CN111437283A - β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用 - Google Patents

β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了β1,4‑半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用，属于肿瘤治疗技术领域。β1,4‑半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用，所述β1,4‑半乳糖基转移酶抑制剂为2‑萘基‑2‑丁酰氨基‑2‑脱氧‑1‑硫代‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷(以下简称612)。本发明揭示特异性β4GalT抑制剂612对HCC细胞系HepG2的选择性生长抑制作用，导致其细胞周期停滞在S期并诱导细胞凋亡。这表明612是一种专门针对β4GalT过度表达的癌症类型有效的抗癌药物。此外，CD‑612纳米颗粒强烈增强612在培养的癌细胞中的细胞毒性作用。

Description

β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的 应用
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在 制备治疗癌症的药物中的应用。
背景技术
癌症是一种危及生命的疾病。因此，发现具有选择性细胞毒性，新作用 机制和较少副作用的新型抗癌药物仍是被迫切需要的。由于已知癌细胞会表 现出异常的糖基化，因此许多研究集中于糖基化在癌症进展中的作用，例如 其对增殖，侵袭，血管生成和转移的影响(PMID：27975160，PMID： 27007155)。糖基转移酶(GTs)是一类将单糖从核苷酸糖供体转移到受体 的酶，它们负责复合寡糖，多糖和糖缀合物的生物合成，这些在细胞生长和 细胞粘附中起着关键性作用(PMID：29462882，PMID：26497328)。异常 糖基化在细胞侵袭和转移中起重要作用(PMID：27975160，PMID：27007155， PMID：26497328)，并且已经鉴定出几种GTs在癌症中异常表达，导致糖 基化的修饰异常并且与癌症转移相关。因此，这些GTs被发现是癌症治疗的 潜在目标(PMID：30858582，10.1039/C4MD00086B，PMID：9816064)。
β1,4-半乳糖基转移酶(β4GalT)参与N-乙酰乳糖胺的合成，并且发现 其在许多癌症中表达水平上调，这与癌症转移相关(PMID：2121334，PMID： 2527370，PMID：29793447)，此外还会导致癌细胞中的多药抗性(PMID： 27516205，PMID：23744354，PMID：23024026)。通过岩藻糖基化(PMID： 28430973)和唾液酸化(PMID：29912148)进一步糖基化修饰N-乙酰基乳 糖胺单元，最终产生唾液酸化路易斯结构，例如SLex和SLea，这也与癌症 转移和癌症患者存活率相关(PMID：24043722，PMID：31054033，PMID： 24425323)。最近的研究报道，二糖类似物作为β4GalT1的特异性抑制剂， 其对选择素介导的肿瘤转移具有抑制作用(PMID：19106107)。此外，抑 制β4GalT的8-羟基喹啉糖缀合物在宫颈癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌和结肠 癌细胞系中表现出抗癌特性(PMID：30530074)。更多研究还表明，通过 SLex前体抑制细胞表面上SLex的表达也阻断了选择蛋白介导的细胞粘附并 降低了癌细胞的转移潜力(PMID：9325281，PMID：12782582)。此外， 诱导细胞凋亡和减少癌细胞增殖的N-和O-糖基化抑制剂(PMID：31028384 PMID：19122213，PMID：30417028)已成为一种有前景的抗癌化疗药物家 族(PMID：29909237，10.4172/2161-0444.1000e106)。
现有技术中，β4GalT特异性抑制剂有2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代 -β-D-吡喃葡萄糖苷(以下简称612)(PMID：20976621)，但是关于2-萘 基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷关于在癌症中的应用未见报 道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治 疗癌症的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰 氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷能够治疗癌症。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的 应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代 -β-D-吡喃葡萄糖苷。
优选的，所述癌症包括人肾腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌或 结肠癌。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备抑制P-/E-selectin选 择速介导的癌细胞的迁移的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂 为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备诱导癌症细胞周期 停滞的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨 基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷；
所述细胞周期为细胞S期。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备诱导癌症细胞凋亡 的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2- 脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备降低促存活蛋白 Bcl-2表达的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁 酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备增加促凋亡蛋白表 达的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基 -2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。优选的，所述促凋亡蛋白包括Bax蛋白、 caspase-3蛋白和caspase-9蛋白中的一种或几种。
优选的，还包括：所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂被β-环糊精装载。
优选的，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂与β-环糊精的质量比为 (1～20):1。
本发明提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的 应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代 -β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明的β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂治疗癌症的机理如图1和如下所 示：
β4GalT与表皮生长因子受体(EGFR)之间的相互作用，参与丝分裂信 号转导到细胞核并促进细胞增殖.612抑制β4GalT活性从而干扰β4GalT与表 皮生长因子受体(EGFR)之间的相互作用，制细胞生长。同时遭遇生长周 期停滞的细胞往往会发生凋亡，在612处理后癌细胞促凋亡的Bcl-2家族成 员Bax表达升高，而抗凋亡的成员Bcl-2的表达降低，凋亡启动子和效应胱 天蛋白酶(caspase-9和caspase-3)以及裂解的caspase-3的表达水平在612处理的细胞中表现为时间依赖性升高，表明612可通过内在途径发生了细胞 凋亡。在这项研究中，612表现出对细胞周期停滞和凋亡的影响，表明612 表现出有希望的抗癌作用。
附图说明
图1为通过蛋白质印迹分析测定HUVEC，CT26，SMMC-7221和HepG2 细胞中β4GalT1蛋白的表达水平，以HUVEC细胞为对照组，**p<0.01，*** p<0.001；
图2为流式细胞仪分析用含612(30μg/mL)的培养基孵育了24h后的 SMMC-7221和HepG2细胞系的细胞周期变化，与对照组比较，*p<0.05,**p <0.01,***p<0.001；
图3流式细胞仪检测用含612(10μg/mL)的培养基孵育的SMMC-7221 和HepG2细胞的细胞凋亡水平，检测点为12h和24h，与对照组比较，**p <0.01,***p<0.001；
图4蛋白质印迹分析使用含612(100μg/mL)的培养基孵育的 SMMC-7221和HepG2细胞的凋亡相关蛋白的表达水平，与对照组比较，*p <0.05,**p<0.01,***p<0.001；
图5划痕实验检测612对HePG2以及SMMC-7721细胞迁移能力的影 响；
图6 Transwell实验检测612对HePG2以及SMMC-7721细胞迁移能力 的影响；
图7 P-选择素和E-选择素的ELISA实验检测612对HePG2以及 SMMC-7721细胞对细胞表面聚糖结构的影响，与对照组比较， *p<0.05,**p<0.01；
图8不同温度下CD-612的直径(a)和PDI(b)随时间的变化；
图9 CD-612在pH分别为5.5、6.5和7.5的含有0.5％Tween-80的PBS 中的药物累积释放量；
图10a，b是检测不同浓度的CD612和CD对SMMC-7221和HepG-2 细胞系的细胞毒性，孵育时间分别为24、48和72h。c浓度为10μg/mL 的612和CD612对SMMC-7221和HepG-2细胞系的MTT分析，孵育时间 为48h(n＝3，平均值±SD)，与游离612处理组比较，***p<0.001；
图11为β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂治疗癌症的机理图。
具体实施方式
本发明提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中 的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1- 硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。本发明对所述2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代 -β-D-吡喃葡萄糖苷的来源没有特殊限定，采用市售产品或者采用常规制备 方法制备即可。在本发明中，所述癌症优选包括人肾腺癌、横纹肌肉瘤、 肝癌、乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定， 采用2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷在医学上可接受 的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定， 采用常规种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中2-萘基-2- 丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量没有特殊限定，采用常规 药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定， 采用常规制备方法即可。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备诱导癌症细胞周 期停滞的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰 氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。在本发明中，所述细胞周期优选为 细胞S期。在本发明中，所述癌症优选包括人肾腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、 乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用2- 萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷在医学上可接受的剂型 即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用 常规种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中2-萘基-2-丁酰 氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量没有特殊限定，采用常规药物 中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采 用常规制备方法即可。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备诱导癌症细胞凋 亡的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基 -2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。在本发明中，所述癌症优选包括人肾腺 癌、横纹肌肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明对所述药物的剂 型没有特殊限定，采用2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖 苷在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和 用量没有特殊限定，采用常规种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发 明对药物中2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量没 有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的 制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备降低促存活蛋白 Bcl-2表达的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2- 丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。在本发明中，所述癌症优选包 括人肾腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明对所述 药物的剂型没有特殊限定，采用2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡 喃葡萄糖苷在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料 的种类和用量没有特殊限定，采用常规种类即可，采用常规辅料的用量即 可。本发明对药物中2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷 的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所 述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备增加促凋亡蛋白 表达的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨 基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。在本发明中，所述促凋亡蛋白优选包 括Bax蛋白、caspase-3蛋白和caspase-9蛋白中的一种或几种。在本发明 中，所述癌症优选包括人肾腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌或结 肠癌。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用2-萘基-2-丁酰氨基-2- 脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用常规种类即可，采用 常规辅料的用量即可。本发明对药物中2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代 -β-D-吡喃葡萄糖苷的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量 即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即 可。
本发明还提供了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备抑制P-/E-selectin 选择速介导的癌细胞的迁移的药物中的应用。在本发明中，所述癌细胞优 选为肝癌细胞。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用2-萘基-2-丁 酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷在医学上可接受的剂型即可。本发 明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用常规种类即 可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧 -1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备 方法即可。
本发明还包括：所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂被β-环糊精装载。在 本发明中，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂与β-环糊精的质量比优选为 (1～20):1，更优选为(5～10):1。
在本发明中，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂被β-环糊精装载的方法 优选包括：将β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂和β-环糊精溶于甲醇中，在温度 为40℃的减压条件下进行旋转蒸发，得到脂质膜，将所述脂质膜溶于水中， 在0℃下超声处理30min，将得到的超声物在4℃和7227g下离心45min， 得到的沉淀为β-环糊精装载了β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂。在本发明中， 所述β-环糊精的质量与甲醇的体积比优选为8mg:10ml。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例用到的试剂如下：
磷酸盐缓冲盐水(PBS，Thermo Fisher Scientific，上海，中国)和胰蛋 白酶-EDTA溶液(Solarbio，北京，中国)。Bcl-2，BAX，caspase-3，caspace-9 和β-肌动蛋白的抗体获自Affinity(北京，中国)。抗β4GalT1抗体获自Santa CruzBiotechnology，Inc.(ON，加拿大)。过氧化物缀合的二抗A获得于 Afnity。凝集素获取自VECTOR，碱性磷酸酶偶联的抗生物素蛋白和硝基苯 基磷酸酯反应底物均获自Sigma。E-选择素和P-选择素获自RnDsystem。β- 环糊精(CD，Annaiji，中国)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四唑 溴化物(MTT)，Super ECL检测试剂(Yeasen Biotech Co，Ltd)，细胞 凋亡检测试剂盒(TransDetect AnnexinV-FITC/PI，TransGen Biotech，北 京，中国)和细胞周期检测试剂盒(PI染色，上海，中国)。
实施例1
制备方法见文献(PMID:17006644)可分为以下步骤：
D-氨基葡萄糖盐酸盐(5.39g)放入80mL含有0.56g Na的无水MeOH 中溶解，轻轻旋转后，NaCl可通过过滤分离并除去。然后在室温下一边搅 拌一边在D-葡萄糖胺溶液中分批加入1.2–1.5等摩尔的丁酸酐。结晶后，通 过过滤获得2-丁酰胺基-2-脱氧D-吡喃葡萄糖，然后用冷的MeOH洗涤，并 在室温干燥。然后，将5克2-丁酰胺基-2-脱氧D-吡喃葡萄糖分批加入10毫 升乙酰氯，室温下搅拌16小时后将反应混合物用倒入40mL CHCl3，然后 将混合为再倒入50mL冰水中。有机层用40mL饱和碳酸氢钠洗涤后用 Mg2SO4干燥。蒸发溶剂，然后从干燥的乙醚中结晶，获得3,4,6-三-O-乙酰 基-2-丁酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基氯无色晶体。
在10mL乙酸乙酯混合溶液：3,4,6-三-O-乙酰基-2-丁酰胺基-2-脱氧-α-D- 吡喃葡萄糖基氯(0.67g，1.70mmol)，2-萘硫醇(0.55g，3.41mmol)， 四正丁基硫酸氢铵(0.58g，1.70mmol)，加入1.5M碳酸钠水溶液(10mL)。 然后将得到的两相系统在室温搅拌1.5h。然后将混合物用乙酸乙酯(75mL) 稀释，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液(2×50mL)，水(2×50mL)和盐 水(50mL)洗涤，并用Na2SO4干燥，过滤有机萃取物，浓缩滤液，得到粗 固体，将其在乙酸乙酯-己烷重结晶，得到2-萘基3,4,6-三-O-乙酰基-2-丁酰 胺基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
向2-萘基3,4,6-三-O-乙酰基-2-丁酰胺基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖 苷的甲醇-甲苯1:1(v/v)溶液中加入催化量的0.5M甲醇钠的甲醇溶液。将 反应混合物在室温搅拌，并通过TLC 4：1(v/v)，CHCl3-MeOH监测反 应进程。完成后，加入等体积的己烷，将混合物冷却，并通过过滤收集沉淀 的产物，干燥后获得产物2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖 苷(以下简称612)。
随后通过1H NMR和LC-ESI-MS分析(PMID：20976621，PMID： 17006644)其表征。
612的结构分析如下：
612的NMR和MS数据如下：1H NMR(600MHz，6mg溶于DMSO-d6)： δ0.89(t，3H，J7.4Hz，CH3CH2CH2)，1.55(m，2H，J 7.3Hz，CH3CH2CH2)， 2.07(t，2H，J 7.2Hz，CH2CO)，3.14-3，75(碳水化合物环上的其他Hs)， 4.88(d，1H，J 10.3Hz，碳水化合物环的异头H)，7.46-7.95(7H，在萘 基环上)；13C NMR(150.9M Hz，DMSO-d6)：δ14.15(CH3CH2CH2)， 19.16(CH3CH2CH2)，38.31(CH2CO)，54.72-81.86(碳水化合物环上的 其他Cs)，87.01(碳水化合物环上的异头C)，126.23，127.02，127.38， 127.66(2C)，128.03，128.57，131.82，133.81和133.93(萘基环上的Cs)，172.46(NCOCH3)；HRMS(ES)：C20H26NO5S([M+H]+)的计算值： 392.1532。实测：392.1439。
细胞培养
人肾腺癌(786-O)，横纹肌肉瘤(RD)，肝癌(SMMC-7221和HepG2)， 乳腺癌(MCF-7和MDA-MB-231)，肺癌(A549)细胞系和小鼠乳腺癌(4T1) 和结肠癌(CT26)细胞系获自中国科学院类型培养物保藏委员会的细胞库(上 海，中国)。含有10％胎牛血清(FBS，ThermoFisher Scientific，上海，中 国)和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific，上海，中国)的细胞生 长完全培养基RPMI 1640和DMEM(Thermo Fisher Scientific，上海，中国) 用于生长细胞。将786-O，RD，SMMC-7221，HepG2和CT26细胞系在RPMI 1640培养基中培养。同时，在DMEM培养基中培养MCF-7，MDA-MB-231， A549和4T1细胞系。所有细胞培养物补充有10％FBS，并在37℃下在含有 5％CO2的培养箱中中温育。
细胞毒性检测
将处于对数生长期(1×104)的细胞接种到含有完全生长培养基的96孔 板上，在CO2培养箱中孵育24h。随后在不存在FBS的情况下用不同浓度 (5-500μg/mL)的游离612分别处理实验组24，48和72h，然后在完全培养 基中再培养24h，选择不含有游离612组用作对照。之后在每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，Sigma-Aldrich，上海，中国)，4h后吸出培养基，在37℃，黑暗条件下加入150μL二甲基亚砜(DMSO)溶液振荡10min (Sigma-Aldrich)。在490nm处测量光密度(OD)，并且每次测量重复6 次。根据下式计算细胞活力，从而通过GraphPad Prism 7计算得出612对应 所有细胞系增殖的半抑制浓度(IC50)。
细胞活力(％)＝实验组的OD/对照组的OD×100％
流式细胞术
将从对数生长期(1×105)收集的细胞接种到6孔板上并预孵育24h， 切换至无血清培养基，然后在加入612。在含有612的培养基中孵育24h 后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并使用结合缓冲液重悬细胞。根 据细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒(BDBiosciences，San Jose，CA)的说明， 在加样到流式细胞仪之前加入AnnexinV-EGFP和PI染色，记录荧光光谱。
蛋白质印迹分析
将细胞于含有100μg/mL 612的培养基中孵育6、12和24h，然后提取 总蛋白质并使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质浓度测定试剂盒(碧云天，北京， 中国)测量。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离 蛋白质30min，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)。将膜与 一抗(1000×稀释)一起温育，并在4℃下孵育24h。将二抗(1000×稀释) 加入膜中，并在用Tris缓冲液-吐温(TBST)洗涤后温育1.5h。将增强的化 学发光(ECL)显影溶液(GE Healthcare，Amersham，英国)加入PVDF 膜中，记录结果并用β-肌动蛋白作为上样对照进行分析。
细胞迁移实验
SMMC-7221和HepG2细胞在完全培养基中于6孔板中生长至达到90％ 融合，然后在含有25或50μg/mL 612的无血清培养基中再生长24h。之后 用10μL移液器枪头划过板中每个孔中间制造划痕。用PBS洗涤细胞，每孔 加入1mL基础培养基，以继续生长24、48、72h。缺少612的组用作对照。 使用显微镜(Olympus)拍摄图像。
对于细胞迁移实验，先将细胞饥饿24h，然后转移到24孔板的transwell 小室中。将200μL包含25或50μg/mL 612的无血清培养基(2×104个细胞 /孔)添加到小室上腔中，并将600μL含10％FBS的培养基作为趋化剂添加 到24孔板的下腔室中。温育24h后，用棉签擦拭小室的上侧，除去小室膜 上侧非迁移细胞。使用显微镜对小室膜下侧的迁移细胞进行拍照。
ELISA实验
将E-选择素或P-选择素(0.5μg/mL)于4℃下在ELISA板上包被过夜。 将已用25或50μg/mL 612预处理24h的细胞和对照细胞加入到相应的孔 中，并在37℃下孵育2h。PBS轻轻洗涤相应的孔，然后用10％甲醛固定并 风干。粘附细胞用结晶紫(0.05％)染色。之后在每孔加入100μL脱色液(50％ 乙醇，0.1％乙酸)。于590nm处读取吸光度。
结果：
612的细胞毒性
通过MTT测定评估612对癌细胞的细胞毒性作用。通过GraphPad Prism 7计算的所有细胞系的半抑制浓度(IC50)显示在表1中。在本实施例的细 胞系中，用正常HUVEC细胞样品观察到612的最高IC50值(IC50＝443.0±15.9 μg/mL)(对应于最弱的细胞毒性)，而用HepG2细胞观察到最低IC50值 52.0±8.2μg/mL(最强的细胞毒性)。此外，计算肾细胞腺癌(786-O)和 乳腺癌细胞系(MCF-7，MDA-MB-231和4T1)样本的IC50值分别为 163.7±14.6、146.0±13.1、116.3±9.5和112.0±10.5μg/mL。612对人横纹肌肉 瘤(RD)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC-7221)和小鼠结肠癌(CT26)细 胞系的IC50值分别为93.0±11.8、88.7±8.5、98.0±11.4和94.0±2.0μg/mL。 表明在一定浓度范围内(50-100μg/mL)，612可作为特异性细胞毒性剂， 对培养的癌细胞具有比对正常细胞更高的功效。这些数据还表明，该药物在 较低浓度下对来自不同组织的癌细胞提供了选择性生长抑制。
表1 612对不同细胞系的IC50值(n＝3，平均值±SD)
Figure BDA0002404225220000111
β4GalT1在癌细胞中的表达
如上所述，癌细胞系对612的治疗表现出不同的敏感性。因此，通过蛋 白质印迹分析并比较正常HUVEC细胞和癌细胞系中612靶向的β4GalT1的 表达，癌细胞系对较低浓度612具有或具有较低的敏感性。在612处理下， 表现出最高IC50(443.0±15.9μg/mL)的HUVEC细胞显示出测试细胞系中 β4GalT1的最低表达水平(图1)。相反，在612处理期间表现出最低的IC50 (52.0±8.2μg/mL)的HepG2细胞，表现出最高的β4GalT1表达水平，表明 612对β4GalT1的抑制会导致生长抑制作用。
612在细胞周期中的作用
将已经在含有30μg/mL 612的无血清培养基中孵育24h的SMMC-722 和HepG2细胞系用PI染色，并通过流式细胞仪进行细胞周期分析。如图2 所示，612显著增加了SMMC-7221细胞在S期的百分比(p<0.001)，并明 显降低了G0/G1期(p<0.01)和G2/M(p<0.05)期的细胞百分比(p<0.05)， 这表明用612处理会导致S期细胞周期停滞。经612处理后，HepG2细胞在S期和G2/M期分布均显著增加，而在G0/G1期则分布减少，表明612主 要诱导S期细胞周期停滞，并且在用612孵育24h后也在G2/M期阻断细 胞周期。
612对癌细胞凋亡的影响
AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)染色用于测定肝癌细胞(HepG2)中的 细胞凋亡水平，其低IC50值表明其对612诱导的细胞毒性敏感。另一种对 612诱导的细胞毒性不太敏感的肝癌细胞系(SMMC-7221)，也用于评估 612的凋亡行为。在用含有10μg/mL 612的无血清生长培养基孵育12和24 h后，将细胞染色并通过流式细胞术分析。如(图3)所示，SMMC-7221(p <0.05)和HepG2(p<0.01)癌细胞在612孵育12h后显示凋亡效应，并且 细胞凋亡水平随着孵育时间的增加而增加(p<0.001)。此外，HepG2细胞 在612处理后显示出更高的凋亡水平，表明HepG2细胞比SMMC-7221细胞 对612诱导的细胞凋亡更敏感。
癌细胞中抗凋亡因子，促凋亡因子和caspase酶家族分子的表达
通过流式细胞仪分析AnnexinV-FITC和PI染色的癌细胞的细胞膜和核 形态变化，结果表明612处理可以诱导癌细胞凋亡。为了进一步揭示由612 触发的凋亡途径，通过蛋白质印迹分析研究了主要影响受体非依赖性细胞凋 亡的相关凋亡因子的表达水平。当用含有100μg/mL 612的无血清培养基处 理癌细胞时，Bcl-2家族分子的表达水平以时间依赖性方式改变(图4)，而 在所有癌细胞中促凋亡因子Bax(21kDa)的表达增加，而发现抗凋亡因子 Bcl-2(26kDa)被抑制。此外，caspase-9(46kDa)的表达随着612孵育时 间的增加而增加，与caspase-3(37kDa)及其裂解形式(17kDa)的情况相 同。该分析表明612通过上调促凋亡蛋白因子Bax刺激癌细胞中的凋亡途径 (p<0.05)，下调抗凋亡因子Bcl-2(p<0.05)，激活凋亡启动子caspase-9 (p<0.05)，最终导致效应器caspace-3的活化(p<0.05)并以时间依赖的 方式增加切割的caspase-3的水平。
612对癌细胞迁移的影响
划痕愈合实验中随着孵育时间的不断延长，不同组的划痕愈合速度不同 (图5)。与对照组的愈合程度相比，25或50μg/mL 612处理过的 SMMC-7721和HepG2细胞的愈合程度减小，表明612对SMMC-7721和 HepG2的迁移有显著的抑制作用。其中50μg/mL 612的抑制效应更强。此 外还通过Transwell细胞迁移实验测定了612对SMMC-7721和HepG2细胞 的迁移能力的影响(图6)。与对照组相比，采用25或50μg/mL 612处理 过的细胞的细胞迁移数目减少，其中用50μg/mL 612处理对细胞迁移的抑 制效果更显著。所有这些结果均表明，经过612处理过的SMMC-7721和 HepG2细胞的迁移能力显著降低。
ELISA实验
ELISA分析表明，612预处理过的细胞与空白组相比较少粘附到E-选择 素和P-选择素包被的板上(图7)。表明在被612孵育过的癌细胞表面修饰 的聚糖结构降低参与选择素介导的癌细胞转移的聚糖表位SLex和SLea的表 达，其中50μg/mL 612的抑制效果更显著。
实施例2
细胞培养
人肾腺癌(786-O)，横纹肌肉瘤(RD)，肝癌(SMMC-7221和HepG2)， 乳腺癌(MCF-7和MDA-MB-231)，肺癌(A549)细胞系和小鼠乳腺癌(4T1) 和结肠癌(CT26)细胞系获自中国科学院类型培养物保藏委员会的细胞库(上 海，中国)。含有10％胎牛血清(FBS，ThermoFisher Scientific，上海， 中国)和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific，上海，中国)的细胞 生长完全培养基RPMI 1640和DMEM(Thermo Fisher Scientific，上海，中国)用于生长细胞。将786-O，RD，SMMC-7221，HepG2和CT26细胞 系在RPMI 1640培养基中培养。同时，在DMEM培养基中培养MCF-7， MDA-MB-231，A549和4T1细胞系。所有细胞培养物补充有10％FBS，并 在37℃下在含有5％CO2的培养箱中中温育。
制备环糊精负载的612(以下简称CD-612)纳米颗粒
将CD：612质量比为1：1，5：1，10：1和20：1的β-环糊精(CD)和 612溶解在10mL甲醇中，0.8mg的β-环糊精溶解于10mL甲醇中。在40℃ 减压条件下，通过旋转蒸发制备脂质膜。待膜干燥后，加入4mL超纯水， 将溶液在0℃下超声处理(20kHz)30min。在37℃下放置2.5h后获得 CD-612纳米颗粒(NPs)。通过4℃以7227×g离心45min，以分离CD-612 (上清液)和游离612(不溶性沉淀物)，从而纯化CD-612。
为了确定包封率(EE)，将20μL CD-612与80μL甲醇混合，将10μL 该混合物注入具有Sum C18柱和UV-Vis检测器的反相高效液相色谱系统 (HPLC，Shimadzu，日本)中。流动相为乙腈水溶液(v/v，40％)，流 速设定为0.4mL/min，在波长223nm下在13.5min测定612保留时间。包 封效率(EE)计算如下。
EE(％)＝(封装总量612)/(进料总量612)×100％
CD-612的物理化学表征
使用ZetasizerNano ZS(Malvern Instruments，Germany)测定CD-612NPs 的大小和zeta电位。在4℃和37℃温育3天后，评估CD-612在盐水和含10％ FBS的PBS中的稳定性。
使用恒温摇动法(PMID：23422276)测量612的体外释放，使用不同 pH值(5.5，6.5和7.4)的含有0.5％Tween-80的20mM PBS作为溶出介质。 在40mL溶解介质中，在37℃恒定搅拌下，透析2mL CD-612(MWCO： 8-10kDa，Fisher Scientific)。在0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，48 和72h取出0.5mL溶出介质，并在每个时间点补加0.5mL新鲜溶解介质。 将收集的溶出介质用0.22μm膜过滤，将10μL样品加载到HPLC系统中进 行分析。记录612的峰面积以计算释放的612的量。
细胞毒性检测
将处于对数生长期(1×104)的细胞接种到含有完全生长培养基的96孔 板上，在CO2培养箱中孵育24h。随后在不存在FBS的情况下用不同浓度 (0.01-20μg/mL)的CD-612复合物分别处理实验组24，48和72h，然后在 完全培养基中再培养24h，选择不含有CD-612组用作对照。之后在每孔加 入20μL MTT溶液(5mg/mL，Sigma-Aldrich，上海，中国)，4h后吸出培养基，在37℃，黑暗条件下加入150μL二甲基亚砜(DMSO)溶液振荡 10min(Sigma-Aldrich)。在490nm处测量光密度(OD)，并且每次测量 重复6次。根据下式计算细胞活力。
细胞活力(％)＝实验组的OD/对照组的OD×100％
流式细胞术
将从对数生长期(1×105)收集的细胞接种到6孔板上并预孵育24h， 切换至无血清培养基，然后在加入CD-612。在含有CD-612的培养基中孵 育24h后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并使用结合缓冲液重悬细 胞。根据制造商的细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)的说明，在加样到流式细胞仪之前加入AnnexinV-EGFP和PI染 色，记录荧光光谱。
蛋白质印迹分析
将细胞于含有100μg/mL CD-612的培养基中孵育6、12和24h，然后 提取总蛋白质并使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质浓度测定试剂盒(碧云天， 北京，中国)测量。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 分离蛋白质30min，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)。将 膜与一抗(1000×稀释)一起温育，并在4℃下孵育24h。将二抗(1000×稀释)加入膜中，并在用Tris缓冲液-吐温(TBST)洗涤后温育1.5h。将增 强的化学发光(ECL)显影溶液(GE Healthcare，Amersham，英国)加入 PVDF膜中，记录结果并用β-肌动蛋白作为上样对照进行分析。
结果：
CD-612的性质
制备具有不同CD：612(w/w)比例的CD-612NPs，以增强612在水 溶液中的溶解度，并对其物理化学性质进行了分析，包括粒度，多分散指数 (PDI)，zeta电位，包封效率(EE)和药物负载能力(LC)(表2)。结 果表明具有较高的CD：612(w/w)比例的CD-612具有小的粒度分布，例 如10：1和20：1。此外，当CD：612比例为10：1也表现出小的多分散 指数(PDI)。
表2 CD-612纳米粒子的物理化学性质
Figure BDA0002404225220000161
当CD：612(w/w)的比例在1：1，5：1，10：1和20：1时，EE 值分别为60.42％，82.92％，95.86％和97.95％。最后，选择以10：1的比 例制备CD-612NPs用于进一步分析其稳定性和细胞毒性。
CD-612的稳定性测量方法为测量其在盐水和含有10％FBS的PBS中在 4℃和37℃下，随着时间的延长其粒径的变化(图8中的a)。散点图显示 粒径没有显著变化，并且可以维持(没有发生聚集)至少一周。PDI数据 绘制在图8中的b中，其显示了CD-612的窄尺寸分布。
在盐水和含有10％FBS的PBS中，EE(％)随时间降低(表3)，表 明612可以在生理条件下从CD-612缓慢释放以表达其抗癌作用。根据在 pH为5.5、6.5和7.4的条件下612的累积释放，可以看出在酸性环境(例如 肿瘤区域)中释放更多612(图9)。
表3 CD-612在盐水和含有10％FBS的PBS中不同时间点的包封率
Figure BDA0002404225220000171
CD-612的细胞毒性
采用MTT方法检测各种浓度的CD-612复合物(10：1)处理了24、48 和72h时，其对癌细胞系的细胞毒性(图10)。在培养24h后，CD-612 对三种癌细胞SMMC-7221，HepG2和CT26的IC50值分别计算为3.1±0.4， 2.4±0.3和3.0±0.3μg/mL。这些值比游离612的相应IC50值分别小28.6， 21.7和31.1倍，因此表明CD-612对所有这些测试的癌细胞表现出比游离612更高的细胞毒性(p<0.001)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和 润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症包括人肾腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌或结肠癌。
3.β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备抑制P-/E-selectin选择速介导的癌细胞的迁移的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4.β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备诱导癌症细胞周期停滞的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷；
所述细胞周期为细胞S期。
5.β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备诱导癌症细胞凋亡的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
6.β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备降低促存活蛋白Bcl-2表达的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
7.β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂在制备增加促凋亡蛋白表达的药物中的应用，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂为2-萘基-2-丁酰氨基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促凋亡蛋白包括Bax蛋白、caspase-3蛋白和caspase-9蛋白中的一种或几种。
9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，还包括：所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂被β-环糊精装载。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述β1,4-半乳糖基转移酶抑制剂与β-环糊精的质量比为(1～20):1。
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