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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Glykosyltransferase-Inhibitoren.
Verbindungen, die Glykosyltransferasen inhibieren, sowie Verfahren
zu deren Identifizierung werden bereitgestellt. Es werden auch Verfahren
zur Inhibierung von Glykosyltransferasen und Verfahren zur Modulation
biologischer Prozesse, die eine Glykosylierung umfassen, bereitgestellt.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Kohlenhydrate
sind im Tier- und Pflanzenreich allgegenwärtig. Es ist bekannt, dass
diese Strukturen in vielen biologischen Prozessen zahlreiche wichtige
Rollen spielen. Kohlenhydrate sind beispielsweise an der interzellulären Erkennung
in Säugetierzellen
beteiligt. In Pilzen und Pflanzen stellen Kohlenhydrate eine wichtige
Strukturkomponente in Zellwänden
dar. Kohlenhydrate werden typischerweise von Enzymen synthetisiert, wie
z. B. Glykosyltransferasen, bei denen es sich um eine Gruppe von
Enzymen handelt, die ein Monosaccharid von einem aktivierten Zuckernucleotid
zu Akzeptoroligosacchariden transferieren, die auf Glykoproteinen, Glykolipiden
oder Polysacchariden zu finden sind. Aufgrund der Bedeutung der
Glykosylierung in biologischen Systemen ist es höchst wünschenswert, wirksame Inhibitoren
für Glykosyltransferasen
und andere Enzyme zu entwickeln, die am Kohlenhydratstoffwechsel
beteiligt sind. Während
in den letzten Jahren der Entwicklung von Glykosyltransferase-Inhibitoren
immer mehr Aufmerksamkeit geschenkt wurde, wurde bisher noch über keine Glykosyltransferase-Inhibitoren
berichtet, die die für
eine therapeutische Verbindung erwünschten Eigenschaften aufweisen.
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Der
Großteil
der Arbeit in Zusammenhang mit Glykosyltransferasen konzentrierte
sich bisher auf hydrophile Analoga der Donor- und Akzeptorsubstrate
dieser Enzyme (Hashimoto et al., J. Org. Chem. 62, 1914–1915 (1997);
Hashimoto et al., J. Synth. Org. Ch. Japan 55, 325–333 (1997);
Muller et al., Angewandte Chemie – International Edition 37,
2893–2897
(1998); Amann et al., Chemistry – A European Journal 4, 1106–1115 (1998);
Murray et al., Biochemistry 36, 823–831 (1997); Kim et al., J.
Am. Chem. Soc. 121, 5829–5830
(1999), Schmidt et al., Bioorg. Med. Chem. 3, 1747–1750 (1993);
Miura et al., Bioorg. Med. Chem. 6, 1481–1489 (1998), und Palcic et
al., J. Biol. Chem. 264, 17174–17181
(1989)). Die besten Inhibitoren liegen im Allgemeinen im μM-Bereich,
aber für
eine Sialyltransferase wurden Inhibitoren mit bis zu 14 nM erhalten (Muller
et al., s. o.). Typischerweise sind die Inhibitoren negativ geladen,
weshalb es unwahrscheinlich ist, dass sie oral verfügbar sind,
es sei denn, eine geeignete Prodrugform wird identifiziert.
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Die
meisten Inhibitoren auf Akzeptorsubstrat-Basis sind synthetische
Di- oder Trisaccharidakzeptoren, die an das Enzym binden, wobei
die Hydroxylgruppe, zu der der Transfer gewöhnlicherweise erfolgt, entfernt (Desoxy-)
oder substituiert (z. B. durch eine Aminogruppe) wird. Kajihara
et al., Carbohydr. Res. 247, 179–193 (1993); Stults et al.,
Glycobiology 9, 661–668
(1999); Lu et al., Bioorg. Med. Chem. 4, 2011–2022 (1996); Lowary et al.,
Carbohydr. Res. 251, 33–67
(1994); Khan et al., J. Biol. Chem. 268, 2468–2473 (1993). Im Allgemeinen
liegen die Ki-Werte der Inhibitoren im Bereich des Km-Werts des
Akzeptorsubstrats, das sie ersetzen. Es wurde jedoch auch über Ki-Werte
in einer Größenordnung
von 10 μM
für eine α-Galactosyltransferase
(Lowary et al., s. o.) und für
N-Acetylglucosaminyltransferase V (Khan et al., s. o.) berichtet.
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Es
wird nicht erwartet, dass die Klasse der Inhibitoren auf Oligosaccharid-Basis
nach dem Stand der Technik Zellmembranen überwindet, und diese werden
als mangelhafte Kandidaten für
ein Therapeutikum erachtet. Verschiedene Gruppen haben jedoch gezeigt,
dass Disaccharid-Akzeptorsubstrate, die auf geeignete Weise mit
hydrophoben Aglykonen und/oder Acetylestern modifiziert wurden,
leicht in Zellen eindringen und das Golgi-Kompartiment erreichen.
Die terminale Glykosylierung von Glykoproteinen an der Zelloberfläche kann
demnach aufgrund der kompetitiven Glykosylierung der Disaccharidsubstrate,
die dann sekretiert werden, inhibiert werden (Neville et al., Biochem.
J. 307, 791–797
(1995); Kuan et al., J. Biol. Chem. 264, 19271–19277 (1989); Sarkar et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3323–3327 (1995); Sarkar et al.,
J. Biol. Chem. 272, 25608–25616
(1997)).
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Es
wurde gezeigt, dass es sich bei weiteren Verbindungen, wie z. B.
N-Butyldesoxynojirimycin (NB-DNJ) und N-Butyldesoxygalactonojirimycin
(NB-DGNJ), um Hemmer von Glucosylceramidsynthetase handelt. N-Butyldesoxynojirimycin
ist besser als Glucosidase-Inhibitor bekannt, aber es wurde festgestellt, dass
es das Enzym inhibiert, das die Synthese von Glucosylceramiden durch
das Binden von Glucose an Ceramid initiiert (Platt et al., J. Biol.
Chem. 269, 8362–8365
(1994), und Platt et al., J. Biol. Chem. 269, 27108–27114 (1994)).
Es wurde gezeigt, dass NB-DNJ die Glykolipid-Synthese in Mäusen reduziert
(Platt et al., J. Biol. Chem. 272, 19365–19372 (1997); Jeyakumar et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6388–6393 (1999), und Andersson
et al., Biochem. Pharmacol. 59, 821–829 (2000)). Ähnliche
Inhibitoren wurden für
Fucosyltransferasen aufgezeigt, z. B. L. Qiao et al., JACS 118,
S. 7653–7662
(1996).
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Basierend
auf den obenstehend beschriebenen Erkenntnissen ist klar, dass Verbindungen,
die die Aktivität
bestimmter Glykosyltransferasen spezifisch modulieren, nützlich sein
können,
um die Anzahl der biologischen Prozesse zu steuern. Aus diesem Grund
besteht ein Bedarf an hochwirksamen Glykosyltransferase-Inhibitoren.
Die vorliegende Erfindung wird diesem und anderen Bedürfnissen
gerecht.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
der Glykosyltransferase-Aktivität
bereit, die vorzugsweise auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen
dem Kohlenhydratabschnitt der Enzymsubstrate, oder -produkte, und
der Glykosyltransferase basieren. Die durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung identifizierten Inhibitoren können eingesetzt werden, um
die Aktivität
von Glykosyltransferasen zu inhibieren, die an der Synthese von
Kohlenhydraten in Zusammenhang mit verschiedenen biologischen Prozessen
beteiligt sind. Es werden Verfahren offenbart, d. h. verschiedene
Screening-Tests zur Identifizierung geeigneter Kandidaten.
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Es
werden therapeutische und weitere Anwendungen für diese Verbindungen bereitgestellt.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten
Inhibitoren können
beispielsweise zur Steuerung der Glykosyltransferase-Aktivität in vitro
eingesetzt werden. Die Inhibitoren können beispielsweise eingesetzt
werden, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Zellkulturen zu inhibieren,
die verwendet werden, um gewünschte Kohlenhydratstrukturen
herzustellen. Die Inhibitoren können
auch in geeigneter Weise zur Herstellung von Tiermodellen für Erkrankungen
eingesetzt werden, indem die gewünschten
Glykosyltransferasen in vivo selektiv inhibiert werden.
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Die
Erfindung stellt insbesondere Verfahren zum Design von Glykosyltransferase-Inhibitoren bereit. Die
Verfahren umfassen die Bereitstellung einer Nichtkohlenhydrat-Testverbindung,
die mit hydrophoben Gruppierungen (z. B. Aminosäureresten) an der aktiven Stelle
der Glykosyltransferase in Wechselwirkung tritt. Die Testverbindung
wird mit der Glykosyltransferase unter Bedingungen kontaktiert,
die geeignet sind, damit die Glykosyltransferase ein Monosaccharid
von einem Donorsubstrat zu einem Akzeptorsubstrat transferiert. Darauf
folgt eine quantitative Detektion des glykosylierten Produkts zur
Bestimmung des Ausmaßes
der Senkung der Aktivität
des Enzyms in Gegenwart der Testverbindung.
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Gewöhnlicherweise
umfasst die Verbindung eine Ringstruktur, die die Pyranoseringe
des Akzeptorsubstrats, des Donorsubstrats oder des Reaktionsprodukts
imitiert. Typischerweise handelt es sich bei dem Ring um eine planare
Ringstruktur. Die Testverbindung kann beispielsweise einen aromatischen
Ring, einen heteroaromatischen Ring oder eine aliphatische Ringstruktur
aufweisen.
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Eine
beliebige Anzahl an Glykosyltransferasen aus eukaryotischen (z.
B. Säugetieren,
Insekten, Pflanzen oder Pilzen) oder prokaryotischen (z. B. Bakterien)
Organismen kann in den Tests eingesetzt werden. Beispielsweise können Fucosyltransferasen
(z. B. FTVII, FTIV oder FTIII), Sialyltransferasen (ST6Gal1 oder ST3Gal1)
und Galactosyltransferasen (z. B. α(1,3)Gal T) eingesetzt werden.
Die Glykosyltransferase kann in dem Test in Abhängigkeit von dem Testformat
in einer Reihe verschiedener Formen vorhanden sein. Das Enzym kann
beispielsweise in einer transgenen Zelle exprimiert werden, oder
es kann in einer normalen Zelle konstitutiv exprimiert werden.
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In
den Tests ist das Mittel, durch welches Mittel das Produkt detektiert
wird, nicht wesentlich, und die Wahl des Mittels hängt vom
Testformat ab. Eines der Enzymsubstrate kann beispielsweise markiert
sein (z. B. durch radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen
und dergleichen), und das markierte Produkt wird detektiert. Alternativ
dazu kann das Produkt unter Einsatz eines Antikörpers detektiert werden, der
spezifisch mit dem Produkt immunreaktiv ist. Bevorzugte Testformate
umfassen Hochdurchsatztests, die auf einem ELISA-Format basieren,
radioaktive Säulentests
und Zelltests.
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Die
in den Tests eingesetzten Testverbindungen sind, wie oben angemerkt,
typischerweise so gestaltet, dass sie mit hydrophoben Resten an
der aktiven Stelle der Zielglykosyltransferase in Wechselwirkung
treten. Vorzugsweise werden Verbindungen oder Analoga davon mit
zu diesem Zweck geeigneten Strukturen eingesetzt. Idealerweise weisen
die Verbindungen einen IC50-Wert im nM-Bereich auf, wenn sie in
den hierin beschriebenen Tests getestet werden. Demnach weisen die
Inhibitoren gewöhnlicherweise
einen IC50 von weniger als etwa 100 μM, gewöhnlicherweise von weniger als
etwa 10 μM
und oft von weniger als 100 nM, auf.
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Definitionen
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Die
Bezeichnung Zucker bezieht sich, wie hierin verwendet, auf eine
Kohlenhydratverbindung, die eine oder mehrere Saccharid-Einheiten
und gewöhnlicherweise
ein Aldehyd- oder Ketonderivat eines mehrwertigen Alkohols, insbesondere
von fünf- und sechswertigen
Alkoholen, umfasst. Für
eine Beschreibung der Saccharidstruktur und deren Nomenklatur siehe
Varki et al. (Hrsg.), Essentials of Glycobiology, Kapitel 2, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1999). Beispiele für Zucker
und deren gewöhnlicherweise
verwendete Abkürzungen
lauten wie folgt:
- Ara
- = Arabinose
- Fru
- = Fructose
- Fuc
- = Fucose
- Gal
- = Galactose
- GalNAc
- = N-Acetylgalactosamin
- Glc
- = Glucose
- GlcNAc
- = N-Acetylglucosamin
- Man
- = Mannose
- NeuAc
- = N-Acetylneuraminsäure
- Sia
- = Sialsäure
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Weitere
Beispiele für
Zucker umfassen Glucosamin, Galactosamin, Rhamnose, Ribose, Glucuronsäure, N-Acetylmuraminsäure, Xylose.
Die Bezeichnung umfasst auch verschiedene Zuckerderivate, wie z.
B. Desoxyderivate, Anhydrouronsäuren,
Chlorderivate, Fluorderivate und Aminozucker (z. B. N-Butyldesoxynojirimycin).
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Es
wird angenommen, dass Oligosaccharide ein reduzierendes Ende und
ein nicht reduzierendes Ende aufweisen, unabhängig davon, ob das Saccharid
an dem reduzierenden Ende tatsächlich
ein reduzierender Zucker ist. Gemäß der gültigen Nomenklatur werden Oligosaccharide
hierin mit dem nicht reduzierenden Ende auf der linken und dem reduzierenden
Ende auf der rechten Seite dargestellt.
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Alle
hierin beschriebenen Oligosaccharide werden mit dem Namen oder der
Abkürzung
für das
nicht reduzierende Saccharid (z. B. Gal) gefolgt von der Anordnung
der Glykosidbindung (α oder β), der Ringbindung,
der Ringposition des an der Bindung beteiligten reduzierenden Saccharids
und dem Namen oder der Abkürzung
des reduzierenden Saccharids (z. B. GlcNAc) beschrieben. Die Bindung
zwischen zwei Zuckern kann beispielsweise als 2,3, 2→3 oder (2,3)
ausgedrückt
werden. Bei allen Sacchariden handelt es sich um Pyranosen.
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In
der Beschreibung von chemischen Verbindungen werden die Bezeichnungen
im Allgemeinen gemäß ihrer
Standardbedeutung verwendet. Die Bezeichnung "Alkyl" bezieht sich, wie hierin verwendet,
auf einen verzweigten oder unverzweigten, gesättigten oder ungesättigten,
einwertigen oder zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen, umfassend Niederalkyle mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen,
wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Butyl, n-Hexyl und dergleichen,
Cycloalkyle (3–7
Kohlenstoffatome), Cycloalkylmethyle (4–8 Kohlenstoffatome) und Arylalkyle.
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Die
Bezeichnung "Alkoxy" bezieht sich auf
Alkylreste, die durch ein Sauerstoffatom an den Rest des Moleküls gebunden
sind, z. B. Ethoxy, Methoxy oder n-Propoxy.
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Die
Bezeichnung "Acyl" bezieht sich auf
einen Rest, der von einer organischen Säure durch die Entfernung der
Hydroxylgruppe abgeleitet wird. Beispiele umfassen Acetyl, Propionyl,
Oleoyl, Myristoyl.
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Die
Bezeichnung "Aryl" bezieht sich auf
einen aromatischen einwertigen carbozyklischen Rest mit einem einzigen
Ring (z. B. Phenyl) oder kondensierten Mehrfachringen (z. B. Naphthyl),
die gegebenenfalls unabhängig
voneinander mit Alkyl, Niederalkyl, Cycloalkyl, Hydroxyniederalkyl,
Aminoniederalkyl, Hydroxyl, Thiol, Amino, Halogen, Nitro, Niederalkylthio,
Niederalkoxy, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Acyl, Hydroxycarbonyl,
Niederalkoxycarbonyl, Hydroxysulfonyl, Niederalkoxysulfonyl, Niederalkylsulfonyl,
Niederalkylsulfinyl, Trifluormethyl, Cyano, Tetrazoyl, Carbamoyl,
Niederalkylcarbamoyl und Diniederalkylcarbamoyl mono-, di- oder
tri-substituiert sein können.
Alternativ dazu können
zwei benachbarte Positionen des aromatischen Rings mit einer Methylendioxy-
oder Ethylendioxygruppe substituiert sein.
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Die
Bezeichnung "Heteroaryl" bezieht sich, wie
hierin verwendet, auf aromatische Ringe, in denen ein oder mehrere
Kohlenstoffatome des aromatischen Rings/der aromatischen Ringe durch
ein Heteroatom, wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel,
substituiert sind. Heteroaryl bezieht sich auf Strukturen, bei denen es
sich um einen einzelnen aromatischen Ring, einen aromatischen Mehrfachring/aromatische
Mehrfachringe oder einen oder mehrere an einen oder mehrere nicht-aromatische
Ringe gebundene aromatische Ringe handeln kann. In Strukturen mit
Mehrfachringen können
die Ringe kondensiert, kovalent gebunden oder an eine gemeinsame Gruppe,
wie z. B. eine Methylen- oder Ethylengruppierung, gebunden sein.
Die gemeinsame Linkergruppe kann auch ein Carbonyl sein, wie z.
B. in Phenylpyridylketon. Wie hierin verwendet sind Ringe, wie z.
B. Thiophen, Pyridin, Isoxazol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, Furan
etc., oder benzokondensierte Analoga dieser Ringe durch die Bezeichnung "Heteroaryl" definiert. Geeigneterweise
werden Verbindungen oder Analoga davon mit für diesen Zweck geeigneten Strukturen
eingesetzt.
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Beispiele
für geeignete
Klassen von Verbindungen, die Heteroaryl-Ringstrukturen aufweisen,
umfassen Chinoline, Arylsulfonamide, Phenothiazine, Carbazole, Benzamide
und Benzopyranone, sind aber nicht auf diese beschränkt.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die Wechselwirkung der hydrophoben
Oberfläche
eines Akzeptorsubstrats mit hydrophoben Resten an der aktiven Stelle
einer Glykosyltransferase:
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1A zeigt
die Wechselwirkung zwischen einem Monosaccharid und der aktiven
Stelle einer Glykosyltransferase;
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1B zeigt
die Wechselwirkung zwischen einem Oligosaccharid und der aktiven
Stelle einer Glykosyltransferase;
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1C zeigt
ein an eine Glykosyltransferase gebundenes Disaccharid;
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1D zeigt
das Inhibitor-Designkonzept der vorliegenden Erfindung;
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1E zeigt
Inhibitor-Glykosyltransferase-Wechselwirkungen.
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2 zeigt
die Schritte in einem erfindungsgemäßen Test des ELISA-Formats.
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3 zeigt
die Schritte in einem erfindungsgemäßen radioaktiven Säulentest.
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4 zeigt
die Schritte in einem erfindungsgemäß zellbasierten Test.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Glykosyltransferase-Inhibitoren
bereit. Glykosyltransferasen katalysieren den Transfer eines Monosaccharids
von einem Zuckernucleotid, dem Donorsubstrat, zu einem Akzeptorsubstrat.
Bei dem Akzeptorsubstrat kann es sich im Wesentlichen um eine beliebige
andere Gruppe handeln, die in der Lage ist, einen Glykosylrest,
umfassend, aber nicht ausschließlich,
Glykosylreste, Polypeptide und Lipide, zu akzeptieren. Die Wahl
des geeigneten Substrats hängt
typischerweise von der Spezifizität der Transferase ab. Für allgemeine
Informationen siehe Beyer et al., Adv. in Enzym. 52, 24 (1981).
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Die
Strukturen derzeit bekannter Glykosyltransferase-Inhibitoren basieren
hauptsächlich
auf hydrophilen Strukturmotiven, die in dem Donorsubstrat zu finden
sind (d. h. Hydroxylgruppen-Anordnungen). Im Gegensatz dazu basieren
die Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert
werden sollen, auf hydrophoben Strukturmotiven, die in dem Kohlenhydratabschnitt
des Akzeptor- oder Donorsubstrats für die Enzyme und auch in den
Produkten der enzymatischen Reaktion zu finden sind (siehe z. B.
Bourne et al., Current Opinion in Structural Biology 3, 681–686 (1993),
und Gabius et al., Pharm. Res. 15, 23–30 (1998)). Die identifizierten
Inhibitoren und Testverfahren der vorliegenden Erfindung nutzen
demnach die hydrophoben Wechselwirkungen, die in der Erkennung des
Akzeptorsubstrats durch die Glykosyltransferase eine Rolle spielen. In
der Folge weisen die Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung
identifiziert werden sollen, vorzugsweise hydrophobe Eigenschaften
auf und sind Nichtkohlenhydrat-Verbindungen, die mit hydrophoben
Aminosäuren
an der aktiven Stelle des Zielenzyms in Wechselwirkung treten und
mit dem Akzeptorsubstrat, dem Donorsubstrat oder dem Produkt konkurrieren.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen,
dass hydrophobe Reste an der aktiven Stelle signifikant zur Erkennung
des natürlichen
Akzeptorsubstrats oder des Produkts der enzymatischen Reaktion beitragen.
Insbesondere treten sperrige aromatische Reste (z. B. Tyr, Trp und
Phe) oder aliphatische Reste (z. B. Leu, Ile und Val) mit der hydrophoben
Oberfläche der
Zucker in dem Akzeptorsubstrat oder dem Produkt in Wechselwirkung
(siehe 1).
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Die
Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden
sollen, basieren zumindest teilweise auf der Erkenntnis, dass Zucker
mit der aktiven Stelle von Glykosyltransferasen durch hydrophobe Wechselwirkungen
in Wechselwirkung treten (siehe z. B. 1C). Wie
in 1C dargestellt weisen Zucker, basierend auf der
Ausrichtung der Hydroxylgruppen, typischerweise ein hydrophobes
Strukturmotiv auf, das mit hydrophoben Aminosäureresten in dem Protein in
Wechselwirkung tritt. Die Inhibitoren imitieren die hydrophobe Wechselwirkung
oder die Struktur der Zuckersubstrate.
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Diese
Nichtkohlenhydrat-Inhibitoren werden somit aufgrund ihrer Fähigkeit
ausgewählt,
jene Abschnitte des Akzeptor- oder Donorsubstrats und/oder des enzymatischen
Produkts zu imitieren, die mit den hydrophoben Resten an der aktiven
Stelle in Wechselwirkung treten. Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Offenbarung
können
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung viele verschiedene potentielle
Glykosyltransferase-Inhibitoren entwickeln und testen. Typischerweise
werden die Inhibitoren aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, die
Struktur und die Anordnung der Pyranoseringe eines oder mehrerer
Zucker in dem Donor- oder Akzeptorsubstrat zu imitieren. Wenn das
Akzeptorsubstrat beispielsweise mehr als einen Zucker enthält, kann der
Inhibitor so entwickelt werden, dass er die räumliche Ausrichtung zwischen
den Zuckern in dem Substrat oder dem Produkt imitiert.
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Da
diese Inhibitoren auf hydrophoben Wechselwirkungen mit dem Enzym
basieren, kann die Gestaltung der Inhibitoren durch die Vorhersage
der relativen Hydrophobie von Kandidatenverbindungen erleichtert werden.
Mittel zur Bestimmung der Hydrophobie von Verbindungen sind bekannt.
Typischerweise wird die Hydrophobie durch die Hansch-Konstante ausgedrückt. Die
Hansch-Konstante ist ein Maß dafür, wie sehr
ein gelöster
Stoff zu hydrophoben Wechselwirkungen in der Lage ist, basierend
auf dem Verteilungskoeffizienten P für die Verteilung des gelösten Stoffs
zwischen Octanol und Wasser. Am allgemeinsten wird P als logP angewandt.
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Selektivität und/oder
eine gesteigerte Affinität
der Inhibitoren in Bezug auf bestimmte Glykosyltransferasen kann
durch die Zugabe von Substituenten, die die Hydrophobie der Testverbindung
beeinflussen, zu einer Kernstruktur erreicht werden. Das Verhalten
verschiedener Substituenten kann durch eine Substituentenkonstante π quantifiziert
werden. In Abhängigkeit
von der als Referenz herangezogenen Kernstruktur gibt es verschiedene
Skalen für π. Tabellen,
die π-Konstanten
für Substituenten
anführen,
sind verfügbar
(siehe z. B. Hansch und Leo, "Substituent
Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology", Wiley, New York (1979);
Hansch et al., J. Med. Chem. 20, 304 (1977); Hansch et al., J. Med.
Chem. 16, 1207 (1973)). Unter Einsatz dieser Information kann die
relative Hydrophobie verschiedener Substitutionen ermittelt werden
und zur Entwicklung von Inhibitoren herangezogen werden.
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Inhibitoren,
die durch die Erfindung identifiziert werden sollen, umfassen typischerweise
eine oder mehrere hydrophobe Gruppen. Gewöhnlicherweise umfassen die
Verbindungen aromatische, heteroaromatische, aromatische Mehrfachring-
oder aliphatische Ringstrukturen oder eine hydrophobe Gruppe, die
mit den hydrophoben Resten an der aktiven Stelle in Wechselwirkung
tritt. Basierend auf den oben beschriebenen hydrophoben Wechselwirkungen
und den oben beschriebenen Substituentenkonstanten können Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung eine Reihe von Testverbindungen identifizieren
oder synthetisieren, die diese Kriterien erfüllen. Um Inhibitoren zu identifizieren,
können
die Testverbindungen auf geeignete Weise in Standardtests gescreent
werden, um ihre Fähigkeit
zur Inhibierung der Aktivität
des ausgewählten
Enzyms zu bestimmen.
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Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung erkennen, dass die Inhibitoren weiter
modifiziert werden können,
um verschiedene hydrophile oder geladene Gruppen zu umfassen, um
ihre Potenz zu optimieren. Diese Gruppierungen können beispielsweise eingesetzt
werden, um die Avidität,
Löslichkeit,
Bioverfügbarkeit
oder andere Aspekte der Pharmakodynamik der Verbindungen zu optimieren.
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Die
Inhibitoren können
zur Inhibierung der Aktivität
von an der Synthese von Kohlenhydraten beteiligten Enzymen eines
beliebigen Organismus eingesetzt werden. Geeignete Pilz-, Bakterien-,
Insekten- und Pflanzenenzyme umfassen Chitinsynthase, Saccharosesynthase,
Invertase und andere Enzyme, die im Kohlenhydratstoffwechsel und
in der Kohlenhydratbiosynthese eine Rolle spielen. Veranschaulichende
biosynthetische Wege umfassen die Zellwandbiosynthese, die Polysaccharidbiosynthese
und die Lipopolysaccharidbiosynthese (siehe beispielsweise Alberts
et al. (Hrsg.), Molecular Biology of the Cell (2. Aufl.), Garland
Publishing, Inc., London (1989); Dey et al. (Hrsg.), Plant Biochemistry,
Academic Press, San Diego (1997)).
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In
Säugetieren
und anderen Organismen sind Glykosyltransferasen basierend auf der
Art des transferierten Zuckerrests in Familien gruppiert. Enzyme,
die Sialsäure
transferieren, werden beispielsweise als Sialyltransferasen bezeichnet,
jene, die Fucose transferieren, als Fucosyltransferasen und jene,
die Galactose transferieren, als Galactosyltransferasen. In jeder
Familie gibt es typischerweise 10–15 verschiedene Enzyme, die
erforderlich sind, um verschiedene Kohlenhydratstrukturen, die auf
Glykoproteinen und Glykolipiden tierischer Zellen vorhanden sind,
zu entwickeln. Jedes Enzym stellt in Abhängigkeit von den Donor- und
Akzeptorsubstraten, die es verwendet, und der bei der Transferreaktion
gebildeten anomerischen Bindung eine definierte Struktur her.
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Eine
Reihe von Fucosyltransferasen sind Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Kurz gesagt umfassen Fucosyltransferasen ein
beliebiges der Enzyme, die L-Fucose von GDP-Fucose zu einer Hydroxyposition
eines Akzeptorzuckers transferieren. In manchen Ausführungsform
handelt es sich bei dem Akzeptorzucker beispielsweise um GlcNAc
in einer Galβ(1→3,4)GlcNAc-Gruppe
in einem Oligosaccharidglykosid. Geeignete Fucosyltransferasen für diese
Reaktion umfassen die bekannte Galβ(1→3,4)GlcNAcα(1→3,4)-Fucosyltransferase (FucT-III
E. C. Nr. 2.4.1.65), die aus menschlicher Milch erhalten wird (siehe
z. B. Palcic et al., Carbohydrate Res. 190, 1–11 (1989); Prieels et al.,
J. Biol. Chem. 256, 10456–10463
(1981), und Nunez et al., Can. J. Chem. 59, 2086–2095 (1981)), sowie die βGal(1→4)βGlcNAcα(1→3)-Fucosyltransferasen
(FucT-IV, FucT-V, FucT-VI und FucT-VII, E. C. Nr. 2.4.1.65), die
in menschlichem Serum zu finden sind. Eine rekombinante Form von βGal(1→3,4)βGlcNAcα(1→3,4)-Fucosyltransferase
ist ebenfalls verfügbar
(siehe Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1, 425–428 (1991), und Kukowska-Latallo
et al., Genes and Development 4, 1288–1303 (1990)). Weitere Beispiele
für Fucosyltransferasen
umfassen α1,2-Fucosyltransferase
(E. C. Nr. 2.4.1.69). Eine α1,3-Fucosyltransferase
IX (Nucleotidsequenzen von menschlicher und Maus-FucT-IX) sind in Kaneko
et al., FEBS Lett. 452, 237–242
(1999), und die chromosomale Lokalisierung des menschlichen Gens ist
in Kaneko et al., Cytogenet. Cell Genet. 86, 329–330 (1999), beschrieben. α1,3-Fucosyltransferasen, über die
kürzlich
berichtet wurde und die ein N-gebundenes GlcNAc als Akzeptor nutzen,
von der Schnecke Lymnaea stagnalis und von der Mungobohne werden
in van Tetering et al., FEBS Lett. 461, 311–314 (1999), bzw. Leiter et
al., J. Biol. Chem. 274, 21830–21839
(1999), beschrieben. Zusätzlich
dazu gibt es bakterielle Fucosyltransferasen, wie z. B. die α(1,3/4)-Fucosyltransferase
von Helicobacter pylori, wie in Rasko et al., J. Biol. Chem. 275,
4988–4994
(2000), beschrieben, sowie die α1,2-Fucosyltransferase
von H. pylori (Wang et al., Microbiology 145, 3245–3253 (1999)).
Siehe auch E. Staudacher, Trends in Glycoscience and Glycotechnology 8,
391–408
(1996), für
die Beschreibung von für
die Erfindung nützlichen
Fucosyltransferasen.
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Beispiele
für Galactosyltransferasen
umfassen α1,3-Galactosyltransferasen
(E. C. Nr. 2.4.1.151, siehe z. B. Dabkowski et al., Transplant.
Proc. 25, 2921 (1993), und Yamamoto et al., Nature 345, 229–233 (1990), Rind
(GenBank j04989), Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264, 14290–14297 (1989),
Maus (GenBank m26925), Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86, 8227–8231
(1989), Schwein (GenBank L36152), Strahan et al., Immunogenetics
41, 101–105
(1995)). Eine weitere α1,3-Galactosyltransferase
ist an der Synthese des Antigens der Blutgruppe B (EC 2.4.1.37)
beteiligt, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265, 1146–1151 (1990) (menschlich).
Weitere umfassen α1,4-Galactosyltransferasen,
zu denen beispielsweise EC 2.4.1.90 (LacNAc-Synthetase) und EC 2.4.1.22 (Lactosesynthetase)
(Rind (D'Agostaro
et al., Eur. J. Biochem. 183, 211–217 (1989)), menschlich (Masri
et al., J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 657–663 (1988)),
Maus (Nakazawa et al., J. Biochem. 104, 165–168 (1988))) sowie EC 2.4.1.38
und die Ceramidgalactosyltransferase (EC 2.4.1.45, Stahl et al.,
J. Neurosci. Res. 38, 234–242
(1994)) gehören.
Weitere geeignete Galacto syltransferasen umfassen beispielsweise α1,2-Galactosyltransferasen
(beispielsweise von Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol.
Biol. Cell 5, 519–528
(1994)).
-
Menschliche
Serin/Threonin-gebundene Oligosaccharide (O-Glykane) werden gewöhnlicherweise
mit der Golgi-Enzymkern-2-β-1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase
(C2 GlcNAcT) synthetisiert. Es wird angenommen, dass Kern-2-O-Glykane
wesentlich für
die Mucin-Produktion und die Selectin-Ligandenbiosynthese ist. Mäuse, denen
C2 GlcNAcT fehlt, wiesen einen eingeschränkten Phänotyp mit Neutrophilie und
einen teilweisen Selectin-Liganden-Mangel auf. Studien deuten darauf
hin, dass die Kern-2-Oligosaccharid-Biosynthese die physiologischen
Rollen der Selectine segregiert, und zeigen eine Funktion von C2
GlcNAcT bei der Myeloid-Homöostase
und bei Entzündungen
auf. Ellies et al., Immunity 9, 881–890 (1998),
WO 99/27465 .
-
Sialyltransferasen
umfassen ST3Gal III, ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal
II, ST6GalNac I, ST6GalNAc II und ST6GalNAc III (die hierin verwendete
Sialylstransferasen-Nomenklatur ist in Tsuji et al., Glycobiology
6, v-xiv (1996), beschrieben). Eine beispielhafte α2,3-Sialystransferase
(EC 2.4.99.6) transferiert Sialsäure
zu der nicht reduzierenden terminalen Gal von Galβ1-4GlcNAc-Disacchrid
oder -Glykosid. Siehe Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256,
3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257, 13845 (1982),
und Wen et al., J. Biol. Chem. 267, 21011 (1992). Eine weitere beispielhafte α2,3-Sialyltransferase
(EC 2.4.99.4) transferiert Sialsäure
zu der nicht reduzierenden terminalen Gal eines Galβ1→3GalNAc-Disaccharids oder
-Glykosids. Siehe Rearick et al., J. Biol. Chem. 254, 4444 (1979),
und Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267, 12004 (1992). Weitere
beispielhafte Enzyme umfassen Gal-β-1,4-GlcNAc-α-2,6-Sialyltransferase (siehe
Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219, 375–381 (1994)).
-
Einige
Immunantworten werden teilweise durch 2,6-Sialylgalactoside und
2,3-Sialylgalactoside vermittelt. Diese Sialylgalactoside sind Liganden
für Zelloberflächenmoleküle, die
an der interzellulären
Haftung und Signalübertragung
beteiligt sind, wie z. B. CD22. Die 2,6-Sialylgalactoside sind typischerweise
an der Modulation von durch B-Zellen vermittelten Immunantworten
beteiligt, während
die 2,3-Sialylgalactoside im Allgemeinen an durch T-Zellen vermittelten
Immunantworten beteiligt sind (siehe z. B.
WO 98/54365 ).
-
Weitere
Glykosyltransferasen umfassen beispielsweise Glucosyltransferasen,
z. B. Alg8 (Stagljov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5977
(1994)) oder Alg5 (Heesen et al., Eur. J. Biochem. 224, 71 (1994)), N-Acetylgalactosaminyltransferasen,
wie z. B. β(1,3)-N-Acetylgalactosaminyltransferase, β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferasen
(
US-Patent Nr. 5.691.180 ;
Nagata et al., J. Biol. Chem. 267, 12082–12089 (1992), und Smith et
al., J. Biol. Chem. 269, 15162 (1994)), und Polypeptid-N-Acetylgalactosaminyltransferase
(Homa et al., J. Biol. Chem. 268, 12609 (1993)). Geeignete N-Acetylglucosaminyltransferasen
umfassen GnTI (2.4.1.101, Hull et al., BBRC 176, 608 (1991)), GnTII
und GnTIII (Ihara et al., J. Biochem. 113, 692 (1993)), GnTV (Shoreiban
et al., J. Biol. Chem. 268, 15381 (1993)), O-gebundene N-Acetylglucosaminyltransferase (Bierhuizen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9326 (1992)), N-Acetylglucosamin-1-phosphattransferase (Rajput
et al., Biochem. J. 285, 985 (1992)) und Hyaluronansynthase.
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Enzyme,
die an der Proteoglykan-Synthese beteiligt sind, beispielsweise
N-Acetylgalactosaminyltransferase I (EC 2.4.1.174), sowie Enzyme,
die an der Chondroitinsulfatsynthese beteiligt sind, wie z. B. N-Acetylgalactosaminyltransferase
II (EC 2.4.1.175), sind ebenfalls von Interesse. Geeignete Mannosyltransferasen
umfassen α(1,2)-Mannosyltransferase, α(1,3)-Mannosyltransferase, β(1,4)-Mannosyltransferase, Dol-P-Man-Synthase,
OCh1 und Pmt1. Xylosyltransferasen umfassen beispielsweise Proteinxylosyltransferase
(EC 2.4.2.26).
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Derzeit
bevorzugte Inhibitoren wirken auf aus FTIII, FTVII, α(1,3)-Galactosyltransferase,
ST6Gal I, ST3Gal I, GlcNAc-Transferase, α(1,3)-Gal-Transferase und UDP-MurNAc-Transferase,
UDPGlcNAc:MurNAc-Transferase ausgewählte Enzyme.
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Glykosyltransferase-Inhibitoren, die durch
die vorliegende Erfindung identifiziert werden können
-
Wie
obenstehend angemerkt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren
zur Inhibierung von Glykosyltransferasen bereit. Die Verfahren umfassen
das Kontaktieren einer Glykosyltransferase mit einem Inhibitor, der
ein hydrophobes Strukturmotiv eines Zuckers imitiert, das durch
die Glykosyltransferase (z. B. in einem Akzeptor- oder Donorsubstrat)
erkannt wird, wodurch die Glykosyltransferase inhibiert wird. In
einem bevorzugten Aspekt handelt es sich bei dem Inhibitor um eine
hydrophobe Nichtkohlenhydrat-Verbindung, die mit den hydrophoben
Aminosäureresten
der aktiven Stelle der Glykosyltransferase in Wechselwirkung tritt.
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Die
Inhibitoren umfassen gewöhnlicherweise
eine carbozyklische (aliphatische oder aromatische) Ringstruktur.
Typischerweise umfassen die Inhibitoren eine Aryl- oder Heteroaryl-Gruppierung,
die die hydrophobe Struktur oder Oberfläche des Zuckers imitiert. Typischerweise
weisen die Ringe der Inhibitoren eine ähnliche Größe auf wie die Ringstruktur
des Zuckersubstrats. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Inhibitoren
eine Heteroaryl-Gruppe, wie z. B., aber nicht ausschließlich, Chinoline,
Phenylsulfonamide, Phenothiazine, Carbazole, Benzamide und Benzopyranone
oder Derivate davon. Weitere bevorzugte Heteroaryl-Gruppierungen
umfassen Carbazole und Phenothiazine oder Derivate davon. Weitere
Inhibitoren umfassen Heteroaryl-Gruppierungen,
wie z. B. Thiophen, Pyridine, Isoxazole, Phthalimide, Pyrazole,
Indole und Furane oder Derivate davon.
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Eine
Reihe von Heteroaryl-Derivaten sind Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Diese Gruppen umfassen beispielsweise Derivate
von 2-Azanaphthalenyl, Benzoxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl,
3-Pyrazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, Pyrazinyl, 2-Oxazolyl,
4-Oxazolyl, 2-Phenyl-4-oxazolyl, 5-Oxazolyl, 3-Isoxazolyl, 4-Isocazolyl, 5-Isoxazolyl,
2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl, 5-Thiazolyl, 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl,
2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-Pyrimidyl, 4-Pyrimidyl, 5-Benzothiazolyl, Purinyl,
2-Benzimidazolyl, 5-Indolyl, 1-Isochinolyl, 5-Isochinolyl, 2-Chinoxalinyl, 5-Chinoxalinyl,
3-Chinolyl, 6-Chinolyl, Thiobenzoxazolyl, Thiobenzothi azolyl und
Thiobenzimidazolyl. Die Heteroaryl-Gruppe kann kovalent an andere funktionelle
Gruppen gebunden sein, um ein hydrophobes Strukturmotiv zu bilden,
das das Akzeptorsubstrat imitiert.
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Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass die Heteroaryl-Derivate
der vorliegenden Erfindung unter Einsatz komplementärer funktioneller
Gruppen hergestellt werden können.
Die Reaktion dieser beiden funktionellen Gruppen, eine an der Heteroaryl-Gruppe
und die andere an dem Derivat, stellt die gewünschte Bindung bereit. Die
Heteroaryl-Gruppe kann beispielsweise eine Amin-funktionelle Gruppe
aufweisen, und bei der funktionellen Gruppe an dem Derivat kann
es sich um eine aktivierte Carboxylgruppe handeln, wie z. B. ein
Acylchlorid oder einen NHS-Ester. Das Umsetzen von zwei komplementären funktionellen
Gruppen miteinander führt
zur Bildung einer Amidbindung zwischen der Heteroaryl-Gruppe und
dem Derivat. Durch die geeignete Wahl der reaktiven Gruppen kann
die gewünschte
Bindung des Heteroaryl-Derivats erzielt werden.
-
In
bestimmten Aspekten werden Inhibitoren aufgrund ihres logP-Werts
ausgewählt.
Der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient für Inhibitoren kann empirisch
bestimmt oder unter Einsatz von Software-Programmen, die Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, vorhergesagt werden.
In einem Aspekt wird Software von Advance Chemistry Development
(ACD) eingesetzt. Das ACD-Programm berechnet beispielsweise einen
genauen logP (Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient) in ±0,3-logP-Einheiten (siehe www.acdlabs.com).
In einem bevorzugten Aspekt liegen der logP des natürlichen
Akzeptorsubstrats der Glykosyltransferase und der Inhibitor-Verbindung in Bezug
aufeinander innerhalb von 3 Einheiten und weisen vorzugsweise einen
Abstand von etwa 1 Einheit bis etwa 2 Einheiten.
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Im
Allgemeinen umfasst die Enzym-Inhibierung die Wechselwirkung einer
Substanz mit einem Enzym, um die Geschwindigkeit der durch das Enzym
katalysierten Reaktion zu reduzieren. Inhibitoren können gemäß verschiedener
Kriterien klassifiziert werden. Sie können beispielsweise reversibel
oder irreversibel sein. Ein irreversibler Inhibitor dissoziiert,
wenn überhaupt,
sehr langsam von seinem Zielenzym, da er, ko valent oder nicht kovalent,
sehr fest an das Enzym gebunden wird. An einer reversiblen Inhibierung
ist im Gegensatz dazu ein Enzym-Inhibitor beteiligt, der dissoziieren
kann.
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Inhibitoren
könne auch
danach klassifiziert werden, ob es sich um kompetitive, nicht-kompetitive oder unkompetitive
Inhibitoren handelt. Bei der kompetitiven Inhibierung kinetisch
einfacher Systeme mit einem einzigen Substrat kann das Enzym entweder
an das Substrat oder den Inhibitor binden, aber nicht an beide.
Typischerweise sind kompetitive Inhibitoren dem Substrat oder dem
Produkt/den Produkten ähnlich
und binden an die aktive Stelle des Enzyms, wodurch die Bindung
des Substrats an die aktive Stelle blockiert wird. Ein kompetitiver
Inhibitor senkt die Katalysegeschwindigkeit, indem er die Affinität des Substrats
in Bezug auf das Enzym wirksam reduziert. Typischerweise kann ein
Enzym aufgrund von Gleichgewichtsgründen durch sein eigenes Produkt
kompetitiv inhibiert werden. Da es sich bei dem Enzym um einen Katalysator
handelt, ist es grundsätzlich
in der Lage, eine Reaktion vorwärts
oder rückwärts zu beschleunigen.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform konkurrieren die
Enzym-Inhibitoren mit dem Akzeptorsubstrat.
-
Nichtkompetitive
Inhibitoren ermöglichen,
dass das Enzym an das Substrat bindet, während es gleichzeitig an den
Inhibitor bindet. Ein nichtkompetitiver Inhibitor wirkt durch die
Senkung der Wechselzahl eines Enzyms anstatt durch die Reduzierung
der freien Enzymmenge. Eine weitere mögliche Kategorie der Inhibierung
ist die gemischte oder unkompetitive Inhibierung, bei der der Inhibitor
die Bindungsstelle beeinflusst und somit die Wechselzahl des Enzyms
verändert.
Die Enzym-Inhibierung kinetisch komplexer Systeme mit mehr als einem
Substrat, wie dies bei Glykosyltransferasen der Fall ist, ist in
Segel, Enzyme Kinetics, Wiley, NY (1975), beschrieben.
-
Tests
-
Nachdem
die Verbindungen synthetisiert oder identifiziert wurden, werden
sie in Standardtests getestet, um das Ausmaß der durch jede Verbindung
erzielten Inhibie rung der Aktivität der Ziel-Glykosyltransferase zu
bestimmen. Die Glykosyltransferase-Aktivität und deren Inhibierung werden
typischerweise gemäß Standardverfahren
zur Bestimmung der Enzymaktivität
getestet. Für
eine allgemeine Erläuterung
der Enzymtests siehe Rossomando, "Measurement of Enzyme Activity", in: Deutscher (Hrsg.),
Guide to Protein Purification, Band 182, Methods of Enzymology (1990),
und Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2. Aufl. (1985).
-
Ein
Test in Bezug auf die Glykosyltransferase-Aktivität enthält typischerweise
eine gepufferte Lösung, die
auf den physiologischen pH angepasst ist, eine Quelle zweiwertiger
Kationen, ein Donorsubstrat, ein Akzeptorsubstrat, Glykosyltransferase
und die Testverbindung. Nach einer vorbestimmten Zeit bei 23°C oder 37°C wird die
Reaktion beendet, und das Produkt wird isoliert und gemäß Standardverfahren
quantifiziert. Glykosyltransferase-Tests, bei denen ein UV-markierter
Akzeptor eingesetzt wird, liefern beispielsweise ein UV-markiertes
Produkt, das leicht durch Umkehrphasen-HPLC abgetrennt und mittels
UV-Spektroskopie quantifiziert werden kann, wie in Schaub et al.,
Glycoconjugate J. 15, 345–354
(1998), beschrieben. Siehe auch Kajihara et al., Carbohydr. Res.
264, C1–C5
(1994); J. Org. Chem. 60, 5732–5735
(1995).
-
Um
eine effiziente Identifizierung der Testverbindungen mit inhibierender
Aktivität
zu unterstützen,
sind Testformate zu bevorzugen, die eine rasche Analyse einer großen Anzahl
von Testverbindungen ermöglichen. Beispielsweise
können
Hochdurchsatztests auf Basis des ELISA-Formats eingesetzt werden
(2). In diesen Tests wird eine der Komponenten
des Tests (gewöhnlicherweise
der Akzeptorzucker) auf einer festen Oberfläche (z. B. dem Well einer Mikrotiterplatte)
immobilisiert. Ein Glykoprotein, das den Akzeptorzucker umfasst,
kann auf geeignete Weise eingesetzt werden. Die anderen Komponenten
werden zugesetzt, und das Gemisch wird unter Bedingungen, die für die Synthese
des Endprodukts geeignet sind, inkubiert. Ein markierter Antikörper, der
spezifisch mit dem Produkt reaktiv ist, wird eingesetzt, um das
Vorhandensein des Endprodukts zu detektieren. Zur Quantifizierung
des durch den markierten Antikörper
erzeugten Signals können
Standardmittel eingesetzt werden.
-
Alternativ
dazu können
radioaktive Säulentests
auf geeignete Weise eingesetzt werden (3). Bei diesen
Verfahren ist entweder der Donor- oder der Akzeptorzucker radioaktiv
markiert (z. B. unter Einsatz von 14C oder 3H). Die anderen Komponenten werden zugesetzt
und unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Das Produkt wird dann
aus den nicht umgesetzten Zuckern unter Einsatz einer Säulenchromatographie
isoliert (z. B. anhand von Größe oder
Ladung getrennt). Die Radioaktivität der Fraktionen, die das Produkt
enthalten, wird gemessen, um die Menge des erzeugten Produkts zu
bestimmen.
-
In
manchen Ausführungsformen
werden Tests auf Zellbasis eingesetzt (
4). In diesen
Tests wird eine Zelle, die das Endprodukt nicht natürlich erzeugt,
mit Nucleinsäuren
transfiziert, die für
die gewünschte Glykosyltransferase
kodieren. Die übrigen
Komponenten, die nicht durch die Zelle bereitgestellt werden, werden
zugesetzt, und die Fähigkeit
der Zelle, das Produkt zu erzeugen, wird detektiert, typischerweise
unter Einsatz eines markierten Antikörpers. Mittel zur rekombinanten
Expression der gewünschten
Glykosyltransferasen und zum Detektieren des Vorhandenseins neuer
Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche
sind bekannt (siehe
US-Patente
Nr. 5.324.663 und
5.595.900 ).
-
Testverbindungen,
die gute inhibierende Eigenschaften aufweisen, können in In-vitro-Zelltests oder an Labortieren
weiter in Bezug auf ihre Fähigkeit
zur Inhibierung verschiedener Reaktionen (z. B. Immun- oder Entzündungsreaktionen)
getestet werden. Tests, die zum Testen der Wirkung eines Glykosyltransferase-Inhibitors
auf andere Arten von Immunreaktionen geeignet sind, umfassen beispielsweise
B-Zell-Proliferationstests,
CTL-Aktivierungstests und dergleichen. Solche Tests sind beispielsweise
in Hennet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4504–4509 (1998),
beschrieben. Zusätzlich
dazu können
weitere Untersuchungen durchgeführt
werden, wie z. B. jene, die für
die Analyse des zeitlichen Verlaufs von Arzneimitteln im Körper in
Bezug auf deren Absorption, Verteilungsstoffwechsel und Eliminierung
(ADME) gestaltet sind. Verschiedene Protokolle für solche Untersuchungen sind
bekannt.
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Einsatz von Glykosyltransferase-Inhibitoren
-
Die
Offenbarung stellt auch Verfahren zur Inhibierung der Glykosyltransferase-katalysierten
Synthese eines bestimmten Glykosids durch das Kontaktieren einer
Glykosyltransferase mit einer durch die vorliegende Erfindung identifizierten
Verbindung bereit. Die Verfahren können eingesetzt werden, um
die Aktivität
von Glykosyltransferasen in verschiedenen Zusammenhängen zu
modulieren. Die identifizierten Inhibitoren können beispielsweise zur Steuerung
der Glykosyltransferase-Aktivität
in vitro eingesetzt werden. Die Inhibitoren können beispielsweise eingesetzt
werden, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Zellkulturen zu inhibieren,
die eingesetzt werden, um die gewünschten Kohlenhydratstrukturen
herzustellen. Die Inhibitoren können
durch die selektive Inhibierung gewünschter Glykosyltransferasen
in vivo auch auf geeignete Weise zur Herstellung von Tiermodellen
einer Erkrankung eingesetzt werden.
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Eine
Reihe biologischer Prozesse hängt
vom Vorhandensein oder Fehlen einer bestimmten Kohlenhydratstruktur
ab. Die Verbindungen können
beispielsweise als Antibiotika eingesetzt werden, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Krankheitserregern,
wie z. B. Bakterien, Pilzen oder Hefe, zu inhibieren. Glykosyltransferasen
spielen bei einer Reihe von Erkrankungen bei Menschen eine Rolle.
Bei vielen Erkrankungszuständen
(z. B. Entzündungs-
oder Immunreaktionen) spielt die durch ein bestimmtes Oligosaccharid
umfassende Zelloberflächenrezeptoren
vermittelte interzelluläre
Erkennung eine Rolle. ST6Gal-Sialyltransferase steuert beispielsweise
die Produktion eines N-gebundenen Sialosids, das der Ligand für das Lectin
CD22 ist. Untersuchungen unter Einsatz von transgenen Mäusen, in
denen das Gen, das für
ST6Gal-Sialyltransferase kodiert, ausgeschaltet wurde, deuten darauf
hin, dass die Aktivität
dieses Enzyms und die damit zusammenhängende Produktion des Oligosaccharids
wesentlich für
die Förderung
der Aktivierung von B-Lymphozyten und für die Immunfunktion sind (Hennet
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(8), 4504–4509 (1998)). Weitere Glykosyltransferasen,
wie z. B. FTIII, FTVII, α(1,3)-Galactosyltransferase,
ST6Gal I, ST3Gal I, GlcNAc-Transferase, UDPMurNAc-Transferase, UDPGlcNAc:MurNAc-Transferase,
spielen auf ähnliche
Weise eine Rolle in Erkrankungsprozessen.
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Auf ähnliche
Weise wurde über
verschiedene und spezifische biologische Rollen von fucosylierten Glykanen
berichtet. Die Kohlenhydrat-Liganden für die Lectin-Moleküle, die
als Selectine bezeichnet werden, sind beispielsweise fucosyliert
(A. Etzioni et al., Immunodeficiency 4, 307–308 (1993)). Für die Selectine
kodieren drei Gene, die entweder E-, L- oder P-Selectin erzeugen.
Diese wurden ursprünglich
in Bezug auf ihre bevorzugte Expression auf Endothel (E-Selectin),
Leukozyten (L-Selectin) und Plättchen
(P-Selectin) definiert. Die Selectine binden an spezifische Glykane,
die als Sialyl-Lewis-X bezeichnet werden und auf Glykoproteinen vorhanden
sind, und möglicherweise
an Glykolipide spezifischer Zellen und Gewebeoberflächen. Diese
Struktur erfordert, dass sowohl Fucose als auch Sialsäure am äußeren Ende
in einer bestimmten Bindungsstruktur vorhanden sind. Zusätzlich dazu
hängt die
epitheliale und gastrointestinale Expression von Fucose mit einer Anfälligkeit
für bestimmte
Erkrankungen und Krankheitserreger zusammen, in manchen Fällen im
Zusammenhang mit Zugehörigkeit
zu den Blutgruppen AB0. Es besteht ein geringer, aber signifikanter
Anstieg der Anfälligkeit
für Magenkrebs
bei Individuen mit Blutgruppe A, während jene mit Blutgruppe 0
eine leicht höhere
Inzidenz von Ulcus pepticum aufweisen. Beide Erkrankungen wurden
mit einer Infektion in Zusammenhang gebracht, bei der die Spirochäte Helicobacter
pylori eine Rolle spielt.
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Es
wurde gezeigt, das die Fucosyltransferase-Aktivität im Magenepithel
in der Lage ist, eine Adhäsionsfunktion
für Helicobacter
pylori bereitzustellen. Die Fucosylierung des Magenepithels kann
aus diesem Grund die Adhäsion
und Besiedelung durch diesen Krankheitserreger in Menschen modulieren.
H. pylori besiedelt den Magen zumindest der Hälfte aller untersuchten Menschen.
Eine Unterpopulation der mit H. pylori infizierten Menschen entwickelt
dann in der Folge Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre. Wie
das Bakterium an Wirtszellen bindet, wurde umfassend untersucht.
Zu den möglichen
Adhäsionsrezeptoren,
die an Darmentzündungskrankheiten
beteiligt zu sein scheinen, gehört
das fucosylierte Kohlenhydrat Lewis-b (Ilver et al., Science 279,
373–377
(1998)). Lewis-b (Fucα1,2Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc-R)
ist das Produkt der beiden Fucosyltransferasen FucT-II und FucT-III
(Falk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1515–1519 (1995),
und Guruge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3925–3930 (1998)).
-
Zusätzlich dazu
wurde die Beteiligung spezifischer Kohlenhydrate an der Angiogenese
gezeigt (
WO 98/48817 ).
Demnach kann die Steuerung der Synthese dieser Strukturen eingesetzt
werden, um Angiogenese in Zusammenhang mit Krebs und anderen Erkrankungen
zu behandeln. Auf ähnliche
Weise können
Glykosyltransferase-Inhibitoren als antibakterielle Verbindungen
eingesetzt werden. Es ist beispielsweise bekannt, dass bekannte
antibakterielle Verbindungen, wie z. B. Ramoplanin und Vancomycin,
die an der Kohlenhydratsynthese beteiligten Enzyme inhibieren. Die
Verbindungen können
demnach als therapeutische Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen
beim Menschen, als Antibiotika und Insektizide eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
können
die Verbindungen zur therapeutischen Behandlung von Erkrankungen
eingesetzt werden.
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Die
Zusammensetzungen und Verfahren kommen in Therapie- und Diagnoseanwendungen
zum Einsatz. Die Glykosyltransferase-Inhibitoren, die als Substrat-Analoga
wirken können,
werden beispielsweise für die
In-vitro-Diagnose von Zellen (z. B. Krebszellen) eingesetzt, die
die bestimmte Glykosyltransferase von Interesse exprimieren. Ferner
können
Inhibitoren von α(1,3)-Galactosyltransferasen
eingesetzt werden, um die Abstoßung
von Xenotransplantaten zu verzögern
oder zu verhindern. Die Reaktion der Zellen auf eine biologisch
wirksame Dosis des Mittels kann dann bestimmt werden.
-
Die
Glykosyltransferase-Inhibitor-Verbindungen finden auch therapeutisch
Anwendung, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Zusammenhang mit verschiedenen
Immunreaktionen selektiv zu inhibieren. Die Inhibitoren können beispielsweise
eingesetzt werden, um schädliche
Immunreaktionen in Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen und
Allergien zu hemmen. Die unangemessene Aktivierung des Immunsystems
ist eine Komponente zahlreicher Immunpathologien, wie z. B. von
Autoimmunerkrankungen, Allotransplantatabstoßungen und allergischen Reaktionen.
Beispiele für
Autoimmunerkrankungen umfassen rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose,
Lupus, Sklerodermie und Myasthenia gravis (Goldflam-Krankheit).
Allergische Reaktionen umfassen Allergien auf verschiedene Pollen,
Staubmilben und dergleichen. Zusätzlich
dazu können
fremde Infektionskrankheiten eine Immunpathologie hervorrufen (z.
B. Lyme-Borreliose, Hepatitis, LCMV, poststreptokokkale Endokarditis
oder Glomerulonephritis). Nahrungsmittelallergien, wie z. B. Zöliakie und
Morbus Crohn, sowie andere allergische Erkrankungen wurden mit unangemessenen
Immunreaktionen in Zusammenhang gebracht, oder es wurde vermutet,
dass diese eine Autoimmun-Komponente aufweisen.
-
Weitere
durch die durch die vorliegende Erfindung identifizierten Zusammensetzungen
behandelbare Erkrankungen umfassen z. B. rheumatoide Arthritis,
post-ischämische
Leukozyten-vermittelte Gewebeschäden
(Reperfusionsverletzungen), akute Leukozyten-vermittelte Lungenverletzungen
(z. B. akutes Lungenversagen), septische Schocks und akute und chronische
Entzündungen,
umfassend atopische Ekzeme und Psoriasis. Im Fall einer Reperfusionsverletzung
werden die Blockiermittel idealerweise vor einem chirurgischen Eingriff
am Herzen prophylaktisch eingesetzt, um die Erholung nach der Operation
zu verbessern. Zusätzlich dazu
kann das Metastasieren von Tumoren durch das Inhibieren der Adhäsion von
im Blutkreislauf befindlichen Krebszellen verhindert werden. Beispiele
umfassen Dickdarmkarzinome und Melanome.
-
In
therapeutischen Anwendungen werden die Glykosyltransferase-Inhibitoren
einem Individuum verabreicht, dass bereits an einer unangemessenen
oder unerwünschten
Immunreaktion leidet. Zusammensetzungen, die die Glykosyltransferase-Inhibitoren
enthalten, werden einem Patienten in einer Menge verabreicht, die
ausreicht, um die unerwünschte
Immunreaktion zu unterdrücken
und Symptome und/oder Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise
zu hemmen. Eine Menge, die zur Erreichung dieses Ziels ausreicht,
ist als "therapeutisch
wirksame Dosis" definiert.
Die Menge, die für
diesen Zweck wirksam ist, hängt
z. B. von der Inhibitor-Zusammensetzung, der Art der Verabreichung,
dem Stadium und der Schwere der behandelten Erkrankung, dem Gewicht
und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Urteil
des behandelnden Arztes ab.
-
Es
muss beachtet werden, dass die Zusammensetzungen auch in ernsten
Erkrankungsstadien, d. h. lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen
Situatio nen, eingesetzt werden können.
In solchen Fällen
ist es in Anbetracht der Minimierung von Fremdsubstanzen und der
relativ untoxischen Natur der Inhibitoren möglich und kann es vom behandelnden
Arzt als wünschenswert
empfunden werden, einen deutlichen Überschuss dieser Zusammensetzungen
zu verabreichen.
-
Die
Dosis des Glykosyltransferase-Inhibitors zur Behandlung von Entzündungserkrankungen
hängt z. B.
vom jeweiligen Inhibitor, der Art der Verabreichung, der behandelten
Erkrankung und deren Schwere, der Gesundheit und dem Zustand des
Patienten im Allgemeinen und dem Urteil des behandelnden Arztes
ab.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen dienen zur parenteralen, topischen,
oralen oder lokalen Verabreichung, wie z. B. unter Einsatz eines
Aerosols oder zur transdermalen Verabreichung, zur prophylaktischen
und/oder therapeutischen behandlung. Zur topischen Anwendung werden
typischerweise nicht aufsprühbare
Formen, viskose bis halbfeste oder feste Formen eingesetzt, die
einen Träger
umfassen, der mit der topischen Anwendung verträglich ist, und die eine dynamische
Viskosität
aufweisen, die vorzugsweise höher ist
als die von Wasser. Geeignete Formulierungen umfassen Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen, Cremen, Salben, Pulver, Einreibemittel,
Heilsalben, Aerosole etc., die nach Wunsch sterilisiert oder mit
Hilfsstoffen gemischt sind, z. B. mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren,
Benetzungsmitteln, Puffern oder Salzen zur Beeinflussung des osmotischen
Drucks etc., sind aber nicht auf diese beschränkt.
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Zur
Verabreichung in Form eines Aerosols werden die Verbindungen vorzugsweise
in fein zerkleinerter Form gemeinsam mit einem Tensid und einem
Treibmittel zugeführt.
Typische Anteile von Blockiermitteln betragen 0,1 bis 10 Gew.-%,
vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%. Das Tensid muss selbstverständlich untoxisch
und vorzugsweise in dem Treibmittel löslich sein. Beispiele für solche
Mittel umfassen Ester oder Partialester von Fettsäuren mit
6 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Capron-, Octan-, Laurin-,
Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Elaeostearin- und Ölsäure, mit
einem mehrwertigen aliphatischen Alkohol oder seinem zyklischen
Anhydrid, wie z. B. Ethylenglykol, Glycerin, Erythrit, Arbitol,
Mannit, Sorbit, die von Sorbit stammenden Hexi tanyhdride, und die
Polyoxyethylen- und Polyoxypropylenderivate von diesen Estern. Gemischte
Ester, wie z. B. gemischte oder natürliche Glyceride, können eingesetzt
werden. Das Tensid kann 0,1 bis 20 Gew.-% der Zusammensetzung ausmachen,
vorzugsweise 0,25 bis 5 Gew.-%. Den Rest der Zusammensetzung bildet
gewöhnlicherweise
das Treibmittel. Bei verflüssigten
Treibmitteln handelt es sich typischerweise um Gase bei Umgebungsbedingungen
und werden unter Druck kondensiert. Zu den geeigneten verflüssigten
Treibmitteln gehören
Niederalkane mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Butan und
Propan; und vorzugsweise fluorierte oder fluorchlorierte Alkane.
Gemische der oben angeführten
können
ebenfalls eingesetzt werden. Zur Herstellung des Aerosols wird ein
mit einem geeigneten Ventil ausgestatteter Behälter mit dem geeigneten Treibmittel,
das die fein zerkleinerten Verbindungen und das Tensid enthält, gefüllt. Die
Inhaltsstoffe werden so unter erhöhtem Druck gehalten, bis sie
durch Betätigung
des Ventils freigesetzt werden.
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Die
vorliegende Offenbarung beschreibt auch Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung, die
eine Lösung
des Glykosyltransferase-Inhibitors umfassen, der in einem annehmbaren
Träger,
vorzugsweise einem wässrigen
Träger,
gelöst
oder suspendiert ist. Verschiedene wässrige Träger können eingesetzt werden, z.
B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung und dergleichen. Diese
Zusammensetzungen können durch
herkömmliche,
bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert oder sterilfiltriert
werden. Die resultierenden wässrigen
Lösungen
können
wie sie sind für
die Anwendung verpackt werden oder gefriergetrocknet werden, wobei
das gefriergetrocknete Präparat
vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen
können
pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die zur Anpassung
der physiologischen Bedingungen erforderlich sind, wie z. B. Substanzen
zur Anpassung des pH-Werts und Puffermittel, Mittel zur Anpassung
der Tonizität,
Benetzungsmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat,
Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat,
Triethanolaminoleat etc.
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Die
Konzentration des Glykosyltransferase-Inhibitors, der unter bestimmten
Umständen
zur Bildung eines "Cocktails" zur Steigerung der
Wirksamkeit in den pharmazeu tischen Formulierungen kombiniert werden kann,
kann in einem weiten Bereich variieren, d. h. von weniger als etwa
0,05 Gew.-% über
gewöhnlicherweise von
oder von zumindest etwa 1 Gew.-% bis zu 10 bis 30 Gew.-%, und wird
primär
in Abhängigkeit
von den Flüssigkeitsvolumina,
den Viskositäten
etc. gemäß der speziellen
gewählten
Verabreichungsform ausgewählt.
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Eine
typische pharmazeutische Zusammensetzung für intravenöse Infusionen könnte 250
ml sterile Ringerlösung
und eine Einheitsdosierung, die 2–2.000 mg der Verbindung umfasst,
enthalten. Die eigentlichen Verfahren zur Herstellung von Verbindungen
zur parenteralen Verabreichung sind Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung klar oder bekannt und sind detailliert beispielsweise
in Remington's Pharmaceutical
Sciences (18. Aufl.), Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990),
beschrieben. Für
feste Zusammensetzungen können
herkömmliche
untoxische feste Träger
eingesetzt werden, die beispielsweise die pharmazeutisch annehmbare
Formen von Mannit, Lactose, Stärke,
Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose,
Magnesiumcarbonat und dergleichen umfassen. Zur oralen Verabreichung
wird eine pharmazeutisch annehmbare untoxische Zusammensetzung durch
die Integration eines beliebigen der gewöhnlicherweise eingesetzten
Arzneimittelträger,
wie z. B. die zuvor angeführten
Träger,
und von im Allgemeinen 10–95%,
vorzugsweise 15%, des Wirkstoffs, d. h. eines oder mehrerer Glykosyltransferase-Inhibitoren,
hergestellt.
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Die
Glykosyltransferase-Inhibitoren können auch über Liposomen verabreicht werden,
die dazu dienen, die Konjugate auf ein bestimmtes Gewebe, wie z.
B. Lymphgewebe, zu richten, oder selektiv auf infizierte Zellen
abgezielt werden sowie die Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung
steigern. Liposomen umfassen Emulsionen, Schäume, Mizellen, unlösliche Monolager,
Flüssigkristalle,
Phospholipiddispersionen, lamellenartige Schichten und dergleichen.
In diesen Präparaten
ist das Peptid, das zugeführt
werden soll, als Teil eines Liposoms integriert, allein oder in
Verbindung mit einem Molekül,
das z. B. einen in Lymphzellen vorhandenen Rezeptor bindet, wie
z. B. monoklonale Antikörper,
die an das CD45-Antigen binden, oder in Verbindung mit anderen therapeutischen
oder immunogenen Zusammensetzungen.
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Liposomen,
die mit einem gewünschten
Peptid oder einem Konjugat der vorliegenden Erfindung gefüllt sind,
können
auf die Lymphzellstelle ausgerichtet werden, wo die Liposomen dann
die ausgewählten
Glykosyltransferase-Inhibitor-Zusammensetzungen zuführen. Liposomen
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden aus herkömmlichen
vesikelbildenden Lipiden gebildet, die im Allgemeinen neutrale und
negativ geladene Phospholipide und ein Sterin, wie z. B. Cholesterin,
umfassen. Die Wahl des Lipids wird im Allgemeinen durch die Berücksichtigung
von beispielsweise Liposomengröße, Säurelabilität und Stabilität der Liposomen
im Blutstrom geleitet. Verschiedene Verfahren stehen für die Herstellung
von Liposomen zur Verfügung, wie
z. B. die in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980),
und den
US-Patenten Nr. 4.235.871 ,
4.501.728 und
4.837.028 beschrieben.
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Das
Targeting von Liposomen unter Einsatz verschiedener Targeting-Mittel
ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe z. B.
US-Patente Nr. 4.957.773 und
4.603.044 ). Zum Targeting
von Immunzellen kann ein Ligand, der in das Liposom integriert werden
soll, z. B. Antikörper
oder Fragmente davon enthalten, die für die Zelloberflächedeterminanten
der gewünschten
Immunsystemzellen spezifisch sind. Eine Liposomensuspension, die
ein Peptid oder Konjugat enthält,
kann intravenös,
lokal, topisch etc. in einer Dosis verabreicht werden, die unter
anderem in Abhängigkeit
von der Art der Verabreichung, dem zugeführten Konjugat und dem Stadium
der behandelten Krankheit variiert.
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Die
Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, können zur
prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung verabreicht
werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen
einem Patienten, der bereits an einer Erkrankung, wie oben beschrieben,
leidet, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Symptome
der Erkrankung und deren Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise
zu hemmen. Eine Menge, die angemessen ist, um dies zu erreichen,
ist als "therapeutisch
wirksame Dosis" definiert.
Einheitsdosierungen, die für
diese Verwendung wirksam sind, hängen
von der Schwere der Erkrankung und dem Gewicht und allgemeinen Zustand
des Patienten ab, liegen aber im Allgemeinen im Bereich von etwa
0,5 mg bis etwa 10 g Glykosyltransferase-Inhibitor für einen
Pa tienten mit 70 kg Körpergewicht, gewöhnlicherweise
von etwa 10 mg bis etwa 5 g und vorzugsweise zwischen etwa 2 mg
und etwa 1 g. Die therapeutische Verabreichung kann mit dem ersten
Anzeichen einer Erkrankung oder dem Nachweis einer Erkrankung oder
im Fall einer Immunstörung
kurz nach der Diagnose beginnen. Darauf folgt oft eine wiederholte Verabreichung,
bis die Symptome zumindest deutlich gelindert wurden, wobei die
Verabreichung auch danach noch für
einen gewissen Zeitraum fortgesetzt wird. Auf diese Dosen können in
Abhängigkeit
vom Ansprechen und dem Zustand des Patienten über Wochen bis Monate hinweg
wiederholte Verabreichungen folgen.
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Bei
prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung enthalten, einem Patienten verabreicht,
der anfällig
für eine
bestimmte Erkrankung ist oder bei dem sonst das Risiko besteht,
dass er an dieser erkrankt. Eine solche Menge wird als "prophylaktisch wirksame
Dosis" bezeichnet.
Zur prophylaktischen Anwendung werden die Inhibitor-Verbindungen
Risikogruppen verabreicht. Bei dieser Anwendung hängen die
genauen Mengen wiederum von Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten
ab, liegen aber im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 mg bis etwa
10 g Glykosyltransferase-Inhibitor für einen Patienten mit 70 kg
Körpergewicht,
gewöhnlicherweise
von etwa 10 mg bis etwa 5 g und vorzugsweise zwischen etwa 2 mg
und etwa 1 g.
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Die
einfache oder mehrfache Verabreichung der Zusammensetzungen kann
mit Dosierungsausmaßen
und in einem Muster erfolgen, die durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden.
Die pharmazeutischen Formulierungen sollten in jedem Fall eine Inhibitor-Menge
bereitstellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln.
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Die
Wirkung der Verabreichung von Glykosyltransferase-Inhibitoren kann
durch das Detektieren des Spiegels von Glykosid-Produkten in einer
von einem Patienten gewonnenen Probe überwacht werden. Dies kann
gemäß herkömmlichen
Verfahren zur Detektion gewünschter
Kohlenhydratstrukturen erfolgen. Spezifische Lectine oder Antikörper, die
gegen den Liganden gebildet werden, können eingesetzt werden. Spezielle Lectine
sind bekannt und im Handel erhältlich
(z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.).
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Glykosyltransferasen
selbst, insbesondere die Akzeptor-Bindungsdomäne einer Glykosyltransferase, sind
auch als Bindungsgruppierungen bei diagnostischen Tests der Erfindung
nützlich.
Bei Fehlen einer bestimmten Glykosyltransferase besteht beispielsweise
die Tendenz, dass die Konzentration der Akzeptor-Gruppierungen ansteigt.
Ein ST6Gal-Sialyltransferase-Mangel verursacht beispielsweise einen
dramatischen Anstieg endständiger
Galactose-Reste (d. h. Galβ1,4GlcNAc-)
an B-Zellen. Demnach kann ST6Gal-Sialylstransferase als Detektionsgruppierung
zur Bestimmung eines ST6Gal-Mangels in den Zellen eingesetzt werden. Eine
ST3Gal-Transferase
kann auf ähnliche
Weise als Detektionsgruppierung eingesetzt werden.
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In
typischen Ausführungsformen
werden die Detektionsgruppierungen mit einer detektierbaren Markierung
markiert. Die detektierbaren Markierungen können primäre Markierungen (wobei die
Markierung ein Element umfasst, das direkt detektiert wird oder
das ein direkt detektierbares Element produziert) oder sekundäre Markierungen
sein (wobei die detektierte Markierung an eine primäre Markierung
bindet, wie es bei der immunologischen Markierung üblich ist).
Eine Einführung
in Bezug auf Markierungen, Markierungsverfahren und die Detektion
von Markierungen ist in Polak und Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry
(2. Aufl.), Springer Verlag, NY (1997), und in Haugland, Handbook
of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), einem kombinierten
Handbuch und Katalog, herausgegeben von Molecular Probes, Inc.,
Eugene, Or., zu finden. Primäre
und sekundäre
Markierungen können
nicht detektierte sowie detektierte Elemente umfassen. Nützliche
primäre
und sekundäre
Markierungen in der vorliegenden Erfindung können spektrale Markierungen,
wie z. B. fluoreszierende Farbstoffe (z. B. Fluorescein und Derivate,
wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Oregon GreenTM, Rhodamin und Derivate (z. B. Texas Red,
Tetrarhodiminisothiocyanat (TRITC) etc.), Digoxigenin, Biotin, Phycoerytrhin,
AMCA, CyDyesTM und dergleichen), radioaktive
Markierungen (z. B. 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 33P etc.), Enzyme
(z. B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase etc.), spektrale
kolorimetrische Markierungen, wie z. B. Perlen aus kolloidalem Gold
oder gefärbtem
Glas oder Kunststoff (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex etc.),
umfassen. Die Markierung kann gemäß Verfahren, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind, direkt oder indirekt an eine Komponente
des Detektionstests (z. B. an das Detektionsreagens) gebunden werden.
Wie oben angedeutet können
viele verschiedene Markierungen eingesetzt werden, wobei die Wahl
der Markierung von der erforderlichen Empfindlichkeit, von der Einfachheit
der Konjugation mit der Verbindung, den Stabilitätsanforderungen, den verfügbaren Geräten und
den Entsorgungsbestimmungen abhängt.
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Bevorzugte
Markierungen umfassen jene, die 1) Chemilumineszenz (unter Einsatz
von Meerrettichperoxidase oder Luciferase mit Substraten, die Photonen
als Zerfallsprodukte wie oben beschrieben erzeugen) unter Einsatz
von Sets z. B. von Molecular Probes, Amersham, Boehringer-Mannheim
und Life Technologies/Gibco BRL; 2) Farberzeugung (unter Einsatz
von Meerrettichperoxidase und/oder alkalischer Phosphatase mit Substraten,
die einen farbigen Niederschlag erzeugen [Sets von Life Technologies/Gibco
BRL und Boehringer Mannheim erhältlich]);
3) Hemifluoreszenz z. B. unter Einsatz von alkalischer Phosphatase
und dem Substrat AttoPhos [Amersham] oder anderen Substraten, die
fluoreszierende Produkte erzeugen; 4) Fluoreszenz (z. B. unter Einsatz
von Cy-5 [Amersham], Fluorescein und anderen fluoreszierenden Markierungen);
5) Radioaktivität
nutzen. Weitere Verfahren zur Markierung und Detektion sind für Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich.
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Bevorzugte
Enzyme, die an erfindungsgemäße Detektionsreagenzien
konjugiert werden können,
umfassen z. B. Luciferase und Meerrettichperoxidase. Das chemilumineszierende
Substrat für
Luciferase ist Luciferin. Ausführungsformen
von Substraten für
alkalische Phosphatase umfassen p-Nitrophenylphosphat (pNPP), das
mit einem Spektralphotometer detektiert wird; 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT)
und Echtrot/Naphthol-AS-TR-phosphat, die visuell detektiert werden;
und 4-Methoxy-4-(3-phosphonophenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan], das mittels eines Luminometers
detektiert wird. Ausführungsformen
eines Meerrettichperoxidase-Substrats umfassen 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS),
5-Aminosalicylsäure
(5AS), o-Dianisidin und o-Phenylendiamin (OPD), die mit einem Spektralphotometer
detektiert werden; und 3,3,5,5'-Tetramethylbenzidin
(TMB), 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB), 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) und 4-Chlor-1-naphthol (4C1N),
die visuell detektiert werden. Weitere geeignete Substrate sind
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
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Im
Allgemeinen wird ein Detektor, der eine bestimmte Markierung überwacht,
eingesetzt, um die Markierung zu detektieren. Typische Detektoren
umfassen Spektralphotometer, Photozellen und Photodioden, Mikroskope,
Szintillationszähler,
Kameras, Filme und dergleichen sowie Kombinationen von diesen. Beispiele
für geeignete
Detektoren sind verbreitet von verschiedenen kommerziellen Quellen
erhältlich,
die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Herkömmlicherweise
wird ein optisches Bild eines Substrats, das gebundene Markierungsgruppierungen
umfasst, für
folgende Computeranalysen digitalisiert.
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Die
Wirksamkeit des Behandlungsschemas wird durch eine deutliche Reduktion
von Glykosid-Produkten in einer von einem Patienten erhaltenen Probe
angezeigt. Alternativ dazu können
Verfahren zur Detektion des Ausmaßes spezifischer Glykosyltransferase-Aktivitäten eingesetzt
werden. Standardtests zur Detektion von Glykosyltransferasen, wie
z. B. ST6Gal und ST3Gal I, sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt. Wiederum wird die Behandlungswirksamkeit durch eine deutliche
Reduktion der Aktivität
der jeweiligen Glykosyltransferase angezeigt. Wie hierin verwendet
bezieht sich eine "deutliche
Reduktion" der jeweiligen
Sialylgalactosid-Spiegel
oder Glykosyltransferase-Aktivität
auf eine Reduktion von zumindest etwa 30% in der Testprobe im Vergleich
mit einer nicht-immundefizienten Kontrolle. Vorzugsweise beträgt die Reduktion
zumindest etwa 50%, noch bevorzugter zumindest etwa 75%, und besonders
bevorzugt werden die Sialylgalactosid- oder Glykosyltransferasespiegel
in einer Probe von einem behandelten Säugetier im Vergleich mit einer
nicht behandelten Kontrolle um zumindest etwa 90% reduziert.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele stellen Testprotokoll-Beispiele der vorliegenden
Erfindung bereit.
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FTVII-TESTPROTOKOLL
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Fluoronunc-Maxisorp-Microtiterplate-Platten
(Nunc Kat.-Nr. 437958) wurden mit 100 μl/Well des Akzeptor-Substrats,
Sialyl-LNnt BSA (10 μg/ml
in PBS), entweder über
Nacht bei 4°C
oder 2 h lang bei 37°C
beschichtet. Die Platten wurden dann mit 100 μl/Well PBS gewaschen und dann
mit Superblock (Pierce Kat.-Nr. 37535) (200 μl/Well) 1 h lang bei Raumtemperatur
blockiert. Die Platten wurden dann mit 200 μl/Well TBS/Tween (Tris-gepufferte
Salzlösung
+ Tween: 25 mM Tris, 0,1 M NaCl, 0,02% Tween 20, 0,02% Natriumazid,
pH 7,5) gewaschen.
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Das
Testgemisch umfasste Folgendes:
TBS:Tween | |
GDP-Fucose | 100 μM |
MnCl2 | 10 μM |
FTVII-Enzym | 6,2
mEinheiten/ml |
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Das
Testgemisch (100 μl/Well)
wurde zugesetzt, und die Platten wurden 90 min lang bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubationsphase wurden die Platten 2-mal mit TBS:Tween
und 1-mal mit TBS-10B (10fach mit H2O plus 0,25% BSA, 0,02% Tween
20 verdünnte
TBS) gewaschen. Ein für
das Produkt spezifischer Antikörper
(der CSLEX-Antikörper)
wurde dann in einer Verdünnung
von 1:30 in TBS-10B zugesetzt und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platten wurden dann erneut 3-mal mit TTBS-10B, 200 μl/Well, gewaschen.
Peroxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgM, das im Verhältnis von 1:1000 in TTBS-10B
verdünnt
war, wurde zu den Platten zugesetzt (100 μl/Well), und die Platten wurden
1 h lang bei Raumtemperatur inku biert. Die Platten wurden dann 6-mal
mit TTBS-10B (100 μl/Well)
gewaschen. Das TMB-Substrat (100 μl/Well)
wurde zu den Platten zugesetzt, und die Farbe wurde 15 min lang
bei Raumtemperatur entwickeln gelassen. Phosphorsäure (1 M) wurde
zu den Platten zugesetzt (100 μl/Well),
um die Peroxidase-Reaktion zu beenden, und nach dem Mischen wurde
das Absorptionsvermögen
bei 450 nm abgelesen.
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ST6-GAL-I-TESTPROTOKOLL
-
Immulon4-ELISA-Platten
(96 Well, Dynex (Kat.-Nr. G2402-958)) wurden mit dem Akzeptorsubstrat Asialo-Fetuin
in PBS (150 mM NaCl, 6,7 mM KH2PO4, 0,02% NaN3, pH
7,4) in einer Konzentration von 20 μg/ml (100 μl/Well) beschichtet, und der
Akzeptor wurde an die Platte über
Nacht bei 4°C
anhaften gelassen. Die Beschichtungslösung wurde durch Absaugen entfernt,
und die Wells wurden mit 3 × 200 μl PBS gewaschen. Die
Wells wurden dann mit 200 μl/Well
PBS plus 1% Gelatine 45–60
min lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach dreimaligem Waschen
der Wells mit PBS wurden 100 μl
des Testgemischs, umfassend 250 μEinheiten/ml
menschlicher ST6Gal-I in Reaktionspuffer (50 mM MES, pH 6,0, 100 μM CMP-Neu5Ac),
zu den Wells zugesetzt und 45 min lang bei 37°C inkubieren gelassen. Die Enzyminkubation
wurde durch das Absaugen der Well-Inhalte beendet. Die Wells wurden
dann mit 3 × 200 μl PBS, umfassend
0,05% Tween 20 (PEST), gewaschen. Das α2,6-sialylierte Produkt wurde durch Emporium-markiertes
Sambucus-nigra-Agglutinin (SNA) detektiert. Die Wells wurden mit
100 μl SNA
in PEST in einer Konzentration von 1 μg/ml 45 min lang bei Raumtemperatur überschichtet,
wonach sie 4-mal mit 100 μl
PBST gewaschen wurden. Europium-Verstärkungsmittel (Naphthoyltrifluoraceton
+ 0,1% Triton-X-100) wurde in einer Menge von 50 μl/Well zugesetzt,
und nach 30-minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten unter Einsatz einer
BMG-Fluostar-Plattenlesevorrichtung unter Anregung bei 340 ± 35 nm
und einer Emission von 615 ± 10
nm gelesen. Um die Wirksamkeit des Detektionsreagens sicherzustellen,
wurde Fetuin in einer Menge von 20 μg/ml als Kontrolle eingesetzt.