JP5153188B2

JP5153188B2 - Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤

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Publication number: JP5153188B2
Application number: JP2007095624A
Authority: JP
Inventors: 淳二赤木
Original assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2027-03-30
Also published as: JP2008255138A

Description

本発明は、多糖体であって、前記多糖体の７５〜９５％がグルコース残基であり、３〜１５残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している多糖体に関する。

免疫細胞であるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）は、その産生するサイトカインの種類の違いから、Ｔｈ１型（Ｔｈ１）と、Ｔｈ２型（Ｔｈ２）に分けられる（非特許文献１）。Ｔｈ１は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）等のＴｈ１サイトカインを産生し、マクロファージやナチュラルキラー細胞を活性化し、ウイルスや細菌等に対する感染防御、及び癌に対する免疫防御といった細胞性免疫を制御している。一方、Ｔｈ２は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０等のＴｈ２サイトカインを産生し、即時性アレルギーや抗体産生調節といった液性免疫を制御している。

Ｔｈ１及びＴｈ２は互いに制約し合い、生体内の免疫調節の恒常性を維持するために、サイトカインやその他の各種因子によってバランスが制御されている（非特許文献２）。近年、このＴｈ１とＴｈ２のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）が免疫機能調節において重要であることが明らかにされており、そのバランスの破綻は、様々な疾患の原因となることが分かっている。例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ１側に傾くと、リウマチ、自己免疫疾患などの原因となり、逆に、Ｔｈ２側に傾くと、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎、発がんなどの原因となることが明らかである。そこで、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに作用し、破綻により引き起こされる様々な疾患を予防又は治療する薬剤の開発が期待されている。特に、Ｔｈ２側への偏りは、今や深刻な国民病でもある花粉症とも深い関係があり、また、癌領域においても、癌に対する免疫防御の主役はＴ細胞を中心とする細胞性免疫であることから、癌治療においてはＴｈ１免疫応答の活性化が重要であると考えられている。さらに、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの破綻によるＴｈ１サイトカインの低下が腫瘍に対する免疫力の低下を反映すると報告されている（非特許文献３）。

ところで、癌疾患等におけるＴｈ２の機能亢進に起因した疾患を治療する又は予防する薬剤として、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制するものがあげられる。しかし、これらの疾患に対して予防薬及び治療薬を開発する方法として、Ｔｈ１免疫応答を補強して、Ｔｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する方法もあげられる。つまり、もっとも効果的に予防薬及び治療薬を開発する方法は、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制し、Ｔｈ１サイトカインの産生を増強させることであり、この方法によってＴｈ２に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２のバランスを改善する改善剤が望まれている。

グルコースを主成分とする多糖体（グルカン）の中には、マクロファージやＴｈ細胞などの免疫細胞を活性化させるものがある。そのなかでもシイタケ子実体から抽出した１，６分岐β−１，３−グルカン（分岐度２／５）は免疫賦活作用を有する抗悪性腫瘍注射剤、レンチナン（ＬＮＴ）（製品名：レンチナン、販売会社：大鵬薬品工業株式会社、）として広く取り扱われてきた。また、ＬＮＴはＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側に改善する作用も報告されており、感染症や、悪性腫瘍治療、特に手術不能又は再発胃癌患者の延命を目的とした免疫療法剤として臨床応用されている。これらの他にも、免疫賦活作用を有する多糖体が、非特許文献４〜７及び特許文献１及び２に報告されている。これらの中には、ＬＮＴのように、Ｔｈ１免疫応答を誘導するものもある。しかし、このような多糖体には同時にＴｈ２免疫応答も強く誘導してしまうものもあり、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調節する意味では使用に適さない。

また、グルカンを中心とした多糖体を用いて、経口摂取で利用可能な免疫賦活剤やＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤が見出されている。しかし、グルカンによっては、もともとの粒子径が１００μｍ以上と大きいため、そのままでは、腸管からは吸収されず、経口での作用はあまり期待できない。そのためレシチンを分散化剤として用いて、きのこ抽出物と混合して平均粒径が１０μｍとなるような微粒子を作製する技術（特許文献３）や、リポソームでβ―グルカンを封入し、ゲルカラム等で封入されなかったβ―グルカンを分離する技術（特許文献４）が報告されている。これらの微粒子化された粒子は、腸管免疫で中心的な役割を担っている、パイエル板から取り込まれやすく、免疫賦活やＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する効果をより発揮することが明らかにされている。しかし、グルカンを用いてこのような目的を達成するには、上記のような微粒子化等のために必要な煩雑な操作や、特殊な装置が必要である。
特開平８−２５９６０２号特開２００４−４３３２６号国際公開ＷＯ２００２/０８７６０３号パンフレット国際公開ＷＯ０１/８５１４１号パンフレット T. R. Mosmann et al., J. Immunol., 136: 2348, 1986 柳原、医学のあゆみ、176: 167, 1996 T. Tabata et al., Am. J. Surg.,177: 203, 1999 ＡＨＣＣ担子菌培養抽出物の基礎と応用、第３９〜４５頁、ライフ・サイエンス社、２００７年７月 Ajico News No. 212,論文１２００４年３月医薬品インタビューフォームレンチナン１ｍｇ日本標準商品分類番号８７４２９９２００３年４月医薬品インタビューフォームクレスチン日本標準商品分類番号８７４２９９２００３年６月

本発明は、免疫賦活作用とＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善作用の優れた化合物を見出し、該物質を含有する医薬品組成物、飲食品組成物を提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、多糖体の７５〜９５％がグルコース残基であり、３〜１５残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐しているような多糖体を見出し、この多糖体に優れた免疫賦活作用とＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善作用があることを見出した。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）多糖体であって、前記多糖体の７５〜９５％がグルコース残基であり、３〜１５残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している、前記多糖体。好ましくは、５〜１３残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している多糖体であり、さらに好ましくは、７〜１２残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している多糖体であり、最も好ましくは、１０〜１１残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している多糖体である。

（２）上記（１）記載の多糖体を含有する免疫賦活剤。
（３）上記（１）記載の多糖体を含有するＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤。（２）又は（３）の剤は、経口投与されることを特徴としてもよい。

（４）上記（１）記載の多糖体を含有する飲食品。

本発明の多糖体は、優れた免疫賦活作用を有し、さらにＴｈ１免疫応答を補強することによってＴｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する作用が高く、免疫賦活剤又はＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤として好ましく、また健康食品の製造において有用な組成物を提供する。

さらに、本発明の多糖体のうち、凝集した形態のものは、従来の分散工程を経なくても、簡便にパイエル板から取り込まれやすい微粒子の形態とすることができるため、産業上利用可能性が高い。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の多糖体
本発明は、多糖体であって、前記多糖体の７５〜９５％がグルコース残基であり、３〜１５残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している、前記多糖体に関する。

本発明の「多糖体」は、加水分解によって２０分子以上の単糖類を生じる糖類をいい、その多糖体の組成としては、糖含有量が９０〜９９％であり、好ましくは、９２〜９８％であり、最も好ましくは、９７％であり、また、多糖体の全体の７５〜９５％、好ましくは、８０〜９０％、さらに好ましくは、８５％がグルコース残基である。糖含有量は、当該技術分野に周知の方法により測定することができ、例えば、フェノール硫酸法（例えば、「新実験化学講座２０生物化学［ＩＩ］」、１０８５頁、日本化学会編、１９７８年１０月２０日発行、丸善株式会社を参照。）があげられるがこれらに限定されない。

本発明の多糖体は、主としてグルコース、ガラクトース、マンノース等の天然に存在する単糖類から構成されるが、これらに限定されず、また、その分子中の１または２以上の箇所においてアシル化、リン酸化などの修飾、またはタンパク質、核酸が結合することによる修飾を受けていてもよい。本発明の多糖体に含まれる単糖類としては、上記グルコース等の他に、例えば、フルクトース、リブロース、タロース、アロース、アピオース、リボース、キシロース、フコース、デオキシリボース、ラムノース、グルコロン酸、ガラクツロン酸、アラビノースなどがあげられる。

上記の糖組成は、当該技術分野に周知の方法により測定することができ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法、アクリルアミドゲル電気泳動を用いた方法やキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いた方法があげられるがこれらに限定されない。好ましくは、ＨＰＬＣを用いた方法であり、糖組成物の検出は各糖の標準品の溶出時間との比較によって行い、また標準品のピーク面積値を利用した検量線を基に含量を算出することができる。本発明に適するＨＰＬＣの分析条件のうち、試料の調製方法としては、例えば、多糖体に、２Ｎトリフルオロ酢酸を添加して、適当な温度及び時間で加水分解し、減圧乾固後、残渣を超純水に溶解し、フィルターでろ過し、ろ液を適当に希釈する方法があげられるがこれらに限定されない。また、ＨＰＬＣ分析条件は、好ましくは、以下の実施例３に記載の条件があげられるがこれらに限定されない。

また、本発明の多糖体の分子量は、透析膜を用いた分画から、１０,０００〜５,０００,０００程度である。
本発明の多糖体に含まれるその他の成分としては、脂質、繊維質、灰分、タンパク質、核酸等のいかなる物質も含まれる。

本発明の「１，３結合グルコース」とは、隣り合うグルコース残基の１位と３位で結合がおこり、グルコースが重合している状態をいい、同様に、「１，３結合グルコースの６位で分岐」とは、１，３結合グルコースの６位で枝分かれしている状態をいう。

このような糖結合様式は、当該技術分野に周知の方法により解析することができ、例えば、メチル化分析を用いることができるが、これに限定されない。本発明のメチル化分析に適する条件としては、完全メチル化糖を加水分解して各単糖に分解した後、還元アセチル化し、部分メチル化糖アルコールのアセチル誘導体（部分メチル化アルジトールアセテート）としてＧＣ、ＧＣ／ＭＳ測定に供することができる。また好ましくは、以下の実施例３に記載の条件があげられるがこれらに限定されない。得られたマススペクトル部分メチル化アルジトールアセテートの標準マススペクトル（出典：生化学データブック）と照らし合わせることにより、クロマトグラム上の主要なピークを同定することができる。また、ガスクロマトグラムで得られた各ピークの面積から、部分メチル化アルジトールアセテートの組成比を算出することができる。好ましくは、以下の実施例３に記載の方法があげられるが、これに限定されない。

ここで、完全メチル化の方法としては、例えば、多糖体をＰ_２Ｏ_５中で数時間〜一晩程度乾燥させたものに、ＤＭＳＯを添加して、適当な時間攪拌後に、粉末ＮａＯＨとヨウ化メチルを添加して、適当な時間攪拌する。それをクロロホルムで数回抽出後、数回洗浄する。次に脱水として、クロロホルム層に無水硫酸ナトリウムを添加し、適当な温度条件下に適当な時間放置後、ろ過を行い、ろ液を乾固して、完全メチル化画分とする方法があげられるが、これらに限定されない。

また、上記の部分メチル化アルジトールアセテートの調製方法としては、上記完全メチル化糖にギ酸を添加し、適当な温度及び時間で加水分解し、減圧乾固後、トリフルオロ酢酸を添加して、さらに加水分解する。減圧乾固後、得られた残渣を洗浄後、ＮａＢＨ_４を添加して、適当な時間及び温度下に放置して減圧乾固する。残渣をメタノールで洗浄後、無水酢酸／ピリジンを添加して、適当な時間及び温度で加熱し乾固させる。残渣をクロロホルムで抽出し、超純水を加えて混和させ、クロロホルム層にさらに超純水を加え、塩の除去を数回行う。次に脱水を目的に、クロロホルム層に無水硫酸ナトリウムを添加し、適当な時間及び温度下で放置後、ろ過を行い、その後、ろ液を乾固し、残渣をクロロホルムに溶解させ、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳ測定に供するという方法があげられるが、これらに限定されない。

本発明の多糖体は、３〜１５残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐しており、好ましくは５〜１３残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐しており、より好ましくは７〜１２残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐しており、最も好ましくは１０〜１１残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している多糖体である。

２．本発明の多糖体の製法
本発明の多糖体は、６位で分岐している頻度の高い１，３−グルカンを、化学修飾する方法や１，6−グルカナーゼなどで酵素処理する方法など公知の方法によって分岐度を調整することで得ることができる。

また、本発明の多糖体は、菌糸体を脱脂した後、熱水抽出して得られる抽出液に、抽出液に対する体積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを加えることにより得られる沈殿画分を１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したものを透析することによって、凝集した形態で得ることができる。ここで「凝集した形態」とは、本発明の多糖体が２つ以上寄り集まったものをいう。具体的には、以下のようにして得ることができる。

ここで、本発明に適する菌糸体としては、きのこ由来のもの、好ましくは、ボタンダケ目バッカクキン科に属する菌種由来のもの、さらに好ましくは、冬虫夏草属に属する菌種由来のもの、最も好ましくは、コルジセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｙ）Ｓａｃｃａｒｄｏ）由来のものがあげられるが、これらに限定されない。なお、冬虫夏草は昆虫などから生じるきのこの総称であり、子のう菌類・麦角菌目・麦角菌科の一属として位置づけられる。そのうちのコルジセプス・シネンシスは鱗翅類のコウモリ蛾の幼虫に寄生し、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布するきのこである。本発明で用いる菌糸体は、天然物でも人工的に培養して得られたものでも市販の粉末等を用いてもよい。市販の粉末としては、例えば中国で市販されている"発酵虫草菌粉"（製品名：ＣＯＲＢＲＩＮＣＡＰＳＵＬＥ、製造会社：杭州中美華東製薬有限公司）、"冬虫夏草菌糸体"（製品名：虫草頭胞菌ＣＡＰＳＵＬＥ、製造会社：山東魯（▲ろ▼）抗医薬株式公司）を用いることができる。

本発明の多糖体の製造方法を、例えば、冬虫夏草菌糸体粉末を用いた場合について以下に説明する。
冬虫夏草菌糸体粉末を７０〜９９．５％エタノールで脱脂する。脱脂は、まず、６０〜１００℃、好ましくは、７０〜９０℃、より好ましくは８０℃で、適当な時間、例えば１時間〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、より好ましくは３〜７時間で抽出した後、残渣を回収することを数回繰り返す。その後、得られた残渣を５０〜８５％エタノールで６０〜１００℃、好ましくは、７０〜９０℃、より好ましくは８０℃で、適当な時間、例えば１時間〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、より好ましくは３〜７時間で抽出し、残渣を回収する。

次に、上記のように回収した残渣の熱水処理を行う。熱水処理は、適当量の蒸留水で６０〜１２０℃、好ましくは、８０〜１１０℃、より好ましくは、１００℃で数時間、例えば１時間〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、より好ましくは３〜７時間で抽出することにより行う。熱水抽出は複数回行ってもよく、例えば１〜４回、好ましくは２〜３回行う。抽出に用いる水のｐＨ値は特に限定されないが、例えば蒸留水を用いて行うことができる。

上記の熱水抽出物の上清を回収する。回収は遠心分離を用いることができ、例えば、１０００〜５０００×ｇ、より好ましくは、３０００×ｇで、室温、５〜３０分間という条件で遠心分離することができる。上記工程を数回程度繰り返し、得られた上清を合わせてから、適当量まで減圧濃縮する。濃縮率は特に限定されないが、例えば体積比で２０〜８０％、好ましくは２５〜６０％であり、さらに好ましくは３０〜５０％である。また当該濃縮は常圧下または減圧下のいずれにおいても行いうるが、好ましくは減圧下で行う。

その後、９０〜９９．５％エタノールを加えて、数時間〜一晩冷暗所に静置することによりエタノール沈殿を行う。抽出液に加えるエタノールの量は、特に限定されないが、例えば濃縮後の抽出液に対する体積比で０．５〜２．０倍の量、好ましくは０．８〜１．２倍であり、濃縮しない場合も同様である。得られた沈殿物は、当該技術分野に周知の方法により精製することができ、適当な条件下で遠心分離により沈殿物を回収した後、少量の蒸留水に溶解してもよく、さらに、再度蒸留水に溶解した後にエタノールを加えて沈殿画分を得る操作を１回または複数回行うことにより精製することもできる。その後、凍結乾燥等の当業界で周知の方法により沈殿物の粉末を得ることができる。

その後、上記粉末を１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜７０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは４０〜６０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、５０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解したものを透析する。透析の条件としては、分子量１，０００〜３００，０００、好ましくは１０，０００〜２００，０００、より好ましくは５，００００〜１５０，０００、最も好ましくは１００，０００の排除分子量の透析膜を用いて、蒸留水に対して、室温以下、例えば、２〜２０℃、好ましくは、２〜１０℃、より好ましくは、４℃にて、数時間〜数日間、好ましくは、１〜５日間、より好ましくは3日間であるが、これらに限定されない。透析の期間中、１〜数日あたり数回、透析外液の蒸留水を交換してもよい。透析期間終了後、透析内液を回収する。回収にあたっては、適当な条件の遠心分離を用いることができる。本発明に適する遠心分離の条件としては、２０００〜２００００×ｇ、好ましくは、５０００〜１５０００×ｇ、より好ましくは、１００００×ｇで、室温以下、例えば、２〜２０℃、好ましくは、２〜１０℃、より好ましくは、４℃にて、５〜３０分、好ましくは、１０〜２０分、より好ましくは、１５分間であるがこれらに限定されない。上記の室温以下条件での透析により、凝集した形態で本発明の多糖体を得ることができる。また、この凝集した形態である本発明の多糖体（以下、「凝集体」）を蒸留水で洗浄することで、純度を高めることができる。さらに「凝集体」を凍結乾燥することにより、茶白色の「凝集体」粉末を得ることができる。

上記「凝集体」の洗浄には、「凝集体」を１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜７０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは４０〜６０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、５０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水を加え懸濁後、遠心分離にて、再度「凝集体」を回収することができる。遠心分離の条件は、２０００〜２００００×ｇ、好ましくは、５０００〜１５０００×ｇ、より好ましくは、１００００×ｇで、室温以下、例えば、２〜２０℃、好ましくは、２℃〜１０℃、より好ましくは、４℃にて、５〜３０分、好ましくは、１０〜２０分、より好ましくは、１５分間であるがこれらに限定されない。この洗浄操作を数回繰り返すことができる。

３．「凝集体」の粒度分布
上記２．に記載の方法により得られた「凝集体」１ｍｇを水１ｍｌに分散させた分散化液を２５℃で測定したとき、粒度分布は、粒子径５０〜５００μｍに全粒子の約８０％が入っている。

粒度分布は、当該技術分野に周知の方法により測定機器を用いて測定することができる。例えば、以下の実施例３に記載の方法を用いることができるが、これに限定されない。さらに、上記「凝集体」を、特に限定されないが、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、１ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、適当な条件下で加熱処理を行うことで、２５℃で粒度分布を測定したところ粒子径１００μｍ以下、好ましくは粒子径０．０１〜１００μｍ、より好ましくは粒子径０．１〜５０μｍ、さらに好ましくは粒子径０．１〜１０μｍ、最も好ましくは粒子径０．２〜７μｍに全粒子の約８０％が入っている微粒子化された凝集体（以下、「微粒子体」）を調製することができる。適当な条件下とは、例えば、４０〜１２０℃、好ましくは、６０〜１１０℃、より好ましくは、８０〜１００℃で数時間、例えば１〜２４時間であり、好ましくは２〜１２時間であり、より好ましくは３〜７時間の加熱をいうが、これらに限定されない。

このように「凝集体」に、上記のような加熱処理を施すだけで、「微粒子体」を得ることができる。これは、従来の分散工程を必要とする微粒子製造方法よりも、簡便であり、好ましい。さらに、この「微粒子体」は、室温で少なくとも３日間は粒度分布の増加は確認されず、再凝集がおこらず、安定である。

つまり、粒度分布を上記のように小さくすることにより、腸管免疫で中心的な役割を担っているパイエル板からの取り込み効率が高まるため、以下に記載する免疫賦活剤やＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤等の製造にあたっては、「凝集体」に微粒子化を施すことが好ましい。

４．本発明の多糖体を含有する免疫賦活剤
本発明は、上記多糖体を含有する免疫賦活剤に関する。本発明の多糖体は、非常に強いサイトカイン産生促進作用を有するため、免疫賦活を必要とする被験者に対して免疫賦活剤として使用することができる。従って、本発明の多糖体は、医薬組成物、特に免疫賦活剤の有効成分として使用することができる。これらの製造にあたっては、パイエル板からの取り込み効率が高い、「微粒子体」を用いるのがより好ましい。

本発明の多糖体が免疫賦活効果を有することは、当該技術分野に周知の方法により測定することができ、例えば、以下のように、ヒト末梢血を用いた免疫賦活作用の測定方法により確認することができるが、これに限定されない。すなわち、適当な培地と、健常者からヘパリン採血した末梢血を添加して、多糖体の終濃度が一定になるようにＰＢＳに溶解させた被験物質を添加して、適当な条件下培養する。その後、培養上清を回収し、上清中に産生されたＩＦＮ−γを定量する。測定には、例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。

この結果から、「凝集体」、及び「微粒子体」には、公知の免疫賦活作用を有する物質、例えば、ＬＮＴ、ＰＳＫ（製品名：クレスチン、販売会社：株式会社クレハ）、ＡＨＣＣ（製品名：ＡＨＣＣ、販売会社：株式会社アミノアップ化学）、ＬＥＭ（製品名：シイタゲン、販売会社：小林製薬株式会社）等より非常に強いサイトカイン産生促進作用が認められ、本発明の多糖体に非常に強い免疫賦活作用があることがわかった。

５．本発明の多糖体を含有するＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤
本発明は、上記多糖体を含有するＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤に関する。
本発明の「Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス」は、生体内において抗原提示細胞から分化したヘルパーＴ細胞のサブセットであるＴｈ１とＴｈ２の存在比をいう。健常人におけるＴｈ１／Ｔｈ２は通常４〜８であり、癌等の免疫抑制状態においてはそれを下回る。本発明の「Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤」は、免疫抑制状態におけるＴｈ２優位の状態からＴｈ１／Ｔｈ２を上昇させる、又は正常のＴｈ１／Ｔｈ２に改善させるものをいう。あるいは、健常人が癌等の免疫抑制状態になりにくい状態を維持または向上させるものをいう。

本発明の多糖体は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する効果を有する。そのため、本発明の多糖体は、癌になりにくい身体状態をつくること、あるいは癌の免疫療法として期待できる。従って、本発明の多糖体は、医薬組成物、特にＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤の有効成分として使用することができる。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する効果は、「凝集体」に比べ「凝集体」を加熱処理して得られる「微粒子体」の方がより高い。そのため、本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤の製造にあたっては、上記「微粒子体」を用いるのがより好ましい。

本発明の多糖体がＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善効果を有することは、当該技術分野に周知の方法により測定及び確認することができ、例えば、上記４．に記載したヒト末梢血を用いた免疫賦活作用の測定方法中に得られた培養上清を用いて、以下のように確認することができるが、これらに限定されない。すなわち、上記培養上清中に産生されたＩＬ−１０を定量して、上記４．で定量したＩＦＮ−γ産生量をもとに、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインの比率を次式より算出することによる。ここで、ＩＬ−１０の定量にはＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
＜計算式＞
（Ｔｈ１サイトカイン）／（Ｔｈ２サイトカイン）＝（ＩＦＮ−γ産生量）／（ＩＬ−１０産生量）
算出した値を用いてグラフ化し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調節能の解析を行うことができるが、この結果から、「凝集体」、「微粒子体」にＴｈ１免疫応答を相対的に高める作用が認められ、その効果は、これまでにＴｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する作用が知られているＬＮＴ、ＰＳＫ、ＡＨＣＣ、ＬＥＭよりも優れていることが明らかである。また、「凝集体」と「微粒子体」を比較すると、「凝集体」の加熱処理に伴い、Ｔｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する効果が高まることも明らかである。

本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関連する癌疾患以外の疾患、例えば、アレルギー、動脈硬化、肝障害、自己免疫病、ＧＶＨＤの治療にも併用することができる。さらに、本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤は、化学療法や放射線療法と併用することもできる。

本発明の上記４．の免疫賦活剤又は５．のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤は種々の剤形とすることができる。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらに限定されない。また、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤を含むことができるが、これらに限定されない。本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤を持続性、徐放性のものとしてもよい。

本発明の上記４．の免疫賦活剤又は５．のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤の投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができるが、例えば、一般に１〜５０００ｍｇ／日／成人の用量で使用される。

上記４．の免疫賦活剤又は５．のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤の投与経路は、安全かつ効果的に投与することができれば、特に限定されるものではなく、経口投与のほか、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、直腸内投与等の非経口投与でもよい。簡便であり、自己投与が容易であるという観点からは、経口投与が好ましい。

６．本発明の多糖体を含有する飲食品
本発明は、上記多糖体を含有する飲食品に関する。本発明の上記多糖体は、そのまま機能性食品として使用できるほか、医薬部外品、飲食物等の有効成分などとして使用することができる。そのような使用により、本発明の免疫賦活効果およびＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善効果を有する当該経口摂取組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な免疫賦活による体質改善、癌の治療および癌の発症の予防が可能となる。本発明の経口摂取組成物が食品素材として使用される例としては、免疫賦活効果もしくはＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善効果または予防効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）があげられるがこれらに限定されない。

本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明を種々変更、修飾して使用することが当業者には可能であり、これらも本発明の範囲に含まれる。

１．本発明の多糖体の分画
冬虫夏草菌糸体粉末５００ｇを９９．５％エタノール１Ｌで８０℃、６時間抽出した。抽出後、グラスフィルターＧＡ−２００（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過し、残渣を回収した。２度の抽出後、残渣を７０％エタノール１Ｌで８０℃、６時間抽出した。抽出後、グラスフィルターＧＡ−２００（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過し、残渣を回収した。３度の抽出後、残渣を蒸留水１Ｌで１００℃、６時間抽出した。抽出後、３０００×ｇ、室温、１５分間遠心分離し、上清を回収した。３度の抽出後、上清を合わせて約１．５Ｌになるまで減圧濃縮し、体積比で等量の９９．５％エタノールを加え、一晩冷暗所に静置した。翌日、３０００×ｇ、室温、１５分間遠心分離し、沈殿物を回収後、少量の蒸留水に溶解し、凍結乾燥により茶色粉末２１．０ｇを得た。次いで、この粉末を５０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＣＥＭｅｍｂｒａｎｅＭＷＣＯ：１００，０００（スペクトラム社）を用いて蒸留水に対して４℃、３日間透析を行った。途中、１日あたり３回、透析外液の蒸留水を交換した。３日後、透析内液を回収し、１００００×ｇ、４℃、１５分間遠心分離し、凝集した形態で本発明の多糖体を回収した。この「凝集体」の洗浄を目的に、適量の蒸留水を加え懸濁後、１００００×ｇ、４℃、１５分間遠心分離し、再度「凝集体」を回収した。この洗浄操作を１０回繰り返し、最終的に少量の蒸留水に「凝集体」を懸濁し、凍結乾燥により茶白色の「凝集体」粉末を１．１３ｇを得た。

２．凝集した形態である本発明の多糖体の微粒子化
実施例１によって得られた「凝集体」粉末を１ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁し、８０℃で３０分間加熱処理を行うことで、「微粒子体」を調製した。

本発明の多糖体の成分解析
１．糖含量測定
常法に従って、フェノール硫酸法による多糖体（Ａ）の糖含量の測定を行った。その結果、本発明の多糖体の糖含量は、Ｄ（＋）−グルコース換算で９６．６％であり、ほぼ糖から構成される多糖体であることが確認された。

２．糖組成分析
以下の方法に従って、酸加水分解で得られた中性糖をＨＰＬＣ法で分析した。ＨＰＬＣ分析のピークの同定は、標準品（グルコース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース）の溶出時間との比較によって行い、また標準品のピーク面積値を利用した検量線を基に含量を算出した。

（１）ＨＰＬＣ測定用試料の調製
実施例１によって得られた「凝集体」粉末１．１９ｍｇをガラス試験管に秤量後、２Ｎトリフルオロ酢酸２００μLを添加し、１００℃で６時間加水分解した。減圧乾固後、残渣を５００μＬの超純水に溶解し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ液を１００倍に希釈し、５０μＬをＨＰＬＣ分析に供した。

（２）ＨＰＬＣ分析条件
（Ａ）装置
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ−９Ａシステム（島津製作所）
検出器：分光蛍光光度計ＲＦ−１０ＡＸＬ（島津製作所）
（Ｂ）カラム
ＴＳＫ−ｇｅｌＳｕｇａｒＡＸＧ１５ｃｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（東ソー）
（Ｃ）分析条件
カラム温度：７０℃
移動相：０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液ｐＨ８．７
移動相流速：０．４ｍｌ／分
ポストカラム標識：反応試薬：１％アルギニン／３％ホウ酸
反応試薬流速：０．５ｍｌ／分
反応温度：１５０℃
検出波長：Ｅｘ．３２０ｎｍＥｍ．４３０ｎｍ
（３）結果
上記のＨＰＬＣ解析の結果、グルコース、マンノース、ガラクトースのピークが検出され、本発明の多糖体はこれらを構成糖とする多糖体であることが確認された。また、ピークの面積値から、糖組成はグルコース：マンノース：ガラクトース＝２１：２：１であり、大部分がグルコースで構成される多糖体であることが確認された。

３．糖結合様式解析
以下のメチル化分析に従って、糖結合様式を解析した。完全メチル化糖を加水分解して各単糖に分解した後、還元アセチル化し、部分メチル化糖アルコールのアセチル誘導体（部分メチル化アルジトールアセテート）としてＧＣ、ＧＣ／ＭＳ測定に供した。得られたマススペクトル部分メチル化アルジトールアセテートの標準マススペクトル（出典：生化学データブック）と照らし合わせることにより、クロマトグラム上の主要なピークを同定した。また、ガスクロマトグラムで得られた各ピークの面積から、部分メチル化アルジトールアセテートの組成比を算出した。

（１）完全メチル化
実施例１によって得られた「凝集体」粉末３．３ｍｇをバイアル管に秤量し、Ｐ_２Ｏ_５中で一晩乾燥させた。ＤＭＳＯを０．６ｍｌ添加し、２時間攪拌後、粉末ＮａＯＨ２０ｍｇとヨウ化メチル０．１５ｍｌを添加し、３０分間攪拌した。クロロホルム１ｍｌで２回の抽出後、超純水２ｍｌで５回洗浄した。次に脱水を目的に、クロロホルム層に無水硫酸ナトリウム１ｇを添加し、室温にて1時間放置後、ろ過を行った。その後、ろ液を乾固し、完全メチル化画分とした。

（２）部分メチル化アルジトールアセテートの調製
加水分解管に完全メチル化糖を加え、９０％ギ酸０．５ｍｌを添加し、１００℃で２時間加水分解した。減圧乾固後、２Ｎトリフルオロ酢酸０．５ｍｌを添加し、１００で５時間さらに加水分解した。減圧乾固後、得られた残渣を少量の超純水で３回洗浄後、１％ＮａＢＨ_４を０．５ｍｌ添加し、室温で一晩放置した。その後、酢酸で過剰のＮａＢＨ_４を分解し、減圧乾固した。残渣をメタノールで５回洗浄後、無水酢酸／ピリジンを０．５ｍｌ添加し、１００℃で１時間加熱し乾固させた。残渣をクロロホルム１ｍｌで抽出し、超純水を１ｍｌ加えて混和させた。クロロホルム層にさらに超純水１ｍｌを加え、塩の除去を５回行った。次に脱水を目的に、クロロホルム層に無水硫酸ナトリウム１ｇを添加し、室温にて1時間放置後、ろ過を行った。その後、ろ液を乾固し、残渣を２５０μＬのクロロホルムに溶解させ、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳ測定に供した。

（３）ＧＣ測定条件
（Ａ）装置：Ｈｅｗｌｅｔｔ−ｐａｃｋａｒｄＨＰ５８９０
（Ｂ）カラム（液相）：ＳＰＧ−５（スペルコジャパン）
（タイプ）Ｆｕｓｅｄｓｉｌｉｃａｃａｐｉｌｌａｒｙ３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．
（Ｃ）分析条件：
キャリアガス：Ｈｅ
カラム温度：６０℃、１分→２８０℃（８℃／ｍｉｎ）
注入温度：２８０℃
注入量：１μＬ

（４）ＥＩ−ＧＣ／ＭＳ測定条件
（Ａ）装置：日本電子ＪＭＳＤＸ−３０３質量分析計
Ｈｅｗｌｅｔｔ−ｐａｃｋａｒｄＨＰ５８９０Ａガスクロマトグラフ
（Ｂ）データ処理：日本電子ＪＭＡＤＡ５０００データ処理システム
＜ＧＣ部条件＞
（Ａ）装置：Ｈｅｗｌｅｔｔ−ｐａｃｋａｒｄＨＰ５８９０Ａ
（Ｂ）カラム（液相）：ＳＰＧ−５（スペルコジャパン）
（タイプ）Ｆｕｓｅｄｓｉｌｉｃａｃａｐｉｌｌａｒｙ３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．
（Ｃ）分析条件
キャリアガス：Ｈｅ
カラム温度：６０℃、１分→２８０℃（８℃／ｍｉｎ）
注入温度：２８０℃
注入量：１μＬ
＜ＭＳ部条件＞
イオン化方式：ＥＩ
電子加速電圧：７０Ｖ
イオン化電流：３００μＡ
イオン化温度：２５０℃
イオン化加速電圧：３．０ＫＶ
走査速度：１ｓｅｃ／ｓｃａｎ
走査間隔：１ｓｅｃ

（５）結果
メチル化分析の結果、１，３結合グルコースと６位で分岐した１，３結合グルコースのピークが検出され、また、ピークの面積値から、本発明の多糖体の結合様式は１０〜１１残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐した結合様式であることが確認された。

４．粒度分布解析
以下の方法に従って、「凝集体」粒度分布の解析を行った。
（１）粒度分布測定用試料の調製
実施例１によって得られた「凝集体」粉末をサンプル管に秤量し、１ｍｇ／ｍｌとなるように超純水を添加した。激しく撹拌することで、「凝集体」を分散させ、測定用試料とした。また、同時に「微粒子体」についても測定用試料とした。

（２）粒度分布測定条件
（Ａ）装置：島津製作所ＳＡＬＤ−２０００Ｊ
（Ｂ）分析条件
屈折率：１．７０−０．２０ｉ
温度：２５℃
試料投入：測定用試料を超純水で５倍希釈
撹拌条件下
（C）データ処理：ＷｉｎｇＳＡＬＤ−２０００Ｊ

（３）結果
粒度分布を図１に示す。「凝集体」の粒度分布は、粒子径５０〜５００μｍに全粒子の８０％が含まれていた（図１Ａ）。それに対して、「微粒子体」の粒度分布は、粒子径０．２〜５μｍに全粒子の８０％が含まれており（図１Ｂ）、微粒子化されていることが明らかとなった。また、「凝集体」と「微粒子体」を比較した結果、「微粒子体」の方が腸管免疫で中心的な役割を担っているパイエル板からの取り込み効率が高いことが確かめられた。
さらに、この「微粒子体」は室温で最低でも３日間は粒度分布の増加は認められなかった（図１Ｃ）。

ヒト末梢血を用いた免疫賦活作用の測定
２４穴細胞培養用プレートに、ＲＰＭＩ１６４０培地７００μＬと、健常者からヘパリン採血した末梢血２００μＬを添加した。そこに、多糖体の終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解させた被験物質を１００μＬ添加し、３７℃，５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。その後、培養上清を回収し、上清中に産生されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法による測定キット（バイオソース社製）で定量した。測定方法と定量結果の解析方法はキット添付の取扱説明書に従った。

免疫賦活作用が知られている、ＬＮＴ、ＰＳＫ、ＡＨＣＣ、ＬＥＭ、５０ＥＰ、８０ＥＰ及びＭ１並びに、実施例１、実施例２で得られた「凝集体」と「微粒子体」について、ＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を図２に示す。

この結果から、「凝集体」と「微粒子体」には、ＬＮＴ、ＰＳＫ、ＡＨＣＣ、ＬＥＭ、５０％ＥＰ、８０％ＥＰ及びＭ１より非常に強いサイトカイン産生促進作用が認められ、ヒト末梢血を用いた評価系における本発明の多糖体の免疫賦活作用が確認された。

５０％ＥＰは、本発明の多糖体の製造過程において、熱水抽出後のエタノール沈殿における、５０％エタノール沈殿画分の多糖体をいい、８０％ＥＰは、５０％エタノール上清画分にエタノールを終濃度８０％となるように加えて得られる８０％エタノール沈殿画分の多糖体をいい、Ｍ１は、上記５０％ＥＰ画分を、２０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＣＥＭｅｍｂｒａｎｅＭＷＣＯ：１００，０００（スペクトラム社）で蒸留水に対し透析した透析内液を凍結乾燥することにより得られる多糖体をいう。

Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調節能の解析
実施例３で得られた培養上清を用いて、上清中に産生されたＩＬ−１０をＥＬＩＳＡ法による測定キット（バイオソース社製）で定量した。また、実施例４で定量したＩＦＮ−γ産生量、及びＩＬ−１０産生量をもとに、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインの比率を次式より算出した。
＜計算式＞
（Ｔｈ１サイトカイン）／（Ｔｈ２サイトカイン）＝（ＩＦＮ−γ産生量）／（ＩＬ−１０産生量）
算出した値を用いてグラフ化し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調節能の解析を行った。ＩＬ−１０の産生量を図３Ａに、（ＩＦＮ−γ産生量）／（ＩＬ−１０産生量）の比率を図３Ｂに示す。この結果から、「凝集体」と「微粒子体」にＴｈ１免疫応答を相対的に高める作用が認められ、その効果は、これまでにＴｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する作用が知られているＬＮＴ、ＰＳＫ、ＡＨＣＣ、ＬＥＭよりも優れていることが明らかとなった。また、同時に、「凝集体」と「微粒子体」の比較から、微粒子化に伴い、Ｔｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する効果が高まることも明らかとなった。

図１は、本発明の多糖体について、「凝集体」（Ａ）、「微粒子体」（Ｂ）及び「微粒子体」を３日間室温放置した後（Ｃ）の粒度分布を示す。図２は、本発明の多糖体について、ＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す。図３は、本発明の多糖体について、ＩＬ−１０産生量（Ａ）及び（ＩＦＮ−γ産生量）／（ＩＬ−１０産生量）の比率を測定（Ｂ）した結果を示す。

Claims

きのこ由来の経口投与用多糖体であって、前記多糖体の７５〜９５％がグルコース残基であり、７〜１２残基の１，３結合グルコースに１個の割合で１，３結合グルコースの６位で分岐している、前記多糖体。
請求項１記載の多糖体を含有する免疫賦活剤。
請求項１記載の多糖体を含有するＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善剤。
請求項１記載の多糖体を含有する飲食品。
２５℃で粒度分布を測定したときに、粒子径０．１〜１０μｍに全粒子の約８０％が入っている微粒子化された請求項１記載の多糖体。