糖神经酰胺浓度的亚氨基糖也能降低神经节甘脂，尤其是GM3的表达，其会导致胰岛素受体接合脂质筏，造成受体失活和内在化，导致胰岛素抵抗。因此，上述亚氨基糖能够使细胞耗尽表面GM3，并使该细胞对胰岛素敏感，由此有利于治疗胰岛素抵抗，所述胰岛素抵抗可能是发展例如代谢综合症、II型糖尿病、非酒精性肝病和动脉粥样硬化的关键。
在一些实施方式中，上述亚氨基糖可用于治疗由毒素造成的细菌性疾病，其通过鞘糖脂或神经节苷脂结合，或结合至鞘糖脂或神经节苷脂。例如，霍乱由毒素(霍乱毒素)所致，所述毒素通过其B-亚基结合至神经节苷脂GM1。通过对霍乱患者进行口服亚氨基糖治疗，或者通过用亚氨基糖进行结肠灌洗，肠上皮中易感细胞的GM1靶标的表达可以被中止或显著减少，通过降低毒素的作用而具有相应的治疗效果。涉及细菌性毒素的另一种疾病是腹泻后溶血性尿毒综合征，其通常与大肠杆菌细菌的特定菌株相关联，所述菌株产生志贺氏(Shiga)毒素型-2，其能够结合至神经节苷脂三聚己糖神经酰胺(Gb3)。与上述关于霍乱治疗的设定类似，上述亚氨基糖可用于治疗大肠杆菌相关的紊乱，所述治疗通过减少所述毒素(在该情况中是Gb3)的神经节苷脂靶标的细胞表达来实现。志贺氏毒素-2通常由大肠杆菌O157:H7表达，其为已知造成肠道出血性疾病的大肠杆菌菌株。因此，上述亚氨基糖可用于治疗与O157相关的肠道出血性疾病，但也能治疗表达志贺氏毒素-2的其它细菌所致的肠道出血性疾病。
在一些实施方式中，为了治疗肠的感染性或炎性疾病，亚氨基糖的头部基团(headgroup)和“尾部基团(tailgroup)”的性质可能均是重要的。尽管相较于对蔗糖酶-异麦芽糖酶(非意图的/不希望的)的抑制，本文所述的化合物可具有针对神经酰胺葡萄糖基转移酶(意图的靶标)的有利活性比例，而对于一般靶向神经酰胺葡萄糖基转移酶(且特别是肠紊乱)的治疗目的，缺乏蔗糖酶-异麦芽糖酶抑制活性的亚氨基糖化合物有可能将会是有利的。因此，美国专利申请公开号2013/0331578中公开的化合物，例如生育酚-戊基-DNJ，可能尤其有利，因为(尽管其具有葡萄糖型头部基团)与一些其它基于DNJ-的亚氨基糖不同，其可能对蔗糖酶-异麦芽糖酶具有非常低的活性，而对神经酰胺葡萄糖基转移酶保留高活性。同样地，具有(替代DNJ)半乳糖型或艾杜糖型亚氨基糖头部基团的化合物可尤其有利，因为这些头部基团可避免对蔗糖酶-异麦芽糖酶的抑制，以及剂量限制性腹泻的可能。
在一些实施方式中，上述亚氨基糖可抑制β-葡糖脑苷脂酶EC 3.2.1.45(也称作D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶或酸性β-葡萄糖苷酶)。β-葡糖脑苷脂酶是一种负责包括神经节苷脂的GSL的溶酶体分解代谢的酶，其在戈谢疾病中突变，产生其特征性的溶酶体贮积病理学。β-葡糖脑苷脂酶还在一些帕金森疾病的情况中突变(杂合性)，其中其为在戈谢突变的“载体”中发现的诱发性突变。尽管对β-葡糖脑苷脂酶的抑制可以是对其本身、非治疗性目标的抑制，但其如此发生以至于作为该酶的活性位点取向的抑制剂的化合物能够伴随该酶的某些突变形式的正确折叠，所述酶在其它情况下会自然倾向于错误折叠，矛盾是这会从戈谢表型的较低基础水平特征增加其催化活性。
在一些实施方式中，上述亚氨基糖可提供β-葡糖脑苷脂酶的增强或作为增强其活性的侣伴效应(chaperoning)。该性质可能尤其有用于治疗戈谢病，尤其是I型，但也有用于治疗II型和III型戈谢病(即神经病变形式)。同样地，虽然β-葡糖脑苷脂酶突变增强帕金森疾病的风险的准确机制尚未知晓，在一些情况中，上述亚氨基糖的侣伴作用可能会排除所述突变在帕金森疾病中的病理作用，这通过允许β-葡糖脑苷脂酶正确折叠和其酶促活性的完全表达而实现。此外，亚氨基糖治疗可防止D1-多巴胺受体通过小窝介导的内在化的脱敏，有此增强帕金森病中病理影响的多巴胺能的通路。
在一些实施方式中，亚氨基糖可用于治疗多种疾病或病症，对于所述疾病或病症而言，抑制GM3合成和/或降低GM3浓度可以是有益的。所述疾病或病症的示例包括I型戈谢病。
在一些实施方式中，上述亚氨基糖可用于抑制细胞中糖脂的生物合成(针对神经节苷脂贮积紊乱的底物减少治疗)，例如哺乳动物细胞，例如人细胞，所述细胞能够生成糖脂，所述抑制通过使所述细胞经受糖脂抑制有效量的亚氨基糖或其药学上可接受的盐来进行。本文中所用的术语“糖脂”包括基于糖脂的分子，例如神经节甘脂。在一些实施方式中，糖脂可以是或可包含鞘糖脂，例如，基于鞘糖脂的糖基化神经酰胺。在一些实施方式中，所述糖脂可包括神经节甘脂中的一种或多种，例如GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b，和GQ1。在一些实施方式中，所述经受可在体外进行。而在一些其他实施方式中，所述细胞的经受可在体内进行。例如，在一些实施方式中，可将糖脂抑制有效量或浓度的亚氨基糖或其药学上可接受的盐给予患有疾病或病症的对象，对于所述疾病或病症而言，抑制糖脂生物合成可以是有益的。所述对象可以是恒温动物，例如哺乳动物，例如人类。所述疾病或病症的示例包括戈谢病(包括I型、II型和III型戈谢病)、法布瑞氏症、山霍夫氏病、泰-萨二氏病、GMI神经节苷脂贮积病、C型尼曼-皮克病、红斑狼疮，例如系统性红斑狼疮，多囊肾疾病、多发性骨髓瘤、格-巴二氏综合征。术语"糖脂抑制有效量"指的是亚氨基糖的量或浓度，所述量或浓度抑制一种或多种糖脂的生成，而不导致超过亚氨基糖应用的益处的毒性作用。
在一些实施方式中，亚氨基糖可以是源自无机酸或有机酸的盐的形式。药学上可接受的盐和用于制备盐形式的方法已公开，例如，于Berge等(J.Pharm.Sci.66:1-18,1977)。合适的盐的示例包括但不限于如下的盐：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、双葡萄糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、占替诺烟酸盐，2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐，和十一酸盐。
在一些实施方式中，亚氨基糖或其药学上可接受的盐可以作为组合物的一部分使用，所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或有利于将所述组合物递送给动物的组分。本领域已知多种有利于将组合物递送给人的多种药学上可接受的载体和有利于将组合物地送给其它动物(例如牛)的组分。向本发明组合物添加所述载体和组分也在本领域普通技术人员的认知范围之内。
在一些实施方式中，药物组合物可基本由亚氨基糖或其药学上可接受的盐组成，这可指所述亚氨基糖或其药学上可接受的盐是所述组合物中的唯一活性成分。
在一些实施方式中，亚氨基糖或其药学上可接受的盐可用于脂质体组合物，例如美国公开号2008/0138351、2009/0252785和2010/0266678中公开的那些。
所述药物组合物中活性成分(例如亚氨基糖)的实际剂量水平可变化，以使给予的活性化合物的量有效于获得对于特定患者的所需治疗响应。
所选的剂量可取决于给予途径、待治疗的病症的严重性，以及待治疗的患者的状况和先前的病史。然而，本领域技术人员了解，亚氨基糖的起始剂量水平低于获得理想治疗效果所需的剂量并逐步增加剂量直到获得理想效果。若需要，可将有效的每天给药分成数次给药以供给药目的，例如，每天2-4次给药。然而，应理解对于任何特定患者而言，特定的给药水平可取决于多种因素，包括体重、健康概况、饮食、给予的时间和途径，以及与其它治疗剂的联合，以及待治疗的病症或疾病的严重性。成人每日剂量为约1微克-约1克或者约10mg-100mg的亚氨基糖/10千克体重。在一些实施方式中，每日总剂量可以是0.1mg/kg体重-100mg/kg体重或1mg/kg体重-60mg/kg体重或2mg/kg体重-50mg/kg体重或3mg/kg体重-30mg/kg体重。每日剂量可在一天中的一次或多次给予事件中给予。例如，在一些实施方式中，每日剂量可以分配在每天的两次给予事件(BID)中，每天三次给予事件(TID)中或每天四次给予事件(QID)中。在某些实施方式中，1mg/kg体重-10mg/kg体重的单次给予事件剂量可BID或TID给予人，实现2mg/kg体重-20mg/kg体重或3mg/kg体重-30mg/kg体重的每日总剂量。当然，应给予细胞或动物的亚氨基糖的量可取决于多种因素，这是本领域技术人员所熟知的，例如亚氨基糖的分子量和给予途径。
可用于本发明方法的药物组合物可以通过口服固体制剂、眼药、栓剂、气溶胶、局部或其它类似制剂全身性给予。例如，其可以是粉末、片剂、胶囊、药糖块、凝胶、溶液、悬液、糖浆等的物理形式。除了所述亚氨基糖以外，此类药物组合物还可包含药学上可接受的运载体和已知能够增强和促进药物给予的其它成分。其它可能的制剂，例如纳米颗粒、脂质体、重封闭红细胞(resealed erythrocyte)，以及基于免疫学的系统，也可用于给予所述亚氨基糖。所述药物组合物可以通过多种途径给予。本文中所用的术语"肠胃外"包括但不限于皮下、静脉内、动脉内、鞘间和注射与输注技术。通过示例方式，所述药物组合物可经口服、局部、肠胃外、全身性，或者通过肺部途径给予。
本文所述的实施方式将通过以下工作实施例进一步说明，但所述实施方式绝不限于这些工作实施方式。
实施例1
材料和方法
糖脂生物合成的抑制
为了在基于细胞的试验中测定对神经酰胺葡萄糖基转移酶活性的抑制，HL60细胞在不同浓度(0–500μM)的化合物N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素(UV-4)和N-丁基-脱氧野尻霉素(NB-DNJ)的存在下培养3天直至融合，实验以三次重复进行。细胞经收获并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，然后重悬于水中，并进行杜恩斯(Dounce)均质化。取该均质物的一等份用于蛋白质试验。剩余物制成4:8:3(v/v/v)氯仿:甲醇:水，以按照如下文献所述提取糖脂(Neville 2004，确切的引用参见该实施例终末处的参考文献部分)。提取的糖脂采用包含1mg/mL牛磺脱氧胆酸钠的20μL的50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的神经酰胺聚糖酶制备物(从欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)内部纯化)在37℃经水解过夜。糖脂源性的寡糖用水制成30μL，并如下所述用邻氨基苯甲酸(2-AA)标记。标记的寡糖用NP-HPLC分析，如下所述(Neville 2004、Neville 2009)。
碳水化合物荧光标记
糖脂源性的寡糖如先前所述用邻氨基苯甲酸标记(Neville 2004)。简言之，将邻氨基苯甲酸(30mg/mL)溶解于甲醇中的三水乙酸钠(4％，w/v)和硼酸(2％w/v)溶液。将该溶液添加至氰基硼氢化钠(终浓度45mg/mL)，并混合以产生最终的标记混合物。将2-AA标记混合物(80μL)添加至FOS样品(30μL水)或糖脂源性的寡糖，然后在80℃孵育1小时。允许该反应冷却至室温，添加1mL乙腈/水(97:3，v/v)，并涡旋该混合物。标记的寡糖利用色谱通过Spe-ed Amide 2柱(美国阿伦敦的应用分离公司(Applied Separations))纯化。该柱用2x1mL乙腈，2x1mL水，随后为2x 1mL乙腈进行预平衡。利用重力流加载样品并允许其通过该柱。该柱用2x 1mL乙腈/水(95:5，v/v)洗涤，而带标记的寡糖用2x 0.75mL水洗脱。
通过正相高效液相色谱(NP-HPLC)的碳水化合物分析
荧光标记的糖脂源性的寡糖通过NP-HPLC分离，采用4.6x 250mM (英国西格玛公司)，根据先前公开的方法进行(Alonzi 2008、Neville2004，2009)。所述色谱系统包含Waters Alliance 2695分离模块和Exλ360nm和Emλ425nm的串联Waters 474荧光检测器装置。所有色谱均在30℃下进行。溶剂A为乙腈。溶剂B为Milli-Q水。溶剂C由100mM氢氧化铵组成，在Milli-Q水中用乙酸滴定至pH 3.85，并采用标准5.0N氢氧化铵溶液(英国西格玛公司)制备。梯度条件如下：时间＝0分钟(t＝0)，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝6，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝6，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝40，52％A，28％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝41，23％A，57％B，20％C(1.0mL分钟-1)；t＝43，23％A，57％B，20％C(1.0mL分钟-1)；t＝44，71.6％A，8.4％B，20％C(1.2mL分钟-1)；t＝59，71.6％A，8.4％B，20％C(1.2mL分钟-1)；t＝60，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)。样品(<50μL)在Milli-Q水/乙腈(1:1，v/v)中注入。
为了分析GSL抑制，检测响应抑制剂治疗的对应于单唾液酸化-神经节苷脂GM3的峰面积，以产生抑制常数(Li等，2008)。抑制常数(IC50)采用四参数Logistic拟合计算(希尔图，Prism软件)。
结果
神经酰胺葡萄糖基转移酶抑制
为评估神经酰胺葡萄糖基转移酶(鞘糖脂的生物合成中的关键酶(Butters2000))的细胞抑制，将化合物给予HL60细胞，持续3天。在脂质提取，寡糖头部基团的酶促释放和荧光标记之后，采用正相HPLC来分析对生物合成的抑制作用。HL60细胞具有简单的糖脂组成成分，并且主要物质是单唾液酸化的神经节苷脂，GM3(Mellor 2004)。亚氨基糖UV-4和NB-DNJ对神经酰胺葡萄糖基转移酶的抑制导致GM3减少，该结果在HPLC分离之后检测到。分析因抑制所致的GM3减少的量以获得IC50值(参见图1)。亚氨基糖UV-4在细胞中的效力是NB-DNJ(Zavesca)的约100倍，NB-DNJ(Zavesca)是用于通过减少戈谢患者中的生物合成来校正GSL贮积的已知GSL抑制剂。
参考文献
Neville,D.C.A.,等.(2009)J Proteome Res 8,681-687
Alonzi,D.S.,等.(2008)Biochem J 409,571-580
Mellor,H.R.,等.(2004)Biochem J 381,861-866
Neville,D.C.A.,等.(2004)Anal Biochem 331,275-282
Butters,T.D.,等.(2000)Tetrahedron:Asymmetry 11,113-124
Li,H.,等.(2008)ChemBioChem 9,253-260
实施例2
神经酰胺葡糖基转移酶的抑制剂和β-葡萄糖苷酶的侣伴
基于DNJ头部基团的多种亚氨基糖已显示针对神经酰胺葡萄糖基转移酶的细胞靶标的令人吃惊的优于已批准的药物ZavescaTM(N-丁基脱氧野尻霉素、NB-DNJ)的改善的功效。这可提供这些亚氨基糖的治疗性应用，通过减少鞘糖脂(GSL)缺失来实现所述治疗性。这可以，例如，减少病毒受体结合，作为抗病毒机制；提供针对糖脂溶酶体贮积紊乱(LSD)(例如戈谢病)宿主的底物减少治疗(图2中所示的SRT)，对于所述紊乱，Zavesca是公认的疗法，以及对于自体免疫疾病系统性红斑狼疮(狼疮)的治疗，所述治疗通过损耗细胞表面处的GSL而实现。在亚微摩尔范围内的许多情况中，这些亚氨基糖也可以是人β-葡糖脑苷脂酶的抑制剂，允许作为第二治疗性机制，作为所述突变酶的侣伴，所述突变酶通常会通过内质网相关性蛋白降解通路降解。
GSL的溶酶体降解由糖苷酶催化，并且人类中观察到其中缺乏溶酶体酶活性的多种遗传性疾病，归因于编码溶酶体酶的基因中的突变，导致GSL在溶酶体中的贮积(Butters等，2000a；Vellodi，2005，对于这些和其它引用，参见下方参考文献部分)。40多种溶酶体贮积症中超过10种归因于鞘酯类降解缺陷，例如戈谢、法布瑞氏症、泰-萨二氏病、山霍夫氏病、GM1神经节苷脂贮积病。(Futerman和van Meer，2004；Meikle等，1999)SRT是对于LSD的药理介入，并且是酶替换治疗(ERT)的替代方式(Lachmann，2010)。SRT的治疗性策略是通过部分生物合成抑制来减少GSL底物流入。这是抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶(CGT)的结果，从而允许溶酶体中突变的分解代谢酶清扫贮积负担，最终导致清除。
有效抑制的化学性质可通过体外试验和细胞研究来确定(Butters等，2000b；Platt等，1994a；Platt等，1994b)。细胞研究可提供关于功效的最大指示，因为其允许通过考量细胞毒性和保持力以及酶在细胞中作用的细胞有效性来说明化合物抑制潜力。因此，本研究通过细胞试验证明如下所述的多种亚氨基糖对于CGT的改善的功效。
当溶酶体中可能缺乏酶活性时，侣伴介导的治疗可以是一项策略，其依赖抑制剂作为稳定剂，因为某些新合成的携带突变的蛋白质是不稳定的，并且倾向于错误折叠。认为这些结构缺陷型蛋白质能通过内质网中的质量控制系统来检测，并且随后转向降解的细胞通路。针对这些溶酶体酶中的一些的竞争性抑制剂可以低于抑制浓度，可作为'侣伴(chaperone)'行使功能，并援救突变的蛋白质，导致其在溶酶体中水解活性的重建(Fan，2003)。
亚氨基糖与突变的酶在非抑制水平的相互作用可在通过质量控制系统降解之前在ER中发生，并且允许保持水解活性的突变的酶运输至溶酶体，其中与大量贮积的ER腔酶底物不同，并且联合低pH环境，导致小分子抑制剂的解离和溶酶体酶活性的增加。
相较于酶替代治疗，采用小分子抑制剂/侣伴可具有如下一种或多种似乎合理的优势：易于口服给予，缺乏免疫原性，和能够穿过血脑屏障递送；以及由此而来的治疗神经变性临床变体的潜力。
通过抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶，细胞表面GSL水平的降低还可在SLE的治疗中具有治疗性作用。SLE是自体免疫疾病，其特征在于遍布的炎症，自身抗体生成，和免疫复合物沉积。SLE影响体内的几乎每个器官系统。尚未知晓SLE的潜在成因，但认为B和T细胞中的异常引起自身耐受的缺失，自身抗体生成，以及免疫复合物在肾和其它靶标组织中的沉积。这些异常的特征为，细胞膜脂质性质的变化，包括Gb3的增加(可能归因于调节狼疮T细胞活化的转录因子FLI1的表达，和通过鞘糖脂代谢的调节的IL-4生成，特别是通过控制早期疾病过程中神经醇胺酶(Neu1)表达和/或NEU活性来介导分解通路)，其能够增加活化(Richard等，2013)。此外，淋巴细胞细胞膜中GSL累积的增加能增加氧化应激以及反应性氧物质的形成是影响响应的两个因素，并且引起SLE患者中心血管风险的增加(Nandagudi等，2013)。
显示下述化合物(参见图3和12)具有针对鞘糖脂生物合成通路酶(神经酰胺葡糖基转移酶，CGT)和/或作为β-葡糖脑苷脂酶的抑制剂(和后续的侣伴)的改善的功效。已批准的药物Zavesca(NB-DNJ/UV-1)作为阳性对照。
方法：
细胞培养。
HL60细胞和戈谢淋巴母细胞(N370S)在分别补充有10％或15％(v/v)胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL盘尼西林和100mg/mL链霉素的RPMI1640培养基中于37℃和5％CO2条件下培养。
糖脂生物合成的抑制
为了在基于细胞的试验中测定对神经酰胺葡萄糖基转移酶活性的抑制，HL60细胞在不同浓度(0–100mM)的化合物的存在下培养3天，直至融合。细胞经收获并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，然后重悬于水中，并进行杜恩斯均质化。取该均质物的一等份用于蛋白质试验。剩余物制成4:8:3(v/v/v)氯仿:甲醇:水以按文献所述提取糖脂(Neville等,2004)。提取的糖脂采用包含1mg/mL牛磺脱氧胆酸钠的20mL的50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的神经酰胺聚糖酶制备物(从欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)内部纯化)在37℃经水解过夜。糖脂源性的寡糖用水制成30mL，并如下所述用邻氨基苯甲酸(2-AA)标记。带标记的寡糖通过NP-HPLC分析，如下所述。
碳水化合物荧光标记
弗里恩(freen)寡糖(FOS)和糖脂源性的寡糖用邻氨基苯甲酸标记，如前描述(Neville等，2004)。简言之，将邻氨基苯甲酸(30mg mL-1)溶解于甲醇中的三水乙酸钠(4％，w/v)和硼酸(2％w/v)溶液。将该溶液添加至氰基硼氢化钠(终浓度45mg mL-1)，并混合以得到最终的标记混合物。将2-AA标记混合物(80mL)添加至FOS样品(30mL水)或糖脂源性的寡糖，然后在80℃孵育1小时。允许该反应冷却至室温，添加1mL乙腈/水(97:3，v/v)，并涡旋该混合物。标记的寡糖利用色谱通过Speed Amide 2柱(美国阿伦敦的应用分离公司(AppliedSeparations))纯化。该柱用2x 1mL乙腈，2x 1mL水，随后为2x 1mL乙腈预平衡。利用重力流加载样品并允许其通过该柱。该柱用2x 1mL乙腈/水(95:5，v/v)洗涤，而带标记的寡糖用2x0.75mL水洗脱。
通过正相高效液相色谱法(NP-HPLC)进行碳水化合物分析
糖脂源性的寡糖通过NP-HPLC分离，采用4.6x 250mM TSKgel Amide-80柱(英国西格玛公司)，根据先前公开的方法进行。所述色谱系统由Waters Alliance 2695分离模块和Exλ360nm和Emλ425nm的同轴Waters 474荧光检测器装置组成。所有色谱均在30℃下进行。溶剂A为乙腈。溶剂B为Milli-Q水。溶剂C由100mM氢氧化铵组成，在Milli-Q水中用乙酸滴定至pH 3.85，并采用标准5.0N氢氧化铵溶液(英国西格玛公司)制备。梯度条件如下：时间＝0分钟(t＝0)，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝6，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝6，71.6％A，8.4％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝40，52％A，28％B，20％C(0.8mL分钟-1)；t＝41，23％A，57％B,20％C(1.0mL分钟-1)；t＝43,23％A,57％B,20％C(1.0mL分钟-1)；t＝44，71.6％A，8.4％B，20％C(1.2mL分钟-1)；t＝59，71.6％A，8.4％B，20％C(1.2mL分钟-1)；t＝60，71.6％A，8.4％B 20％C(0.8mL分钟-1)。样品(<50mL)在水/乙腈(1:1，v/v)中注射。
对于GSL分析，测量响应抑制剂治疗的对应于单唾液酸化-神经节苷脂GM3的峰面积，以产生抑制常数。
β-葡糖脑苷脂酶抑制试验
人胎盘β-葡糖脑苷脂酶按照如下文献所述的步骤分离并纯化，Furbish等，Proc.Nat.Acad.Sci.(1977)74(8)3560-3。在37℃下在50ml的包含0.25％牛磺胆酸钠、0.1％TX100的0.1M柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 5.2)中的5mM 4-甲基伞形基-β-葡萄糖苷(4-MU-b-葡萄糖苷)中检测酶活性15–60分钟。通过添加200ml 0.5M碳酸钠停止该反应，并在激发波长350nm，发射波长460nm下检测荧光。利用0.5mM底物浓度产生胎盘β-葡糖脑苷脂酶(4-MU-β-葡萄糖苷的Km，1.9±0.3mM)的抑制常数(IC50)。测定以三个重复进行。采用HillSlope制图(Prizm软件)拟合数据，并对各IC50值确定对称标准误。
β-葡糖脑苷脂酶活化试验
戈谢淋巴母细胞(N370S)在不同浓度的抑制剂(0-50μM)的存在下培养3天，然后检测β-葡糖脑苷脂酶活性。细胞在磷酸盐缓冲盐水中清洗两次，采用小杜恩斯匀浆器在水中均质化，以800g离心5分钟，并取上清液用于蛋白质和β-葡糖脑苷脂酶活性。蛋白质浓度采用BCA试验(英国皮尔斯公司(Pierce))按照生产商的说明测定。全部酶活化检测均采用如上所述的包含0.25％牛磺胆酸钠、0.1％TX100的0.1M柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 5.2)中的5mM 4-甲基伞形基-β-葡萄糖苷和等份的均质物进行。向一些酶活性测定中添加溴代牛弥菜醇(500μM-2.5mM)以确认通过β-葡糖脑苷脂酶的特异性底物水解。酶活化定义为相较于未处理的细胞，处理的细胞中酶活性(U/mg蛋白质)的倍数增加。
结果：
神经酰胺葡萄糖基转移酶抑制
为评估神经酰胺葡萄糖基转移酶的(鞘糖脂的生物合成中的关键酶)的细胞抑制，化合物以对于HL60细胞而言非毒性的浓度下给予，持续3天。在脂质提取，寡糖头部基团的酶促释放和荧光标记之后，采用正相HPLC(NP-HPLC)来分析对生物合成的抑制作用。HL60细胞具有简单的糖脂组成成分，并且主要物质是单唾液酸化的神经节苷脂，GM3。亚氨基糖对神经酰胺葡萄糖基转移酶的抑制导致GM3减少，其在HPLC分离(图4)后检测到。表1显示神经酰胺葡萄糖基转移酶细胞试验数据。采用希尔图计算IC50值，例如图5中所示那些。
表1：神经酰胺葡萄糖基转移酶细胞试验数据
导致HL60细胞中神经酰胺葡萄糖基转移酶活性的50％抑制的亚氨基糖UV1-5、UV6.2和UV 6.8浓度，与NB-DNJ(UV1)做比较。
表1中的数据清楚显示在一些情况中，提高了100倍的活性。该数据是重要的，因为尽管体外数据给出了该试验关于活性的良好指示，但允许考量化合物的接触和保持的任何细胞差异。归因于接触的任何差异性可能受限于随机接触亚氨基糖的CGT细胞位置。亚氨基糖可快速而有效地穿过质膜，从而化合物在细胞中的浓度与胞外浓度平衡。N-烷基化的DNJ类似物可快速进入细胞，其中它们能与神经酰胺葡萄糖基转移酶在高尔基体顺面网状结构的胞质侧直接相互作用。
β-葡糖脑苷脂酶抑制
全部在研的化合物显示相较于NB-DNJ，对人胎盘β-葡糖脑苷脂酶的提高的抑制功效，者通过荧光生成试验，采用4-甲基伞形基-β-葡萄糖苷(表2)来确定。采用希尔图计算表2中的IC50值，例如图6中所示那些。
表2：人胎盘β-葡糖脑苷脂酶的体外数据
导致β-葡糖脑苷脂酶活性的50％抑制的亚氨基糖UV1-5、UV6.2、UV6.4、UV6.5和UV6.8的浓度，与NB-DNJ(UV1)做比较
表2中的体外数据显示在研化合物具有令人吃惊的高于UV1(Zavesca)的β-葡糖脑苷脂酶抑制活性。这些数据表明，在研化合物可作为竞争性抑制剂，并且能够结合至ER中的突变的酶，并使所述蛋白质稳定，以至于能够保护其不被降解。
对于侣伴β-葡糖脑苷脂酶的能力
这组化合物在具有最常见的N370S突变的突变戈谢淋巴母细胞中的侣伴活性报告于表3。这些数据相较于未处理的细胞而言，β-葡糖脑苷脂酶活性的倍增。完全剂量响应关系示于图7。
表3：戈谢成纤维细胞中β-葡糖脑苷脂酶的增强水平
相较于UV1，在研的亚氨基糖再次显示出惊人的功效增强。就潜在的治疗而言，2倍的增加是显著的，所述化合物还使溶酶体中的SRT具有提高的活性，这能够改善/清除与所述疾病相关联的任何GSL贮积问题。
概述
相较于Zavesca(UV1)，在研的亚氨基糖已显示针对细胞靶标具有惊人的高功效。神经酰胺葡萄糖基转移酶是上述多种疾病中的治疗性靶标，所述疾病例如溶酶体贮积疾病(LSD)、系统性红斑狼疮(SLE))，但具体而言是对于LSD(包括戈谢病)的治疗。治疗戈谢病的第二作用机制(次于上述底物减少治疗)是采用小分子对戈谢病的侣伴-介导的治疗，所述小分子促进突变的β-葡糖脑苷脂酶的正确折叠。该第二机制可以仅有效于患有戈谢病的患者，其归因于错误折叠的突变N370S，因为已显示亚氨基糖促进β-葡糖脑苷脂酶的该特定突变形式的正确折叠。已记载GBA基因中的超过300种突变，阿什肯纳兹犹太人中五种最常见的突变中的三种—N370S、84GG和V394L(Fares等，2008)。每20个阿什肯纳兹犹太人中约有一个携带N370S突变的拷贝。每334个中约有一个携带84GG突变拷贝。发现V394L突变是每1,112个阿什肯纳兹犹太人中约有一个携带。N370S仅与1型戈谢病相关联，其通常缺乏神经学上的症状(Elstein等，2001)。由于N370S突变可受侣伴治疗的影响，可见本发明的化合物能够在N370S变体的I型戈谢病中具有双重作用机制，其部分由底物减少(对神经酰胺葡萄糖基转移酶的抑制)介导，且部分由侣伴效应(促进β-葡糖脑苷脂酶的折叠)介导。该突变允许突变的酶的侣伴介导的折叠，保护其不被ER中的ERAD转运子清除，并且进一步允许纠正该正确折叠的酶运输至溶酶体，其正确的目标细胞器。这两个靶标酶(β-葡糖脑苷脂酶和CGT)的细胞位置也可能是重要的，因为发现CGT在高尔基体的胞质面，这可以清楚地接触亚氨基糖，而ER(其中发生侣伴效应)对亚氨基糖的接触可能弱得多。然而，由于可能需要低于抑制水平的化合物水平来产生侣伴效应，该性质可以是本发明化合物的有利特征。
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实施例3
Huh7.5细胞培养(图14)：Huh7.5细胞生长于附加有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1x MEM和10％FBS的DMEM中。所有孵育都在37℃/5％CO2下进行。在亚氨基糖存在或不存在的情况下，孵育4天之后，测定亚氨基糖处理对细胞中细胞脂质特征的作用，此时采用胰蛋白酶/EDTA收取细胞，在冷PBS中清洗3次，采用台盼蓝染色计数，并将最终的细胞团块重悬于甲醇:丙酮(体积1:1)，然后进行脂质特征分析，采用小体积的各样品进行总蛋白评价，所述评价利用布拉福德蛋白试验(生物辐射实验室股份有限公司(Bio-Rad))进行。
GlcCer和LacCer(图14)的检测：
葡糖基神经酰胺(由‘醣基神经酰胺’的测量检测并推断，因为MS方法不区分葡糖基和半乳糖基部分)，并且进行乳糖神经酰胺(LacCer)的明确检测，作为细胞脂质的全面脂类分析的部分，如下所述。该方法已与先前详细描述(Wolf,C.,Quinn,P.J.,脂类：实践方面与应用(Lipidomics:Practical aspects and applications).Progress in LipidResearch 2008,47,15-36:Quinn,P.J.,Rainteau,D.,Wolf,C.,人类疾病诊断中的红细胞脂类(Lipidomics of the red cell in diagnosis of human disorders).Methods MolBiol 2009,579,127-159)。利用Bligh和Dyer的方法采用氯仿提取培养的肝癌Huh7.5细胞的团块(BligH、E.G.，Dyer，W.J.，总脂质提取与纯化的快速方法(A Rapid Method ofTotal Lipid Extraction and Purification)Canadian Journal of Biochemistry andPhysiology 1959，37，911-917)。氯仿提取物在聚乙烯醇官能化的二氧化硅柱(PVASil，YMC，ID 4mm，长度250mm，英特奇姆公司(Interchim)，蒙特吕松03100，法国)上通过HPLC(Agilent 1200系列)，以分离出不同的脂质类别。较少的极性脂质(甘油三酯、甘油二酯、胆固醇酯、神经酰胺、葡糖神经酰胺和乳糖神经酰胺)在5-15分钟之间通过溶剂系统己烷/异丙醇/水乙酸铵10mM(40/58/2v/v)洗脱。随后通过溶剂己烷/异丙醇/水乙酸铵10mM(40/50/10v/v)洗脱磷脂，其以以下顺序在15-60分钟时以极性递增的函数形式洗脱：磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱。洗脱的脂质传输至波谱仪的电喷射界面(图波离子公司(TurboIon)，弗雷明汉，马萨诸塞州01701，美国)。以正模式进行脂质离子化以检测M+NH4 +和M+H+。将源与以“碰撞诱导解离”模式(或“前体”模式)运行的三重四极质谱仪(API3000，ABSciex公司，加拿大多伦多)偶联以监测连续洗脱的脂质类别的特征性片段离子。在制备用于培养的肝癌细胞的文库中鉴定特征碎片离子的前体分子物质，采用软件LIMSA(Haimi，P.,Chaithanya，K.，Kainu，V.，Hermansson，M.，Somerharju，P.，用于MS-MS和LC-MS脂类数据分析的仪器独立软件工具(Instrument-independent software tools for the analysis of MS-MS and LC-MSlipidomics data)，Methods in molecular biology(新泽西克里夫顿)2009,580)。在鉴定脂质的分子种类时，制备离子对(前体/产物离子)的列表以通过多反应监测(MRM)来定量。相应的MEM峰是时间积分的。相对于适当脂质类型标准品计算脂质含量，假定该类别中所有分子物质的应答常数相等。
使用软件(2011.2版；插件软件公司(Addinsoft)，法国)进行比较特征概况的统计分析。进行参数检验、多变量分析、相关性检验和回归分析，详细请见(Golmard，J.L.，2012，Analyse Statistique des Donnees，Ellipses编，法国巴黎75740Cedex 15)。
***
虽然前文描述了具体优选的实施方式，应理解本发明不限于此。本领域技术人员应理解，可对公开的实施方式进行多种修改且这类修改旨在包含在本发明的范围内。
说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利都通过全文引用纳入本文。

Claims (42)

1.一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素或其药学上可接受的盐。
2.一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中R是：
R1是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；
X1-5独立地选自H、NO2、N3或NH2；
Y不存在或者是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团；且
Z选自键或NH，
限制条件是当Z是键时，Y不存在，并且
限制条件是当Z是NH时，Y是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，R1是取代或未取代的丁基、戊基、己基、庚基，或辛基基团。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，Z是NH。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，X1-5中至少一个选自NO2、N3或NH2。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，式I化合物具有式IA化合物的结构：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
R1是–(CH2)5-；
W1-4是H；
X1是NO2；
X3是N3；
X2，X4和X5是H；
Y是–(CH2)-；且
Z是NH。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
R1是-(CH2)5-；
W1-4是H；
X1和X3是NO2；
X2、X4和X5是H；
Y是–(CH2)-；且
Z是NH。
9.一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐：
其中R是：
R’是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且
X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于R’是具有1-12个碳原子的未取代或取代的烷基基团。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于R’是被1-3个氧原子取代的烷基基团。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于R’是(CH2)n-O-(CH2)m，其中n是5-8且m是0-4。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于R’是氨基取代的烷基基团。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，R’是(CH2)p-NH-(CH2)q，其中p是5-8且q是0-2。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于X1-5中至少一个是卤素或卤代的烷基。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于式II化合物具有式IIa：
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，R选自
18.一种抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的下式化合物
或其药学上可接受的盐。
19.如权利要求1-2、9和18中任一项所述的方法，其特征在于，对于所述对象患有的疾病或病症来说，抑制神经酰胺葡萄糖基转移酶和/或降低糖脂浓度是有益的，其中所述给予导致对所述疾病或病症的治疗。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是戈谢病、法布瑞氏症、山霍夫氏病、泰-萨二氏病、GMI神经节苷脂沉积病、C型尼曼-皮克病、2型糖尿病、与糖尿病性肾病相关联的肥大或增生、血液葡萄糖水平升高、糖化血红蛋白水平升高、肾小球疾病或狼疮。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是I型、II型或III型戈谢病。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述给予导致β-葡糖脑苷脂酶活性的侣伴效应。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是系统性红斑狼疮。
24.如权利要求1-2、9和18中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是人类。
25.一种抑制具有生成糖脂的能力的细胞中的糖脂生物合成的方法，所述方法包括使所述细胞经受糖脂抑制有效量的N-(9-甲氧基壬基)脱氧野尻霉素或其药学上可接受的盐。
26.一种抑制具有生成糖脂的能力的细胞中的糖脂生物合成的方法，所述方法包括使所述细胞经受糖脂抑制有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中R是：
R1是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；
X1-5独立地选自H、NO2、N3或NH2；
Y不存在或者是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团；且
Z选自键或NH，
限制条件是当Z是键时，Y不存在，并且
限制条件是当Z是NH时，Y是除羰基以外的取代或未取代的C1-烷基基团。
27.一种抑制具有生成糖脂的能力的细胞中的糖脂生物合成的方法，所述方法包括使所述细胞经受糖脂抑制有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐：
其中R是：
R’是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且
X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述经受于体外进行。
29.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖脂包含基于糖基化神经酰胺的鞘糖脂。
30.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖脂包含GM3。
31.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是人细胞。
32.一种通式I的化合物：
其中R是：
R’是取代或未取代的烷基基团；
W1-4独立地选自氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的卤代烷基基团、取代或未取代的烷酰基基团、取代或未取代的芳酰基基团，或者取代或未取代的卤代烷酰基基团；并且
X1-5独立地选自H、NO2、卤素、烷基，或卤代的烷基。
33.如权利要求32所述的化合物，其特征在于R’是具有1-12个碳原子的未取代或取代的烷基基团。
34.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，R’是被1-3个氧原子取代的烷基基团。
35.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，R’是(CH2)n-O-(CH2)m，其中n是5-8且m是0-4。
36.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，R’是氨基取代的烷基基团。
37.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，R’是(CH2)p-NH-(CH2)q，其中p是5-8且q是0-2。
38.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，X1-5中至少一个是卤素或卤代的烷基。
39.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，X3和X5中至少一个是卤素、NO2或卤代的烷基，并且X1、X2和X4是氢。
40.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，X3和X5中至少一个是F或Cl。
41.如权利要求32所述的化合物，其具有式IIa：
42.如权利要求32所述的化合物，其特征在于，R选自：
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