KR20120117803A - 파골세포형성 및/또는 파골세포 활성화 억제용 ｎ-치환 데옥시노지리마이신 화합물 - Google Patents

Abstract

세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제 두가지 모두인 제제는 파골세포형성을 억제 및/또는 파골세포 활성화를 감소시킬 수 있고, 그러므로 다발성 골수종과 같은 상태를 가진 대상에서의 골용해성 활성 및 골 손실에 유용할 수 있다.

Description

파골세포형성 및/또는 파골세포 활성화 억제용 Ｎ-치환 데옥시노지리마이신 화합물{N-SUBSTITUTED DEOXYNOJIRIMYCIN COMPOUNDS FOR USE IN INHIBITING OSTEOCLASTOGENESIS AND/OR OSTEOCLAST ACTIVATION}

본 출원은 2009년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 제 61/282,033호에 대해 우선권을 주장한다. 전술한 출원의 전문은 본원에 참고문헌으로 인용된다.

본 개시는 일반적으로 의학적 목적을 위한 이미노슈가의 용도 및 특히, 파골세포형성 및/또는 파골세포 활성화를 억제하기 위한 이미노슈가의 용도에 관련된다.

한 실시양태에 따르면, 파골세포형성 억제 및/또는 파골세포 활성화 감소를 위한 방법은 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제인 제제의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 실시양태에 따르면, 골용해성 활성 및/또는 골 손실을 감소 또는 예방하는 방법은 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제인 제제의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다.

본 출원 파일은 칼라로 만들어진 하나 이상의 도면을 포함한다. 칼라 도면(들)을 가진 본 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용의 지불시에 사무국으로부터 제공될 것이다.
도 1 A-B는 선택된 이미노슈가에 의한 RANKL-의존성 파골세포형성의 시험관내 억제에 대한 자료를 보여준다.
도 2 A-D는 선택된 이미노슈가에 대한 파골세포형성 중 MAPK 시그널링(signaling) 및 NFATc 활성화의 억제에 대한 자료를 보여준다.
도 3은 Src 및 TRAF6와 래프트(raft)의 회합의 글리코스핑고리피드 변태에 관한 자료를 보여준다.
도 4 A-B는 선택된 이미노슈가에 의한 갈락토실세라마이드 및 RANKL에 의한 파골세포 활성화의 생체내 억제에 대한 자료를 보여준다.
도 5 A-B는 다발성 골수종(MM) 환자에서의 GSL의 질량 스펙트럼 프로파일을 보여준다. 프로파일은 MM에서 GM2 및 GM3가 가장 일반적인 GSL임을 드러낸다.
도 6 A-E는 파골세포형성을 촉진하는데에 GM3가 RANKL 및 IGF-1과 협력하는 것을 입증하는 자료를 보여준다.

달리 명시되지 않으면, "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미한다.

파골세포는 정상 및 병적 상태 모두에서의 일차 골-재흡수성 세포이다. 증가된 파골세포의 골 재흡수는 골 재흡수를 위한 미리 형성된 파골세포의 활성화 및 증가된 파골세포 형성 모두로부터 기인할 수 있다. 골전이 환자에게서, 골용해성 골 파괴는 심각한 골통, 병적골절, 고칼슘혈증, 및 신경 압박 증후군을 야기할 수 있다. 신장암, 폐암, 갑상선암, 전립선암, 다발성 골수종 및 유방암을 포함하여 몇몇의 암은 골에 대해 높은 호발을 보이고, 이는 예를 들어, 문헌[Roodman, Journal of Clinical Oncology, vol. 19, 2001, p. 3562]을 참고한다. 파골세포 형성 및 활성화는 또한 폐경후 골다공증과 같은 골다공증, 파제트병, 류머티스성 관절염 및 머리 및 목의 편평상피암을 앓고 있는 개인에게 골용해성 질병 및 골 손실을 야기할 수 있으며, 이는 예를 들어, 미국 특허 제 7,462,646호를 참고한다.

글루코실세라마이드 합성효소 억제제인 D-트레오-1-페닐-2-데카노일아민-3-모르폴리노-1-프로판올(d-PDMP)에 의한 글리코스핑고리피드의 억제는 핵 인자-κΒ 리간드(RANKL)의 수용체 활성화제 및 대식세포-콜로니 자극 인자에 의해 유도된 파골세포 형성을 억제할 수 있으며, 이는 문헌[이와모토(Iwamoto) 등, Journal of Biological Chemistry, 276, 46031-46038, 2001]을 참고한다.

본 발명자는 특정한 제제에 의한 글리코스핑고리티드 그 자체의 억제는 이러한 제제가 파골세포형성의 억제 및 파골세포 활성화의 감소에 효과적이도록 되기에는 그 제제 자체만에 의해서는 충분하지 않을 수 있다는 것을 발견했다. 그러므로, 파골세포형성의 억제 및 파골세포 활성화의 감소에 효과적이기 위해서는, 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제(CGT) 억제제인 것 외에, 제제는 또한 CGT 이외의 하나 이상의 추가적인 효소의 억제제이어야 한다.

많은 실시양태에서, 파골세포형성의 억제 및 파골세포 활성화의 감소에 효과적일 수 있는 제제는 CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두일 수 있으며 즉, 제제는 CGT 및 글루코시다제 두 가지 모두에 억제성 효과를 줄 수 있다. 용어 "글루코시다제 억제제"는 하나 이상의 α-글루코시다제 및 β-글루코시다제에 대해 억제 활성을 가질 수 있는 물질을 의미한다. 많은 실시양태에서, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제는 N-치환 데옥시노지리마이신과 같은 이미노슈가일 수 있다.

특정 실시양태에서, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제는 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이러한 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물일 수 있다:

(I)

화학식 (Ⅰ)에서, R¹은 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐, 아실, 아랄킬, 아로일, 알콕시기, 아랄콕시기 및 헤테로시클릭기로부터 선택될 수 있고; 반면에 R², R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 아실기, 알카노일기, 아로일기, 및 할로알카노일기로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, R¹은 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있으며, 분지쇄 또는 미분지쇄 알킬기는 1 내지 24 탄소 원자, 또는 2 내지 12 탄소 원자, 또는 3 내지 5 탄소 원자, 또는 14 내지 22 탄소 원자 또는 17 내지 20 탄소 원자를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "알킬"은 단독으로 또는 조합으로, 1 내지 24 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 라디칼을 의미한다.

치환된 알킬은 단독으로 또는 조합으로, 아릴 및 헤테로시클로의 정의와 관련하여 본원에서 정의된 바와 같은 임의적으로 치환된 알킬 라디칼을 의미한다. 알킬렌은 메틸렌(--CH₂--)와 같은 둘 이상의 위치에서 부착된 포화 지방족 탄화수소 부분을 의미한다. 알킬 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 이차-부틸, 삼차-부틸, 펜틸, 이소-아밀, 헥실, 옥틸, 노닐, 데실, 우나데실, 옥타데실 등을 포함한다.

용어 "시클로알킬"은 단독으로 또는 조합으로, 포화된 또는 부분적으로 포화된 모노시클릭, 바이시클릭 또는 트리시클릭 알킬 라디칼을 의미하고, 여기서 각각의 시클릭 부분은 바람직하게 3 내지 10의 탄소 원자 고리 구성원을 포함하고, 이는 임의적으로 아릴의 정의와 관련하여 본원에서 정의된 바와 같은 임의적으로 치환된 벤조 융합 고리계일 수 있다. 이러한 시클로알킬 라디칼의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 옥타히드로나프틸, 2,3-디히드로-1H-인데닐, 아다만틸 등을 포함한다. 용어 "아릴"은, 단독으로 또는 조합으로, 또는 "아라" 또는 "아르"는 조합으로, 알킬, 알킬카보닐, 알콕시, 할로겐, 히드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 할로알킬, 할로알킬티오, 할로알킬옥시, 카복시, 알콕시카보닐, 시클로알킬, 헤테로시클로, 알킬카보닐아미노, 아미노알카노일, 아미도, 아미노카보닐, 아릴카보닐, 아릴카보닐아미노, 아릴, 아릴옥시, 알킬옥시카보닐, 아릴알킬옥시카보닐, 알콕시카보닐아미노, 치환 아미노, 이치환 아미노, 치환 아미노카보닐, 이치환 아미노카보닐, 치환 아미도, 이치환 아미도, 아랄콕시카보닐아미노, 알킬티오, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 할로알킬티오, 할로알킬설피닐, 할로알킬설포닐, 아릴티오, 아릴설피닐, 아릴설포닐, 알킬설피닐아미노, 알킬설포닐아미노, 할로알킬설피닐아미노, 할로알킬설포닐아미노, 아릴설피닐아미노, 아릴설포닐아미노, 헤테로시클로, 설포네이트, 설폰산, 삼치환 실릴 등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의적으로 치환된 페닐 또는 나프틸 라디칼을 의미한다. 나프틸 및 베타-카보리닐과 같은 융합 고리계 및 비페닐, 페닐피리딜, 나프틸 및 디페닐피페라지닐과 같은 치환 고리계 모두를 포함하는 것이 의도된다. 아릴 라디칼의 예는 페닐, p-톨릴, 4-메톡시페닐, 4-(t-부톡시)페닐, 3-메틸-4-메톡시페닐, 4-플루오로페닐, 4-클로로페닐, 3-니트로페닐, 3-아미노페닐, 3-아세타미도페닐, 4-아세타미도페닐, 2-메틸-3-아세타미도페닐, 4-CF₃-페닐, 2-메틸-3-아미노페닐, 4-CF₃O-페닐, 3-메틸-4-아미노페닐, 2-아미노-3-메틸페닐, 2,4-디메틸-3-아미노페닐, 4-히드록시페닐, 3-메틸-4-히드록시페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 3-아미노-1-나프틸, 2-메틸-3-아미노-1-나프틸, 6-아미노-2-나프틸, 4,6-디메톡시-2-나프틸, 피페라지닐페닐 등이다.

용어 "아랄킬" 및 "아랄콕시"는 단독으로 또는 조합으로, 하나 이상의 수소 원자가 상기 정의된 아릴 라디칼로 대체된, 상기 정의된 알킬 또는 알콕시 라디칼을 의미한다. 그러므로, "아릴"은 벤질, 2-페닐에틸, 디벤질메틸, 히드록시페닐메틸, 메틸페닐메틸, 및 디페닐메틸과 같은 치환체를 포함하고, "아릴옥시"는 벤질옥시, 디페닐메톡시, 4-메톡시페닐메톡시 등과 같은 치환체를 포함한다.

용어 "아로일"은 아릴카복실산으로부터 유래한 아실 라디칼을 의미하고, "아릴"은 상기 주어진 의미를 갖는다. 이러한 아로일 라디칼의 예는 벤조일, 4-클로로벤조일, 4-카복시벤조일, 4-(벤질옥시카보닐)벤조일, 1-나프토일, 2-나프토일, 6-카복시-2-나프토일, 6-(벤질옥시카보닐)-2-나프토일, 3-벤질옥시-2-나프토일, 3-히드록시-2-나프토일, 3-(벤질옥시포름아미도)-2-나프토일 등과 같은 치환 및 비치환 벤조일 또는 나프토일을 포함한다.

화학식 (Ⅰ)의 화합물을 합성하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제 5,622,972, 4,246,345, 4,266,025, 4,405,714, 및 4,806,650호에 서술되어 있다.

일부 실시양태에서, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제는 무기 또는 유기산으로부터 유래된 염의 형태일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염 및 염 형태를 제조하는 방법은, 예를 들어 문헌[베르게(Berge) 등, J.Pharm. Sci . 66: 1-18, 1977]에 서술되어 있다. 적절한 염의 예는 하기의 염: 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로리드, 히드로브로미드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 메실레이트 및 운데카노에이트를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

일부 실시양태에서, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제는 전구 약물의 형태로 사용될 수 있다. 6-인산화 DNJ 유도체와 같은 DNJ 유도체의 전구 약물은 미국 특허 제 5,043,273호 및 제 5,103,008호에 서술되어 있다.

일부 실시양태에서, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제는 조성물을 동물에게 전달하는데 유용한 성분 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물의 일부로서 사용될 수 있다. 조성물을 사람에게 전달하는데 유용한 많은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 조성물을 소와 같은 다른 동물들에게 전달하는데 유용한 성분들은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 담체 및 성분의 첨가는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 화학식 (Ⅰ)의 화합물과 같은 이미노슈가는 미국 공보 제 2008/013851호; 2009년 3월 25일 출원된 미국 출원 제 12/410,750호 및 2009년 3월 27일 출원된 미국 가출원 제 61/202,699호에 서술된 것과 같은 리포좀 조성물에서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제는 세포 내 파골세포형성을 억제 및/또는 파골세포 활성화를 감소시키기 위해 세포 배양액에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 파골세포형성 및/또는 파골세포 활성화를 통해 진행할 수 있는 상태를 치료 또는 예방하기 위해서, 사람과 같은 동물에 투여될 수 있다. 이러한 상태의 예는 신장암, 폐암, 갑상선암, 전립선암, 다발성 골수종, 유방암, 폐경기후 골다공증과 같은 골다공증, 파제트병, 류마티스성 관절염 또는 머리 및 목의 편평상피암을 가진 대상에서의 골용해성 질병 및/또는 골 손실 또는 파괴를 포함한다.

세포 또는 동물에 투여되는 상기 제제의 양은 파골세포형성 억제 및/또는 파골세포 활성화 감소에 유효한 양일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "억제"는 상기 제제의 부재하에서 보여지는 생물학적 활성의 탐지가능한 감소 및/또는 제거를 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 상기 명시된 효과를 달성하기 위해 필요한 제제의 양을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 대상에서 증상을 감소 또는 완화시키는 것, 증상의 악화 또는 진행을 예방하는 것, 또는 그것의 진행이 파골세포형성 및/또는 파골세포 활성화에 의존하는 장애의 예방을 나타낼 수 있다. 이러한 장애의 예는 신장암, 폐암, 갑상선암, 전립선암, 다발성 골수종, 유방암, 폐경기후 골다공증과 같은 골다공증, 파제트병, 류마티스성 관절염 또는 머리 및 목의 편평상피암을 가진 대상에서의 골용해성 질병 및/또는 골 손실 또는 파괴를 포함한다.

세포 배양액 또는 동물에 투여될 수 있는, CGT 억제제 및 글루코시다제 억제제 두 가지 모두인 제제의 양은 바람직하게 그것의 투여가 동반하는 장점보다 더 큰 어떠한 독성 효과를 유발하지 않는 양이다.

약제학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 용량 정도는 특정한 환자에 대한 바람직한 치료학적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 화합물(들)의 양을 투여하기 위해서 변할 수 있다.

선택되는 용량 정도는 제제의 활성, 투여 경로, 치료받을 상태의 심각성 및 치료받을 환자의 이전 병력 및 상태에 의존할 수 있다. 하지만, 바람직한 치료학적 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 정도에서 화합물(들)의 용량을 시작하고 바람직한 효과가 달성될 때까지 점차적으로 용량을 증가시키는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 바람직하다면, 유효한 일일 용량을 예를 들어 하루 2 내지 4회 용량과 같이, 투여 목적으로 다수회 용량으로 나눌 수 있다. 하지만, 임의의 특정한 환자에 대한 특정한 용량 정도는 체중, 일반적 건강, 식단, 투여 시간 및 경로 및 다른 치료제와의 병용 및 치료받을 상태 또는 질병의 심각성을 포함하는 다양한 요인에 의존할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 성인의 하루 복용량은 체중 10 킬로그람 당 약 1 마이크로그람 내지 약 1 그람, 또는 약 10 mg 내지 100 mg 범위의 제제일 수 있다. 물론, 세포 또는 동물에 투여되어야 하는 제제의 양은 제제의 분자량 및 투여 경로와 같은, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 요인에 의존할 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 경구용 고형 제형, 안과, 좌제, 에어로솔, 국소 또는 다른 유사한 제형으로 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 분말, 정제, 캡슐, 로젠지, 겔, 용액, 현탁액, 시럽 등의 물리적 형태일 수 있다. 활성 제제 이외에, 이러한 약제학적 조성물은 약물 흡수를 향상 및 촉진시키는 것으로 알려진 다른 성분 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 나노입자, 리포좀 재밀봉 적혈구 및 면역학적 기초 시스템과 같은 다른 가능한 제형들 또한 상기 제제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 동맥내, 척추강내 및 주사 및 주입 기술을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 예로써, 약제학적 조성물은 경구, 국소, 비경구, 전신, 또는 폐 경로로 투여될 수 있다.

이러한 조성물은 단일 용량 또는 다른 시간에 투여되는 복수회 용량으로 투여될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예로 더 상세하게 실증될 수 있지만, 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

실시예

다발성 골수종(MM)은 형질 세포(PC)의 클론 확장(clonal expansion) 및 쇄약하게 하는 골용해성 골 질병으로 특징되는 불치성 악성 장애이다. 일부 경우에서, MM은 시간이 지나 MM으로 변형될 수 있는 단일클론성 감마글로불린혈증(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)으로 불리는 무증상, 전악성 장애로 시작할 수 있다. 유전적 결함 및 악성 PC와 미세환경의 크로스토크(crosstalk)는 MM의 생물학적 거동에 대해 아마도 어느 정도 책임이 있다.

MM의 유전적 기초 및 미세환경의 역할

IgH 인핸서(enhancer) 요소를 포함하여 종종 염색체의 전좌의 결과로써, 다른 종양 유전자, 특히 싸이클린 D1, 2 또는 3의 과발현은 MM에서의 일차 유전적 사건일 수 있다. 이것은 심지어 MGUS 환자에게서도 발견될 수 있다(문헌[히데시마(Hideshima) 등, Nature Reviews in Cancer 2, 927-937, 2002]; 문헌[히데시마 등, Blood 104, 607-618, 2004]). 질병 진행은 C- MYC 탈조절(deregulation) 및 P53 또는 RB-관련 유전자와 같은 종양 억제 유전자의 불활성화와 같은 추가적인 유전적 변화의 발생에 의존할 수 있다(문헌[히데시마 등, Nature Reviews in Cancer, 상기와 같음]; 문헌[히데시마 등, Blood, 상기와 같음]; 문헌[미츠시아즈스(Mitsiades) 등, Proceedings of the National Academy of Science USA 101, 540-545 2004]).

MM 세포와 골수 줄기세포 및 골아세포(OB)의 직접적 상호작용은 자가- 또는 측분비 방식으로 종양 자체의 생존 및 성장을 촉진시킬 수 있는 많은 시토카인의 생산 및 골 질환의 결과를 가져오는 증가된 파골세포(OC) 활성에 대한 계기일 수 있다.

스트로마(stroma) 및 OB에 의해 분비된 가장 중요한 MM-영양 인자들 중의 하나인, IL-6은 Ras/Maf/MAPK 및 JAK/STAT3 경로 각각의 활성화에 의해 MM 세포 성장 및 생존을 촉진시킬 수 있다(문헌[히데시마 등, Nature Reviews in Cancer, 상기와 같음]; 문헌[히데시마 등, Blood, 상기와 같음]; 문헌[미츠시아즈스 등, Proceedings of the National Academy of Science USA, 상기와 같음]).

다른 시토카인 및 성장 인자들 중에서 무엇보다, 스트로마에 의한 인슐린 성장 인자(IGF-1) 및 TNFa의 증가된 분비의 결과로써, MM 세포에서의 전사 인자 NFkB의 체질성 활성화(문헌[바티(Bharti) 등, Blood, 103, 3175-3184 2004]; 문헌[바티 등, Journal of Biological Chemistry 279, 6065-6076 2004])는 종양 세포의 성장 및 세포사멸(apoptosis)에 대한 저항성에 중요할 수 있다(문헌[미츠시아즈스 등, Oncogene 21, 5673-5683 2002]). 프로테아좀 억제제 보르테조밉(bortezomib)에 의한 NFkB 활성화의 중단 및 그것의 중대한 임상적 활성은 골수종 PC의 생물학에서 NFkB의 중심이 되는 역할을 강조한다(문헌[히데시마 등, Journal of Biological Chemistry 277, 16639-16647, 2002). 그러므로, MM-미세환경의 분자적 상호작용의 더 깊은 이해는 새로운 치료법 개발을 위해 중요하다.

MM에서의 골 질병의 발병

골 항상성은 두 가지 유형의 세포, 골 재흡수 파골세포(OC) 및 골 형성 골아세포의 지속적이고 공동으로 작용하는 활동에 의해 달성될 수 있다. 질환의 가장 쇄약하게 하는 합병증들 중의 하나인, MM에서의 골용해성 골 파괴는 OC의 향상된 활성화 및 질환의 말기에서 OB 활성의 억제에 의해 야기될 수 있다. 이러한 과정이 MM세포와 OC 및 OB의 친밀한 물리적 근접성에 크게 의존하고 골수 또는 줄기 세포 유래의 가용성 인자에 의해 중재된다는 증거가 있다. 또한 MM 세포와 스트로마, OC 및 OB의 밀접한 상호작용이 적어도 질병의 초기 단계에서 골수종 생존 및 성장에 중요할 수 있다는 것을 제시하는 증거가 있다. 그러므로, 이러한 크로스토크의 파괴는 골 질환의 심각성 및 종양의 부담을 감소시키는 잠재력을 제공할 수 있다.

MM에서의 OC 활성화의 메커니즘

RANKL은 골 항상성에서 주요 OC-활성화 인자(OAF)로서 기능할 수 있는 가용성 시토카인 내에 있고/있거나 표면결합되어 있다(문헌[보일(Boyle) 등, Nature 423, 337-342], 문헌[와다(Wada) 등, Trends in Molecular Medicine 12, 17-25, 2006]). 스트로마 세포 및 OB 뿐만아니라 골수종 세포 자체에 의한 이것의 증가된 분비는 MM에서의 OC 활성화, 증가된 골 흡수 및 결과적으로 골용해 및 골 질병의 주된 메커니즘일 수 있다(문헌[드 리니어(De Leenheer) 등, Current Opinion in Pharmacology 4, 340-346, 2004]; 문헌[터포스(Terpos) 등, International Journal of Hematology 78, 344-348]). 증가된 RANKL은 종양 미세환경에서 뿐만아니라 MM 환자의 혈청에서도 또한 검출될 수 있으며, 이전에 보여진 것처럼, 증가된 RANKL/OPG(오스테오프로테게린, RANKL의 억제성 데코이(decoy) 수용체)는 불충분한 생존의 예측이 된다(문헌[터포스 등, Blood, 102, 1064-1069, 2003)]. 골수종-유래의 IL-7 세포에 의해 자극되는, T-세포는 또한 다발성 골수종에서 RANKL의 중요한 공급원이다(문헌[콜루치(Colucci) 등, Blood 104, 3722-3730, 2004]; 문헌[줄리아니(Giuliani) 등, Blood 100, 4615-4621, 2002]). RANKL 이외에, 골수종 미세환경에서 IL-3(문헌[리(Lee) 등, Blood 103, 2308-2315, 2004]) 및 VEGF(문헌[단크바르(Dankbar) 등, Blood 95, 2630-2636, 2000]; 문헌[나카가와(Nakagawa) 등, FEBS Letters 473, 161-164, 2000])과 같은 시토카인의 케모카인 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a)(문헌[아베(Abe) 등, Blood 100, 2195-2202, 2002]; 문헌[최(Choi) 등, Journal of Clinical Investigation 108, 1833-1841, 2001])의 증가된 분비는 증가된 파골세포 활성에 기여한다.

MM에서의 OB 억제의 메커니즘

억제된 OB 기능 및 감소된 골 형성 활성은 말기 MM에서의 골 질병에 기여하는 복합 인자일 수 있다. MM 환자의 골수 혈장 및 말초 혈액에서 증가된 것이 발견된 Wnt 경로 가용성 억제제, 딕코프(Dickkopf; Dkk)의 증가된 수준에 관심이 도출되었다. 정규 Wnt 경로가 OB 발달 및 기능에 요구되며, Dkk에 의한 이것의 억제는 MM에서의 OB 기능장애에 중요한 인자로 보인다. OB 기능장애는 또한 IL-3 및 HGF와 같은 MM 미세환경에서 과량으로 분비된 다른 가용성 인자에 의해 부여된다.

글리코스핑고리피드 및 악성

글리코스핑고리피드(GSL)는 세라마이드의 글리칸 변형으로 발생된 세포의 혈장 막을 구성하는 복합 지질이다(문헌[데흐로트(Degroot) 등, Seminars in Cell and Developmental Biology 15, 375-387, 2004]).

구조적으로 GSL는 조직마다 그리고 또한 분화 중 동일한 조직내에서도 다를 수 있다. 이러한 가변성은 세포막의 티로신 키나아제에 의해 개시되는 세포 신호화(signaling)의 변경, 세포 주기 조절 및 세포 사멸, 부착 및 이주를 포함하여 많은 세포내 과정에서 그것들의 다른 기능적인 역할들을 반영할 수 있다(문헌[데흐로트 등, supra]). 세포의 GSL 프로파일에서의 정량적 및/또는 정성적 변화는 악성 형질 변환의 특성일 수 있다(문헌[하코모리(Hakomori), Glycoconjugate Journal 17, 627-647, 2000]).

다수의 및 생체내 전임상 실험에서, 종양 관련 GSL이 종양 생존 및 성장, 전이, 혈관형성을 촉진하고 항종양 면역의 억제를 유도하는 많은 세포의 기능을 조절하는 것이 보여졌다(문헌[버클(Birkle) 등, Biochimie 85, 455-463, 2003]; 문헌[하코모리, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99, 10231-10233 2002]). 그러므로, 변형된 GSL 조성은 단지 악성 형질 변환과 연관된 중성적 과정일 수 없고; 대신에 제시된 종양의 임상적 거동에 중요한 세포내 과정에 참여하고 이를 향상시킬 수 있다.

파골세포 발달 기능 및 GSL

GM1이 지질 래프트(lipid raft)에서 RANKL 수용체, RANK와 함께 세포내 위치할 수 있는 반면에, 락토실세라마이드, GM2 및 GM3는 성숙한 파골세포의 주된 GSL 구성성분일 수 있다. 글루코실세라마이드 합성효소 억제제 d-PDMP에 의한 GSL 합성의 억제 또는 지질 래프트의 화학적 파괴는 OC 발달을 막을 수 있다. 또한 MM의 골 질환의 발병과 관련하여, 이와모토 등은 RANKL 의존성 파골세포형성에서 외인성 락토실세라마이드의 시험관내 시너지 효과를 입증하였다(문헌[이와모토 등, Journal of Biological Chemistry 276, 46031-46038, 2001]).

요약

세라마이드 글루코실트랜스퍼라제(CGT) 억제제인 이미노슈가는 종양 유래, 전-파골세포성 GSL의 발생을 억제함으로써 뿐만아니라 새로운(de novo) OC GSL 합성 및 이에 따른 OC 활성화를 억제함으로써 OC 활성화를 감소시키는데 유용할 수 있다. 그러나, CGT 억제제로 알려진 PDMP는 효과적이나, 더 선택적인 이미노슈가 억제제, NB-DGT(문헌[앤더슨(Andersson) 등, Biochemical Pharmacology 59, 821-829, 2000)는 현저하게 덜 강력하기 때문에, 이 메카니즘은 NB-DNJ를 사용한 활성화의 감소를 완전히 설명하지 못한다. NB-DNJ를 포함하는 데옥시노지리마이신(DNJ) 유사체는 CGT에 대한 이들의 억제 활성 이외에 α- 및 β-글루코시다제 모두의 억제 활성을 가진다(문헌[피아트(Platt) 등, Journal of Biological Chemistry 269, 27108-27114, 1994]). DNJ 이미노슈가에 의한 파골세포 활성화의 감소는 하나 초과의 공지된 메카니즘이 활성화 경로에서 역할을 할 수 있다는 것을 제시할 수 있다.

많은 이미노슈가가 CGT 및 글루코시다제 억제제로 알려졌고(문헌[버터스(Butters) 등, Chemical Reviews 100, 4683-4696, 2000]), 한, N-부틸-데옥시노지리마이신(NB-DNJ)은 고셰병에서 GSL의 리소좀 축적을 조절하기 위해 GSL 생합성을 감소시키는데 임상적 유용성을 발견했다. 이러한 이미노슈가는 파골세포 활성화가 질병 확산에서 일차 효과일 수 있는 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 이러한 장애의 한 예는 상당한 골 파괴가 관찰되는 MM일 수 있다.

도 1은 선택된 이미노슈가에 의한 RANKL-의존성 파골세포형성의 시험관내 억제에 대한 자료를 보여준다.

A. 쥐 골수세포를 4 일 동안 96-웰 플레이트(well-plate)에서 50 ng/ml의 RANKL과 함께 및 d-PDMP(1.25, 5 또는 20 μM), NB-DNJ(N-부틸-데옥시노지리마이신), NB-DGJ(N-부틸-데옥시갈락토노지리마이신), 또는 N-OD-DNJ(N-옥타데실-데옥시노지리마이신)(5, 50 또는 500 μM)과 함께 또는 없이, 25 ng/ml의 M-CSF(대식세포 콜로니 자극 인자)의 존재하에서 배양했다. 플라스틱 판 위에 배양액을 고정하고 TRAP(타르트레이트 저항성 산 포스페이트)으로 염색했다. TRAP 양성 다핵성 (>3 핵) 파골세포를 수를 세었다.

B. 쥐 골수세포를 48-웰 플레이트에서 50 ng/ml의 RANKL과 함께 25 ng/ml의 M-CSF의 존재하에서 배양했다. 3 일차, d-PDMP(1.25, 5 또는 20 μM), NB-DNJ, NB-DGJ, 또는 N-OD-DNJ(5, 50 또는 500 μM)를 첨가했다. 고정하고 TRAP으로 염색하기 전에 또 다른 24 시간 동안 세포를 배양했다. 4 일차, 성숙한 TRAP 양성 파골세포를 세었다(왼쪽). 4 일차 파골세포의 형태학. 파골세포 및 F-액틴을 각각 입증하기 위해 TRAP 또는 팔로이딘(phalloidin)으로 세포를 염색했다.

도 2는 선택된 이미노슈가에 대한 파골세포형성 중 MAPK 시그널링 및 NFATc 활성화의 억제에 대한 자료를 보여준다.

BMC를 3 일차까지 배양하고 그리고는 하룻밤 동안 0.5 % 혈청 배지에서 스타빙(starving) 시켰다. 세포를 명시된 시간 동안 RANKL(A) 또는 M-CSF(B)로 처리했고 그리고는 α-pERK1/2, α-pP38, α-pJNK 항체로 면역 블럿팅(immunoblot) 하였다. 막을 벗기고 α-ERK, α-P38, α-JNK 항체로 재염색했다. NB-DNJ로 처리시에 p38 및 더 적은 정도의 ERK 및 JNK의 M-CSF 및 RANKL-의존성 인산화가 관찰된다. C. 하룻밤 동안 혈청 스타빙시킨 OC를 명시된 것처럼 처리하고 이어서 항-NFATc1으로 염색하고 면역형광현미경검사(immunofluorescent microscopy)로 관찰했다. NB-DNJ는 핵 내에서 NFAtcl의 M-CSF+RANKL 유도 축적을 없앴다. (D) BMC를 M-CSF, RANKL 및 NB-DNJ의 상이한 조합으로 48 시간 동안 배양했다. 세포를 모으고 핵 단백질을 추출하고 NFATc1 발현을 웨스턴 블럿(Western blot)으로 확인했다. 히스톤-1의 염색을 로딩(loading) 대조군으로 제공했다. NB-DNJ의 존재하에서, 상당히 더 적은 핵의 NFTc1이 관찰된다.

도 3은 Src 및 TRAF6와 래프트의 회합의 글리코스핑고리피드 변태에 관한 자료를 보여준다.

RAW 264.7 쥐과 대식세포에서의 지질 래프트(3-5 부분) 또는 비-래프트 부분(7-9 부분)의 국지의 TRAF6, Src, 및 GM1 강글리오사이드(Ganglioside)를 4 일 동안 48-웰 플레이트에서 오직 배지에서만(대조군), 50 ng/ml의 RANKL 또는 RANKL+NB-DNJ의 존재하에서 배양했다. 세포 용해물을 불연속적인 수크로오스 구배 이용한 초원심분리(discontinuous sucrose gradient ultracentrifugation)를 사용하여 만들고 분리하였다. 총 9 개의 부분(각각 1 ml)을 구배의 위에서부터 바닥까지로 부터 모았고 2 내지 5 부분은 GM1 강글리오사이드에 대해 양성, 즉 지질 래프트을 포함했다. 비-래프트 부분은 7 내지 9였다. RANKL없이, TRAF6는 비-래프트 부분에 국한하지만, Src는 래프트 및 비래프트 부분 모두에서 보여진다. RANKL 처리 후에, TRAF6를 래프트 부분에서 검출했고 Src는 거의 완전히 래프트 부분으로 이동했다. NB-DNJ의 존재하에서, TRAF6 및 Src는 래프트으로부터 제외되고 따라서 RANKL과 상호작용할 수 없다.

도 4 A-B는 선택된 이미노슈가에 의한 갈락토실세라마이드 및 RANKL에 의한 파골세포 활성화의 생체내 억제에 대한 자료를 보여준다.

A. NB-DNJ는 혈청 CTX 수준에 의해 반영된 것처럼 α-갈락토실세라마이드-유도 OC 활성화를 억제한다. NB-DNJ (500 mg/Kg) 또는 PBS를 8 주 지난 C57BL/6 쥐에 연속된 6 일 동안 하루에 한번 복강내(i.p.) 주사했다. 알파-갈락토실세라마이드 또는 PBS를 3 일차에 2 μg 의 단회 i.p. 주사로 투여했다. 7 일차에 모은 혈청을 카복시말단의 가교결합 텔로펩티드(telopeptide)의 유형 1 콜라겐(CTX) 수준을 결정하기 위해 사용했다(n=4-5, 8주 지난 암컷 C57BL/6 쥐).

B. NB-DNJ는 혈청 CTX 수준에 의해 반영된 것처럼 RANKL-유도 OC 활성화를 억제한다. 상기와 같이 NB-DNJ의 동일한 스케쥴을 사용했고 RANKL를 3 일차에 4 mg/일 i.p. 투여했다(n=2).

도 5 A-B는 다발성 골수종(MM) 환자에서의 GSL의 질량 스펙트럼 프로파일을 보여준다. 프로파일은 MM에서 GM2 및 GM3가 가장 일반적인 GSL임을 드러낸다.

(A) MM 환자 CD138⁺ 및 (B) MM 환자 CD138^- 골수세포로부터 더 위 단계의 GSL. GSL의 프로파일은 C₁₈ 셉팩(Sep-Pak)으로부터 80 %(왼쪽 판) 및 100 % 프로판올(오른쪽 판) 부분으로부터 온다. 삽입 도표는 GM₃ 덩어리 지역의 줌 스캔(zoomed scan)에 상응한다.

GSL은 d-에리쓰로-스핑고신을 스핑고신 염기로 간주할 때, 지질형태 부분을 위한 지방산의 조성물 및 글리칸 부분을 위한 카툰(Cartoon) 구조로 명시된다. 카툰 구조는 기능성 글리코믹스 컨소시움(Consortium for Functional Glycomics)(http://www.functionalglycomics.org) 기준에 따른다. 지방산 조성물은 카툰 구조 바로 아래에 명시된다. 비할당 피크는 화학적 유도체화 가공물 및/또는 GSL에 상응하지 않는 구조에 상응한다. 모든 분자 이온은 [M+Na]⁺이다. 글리칸 부분의 구조적 배치는 단당류 조성물, 탠덤(tandem) 질량 분석법 및 생합성 경로의 지식을 기초로 한다.

도 6 A-E는 파골세포형성을 촉진하는데에 GM3가 RANKL 및 IGF-1과 협력하는 것을 입증하는 자료를 보여준다.

A. 쥐 골수세포를 4일 동안 48-웰 플레이트에서 50 ng/ml의 RANKL 및 GM3 (0.05, 0.5 또는 5 μΜ)과 함께 25 ng/ml의 M-CSF 존재하에서 배양했다. 플라스틱 판 위에 배양액을 고정하고 TRAP으로 염색했다. TRAP 양성 성숙 파골세포를 세었다.

B. IGF-1은 파골세포형성을 촉진한다. 뿐만아니라 명시된 농도로 RANKL+M-CSF, IGF-1를 첨가했다.

C. 파골세포형성을 촉진하는데 IGF-1는 GM3과 협력한다. OC는 RANKL+M-CSF(대조군), 또는 이러한 두 가지 시토카인 플러스 IGF-1, GM3 또는 IGF-1+GM3의 존재하에서 발달했다.

D. OC를 3 일차까지 M-CSF+RANKL과 함께 배양했고 그리고는 0.5 % 혈청 배지에서 하룻밤 동안 스타빙 시켰다. 세포를 명시된 시간 동안 GM3 또는 GM3+NB-DNJ로 처리했고 그리고는 α-pERK1/2, α-pP38, α-pJNK 항체로 면역 블럿팅하였다. 막을 벗기고 α-ERK, α-P38, α-JNK 항체로 재염색했다. GM3는 NB-DNJ에 의해 제거된 효과, EER, P38 및 JNK의 인산화를 촉진한다.

E. 하룻밤 동안 혈청-스타빙시킨 OC를 M-CSF, RANKL 또는 GM3로 처리했고 명시된 시간 지점에서 NFATc1에 대한 면역 블럿팅을 수행했다. GM3는 M-CSF 및 RANKL 만큼 탈인산화된(더 아래의 띠) 활성 형태로 전사된 NFATc1에 대해 효과적이다.

[표 1]

* 은 GSL의 글리칸 부분에 상응한다.

** % 상대적 강도를 하기와 같이 계산하였다: 모든 스펙스럼을 피크 탈동위(deisotoping)화 시켰다. 모든 가능한 세라마이드 부분(지질 형태)을 가지는 동일한 글리칸 부분에 상응하는 모든 GSL의 % 상대적 강도를 합하였다. 동일한 스펙트럼의 모든 GSL의 합쳐진 % 상대적 강도를 최대 상대적 강도(100%)로 표준화시켰다.

결론

다발성 골수종(MM)에서, 형질 세포의 악성, 악성 세포 및 그것들의 미세환경, 특히 파골세포(OC)를 포함하는 자가분비 및 측분비 네트워크는 질환 발병에서 중대한 역할을 할 수 있다. OC 활성화 및 골 파괴는 이러한 질병에서 흔하고 엄청난 손상을 가하는 사건이다. 종양 유래 글리코스핑고리피드(GSL)는 종양 성장, 혈관신생, 면역 회피 및 전이를 촉진하여 종양 미세환경을 변경시키는 것으로 보여진다. OC 발달 및 활성화에서의 MM 유래 GSL의 역할을 조사하였고 OC 발달에서의 새로운 GSL 합성의 역할을 규명했다. MALDI-TOF MS 및 MS-MS를 사용하여(표 1 및 도 5 참고), 일차 CD 138+ 골수세포(n=3)의 GSL 목록을 결정했고 그것을 비-골수종 골수세포(즉, CD138+ 세포 부재)(n=3) 및 다양한 골수종 세포주(n=5)와 비교했다.

GM3는 일차 골수종 세포에서, GM2/GM3는 골수종 세포주에서 우세한 GSL로 밝혀졌고; 대조적으로, 비골수종 골수에서 비극성 락커(LacCer)가 우세한 GSL이였다. GM3가 골수종 세포에서 우세한 GSL이였기 때문에, 파골세포 기능에 대한 효과를 시험했다(도 6). 외인성 GM3은 시험관내에서 쥐의 골수 OC의 성숙을 유도하는 M-CSF 및 RANKL의 능력을 시너지에 의해 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 면역 블럿팅에서 보여지는 것처럼, 이것은 RANKL에 반응한 OC 분화 및 성숙에 요구되는 각각의 증가된 ERK1/2, p38, JNK 인산화 및 NFATc 탈인산화, 신호 변환 및 전사 사건과 관련되어 있다. 게다가, GM3는 골수종 성장 및 OC 활성화를 촉진시키는 것으로 알려진 성장 인자, IGF-1과 시너지로 OC 성숙을 추가로 향상시켰다(도 6 참고). 다음으로, 파골세포형성에서 새로운 GSL 생합성의 억제의 효과를 시험했다. 글루코오스 세라마이드 합성효소 억제제(CGT), NB-DNJ는 OC 분화 배양 초기 또는 도중에 첨가될 때, 용량 의존 방식으로 쥐 뿐만아니라 사람의 단핵구 유래 OC의 RANKL- 및 M-CSF-의존성 발달을 억제시키는 것으로 밝혀졌다(도 1). 이 효과는 ERK, JNK 및 p38의 상당히 감소된 RANKL- 및 M-CSF-의존성 인산화 뿐만아니라 핵에서의 NFATc의 감소된 국부화와 관련되었다(도 2). RANKL-RANK 상호작용에 대한 반응으로 OC 발달은 하류 신호화에 중대한 어댑터 TRAF6, 및 액틴 고리 형성 및 OC 재흡수 활성에 요구되는 cSrc와 상호작용하는 지질 래프트로의 RANK의 이동을 요구한다. 래프트의 마커로써 GM1 및 수크로오스 구배 막 분리를 사용하여, GCS 억제제가 발달하는 파골세포에서 지질 래프트의 일체성을 부분적으로 파괴하고 지질 래프트에서 TRAF6 및 Src의 RANKL 유도 국부화를 막는다는 것을 발견했다(도 3). 선천적 면역 반응을 빠르게 활성화시키는 것으로 알려진 변하지 않는 NKT 세포 리간드, 알파-갈락토실세라마이드(αGC)의 단일 주입에 의해 야기되는 OC 활성화를 막는 NB-DNJ의 능력에 대한 분석을 생체내에서 수행했다(도 4). αGC를 받은 쥐에서는, 혈청 C-텔로펩티드 유형 Ⅰ콜라겐(CTX) 수분이 ~50 %(p<0.01)로 증가했고, 반면에 αGC 플러스 NB-DNJ가 동시 주입(3 일 동안 매일 i.p)된 쥐에서는, CTX 수준이 기준치(p<0.01)로 되돌아 갔고, NB-DNJ만 받은 쥐에서는, CTX 수준이 운반체 대조군(p>0.05)과 크게 다르지 않았다(도 4 참고). 함께 고려해볼 때, 이러한 자료는 OC 분화 및 활성화를 촉진시키는 데에 있어서 GSL의 새로운 역할을 입증한다. 그러므로, 특정한 이미노슈가 억제제는 종양 유래 전-파골세포성 GSL의 발생을 예방함으로써, 뿐만아니라 새로운 OC GSL 합성 및 이에 따른 OC 활성화를 억제함으로써 MM에서의 OC 활성화 및 골 파괴를 감소시키는데 유용할 수 있다.

비록 전술한 내용이 특정 바람직한 실시태양을 언급한 것이지만, 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 다양한 변형이 개시된 실시양태에 가해질 수 있고 그러한 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 출원 및 특허는 전문으로써 본원에 참고문헌으로 인용된다.

Claims (28)

1. 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제인 제제의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 파골세포형성을 억제 및/또는 파골세포 활성화를 감소시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제제가 이미노슈가인 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 제제가 화학식 Ⅰ의 화합물, 이의 전구약물 또는 약제학적으로 허용가능한 염인 것인 방법.
   

   

   (Ⅰ)
   (여기서 R¹은 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐, 아실, 아랄킬, 아로일, 알콕시기, 아랄콕시기 및 헤테로시클릭기로부터 선택되고 R², R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 아실기, 알카노일기, 아로일기, 및 할로알카노일기로부터 선택됨)
4. 제3항에 있어서, 상기 R², R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 수소인 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 R¹은 C₁-C₂₄ 알킬기인 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 R¹은 C₂-C₁₂ 알킬기인 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 R¹은 C₃-C₅ 알킬기인 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 R¹이 부틸인 것인 방법.
9. 제5항에 있어서, 상기 R¹이 C₁₄-C₂₂ 알킬기인 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 R¹이 C₁₇-C₂₀ 알킬기인 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 R¹이 옥타데실인 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 대상이 사람인 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 대상이 다발성 골수종, 신장암, 폐암, 갑상선암, 전립선암, 유방암, 골다공증, 파제트병, 류마티스성 관절염 및 머리 및 목의 편평상피암으로부터 선택된 상태를 가지고, 상기 투여가 대상 내에서 상기 상태와 관련된 골 파괴를 감소시키는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 대상이 다발성 골수종을 가지는 것인 방법.
15. 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제인 제제의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 골용해성 활성 및/또는 골 손실을 감소 또는 예방하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 제제가 이미노슈가인 것인 방법.
17. 제15에 있어서, 상기 제제가 화학식 Ⅰ의 화합물, 이의 전구약물 또는 약제학적으로 허용가능한 염인 것인 방법.
    

    

    
    (여기서 R¹은 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐, 아실, 아랄킬, 아로일, 알콕시기, 아랄콕시기 및 헤테로시클릭기로부터 선택되고 R², R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 아실기, 알카노일기, 아로일기, 및 할로알카노일기로부터 선택됨)
18. 제17에 있어서, 상기 R², R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 수소인 것인 방법.
19. 제18에 있어서, 상기 R¹은 C₁-C₂₄ 알킬기인 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 R¹은 C₂-C₁₂ 알킬기인 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 R¹은 C₃-C₅ 알킬기인 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 R¹이 부틸인 것인 방법.
23. 제19항에 있어서, 상기 R¹이 C₁₄-C₂₂ 알킬기인 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 R¹이 C₁₇-C₂₀ 알킬기인 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 R¹이 옥타데실인 것인 방법.
26. 제15항에 있어서, 상기 대상이 사람인 것인 방법.
27. 제15항에 있어서, 상기 대상이 다발성 골수종, 신장암, 폐암, 갑상선암, 전립선암, 유방암, 골다공증, 파제트병, 류마티스성 관절염 및 머리 및 목의 편평상피암으로부터 선택된 상태를 가지고, 상기 골용해성 활성 및 골 손실이 상기의 상태에 의해 야기되는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 대상이 다발성 골수종을 가지는 것인 방법.
    
    

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