CN103539863B - 褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖在制备治疗帕金森病药物和保健品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类来源于海洋褐藻的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖在制备帕金森病药物和保健品中的应用。该低硫酸化杂聚糖主要组成单糖包括甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、半乳糖等，其水解硫酸基含量为5％-28％，岩藻糖含量3-28％，糖醛酸含量5-30％。该硫酸杂聚糖系从海洋褐藻包括海带、裙带菜、马尾藻、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、海黍子、海蒿子等褐藻中提取并经过阴离子交换层析分离得到。该类硫酸杂聚糖具有显著的神经保护作用，其特征在于对神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的细胞损伤起到保护作用，并在抗帕金森病动物模型中表现出良好的抗帕金森病作用。

Description

褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖在制备治疗帕金森病药物和保健品中的应用

技术领域

本发明涉及褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖的在治疗帕金森病和老年痴呆药物中的应用。

背景技术

随着人类平均寿命的逐年增加，世界正步入全球老龄化时代。与年龄有关的神经退化性疾病也随之增加，在中枢神经系统方面，主要表现为兴奋与抑制过程减弱，大脑功能降低，记忆力减退和丧失，随后出现识别功能的进行性减退和情绪紊乱的加重等。帕金森病又称震颤麻痹，是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病，帕金森病的主要病理特征是是因位于中脑部位"黑质"中的细胞发生病理性改变后，多巴胺的合成减少，抑制乙酰胆碱的功能降低，则乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了“震颤麻痹”。最新资料表明，中国有170万帕金森病患者，其中55岁以上的人群中每100人就有1个帕金森病人，估计每年新增帕金森病人约10万人。帕金森病对患者、家庭和社会都带来巨大的压力，使得全世界对其给予众多的关注，帕金森病的治疗药物研究成为老年医学领域中的一个重要课题。

海洋是地球上所占面积最大的区域，因此开发海洋药物越来越受到重视，而海洋物质提取在制备和开发抗帕金森药物及在神经保护方面有着不可估计的社会和经济效益。

海藻多糖在制备神经退行性疾病中的应用已有多个专利公开。专利“岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病药物或保健品中的应用”（ZL200710014587.1）公开了一种岩藻聚糖硫酸酯或以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和认知损伤药物中的应用。其中的岩藻聚糖硫酸酯是以α-L-岩藻糖-4-硫酸酯为主要成分的高分子多糖。专利“褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病中的用途”（ZL200710099008.8）公开了一种主要由岩藻糖和半乳糖组成，岩藻糖31%，硫酸基含量32%，分子量180KD的褐藻多糖硫酸酯以及一种岩藻糖30%，硫酸基31%，平均分子量7kD的褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病中的用途。

海洋褐藻中的多糖种类繁多，结构复杂多样，仅硫酸多糖就包括三大类，一类是岩藻聚糖硫酸酯（也称为褐藻多糖硫酸酯），是由岩藻糖为组成单糖的硫酸多糖组分，另一类是由岩藻糖和半乳糖组成的硫酸多糖，即半乳岩藻聚糖硫酸酯，此外褐藻中还普遍存在一类富含糖醛酸的低硫酸化杂聚糖，其单糖组成比较复杂，包含甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、半乳糖等多种单糖，在对褐藻中的硫酸多糖组分通过阴离子凝胶色谱进行分级纯化时，一般含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖组分会被低浓度的电解质首先洗脱下来。由于化学特性差异较大，低硫酸化杂聚糖与岩藻聚糖硫酸酯生物活性差异很大。例如，Croci等报道了褐藻Laminariasaccharina中分离到两种硫酸多糖，一种属于低硫酸化杂聚糖，称为岩藻甘露葡萄糖醛酸聚糖（Fucomannoglucuronans），另一种为岩藻聚糖，他们对两种不同多糖的活性比较研究后得出结论为，是岩藻聚糖而不是岩藻甘露葡萄糖醛酸聚糖决定了褐藻Laminariasaccharina中硫酸多糖的生物活性，包括抗凝血、抗肿瘤、抗炎等活性。（Fucans,butnotfucomannoglucuronans,determinethebiologicalactivitiesofsulfatedpolysaccharidesfromLaminariasccharinabrownseaweed,PLoSONE2011,6(2):1-10）

发明内容

为了进一步明确海洋褐藻多糖中神经保护活性成分，本专利通过对褐藻中不同多糖组分的分离纯化以及其神经保护作用研究发现，一种主要由甘露糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖等单糖组成的硫酸杂聚糖对PD细胞的神经保护作用明显强于岩藻聚糖硫酸酯组分，而且在抗帕金森病的动物实验中对帕金森病具有明显的治疗作用。

褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖在制备治疗帕金森病药物和保健品中的应用。

所述的低硫酸化杂聚糖具有如下特征：水解硫酸基含量在5-28%之间，岩藻糖含量在3%-28%之间,糖醛酸含量在5%-30%之间。其单糖组分包括岩藻糖、葡萄糖醛酸，此外还包括甘露糖，葡萄糖，鼠李糖，半乳糖，木糖，古洛糖醛酸，甘露糖醛酸等中的一种或多种。

所述的低硫酸化杂聚糖来源于海洋褐藻，包括海带、裙带菜、马尾藻、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、莫氏马尾藻、海黍子、海蒿子等褐藻。

所述的褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖按照以下方法制备：采用水提或酸提方法提取海洋褐藻中的水溶性多糖。水溶性多糖通过阴离子交换色谱进行分级，采用低浓度电解质洗脱得到的组分经过脱盐、浓缩、干燥后即得。其中所述的阴离子交换色谱介质包括二乙氨乙基型弱阴离子凝胶如二乙氨乙基交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）、二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）、二乙氨乙基交联琼脂糖凝胶（DEAE-琼脂糖）等，以及强阴离子凝胶如Q-sepharose凝胶、Q-sephadex等。所述的低浓度电解质浓度范围为0.3-0.6mol/L，电解质可以为NaCl、KCl等，电解质溶剂为去离子水或缓冲液。

所述的低硫酸化杂聚糖分子量为1KD～1000KD。一种具有如下结构特征的低硫酸化杂聚糖及其在制备治疗帕金森病药物和保健品中的应用。其结构特征：

（1）组成糖：甘露糖，葡萄糖醛酸，岩藻糖等。

（2）甘露糖和葡糖糖醛酸以α（1→4）糖苷键连接；葡萄糖醛酸和甘露糖以β（1→2）

糖苷键连接。

（3）葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸之间以β（1→3）糖苷键连接。

（4）岩藻糖以α（1→3）糖苷键连接，C2或C4位硫酸化。

（5）包含如下结构单元（Ⅰ），（Ⅱ），（Ⅲ），不同结构单元之间相互交替连接。

其中n，m，x分别为1-15之间的整数。R为H或硫酸基

所述药物为含有褐藻硫酸杂聚糖和药学可接受的载体的药物组合物。所述药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。

本发明具有如下优点：

1．发现褐藻来源的低硫酸化杂聚糖对帕金森病具有神经保护作用，可以用于制备治疗帕金森病的药物和保健品。

2．通过对不同褐藻多糖抗帕金森病的细胞模型活性的比较研究，首次发现富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖对帕金森病具有显著的治疗作用，而高硫酸化岩藻聚糖（岩藻聚糖硫酸酯或褐藻多糖硫酸酯）活性较弱甚至没有活性，而且在不同多糖的对比研究中表明硫酸化程度较高的杂聚糖抗帕金森病活性同样很弱，具有显著抗帕金森病活性的杂聚糖具有以下特征：岩藻糖含量低于29%，硫酸基含量低于29%，含有较高的糖醛酸含量（5-30%）。

3．公开了一种具有显著抗帕金森病活性的褐藻低硫酸化杂聚糖的结构特征，其结构单元包括甘露糖-葡萄糖醛酸组成的结构单元，葡萄糖醛酸寡糖单元以及岩藻寡糖硫酸酯结构单元。

附图说明

图1海带多糖分级组分F1、F2和F3（从上到下）的HPGPC测定分子量谱图；

图2海带多糖分级组分F1、F2和F3（从上到下）的IR图；

图3半叶马尾藻多糖的IR图；

图4羊栖菜硫酸杂聚糖的IR图；

图5海黍子硫酸杂聚糖的IR图；

图6全缘马尾藻硫酸杂聚糖的IR图；

图7硇洲马尾藻硫酸杂聚糖的IR图；

图8褐藻硫酸杂聚糖F1和SIP对帕金森病小鼠行为学的影响；

图9褐藻硫酸杂聚糖F1和SIP对帕金森病小鼠纹状体内DA和DOPAC的含量的影响；

图10组分YD-1（a）,YD-2(b),YT(c)的ESI-MS图；

图11J-2的凝胶色谱图；

图12J-2的G1-G4的ESI图和HPLC图；

图13各组分相应的ESI-CID-MS/MS图；

图14G1的¹H-NMR，DEPT-Q，HMBC图；

图15脱硫的分级组分一的ESI-MS图。

具体实施方式

下面用实施例对本发明进行具体说明，不过本发明并不只限于以下实施案例范围。

实施例1：热水提取法提取海带（laminariajaponica）多糖及不同多糖组分的制备

（1）将5kg海带除去泥沙，用20倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取进行2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入浓缩液4倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀真空干燥得到粗多糖，多糖粗品得率为：4.84%。

（2）将粗多糖溶于水配成浓度为1.5%（质量浓度）的溶液，加入2mol/LMgCl₂使MgCl₂终质量浓度为0.05mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20%，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，取上清液加入95%乙醇，使乙醇终重量浓度为70-75%，搅拌生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀溶于适量水配成质量浓度2%（质量浓度）的水溶液，用截留分子量为3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得海带多糖，得率为2.71%。

（3）取上述冻干得到的海带多糖溶于水，配成质量浓度为2.5%（质量浓度）的水溶液，上样到以DEAE-Sepharose-CL-6B为载体的柱层析，依次用0.5mol/LNaCl、1.0mol/LNaCl和2.0mol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，分别装入截留分子量为3500道尔顿的透析袋以自来水流水透析2天，蒸馏水透析1天、冻干。其中由0.5mol/LNaCl洗脱得到杂聚糖组分F1，1.0mol/LNaCl洗脱得到岩藻聚糖硫酸酯组分F2；2.0mol/LNaCl洗脱得到岩藻聚糖硫酸酯组分F3。分别对三个分级组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量，分子量和红外分析，结果如下表1和2、图1和2。

实施例2分级组分F1降解产物DF1的制备

取实施例1中海带多糖分级组分F150g配成1.5％的水溶液，在该溶液中加入30mM抗坏血酸和30mM过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3500Da的透析袋分别在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干。得到低分子量组分DF1。对DF1进行化学分析，结果见表1和表2。

表1海带多糖分级组分F1、F2、F3和DF1的化学组分

表2分级组分F1、F2、F3和DF1的单糖组成（摩尔比）

图1海带多糖分级组分F1、F2和F3（从上到下）的HPGPC测定分子量谱图；

图2海带多糖分级组分F1、F2和F3（从上到下）的IR图；

从以上结果来看，分级组分F1是一类较复杂的低硫酸化的杂聚糖，其单糖组成复杂，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、岩藻糖所占比例较为接近，没有一种单糖具有支配地位。其降解产物DF1分子量显著降低，但化学组成与F1基本一致，说明降解过程没有破坏F1的化学结构。分级组分F2可以看作是一类半乳岩藻聚糖硫酸酯，分级组分F3是一类岩藻聚糖硫酸酯。从F1到F3，分子量从小到大，硫酸根的含量从少到多，分子逐渐增大，硫酸根的含量从少到多，而糖醛酸的含量正好跟硫酸根相反，由多到少，而且单糖组成从F1的杂多糖逐渐过渡到F2和F3的以岩藻糖为主的褐藻多糖硫酸酯。且根据红外判断，F2和F3在840-850cm^-1有吸收峰，表明F2和F3主要以岩藻糖C4位的硫酸根或半乳糖C6-位硫酸根为主，而分级组分F1峰的位置在820cm^-1，表明F1主要以岩藻糖C2位的硫酸根为主。

实施例3：酸提法提取鼠尾藻多糖及不同鼠尾藻多糖组分的制备

（1）将5kg鼠尾藻除去泥沙，加入100L0.1M的盐酸室温搅拌提取3小时，提取液过滤后，藻渣用100L0.1M盐酸重复提取1次，过滤，合并两次提取的滤液，用碱调滤液的pH至5-7，用硅藻土过滤，滤液超滤，浓缩，加入浓缩液4倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到鼠尾藻多糖SP16.2g。

（2）取上述得到的鼠尾藻多糖溶于水，配成浓度为2.5%的水溶液，上样到以DEAE-Sepharose-CL-6B为载体柱层析，依次用0.3mol/LNaCl、1.0mol/LNaCl和2.0mol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，分别透析、冻干。其中由0.3mol/LNaCl洗脱得到杂聚糖组分S1，1.0mol/LNaCl洗脱得到半乳岩藻聚糖硫酸酯组分S2；2.0mol/LNaCl洗脱未收集到多糖组分。分别对SP和S1、S2三个多糖组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量，分子量和红外分析，结果见表3和表4。

实施例4分级组分S1降解产物DS1的制备

取实施例3中海带多糖分级组分S150g配成1.5％的水溶液，在该溶液中加入30mM抗坏血酸和30mM过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3500Da的透析袋分别在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干。得到低分子量组分DF1。对DS1进行化学分析，结果见表3和表4。

从表3和表4的结果来看，鼠尾藻多糖SP本身属于单糖组成较为复杂的低硫酸化的杂聚糖，经过进一步分级纯化，分级组分S1也是富含糖醛酸的低硫酸化的杂聚糖，其单糖组成复杂，葡萄糖醛酸含量最好，此外甘露糖、半乳糖、岩藻糖所占比例均较高，没有一种单糖具有支配地位。其降解产物DS1分子量显著降低，但化学组成与S1基本一致，说明降解过程没有破坏S1的化学结构。分级组分S2可以看作是一类半乳岩藻聚糖硫酸酯，其单糖组成以岩藻糖和半乳糖为主，硫酸根含量30.2%。

表3鼠尾藻多糖SP、S1、S2、和DS1的化学组分

表4鼠尾藻多糖组分S1、S2、SP和DS1的单糖组成（摩尔比）

实施例5半叶马尾藻多糖的提取

1．提取

1）称取剪碎半叶马尾藻100g，2000ml水（20倍），110-120℃，4小时。

2）筛绢过滤，硅藻土过滤，得滤液约1700ml。

3）浓缩470ml。

4）20%乙醇-0.05mol/LMgCL2去除褐藻胶。

5）离心（4000r，15min），上清液透析，浓缩，酒精沉淀，用95%乙醇洗沉淀洗涤，红外灯下烘干，放干燥器中保存。

2．化学组分分析和红外光谱图见表5、表6和图3。从结果看半叶马尾藻多糖为以岩藻糖为主要单糖的杂聚糖，其硫酸化程度较高，硫酸根含量为28.96%，从红外光谱分析，其835cm^-1的吸收峰该峰介于820cm^-1的平伏键（岩藻糖C2位硫酸化）和840-850cm^-1的直立键（岩藻糖C4位硫酸化或半乳糖C6-位硫酸化，）表明其硫酸化位置较为复杂。

表5半叶马尾藻多糖的化学组分

表6半叶马尾藻多糖的单糖组成摩尔比

图3半叶马尾藻多糖的IR图；

实施例6羊栖菜（hizikiafusiforme）硫酸杂聚糖的提取

1．提取

1）称取剪碎羊栖菜100g，2000ml水（20倍），110-120℃，4小时。

2）筛绢过滤，硅藻土过滤，得滤液约1700ml。

3）浓缩至470ml。

4）20%乙醇-0.05mol/LMgCL₂去除褐藻胶。

5）离心（4000r，15min），上清液透析，浓缩，酒精沉淀，用95%乙醇洗沉淀洗涤，红外灯下烘干，放干燥器中保存。

2．化学组分和IR图见表7-8和图4。从结果看羊栖菜多糖为硫酸杂聚糖，

从红外光谱分析，其硫酸化位置主要在C2位。

表7羊栖菜硫酸杂聚糖的化学组分

表8羊栖菜硫酸杂聚糖的单糖组成摩尔比

图4羊栖菜硫酸杂聚糖的IR图

实施例7海黍子（Sargassummuticum）硫酸杂聚糖的提取

1．提取

1）称取剪碎海黍子100g，2000ml水（20倍），110-120℃，4小时。

2）筛绢过滤，硅藻土过滤，得滤液约1700ml。

3）浓缩至470ml。

4）20%乙醇-0.05mol/LMgCL2去除褐藻胶。

5）离心（4000r，15min），上清液透析，浓缩，酒精沉淀，用95%乙醇洗沉淀洗涤，红外灯下烘干，放干燥器中保存。

2．化学组分和IR图见表9-10和图5。从结果看海黍子多糖为硫酸杂聚糖，从红外光谱分析，其硫酸化位置主要在C2位。

表9海黍子硫酸杂聚糖的化学组分分析（占干重百分比）

表10海黍子硫酸杂聚糖的单糖组成摩尔比

图5海黍子硫酸杂聚糖的IR图

实施例8：全缘马尾藻(Sargassumintegerrimum)硫酸杂聚糖的提取

1．提取

1）称取剪碎全缘马尾藻100g，2000ml水（20倍），110-120℃，4小时。

2）筛绢过滤，硅藻土过滤，得滤液约1700ml。

3）浓缩至470ml。

4）20%乙醇-0.05mol/LMgCL2去除褐藻胶。

5）离心（4000r，15min），上清液透析，浓缩，酒精沉淀，用95%乙醇洗沉淀洗涤，红外灯下烘干，放干燥器中保存。

2．化学组分和IR图见表11-12和图6。从结果看全缘马尾藻多糖为硫酸杂聚糖，从红外光谱分析，其硫酸化位置主要在C2位。

表11全缘马尾藻硫酸杂聚糖的化学组分

表12全缘马尾藻硫酸杂聚糖的单糖组成摩尔比

图6全缘马尾藻硫酸杂聚糖的IR图

实施例9硇洲马尾藻(S.naozhouense)硫酸杂聚糖的提取

1．提取

1）称取剪碎硇洲马尾藻100g，2000ml水（20倍），110-120℃，4小时。

2）筛绢过滤，硅藻土过滤，得滤液约1700ml。

3）浓缩470ml。

4）20%乙醇-0.05mol/LMgCL2去除褐藻胶。

5）离心（4000r，15min），上清液透析，浓缩，酒精沉淀，用95%乙醇洗沉淀洗涤，红外灯下烘干，放干燥器中保存。

2．化学组分和IR图见表13-14和图7。从结果看硇洲马尾藻多糖为硫酸杂聚糖，从红外光谱分析，IR中出现834cm^-1，表明其硫酸化位置较为复杂，在C2位和C4位均有硫酸化，且比例较为接近。

表13硇洲马尾藻硫酸杂聚糖的化学组分

表14硇洲马尾藻硫酸杂聚糖的单糖组成摩尔比

图7硇洲马尾藻硫酸杂聚糖的IR图；

实验例1：上述实施例1-4中各样品对神经毒素6-OHDA损伤的神经细胞的保护作用

本试验通过MTT法测定细胞存活率来反映各样品对抗神经毒素6-OHDA的毒性作用大小，来说明其在神经保护方面的作用。

测试样品：实施例1-9中制备的各个硫酸杂聚糖样品。包括实施例1中F1、F2、F3、实施例2中DF1；实施例3中S1、S2、SP；实施例4中DS1。

取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×10⁵个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。贴壁后加入用Dulbecco'smodificationofEagle'smedium/F12（DMEM/F12）培养液（Gibco公司）测试样品（浓度1mg/ml，0.1mg/ml）与6-OHDA（100μmol/L）共培养24h，对照组不加入6-OHDA；6-OHDA损伤组不加入任何测试样品；之后每孔加入5mg/ml的3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（MTT）20μl,37℃培养箱中培养4h。弃上清后每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，自动酶标读数仪（R-T-2100C，深圳雷杜公司）比色（波长570nm），测定其吸光度值来反映MES23.5细胞的存活率。

上述MTT测定结果提示，当只加入6-OHDA时，细胞的存活率较对照组明显下降，说明6-OHDA对多巴胺能细胞具有明显的损伤作用；比较海带热水提取多糖分级组分F1-F3的活性，F1与6-OHDA共孵育时，可以明显抑制细胞存活率的下降，与6-OHDA单独作用组相比具有极统计学意义。说明F1具有显著的神经保护作用；而F2仅在高浓度下具有神经保护作用，而且其活性明显低于F1，F2低浓度和F3在测试浓度下与6-OHDA组没有明显差异，鼠尾藻多糖SP及分级组分的测试结果与海带多糖分级组分相似，硫酸杂聚糖组分S1和SP具有明显的神经保护作用，而高硫酸化岩藻聚糖硫酸酯组分S2都不具有神经保护作用。

比较F1和其降解产物DF1，S1和其降解产物DS1对6-OHDA损伤的神经细胞的保护作用，硫酸杂聚糖F1、S1及其低分子量组分DF1和DS1均呈现显著的神经保护作用，高分子量组分与低分子量组分的神经保护活性没有显著差异。说明硫酸杂聚糖在很宽的分子量范围内均具有显著的神经保护作用。

结合以上的化学分析，可以看出，海带和鼠尾藻中的低葡萄糖醛酸含量的高硫酸化的岩藻聚糖硫酸酯（褐藻多糖硫酸酯组分）及半乳岩藻聚糖硫酸酯仅具有弱神经保护作用或没有作用，而富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖具有明显的神经保护作用，而且富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖在很宽的分子量范围内均具有显著的神经保护作用。

表15.海带多糖分级组分（1mg/ml和0.1mg/ml）对细胞存活率的影响

所有样品和对照相比都具有统计学意义。

*(P<0.05),与6-OHDA进行对比，具有统计学意义。

**(P<0.01),与6-OHDA进行对比，具有极统计学意义。

实验例2其它褐藻中硫酸杂聚糖对抗神经毒素6-OHDA的毒性作用

本试验通过MTT法测定细胞存活率来反映其对抗神经毒素6-OHDA的毒性作用大小，来说明其在神经保护方面的作用。

测试样品：实施例5-9中制备的各个硫酸杂聚糖样品。包括实施例5中半叶马尾藻多糖；实施例6中羊栖菜多糖；实施例7中海黍子多糖；实施例8中全缘马尾藻多糖；实施例9中硇洲马尾藻多糖。

取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×10⁵个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。贴壁后加入用Dulbecco'smodificationofEagle'smedium/F12（DMEM/F12）培养液（Gibco公司）测试样品（浓度1mg/ml，0.1mg/ml）与6-OHDA（100μmol/L）共培养24h，对照组不加入6-OHDA；6-OHDA损伤组不加入任何测试样品；之后每孔加入5mg/ml的3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（MTT）20μl,37℃培养箱中培养4h。弃上清后每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，自动酶标读数仪（R-T-2100C，深圳雷杜公司）比色（波长570nm），测定其吸光度值来反映MES23.5细胞的存活率。

上述MTT测定结果提示，当只加入6-OHDA时，细胞的存活率明显下降，说明6-OHDA对多巴胺能细胞具有明显的损伤作用；五种褐藻中提取的硫酸杂聚糖分别与6-OHDA共孵育时，在1mg/mL浓度下，除半叶马尾藻多糖外，其余褐藻中的硫酸杂聚糖均明显抑制细胞存活率的下降，与6-OHDA单独作用组相比具有极统计学意义。在0.1mg/mL浓度时，除羊栖菜和半叶马尾藻中的硫酸杂聚糖组分与6-OHDA组相比没有明显变化，其余褐藻中提取的硫酸杂聚糖均显著改善神经细胞损伤。通过比较五种褐藻中的多糖的化学成分，可以看出，半叶马尾藻岩藻糖和硫酸基含量较高，均大于28%，而糖醛酸含量低于5%，而其余褐藻中多糖组分均为富含葡萄糖醛酸低硫酸化的杂聚糖组分，表明富含葡萄糖醛酸的低硫酸化的杂聚糖组分对神经毒素损伤的MES23.5细胞都有明显的神经保护作用。具体数据见表16和表17。

表16.不同褐藻中提取的多糖样品（1mg/ml和0.1mg/ml）对细胞存活率的影响

所有样品和对照相比都具有统计学意义。

*(P<0.05),与6-OHDA进行对比，具有统计学意义。

**(P<0.01),与6-OHDA进行对比，具有极统计学意义。

表17.不同褐藻中提取的多糖样品（1mg/ml和0.1mg/ml）对细胞存活率的影响

所有样品和对照相比都具有统计学意义。

*(P<0.05),与6-OHDA进行对比，具有统计学意义。

**(P<0.01),与6-OHDA进行对比，具有极统计学意义。

实验例3两种硫酸杂聚糖灌胃给药对帕金森病小鼠的治疗作用

根据多巴胺能神经细胞的细胞活性实验结果，继续选取两个硫酸杂聚糖样品进行动物模型药效学研究，进一步确定硫酸杂聚糖对帕金森病的治疗作用。

实验样品：实施例1中制备的样品F1和实施例8中制备的全缘马尾藻多糖组分(简写为SIP)。给药方式：灌胃给药，给药剂量：每个样品设两个剂量组，分别为每天50mg/kg体重和100mg/kg。

实验方法：

MPTP是一种脂溶性的神经毒素，全身给药可迅速透过血脑屏障，在脑内经胶质细胞内的B型单胺氧化酶作用转化成其活性形式MPP⁺后，被DA神经元上的DA转运体特异性摄取，通过抑制线粒体呼吸链复合体I和氧化应激选择性地损伤黑质致密部的DA能神经元，导致纹状体内DA含量明显减少，是目前应用最为广泛的帕金森病动物模型。

选用8～10周龄的雄性C57BL/6J小鼠，按15mg/kg体重腹腔注射MPTP，每2小时一次，连续注射4次，空白对照组给予等体积生理盐水（NS）。将动物分为6组：(1)NS+NS组;（2）MPTP+NS组;（3）F150mg/kg灌胃+MPTP组;（4）F1100mg/kg灌胃+MPTP组；（5）SIP50mg/kg灌胃+MPTP组;（6）SIP100mg/kg灌胃+MPTP组。

在MPTP损毁的第二天起始灌胃硫酸杂聚糖样品，每天一次，模型组和空白对照组灌服NS；连续灌胃14天后，进行行为学测试，完成行为学测试后处死动物，对纹状体DA及其代谢产物含量进行检测，结果如下：

硫酸杂聚糖可以显著改善MPTP小鼠的行为学表现

应用Truscan动物活动监测系统连续记录小鼠自主活动，记录时间为60分钟，用随机软件对各项运动指标进行分析，结果表明，MPTP小鼠在相同时间内的总活动距离、平均运动速度和每次活动的平均移动距离均显著低于生理盐水对照组，但100mg/kgF1以及50mg/kg和100mg/kgSIP（全缘马尾藻硫酸杂聚糖）灌胃14天组小鼠的上述运动指标均明显好转，结果具有统计学意义（图8）。结果提示海带硫酸杂聚糖组分F1和全缘马尾藻硫酸杂聚糖灌胃给药可以减轻MPTP诱导的帕金森病小鼠的运动减少和运动迟缓，改善帕金森病小鼠的行为能力。

图8褐藻硫酸杂聚糖F1和SIP对帕金森病小鼠行为学的影响；

褐藻硫酸杂聚糖F1和SIP对帕金森病小鼠纹状体内DA和DOPAC的含量（图9）

用高效液相－电化学法（HPLC-ECD）对小鼠纹状体中DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量进行了检测，并对DA、DOPAC和HVA的含量及（HVA＋DOPAC）/DA的比值进行了计算及统计学分析。结果表明，海带硫酸杂聚糖F1在50mg/kg和100mg/kg剂量下均使MPTP小鼠纹状体中DA和DOPAC的含量显著地增高，全缘马尾藻硫酸杂聚糖SIP在50mg/kg和100mg/kg剂量下均使MPTP小鼠纹状体中DA的含量显著地增高，SIP在100mg/kg剂量下使MPTP小鼠纹状体中DOPAC含量显著地增高，表明褐藻硫酸杂聚糖能够提高帕金森病小鼠的多巴胺水平，对帕金森病的发展具有显著的治疗作用。图9褐藻硫酸杂聚糖F1和SIP对帕金森病小鼠纹状体内DA和DOPAC的含量的影响；

通过细胞实验和动物实验，我们发现褐藻硫酸杂聚糖对帕金森病细胞模型和动物模型的DA能神经元都有明显的神经保护效应。

实施例1中海带多糖分级组分F1的结构特征研究

由于F1的组分较复杂，通过常规的NMR分析不能确定其基本结构特征。为了进一步研究其结构特征，首先对F1进行部分酸水解以及DMSO脱硫法降解，然后再通过色谱（包括凝胶色谱，活性炭柱层析，离子柱色谱等手段）对F1部分酸水解和降解产物产物进行分离纯化，对分离组分进行电喷雾质谱（ESI-MS），电喷雾-碰撞诱导解离-串联质谱（ESI-CID-MS/MS），NMR等分析。推测其结构含有以下一般式（I）,(II),(III)表示的结构单元，以及可能存在的一般式相互交替连接。

其中n，m，x分别为1-15之间的整数。R为H或SO₃H，或SO₃K，或SO₃Na。

(1)分级组分F1寡糖的制备

分级组分F110g样品溶于4%的硫酸溶液中（料液比为60mg/mL）加热回流5小时，氢氧化钡中和，离心，浓缩，过活性炭柱层析，用水平衡（记为J-1），然后用50%-90%乙醇洗脱（记为J-2）。J-1通过DEAE-BioGelagroseFF(2.6cm×30cm)柱层析，分别用水平衡（J-1-1），0.05MNaCl洗脱（J-1-2），0.1MNaCl（J-1-3）。以上三组分分别通过SephadexG-10进行分离及脱盐,分别得到YD-1（图10a）/YD-2(图10b),YT(图10c)。表18总结了部分组分相应的化学特征。J-2直接上Bio-gelP4分离得到六个组分(图11)，并且对上面收集得到的样品进行分析（图12）。

结果如下：图10组分YD-1（a）,YD-2(b),YT(c)的ESI-MS图；图11J-2的凝胶色谱图；

表18.F1经部分酸水解后各分离组分对应的质谱信号和化学特征分析

图12J-2的G1-G4的ESI图和HPLC图；

通过对以上组分的ESI-MS分析，初步确定相应组分的特征及分子量，为了对其结构进行确认，进一步采用ESI-CID-MS/MS进行分析。从表18中可以看出J-2含有甘露葡萄糖醛酸寡糖（DP为2，4，6，8），其ESI-CID-MS/MS的裂解方式相似，因此对[GlcA-Man]₄的ESI-CID-MS/MS谱图（图13a）进行讨论。糖酐键断裂形成的碎片峰有175，193，337，355，513，675，693，851，所属类型见谱图。从而确认了寡糖[GlcA-Man]₄的序列为GlcA-Man-GlcA-Man-GlcA-Man-GlcA-Man，特征离子峰^0,2A-型235（信号较弱，谱图不显示），573（信号较弱，谱图不显示）和911的存在说明GlcA和Man之间为1→2糖苷键。Man和GlcA之间的糖苷键通过核磁(图14)得到。

从表18中，我们还可以看到硫酸化的甘露葡萄糖醛酸寡糖，分别为435，611，773，949，1111。我们对GlcA₃Man₃SO₃H（质荷比为1111）进行ESI-CID-MS/MS，得到图13b。糖苷键断裂形成的碎片离子峰为175，193，377，417，474，465，546，773，931，从而得到糖序列为GlcA-Man（SO₃H）-GlcA-Man-GlcA-Man-GlcA-Man。糖苷键断裂伴随着硫酸根的丢失所形成的碎片离子峰为513，693和851，说明硫酸根在CID-MS/MS下容易断裂丢失，初步判断为C6位。特征离子峰^0,2A-型326(-2)（信号较弱，谱图不显示）和495的存在说明GlcA和Man之间为1→2糖苷键。Man和GlcA之间的糖苷键也通过核磁确认。

193，369和545的存在（表18）中，说明分级组分F1含有葡萄糖醛酸寡糖的片段，由于相似寡糖具有相似的ESI-CID-MS/MS谱，因此对GlcA₃（质荷比为541）进行二级质谱分析，如图13c。糖苷键的断裂形成的碎片峰同时证明了葡萄糖醛酸寡糖GlcA₃的糖基序列。由于^0,2A-型信号较弱，从而说明葡萄糖醛酸寡糖主要以1→3糖苷键为主，但是也有少量的1→4糖苷键。

从以上的说明来看分级组分F1含有一般式（I）,(II)表示的结构单元。

其中n，m分别为1-15之间的整数。R为H，或SO₃H，或SO₃K，或SO₃K。

图13各组分相应的ESI-CID-MS/MS图；图14G1的¹H-NMR，DEPT-Q，HMBC图；

上述讨论主要是从部分酸解得到的结果。我们同时通过DMSO法来解析分级组分F1中关于岩藻糖相关的组分。以分级组分F1为原料，可按如下步骤进行操作，将分级组分F1溶于体积之比为10%DMSO/甲醇溶液，质量浓度为2.5%，反应温度80℃，反应时间为5h,而得到的降解混合物；反应完毕后，采用膜分离技术脱盐，冷冻干燥，从而得到寡糖混合物。附图15为其ESI-MS图。403，549，695，841，988，1134分别对应着甲基化硫酸化的岩藻寡糖，因此说明有F1中含有具有一般式（III）的结构单元。

其中x为1-15之间的整数。R为H，或SO₃H，或SO₃K，或SO₃K。

Claims (7)

1.褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖在制备治疗或预防帕金森病的药物或保健品中的应用；所述的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖具有如下特征：其主要组成单糖包括葡萄糖醛酸、岩藻糖和甘露糖，此外还包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸中的一种或多种；其水解硫酸基含量在5-28％之间，岩藻糖含量在3％-28％之间，糖醛酸含量在5％-30％之间；

所述低硫酸化杂聚糖具有如下结构特征：

(1)组成糖包括：甘露糖，葡萄糖醛酸，岩藻糖；

(2)甘露糖和葡糖糖醛酸以α(1→4)糖苷键连接；葡萄糖醛酸和甘露糖以β(1→2)糖苷键连接；

(3)葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸之间以β(1→3)糖苷键连接；

(4)岩藻糖以α(1→3)糖苷键连接，C2或C4位硫酸化；

(5)包含如下结构单元(I)，(II)，(III)，不同结构单元之间相互交替连接；

其中n，m，x分别为1-15之间的整数；R为H或硫酸基。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的褐藻来源的富含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖按照以下方法制备：采用水提或酸提方法提取海洋褐藻中的水溶性多糖；水溶性多糖通过阴离子交换色谱进行分级，采用低浓度电解质洗脱得到的组分经过脱盐、浓缩、干燥后即得；

其中所述的阴离子交换色谱介质包括二乙氨乙基型弱阴离子凝胶以及强阴离子凝胶；

所述的低浓度电解质浓度范围为0.3-0.6mol/L，电解质为NaCl、KCl中的一种或多种，电解质溶剂为去离子水或缓冲液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的二乙氨乙基型弱阴离子凝胶为二乙氨乙基交联葡聚糖、二乙氨乙基纤维素、二乙氨乙基交联琼脂糖凝胶，以及强阴离子凝胶为Q-sepharose凝胶和Q-sephadex。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的低硫酸化杂聚糖来源于海洋褐藻，海洋褐藻包括海带、裙带菜、马尾藻、鹿角菜、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、莫氏马尾藻、海黍子、海蒿子中的一种或多种。

5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：所述的低硫酸化杂聚糖分子量为1KD～1000KD。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为含有褐藻低硫酸化杂聚糖和药学可接受的载体的药物组合物。

7.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。