JP2008513484A - リソソーム酵素欠損症のための組成物およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
リソソーム蓄積症(LSD)は、特定のリソソーム酵素、受容体標的、活性化タンパク質、膜タンパク質、または輸送体の細胞における欠損に起因する約50種の遺伝性代謝疾患のグループであり、リソソームにおける物質の病原性の蓄積を招き、その基質の蓄積を引き起こし、結果として細胞および組織の機能の劣化を生じる。Wilcox, W.R., Lysosomal storage disorders: the need for better pediatric recognition and comprehensive care.J Pediatr. 2004 May; 144(5 Suppl):S3-14。リソソーム蓄積症は、生児出生5,000件に約1件発生し、相当な臨床的および生化学的異質性を提示する。リソソーム蓄積症の大多数は常染色体劣性疾患として遺伝するが、X連鎖の2つの例はMPS IIおよびファブリー病である。
リソソーム障害は、本発明の組成物および方法を用いた経口投与による、欠損遺伝子のマクロファージを標的とした発現を通じて治療することができる。好ましい態様において、リソソーム酵素を発現するプラスミドDNAが、カチオン性ポリマー-DNAナノ複合体の形態で、酵母グルカン粒子(YGP)および酵母グルカン-マンナン粒子(YGMP)中に組み込まれる。これらのYGP-DNA微粒子およびYGMP-DNA微粒子は、粒子表面のグルカンおよびマンナン多糖体に結合する炭水化物受容体を介した、組織、粘膜、および腸管関連リンパ組織(GALT)のマクロファージ中への受容体媒介取込みによって、全身的に、経粘膜的に、および経口的に生物利用可能である。食作用が起こると、これらの粒子はエンドソーム区画中に包み込まれ、そこでカチオン性ポリマーがDNAを放出し、かつエンドソームを膨張させて細胞質中へDNAを放出する。YGP-DNA製剤およびYGMP-DNA製剤中に賦形剤を混合すると、エンドソームのDNA放出および核による取込みが促進される。欠損タンパク質を発現するDNAの送達は、その欠損タンパク質の活性の補充、好ましくは回復をもたらし、かつ有毒な蓄積された貯蔵産物の分解を触媒する。
本発明は、β-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含む組成物であって、ペイロード分子およびペイロード閉じ込め分子が同じ溶媒系に可溶であり、欠損したリソソーム酵素の機能をペイロード分子が補う組成物を提供する。本発明はさらに、この組成物を作製する方法および使用する方法も提供する。
「対象」とは、哺乳動物および非哺乳動物を意味する。「哺乳動物」とは、限定されるわけではないが、ヒト、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、およびブタなどの農場動物;ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜;ラット、マウス、およびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物;ならびに同種のものを含む哺乳綱の任意のメンバーを意味する。非哺乳動物の例には、トリなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。「対象」という用語は、特定の年齢も性別も示さない。
ペイロード閉じ込め分子は、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤である。ペイロードおよび閉じ込め分子は、双方とも溶媒系に可溶である;この溶媒系は、酵母細胞粒子の炭水化物マトリックスを通って吸収され、ペイロードおよび閉じ込め分子の吸収を可能にさせなければならない。ペイロードおよび閉じ込め分子は、好ましくは水溶性である。好ましい態様において、閉じ込め分子は生分解性である。
本発明の粒子送達系は、限定されるが、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、siRNA、酵素的RNA、および発現ベクターを含む組換えDNA構築物などの核酸を含む、ペイロード分子のインビボまたはインビトロの送達に有用である。
好ましい態様において、本発明の粒子送達系は、ワクチンの経口送達を提供する際に有用である。好ましい態様において、本系は、淋菌(Neisseria gonorrhea)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ヘルペスウイルス(Herpes virus)(ヒト(humonis)1型および2型)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、ヘモフィルス・バジナリス(Haemophilus vaginalis)、B群連鎖球菌種(Group B Streptococcus sp.)、マイクロプラズマ・ホミニス(Microplasma hominis)、軟性下疳菌(Hemophilus ducreyi)、グラヌローマ・イングイネル(Granuloma inguinale)、リンホパチア・ベネレウム(Lymphopathia venereum)、梅毒トレポネ−マ(Treponema pallidum)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、カンピロバクター・フィタス・インテスチナリス(Campylobacter fetus intestinalis)、レプトスピラ・ポモナ(Leptospira pomona)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ブルセラ・オビス(Brucella ovis)、ウマヘルペスウイルス1型、ウマ動脈炎ウイルス(equine arteritis virus)、IBR-IBPウイルス、BVD-MBウイルス、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、トリコモナス・フィータス(Trichomonas foetus)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、大腸菌(Escherichia coli)、アクチノバチルス・エクーリ(Actinobacillus equuli)、ヒツジ流産菌(Salmonella abortus ovis)、ウマ流産菌(Salmonella abortus equi)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、コリネバクテリウム・エクイ(Corynebacterium equi)、コリネバクテリウム・ピオゲネス(Corynebacterium pyogenes)、アクチノバチルス・セミニス、マイコプラズマ・ボビジェニタリウム(Mycoplasma bovigenitalium)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アブシジア・ラモサ(Absidia ramosa)、トリパノソーマ・エクイペルダム(Trypanosoma equiperdum)、バベシア・カバリ(Babesia caballi)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)などのような微生物の抗原などの抗原を送達するのに使用される。他の態様において、本系は、上記の微生物に対抗する中和抗体を送達するのに使用され得る。
好ましい態様において、本発明は、遺伝的障害または遺伝的要素を有する状態を治療するための組成物および方法を提供する。さらに好ましい態様において、本発明は、遺伝的障害または遺伝的要素を有する状態を治療するための薬学的製品の製造に有用な組成物を提供する。
このタイプは、1つの遺伝子のDNA配列中で生じる変化または変異によって引き起こされる。遺伝子は、タンパク質、すなわち作業の大半を実施し、大半の生命機能を果たし、かつさらには細胞構造体の大部分を構成する分子をコードしている。ある遺伝子が変異して、そのタンパク質産物がその正常機能をもはや果たさない場合、障害が結果として起こり得る。6,000種を超える公知の単一遺伝子性障害があり、出生200件毎に約1件発生する。いくつかの例は、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、マルファン症候群、ハンチントン病、および遺伝性ヘモクロマトーシスである。
このタイプは、環境要因および複数の遺伝子中の変異の組合せによって引き起こされる。例えば、乳癌の罹病性に影響する様々な遺伝子が、6、11、13、14、15、17、および22番染色体上で発見された。これは、性質がより複雑であるため、単一遺伝子性障害または染色体性障害よりも分析がより困難になっている。最も一般的な慢性障害のいくつかは、多因子性障害である。例には、心臓疾患、高血圧、アルツハイマー病、関節炎、糖尿病、癌、および肥満が含まれる。多因子性遺伝はまた、指紋、身長、眼色、および皮膚色などの遺伝的形質にも関連している。
染色体、すなわちDNAおよびタンパク質から構成される独特の構造体は、各細胞の核内に配置されている。染色体は遺伝物質の担体であるため、欠失したもしくは余分なコピー、または大きな切断および再結合(転座)のような染色体構造中の異常は、疾患をもたらし得る。いくつかのタイプの主要な染色体異常は、顕微鏡的検査によって検出することができる。ダウン症候群または21トリソミーは、人が21番染色体を3コピー有する場合に発生する一般的な障害である。
この比較的まれなタイプの遺伝的障害は、ミトコンドリアの非染色体性DNA中の変異によって引き起こされる。ミトコンドリアは、細胞呼吸に関与し、かつ植物細胞および動物細胞の細胞質中に存在する、小型の球形または棒状の細胞小器官である。各ミトコンドリアは、5〜10個の環状DNAを含み得る。
投与経路には、経口;口腔内、舌下、肺、経皮、経粘膜、ならびに皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、および筋肉内注射が含まれるがこれらに限定されるわけではない。好ましい投与経路は、経口;口腔内、舌下、肺、および経粘膜である。
本明細書において使用される場合、「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)という用語は、タンパク質に特異的に結合することができる完全な分子ならびに抗体断片(例えばFab断片およびF(ab')2断片など)を含むことが意図されている。Fab断片およびF(ab')2断片は、完全な抗体のFc断片を欠き、血液循環からより急速に消失し、かつ完全な抗体よりも少ない非特異的組織結合を有し得る。したがって、これらの断片、ならびにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物が好ましい。さらに、本発明の抗体には、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体が含まれる。
図1は、酵母細胞壁の横断面の概略図100である。外側から内側に向かって、外側の繊維層110、外側のマンノプロテイン層120、βグルカン層130、βグルカン層-キチン層140、内側のマンノプロテイン層150、形質膜160、および細胞質170を示す。
全グルカン粒子(WGP、ロットW0282)を予めAlpha-Beta Technologyから入手した。一般に、全グルカン粒子は、酵母細胞壁からアルカリ不溶性のグルカン画分を抽出および精製することによって酵母細胞から調製される。酵母細胞壁を粉砕せずに、細胞のタンパク質および細胞内部分を消化する水酸化物水溶液で酵母細胞を処置して、著しいタンパク質混入が無く、かつβ(1-6)結合グルカンおよびβ(1-3)結合グルカンからなる不変の細胞壁構造を実質的に有するグルカン壁成分を残す。フェドバッチ発酵条件下、最小培地中で酵母細胞(S.セレビシエ株R4)を中期対数期まで増殖させた。2000rpm、10分間のバッチ式遠心分離によって、細胞(乾燥細胞重量約90g/L)を回収した。次いで、これらの細胞を蒸留水中で1回洗浄し、次いで1M NaOH 1リットル中に再懸濁し、かつ摂氏90度まで加熱した。この細胞懸濁液をこの温度で1時間、勢いよく攪拌した。2000rpmで10分間遠心分離することによって、細胞壁を含む不溶性材料を回収した。次いで、この材料を1M NaOH 1リットル中に再懸濁し、かつ摂氏90度まで再度加熱した。この懸濁液をこの温度で1時間、勢いよく攪拌した。次いで、懸濁液を室温まで放冷させ、かつさらに16時間、抽出を継続した。2000rpmで10分間の遠心分離によって、不溶性残留物を回収した。摂氏75度で1時間、HClでpH4.5に調整した水1リットル中でこの材料を最後に抽出した。遠心分離によって不溶性残留物を回収し、かつ水200ミリリットルで3回、イソプロパノール200ミリリットルで4回、およびアセトン200ミリリットルで2回、洗浄した。結果として生じるスラリーをガラス製トレイに入れ、かつ減圧下、摂氏55度で乾燥させて、白色の細粉末7.7gを得た。
S.セレビシエ(Fleishmans Bakers yeast 100g)を1M NaOH 1リットル中に懸濁し、かつ摂氏55度まで加熱した。この細胞懸濁液をこの温度で1時間、混合した。2000rpmで10分間遠心分離することによって、細胞壁を含む不溶性材料を回収した。次いで、水1リットル中にこの材料を懸濁し、HClでpH4〜5に調整し、かつ摂氏55度で1時間、インキュベートした。遠心分離によって不溶性残留物を回収し、かつ水1000ミリリットルで1回、無水イソプロパノール200ミリリットルで4回、およびアセトン200ミリリットルで2回、洗浄した。結果として生じるスラリーをガラス製トレイに入れ、室温で乾燥させて、わずかに色味がかった白色の細粉末12.4gを得た。
S.セレビシエ(SAF-Mannan 75g)を水1リットル中に懸濁し、1M NaOHでpH12〜12.5に調整し、かつ摂氏55度まで加熱した。この細胞懸濁液をこの温度で1時間、混合した。2000rpmで10分間遠心分離することによって、細胞壁を含む不溶性材料を回収した。次いで、水1リットル中にこの材料を懸濁させ、HClでpH4〜5に調整し、かつ摂氏55度で1時間、インキュベートした。遠心分離によって不溶性残留物を回収し、かつ水1000ミリリットルで1回、無水イソプロパノール200ミリリットルで4回、およびアセトン200ミリリットルで2回、洗浄した。結果として生じるスラリーをガラス製トレイに入れ、室温で乾燥させて、わずかに色味がかった白色の細粉末15.6gを得た。
アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC、Manassas,VA)から入手した培養物に由来する酵母細胞(ロドトルラ(Rhodotorula)種)を摂氏30度、YPD中で定常期まで好気的に増殖させた。ATCCから入手可能なロドトルラ種培養物には、886番、917番、9336番、18101番、20254番、20837番、および28983番が含まれる。2000rpm、10分間のバッチ式遠心分離によって、細胞(1L)を回収した。次いでこれらの細胞を蒸留水中で1回洗浄し、次いで摂氏75度で1時間、HClでpH4.5に調整した水に再懸濁した。2000rpmで10分間遠心分離することによって、細胞壁を含む不溶性材料を回収した。次いで、この材料を1M NaOH 1リットル中に懸濁し、かつ1時間、摂氏90度まで加熱した。次いで、懸濁液を室温まで放冷させ、かつさらに16時間、抽出を継続した。2000rpmで15分間の遠心分離によって不溶性残留物を回収し、かつ水1000ミリリットルで2回、イソプロパノール200ミリリットルで4回、およびアセトン200ミリリットルで2回、洗浄した。結果として生じるスラリーをガラス製トレイに入れ、室温で乾燥させて、明るい茶色の細粉末2.7gを得た。
酵母細胞壁粒子の流体力学的体積を、粒子のペイロード容量の指標として測定した。風袋測定済の15ml遠心チューブ中で酵母細胞壁粒子の1gアリコートを計量して、乾燥粒子の重量を測定した。チューブに水(12.5ml)を添加し、かつそのチューブをボルテックスして酵母細胞壁粒子の懸濁液を混合した。これらの粒子を30分間膨潤させ、かつ水を吸収させた。粒子懸濁液を2000rpmで10分間遠心分離した。水を除去し、チューブを計量し、吸収された水の重量を算出した。吸収された水の重量と乾燥粒子の重量の比として、流体力学的体積を算出した。表3は、先行技術のWGPの2種の調製物ならびに本発明のYGPおよびYGMPの結果を示す。
取込み調査のために、蛍光標識した酵母グルカン粒子(YGP-F)および蛍光標識した酵母グルカン-マンナン粒子(YGMP-F)を調製した。出発原料は、以下のものであった:YGP 5ml(0.1Mホウ酸塩緩衝液、pH8中、5mg/ml)、YGMP 5ml(0.1Mホウ酸塩緩衝液、pH8中、5mg/ml)、新たに調製された、DMSO中ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)20mg/ml、および0.1Mホウ酸塩緩衝液、pH8。
カチオン性閉じ込めポリマーであるキトサンを用いてYGP粒子を調製した。高分子量(HMW)キトサン(分子量約70,000、Sigma Chemical St.Louis, Mo)または低分子量(HMW)キトサン(分子量約10,000、Sigma Chemical St.Louis, Mo)のいずれかを用いて、0.1M酢酸中1% w/vキトサン溶液を調製した。1% w/vのHMWキトサン溶液およびLMWキトサン溶液の双方を0.1M酢酸中で調製した。HMWキトサン溶液またはLMWキトサン溶液4mlを50ml円錐形遠心チューブ中のYGP2gに添加し、かつ滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を室温で1時間インキュベートして、液体を吸収させた。NaOH(40ml、0.1M)を各チューブに添加し、これを直ちにボルテックスして、YGPの内側にキトサンを沈着させた。YGP:キトサン懸濁液を18ゲージの針に通して、YGP:キトサン粒子の微細な懸濁液を作製した。遠心分離(2,000rpmで10分間)を実施し、続いて上清のpHが7〜8になるまで脱イオン水で沈殿物を洗浄することによって、YGP:キトサン粒子を回収した。次いで、YGP:キトサン粒子を沈殿物の2倍体積量のイソプロパノールで4回洗浄し、次いで沈殿物の2倍体積量のアセトンで2回洗浄した。次いで、YGP:キトサン粒子を室温、フード中で乾燥させた。この手順により、YGP:LMWキトサン粒子1.2gおよびYGP:HMWキトサン粒子1.4gが生じた。
生分解性のカチオン性閉じ込めポリマーであるCytoPure(商標)、すなわち登録商標を持つ市販の水溶性カチオン性ポリマートランスフェクション試薬(Qbiogene, Inc., CA)を用いてYGP粒子を調製した。CytoPure(商標)20μlを脱イオン水0.5ml中で希釈し、かつ50ml円錐形遠心チューブ中のYGP0.5gに添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を摂氏4度で15分間インキュベートして、液体を吸収させた。エタノール25mlを各チューブに添加し、これを直ちにボルテックスして、YGPの内側にCytoPure(商標)を沈着させた。このYGP:CytoPure(商標)懸濁液を超音波処理して、YGP:CytoPure(商標)粒子の微細な懸濁液を作製した。遠心分離(2,000rpmで10分間)を実施し、続いて沈殿物を沈殿物の2倍体積量のイソプロパノールで4回洗浄し、次いで沈殿物の2倍体積量のアセトンで2回洗浄することによって、YGP:CytoPure(商標)粒子を回収した。次いで、YGP:CytoPure(商標)粒子を室温、フード中で乾燥させた。この手順により、YGP:CytoPure(商標)粒子0.45gが生じた。
カチオン性閉じ込めポリマーとしてポリエチレンイミン(PEI)を用いてYGP粒子を調製した。PEI(分子量約50,000、Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)の2%w/v水溶液の0.5mlアリコートを50ml円錐形遠心チューブ中のYGP0.5gに添加し、かつ滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を室温で1時間インキュベートして、液体を吸収させた。エタノール25mlを各チューブに添加し、これを直ちにボルテックスして、YGPの内側にPEIを沈着させた。YGP:PEI懸濁液を18ゲージの針に通して、YGP:PEI粒子の微細な懸濁液を作製した。遠心分離(2,000rpmで10分間)を実施し、続いて沈殿物を沈殿物の2倍体積量のイソプロパノールで4回洗浄し、次いで沈殿物の2倍体積量のアセトンで2回洗浄することによって、YGP:PEI粒子を回収した。次いで、YGP:PEI粒子を室温、フード中で乾燥させた。この手順により、YGP:PEI粒子0.48gが生じた。
アニオン性閉じ込めポリマーとしてアルギナート(F200またはF200L、Multi-Kem Corp., Ridgefield, NJ)を用いてYGP粒子を調製した。アルギナートの1% w/v水溶液の2mlアリコートを50ml円錐形遠心チューブ中のYGP1gに添加し、かつ滑らかなペーストを形成するまで混合した。この混合物を室温で1時間インキュベートして、液体を吸収させた。この混合物を1% w/v塩化カルシウム水溶液40mlで希釈した。YGP:アルギナート懸濁液を18ゲージの針に通して、YGP:アルギナート粒子の微細な懸濁液を作製した。遠心分離(2,000rpmで10分間)によって、YGP:アルギナート粒子を回収した。YGP:アルギナート粒子を沈殿物の2倍体積量のイソプロパノールで4回洗浄し、次いで沈殿物の2倍体積量のアセトンで2回洗浄した。次いで、YGP:アルギナート粒子を室温、フード中で乾燥させた。この手順により、YGP:F200アルギナート粒子0.95gおよびYGP:F200Lアルギナート粒子0.86gが生じた。
閉じ込めポリマーとしてポリ-L-リシン(PLL)を用いてYGP粒子およびYGMP粒子を調製した。PLL(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)の1% w/v水溶液の4mlアリコートを50ml円錐形遠心チューブ中の1gのYGPまたはYGMPに添加した。この混合物を摂氏55度で30分間インキュベートして、液体を吸収させた。エタノール10mlを各チューブに添加し、これをホモジナイズして(Polytronホモジナイザー)、YGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子の微細な懸濁液を作製した。遠心分離(2,000rpmで10分間)によって、YGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子を回収した。YGP:PLLまたはYGMP:PLLを沈殿物の2倍体積量のイソプロパノールで4回洗浄し、次いで沈殿物の2倍体積量のアセトンで2回洗浄した。次いで、YGP:PLLまたはYGMP:PLLを室温、フード中で乾燥させた。この手順により、YGP:PLL粒子1.3gおよびYGMP:PLL粒子1.1gが生じた。顕微鏡的評価では、遊離したPLL凝集体は無く、YGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子のみが示された。
アニオン性閉じ込めポリマーとしてキサンタンを用いてYGP粒子およびYGMP粒子を調製した。1% w/vキサンタン水溶液の4mlアリコートを摂氏55度まで加熱して粘度を低下させ、かつ50ml円錐形遠心チューブ中の1gのYGPまたはYGMPに添加した。この混合物を摂氏55度で30分間インキュベートした。エタノール10mlを各チューブに添加し、これをホモジナイズして(Polytronホモジナイザー)、YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子の微細な懸濁液を作製した。遠心分離(2,000rpmで10分間)によって、YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子を回収した。YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子を沈殿物の2倍体積量のイソプロパノールで4回洗浄し、次いで沈殿物の2倍体積量のアセトンで2回洗浄した。次いで、YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子を室温、フード中で乾燥させた。この手順により、YGP:キサンタン粒子1.2gおよびYGMP:キサンタン粒子1.1gが生じた。顕微鏡的評価では、遊離したキサンタン凝集体は無く、YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子のみが示された。
上記の実施例7および9において説明したようにして、YGP:キトサン粒子およびYGP:アルギナート粒子を調製した。トリパンブルー(Benzamine blue; CI23850)、アニオン性色素、およびキシレンシアノール(アシッドブルー、カチオン性色素)の0.1% w/v水溶液を調製した。色素の0.1% w/v水溶液の50μlアリコートを微量遠心チューブ中の10mgのYGP、YGP:キトサン、またはYGP:アルギナートに添加し、かつこの混合物を室温で1時間インキュベートした。上清溶液の色が無くなるまで、沈殿物を脱イオン水で洗浄した。沈殿物の色を評価した;これらの結果を以下の表5に提示する。
YGP中にペイロードを閉じ込めるための手段としての物理的閉じ込めを評価するためにYGP:アガロースを調製した。アガロース(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)の2% w/v溶液をTE中で調製し、かつ摂氏50度まで冷却した。TE中1mg/mlサケ精子DNAストック溶液を摂氏50度で希釈して、TE中または1%アガロース中0.5mg/ml DNA溶液とした。YGPの500mgアリコートをTE中DNA 500μlまたはアガロース中DNA 500μlと摂氏50度で混合し、かつこの混合物を摂氏50度で1時間インキュベートした。次いでこの混合物を冷蔵装置中で1時間冷却してアガロースを凝固させた。1時間後に、TE10mlを添加し、かつこの混合物を冷蔵装置中で一晩インキュベートした。次いでこの混合物を遠心分離し、かつ上清中のDNAを260nmでの吸収度によって測定した。添加されたDNAの1%未満しか対照のYGP:TEによって保持されなかったのに対し、添加されたDNAの約80%超がYGP:アガロースによって保持された。これらの結果により、アガロースが、物理的閉じ込めによってYGPの内側にDNAを効果的に閉じ込めることが示唆される。
YGP中にペイロードを閉じ込めるための手段としての物理的閉じ込めを評価するためにYGP:ポリアクリルアミドを調製した。TE中1mg/mlサケ精子DNAストック溶液を希釈して、TE中または30%ポリアクリルアミド/ビス(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)中0.5mg/ml DNA溶液とした。TEMED(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)を各DNA混合物に添加し(DNA溶液5mlに対してTEMED 1μl)、かつ各溶液の2mlアリコートをYGP 1gに添加した。結果物を混合して均一な懸濁液を形成させ、かつ室温で3時間インキュベートした。3時間のインキュベーション後に、TE10mlを添加し、かつこの混合物を冷蔵装置中で一晩インキュベートした。次いでこの混合物を遠心分離し、かつ上清中のDNAを260nmでの吸収度によって測定した。添加されたDNAの1%未満しか対照のYGP:TEによって保持されなかったのに対し、添加されたDNAの約95%超がYGP:ポリアクリルアミドによって保持された。これらの結果により、ポリアクリルアミドが、物理的閉じ込めによってYGPの内側にDNAを閉じ込めるのに使用するのに有効な閉じ込めポリマーであることが示唆される。
比較的難溶性のテトラサイクリン-カルシウム塩を用いて、抗生物質テトラサイクリン(tet)をYGP中に充填した。使用した酵母細胞壁粒子は、前述したようにして調製したYGP、YGP:F200アルギナート、およびYGP:F200Lアルギナートであった。ストック溶液は、1M CaCl2および100mg/mlテトラサイクリンHCl(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)であった。以下の表6に要約するようにして充填混合物を準備した。これらの混合物を室温で30分間インキュベートし、次いで表に示すように脱イオン水または1M CaCl2を添加した。60分後、室温でこれらの混合物を超音波処理し、かつ少なくともさらに30分間、室温でインキュベートした。
上記の実施例13において説明したようにして、YGP:アルギナート-tetを調製した。ストック溶液1ml当たりのYGPおよびYGP:アルギナート-tetの粒子数は、それぞれ9×107/mlおよび6×108/mlであった。
治療用のペプチドもしくはタンパク質、ワクチン抗原、または他のペプチドもしくはタンパク質の保持、輸送、および送達のための本発明の送達系の有用性を、ウシ胎児血清の混合性タンパク質を用いて評価した。使用した酵母細胞壁粒子は、前述のようにして調製したYGP、YGP-PEI、およびYGP-キトサンであった。ストック溶液は、45ng/μlウシ胎児血清(FCS)(ウシ胎児血清、JRH Biosciences, Lenexa, KS)、TE中0.2%PEI(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)、0.05Mリン酸緩衝液、pH7.2(P緩衝液)、および0.05Mリン酸緩衝液、pH7.2、1M NaCl(P+塩緩衝液)であった。
YGP、低分子量(LMW)キトサンを含むYGP、または高分子量(HMW)キトサンを含むYGP中にサケ精子DNAを充填するいくつかの方法を評価した。
サケ精子DNA(Sigma, St.Louis, MO)を18ゲージの針に40回通してせん断し、かつ50mM TE(Tris-HCl、pH8、2mM EDTA)中で0.1mg/mlの濃度に希釈した。DNA溶液の充填量を測定し、かつ実施例2のような100mgアリコートのYGP、YGP:LMWキトサン、またはYGP:HMWキトサンと遠心チューブ中で二つ組で混合し、かつ1時間インキュベートした。インキュベートしたこれらの混合物を各チューブにエタノール1.5mlを添加することによってエタノール沈殿させた。2,000rpmで10分間の遠心分離によって、不溶性生成物を回収した。TE10mlを各チューブに添加し、摂氏37度で1時間インキュベートし、2,000rpmで10分間遠心分離して不溶性のYGPを沈降させ、かつ上清のDNA含有量を260nmでの吸収度によって測定した。YGP中に残存するDNAの量を算出した。
DNA溶液の充填量を実施例4aのような100mgアリコートのYGP、YGP:LMWキトサン、またはYGP:HMWキトサンと遠心チューブ中で二つ組で混合し、かつ1時間インキュベートした。TE10mlを各チューブに添加し、摂氏37度で1時間インキュベートし、2,000rpmで10分間遠心分離して不溶性のYGPを沈降させた。上清のDNA含有量を260nmでの吸収度によって測定した。YGP中に残存するDNAの量を算出した。
DNA溶液の充填量を実施例4のような100mgアリコートのYGP、YGP:LMWキトサン、またはYGP:HMWキトサンと遠心チューブ中で二つ組で混合し、かつ1時間インキュベートした。各チューブに2%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(臭化セチルトリメチルアンモニウムまたはCTABとしても公知)1.5ml溶液を添加することによって、インキュベートした混合物を沈殿させた。TE10mlを各チューブに添加し、これを摂氏37度で1時間インキュベートし、かつ2,000rpmで10分間遠心分離して不溶性のYGPを沈降させた。上清のDNA含有量を260nmでの吸収度によって測定した。YGP中に残存するDNAの量を算出した。これらの結果を以下の表10に提供する。
0.1M炭酸緩衝液、pH9.2中1mg/mlサケ精子DNA溶液1mlを10mM炭酸緩衝液、pH9.2中1mg/ml DTAF懸濁液100μlと混合することによって、蛍光性のサケ精子DNAを調製した。摂氏37度で一晩インキュベートした後、1M Tris-HCl、pH8.3、200μlを添加し、かつ室温で15分間インキュベートした。次いで、1M NaCl 100μlおよびエタノール3mlを添加して、DNAをエタノール沈殿させた。-20Cで一晩保存した後、10,000rpmで15分間の遠心分離によってエタノール沈殿物を回収した。このエタノール沈殿物を上清が透明になるまで70%エタノールで洗浄し、かつTE 1ml中に再懸濁した。
pIRESプラスミドを含むYGPを、J774細胞、すなわちマウスマクロファージ由来細胞株におけるコードされたEGFPのトランスフェクションおよび発現のために調製した。使用したカチオン性閉じ込め物質には、ポリエチレンイミン(PEI)、CytoPure(商標)、すなわち登録商標を持つ市販の水溶性カチオン性ポリマートランスフェクション試薬(Qbiogene, Inc., CA)、キトサンおよびカチオン性界面活性剤ヘキサデシルトリメチル-アンモニウムブロミド(CTAB)などのカチオン性ポリマーが含まれた。好ましいPEIはJetPEI、すなわち市販の直鎖ポリエチレンイミンカチオン性ポリマートランスフェクション試薬(Qbiogene、Inc.、CA)である。
本実施例ではpIRESプラスミドDNAを蛍光標識せず、むしろ、pIRESによってコードされた緑色蛍光タンパク質(GFP)の機能的発現を、蛍光の生成によって立証されるような、添加された酵母細胞壁粒子の取込み、pIRES DNAの細胞内放出、およびGFPの発現の証明として使用した。
以下の材料を使用した:YGP:蛍光性サケ精子DNA:PEI:CTAB粒子、YGP:蛍光性オリゴヌクレオチド:PEI:CTAB粒子、およびYGP:蛍光性siRNA:PEI:CTAB。蛍光性オリゴヌクレオチは、5'末端にフルオレセイン残基が結合された、Sigma Genosysによって合成された18 merであった:
5'フルオレセイン-TTGGTCATCCATGGCTCT 3' 配列番号:1。
蛍光性siRNAは、5'末端にフルオレセイン残基が結合された、21 merのサイレンシング活性を持たない対照の合成siRNAであった(Qiagen, Valencia, CA, Catalog No.1022079):
5'フルオレセイン-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3' 配列番号:2。
実施例18において前述したような方法を使用して、hGCを発現するプラスミドDNA(pMFG-GC)をマウスマクロファージ細胞株J774中に送達し、遺伝子産物、すなわちヒトグルコセレブロシダーゼの発現を実証した。使用する組成物は、前述したように調製した。これらを以下の表16に記載する。さらに、pIRESを含む酵母細胞壁粒子を含む製剤を前述したようにして調製した。
図8は、インビボの経口投与180後にマクロファージ遊走370によって様々な器官450、452、454、456、458に酵母βグルカン粒子(YGP)230を送達する方法の好ましい態様の概略図である。酵母βグルカン粒子(YGP)230を含む組成物182を対象185に経口投与180する。酵母βグルカン粒子(YGP)230は、小腸の内壁中のM細胞355によって取り込まれ、かつ上皮350を通過して移行され、かつ腸管マクロファージ360によって貪食される。YGPを含むマクロファージは、骨450、肺452、肝臓454、脳456、および脾臓458を含む器官および組織に遊走する370。経口投与後約72時間目に、YGPを貪食した脾臓マクロファージ364が脾臓458中で観察された(図解および蛍光顕微鏡カラー写真の逆コントラストのグレースケール像の双方で示した)。経口投与後約90時間目に、YGPを貪食した骨髄マクロファージ362が骨450中で観察された(図解および蛍光顕微鏡カラー写真の逆コントラストのグレースケール像の双方で示した)。
同じ変異を有するゴーシェ病患者に類似した生化学的異常および表現型異常を有する、これらの寿命が長い点突然変異ゴーシェ病マウスを利用できることにより、ゴーシェ病において観察される全身神経系および中枢神経系の病理の修正における、経口投与された遺伝子療法の有効性を試験するための手段が提供された。
Claims (41)
- 内部空間の境界を定め、かつ約6〜約90重量パーセントのβ-グルカンを含む抽出酵母細胞壁;
ペイロード閉じ込め分子;ならびに
欠損したリソソーム酵素の機能を補うのに有効な量の、核酸、ペプチド、タンパク質、およびそれらの混合物からからなる群より選択されるペイロード分子
を含む組成物であって、
ペイロード分子およびペイロード閉じ込め分子は同じ溶媒系に可溶であり、かつペイロード閉じ込め分子は、ペイロード分子および抽出酵母細胞壁の結合を安定させる、組成物。 - ペイロード閉じ込め分子が、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ-L-リシン、アルギナート、キサンタン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 抽出酵母細胞壁が、30重量パーセントを超えるマンナンをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 抽出酵母細胞壁が、50重量パーセントを超えるキチンを含む、請求項1記載の組成物。
- 核酸が、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、siRNA、酵素的RNA、組換えDNA構築物、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 組換えDNA構築物が、タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項5記載の組成物。
- オープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質が、構造タンパク質、酵素活性を有するタンパク質、膜タンパク質、DNA結合タンパク質、シグナル伝達タンパク質、またはそれらの機能的等価物である、請求項6記載の組成物。
- 核酸が、欠けている、欠陥を有する、または抑制された遺伝子の機能を補うヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の組成物。
- タンパク質が、ヒトグルコセレブロシダーゼまたはその機能的等価物である、請求項6記載の組成物。
- 組換えDNA構築物が、リソソーム酵素、リソソーム酵素の機能的等価物、リソソーム酵素活性化タンパク質、またはリソソーム酵素活性化タンパク質の機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項5記載の組成物。
- リソソーム酵素活性化タンパク質が、サポシンA、サポシンB、サポシンC、サポシンD、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項10記載の組成物。
- タンパク質が、リソソーム酵素またはその機能的等価物である、請求項1記載の組成物。
- タンパク質が、サポシンA、サポシンB、サポシンC、サポシンD、GM2活性化タンパク質、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 請求項1記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- リソソーム蓄積症の治療用の薬剤を製造するための請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物の使用。
- リソソーム蓄積症が、グリコサミノグリカンの代謝欠陥、糖タンパク質のグリカン部分の分解の欠陥、グリコーゲンの分解の欠陥、スフィンゴ脂質成分の分解の欠陥、ポリペプチドの分解の欠陥、コレステロール、コレステロールエステル、もしくは他の複合脂質の分解もしくは輸送の欠陥、複数のリソソーム酵素の欠損、輸送の欠陥、または細胞内トラフィッキングの欠陥である、請求項15記載の使用。
- リソソーム蓄積症が、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリッポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、スライ病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシスI型、ポンペ病、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病1型、ゴーシェ病2型、ゴーシェ病3型、GM1-ガングリオシドーシス、テイ・サックス病もしくはサンドホフ病などのGM2-ガングリオシドーシス、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病A型、ニーマン・ピック病B型、濃化異骨症、セロイドリポフスチン症、コレステロールエステル蓄積症、ニーマン・ピック病C型、ウォルマン病、多発性スルファターゼ疾患、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシスII型、ムコリピドーシスIII型、シスチン症、ムコリピドーシスIV、シアル酸蓄積症、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、およびダノン病、幸福顔貌骨異形成症(geleophysic dysplasia)、またはマリネスコ・シェーグレン症候群である、請求項15記載の使用。
- 内部空間の境界を定め、かつ約6〜約90重量パーセントのβ-グルカンを含む抽出酵母細胞壁を提供する段階;
欠損したリソソーム酵素の機能を補うのに有効な量の、核酸、ペプチド、タンパク質、およびそれらの混合物からからなる群より選択されるペイロード分子に抽出酵母細胞壁を接触させる段階;
ペイロード閉じ込め分子に抽出酵母細胞壁を接触させる段階
を含む、組成物を作製する方法であって、
ペイロード分子およびペイロード閉じ込め分子は同じ溶媒系に可溶であり、かつペイロード閉じ込め分子は、ペイロード分子および抽出酵母細胞壁の結合を安定させる、組成物を作製する方法。 - ペイロード閉じ込め分子が、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ-L-リシン、アルギナート、キサンタン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 抽出酵母細胞壁が、30重量パーセントを超えるマンナンをさらに含む、請求項18記載の方法。
- 抽出酵母細胞壁が、50重量パーセントを超えるキチンを含む、請求項18記載の方法。
- 核酸が、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、siRNA、酵素的RNA、組換えDNA構築物、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 組換えDNA構築物が、タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項18記載の方法。
- オープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質が、構造タンパク質、酵素活性を有するタンパク質、膜タンパク質、DNA結合タンパク質、シグナル伝達タンパク質、またはそれらの機能的等価物である、請求項18記載の方法。
- 核酸が、欠けている、欠陥を有する、または抑制された遺伝子の機能を補うヌクレオチド配列を含む、請求項18記載の方法。
- 以下の段階を含む、細胞における酵素欠損を補う方法:
約6〜約90重量パーセントのβ-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含む第1の送達系の有効量を提供する段階であって、ペイロード分子が、欠損酵素またはその機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである段階;ならびに
そのような酵素欠損を有する細胞を第1の送達系に接触させる段階。 - 酵素欠損がリソソーム酵素欠損である、請求項26記載の方法。
- オープンリーディングフレームによってコードされる酵素が、ヒトグルコセレブロシダーゼまたはその機能的等価物である、請求項26記載の方法。
- 接触させる段階がインビトロで実施される、請求項26記載の方法。
- 接触させる段階がインビボで実施される、請求項26記載の方法。
- 細胞による第1の組成物の食作用の段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
- 以下の段階をさらに含む、請求項26記載の方法:
β-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含む第2の送達系の有効量を提供する段階であって、ペイロード分子が、欠損酵素の活性化因子またはその機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである段階;ならびに
そのような酵素欠損を有する細胞を第2の送達系に接触させる段階。 - 細胞による第2の送達系の食作用の段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
- 細胞が、マクロファージ、パイエル板のM細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳中マクロファージ、小膠細胞、好酸球、顆粒球、糸球体間質食細胞、または滑膜A細胞である、請求項26記載の方法。
- 以下の段階を含む、タンパク質の欠損に起因するリソソーム蓄積症に罹患している対象を治療する方法:
β-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含む第1の組成物の有効量を投与する段階であって、ペイロード分子が、欠損タンパク質またはその機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである段階;ならびに
第1の組成物に食細胞を接触させる段階。 - 第1の組成物が、経口的に、皮下に、筋肉内に、または吸入によって対象に投与される、請求項35記載の方法。
- 対象が胎児であり、かつ組成物が、母親に組成物を投与することによって、または羊水中に有効量の組成物を入れることによって、子宮内の胎児に投与される、請求項35記載の方法。
- 以下の段階をさらに含む、請求項35記載の方法:
β-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含む第2の組成物の有効量を投与する段階であって、ペイロード分子が、活性化タンパク質またはその機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである段階;ならびに
食細胞を第2の組成物に接触させる段階。 - 以下の段階を含む、リソソームタンパク質欠損を有する対象を治療する方法:
第1の組成物の有効量を投与する段階であって、第1の組成物はβ-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含み、ペイロード分子が、欠損タンパク質またはその機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである、段階、
ならびに第2の組成物の有効量を投与する段階であって、第2の組成物はβ-グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード閉じ込め分子、およびペイロード分子を含み、ペイロード分子が、活性化タンパク質、その機能的等価物、または活性化タンパク質もしくはその機能的等価物をコードしているオープンリーディングフレームに機能的に連結されている制御エレメントを含む発現ベクターである、段階。 - 第1の組成物が、経口的に、皮下に、筋肉内に、または吸入によって対象に投与される、請求項39記載の方法。
- 食細胞を第1の組成物に接触させる段階および食細胞を第2の組成物に接触させる段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
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